JP6437441B2 - 抗ｃｄ２０抗体およびｐｉ３キナーゼ選択的阻害剤の組み合わせ - Google Patents

抗ｃｄ２０抗体およびｐｉ３キナーゼ選択的阻害剤の組み合わせ Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月2日に出願された米国仮特許出願第61/771,812号に基づく優先権を主張し、その内容を参照することによって本明細書に援用する。
本書では、PI3Kδおよび／またはCD20介在性疾患または疾病の治療および改善のため、有効性の高い、式Aの化合物（PI3Kδ選択的阻害剤）および抗CD20抗体の組み合わせが提供される。特に、この組み合わせは、がんおよび自己免疫疾患の治療に使用され得る。より具体的には、本発明は、白血病およびリンパ腫等の血液悪性疾患の治療および／または改善のため、式Aの化合物またはその立体異性体、およびウブリツキシマブの組み合わせを提供する。
PI3Kδ酵素およびCD20の両者は、多岐にわたるヒトのがん、特に血液悪性疾患における腫瘍形成に個々に影響していることを示す、相当のエビデンスがある。ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）は、ホスホイノシチド二次メッセンジャー分子を産生することにより、各細胞型において多様な生物学的機能を制御する酵素ファミリーである。これらのホスホイノシチド二次メッセンジャーの活性はそれらのリン酸化状態によって決定されるため、これらの脂質に作用し、修飾するキナーゼおよびホスファターゼは、細胞内シグナル伝達事象を正確に遂行するための中心的役割を果たす。PI3Kは、イノシトール環の3-ヒドロキシル残基で脂質をリン酸化し（ホワイトマン(Whitman)ら、Nature 332:664 (1988)）、リン酸化リン脂質（PIP3）を産生するが、これは、Aktやホスホイノシチド依存性キナーゼ-1（PDK1）等の、脂質結合ドメイン（プレクストリン相同（PH）領域を含む）を有するキナーゼをリクルートする二次メッセンジャーとして作用する。Aktが膜PIP3に結合することによってAktは細胞膜へ移動し、AktがPDK1に接触し、これによりAktが活性化される。腫瘍抑制ホスファターゼであるPTEN（第10染色体で欠失しているホスファターゼ・テンシン・ホモログ）はPIP3を脱リン酸化し、従ってAkt活性化の負の調節因子として作用する。PI3キナーゼであるAktおよびPDK1は、細胞周期の調節、増殖、生存、アポトーシスおよび運動性等の多くの細胞プロセスの調節において重要であり、がん、糖尿病および免疫性炎症等の疾病の分子機構の重要な要素である（ヴィヴァンコ(Vivanco)ら、Nature Rev. Cancer 2:489 (2002)；フィリップス(Phillips)ら、Cancer 83:41 (1998)）。
PI3Kファミリーは、4つの異なるクラス：クラスI、II、IIIおよびIVより構成される。クラスI〜IIIは脂質キナーゼであり、クラスIVはセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。
PI3KのクラスIファミリーの構成員は調節サブユニットと触媒サブユニットの二量体である。クラスIのファミリーは、4種のアイソフォームよりなり、110 kDaの触媒サブユニットα、β、γおよびδによって決定される。エンゲルマン(Engelman) J.A., Nat Rev Genet 7:606-619 (2006)；カルネロ(Carnero) A., Curr Cancer Drug Targets 8:187-198 (2008)；およびヴァンヘーセブレック(Vanhaesebroeck) B., Trends Biochem Sci 30:194-204 (2005)参照のこと。クラスIは、2つのサブクラスにさらに分類し得る：クラスIaは、p110α、β、およびδ、および調節サブユニット（p85、p55またはp50）の組み合わせにより形成され、クラスIbは、p110γおよびp101調節サブユニットより形成される。
PI3Kおよび関連するプロテインキナーゼ経路に関する研究は、様々な研究グループによって発表されており、例えば、リウ(Liu)ら、Nature Reviews Drug Discovery 8:627-644 (2009)；ナタン(Nathan)ら、Mol. Cancer Ther. 8(1) (2009)；およびマローネ(Marone)ら、Biochimica et Biophysica Acta 1784:159-185 (2008)が挙げられる。2種の既知のPI3K阻害剤、LY294002およびウォルトマンニンは、クラスIのPI13Kの4種：α、β、γおよびδに分類されない、非特異的なPI3K阻害剤である。多数のPI3K阻害剤ががん治療の臨床試験を開始しており、乳がん、非小細胞肺がん（NSCLC）および血液がん等の多様な種類のがんが治療的関心領域と考えられている。
CD20は分子量が35〜37 kDaの疎水性膜貫通タンパクであり、成熟Bリンパ球の表面に存在する。CD20は、プレB段階からプラズマ細胞に分化するまでの、Bリンパ球細胞（B細胞）が成長する間に発現され、プラズマ細胞はこの発現が消失する段階である。CD20は、正常Bリンパ球と、殆どの非ホジキンB細胞リンパ腫（NHL）およびB型慢性リンパ球性白血病（B-CLL）細胞等の悪性B細胞との両者に存在する。CD20抗原は造血幹細胞またはプラズマ細胞では発現しない。
抗CD20抗体は、B細胞疾患の治療のために開発され、その開発は継続されている。抗CD20抗体であるリツキシマブの成功が報告されている。しかし、相当数の患者が、リツキシマブ治療に抵抗性であるか、リツキシマブの長期投与の過程で（単剤での使用または化学療法レジメンとの併用であっても）耐性を発現する。
従って、PI3Kδ酵素および／またはCD20タンパク質の調節に関連する疾病または疾患の治療および／または改善、特に、B細胞疾患の治療および改善に、より有効な治療法が必要とされている。
本発明は、PI3Kδ選択的阻害剤である式(A)の化合物：
そしてその立体異性体、その互変異性体、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、そしてプロドラッグ、および少なくとも1つの抗CD20抗体を含む組み合わせを対象とする。
この組み合わせは、PI3Kδ酵素および／またはCD20タンパク質に関連する疾患、疾病または症状、例えば、がん等の増殖性疾患の治療に好適に使用される。特に、この組み合わせは、B細胞疾患、例えば、血液悪性疾患の治療および／または改善に好適である。
従って、いくつかの態様では、細胞集団の増殖を阻害する方法が提供される。いくつかの態様では、該方法は、該集団を、(i) 式Aの化合物、その立体異性体、その互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片であって、該抗CD20抗体または断片がウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するものを含む組み合わせと、接触させることを含む。
いくつかの態様では、該方法は、細胞集団を、(i) 式Aの化合物、その立体異性体、その互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片であって、該抗CD20抗体または断片がFc-γRIII（CD16）に高親和性を示すものを含む組み合わせと、接触させることを含む。
いくつかの態様では、該方法は、細胞集団を、(i) 式Aの化合物、その立体異性体、その互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体または断片のフコース含有量が65%未満であるものを含む組み合わせと、接触させることを含む。
いくつかの態様では、該方法は、細胞集団を、(i) 式Aの化合物、その立体異性体、その互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体または断片が、配列番号1、2および3の配列のVH CDR1、CDR2およびCDR3領域、および配列番号6、7および8の配列のVL CDR1、CDR2およびCDR3領域を含むものを含む組み合わせと、接触させることを含む。いくいつかの態様では、抗CD20抗体またはその抗原結合断片は、配列番号4のVHおよび配列番号9のVLを含む。いくつかの態様では、抗CD20抗体はウブリツキシマブである。
いくつかの態様では、式Aの化合物は、
(RS)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；または
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンである。
いくつかの態様では、式Aの化合物は、(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンである。
いくつかの態様では、細胞集団の増殖を抑制する方法は、該集団を、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される少なくとも1つの化合物、および(ii) 少なくとも1つの抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含む組み合わせと、接触させることを含む。
いくつかの態様では、細胞集団の増殖を抑制する方法は、該集団を、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される化合物、および(ii) 少なくとも1つの抗CD20抗体またはその抗原結合断片であって、該抗CD20抗体またはその断片がウブリツキシマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、GA101、AME-133v、PRO131921、トシツモマブ、hA20、およびPRO70769と同一のエピトープに結合する抗体およびその断片よりなる群から選択されるものを含む組み合わせと、接触させることを含む。
いくつかの態様では、該集団は、
(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される化合物、および
(ii) 抗CD20抗体を含む組成物と接触する。
いくつかの態様では、該集団は、
(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される化合物を含む第一の組成物、および
(ii) 抗CD20抗体を含む第二の組成物と接触する。
いくつかの態様では、該集団はB細胞を含む。
いくつかの態様では、該集団はヒト被験者内にある。
いくつかの態様では、該被験者は過剰なB細胞増殖に関連する疾病または疾患を罹患している。
いくつかの態様では、該被験者はがんを罹患している。いくつかの態様では、がんは血液悪性疾患である。いくつかの態様では、血液悪性疾患はリンパ腫または白血病である。いくつかの態様では、血液悪性疾患は、急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、多発性骨髄腫（MM）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、濾胞性リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（WM）、B細胞リンパ腫およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）よりなる群から選択される。いくつかの態様では、がんはCD20を過剰発現する。いくつかの態様では、がんは化学療法に不応性である。
いくつかの態様では、該被験者は自己免疫疾患または疾病を罹患している。いくつかの態様では、自己免疫疾患または疾病は、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、または関節リウマチである。
いくつかの態様では、該被験者はリツキシマブに不応性である。
いくつかの態様では、該被験者は、化学療法、リツキシマブ、またはそれらの組み合わせで以前に治療されている。
いくつかの態様では、(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンおよび該抗CD20抗体または断片は連続的に投与される。
いくつかの態様では、(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンおよび該抗CD20抗体または断片は同時に投与される。いくつかの態様では、(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンおよび該抗CD20抗体または断片は、同一の医薬組成物中に含有される。いくつかの態様では、(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンおよび該抗CD20抗体または断片は、別々の医薬組成物中に存在する。
いくつかの態様では、該方法は、少なくとも1つの追加の治療薬を該被験者に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、その少なくとも1つの追加の治療薬は、プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））、カルフィルゾミブ（PR-171）、PR-047、ジスルフィラム、ラクタシスチン、PS-519、エポネマイシン、エポキソマイシン、アクラシノマイシン、CEP-1612、MG-132、CVT-63417、PS-341、ビニルスルホントリペプチド阻害剤、リトナビル、PI-083、(+/-)-7-メチルオムラリド、(-)-7-メチルオムラリド、レナリドミド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される。
いくつかの態様では、該方法は、少なくとも2つの追加の治療薬を該被験者に投与することをさらに含み、その少なくとも2つの追加の治療薬は、以下よりなる群から選択される：a) CHOP（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）；b) R-CHOP（リツキシマブ-CHOP）；c) ハイパーCV AD（多分割シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン、メトトレキサート、シタラビン）；d) R-ハイパーCV AD（リツキシマブ-ハイパーCV AD）；e) FCM（フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン）；f) R-FCM（リツキシマブ、フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン）；g) ボルテゾミブおよびリツキシマブ；h) テムシロリムスおよびリツキシマブ；i) テムシロリムスおよびベルケイド（登録商標）；j) ヨウ素-131 トシツモマブ（ベキサール（登録商標））およびCHOP；k) CVP（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）；l) R-CVP（リツキシマブ-CVP）；m) ICE（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；n) R-ICE（リツキシマブ-ICE）；o) FCR（フルダラビン、シクロホスファミド、リツキシマブ）；p) FR（フルダラビン、リツキシマブ）；およびq) D.T. PACE（デキサメタゾン、サリドマイド、シスプラチン、アドリアマイシン、シクロホスファミド、エトポシド）。
いくつかの態様では、B細胞を枯渇させる方法が提供される。いくつかの態様では、該方法は、B細胞を含む組成物を、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される、少なくとも1つの式Aの化合物、および(ii) 少なくとも1つの抗CD20抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む。
いくつかの態様では、アポトーシスを促進する方法が提供される。いくつかの態様では、該方法は、B細胞を、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される、少なくとも1つの式Aの化合物、および(ii) 少なくとも1つの抗CD20抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む。
いくつかの態様では、細胞周期の停止を促進する方法が提供される。いくつかの態様では、該方法は、細胞を、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される、少なくとも1つの式Aの化合物、および(ii) 少なくとも1つの抗CD20抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む。
いくつかの態様では、式Aの該化合物および該抗CD20抗体または断片は、連続的に送達される。
いくつかの態様では、式Aの該化合物および該抗CD20抗体または断片は、同時に送達される。いくつかの態様では、式Aの該化合物および該抗CD20抗体または断片は、同一の組成物中において送達される。いくつかの態様では、式Aの該化合物および該抗CD20抗体または断片は、別々の組成物中において送達される。
本発明では、キットもまた提供される。いくつかの態様では、該キットは、(i) 式Aの化合物、その立体異性体、その互変異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、および(ii) 該化合物を抗CD20抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための取扱説明書を含み、該抗CD20抗体または断片は、(a) ウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するか、(b) Fc-γRIII（CD16）に高親和性を示すか、または(c) フコース含有量が65%未満である。
いくつかの態様では、該キットは、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される、少なくとも1つの化合物、および(ii) 該化合物を抗CD20抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための取扱説明書を含む。
いくつかの態様では、該キットは、抗CD20抗体または断片をさらに含む。
いくつかの態様では、該キットは、(i) 少なくとも1つの抗CD20抗体またはその抗原結合断片、および(ii) 該抗CD20抗体または断片を、
2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
よりなる群から選択される、少なくとも1つの化合物と組み合わせて使用するための取扱説明書を含み、該抗CD20抗体またはその断片は、(a) ウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するか、(b) Fc-γRIII（CD16）に高親和性を示すか、または(c) フコースが65%未満である。
いくつかの態様では、該キットは、(i) 少なくとも1つの抗CD20抗体またはその抗原結合断片、および(ii) 該抗CD20抗体または断片を、
2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
よりなる群から選択される、少なくとも1つの化合物と組み合わせて使用するための取扱説明書を含む。
いくつかの態様では、該キットは、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
よりなる群から選択される化合物、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗CD20抗体またはその断片は、(a) ウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するか、(b) Fc-γRIII（CD16）に高親和性を示すか、または(c) フコース含有量が65%未満である。
いくつかの態様では、該キットは、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
よりなる群から選択される化合物、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含む。
いくつかの態様では、該抗CD20抗体または断片および該化合物は同一の組成物中に含有される。
いくつかの態様では、該抗CD20抗体または断片および該化合物は別々の組成物中に存在する。
いくつかの態様では、該キットは、1つ以上の追加的活性薬剤をさらに含む。
本明細書では、医薬組成物もまた提供される。いくつかの態様では、該医薬組成物は、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
よりなる群から選択される化合物、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含む。
いくつかの態様では、該医薬組成物は、(i) 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
よりなる群から選択される化合物、および
(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗CD20抗体または断片は、(a) ウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するか、(b) Fc-γRIII（CD16）に高親和性を示すか、または(c) フコース含有量が65%未満である。
図1は、式Aの化合物のS-異性体およびウブリツキシマブの、ヒト全血由来のCD19陽性細胞の枯渇（左）およびCD20陽性細胞の枯渇（右）に対する効果を示す、棒グラフである。 図2は、式Aの化合物のS-異性体およびウブリツキシマブの、LPS誘導性CD19陽性細胞増殖に対する効果を示す、棒グラフである。 図３は、式Aの化合物のS-異性体およびウブリツキシマブの、LPS誘導性CD20陽性細胞増殖に対する効果を示す、棒グラフである。 図4は、式Aの化合物のS-異性体およびウブリツキシマブの、Daudi、RPMI-8226、Raji、およびU266B1細胞におけるアポトーシスに対する効果を示す、棒グラフである。 図5は、式Aの化合物のS-異性体の、U226B1細胞の細胞周期に対する効果を示す、ヒストグラムである。 図6は、抗CD20抗体であるウブリツキシマブの、U226B1細胞の細胞周期に対する効果を示す、ヒストグラムである。 図7は、式Aの化合物のS-異性体および抗CD20抗体であるウブリツキシマブの、U226B1細胞の細胞周期に対する効果を示す、ヒストグラムである。 図8は、式Aの化合物のS-異性体の、Raji細胞の細胞周期に対する効果を示す、ヒストグラムである。 図9は、抗CD20抗体であるウブリツキシマブの、Raji細胞の細胞周期に対する効果を示す、ヒストグラムである。 図10は、式Aの化合物のS-異性体および抗CD20抗体であるウブリツキシマブの、Raji細胞の細胞周期に対する効果を示す、ヒストグラムである。 図11は、式Aの化合物のS-異性体およびウブリツキシマブの、LY1細胞におけるアポトーシスに対する効果を示す、カスパーゼ3活性のプロットである。 図12は、式Aの化合物のS-異性体およびウブリツキシマブの、Raji細胞におけるアポトーシスに対する効果を示す、カスパーゼ3活性のプロットである。
I. 定義
本発明を容易に理解するため、多数の用語および表現を以下に規定する。
「CD20」（また、Bリンパ球CD20抗原、MS4A1、Bリンパ球表面抗原B1、Bp35、白血球表面抗原Leu-16としても知られる）という用語は、別段の指示がない限り、あらゆる天然のCD20を指す。「CD20」という用語は、「全長の」未処理のCD20、および、細胞内での処理により得られるあらゆる形態のCD20を包含する。また、この用語は、CD20の自然発生の変異体、例えば、スプライス変異体、対立遺伝子変異体およびアイソフォームも包含する。本書で記載されるCD20ポリペプチドは、ヒト組織型または他のソース等の多様なソースから単離するか、または組み換えまたは合成法によって製造することができる。CD20配列の例としては、限定されないが、NCBI参照番号NP_068769.2およびNP_690605.1が挙げられる。
「抗体」という用語は、標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味し、標的としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質または前記の組み合わせ等が挙げられ、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位によって結合する。本書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷ポリクローナル抗体、無傷モノクローナル抗体、抗体断片（Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片等）、一本鎖Fv（scFv）突然変異体、少なくとも2つの無傷抗体から産生される二重特異性抗体等の多特異的抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定タンパク質を含む融合タンパク質、および、抗体が所望の生物活性を示す、抗原認識部位を含むあらゆる他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、α、δ、ε、γおよびμと称される重鎖定常領域の同一性に基づく、免疫グロブリンの5つの主要なクラス：それぞれ、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）のいずれであってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元配置を有する。抗体はネイキッドであるか、毒素、ラジオアイソトープ、タンパク質等の他の分子に結合することができる。
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、CD20等の、結合する抗原の生物活性を阻害または抑制するものである。ある態様では、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、実質的または完全に、抗原の生物活性を阻害する。望ましくは、生物活性は、10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、または100%まで抑制される。
「抗CD20抗体」または「CD20に結合する抗体」という用語は、抗体が、CD20をターゲットととする診断および／または治療薬として充分有用な親和性でCD20に結合する能力がある抗体を指す。抗CD20抗体の、関連性のない非CD20タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）で測定する場合、該抗体のCD20への結合の約10%未満である。ある態様では、CD20に結合する抗体の解離定数（Kd）は、≦1 μM、≦100 nM、≦10 nM、≦1 nM、または≦0.1 nMである。
「抗体断片」という用語は、無傷抗体の一部分を指し、また、無傷抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、一本鎖抗体、および抗体断片から形成される多特異的抗体が挙げられる。
「モノクローナル抗体」とは、単鎖抗原決定基、またはエピトープの高特異性の認識及び結合に関連する、均一抗体集団を指す。このことは、ポリクローナル抗体が典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むことと対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷および全長のモノクローナル抗体の両者、並びに抗体断片（Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等）、単鎖（scFv）変異体、抗体の一部を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む、あらゆる他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、およびトランスジェニック動物による方法等の、様々な方法で製造された抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、最小非ヒト（例えば、マウス）配列を含有するそれらの断片である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（CDR）由来の残基が、ヒト以外の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のCDRに由来し、所望の特異性、親和性、および能力を有する残基で置換された、ヒト免疫グロブリンである（ジョーンズ(Jones)ら、Nature, 321:522-525 (1986)；リーヒマン(Riechmann）ら、Nature, 332:323-327 (1988)；ヘルホイエン(Verhoeyen)ら、Science, 239:1534-1536 (1988))。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する、ヒト以外の種由来の抗体中の、対応する残基で置換される。ヒト化抗体は、Fvフレームワーク領域内および／または置換された非ヒト残基内のいずれかにおける追加的残基の置換によってさらに修飾して、抗体の特異性、親和性、および／または能力を改良および最適化し得る。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDR領域の全てまたは実質的に全てを含有する、少なくとも1つ、典型的には2つか3つの、可変領域を実質的に全て含み、一方、FR領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン・コンセンサス配列のものである。また、ヒト化抗体は、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含み得る。ヒト化抗体を産生するために使用される方法の例は、米国特許5,225,539号または5,639,641号に記載されている。
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域の、単独または組み合わせを指す。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる、3つの相補性決定領域（CDR）によって結合する4つのフレームワーク領域（FR）よりなる。各鎖のCDRは、FRによって非常に近接して、共に保持され、他の鎖に由来するCDRを用いて、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。CDRを決定する少なくとも2つの技術がある：(1) 異種間の配列変化に基づくアプローチ（即ち、カバト(Kabat)ら. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)）；および(2)抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（アルラジカニ(Al-lazikani)ら J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)）。加えて、CDRを決定する技術において、これら2つのアプローチの組み合わせを使用することがある。
可変領域（およそ、軽鎖の1〜107残基および重鎖の1〜113残基）中の残基に言及する場合、カバット・ナンバリング体系が一般的に使用される（例えば、カバット(Kabat)ら、Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991年)）。
カバット(Kabat)におけるアミノ酸位置のナンバリングは、カバットらの、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)における、抗体の集合体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域に使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変領域のFRまたはCDRの短縮またはそれらの挿入に対応するアミノ酸を、より少なく、または追加的に含有し得る。例えば、重鎖可変領域としては、H2の残基52の後の単一アミノ酸の挿入（カバットによる残基52a）および重鎖FR残基82の後の挿入残基（例えば、カバットによる残基82a、82b、および82c等）が挙げられる。所与の抗体の、残基のカバットによる番号付けは、「標準的な」カバットの番号付けされた配列を有する抗体の配列の相同領域でのアライメントによって決定し得る。また、コチア(Chothia)は、構造的ループの位置の代わりに参照する（コチアおよびレスク(Lesk)、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。コチアCDR-H1ループの末端は、カバットのナンバリング変換を使用して番号付けする場合、ループの長さによってH32とH34の間で変化する（これは、カバットの番号付けスキームが、H35AおよびH35Bに挿入を置き；35Aおよび35Bのいずれも存在しない場合は、ループは32位で終わ；35Aのみが存在する場合は、ループは33位で終わり；35Aおよび35Bの両者が存在する場合は、ループは34位で終わる）。AbM超可変領域は、カバットCDRとコチア構造ループとの妥協を示しており、Oxford Molecular’s AbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。
「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって製造される抗体、または、当業界で知られているあらゆる技術を使用してヒトによって製造された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、無傷または全長の抗体、その断片、および／または、例えばマウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体等の、少なくとも1つのヒト重鎖および／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、2つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖の両者の可変領域が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、哺乳類の一種（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、その種において免疫反応を引き起こすことを避けるため、別の種（通常はヒト）に由来する抗体中の配列に相同である。
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本書では同じ意味で使われ、特定の抗体によって認識され特異的に結合される能力がある抗原の一部を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次元の折り畳みによって並列する、隣接アミノ酸および非隣接アミノ酸の両者から形成し得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性に際して保持され、一方、三次元の折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的にはタンパク質変性に際して損なわれる。エピトープは、典型的には、少なくとも3つ、より一般的には、少なくとも5つまたは8〜10個のアミノ酸を独特の空間構造内に含む。
「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有相互作用の総計の強度を指す。本書で使用される場合、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）の要素間の1：1の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数（Kd）で表し得る。親和性は、本書で説明する方法等の、当業界で知られている通常の方法で測定し得る。低親和性の抗体は、一般的に、抗原にゆっくり結合し、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性の抗体は、一般的に、より迅速に結合し、より長く結合している傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当業界で知られており、本発明の目的のため、いずれの方法も使用することができる。具体的な実施態様を本書に記載する。
本書において結合親和性に言及するために使用する場合の「またはそれ以上」は、分子とその結合パートナーとの間のより強い結合を指す。本書で使用される場合、「またはそれ以上」は、より強い結合を指し、より小さい数値のKd値で表される。例えば、抗原に対する親和性が「0.6 nMまたはそれ以上」である抗体は、抗原に対する抗体の親和性が<0.6 nMであり、即ち0.59 nM、0.58 nM、0.57 nM等であるか、または0.6 nM未満のあらゆる値である。
本書で用いられる場合、「実質的により小さい」または「実質的に同一」という語句は、2つの数値（一般的に、1つは本発明の抗体に関連し、他方は参照／比較抗体に関連する）間の類似性が充分に高く、当業者が2つの値の間の差が、前記の値（例えば、Kd値）によって測定された生物学的特性の文脈内で、生物学的および／または統計的有意差が殆どまたは全くないと考えられることを示す。前記の2つの値の間の差は、参照／比較抗体の値の関数として、約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、または約10%未満である。
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然では見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物としては、天然で見られる形態ではない程度まで精製されたものが挙げられる。いくつかの態様では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
本書で用いられる場合、「実質的に純粋」とは、少なくとも50%純粋（即ち不純物がない）、少なくとも90%純粋、少なくとも95%純粋、少なくとも98%純粋、または少なくとも99%純粋である物質を指す。
「がん」および「がん性の」という用語は、哺乳類において、細胞集団の無秩序な細胞増殖が特徴である、生理学的状態を言い、または説明する。がんの例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このようながんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化管がん、膵臓がん、グリア肉腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、大腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がんよび多様なタイプの頭部および頸部がんが挙げられる。
「腫瘍」および「新生物」は、前がん病変を含む、良性（非がん性）または悪性（がん性）のいずれかの、過剰な細胞生長または増殖による組織のあらゆる塊を指す。
「がん細胞」、「腫瘍細胞」という用語、および文法的に同意義の用語は、腫瘍または前がん病変に由来する細胞集団全体を指し、腫瘍細胞集団の大部分を含む非腫瘍形成性細胞、および腫瘍形成性幹細胞（がん幹細胞）の両者を含む。本書で用いられる場合、「腫瘍細胞」という用語は、再生および分化する能力がない腫瘍細胞のみに言及する場合、「非腫瘍形成性」という用語で修飾し、腫瘍細胞をがん幹細胞と区別する。
「被験者」という用語は、あらゆる動物（例えば、哺乳類）を指し、ヒトに限定しないが、ヒト以外の霊長類、齧歯類等を含み、特定の治療のレシピエントとなる。本書では、ヒト被験者に関しては、典型的には、「被験者」および「患者」という用語は同じ意味で使われる。
細胞「集団」は、単一細胞または多細胞に言及し得る。1個または複数の細胞は、培養細胞または生体内の細胞であり得る。例えば、細胞集団は、被験者または患者内に存在し得る。
「薬学的製剤」という用語は、有効成分の生物学的活性が有効であり得る形態であり、かつ製剤が投与される患者に許容されない毒性を有する追加要素を含有しない製剤を指す。このような製剤は無菌であり得る。
本書で開示される場合、抗体の「有効量」は、具体的に述べた目的を実施する充分量である。「有効量」は、記載した目的に関連して、経験的に、かつ通常の方法で決定し得る。
「治療的有効量」という用語は、抗体または他の薬剤が、被験者または哺乳類の疾患または疾病を「治療する」ために有効な量を指す。がんの場合、治療的有効量の薬剤は、がん細胞の数を低下させ、腫瘍の大きさを縮小し、がん細胞の末梢器官中への浸潤を阻害し（即ち、ある程度遅くし、ある態様では停止させる）、腫瘍の転移を阻害し（即ち、ある程度遅くし、ある態様では停止させる）、腫瘍の成長をある程度阻害し、および／または、がんに関連する1つ以上の兆候をある程度回復させることが可能である。本書における「治療」の定義を参照のこと。薬剤が存在するがん細胞の成長を阻害し、および／またはがん細胞を殺す限り、その薬剤は、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性があり得る。「予防的有効量」とは、所望の予防効果を達成するために必要な投与量および期間での有効量を指す。必然ではないが、予防的投与量は、典型的には疾患の早期以前または早期に被験者に使用するため、予防的有効量は治療的有効量より少ないと考えられる。
「治療する」または「治療」または「治療すること」または「緩和する」または「緩和すること」等の用語は、1) 診断された病態または疾病を、治し、減速し、それらの症状を軽減し、および／または、それらの進行を停止させる、治療的手段、および2) 標的とされる病態または疾病の進行を予防および／または減速する、予防的手段の、両者を指す。従って、治療が必要とされる被験者としては、既に疾病を有する被験者；疾病を有する傾向がある被験者；および、疾病が予防されるべき被験者が挙げられる。ある態様では、患者が以下の1つ以上を示す場合、被験者は、本発明の方法によってがんの「治療」に成功したとする：悪液質の減少、生存期間の延長、腫瘍進行時間の伸長、腫瘍量の減少、全身腫瘍組織量の減少、および／または、腫瘍転移、腫瘍再発までの時間の伸長、腫瘍反応、完全寛解、部分反応、安定疾患、進行性疾患、無進行生存（PFS）、全生存（OS）であり、それぞれは、新薬承認のため、米国国立がん研究所および米国食品医薬品局が規定した標準的方法によって測定する。ジョンソン(Johnson)ら、J. Clin. Oncol. 21(7):1404-1411 (2003)を参照のこと。
抗CD20抗体とPI3Kδ選択的阻害剤との「組み合わせ」は、抗CD20抗体またはその断片と、本書で規定される化合物Aを指し、それらは、同一の細胞集団または同一の被験者に、同時に、連続的に、または同時にかつ連続的に、投与することを目的としている。従って、例として、化合物Aの投与の前または後（例えば、1時間、1日、1週間または1ヶ月）に抗CD20抗体またはその断片を投与することは、抗CD20抗体またはその断片と化合物Aとの組み合わせの投与となる。加えて、抗CD20抗体またはその断片と化合物Aとの同時投与も、抗CD20抗体またはその断片と化合物Aとを、一つの医薬製剤において一緒に投与するか、別々の医薬製剤中で同一または異なる投与経路で同時に投与するかに拘わらず、抗CD20抗体またはその断片と化合物Aとの組み合わせの投与となる。
抗CD20抗体による治療に対して、「反応しない」、「反応性が乏しい」、または「不応性である」腫瘍は、一般に認められている動物モデルまたはヒトの臨床試験において非処置またはプラセボ処置と比較した場合、抗CD20抗体治療に対する反応において統計的に有意な改善が見られず、抗CD20抗体による初期の治療には反応するが、治療を継続するにつれて成長する。
腫瘍または細胞型の抗CD20抗体に反応する能力は、RajiまたはWil2-S等の実験的細胞株または患者のドナー細胞株を用いて試験し得る。加えて、活性は、B細胞ディプリーションアッセイ、例えば患者の全血中のB細胞ディプリーションアッセイで測定し得る。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本書では同じ意味で使われるが、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらのアナログ、または、DNAまたはRNAポリメラーゼによってポリマー中に組み込むことができるあらゆる基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログ等の、修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造が修飾される場合、ポリマーの集合の前か後に修飾され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識化要素との結合等によってさらに修飾され得る。他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」と呼ばれる、1以上の自然発生ヌクレオチドのアナログでの置換；ヌクレオチド間の修飾、例えば、非荷電性結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）および荷電性結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、単一ペプチド、ply-L-リシン等）等の懸垂部分を含有するもの、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラーレン等）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ボロン、酸化金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合（例えば、αアノマー核酸等）を有するもの；および、修飾されない形態のポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、糖類中に一般的に存在するいずれのヒドロキシル基も、例えば、標準的な保護基で保護されるか、さらなるヌクレオチドとさらなる結合を作るために活性化された、ホスホネート基、ホスフェート基で置換されてもよく、または、固体担体と結合してもよい。5’および3’末端のOHは、リン酸化されるか、アミンまたは炭素数1〜20の有機キャッピング基部分で置換されてもよい。他のヒドロキシル基も、標準的な保護基に誘導化されてもよい。また、ポリヌクレオチドは、当業界で一般的に知られている、リボースまたはデオキシリボース糖のアナログ形態を含有してもく、例えば、2'-O-メチル-、2'-O-アリル、2'-フルオロ-または2'-アジド-リボース、炭素環糖アナログ、α-アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、およびメチルリボシド等の脱塩基ヌクレオシドアナログが挙げられる。1以上のホスホジエステル結合は、別の結合基で置換され得る。これらの別の結合基としては、限定されないが、ホスフェートがP(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、COまたはCH2（「ホルムアセタール」）によって置換された態様が挙げられ、ここで、RまたはR’はそれぞれ独立して、Hまたは、置換または非置換の、任意にエーテル（-O-）結合を含有するアルキル（1-20C）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルキルである。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。前述の説明は、RNAおよびDANを含む、本書で言及された全てのポリヌクレオチドに適用される。
「ベクター」という用語は、ホスト細胞中、関心のある1以上の遺伝子または配列を送達、および発現する能力のある構成物を意味する。ベクターの例としては、限定されないが、ウィルス性ベクター、ネイキッドDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン縮合剤に関連するDNAまたはRNA発現ベクター、リポソーム中に封入されたDNAまたはRNA発現ベクター、およびプロデューサー細胞等の、ある真核細胞が挙げられる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本書では同じ意味で使われ、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖状または分枝鎖状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、かつ、非アミノ酸で中断されてもよい。また、これらの用語は、自然に修飾されたか、介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、糖化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、標識化要素との結合等のあらゆる他の操作または修飾が挙げられる。また、この規定内には、例えば、アミノ酸の1以上のアナログを含有するポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸等を含む）、並びに当業界で知られている他の修飾も含まれる。本発明のポリペプチドは抗体を基礎としているため、ある態様では、該ポリペプチドは単鎖または関連する鎖として存在し得る可能性があることが理解される。
2以上の核酸またはポリペプチドについての文脈で、最大一致(maximum correspondence)を比較またはアラインメント（要すれば、ギャップを形成）するが、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を全く考慮しない場合、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、同一であるか、または、特定のパーセンテージの同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、2以上の配列またはサブ配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを用いるか、目視検査によって測定し得る。多様なアルゴリズムおよびソフトウェアが当業界で知られており、アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用し得る。このような配列アラインメントアルゴリズムの非限定的な例の1つは、カーリン(Karlin)ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268 (1990)に記載されたアルゴリズムであり、カーリンら、Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877 (1993) によって修飾され、NBLASTおよびXBLASTプログラム（アルチュル(Altschul)ら、Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1991)）に取り入れられている。ある態様では、アルチュルら、Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)に記載された様に、ギャップを形成したBLASTを使用し得る。さらに、BLAST-2、WU-BLAST-2（アルチュルら、Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)）、ALIGN、ALIGN-2（ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）またはMegalign（DNASTAR）は、配列のアラインメントを作るために使用し得る、公的に入手可能なソフトウェアプログラムである。ある態様では、2つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアのGAPプログラムを使用して決定される（例えば、NWSgapdnaを使用。CMPマトリックスおよびギャップウェイトが40、50、60、70、または90およびレングスウェイト(length weight)が1、2、3、4、5、または6）。ある別の態様では、ニードルマン(Needleman)およびヴンシュ(Wunsch)のアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）が組み込まれたGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムが、2つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を決定するために使用し得る（例えば、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかを使用し、ギャップウェイトは16、14、12、10、8、6、または4であり、レングスウェイトは1、2、3、4、5である）。または、ある態様では、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ミエールズ(Myers)およびミラー(Miller)のアルゴリズム（CABIOS, 4:11-17 (1989)）を用いて決定する。例えば、パーセント同一性は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）および、残基表、ギャップレングスペナルティが12で、ギャップペナルティが4であるPAM120を用いて決定し得る。特別のアライメントソフトウェアによる最大アライメントについての適宜のパラメーターは、当業者が決定し得る。ある態様では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメーターを使用する。ある態様では、第二の配列のアミノ酸に対する第一のアミノ酸配列のパーセント同一性「X」は、100 x(Y/Z)として計算され、ここでYは、第一および第二の配列のアライメントにおいて完全一致として記録されるアミノ酸残基の数であり（目視検査または特定の配列アラインメントプログラムによってアライメントを行う）、Zは第二の配列中の残基の総数である。第一の配列の長さが第二の配列よりも長い場合、第二の配列に対する第一の配列のパーセント同一性は、第一の配列に対する第二の配列のパーセント同一性より長くなるであろう。
非限定的例として、いずれかの特定のポリヌクレオチドが参照配列に対してあるパーセントの配列同一性（即ち、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一であり、いくつかの態様では、少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%同一である）を有するかどうかは、ある態様では、ベストフィット(Bestfit)プログラム（ウィスコンシン配列分析パッケージ(Wisconsin Sequence Analysis Package)、Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, マジソン、米国ウィスコンシン州WI 53711）を用いて決定し得る。ベストフィットは、スミス(Smith)およびウォーターマン(Waterman)、Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)のローカル・ホモロジーアルゴリズムを用い、2つの配列間の最良の相同性断片を検出する。ベストフィットまたはあらゆる他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に95%同一であるかどうかを決定する場合、パラメーターは、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長に渡って計算され、参照配列中、ギャップの相同性がヌクレオチド総数の5%以下となるように設定される。
いくつかの態様では、配列比較アルゴリズムを用いるか目視検査によって測定した、最大一致(maximum correspondence)を比較またはアラインメントする場合、本発明の2つの核酸またはポリヌクレオチドは実質的に同一であり、即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%同一であり、いくつかの態様では、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%である。ある態様では、配列の長さが少なくとも約10、約20、約40〜60残基であるか、その間のあらゆる整数の残基数の長さの配列領域にわたって同一性があるか、または、60〜80残基より長い領域、少なくとも約90〜100残基にわたって同一性があり、或いは、配列は、例えばヌクレオチド配列のコーディング領域等の、比較されている配列の全長にわたって実質的に同一である。
「保存的アミノ酸置換」は、1個のアミノ酸残基が、類似した側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で規定されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝状側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、フェニルアラニンのチロシンでの置換は、保存的置換である。ある態様では、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の、抗原、即ち、ポリペプチドまたは抗体が結合するFOLR1への結合を損なわない。抗原の結合を断ち切らない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を特定する方法は、当業界でよく知られている（例えば、ブランメル(Brummell)ら、Biochem. 32: 1180-1 187 (1993)；コバヤシ(Kobayashi)ら、Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；およびバークス(Burks)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)参照）。
量、物質の割合、物質の物理的性質、および／または使用を示す、本開示における全ての数は、他に明確に示されている場合を除き、「約」という言葉に修飾されていると理解すべきである。「約」という用語は、数または数値範囲に言及する場合、言及される数または数値範囲が実験的変動内（または統計的実験誤差内）の近似値であることを意味し、従って、これらの数または数値範囲は、例えば述べられた数または数値範囲の1％〜15%の間で変化し得る。
本発明の化合物は、1以上の不斉中心（キラル中心）を含有し得るため、エナンチオマー、ジアステレオマー、および絶対立体化学で(R)-または(S)-と規定され得る他の立体異性体が生じ得る。本開示は、全てのこのような可能な形態、およびそれらのラセミ形態および分割形態、およびそれらの混合物を包含することが意図されている。個々のエナンチオマーは、本開示を勘案し、当業界で知られている方法によって分離し得る。
本書で使用される場合、「立体異性体」という用語は、空間において分子中の原子の配向のみが異なる、個々の分子の全ての異性体を指す、一般的な用語である。立体異性体は、互いに鏡像ではない、1つより多いキラル中心を有する化合物（ジアステレオマー）の、エナンチオマーおよび異性体を含む。
「キラル中心」という用語は、4つの異なる基が結合している炭素原子を言う。
「エナンチオマー」および「エナンチオマーの」という用語は、その鏡像に重ね合わせることができず、故に光学活性である分子を言い、エナンチオマーは一方向に偏光面を回転させ、その鏡像化合物は偏光面を反対方向に回転させる。
「ラセミ」という用語は、エナンチオマーの等量の混合物を言い、混合物は光学活性ではない。
「分割」という用語は、分子の2つのエナンチオマー形態のうちの一方の分離、濃縮または枯渇を言う。
本開示は、本発明の化合物の溶媒和物を包含する。溶媒和物は、典型的には、該化合物の生理学的活性または毒性を大きく変えず、薬理学的等価物として機能し得る。本書で使用される場合、「溶媒和物」という用語は、本開示の化合物の溶媒分子との組み合わせ、物理的関連性および／または溶媒和を言い、例えば、ジソルベート、モノソルベートまたはヘミソルベートであり、溶媒分子の本開示の化合物に対する比は、それぞれ、約2：1、約1：1または約1：2である。この物理的関連性は、水素結合を含む、様々な程度のイオンおよび共有結合に影響する。ある例では、溶媒和物は、1以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子中に取り込まれる場合等で単離し得る。従って、「溶媒和物」は、溶液相と単離可能な溶媒和物の両者を包含する。本発明の化合物は、水、メタノール、エタノール等の、薬学的に許容される溶媒との溶媒和形態で存在し得るが、本開示は、本発明の化合物の溶媒和形態と非溶媒和形態の両者を含む。溶媒和物の1つのタイプは水和物である。「水和物」は、溶媒分子が水である、溶媒和物の特定のサブグループに関係する。溶媒和物は、典型的には、薬理学的等価物として機能し得る。溶媒和物の製造は、当業界で知られている。例えば、M.ケイラ(Caira)ら、J. Pharmaceut. Sci., 93(3):601-611 (2004)；E.C.ファントンデル(van Tonder)ら、AAPS Pharm. Sci. Tech. 5(1):Article 12 (2004)；およびA.L.ビンガム(Bingham)ら、Chem. Commun. 603-604 (2001)参照のこと。代表的な、非限定的な、溶媒和物の製造方法は、本発明の化合物を所望の溶媒（有機、水、またはそれらの混合物）中に約20〜約25℃の温度で溶解し、その後、溶液を結晶を形成するのに十分な速度で冷却し、例えば濾過等の知られている方法で結晶を単離することを含む。赤外分光等の分析技術を使用して、溶媒和物の結晶中の溶媒の存在を確認し得る。
「プロドラッグ」という用語は、化合物の不活性な前駆体であって、体内で通常の代謝過程によって活性型に変換される化合物を言う。プロドラッグの設計は、一般的には、ハードマ(Hardma)ら編、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th ed., pp. 11-16 (1996)において議論されている。徹底的な議論が、ヒグチ(Higuchi)ら、Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, ASCD Symposium Series、およびロシュ(Roche)編、Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987)においてなされている。説明すると、プロドラッグは、例えばエステルまたはアミド結合の加水分解によって薬理学的活性体に変換され、それにより、得られる生成物に官能基を導入または暴露する。プロドラッグは、内因性化合物と反応して、例えば循環半減期を延長する等、化合物の薬理学的特性をさらに強める水溶性複合体を形成するように設計し得る。或いは、プロドラッグは、例えばグルクロン酸、硫酸エステル、グルタチオン、アミノ酸、または酢酸エステルを有する官能基に対し、共有結合修飾を受けるように設計し得る。得られる複合体は、不活化されて尿中に排泄されるか、親化合物より強力な状態になり得る。高分子量の複合体もまた、胆汁中に排泄され、酵素的切断を受け、血液循環中に再度放出されることにより、当初投与された化合物の生物学的半減期を有効に延長し得る。本発明の化合物のプロドラッグは、本発明の範囲に含まれることが意図される。
本発明は、1以上の同位体濃縮原子の存在のみが異なる化合物、例えば、水素をジュウテリウムまたはトリチウムで置換したもの、または炭素を13C-または14C-濃縮炭素で置換したものも含む。本発明の化合物は、化合物を構成する1以上の原子で、非天然の比率の原子同位体を含んでもよい。例えば、該化合物は、例えばトリチウム（3H）、ヨウ素-125（125I）または炭素-14（14C）等の放射性同位体で放射標識してもよい。本発明の化合物の全ての同位体的な変化体は、放射性であってもなくとも、本発明の範囲内に包含される。
本開示は、さらに、非毒性の薬学的に許容される塩等の、本発明の化合物の塩を包含する。薬学的に許容される付加塩の例としては、無機および有機酸付加塩および塩基性塩が挙げられる。薬学的に許容される塩としては、限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩等の金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン塩等の、有機アミン塩；塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩；クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、酢酸塩、ジクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、パルミチン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩、グリセロリン酸塩、ケトグルタル酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、チロシン、シスチン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、オルニチン、リシン、アルギニン、およびセリン等の天然アミノ酸の塩；およびD-異性体または置換アミノ酸等の非天然アミノ酸の塩；グアニジンの塩；および置換グアニジンの塩であって、置換基は、ニトロ、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アンモニウムより選択されるもの、または置換アンモニウム塩およびアルミニウム塩が挙げられる。
生物学的活性剤に用いられる「選択的阻害剤」という用語は、非特異的なシグナル伝達活性と比較して、薬剤との直接または間接的な相互作用によって、標的シグナル伝達活性を選択的に低下させる薬剤の能力を言う。
「PI3Kδ選択的阻害剤」という用語は、本書で規定される化合物Aを言い、これはPI3Kδアイソフォームの活性を、PI3Kファミリーの他のアイソフォーム（α、β、およびγ）よりも効果的に、選択的に阻害する。例えば、式Aの化合物は、δ型のPI3Kキナーゼに関して、他のPI3Kアイソフォームの残り（α、β、およびγ）に関する阻害剤のIC50よりも、少なくとも20倍低い50%阻害濃度（IC50）を示す化合物であり得る。
PI3Kδの阻害は、様々な症状、例えば、限定されないが、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、および関節炎疾患等の、炎症性反応が特徴である症状の治療において、治療上有効である可能性がある。重要なことは、PI3Kδ機能の阻害は、生存率および出生率等の生物学的機能に影響するとは思われない。
本書で使用される場合、「炎症性反応」は、発赤、熱、腫脹および疼痛（即ち、炎症）が特徴であり、典型的には、組織の損傷および破壊に関与する。炎症性反応は、通常は、組織の損傷または破壊によって引き起こされる限局性の保護反応であり、障害性物質および損傷組織の両者を破壊、希釈または包囲（隔離）する役割を果たす。免疫反応は、特に、白血球の流入および／または白血球（例えば、好中球）走化性に関連する。免疫反応は、病原体およびウィルスの感染、外傷または、心筋梗塞または脳卒中後の再灌流等の非感染性手段、外来抗原に対する免疫反応、および自己免疫疾患に起因し得る。本発明による方法および化合物を用いて治療が可能である免疫反応は、特異的防御システムの反応に関連する症状、並びに、非特異的防御システムの反応に関連する症状を包含する。
本発明の治療方法としては、炎症細胞の活性化に関連する症状の治療方法が挙げられる。「炎症細胞の活性化」は、増殖細胞反応の刺激（限定されないが、サイトカイン、抗原または自己抗体を含む）による誘導、可溶性メディエーター（限定されないが、サイトカイン、酸素ラジカル、酵素、プロスタノイド、または血管作用性アミンを含む）の産生、または、炎症細胞（限定されないが、単球、マクロファージ、Tリンパ球、Bリンパ球、顆粒球（好中球、好塩基球、および好酸球等の多形核白血球）、肥満細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、および内皮細胞）における新規または増加したメディエーター（限定されないが、主要な組織適合性抗原または細胞接着分子）の細胞表面発現を言う。これらの細胞におけるこれらの表現型の1つまたは組み合わせの活性化は、炎症症状の開始、永続化、または悪化に関与することは、当業者に理解されるであろう。
本書で使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、組織損傷が身体自身の構成要素に対する体液性または細胞性反応に関連する、あらゆる疾病群を言う。
本書で使用される場合、「移植拒絶反応」という用語は、移植された組織（器官または細胞を含み、例えば、骨髄）に対する免疫反応（移植された組織および周辺組織の機能の喪失、疼痛、腫脹、白血球増加、および血小板減少を特徴とする）を言う。
本書で使用される場合、「アレルギー性疾患」という用語は、アレルギーに起因するあらゆる兆候、組織の損傷、または組織機能の損失を言う。
本書で使用される場合、「関節炎疾患」という用語は、様々な病因に起因する関節の炎症性病変を特徴とする、あらゆる疾患を言う。
本書で使用される場合、「皮膚炎」という用語は、様と々な病因に起因する皮膚の炎症を特徴とする、大分類の皮膚疾患の全てを言う。
本書で使用される場合、「相乗効果」と言う用語は、化合物の組み合わせによって生み出される、相加効果を上回る治療効果を言い、組み合わせを用いて得られる治療効果は、化合物単独の個々の投与で得られる相加効果を超える。本発明の態様としては、血液がんの治療において相乗効果を生み出す方法が挙げられ、ここで、該効果は、対応する相加効果より、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも500%、または少なくとも1000%大きい。
本書で使用される場合、「治療的相乗効果」とは、抗CD20抗体の化合物Aとの組み合わせが、抗CD20抗体とPI3Kδ選択的阻害剤とをそれぞれ単独で使用した場合の相加効果より大きい、治療時の治療効果を生み出すことを意味する。
本開示および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」および「the」は、文脈で他に明確に定めない限りは、複数形を含む。
本書において、態様が「〜を含む(comprising)」という文体で記載される場合は、「〜よりなる(consisting of)」および／または「実質的に〜よりなる(consistingessentially of)」という用語で記載された他の類似の態様もまた提供されることが理解される。
II. PI3Kδ選択的阻害剤
本書に記載されている通り、抗CD20抗体およびその抗原結合断片と組み合わせて使用される、PI3Kδ選択的阻害剤は、式Aの化合物：
およびその立体異性体、その互変異性体、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグである。
1つの態様では、抗CD20抗体およびその抗原結合断片と組み合わせて使用される化合物Aは、(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグである。本書では、この立体異性体は「式Aの化合物のS-異性体」、「S-異性体」、「TGR-1202」および「RP5307」とも言う。
別の態様では、抗CD20抗体およびその抗原結合断片と組み合わせて使用される化合物Aは、(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグである。
これらの化合物の化学構造を以下に示す：
III. 抗CD20抗体
CD20は、ヒトおよびマウスにおいて、主にプレB細胞および成熟末梢B細胞で発現する、テトラスパニング膜貫通リン・タンパク質である。ヒトにおいて、CD20は、殆どの成熟B細胞悪性腫瘍に対しても、強力かつ一様に発現する。
本書で示される場合、抗CD20抗体およびその抗原結合断片は、PI3Kδ選択的阻害剤と組み合わせて使用し得る。
多数の抗CD20抗体が知られており、例えば、ウブリツキシマブ、リツキシマブ、オファツムマブ（HuMax; Intracel）、オクレリズマブ、ベルツズマブ、GA101（オビヌツズマブ）、AME-133v（Applied Molecular Evolution）、オカラツズマブ（Mentrik Biotech）、PRO131921、トシツモマブ、イブリツモマブ-チウキセタン、hA20（Immunomedics, Inc.）、BLX-301（Biolex Therapeutics）、レディタクス（Dr. Reddy’s Laboratories）、およびPRO70769（国際特許第WO2004/056312号に記載）が挙げられる。
ウブリツキシマブ（UtuxinTM、LFB-R603、TG20、EMAB603）は、CD20上の特異的で独特のエピトープを標的とし、臨床活性および有効性を高めるためにバイオエンジニアリングによって作られた、モノクローナル抗体である。
リツキシマブは、CD20抗原に対する、遺伝子操作されたマウス‐ヒトキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブは、米国特許第5,736,137号では、「C2B8」と呼ばれる抗体である。リツキシマブ抗体のアミノ酸配列および、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞での組み換え発現によるその製造方法の例が、米国特許第5,736,137号に開示されており、その内容を参照することによって本明細書に援用する。
オファツムマブは、抗CD20 IgG1κヒトモノクローナル抗体である。研究により、オファツムマブはCD20から解離するが、リツキシマブと比較して解離速度は遅く、細胞膜近傍のエピトープに結合することが示されている。ツァン(Zhang)ら、Mabs 1: 326-331 (2009)。エピトープのマッピングにより、オファツムマブは、リツキシマブが標的とする位置よりも、CD20のN-末端により近いエピトープに結合し、抗原の細胞外ループを含むことが示された。Id.
従って、いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその断片は、ウブリツキシマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、GA101、AME-133v、PRO131921、トシツモマブ、hA20、またはPRO70769と同じエピトープに結合する抗体よりなる群から選択される。いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその断片は、ウブリツキシマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、GA101、AME-133v、PRO131921、トシツモマブ、hA20、PRO70769、またはその断片である。
いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその断片は、ウブリツキシマブと同じエピトープに結合する。いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその断片は、CD20のアミノ酸N153-S179を含む配列に結合する。いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその断片は、CD20のアミノ酸N153-S179における不連続エピトープに結合する。
いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその断片は、解離定数Kdが、約10-7 M未満、約10-8 M未満または約10-9 M未満であることが特徴の親和性で、CD20に結合する。いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその断片は、解離定数Kdが10-10〜10-9Mであることが特徴の親和性で、CD20に結合する。いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその断片は、解離定数Kdが0.7 x 10-9 Mであることが特徴の親和性で、CD20に結合する。抗体結合解離定数の文脈において使用される場合、「約」という用語は、抗体親和性の測定に使用される方法に固有の、変化の程度を考慮に入れるものである。例えば、使用される機器の正確性のレベル、測定するサンプル数に基づく標準誤差、および丸め誤差によって、「約10-2 M」という用語は、例えば、0.05 Mから0.005Mまでを含む可能性がある。
いくつかの態様では、抗CD20抗体は、Fc-γRIII（CD16）に対して高い親和性を示す。いくつかの態様では、CD16に対して抗体のFc領域が高親和性である結果、このような抗体は、IgGポリクローナル抗体、特に血清中に存在するIgGでは置換されない。いくつかの態様では、例えば、スキャッチャード分析またはBIAcore技術（無標識表面プラズモン共鳴に基づく技術）によって測定する場合、抗体がCD16（例えば、マクロファージ上で発現）に結合する際の親和性は、少なくとも2 x 106 M-1、少なくとも2 x 107 M-1、2 x 108 M-1または2 x 107 M-1である。
いくつかの態様では、抗CD20抗体は、そのFc領域におけるフコース含有量が低いことを特徴とするグリコシル化パターンを示す。例えば、いくつかの態様では、組成物は、Fc-γグリコシル化部位（Asn 297、EUナンバリング）に結合したN-グリコシド結合糖鎖を含む、抗CD20抗体を含むが、組成物の全ての抗体のN-グリコシド結合糖鎖の中で、フコース含有量は、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、45%未満、または40%未満である。いくつかの態様では、組成物の全ての抗体のN-グリコシド結合糖鎖の中で、フコース含有量は、15〜45%または20〜40%である。
いくつかの態様では、抗CD20抗体は、強力なインビトロの抗体依存性細胞毒性（ADCC）を示す。いくつかの態様では、抗CD20抗体は、健常人ドナー由来のナチュラルキラー細胞（NK）を用い、50 ng/mlの濃度で、ADCCプラトーを少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、または少なくとも約30%生み出す。ADCCを測定する技術は当業界では知られており、例えば、ロメアフ(Romeauf)ら、British Journal of Haematology 140: 635-643 (2008)に掲載されている。いくつかの態様では、抗CD抗体は、健常人ドナーからのNK細胞を用い、50 ng/mlの濃度で、ADCCプラトーを約35%生み出す。
いくつかの態様では、抗CD20抗体は、NF-κ-B活性を低下させ得る。いくつかの態様では、抗CD20抗体は、SNAIL発現を低下させ得る。いくつかの態様では、抗CD20抗体は、RKIP活性を高め得る。いくつかの態様では、抗CD20抗体は、PTEN活性を高め得る。いくつかの態様では、抗CD20抗体は、TRAIL-アポトーシスに対する細胞の感受性を亢進し得る。
いくつかの態様では、抗CD20抗体は、最適化されたFc-γ-RIIIA（CD16）である。タイプIIIFc受容体を活性化する能力があり、特定のグリカン構造を有する抗体は、例えば、米国特許第7,931,895号に記載されており、その内容を参照することによって本明細書に援用する。従って、いくつかの態様では、米国特許第7,931,895号に記載された通り、抗CD20抗体は、Asn 297（EUナンバリング）に対し、二分岐および／またはオリゴマンノシド型のN-グリコシル化により修飾される。免疫系のエフェクター細胞の受容体CD16に対して強い親和性を有する抗体の産生方法は、例えば、米国出願公開第2005/0271652号に示されており、その内容を参照することによって本明細書に援用する。
いくつかの態様では、抗CD20抗体は、高いADCC活性を有する。高いADCC活性を有する抗体の製造方法は、例えば、米国特許第7,713,524号に示されており、その内容を参照することによって本明細書に援用する。
ウブリツキシマブは、以下に示される抗体配列を含む：
可変重鎖CDR1: Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn (配列番号1)
可変重鎖 CDR2: Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr (配列番号2)
可変重鎖 CDR3: Ala Arg Tyr Asp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr (配列番号3)
可変重鎖:
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Asp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser (配列番号4)
定常領域重鎖:
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys (配列番号5)
可変軽鎖 CDR1: Ser Ser Val Ser Tyr (配列番号6)
可変軽鎖 CDR2: Ala Thr Ser (配列番号7)
可変軽鎖 CDR3: Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr (配列番号8)
可変軽鎖 :
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys (配列番号9)
定常領域軽鎖:
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (配列番号10)
従って、いくつかの態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、免疫グロブリン重鎖可変領域（VH領域）を含むか、実質的に該VH領域よりなるか、または該VH領域よりなり、該VH領域のCDRの少なくとも1つ（即ち、1つ、2つ、または3つ）は、配列番号1、2、または3のCDR1、CDR2またはCDR3領域に、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または同一であるアミノ酸配列を有し、該VH領域を含む抗体またはその抗原結合断片は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、免疫グロブリン重鎖可変領域（VH領域）を含むか、実質的に該VH領域よりなるか、または該VH領域よりなり、該VH領域のCDRの少なくとも1つ（即ち、1つ、2つ、または3つ）は、1、2、3、4、または5つの保存アミノ酸置換以外は、配列番号1、2、または3のCDR1、CDR2またはCDR3領域に同一であるアミノ酸配列を有し、該VH領域を含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、配列番号4のVHアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有するVH領域を含むか、実質的に該VH領域よりなるか、または該VH領域よりなり、該VH領域を含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、配列番号4および5を含む重鎖アミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖を含むか、実質的に該重鎖よりなるか、または該重鎖よりなり、該重鎖を含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
いくつかの態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL領域）を含むか、実質的に該VL領域よりなるか、または該VL領域よりなり、該VL領域のCDRの少なくとも1つ（即ち、1つ、2つ、または3つ）は、配列番号6、7、または8のCDR1、CDR2またはCDR3領域に、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または同一であるアミノ酸配列を有し、該VL領域を含む抗体またはその抗原結合断片は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL領域）を含むか、実質的に該VL領域よりなるか、または該VL領域よりなり、該VL領域のCDRの少なくとも1つ（即ち、1つ、2つ、または3つ）は、1、2、3、4、または5つの保存アミノ酸置換以外は、配列番号6、7、または8のCDR1、CDR2またはCDR3領域に同一であるアミノ酸配列を有し、該VL領域を含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、配列番号9のVLアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有するVL領域を含むか、実質的に該VL領域よりなるか、または該VL領域よりなり、該VL領域を含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、配列番号9および10を含む重鎖アミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖を含むか、実質的に該軽鎖よりなるか、または該軽鎖よりなり、該軽鎖を含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
いくつかの態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、免疫グロブリン重鎖可変領域（VH領域）および免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL領域）を含むか、実質的に該VH領域およびVL領域よりなるか、または該VH領域およびVL領域よりなり、該VH領域のCDRの少なくとも1つ（即ち、1つ、2つ、または3つ）は、配列番号1、2、または3のCDR1、CDR2またはCDR3領域に、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または同一であるアミノ酸配列を有し、該VL領域のCDRの少なくとも1つ（即ち、1つ、2つ、または3つ）は、配列番号6、7、または8のCDR1、CDR2またはCDR3領域に、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、該VH領域およびVL領域（を含む抗体またはその抗原結合断片は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、免疫グロブリン重鎖可変領域（VH領域）、および免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL領域）を含むか、実質的に該VH領域およびVL領域よりなるか、または該VH領域およびVL領域よりなり、該VH領域のCDRの少なくとも1つ（即ち、1つ、2つ、または3つ）は、1、2、3、4、または5つの保存アミノ酸置換以外は、配列番号1、2、または3のCDR1、CDR2またはCDR3領域に同一であるアミノ酸配列を有し、該VL領域のCDRの少なくとも1つ（即ち、1つ、2つ、または3つ）は、1、2、3、4、または5つの保存アミノ酸置換以外は、配列番号6、7、または8のCDR1、CDR2またはCDR3領域に同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、該VHおよびVLを含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
いくつかの態様では、抗CD20抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、配列番号1、2、および3の配列のVH CDR1、CDR2およびCDR3領域、および、配列番号6、7、および8の配列のVL CDR1、CDR2およびCDR3領域を含む。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、VH領域およびVL領域を含むか、実質的にVH領域およびVL領域よりなるか、またはVH領域およびVL領域よりなり、VHは、配列番号4のVHアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号9のVLアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、VHおよびVL領域を含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその抗原結合断片は、配列番号4のVHおよび配列番号9のVLを含む。
いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその抗原結合断片は、配列番号4のVHおよび配列番号9のVLを含む抗体と同じエピトープに結合する。
別の態様では、単離された抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、重鎖および軽鎖を含むか、実質的に重鎖および軽鎖よりなるか、または重鎖および軽鎖よりなり、該重鎖は、配列番号4および5を含む重鎖アミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を有し、該軽鎖は、配列番号9および10を含む重鎖アミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一であるアミノ酸配列を有し、かつ、該重鎖を含む抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体は、特異的または優先的にCD20に結合し得る。
いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその抗原結合断片は、配列番号4および5を含む重鎖および配列番号9および10を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様では、抗CD20抗体またはその抗原結合断片は、配列番号4および配列番号5を含む抗体と同じエピトープに結合する。
いくつかの態様では、抗CD20抗体はウブリツキシマブである。
いくつかの態様では、抗体はEMAB603（国際特許WO2006/064121号参照、その内容を参照することによって本明細書に援用する）であり、クローンR603-12D11によって製造され、Collection Nationale des Cultures de Microorganismesに寄託番号CNCM I-3529として寄託されている。
いくつかの態様では、抗CD20抗体は、ラットのハイブリドーマYB2/0細胞株（YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞、ATCC番号CRL-1662としてAmerican Type Culture Collectionに登録）において製造される。
CD20に特異的に結合し、所望の活性を保持する能力がある抗体の正確な化学構造は、多数の要素によって決まる。イオン性のアミノ基およびカルボキシル基が分子中に存在するため、特定のポリペプチドが酸性または塩基性塩として、または中性形態で得られる可能性がある。好適な環境条件に置かれた場合に生物学的活性を保持するような全ての製剤は、本書で使用される場合、抗CD20抗体の規定に含まれる。さらに、抗体の一次アミノ酸配列は、糖成分を用いた誘導体化（グリコシル化）によって、または、脂質、リン酸塩、アセチル基等の他の追加分子によって、延長し得る。また、サッカリドとの結合によっても延長し得る。このような延長の特定の様相は、産生ホストの翻訳後プロセシング系によって達成されるが、他のこのような修飾は、インビトロで導入し得る。いずれにしても、このような修飾は、抗CD20抗体の所望の特性が損なわれない限り、本書で使用される抗CD20抗体の規定に含まれる。このような修飾は、様々なアッセイにおいて、ポリペプチドの活性を増強または減少させることによって、定量的または定性的に活性に影響し得ることが期待される。さらには、鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって修飾され、ポリペプチドを開裂して、活性を保持した断片を得ることが可能である。所望の特性（例えば、CD20に対する結合特異性）を損なわないような変化は、本書で使用される場合、関心のある抗CD20抗体の規定から、該ポリペプチド配列を除外しない。
当業界では、ポリペプチド変異体の製造および使用に関して、実質的ガイダンスが提供されている。抗CD20結合分子の変異体、例えば、抗体または抗原結合断片、変異体、またはそれらの誘導体を製造する場合、当業者は、天然タンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対して、医薬組成物の治療的有効成分として好適に使用される変異体が得られる修飾を容易に決定し得る。
抗体分子のフレームワーク領域のみまたはCDR領域のみに突然変異を導入することは可能である。導入された突然変異は、サイレント突然変異または中立ミスセンス突然変異であってもよく、即ち、抗体の抗原に結合する能力に全くまたは殆ど影響しない。これらのタイプの突然変異は、コドンの使用頻度を最適化し、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するのに有用であり得る。或いは、非中立ミスセンス突然変異は、抗体の抗原に結合する能力を変え得る。殆どのサイレントおよび中立ミスセンス突然変の位置はフレームワーク領域にある可能性が高く、一方、殆どの非中立ミスセンス突然変異の位置はCDRにある可能性が高いが、このことは絶対条件ではない。当業者は、抗原結合活性を変えない、または結合活性を変える等（例えば、抗原結合活性の向上または抗体特異性の変化）の、所望の特性を有する突然変異分子を設計および試験することが可能である。突然変異誘発後、コードされたタンパク質は、ごく普通に発現させることができ、コードされたタンパク質の機能活性および／または生物学的活性（例えば、CD20ポリペプチドの少なくとも1つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）は、本書に記載した技術を用いて、または当業界で知られている技術をごく普通に修飾することによって、測定し得る。
ある態様では、抗CD20抗体は、少なくとも1つの最適化された相補性決定領域（CDR）を含む。「最適化されたCDR」とは、CDRにおいて、最適化されたCDRを含む抗CD20抗体に与えられる、保持または改善された結合親和性および／または抗CD20活性に基づいて選択された配列が修飾および最適化されたことを意図する。「抗CD20活性」としては、例えば、CD20に関連する以下の活性の1以上を調整する活性が挙げられ、CD20に関連する活性の例としては、B細胞のアポトーシスを誘導する能力、B細胞（例えば、CLL細胞）に対するACDDを誘導する能力、NFκB活性を阻害する能力、Snail発現を阻害する能力、RKIPを抑制解除する能力、PTENを抑制解除する能力、TRAILアポトーシスに対して腫瘍細胞を感作する能力、またはCD20に関連するあらゆる他の活性が挙げられる。このような活性は、例えば、バリタキ(Baritaki)ら、International Journal of Oncology 38: 1683-1694 (2011)に記載されており、その内容を参照することによって本明細書に援用する。修飾としては、抗CD20抗体がCD20抗原に対する特異性を保持し、結合親和性および／または抗CD20活性が改善されるような、CDR内のアミノ酸残基の置換が含まれる。
ある抗CD20抗体、またはその抗原結合断片では、1以上の定常領域ドメインの少なくとも一部は、所望の生化学的性質を付与するために欠失または改変されており、所望の性質としては、エフェクター機能の低下、非共有結合的に二量化する能力、腫瘍部位に局在化する能力の向上、同程度の免疫原性を有する改変されていない全抗体と比較した、血中半減期の短縮または延長等が挙げられる。例えば、ある抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似したポリペプチド鎖を含むが、1以上の重鎖ドメインの少なくとも一部が欠失している、ドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体では、修飾された抗体の定常領域の1つのドメイン全体が欠失し、例えば、CH2ドメインの全体または一部が欠失する。
ある抗CD20抗体、またはその抗原結合断片では、当業界で知られている技術を用いて、Fc部分を変異させて、エフェクター機能を低下させ得る。例えば、定常領域の修飾を使用して、ジスルフィド結合またはオリゴサッカリド部分を修飾することができ、それにより、抗原特異性または抗体の柔軟性を高めることによって局在化を強化することができる。得られる生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティーおよび修飾の他の生化学的効果は、必要以上の実験を行わずに、よく知られた免疫学的技術を用いて、容易に測定および定量し得る。
ある態様では、抗CD20抗体またはその抗原結合断片は、治療される動物、例えばヒトにおいて、有害な免疫反応を起こさない。1つの態様では、抗CD20抗体またはその抗原結合断片は、当該技術において認められている技術を用いて、それらの免疫原性を減じるために修飾し得る。例えば、抗体はヒト化、霊長類化、脱免疫化を受けることができ、またはキメラ抗体を作ることができる。これらのタイプの抗体は、ヒト以外の抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来し、親抗体の抗原結合特性を保持するか実質的に保持するが、ヒトにおいては免疫原性が低くなる。これは様々な方法で達成することができ、例えば、(a) ヒト以外の可変領域全体をヒトの定常領域にグラフトして、キメラ抗体を産生する方法；(b) 1以上のヒト以外の相補性決定領域（CDR）の少なくとも一部を、必須フレームワーク残基を保持するか保持せずに、ヒトのフレーワーク定常領域中にグラフトする方法；または(c)ヒト以外の可変領域全体を移植するが、表面残基の置換によって、その可変領域をヒト様部分で「クロ―キング(cloaking)」する方法が挙げられる。このような方法は、モリソン(Morrison)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984)；モリソンら、Adv. Immunol. 44:65-92 (1988)；ヴェリョ−エン(Verhoeyen)ら、Science 239:1534-1536 (1988)；パドラン(Padlan)、Molec. Immun. 28:489-498 (1991)；パドラン、Molec. Immun. 31:169-217 (1994)、および米国特許第5,585,089号、5,693,761号、5,693,762号、および6,190,370号に開示されており、これらはすべて、その内容を参照することによって本明細書に援用する。
抗体またはその抗原結合断片の修飾された形態は、当業界で知られている技術を用いて、前駆体全体または親抗体から作成し得る。
抗CD20抗体またはその抗原結合断片は、当業界で知られている技術を用いて、作成または製造され得る。ある態様では、抗体分子またはその断片は、「組み換え技術によって製造」され、即ち、組み換えDAN技術を用いて製造される。抗CD20抗体またはその断片は、例えばハイブリドーマまたはファージ提示法によって、ポリクローナル抗体の産生またはモノクローナル抗体の調製等の、当業界で知られているあらゆる好適な方法によって産生され得る。
抗体分子を発現させるため、多様な宿主発現ベクター系を利用し得る。宿主細胞は2つの発現ベクターでコトランスフェクトされ得るが、第一のベクターは重鎖由来のポリペプチドをコードし、第二のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコードする。これら2つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドで同等の発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含有し得る。或いは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両者をコードする、単一ベクターを使用し得る。このような状態では、毒性のない重鎖が過剰になることを避けるため、軽鎖が重鎖の前に有利に配置される（プラウドフット(Proudfoot)、Nature 322:52 (1986)；コーラー(Kohler), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)）。また、宿主細胞は重鎖由来のポリペプチドおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする単鎖ベクターでトランスフェクトされ得る。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含み得る。
従来技術によって、1つまたは複数の発現ベクターを宿主細胞に移入することができ、その後、トランスフェクト細胞を従来技術によって培養して、抗体を作成する。従って、異種プロモーターに動作可能に結合される、抗体、またはその重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が提供される。二本鎖抗体の発現に関するある態様では、免疫グロブリン分子全体を発現するため、重鎖および軽鎖の両者をコードするベクターを宿主細胞中で同時発現し得る。
宿主発現系は、関心のあるコード配列が作成され、その後精製されることからビヒクルを表すが、適宜のヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、原位置(in situ)でCD20抗体を発現し得る細胞も表す。これらとしては、限定されないが、組み換えバクテリオファージDNAで形質転換されたバクテリア（例えば、E. coli, B. subtilis）、抗体コード配列を含有するプラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクター等の微生物；抗体コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Saccharomyces, Pichia）；抗体コード配列を含有する、組み換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する、組み換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、CaMV、タバコモザイクウィルス、TMV）を感染させた植物細胞系、または組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または、哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウィルス由来のプロモーター（例えば、アデノウィルス後期プロモーター；ワクシニアウィルス7.5Kプロモーター）を含有する組み換え発現構築物を有する持つ、哺乳類細胞系（例えば、COS、CHO、BLK、293、3T3細胞）が挙げられる。大腸菌等のバクテリア細胞、または、例えば組み換え抗体分子全体の発現のための真核細胞は、組み換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）等の哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウィルス由来の主要中間体である初期遺伝子プロモーター要素等のベクターと併せて、抗体に対する有効な発現系である（フォーキング(Foecking)ら、Gene 45:101 (1986)；クロケット(Cockett)ら、Bio/Technology 8:2 (1990)）。いくつかの態様では、抗CD20抗体は、CHO細胞ではない宿主細胞中で生成される。
一度抗体が組み換え技術によって発現されると、免疫グロブリン分子の精製について当業界で知られているあらゆる方法で精製することができ、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインA後の特異的抗原に対するアフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のためのあらゆる他の標準的技術が挙げられる。
いくつかの態様では、抗CD20抗体はラットハイブリドーマ細胞株によって生成される。いくつかの態様では、抗CD20抗体は、YB2/0（ATCC CRL-1662）において生成される。
IV. 医薬組成物
式Aの化合物および抗CD20抗体は、当業者が決定したあらゆる順番またはあらゆる間隔で投与し得る。例えば、式Aの化合物および抗CD20抗体は、（あらゆる順番で）連続的に、同時に、または連続的および同時投与のあらゆる組み合わせで、投与し得る。式Aの化合物および抗CD20抗体は、同一の医薬組成物、または別々の医薬組成物において投与し得る。
同時、（あらゆる順番の）連続または両者の組み合わせの投与は、当業者によって決定され得る通りの、あらゆる所望の分間隔（例えば、0〜60分）、時間間隔（例えば、0〜24時間）、日数間隔（例えば、0〜7日）、および／または週間隔（例えば、0〜52週）で実施し得る。用法もまた経時的に変えることができ、例えば、ある期間（例えば、1、2、3、4、5、または6週間）は週に一度の投与で開始し、その後、2週間に一度、3週間に一度、4週間に一度、5週間に一度、または6週間に一度投与する。
式Aの化合物および抗CD20抗体は、ヒト等の哺乳類に投与するための医薬組成物中に製剤化し得る。この医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み、担体としては、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩等の塩類または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン‐ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
該組成物は、あらゆる好適な方法で投与することができ、例えば、非経口的、脳室内、経口的、吸入噴霧、局所的、直腸内、経鼻的、口腔内、経膣または埋め込み式リザーバーによって投与し得る。いくつかの態様では、式Aの化合物は経口投与される。本書で使用される場合「非経口的」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液嚢内、胸骨下、くも膜下、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
非経口製剤は、単回ボーラス投与、注入または負荷量ボーラス投与の後に維持量投与し得る。これらの組成物は、特定の固定された、または可変的な間隔、例えば1日に1回、または「用時」ベースで投与し得る。いくつかの態様では、抗CD20抗体は静脈内投与される。
ある医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または溶液剤等の許容される投与形態で、経口投与し得る。また、ある医薬組成物は、経鼻的エアロゾルまたは吸入剤によって投与し得る。このような組成物は、生理食塩水溶液として調製することができ、ベンジルアルコールまたは他の好適な保存料、バイオアベイラビリティーを高めるための吸収プロモーター、および／または慣用の可溶化剤または分散剤を使用し得る。
全ての個別の患者に対する特定の投与量および治療計画は、様々な要因によって決定され、例えば、使用される個別の治療薬、患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別、および食習慣、また、投与時間、排泄率、薬剤の組み合わせ、および治療されている個別の疾患の重症度が挙げられる。医療提供者によるこのような要因の判断は、当該技術分野における通常の技術の範囲内である。量もまた、治療を受ける個々の患者、投与経路、製剤のタイプ、使用される化合物の特性、疾患の重症度、および所望の効果によって変化する。使用量は、当業界でよく知られている薬理学的および薬物動態的原理によって決定し得る。
いくつかの態様では、抗CD20抗体は、187.5 mg/m2、75 mg/m2、37.5 mg/m2、15 mg/m2、7.5 mg/m2、3.75 mg/m2未満の投与量で投与される。いくつかの態様では、投与量は、187.5 mg/m2〜75 mg/m2、75 mg/m2〜37.5 mg/m2、75 mg/m2〜15 mg/m2、75 mg/m2〜7.5 mg/m2、または75 mg/m2〜3.75 mg/m2であり得る。
いくつかの態様では、式Aの化合物は、1日当たり、10〜2500 mg/日、10〜1500 mg/日、50〜1000 mg/日、100〜750 mg/日、150〜500 mg/日の投与量範囲で投与される。いくつかの態様では、投与量は、1日当たり200〜400 mgであり得る。いくつかの態様では、投与量は500、1000、1500、2000または2500 mg/日であり得る。
追加の活性化合物も、該組成物中に組み込み得る。例えば、抗CD20抗体および式Aの化合物を、抗がん剤等の1以上の追加の治療薬と同時処方および／または併用し得る。
V. キット
本発明は、化合物A、抗CD20抗体、他の薬剤を含み、本書に記載された方法を実施するために使用し得るキット、およびその組み合わせを提供する。ある態様では、キットは、1以上の容器中にCD20 に対する少なくとも1つの精製された抗体、および該抗体を式Aの化合物と組み合わせて使用するための取扱説明書を含む。ある態様では、キットは、式Aの化合物、および、該阻害剤を抗CD20抗体と組み合わせて使用するための取扱説明書を含む。ある態様では、キットは、少なくとも1つの抗CD20抗体および式Aの化合物を含む。
本書では、医薬化合物の1以上の成分を充填した1以上の容器、および、式Aの化合物および／または1以上の抗CD20抗体を含む本発明の組成物を含む、医薬キットも提供される。このようなキットは、例えば、他の化合物および／または組成物、該化合物および／または組成物を投与するための装置、および、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の取扱説明書も含む。
当業者は、開示された抗体および本書に記載された式Aの化合物が、当業界でよく知られている確立されたキットの形式の1つに容易に組み込まれることを、容易に認識するであろう。
さらに、(a) 式Aの化合物、抗CD20抗体、またはそれらの組み合わせ、および(b) 追加的抗がん剤を含むキットが提供される。ある態様では、追加的抗がん剤は化学療法剤である。
VI. 式Aの化合物および抗CD20抗体の組み合わせの使用方法
式Aの化合物および抗CD20抗体の組み合わせは、対象者における疾患または疾病の治療方法において使用し得る。
従って、増殖性疾患の治療用医薬品の製造における式Aの化合物の使用であって、式Aの化合物が抗CD20抗体と組み合わせて（例えば、連続的または同時に）投与されるものが提供される。加えて、増殖性疾患の治療用医薬品の製造における抗CD20抗体の使用であって、抗CD20抗体が式Aの化合物と組み合わせて（例えば、連続的または同時に）投与されるものも提供される。
さらに、本発明は、本発明の組み合わせの有効量を患者に投与することによる、患者におけるPI3Kδアイソフォームおよび／またはCD20の阻害方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明の組み合わせの有効量を患者に投与することによる、患者におけるPI3Kδ介在性疾患、疾病または症状および／またはCD20介在性疾患、疾病、または症状（がんまたは他の増殖性疾患または疾病等）の、治療、予防、および／または阻害方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明の組み合わせの有効量を患者に投与することによる、患者におけるPI3Kδアイソフォームおよび／またはCD20関連性疾患、疾病または症状の治療方法を提供する。1つの態様では、組み合わせにおいて投与される化合物の量は、PI3Kδおよび／またはCD20の選択的阻害によって、PI3Kδアイソフォームおよび／またはCD20関連性疾患、疾病または症状を治療するために充分な量である。
さらに、本発明は、少なくとも1つの式Aの化合物および本発明の抗体の有効量を増殖性疾患の治療が必要な患者に投与することによる、増殖性疾患の治療方法を提供する。1つの態様では、組み合わせにおいて投与される化合物の量は、PI3Kδの選択的阻害および／またはCD20の阻害によって、増殖性疾患を治療するために充分な量である。
さらに、本発明は、本発明の組み合わせの有効量を、少なくとも1つの他の抗がん剤とさらに組み合わせて（同時または連続的に）増殖性疾患の治療が必要な患者に投与することによる、増殖性疾患の治療方法を提供する。1つの態様では、投与される化合物Aの量は、PI3Kδの選択的阻害によって、増殖性疾患を治療する（または治療を容易にする）ために充分な量である。
本発明の組み合わせは、限定されないが、以下の様々ながんの治療に有用である：
・がん、以下のがんを含む：膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺（小細胞肺がんを含む）、食道、胆嚢、子宮、卵巣、精巣、咽頭、口腔、胃腸管（例えば、食道、胃、膵臓）、脳、頸部、甲状腺、前立腺、血液、および皮膚（扁平上皮細胞がんを含む）；
・リンパ系の造血器腫瘍、例えば、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、へアリー細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫；
・骨髄細胞系の造血器腫瘍、例えば、急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および前骨髄性白血病；
・間葉に由来する腫瘍、例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫；
・中枢および末梢神経系の腫瘍、例えば、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および神経鞘腫；および
・他の腫瘍、例えば、黒色腫、精上皮腫、奇形腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞がんおよびカポジ肉腫。
本発明の組み合わせは、アポトーシスのモジュレーターとして、がん（限定されないが、本書の上記のタイプのものを含む）の治療、予防、および阻害に有用である。
本発明の組み合わせは、がんの化学予防において有用である。化学予防としては、浸潤がんの発生を変異原性イベントの開始を遮断することによって阻害すること、既に損傷を有する前悪性細胞の進行を遮断すること、または腫瘍の再発を阻害することが挙げられる。また、該化合物は、腫瘍の血管新生および転移の阻害にも有用である。本発明の一つの態様は、本発明の1以上の化合物の有効量を投与することによって、患者における腫瘍血管新生または転移を阻害する方法である。
さらに、本発明は、免疫系関連疾患（例えば、自己免疫疾患）、炎症に関与する疾患または疾病（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、神経炎症性疾患、多発性硬化症、ブドウ膜炎および免疫系疾患）、がんまたは他の増殖性疾患、肝臓病または肝疾患、または腎臓病または腎疾患の治療方法を提供する。該方法は、本発明の組み合わせの有効量を投与することを含む。
本発明の化合物によって治療され得る免疫性疾患の例としては、限定されないが、乾癬、関節リウマチ、血管炎、炎症性腸疾患、皮膚炎、変形性関節症、喘息、炎症性筋疾患、アレルギー性鼻炎、膣炎、間質性膀胱炎、強皮症、骨粗鬆症、湿疹、同種異型または異種移植（器官、骨髄、幹細胞および他の細胞および組織）移植片拒絶、移植片対宿主疾患、エリテマトーデス、炎症性疾患、1型糖尿病、肺線維症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、甲状腺炎（例えば、橋本病および自己免疫性甲状腺炎）、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、多発性硬化症、嚢胞性線維症、慢性再発性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アレルギー性結膜炎、およびアトピー性皮膚炎が挙げられる。
さらに、本発明は、本発明の組み合わせの治療的有効量を投与することによる、患者における白血病の治療方法を提供する。例えば、本発明の方法は、慢性リンパ球性白血病（CLL）、非ホジキンリンパ腫（NFL）、急性骨髄性白血病（AML）、多発性骨髄腫（MM）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、および緩慢性非ホジキンリンパ腫（I-NHL）の治療に有効である。
上記の治療方法では、本発明の組み合わせと共に、1以上の追加的活性薬剤を投与し得る。例えば、本発明の組み合わせは、放射線療法等の知られている抗ガン治療、または1以上の細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤または抗がん剤との組み合わせ（一緒にまたは連続的に投与）において有用であり、このような薬剤としては、例えばシスプラチンまたはドキソルビシン等のDNA相互作用薬；エトポシド等のトポイソメラーゼII阻害剤；CPT-11またはトポテカン等のトポイソメラーゼI阻害剤；パクリタキセル、ドセタキセルまたはエポチロン（例えばイキサベピロン）等の、自然発生または合成のチューブリン相互作用薬；タモキシフェン等のホルモン剤；5-フルオロウラシル等のチミジル酸シンターゼ；および、メトトレキサート等の代謝拮抗剤；イレッサおよびOSI-774等の他のチロシンキナーゼ阻害剤；血管新生阻害剤；EGF阻害剤；VEGF阻害剤；CDK阻害剤；SRC阻害剤；c-Kit阻害剤；アービタックス（EGF）およびハーセプチン（Her2）等の、Her1/2阻害剤および成長因子受容体に対するモノクローナル抗体；および他のプロテインキナーゼモジュレーターが挙げられる。また、追加的活性薬剤は、プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））、カーフィルゾミブ（PR-171）、PR-047、ジスルフィラム、ラクタシスチン、PS-519、エポネマイシン、エポキソマイシン、アクラシノマイシン、CEP-1612、MG-132、CVT-63417、PS-341、ビニルスルホントリペプチド阻害剤、リトナビル、PI-083、(+/-)-7-メチルオムラリド、(-)-7-メチルオムラリド、レナリドミド（レブラミド（登録商標））、またはこれらの組み合わせであってもよい。
また、本発明の組み合わせは、1以上のステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）または免疫選択性抗炎症誘導体（ImSAID）との組み合わせ（一緒にまたは連続的に投与）においても有用である。
特別な態様では、がんは血液悪性疾患および/または固形腫瘍である。別の特別な態様では、血液悪性疾患は白血病またはリンパ腫である。
いくつかの態様では、リンパ腫は成熟（末梢）B細胞腫瘍である。具体的な態様では、成熟B細胞腫瘍は、B細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫；B細胞前リンパ球性白血病；リンパ形質細胞性リンパ腫；脾性辺縁帯B細胞リンパ腫（+/-有毛リンパ球）、節性辺縁帯リンパ腫（+/-単球様B細胞）、および粘膜関連リンパ組織（MALT）型節外性辺縁帯B細胞リンパ腫等の、辺縁帯リンパ腫；有毛細胞白血病；形質細胞骨髄腫／形質細胞腫；濾胞性リンパ腫、濾胞腫瘍；マントル細胞リンパ腫；びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、および原発性滲出液リンパ腫を含む）；およびバーキットリンパ腫／バーキット細胞白血病よりなる群から選択される。
いくつかの態様では、リンパ腫は、多発性骨髄腫（MM）および非ホジキンリンパ腫（NHL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、濾胞性リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（WM）またはB細胞リンパ腫およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）よりなる群から選択される。
さらに特別な態様では、白血病は、急性リンパ性白血病／急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、および小リンパ球性リンパ腫（SLL）よりなる群から選択される。いくつかの態様では、非ホジキンリンパ腫（NHL）は、侵攻性NHLまたは無痛性NHKである。侵攻性NHLの例としては、B細胞腫瘍、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、T/NK細胞腫瘍、未分化大細胞型リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性白血病／リンパ腫、前駆Tリンパ芽球性白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、成人T細胞リンパ腫／白血病（HTLV+1）、原発性CNSリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、移植後多形リンパ増殖性疾患（PTLD）、AIDS関連リンパ腫、組織球性リンパ腫、および芽球性NK細胞リンパ腫が挙げられる。最も一般的なタイプの侵攻性NHLは、びまん性大細胞型リンパ腫である。無痛性NHLの非限定的な例としては、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯リンパ腫（粘膜関連リンパ組織-MALTリンパ腫とも呼ばれる）、節性辺縁帯B細胞リンパ腫（単球様B細胞リンパ腫）、脾性辺縁帯リンパ腫、およびリンパ形質細胞性リンパ腫（ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）が挙げられる。いくつかの態様では、対象者は侵攻性NHLまたは無痛性NHLを有する。
いくつかの態様では、患者は、マントル細胞リンパ腫（MCL）、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、濾胞性リンパ腫（FL）、急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、および小リンパ球性リンパ腫（SLL）、多発性骨髄腫（MM）、および辺縁帯リンパ腫よりなる群から選択される症状を有する。
いくつかの態様では、患者は、再発性または不応性の症状を有する。特別な態様では、患者は化学療法に不応性であるか、化学療法の後、再発している。
いくつかの態様では、がんはリツキシマブ治療に抵抗性である。いくつかの態様では、がんはリツキシマブ治療に対する反応性が低下している。いくつかの態様では、患者は以前にリツキシマブ治療を受けたことがある。
特別な態様では、該方法は、患者において、NF-κ-B活性値を低下させること、SNAIL発現を低下させること、RKIP活性を高めること、PTEN活性を高めること、TRAIL-アポトーシスに対する腫瘍感受性を高めること、PI3Kδ活性値を低下させること、またはこれらの組み合わせを含む。
特別な態様では、式Aの化合物と抗CD20抗体との組み合わせは、ヒト全血由来のB細胞を枯渇させる。いくつかの態様では、式Aの化合物と抗CD20抗体との組み合わせは、式Aの化合物または抗CD20抗体のいずれか一方が単独でヒト全血由来のB細胞を枯渇させる程度より大きく、ヒト全血由来のB細胞を枯渇させる。いくつかの態様では、式Aの化合物と抗CD20抗体との組み合わせは、式Aの化合物による枯渇と抗CD20抗体による枯渇の合計より大きく、ヒト全血由来のB細胞を枯渇させる。
いくつかの態様では、式Aの化合物と抗CD20抗体は、過剰なB細胞の増殖に関連する疾患または疾病の治療方法に使用され、該方法は、式Aの化合物および抗CD20抗体を、それらを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの態様では、式Aの化合物および抗CD20抗体は、過剰なB細胞活性に関連する疾患または疾病の治療方法に使用され、該方法は、式Aの化合物および抗CD20抗体を、それらを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの態様では、式Aの化合物および抗CD20抗体は、過剰なB細胞数に関連する疾患または疾病の治療方法に使用され、該方法は、式Aの化合物および抗CD20抗体を、それらを必要とする患者に投与することを含む。
式Aの化合物は、国際特許出願公開第WO 2011/055215 A2号および米国特許出願公開第2011/0118257 A1号に開示された、一般的な合成法を用いて製造することができ、特定の化合物の製造は、2012年7月4日に出願されたインド仮特許出願2693/CHE/2012号、2012年8月21日に出願された米国仮特許出願第61/691,586号、2013年7月2日に出願されたPCT/US2013/055434号および2013年7月2日に出願された米国特許出願第13/933,856号に開示された通りである。これらの各出願および公開はそれぞれ、その内容を参照することによって本明細書に援用する。
式Aの化合物の合成
他に明確に指示されている場合を除き、精製は、固定相としてシリカゲルを用い、移動相として好適な極性の、石油エーテル（60〜80℃で沸騰）および酢酸エチルまたはジクロロメタンおよびメタノールの混合物を用いたカラムクロマトグラフィーを意味する。「RT」という用語は、周囲温度（25〜28℃）を言う。
中間体1：2-(1-ブロモエチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
工程-1：[1-(5-フルオロ-2-ヒドロキシフェニル)-2-(3-フルオロフェニル)エタノン]：3-フルオロフェニル酢酸（7.33 g, 47.56 mmol）を25 mlのジクロロメタンに溶解した。この混合物に、塩化オギザリル（7.54 g, 59.46 mmol）およびDMF（3滴）を0℃で添加し、30分間撹拌した。溶媒を溜去し、25 mlのジクロロメタンに溶解した。この混合物に、4-フルオロアニソール（5.00 g, 39.64 mmol）を添加し、0oCに冷却した。0oCで、AlCl3（7.95 g, 59.46 mmol）を添加し、反応混合物をRTまで加温し、12時間撹拌した。2N HClを添加して反応混合物を急冷し、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。粗生成物を、酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を無色固体として得た（4.5 g, 収率45%）。1H-NMR (δ ppm, DMSO-D6, 400 MHz): δ 11.34 (s, 1H), 7.75 (dd, J=9.4, 3.1 Hz, 1H), 7.42 (m, 2H), 7.12 (m, 3H), 7.05 (dd, J=9.0, 4.5 Hz, 1H), 4.47 (s, 2H).
工程-2：[2-エチル-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン]：工程1で得た1-(5-フルオロ-2-ヒドロキシフェニル)-2-(3-フルオロフェニル)エタノン（3.00 g, 12.08 mmol）を丸底フラスコに入れ、そこにトリエチルアミン（25 ml）およびプロピオン酸無水物（4.92 g, 37.82 mmol）を添加し、混合物を24時間還流した。RTまで冷却した後、反応混合物を1N HCl溶液を加えて酸性化し、酢酸エチルで抽出し、重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物をオフ・イエローの固体として得た（1.80 g, 収率52%）。1H-NMR (δ ppm, DMSO-D6, 400 MHz): δ7.80 (m, 1H), 7.76 (m, 2H), 7.51 (dd, J=8.0, 6.4 Hz), 7.22 (m, 1H), 7.18 (m, 2H), 2.56 (q, J=7.6 Hz, 2H), 1.20 (t, J=7.6 Hz, 3H).
工程-3：工程2で得た2-エチル-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン（1.80 g, 6.28 mmol）の四塩化炭素（20 ml）溶液に、N-ブロモスクシンイミド（1.11 g, 6.28 mmol）を添加し、80℃に加熱した。アゾビスイソブチロニトリル（10 mg）を反応混合物に80℃で添加した。12時間後、反応混合物をRTまで冷却し、ジクロロメタンで希釈し、水洗した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、粗表題化合物を黄色固体として得た（1.25 g, 収率55% yield）。1H-NMR (δ ppm, DMSO-D6, 400 MHz): δ 7.91 (dd, J=9.2, 4.3 Hz, 1H), 7.81 (dt, J=8.2, 2.8 Hz, 1H), 7.74 (dd, J=8.3, 3.1 Hz, 1H), 7.57 (m, 1H), 7.32 (dt, J=8.5, 2.4 Hz, 1H), 7.19 (m, 2H), 5.00 (q, J=6.8 Hz, 1H), 1.97 (d, J=6.8 Hz, 3H).
中間体 2：6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-2-(1-ヒドロキシエチル)-4H-クロメン-4-オン
中間体1（15.0 g, 40.84 mmol）のDMSO（150 ml）溶液に、n-ブタノール（7.5 ml）を添加し、3時間120℃に加熱した。反応混合物をRTまで冷却し、水で急冷し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物をオフホワイトの固体として得た（7.90 g, 64%）。1H-NMR (δ ppm, CDCl3, 400 MHz): 7.85 (dd, J = 8.1, 3 Hz, 1H), 7.54 (dd, J = 9.2, 4.2 Hz, 1H), 7.47-7.37 (m, 2H), 7.15-6.98 (m, 3H), 4.74 (quintet, J= 6.8 Hz, 1H), 2.23 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 1.54 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
中間体3：2-アセチル-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
DMSO（5.60 ml, 79.14 mmol）をジクロロメタン（40 ml）に添加し、 -78°Cに冷却した後、塩化オギザリル（3.40 ml, 39.57 mmol）を添加した。10分後、ジクロロメタン（54 ml）中の中間体2（6.00 g, 19.78 mmol）を滴下し、20分間撹拌した。トリエチルアミン（12 ml）を添加し、1時間撹拌した。反応混合物を水で急冷し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物を黄色固体として得（4.2 g, 71%）、そのまま次の工程で使用した。
中間体4：(S)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-2-(1-ヒドロキシエチル)-4H-クロメン-4-オン
中間体3（2.00 g, 6.66 mmol）に、R-アルピンボラン（TMF中0.5 M, 20 ml）を添加し、20時間60°Cに加熱した。反応混合物を2N HClで急冷し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで抽出し、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物をオフホワイトの固体として得た（1.51 g, 75%）。鏡像体過剰率：94.2%、溶出が速い異性体が濃縮（保持時間：8.78分）、キラルパック(chiralpak)AD-HカラムでのHPLCで定量。
中間体5：(R)-1-(6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4-オキソ-4H-クロメン-2-イル)エチル 4-クロロベンゾエート
中間体4（1.45 g, 4.78 mmol）のTHF（15 ml）溶液に、4-クロロ安息香酸（0.748 g, 4.78 mmol）およびトリフェニルホスフィン（1.88 g, 7.17 mmol）を添加し、45°Cに加熱した後、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（1.4 ml, 7.17 mmol）を添加した。1時間後、反応混合物を濃縮し、残渣を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物をオフホワイトの固体として得（1.81 g, 86%）、精製せずに次の工程で使用した。
中間体6：(R)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-2-(1-ヒドロキシエチル)-4H-クロメン-4-オン
方法A
中間体5（1.75 g, 3.96 mmol）をメタノール（17 ml）中10°Cに冷却し、炭酸カリウム（0.273 g, 1.98 mmol）を添加して、30分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、2N HCl溶液で酸性化し、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を黄色固体として得た（1.05 g, 収率87%）。鏡像体過剰率：93.6%、溶出が遅い異性体が濃縮（保持時間：11.12分）、キラルパック(chiralpak)AD-HカラムでのHPLCで定量。
方法B
工程-1 [(R)-2-(1-(ベンジルオキシ)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン]：ジクロロメタン中の1-(5-フルオロ-2-ヒドロキシフェニル)-2-(3-フルオロフェニル)エタノン（11.00 g, 44.31 mmol）に、HATU（33.7 g, 88.63 mmol）およびR-(+)2-ベンジルオキシプロピオン酸（9.58 g, 53.17 mmol）を添加し、10分間撹拌した。トリエチルアミン（66.7 ml, 0.47 mol）を滴下し、RTで24時間撹拌した。反応混合物を水で急冷し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を黄色固体として得た（10.5 g, 収率60%）。1H-NMR (δ ppm, CDCl3, 400 MHz): 7.85 (dd, J = 8.1,3 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 9.1, 4.1 Hz, 1H), 7.47-7.39 (m, 1H), 7.39-7.34 (m, 1H), 7.28-7.20 (m, 3H), 7.20-7.14 (m, 2H), 7.16-7.07 (m, 1H), 6.99-6.89 (m, 2H), 4.50-4.31 (m, 3H), 1.56 (d, J = 6.4 Hz, 3H).
工程-2：工程-1で得られた(R)-2-(1-(ベンジルオキシ)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン（10.5 g, 26.69 mmol）をジクロロメタン（110 ml）中、0°Cに冷却し、塩化アルミニウム（5.35 g, 40.03 mmol）を少量ずつ添加し、RTで6時間撹拌した。反応混合物を2N HCl溶液で急冷し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、中間体6を黄色固体として得た（6.1 g, 収率76% yield）。鏡像体過剰率：97.7%、溶出が遅い異性体が濃縮（保持時間：11.12分）、キラルパック(chiralpak)AD-HカラムでのHPLCで定量。
中間体7：4-ブロモ-2-フルオロ-l-イソプロポキシベンゼン
4-ブロモ-3-フルオロフェノール（10 g, 52.35 mmol）のTHF（100ml）溶液に、イソプロピルアルコール（4.8 ml, 62.62 mmol）およびトリフェニルホスフィン（20.6 g, 78.52 mmol）を添加し、45°Cに加熱した後、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（15.4 ml, 78.52 mmol）を添加した。混合物を1時間還流し、濃縮し、残渣を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を無色液体として得（13.1 g, 収率99%）、精製せずに次の工程で使用した。
中間体8：2-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン
酢酸カリウム（10.52 g, 107.2 mmol）およびビス(ピナコラト)ジボロン（15 g, 58.96 mmol）を中間体7（10.52 g, 107.2 mmol）のジオキサン（125 ml）溶液に添加し、この溶液を30分間脱気した。[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II) CH2Cl2（4.4 g, 5.36 mmol）を窒素雰囲気下で添加し、80°Cに加熱した。12時間後、反応混合物をセライト濾過し、濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を黄色油状物質として得（13.9 g, 99%）、精製せずに次の工程で使用した。
中間体9：3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン
3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（11.0 g, 42.14 mmol）のDMF（110 ml）溶液に、エタノール（55 ml）および水（55 ml）、中間体8（23.4 g, 84.28 mmol）および炭酸ナトリウム（13.3 g, 126.42 mmol）を添加し、30分間脱気した。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（2.4 g, 2.10 mmol）を窒素雰囲気下で添加し、80°Cに加熱した。12時間後、反応混合物をセライト濾過し、濃縮し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をジエチルエーテルと練和し、濾過し、真空下で乾燥して、表題化合物を淡褐色固体として得（3.2 g, 収率26%）、そのまま次の工程で使用した。
(RS)- 2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
中間体9（0.080 g, 0.293 mmol）のDMF（2 ml）溶液に、炭酸カリウム（0.081 g, 0.587 mmol）を添加し、RTで10分間撹拌した。この混合物に、中間体1（0.215 g, 0.587 mmol）を添加し、12時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をメタノール：ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を淡黄色固体として得た（0.045 g）。融点：175-177°C. 1H-NMR (δ ppm, DMSO-D6, 400 MHz): δ 8.20 (s, 1H), 7.85 (dd, J = 81, 3.0 Hz, 1H), 7.48-7.33 (m, 5H), 7.14 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.02 (m, 2H), 6.90 (m, 1H), 6.10 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 5.42 (s, 2H), 4.64 (quintet, J = 6.0 Hz, 1H), 1.99 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.42 (d, J = 6.1 Hz, 6H).
(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン（「S-異性体」）
中間体9（0.134 g, 0.494 mmol）のTHF（2.0 ml）溶液に、中間体6（0.150 g, 0.494 mmol）およびトリフェニルホスフィン（0.194 g, 0.741 mml）を添加し、RTで5分間撹拌した。ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（0.15 ml, 0.749 mmol）を添加し、45°Cに加熱した。2時間後、反応混合物を水で急冷し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物をオフホワイトの固体として得た（0.049 g, 収率20%）。融点：139-142°C. 質量：571.7 (M+).鏡像体過剰率：89.8%、キラルパック(chiralpak)AD-HカラムでのHPLCで定量、溶出が速い異性体が濃縮（保持時間：10.64分）。
(R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン
中間体8（0.284 g, 0.989 mmol）のTHF（5.0 ml）溶液に、中間体4（0.250 g, 0.824 mmol）およびトリス(4-メトキシ)フェニルホスフィン（0.435 g, 1.23 mml）を添加し、RTで5分間撹拌した。ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（0.25 ml, 1.23 mmol）を添加し、RTで撹拌した。12時間後、反応混合物を水で急冷し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸エチル：石油エーテルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物をオフホワイトの固体として得た（0.105 g, 収率22 %）。融点：145-148°C. 質量：571.7 (M+). 鏡像体過剰率：95.4%、キラルパック(chiralpak)AD-HカラムでのHPLCで定量、溶出が遅い異性体が濃縮（保持時間：14.83分）。

生物的評価
式Aの化合物と抗CD20抗体との組み合わせ
実施例1：式Aの化合物のS-異性体とウブリツキシマブとの組み合わせは、全血由来のB細胞を枯渇させる
フローサイトメトリー分析を用いて、式Aの化合物のS-異性体、ウブリツキシマブ（Ubx）、およびそれらの組み合わせについて、ヒト全血（HWB）由来のB細胞を枯渇させる能力を比較した。この分析では、50 μlのHWBサンプルを、式Aの化合物のS-異性体（1000 nM）、UBX（100 μg/ml〜0.1 μg/ml）、またはUBXの、式Aの化合物のS-異性体1000 nMとの組み合わせのいずれかで処理し、37°Cおよび5% CO2で24時間インキュベートした。処理したサンプル20 μlを、1.5 mlの遠心分離管に取り、CD45 FITCおよびCD19 PEまたはCD20 FITC抗体で標識し、暗所で1時間、室温でインキュベートした。赤血球（RBC）溶血溶液1mlを加え、遠心分離管を3000 rpmで10分間遠心分離した。上清を吸引し、250 μlのPBSをペレットに加えた。遠心分離管をボルテックスし、Guava（登録商標） easyCyteTMフローサイトメーターで5000イベントを検出し、インサイト(Incyte)ソフトウェアで分析した。
CD45-陽性細胞のゲート化(gated)集団をCD19についてさらに分析した。CD45およびCD19陽性の細胞数を計算し、データを集団中のCD19陽性細胞のパーセンテージで表した。CD20陽性集団は、蛍光陽性(−)非標識細胞でゲート化し、データは、集団中のCD20陽性細胞のパーセンテージで表した。対照からのCD19/CD20集団の損失を計算し、対照に対する枯渇%で表した。
結果を図1に示す。式Aの化合物のS-同位体は、10 μM以下の濃度ではB細胞に対して細胞毒性はない。従って、式Aの化合物のS-異性体1 μMでは、CD19陽性またはCD20陽性HWBB細胞の減少は観察されなかった。UBX抗CD20抗体は、1〜100,000 ng/mlの投与量ではB細胞の枯渇は20〜30%のみであったが、CD20+B細胞においては、投与量依存性の減少を引き起こした。1000 nMの式Aの化合物のS-同位体と10 ng/ml UBXとの組み合わせにより、CD19+細胞の枯渇が増強され、1000 nMの式Aの化合物のS-同位体と0.1〜10 ng/mlの濃度のUBXとの組み合わせにより、CD20+細胞の枯渇に対してわずかな相加効果が得られた。これらの結果から、式Aの化合物のS-同位体（1000 nM）とUBX（10 ng/ml）との組み合わせにより、CD19陽性細胞の枯渇が増強され、CD20陽性細胞の枯渇に対してはわずかな効果を示すことが実証された。

実施例2：式Aの化合物のS-異性体とUBXとの組み合わせは、LPS誘発性のB細胞の増殖をもたらす
フローサイトメトリーを用いて、式Aの化合物のS-異性体、Ubx、およびそれらの組み合わせの、HWB中のCD19およびCD20のLPS誘発性の増殖に対する効果を試験した。これらの実験では、250 μlの希釈したHWB（1：3.5のRPMI-HG培地）サンプルを、式Aの化合物のS-異性体（10 μM〜0.1 μM）、UBX（100 μg/ml〜0.1 μg/ml）またはUBXと式Aの化合物のS-異性体（1000 nM）のいずれかで15分間処理し、20μg/mlのLPSで誘導し、37°Cおよび5% CO2で72時間インキュベートした。処理したサンプル20 μlを1.5 mlの遠心分離管に取り、CD20 FITCおよびCD19 PE抗体で標識し、暗所で1時間、RTでインキュベートした。RBC溶血溶液1mlを加え、遠心分離管を3000 rpmで10分間遠心分離した。上清を吸引し、250 μlのPBSをペレットに加えた。遠心分離管をボルテックスし、Guava（登録商標） easyCyteTMフローサイトメーターで5000イベントを検出し、インサイト(Incyte)ソフトウェアで分析した。
リンパ球陽性細胞のゲート化(gated)集団をCD19およびCD20についてさらに分析した。CD19および／またはCD20陽性の細胞を計算し、データを集団中の陽性細胞のパーセンテージで表した。LPS誘導を行った対照からの陽性集団の損失を計算し、対照に対する阻害%で表した。
結果を図2および3に示す。式Aの化合物のS-異性体（1 μM）は、HWBを用いたLPS誘発性CD19+ B細胞増殖を、投与量に依存して阻害した（〜60%）。式Aの化合物のS-異性体1 μMを種々の濃度のUBXに添加したが、反応は、CD19+細胞に対するUBXの最小効果の結果としての〜60%を超える程には上昇しなかった。しかし、CD19+細胞増殖に対する組み合わせの相加効果は、UBXの濃度が100 ng/mlの場合で注目された。
CD19+細胞増殖に対する効果とは対照的に、式Aの化合物のS-異性体は、1 μMで、CD20+細胞の〜40%の阻害を示した。式Aの化合物のS-異性体1μMとUBXとの組み合わせの相加効果は、特に0.1 ng/ml投与量で顕著である。

実施例3：式Aの化合物のS-異性体とUBXとの組み合わせは、がん細胞におけるアポトーシスを高める
がん細胞におけるアポトーシスに対する、式Aの化合物のS-異性体、UBX、およびそれらの組み合わせの効果を測定するため、インサイツ・カスパーゼ-3キット（ミリポア）を使用した。細胞を0.5 x 106個/mlの濃度で6穴プレートに入れ、式Aの化合物のS-異性体（1000 nM）、UBX（100 μg/ml〜0.1 μg/ml）、またはUBXと式Aの化合物のS-異性体（1000 nM）のいずれかで処理し、37°Cおよび5% CO2で24時間インキュベートした。その後、細胞を微量遠心管に移し、新たに調製したFLICATM試薬10μlを加えて、暗所で24 時間、37°Cおよび5% CO2でインキュベートした。洗浄緩衝液で充分に洗浄した後、試験サンプルをPBS中の細胞数と等しくなるように調整した。各細胞懸濁液100 μlを黒色96穴プレートに二通り移し、蛍光を、励起波長490 nmおよび発光波長520 nmで、プレートリーダーにおいて読み取った。DMSO対照の蛍光強度を試験化合物の蛍光強度から引いた。データは最大反応（100%）に対するパーセンテージで表し、それに基づいてプロットした。
結果を図4に示す。UBXは、試験した細胞株におけるカスパーゼ-3活性を誘導する能力が限定的であることを示した。カスパーゼ-3活性は、細胞株を式Aの化合物のS-異性体1 μMとインキュベートすることによって、40〜75%増加した。Daudi細胞においてUBX濃度100 ng/mlで組み合わせの相乗効果が注目されたが、RPMI-8226、Raji、およびU226B1細胞株においては、より高濃度のUBX（10および100 ng/ml）で相加効果が見られた。

実施例4：式Aの化合物のS-異性体とUBXとの組み合わせは、細胞周期の停止を引き起こす
細胞周期分析試薬（ミリポア）を使用して、がん性細胞の細胞周期に対する、式Aの化合物のS-異性体、UBX、およびそれらの組み合わせの効果を測定した。これらの実験では、細胞を、0.5 x 106個/mlの濃度で6穴プレートに入れ、式Aの化合物のS-異性体（10 μM〜0.1 μM）、UBX（100 μg/ml〜0.1 μg/ml）、またはUBXと式Aの化合物のS-異性体（1000 nM）のいずれかで処理し、37°Cおよび5% CO2で72時間インキュベートした。細胞を微量遠心管に移し、50μlの細胞周期試薬を加えて、暗所で30分間、RTでインキュベートした。その後、細胞を300〜400μlのPBSで希釈し、Guava（登録商標） easyCyteTMフローサイトメーターで最小限の10,000イベントを検出した。データは、エクスプレス・プロ(Express Pro)ソフトウェアで分析し、対照に対する、種々の細胞周期ステージでの細胞集団のパーセンテージを、ヒストグラムで表した。
図5〜10は、U266B1、およびRaji細胞で得られた結果を示す。加えて、以下の表1〜12はU266B1、DB、Raji、およびDaudi細胞を用いて得られた、定量的な結果を表す。
これらの結果から、式Aの化合物のS-異性体と接触した細胞が、投与量依存性のG2/M停止を引き起こしたことが示される。加えて、UBXでの72時間の処理により、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DB）およびU266B1細胞において、緩徐なG2/M停止を引き起こしたが、一方、RajiおよびDaudi細胞ではSub G0細胞数が増加した。1 μMの式Aの化合物のS-異性体との組み合わせは、試験した細胞株全体でUBX反応を増強した。

実施例5：式Aの化合物のS-異性体とUBXとの組み合わせは、がん細胞におけるアポトーシスを相乗的に高める
がん細胞におけるアポトーシスに対する、式Aの化合物のS-異性体、UBX、およびそれらの組み合わせの効果を測定するため、インサイツ・カスパーゼ-3キット（ミリポア）を使用した。細胞を0.5 x 106個/mlの濃度で6穴プレートに入れ、式Aの化合物のS-異性体（200〜5000 nM）、UBX（10,000 ng/ml〜10 ng/ml）、またはUBXと式Aの化合物のS-異性体（示した通り）のいずれかで処理し、37°Cおよび5% CO2で24時間インキュベートした。その後、細胞を微量遠心管に移し、新たに調製したFLICATM試薬10μlを加えて、暗所で1 時間、37°Cおよび5% CO2でインキュベートした。洗浄緩衝液で充分に洗浄した後、試験サンプルをPBS中の細胞数と等しくなるように調整した。各細胞懸濁液100 μlを黒色96穴プレートに二通り移し、蛍光を、励起波長の490 nmおよび発光波長の520 nmで、プレートリーダーにおいて読み取った。DMSO対照の蛍光強度を試験化合物の蛍光強度から引いた。データはカスパーゼ-3活性として表し、組み合わせ指数（C.I.）を計算した。1未満のCIは相乗効果を示し、1は相加効果を示し、1より大きい場合は拮抗作用を示す。
DBCL細胞株LY1についての結果を図11および表13〜15に示す。カスパーゼ-3活性はUBX（全ての濃度）および式Aの化合物のS-異性体（1000 nM）の存在下で相乗的に増加した。
バーキットリンパ腫細胞株Rajiについての結果を図12および表16〜18に示す。UBXはRaji LY1においてカスパーゼ-3活性を誘導した。カスパーゼ-3活性は、UBX（全ての濃度）および式Aの化合物のS-異性体（200 nM）の存在下で相乗的に増加した。
3種の追加の細胞株、LY10（DLBCL）、Toledo（DLBCL）およびDaudi（バーキットリンパ腫）について、上述の通り、カスパーゼ-3活性に対する式Aの化合物のS-異性体とUBXとの組み合わせの効果を評価した。結果を表19〜21に示す。この組み合わせは、カスパーゼ-3の相乗的活性化も示した。
3種のマントル細胞リンパ腫（MCL）細胞株である、Jeko、MaverおよびRec-1について、上述の通り、カスパーゼ-3活性に対する式Aの化合物のS-異性体とUBXとの組み合わせの効果を評価した。結果を表22〜24に示す。この組み合わせは、カスパーゼ-3の相乗的活性化も示し、相乗効果はより高濃度のS-異性体およびUBXで最適化された。
全体として、これらの結果は、式Aの化合物のS-異性体およびUBXが、B細胞リンパ腫モデルにおいて、アポトーシスのマーカーであるカスパーゼ-3の活性化に強い相乗作用を与えることを示す。
本発明については、特定の機能およびそれらの関係の実行を説明する、機能的ビルディングブロックを用いて上記で述べた。これらの機能的ビルディングブロックの境界線は、説明の都合上、本書では任意に規定されている。特定の機能およびそれらの関係が適切に実施される限り、別の境界線を規定してもよい。
特定の態様についての上述の説明によって、本発明の一般概念を逸脱することなく、他者が当業界の技術の範囲内の知識を適用することによって、過度の実験をせずに、特定の態様等の種々の適用を容易に修正および／または適合させることができる、本発明の一般的性質が完全に明らかになるであろう。従って、このような適合および修正は、本書で示された教示および指針に基づいて、開示された態様の等価物の意味および範囲内であることを意図する。本書における表現および用語は、説明することが目的であり、限定することを目的とせず、本明細書の用語または表現は、該教示および指針を踏まえて当業者が解釈し得る。本書で引用された参照文献は、参照することによって本明細書に援用する。

Claims (39)

  1. B細胞集団の増殖を抑制するインビトロの方法であって、該集団を、(i) 式Aの化合物、
    その立体異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩、または溶媒和物、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含む組み合わせと、接触させることを含む、方法。
  2. 該抗CD20抗体がウブリツキシマブであるか、またはウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するか、または前記抗体の抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
  3. 該抗体または断片が、配列番号1、2、および3の配列のVH CDR1、CDR2およびCDR3領域、および配列番号6、7、および8の配列のVL CDR1、CDR2およびCDR3領域を含むものである、請求項１に記載の方法。
  4. 抗CD20抗体またはその抗原結合断片が、配列番号4のVHおよび配列番号9のVLを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 該抗CD20抗体が、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、GA101、AME-133v、PRO131921、トシツモマブ、hA20、およびPRO70769、または前記抗体の抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 式Aの該化合物が、
    (RS)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；または
    (R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンである、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
  7. 集団を、
    (i) (RS)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
    (R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される化合物、および
    (ii) 抗CD20抗体、を含む組成物、と接触する、
    請求項１〜６のいずれか一項の方法。
  8. 集団を、
    (i) (RS)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
    (R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンよりなる群から選択される化合物を含む第一の組成物、および
    (ii) 抗CD20抗体を含む第二の組成物と接触する、
    請求項１〜７のいずれか一項の方法。
  9. 抗CD20抗体がウブリツキシマブである、請求項１〜４または６〜８のいずれか一項の方法。
  10. 式Aの化合物が、(S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンである、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
  11. (i) 式Aの化合物、
    その立体異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩、または溶媒和物、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含む組み合わせを含む、
    過剰なB細胞増殖に関連する疾病または疾患、あるいは血液悪性疾患を処置するための医薬。
  12. 該抗CD20抗体がウブリツキシマブであるか、またはウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するか、または前記抗体の抗原結合断片である、請求項１１に記載の医薬。
  13. 該抗CD20抗体が、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、GA101、AME-133v、PRO131921、トシツモマブ、hA20、およびPRO70769、または前記抗体の抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬。
  14. 前記化合物が、
    (RS)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
    (R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンから選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項の医薬。
  15. 該抗CD20抗体がウブリツキシマブである、請求項１１、１２または１４のいずれか一項の医薬。
  16. 式Ａの化合物が、
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンである、請求項１１〜１５のいずれか一項の医薬。
  17. 前記化合物が、
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンのｐ−トルエンスルホン酸塩であり、前記抗CD20抗体がウブリツキシマブである、請求項１１、１２または１４〜１６のいずれか一項の医薬。
  18. 血液悪性疾患がリンパ腫または白血病である、請求項１１〜１７のいずれか一項の医薬。
  19. 血液悪性疾患が、急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、多発性骨髄腫（MM）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、濾胞性リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（WM）、B細胞リンパ腫およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）よりなる群から選択される、請求項１８の医薬。
  20. 血液悪性疾患が、CD20を過剰発現している、および／または血液悪性疾患が、化学療法に不応性である、請求項１１〜１９のいずれか一項の医薬。
  21. 被験者が、化学療法、リツキシマブ、またはそれらの組み合わせで以前に治療されている、請求項１１〜２０のいずれか一項の医薬。
  22. 該化合物および該抗CD20抗体または断片が、被験者に連続的にまたは同時に投与される、請求項１１〜２１のいずれか一項の医薬。
  23. 該化合物および該抗CD20抗体または断片が、同一の医薬組成物中に、または別々の医薬組成物中に含有される、請求項１１〜２２のいずれか一項の医薬。
  24. 前記治療の組み合わせが、少なくとも１つの追加の治療薬を含む、請求項１１〜２３のいずれか一項の医薬。
  25. 追加の治療薬が、プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））、カルフィルゾミブ（PR-171）、PR-047、ジスルフィラム、ラクタシスチン、PS-519、エポネマイシン、エポキソマイシン、アクラシノマイシン、CEP-1612、MG-132、CVT-63417、PS-341、ビニルスルホントリペプチド阻害剤、リトナビル、PI-083、(+/-)-7-メチルオムラリド、(-)-7-メチルオムラリド、レナリドミド、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項２４の医薬。
  26. 前記治療の組み合わせが、以下よりなる群から選択される少なくとも２つの追加の治療薬を含む、請求項１１〜２５のいずれか一項の医薬。
    a) CHOP（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）；
    b) R-CHOP（リツキシマブ-CHOP）；
    c) ハイパーCV AD（多分割シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン、メトトレキサート、シタラビン）；
    d) R-ハイパーCV AD（リツキシマブ-ハイパーCV AD）；
    e) FCM（フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン）；
    f) R-FCM（リツキシマブ、フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン）；
    g) ボルテゾミブおよびリツキシマブ；
    h) テムシロリムスおよびリツキシマブ；
    i) テムシロリムスおよびベルケイド（登録商標）；
    j) ヨウ素-131 トシツモマブ（ベキサール（登録商標））およびCHOP；
    k) CVP（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）；
    l) R-CVP（リツキシマブ-CVP）；
    m) ICE（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；
    n) R-ICE（リツキシマブ-ICE）；
    o) FCR（フルダラビン、シクロホスファミド、リツキシマブ）；
    p) FR（フルダラビン、リツキシマブ）；および
    q) D.T. PACE（デキサメタゾン、サリドマイド、シスプラチン、アドリアマイシン、シクロホスファミド、エトポシド）。
  27. (i) 式Aの化合物、
    その立体異性体、またはそれらの薬学的に許容される塩、または溶媒和物、および(ii) 抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含む、過剰なB細胞増殖に関連する疾病または疾患、あるいは血液悪性疾患を処置するためのキット。
  28. 該抗CD20抗体がウブリツキシマブであるか、またはウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するか、または前記抗体の抗原結合断片である、請求項２７のキット。
  29. 該抗CD20抗体が、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、GA101、AME-133v、PRO131921、トシツモマブ、hA20、およびPRO70769、または前記抗体の抗原結合断片からなる群から選択される、請求項２７のキット。
  30. 前記式Aの化合物が、
    (RS)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
    (R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンからなる群から選択される、請求項２７〜２９のいずれか一項のキット。
  31. 該抗CD20抗体がウブリツキシマブである、請求項２７、２８または３０のいずれか一項のキット。
  32. 式Ａの化合物が、
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンである、請求項２７〜３１のいずれか一項のキット。
  33. 前記化合物が、
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンのｐ−トルエンスルホン酸塩であり、前記抗CD20抗体がウブリツキシマブである、請求項２７、２８または３０〜３２のいずれか一項のキット。
  34. 該抗CD20抗体または断片及び該化合物が、同一の組成物中に、または別々の組成物中に含有される、請求項２７〜３３のいずれか一項のキット。
  35. １以上の追加の治療薬をさらに含む、請求項２７〜３４のいずれか一項のキット。
  36. (i) (RS)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オン；および
    (R)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンからなる群から選択される、式Aの化合物、
    またはそれらの薬学的に許容される塩、および
    (ii)抗CD20抗体またはその抗原結合断片を含む、過剰なB細胞増殖に関連する疾病または疾患、あるいは血液悪性疾患を処置するための医薬組成物。
  37. 該抗CD20抗体がウブリツキシマブであるか、またはウブリツキシマブと同一のエピトープに結合するか、または前記抗体の抗原結合断片である、請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 前記式Aの化合物が、
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンである、請求項３６または３７の医薬組成物。
  39. 前記化合物が、
    (S)-2-(1-(4-アミノ-3-(3-フルオロ-4-イソプロポキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)エチル)-6-フルオロ-3-(3-フルオロフェニル)-4H-クロメン-4-オンのｐ−トルエンスルホン酸塩であり、前記抗CD20抗体がウブリツキシマブである、請求項３６〜３８のいずれか一項の医薬組成物。
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