RS60844B1

RS60844B1 - Kombinacija anti-cd20 antitela i selektivnog inhibitora pi3 kinaze

Info

Publication number: RS60844B1
Application number: RS20201003A
Authority: RS
Inventors: Michael Weiss; Hari Miskin; Peter Sportelli; Swaroop K V S Vakkalanka
Original assignee: Tg Therapeutics Inc; Rhizen Pharmaceuticals S A; Lab Francais Du Fractionnement
Priority date: 2012-11-02
Filing date: 2013-11-01
Publication date: 2020-10-30
Also published as: JP6437441B2; EA201590866A1; US9694071B2; JP2016505515A; CL2015001124A1; AU2020203417A1; KR102341275B1; SMT202000543T1; KR102185175B1; AU2018203579A1; CN105073197A; CN110269941A; MX2015005555A; EP3756686A1; AU2013337733B2; KR20150084885A; MX375325B; EP3150256A1; CA2890176A1; US20200323981A1

Description

Opis pronalaska

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI

[0001] Ovde su obezbeđene visoko efektivne kombinacije Jedinjenja formule A (selektivnog inhibitora PI3Kδ) i anti-CD20 antitela za lečenje i pobolјšanje stanja u oboljenjima i poremećajima posredovanim sa PI3Kδ i/ili CD20. Preciznije, kombinacija može biti upotrebljena za lečenje kancera i autoimunih oboljenja. Još preciznije, pronalazak obezbeđuje kombinaciju Jedinjenja formule A, ili njegovih stereoizomera, i ublituksimaba za lečenje i/ili pobolјšanje stanja kod hematoloških maligniteta, kao što su leukemija i limfom.

POZNATO STANJE TEHNIKE

[0002] Postoje značajni dokazi koji ukazuju da i enzimi PI3Kδ i CD20 pojedinačno doprinose tumorigenezi kod širokog spektra humanih kancera, a posebno kod hematoloških maligniteta. Fosfoinozitid-3-kinaze (PI3K) su familija enzima koji regulišu raznovrsne biološke funkcije u svakoj vrsti ćelija, generisanjem fosfoinozitidnih molekula kao sekundarnih glasnika. Kako je aktivnost ovih fosfoinozitidnih sekundarnih glasnika određena njihovim fosforilacionim statusom, kinaze i fosfaze koje deluju tako što modifikuju ove lipide su od centralne važnosti za pravilno izvršavanje unutarćelijskih signalnih događaja. PI3K fosforilišu lipide na 3-hidroksilnom ostatku inozitolnog prstena (Whitman i saradnici, Nature 332:664 (1988)) da bi se generisali fosforilisani fosfolipidi (PIP3) koji deluju kao kinaze sa domenima za vezivanje lipida regrutujući tako sekundarne glasnike (uklјučujući regione homologne plekstrinu (PH)), kao što su Akt i fosfoinozitid-zavisna kinaza-1 (PDK1). Vezivanje Akt za membranske PIP3 prouzrokuje translokaciju Akt u plazma membranu, dovodeći Akt u kontakt sa PDK1, a koji je odgovoran za aktiviranje Akt-a. Tumor-supresorska fosfataza, PTEN (od engl. Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten), defosforiliše PIP3 i tako deluje kao negativni regulator aktivacije Akt-a. PI3-kinaze Akt i PDK1 su važne u regulaciji mnogih ćelijskih procesa, uklјučujući regulaciju ćelijskog ciklusa, proliferaciju, preživlјavanje, apoptozu i motilitet, a značajne su i kao komponente molekulskih mehanizama oboljenja kao što su kancer, dijabetes i imunska inflamacija (Vivanco i saradnici, Nature Rev. Cancer 2:489 (2002); Phillips i saradnici, Cancer 83:41 (1998)).

[0003] PI3K familiju čine četiri različite klase: Klase I, II, III i IV. Klase I-III su lipidne kinaze, dok u Klasu IV spadaju serin/treoninske proteinske kinaze.

[0004] Članovi Klase I PI3K familije su dimeri regulatorne i katalitičke subjedinice. Familija Klase I se sastoji od četiri izoforme, određene 110 kDa katalitičkim subjedinicama α, β, γ i δ. Pogledati, Engelman J.A, Nat Rev Genet 7:606-619 (2006); Carnero A, Curr Cancer Drug Targets 8:187-198 (2008); i Vanhaesebroeck B, Trends Biochem Sci 30:194-204 (2005). Klasa I može biti podeljena u dve podklase: Klasa Ia, koja nastaje kombinacijom p110 α, β i δ sa regulatornom subjedinicom (p85, p55 ili p50); i Klasa Ib, koj nastaje od p110γ i p101 regulatornih subjedinica.

[0005] Razne istraživačke grupe su objavile studije u vezi PI3K i srodnih protein kinaznih puteva, uklјučujući: Liu i saradnici, Nature Reviews Drug Discovery 8:627-644 (2009); Nathan i saradnici, Mol. Cancer Ther. 8(1) (2009); i Marone i saradnici, Biochimica et Biophysica Acta 1784:159-185 (2008). Dva poznata inhibitora PI3K, LY294002 i vortmanin, su nespecifični inhibitori PI3K pošto ne razlikuju četiri člana Klase I PI3K: α, β, γ i δ. Brojni inhibitori PI3K su ušli u klinička ispitivanja za lečenje kancera, a razne vrste kancera, uklјučujući kancer dojke, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC) i hematološke kancere, razmatraju se kao oblasti od terapijskog interesa.

[0006] CD20 je hidrofobni transmembranski protein molekulske težine 35-37 kDa, koji je prisutan na površini zrelih B limfocita. Eksprimira se tokom razvoja B limfocitnih ćelija (B-ćelija), od ranog pre-B stadijuma do diferencijacije u plazmocite, faze u kojoj ovakva ekspresija nestaje. CD20 je prisutan i u normalnim B limfocitima i u malignim B-ćelijama, uklјučujući većinu ne-Hočkinovih B-ćelijskih limfoma (NHL) i B-tipa hronične limfocitne leukemije (B-CLL). Antigen CD20 se ne eksprimira na hematopoetskim matičnim ćelijama niti na plazmocitima.

[0007] Anti-CD20 antitela su razvijena, i nastavlјaju da se razvijaju, za lečenje oboljenja povezanih sa B-ćelijama. Uspešno dejstvo je tako prijavljeno za anti-CD20 antitelo rituksimab. Ipak, postoji značajan broj pacijenata koji su rezistentni na lečenje sa rituksimabom ili koji razvijaju rezistenciju tokom dužeg lečenja sa rituksimabom (upotrebljenim kao jedinim sredstvoma ili čak u kombinaciji sa hemoterapijskim režimima).

[0008] Shodno navedenom, postoji potreba za efektivnijim terapijama za lečenje i/ili ublažavanje stanja kod oboljenja ili poremećaja povezanih sa modulacijom PI3Kδ enzima i/ili CD20 proteina, a naročito za lečenje i pobolјšanje stanja kod oboljenja povezanih sa B-ćelijama.

[0009] WO2010/014595 opisuje postupke za lečenje B-ćelijskih maligniteta kod subjekta koji obuhvataju sekvencijalnu strategiju, da bi se izbegao antagonizam između sredstva za pojačavanje urođenog imuniteta koji sadrži lenalidomid, i anti-CD20 antitela koja sadrži rituksimab, u terapijskom režimu za subjekta.

[0010] EP2000541 opisuje humanizovano anti-humano CD20 monoklonsko antitelo koje ispoljava biološke karakteristike pogodne za upotrebu u vidu farmaceutika.

[0011] WO2014/006572 se odnosi na selektivne inhibitore PI3K delta proteinskih kinaza koje sadrže 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidinski sistem prstenova.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0012] Predmetni pronalazak je usmeren na in vitro postupak inhibiranja proliferacije ćelijske populacije koji obuhvata kontakt populacije sa kombinacijom koja sadrži

(i) jedinjenje formule A,

njegov stereoizomer, ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat, i

(ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

U određenim primerima izvođenja, navedeno anti-CD20 antitelo je ublituksimab, ili se vezuje za isti epitop kao ublituksimab, ili predstavlja fragment navedenog antitela koji vezuje antigen. U određenim primerima izvođenja, navedeno antitelo ili fragment sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 regione iz sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 i 3, kao i VL CDR1, CDR2 i CDR3 regione iz sekvenci SEQ ID NO: 6, 7 i 8, po izvboru, pri čemu anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 9.

[0013] U određenim primerima izvođenja, navedeno jedinjenje formule A je (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on; ili (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.

[0014] U određenim primerima izvođenja, populacija se dovodi u kontakt sa kompozicijom koja sadrži

(i) jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, i

(ii) anti-CD20 antitelo.

[0015] U određenim primerima izvođenja, populacija se dovodi u kontakt sa

(i) prvom kompozicijom koja sadrži jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d] pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, i

(i) drugom kompozicijom koja sadrži anti-CD20 antitelo.

[0016] U određenim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo je ublituksimab. U određenim primerima izvođenja, jedinjenje formule A je (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.

[0017] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na terapijsku kombinaciju koja sadrži:

(i) jedinjenje formule A,

njegov stereoizomer, ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat;

i

(ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen,

za upotrebu u vidu medikamenta za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem.

[0018] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na jedinjenje formule (A), ili na njegov stereoizomer, njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat, za upotrebu u vidu medikamenta u postupku za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem, pri čemu postupak obuhvata primenu jedinjenja u kombinaciji sa anti-CD20 antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen.

[0019] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u vidu medikamenta u postupku za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem, pri čemu postupak obuhvata primenu anti-CD20 antitela ili fragmenta u kombinaciji sa Jedinjenjem formule (A) ili njegovim stereoizomerom, njegovom farmaceutski prihvatlјivom soli ili solvatom.

[0020] Kombinacija je pogodna za upotrebu u lečenju oboljenja, poremećaja ili stanja povezanog sa PI3Kδ enzimom i/ili CD20 proteinom, npr. proliferativnog oboljenja kao što je kancer. Preciznije, kombinacija je pogodna za lečenje i ili ublažavanje oboljenja povezanih sa B-ćelijama, npr. hematoloških maligniteta.

[0021] Tako, u skladu sa patentnim zahtevima, obezbeđeni su in vitro postupci inhibiranja proliferacije ćelijske populacije. Takođe su obezbeđeni, u skladu sa patentnim zahtevima, terapijska kombinacija; jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat; ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u vidu medikamenta u postupku za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem.

[0022] U pojedinim primerima izvođenja, postupak obuhvata kontakt populacija sa kombinacijom koja sadrži (i) jedinjenje formule A, njegov stereoizomer, njegov tautomer ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat, (ii) i anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu se anti-CD20 antitelo ili fragment vezuje za isti epitop kao i ublituksimab.

[0023] U pojedinim primerima izvođenja, postupak obuhvata kontakt ćelijske populacije sa kombinacijom koja sadrži (i) jedinjenje formule A, njegov stereoizomer, njegov tautomer ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat, (ii) i anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu anti-CD20 antitelo ili fragment ispoljavaju visok afinitet za Fc-gamaRIII (CD16).

[0024] U pojedinim primerima izvođenja, postupak obuhvata kontakt ćelijske populacije kombinacijom koja sadrži (i) jedinjenje formule A, njegov stereoizomer, njegov tautomer ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat i (ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu je sadržaj fukoze u antitelu ili fragmentu manji od 65%.

[0025] U pojedinim primerima izvođenja, postupak obuhvata kontakt ćelijske populacije sa kombinacijom koja sadrži (i) jedinjenje formule A, njegov stereoizomer, njegov tautomer ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat, i (ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu antitelo ili fragment sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 regione iz sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 i 3, kao i VL CDR1, CDR2 i CDR3 regione iz sekvenci SEQ ID NO: 6, 7 i 8. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 9. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo je ublituksimab.

[0026] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A je

(RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on;

(S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on; ili

(R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.

[0027] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A je (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.

[0028] U pojedinim primerima izvođenja, in vitro postupak inhibiranja proliferacije ćelijske populacije obuhvata kontakt populacije sa kombinacijom koja sadrži (i) najmanje jedno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od 2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona i (ii) najmanje jedno anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

[0029] U pojedinim primerima izvođenja, in vitro postupak inhibiranja proliferacije ćelijske populacije obuhvata kontakt populacije sa kombinacijom koja sadrži (i) jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od 2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il) etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona i (ii) najmanje jedno anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu je anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment, izabrano iz grupe koja se sastoji od antitela i njihovih fragmenata koji se vezuju za isti epitop kao ublituksimab, rituksimab, ofatumumab, okrelizumab, veltuzumab, GA101, AME-133v, PRO131921, tozitumomab, hA20 i PRO70769.

[0030] U pojedinim primerima izvođenja, populacija se dovodi u kontakt sa kompozicijom koji sadrži

(i) jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od

2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona;

(S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i

(R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, i

(ii) anti-CD20 antitelo.

[0031] U pojedinim primerima izvođenja, populacija se dovodi u kontakt sa

(i) prvom kompozicijom koja sadrži jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od

1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, i

(ii) drugom kompozicijom koja sadrži anti-CD20 antitelo.

[0032] U pojedinim primerima izvođenja, populacija sadrži B-ćelije.

[0033] U pojedinim primerima izvođenja, terapijska kombinacija; jedinjenja formule (A) ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat; ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, su za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevima, pri čemu je populacija u humanom subjektu.

[0034] U skladu sa patentnim zahtevima, subjekat boluje od oboljenja ili poremećaja koji je povezan sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem.

[0035] U pojedinim primerima izvođenja, subjekt boluje od kancera. U pojedinim primerima izvođenja, kancer je hematološki malignitet. U pojedinim primerima izvođenja, hematološki malignitet je limfom ili leukemija. U pojedinim primerima izvođenja, hematološki malignitet je izabran iz grupe koja se sastoji od akutne limfocitne leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije (CLL), sitnoćelijskog limfocitnog limfoma (SLL), multiplog mijeloma (MM), ne-Hočkinovog limfoma (NHL), limfoma mantle ćelija (MCL), folikularnog limfoma, Valdenstromove makroglobulinemije (WM), B-ćelijskog limfoma i difuznog krupnoćelijskog B-limfoma (DLBCL). U pojedinim primerima izvođenja, kancer prekomerno eksprimira CD20. U pojedinim primerima izvođenja, kancer je refraktoran na hemoterapiju.

[0036] U pojedinim primerima izvođenja, subjekt boluje od autoimunog oboljenja ili poremećaja. U pojedinim primerima izvođenja, autoimuno oboljenje ili poremećaj je alergijski rinitis, astma, hronična opstruktivna bolest pluća (HOPB) ili reumatoidni artritis.

[0037] U pojedinim primerima izvođenja, subjekt je refraktoran na rituksimab.

[0038] U pojedinim primerima izvođenja, subjekt je prethodno lečen sa hemoterapijom, rituksimabom ili njihovom kombinacijom.

[0039] U pojedinim primerima izvođenja, (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on i anti-CD20 antitelo ili fragment se primenjuju sekvencijalno.

[0040] U pojedinim primerima izvođenja, (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on i anti-CD20 antitelo ili fragment se primenjuju istovremeno. U pojedinim primerima izvođenja, (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on i antitelo ili fragment anti-CD20 su sadržani u istoj farmaceutskoj kompoziciji. U pojedinim primerima izvođenja, (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on i anti-CD20 antitelo ili fragment su u odvojenim farmaceutskim kompozicijama.

[0041] U pojedinim primerima izvođenja, terapijska kombinacija; jedinjenja formule (A) ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat; ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, su za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevima, pri čemu postupak dalјe obuhvata primenu najmanje jednog dodatnog terapijskog sredstva subjektu. U pojedinim primerima izvođenja, najmanje jedno dodatno terapijsko sredstvo je izabrano iz grupe koju čine inhibitor proteazoma, Bortezomib (Velcade®), Carfilzomib (PR-171), PR-047, disulfiram, laktacistin, PS-519, eponemicin, epoksomicin, aklacinomicin, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, vinil sulfon tripeptidni inhibitori, ritonavir, PI-083, (+/-)-7-metilomuralid, (-)-7-metilomuralid, lenalidomid i njihove kombinacije.

[0042] U pojedinim primerima izvođenja, terapijska kombinacija; jedinjenja formule (A) ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat; ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, su za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevima, pri čemu postupak dalјe obuhvata primenu najmanje dva dodatna terapijska sredstva subjektu, pri čemu su najmanje dva dodatna terapijska sredstva izabrana iz grupe koju čine: a) CHOP (ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin, prednizon); b) R-CHOP (rituksimab-CHOP); c) hiperCV AD (hiperfrakcionisani ciklofosfamid, vinkristin, doksorubicin, deksametazon, metotreksat, citarabin); d) R-hiperCV AD (rituksimab-hiperCV AD); e) FCM (fludarabin, ciklofosfamid, mitoksantron); f) R-FCM (rituksimab, fludarabin, ciklofosfamid, mitoksantron); g) bortezomib i rituksimab; h) temzirolimus i rituksimab; i) temzirolimus i Velcade®; j) jod-131 tozitumomab (Bexxar.RTM.) i CHOP; k) CVP (ciklofosfamid, vinkristin, prednizon); 1) R-CVP (rituksimab-CVP); m) ICE (ifosfamid, karboplatin, etopozid); n) R-ICE (rituksimab-ICE); o) FCR (fludarabin, ciklofosfamid, rituksimab); p) FR (fludarabin, rituksimab); i q) D.T. PACE (Deksametazon, Talidomid, Cisplatin, Adriamicin, Ciklofosfamid, Etopozid).

[0043] U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za depleciju B-ćelija. U pojedinim primerima izvođenja, postupak obuhvata kontakt kompozicije koja sadrži B-ćelije sa (i) najmanje jednim jedinjenjem formule A izabranim iz grupe koja se sastoji od 2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il) etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, kao i (ii) najmanje jednim anti-CD20 antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen.

[0044] U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za pospešivanje apoptoze. U pojedinim primerima izvođenja, postupci obuhvataju kontakt B-ćelije sa (i) najmanje jednim jedinjenjem formule A izabranim iz grupe koja se sastoji od 2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil))-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il) etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona i sa (ii) najmanje jednim anti-CD20 antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen.

[0045] U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za zaustavlјanje ćelijskog ciklusa. U pojedinim primerima izvođenja, postupci obuhvataju kontakt ćelije sa (i) najmanje jednim jedinjenjem formule A izabranim iz grupe koja se sastoji od 2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H -pirazol[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il) etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona i sa (ii) najmanje jednim anti-CD20 antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen.

[0046] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo ili fragment se isporučuju sekvencijalno.

[0047] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo ili fragment se isporučuju istovremeno. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo ili fragment se isporučuju u istoj kompoziciji. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo ili fragment se isporučuju u odvojenim kompozicijama.

[0048] Prema pronalasku, obezbeđen je i komplet koji sadrži (i) jedinjenje formule A, njegov stereoizomer ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat i (ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

[0049] U pojedinim primerima izvođenja, komplet sadrži

(i) jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od

(ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

[0050] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili fragment i jedinjenje su sadržani unutar iste kompozicije.

[0051] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili fragment i jedinjenje su u odvojenim kompozicijama.

[0052] U pojedinim primerima izvođenja, komplet sadrži jedno ili više od dodatnih aktivnih sredstava.

[0053] Obezbeđena je takođe, u skladu sa pronalaskom, farmaceutska kompozicija koja sadrži:

(i) jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od

(ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

[0054] U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži

(i) jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od

(ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu se anti-CD20 antitelo ili fragment (a) vezuje za isti epitop kao ublituksimab, (b) pokazuje visok afinitet za Fc-gamaRIII (CD16) ili (c) sa sadržajem su fukoze koji je manji od 65%.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0055]

Slika 1: Grafici sa stubićima koji prikazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A i Ublituksimaba na depleciju ćelija pozitivnih na CD19 (levo) i depleciju ćelija pozitivnih na CD20 (desno) iz pune krvi čoveka.

Slika 2: Grafici sa stubićima koji prikazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A i Ublituksimaba na proliferaciju ćelija pozitivnih na CD19, prouzrokovanu sa LPS-om.

Slika 3: Grafici sa stubićima koji prikazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A i Ublituksimaba na proliferaciju ćelija pozitivnih na CD20, prouzrokovanu sa LPS-om.

Slika 4: Grafici sa stubićima koji prikazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A i Ublituksimaba na apoptozu u Daudi, RPMI-8226, Raji i U266B1 ćelijama.

Slika 5: Histogrami koji prikazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A na ćelijski ciklus u U226B1 ćelijama.

Slika 6: Histogrami koji prikazuju uticaj anti-CD20 antitela ublituksimaba na ćelijski ciklus u U226B1 ćelijama.

Slika 7: Histogrami koji prikazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela ublituksimaba na ćelijski ciklus u U226B1 ćelijama.

Slika 8: Histogrami koji prikazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A na ćelijski ciklus u Raji ćelijama.

Slika 9: Histogrami koji prikazuju uticaj anti-CD20 antitela ublituksimaba na ćelijski ciklus u Raji ćelijama.

Slika 10: Histogrami koji prikazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela ublituksimaba na ćelijski ciklus u Raji ćelijama.

Slika 11: Plotovi aktivnosti kaspaze 3 koji pokazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A i Ublituksimaba na apoptozu u LY1 ćelijama.

Slika 12: Plotovi aktivnosti kaspaze 3 koji pokazuju uticaj S-izomera Jedinjenja formule A i Ublituksimaba na apoptozu u Raji ćelijama.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

I. Definicije

[0056] Da bi se olakšalo razumevanje predmetnog pronalaska, u nastavku teksta su definisani brojni pojmovi i fraze.

[0057] Termin "CD20" (takođe poznat kao CD20 antigen B limfocita, MS4A1, površinski antigen B limfocita B1, Bp35, površinski antigen leukocita Leu-16) odnosi se na bilo koji nativni CD20, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Pojam "CD20" obuhvata neobrađen CD20 "pune dužine", kao i bilo koji oblik CD20 koji je rezultat obrade unutar ćelije. Termin takođe obuhvata varijante CD20 koje se javlјaju u prirodi, npr. varijante nastale obradom, alelske varijante i izoforme. CD20 polipeptidi koji su ovde opisani, mogu biti izolovani iz raznovrsnih izvora, kao što su različiti tipovi hujmanih tkiva ili iz drugih izvora, ali mogu biti pripremljeni i rekombinantnim ili sintetskim postupcima. Primeri CD20 sekvenci obuhvataju, ali nisu ograničeni na, NCBI referentne brojeve NP_068769.2 i NP_690605.1.

[0058] Pojam "antitelo" označava imunoglobulinski molekul koji prepoznaje i specifično se vezuje za cilјni molekul, kao što je protein, polipeptid, peptid, uglјeni hidrat, polinukleotid, lipid ili kombinacije prethodno navedenih, preko najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena unutar varijabilnog regiona imunoglobulinskog molekula. Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitelo" obuhvata intaktna poliklonska antitela, intaktna monoklonska antitela, fragmente antitela (kao što su Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmenti), jednolančane Fv (scFv) mutante, multispecifična antitela kao što su bispecifična antitela generisana od najmanje dva intaktna antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzione proteine koji sadrže deo antitela koji određuje specifičnost za antigen, kao i bilo koji drugi modifikovan imunoglobulinski molekul koji sadrži mesto za prepoznavanje antigena, sve dok antitela ispoljavaju želјenu biološku aktivnost. Antitelo može biti bilo koje od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ili njihovih podklasa (izotipova) (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), što se zasniva na identitetu njihovih konstantnih domena teških lanaca koji se označavaju kao alfa, delta, epsilon, gama i mi, tim redom. Različite klase imunoglobulina su sa različitim i dobro poznatim strukturama subjedinica, kao i trodimenzionalnim konfiguracijama. Antitela mogu biti "gola" ili konjugovana sa drugim molekulima poput toksina, radioizotopa, proteina itd.

[0059] "Blokirajuće" antitelo ili "antagonističko" antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena za koga se vezuje, kao što je CD20. U određenom primeru izvođenja, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela značajno ili potpuno inhibiraju biološku aktivnost antigena. Poželјno je da se biološka aktivnost smanjuje za 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak 100%.

[0060] Termin "anti-CD20 antitelo" ili "antitelo koje se vezuje za CD20" se odnosi na antitelo koje je u stanju da vezuje CD20 sa dovolјnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u cilјanom dejstvu na CD20. Obim vezivanja anti-CD20 antitela za nesrodan protein koji je različit od CD20, manji je za oko 10% od vezivanja antitela za CD20, što se meri, npr. radioimunološkom analizom (RIA). U određenim primerima izvođenja, antitelo koje se vezuje za CD20 je sa konstantom disocijacije (Kd) od ≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM ili ≤0,1 nM.

[0061] Pojam "fragment antitela" se odnosi na deo intaktnog antitela i odnosi se varjabilne regione intaktnog antitela koji su specifični za antigen. Primeri fragmenata antitela obuhvataju, ali nisu obraničeni na, Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, linearna antitela, jednolančana antitela i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata antitela.

[0062] "Monoklonsko antitelo" se odnosi na homogenu populaciju antitela koja je uklјučena u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje za jedinstvenu antigenu detrminantu ili epitop. Navedeno je u suprotnosti sa poliklonskim antitelima koja obično podrazumevaju različita antitela koja su usmerena na različite antigene detrminante. Termin "monoklonsko antitelo" obuhvata intaktna i monoklonska antitela pune dužine, kao i fragmente antitela (poput Fab, Fab’, F(ab')2, Fv), jednolančane (scFv) mutante, fuzione proteine koji sadrže deo antitela i bilo koji drugi modifikovani imunoglobulinski molekul koji sadrži mesto za prepoznavanje antigena. Štaviše, "monoklonsko antitelo" se odnosi na takva antitela koja su napravlјena na bilo koji od brojnih načina, uključujući, ali se ne ograničavajući samo na, od strane hibridoma, fagnom selekcijom, rekombinantnom ekspresijom i u transgenim životinjama.

[0063] Pojam "humanizovano antitelo" se odnosi na oblike antitela koji nisu humani (npr. mišja su), a koji su specifični imunoglobulinski lanci, himerni imunoglobulini ili njihovi fragmenti koji sadrže minimalne sekvence koje nisu humane (npr. mišje su). Uobičajeno je da su humanizovana antitela humani imunoglobulini u kojima su ostaci iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) zamenjeni ostacima iz CDR sekvenci vrsta različitih od čoveka (npr. iz miša, pacova, zeca, hrčka), a koje karakteriše željena specifičnost, afinitet i sposobnost (Jones i saradnici, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann i saradnici, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen i saradnici, Science, 239:1534-1536 (1988)). U pojedinim slučajevima, ostaci Fv uokvirujućih regiona (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju sa odgovarajućim ostacima u antitelu iz vrste različite od čoveka koje je sa željenom specifičnošću, afinitetom i sposobnosću. Humanizovano antitelo može dalјe biti modifikovano supstitucijom dodatnih ostataka, bilo u Fv uokvirujućem regionu i/ili unutar zamenjenih ostataka koji nisu humani, da bi se fino podesili i optimizovali specifičnost, afinitet i/ili sposobnost antitela. U principu, humanizovano antitelo će uglavnom sadržavati sve od najmanje jednog, a obično dva ili tri varijabilnih domena koji sadrže sve ili suštinski sve od CDR regiona koji odgovaraju imunoglobulinu koji nije humani, dok su svi ili suštinski svi FR regioni oni iz humane imunoglobulinske konsenzusne sekvence. Humanizovano antitelo može takođe sadržavati najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona ili domena (Fc), obično onaj koji je iz humanog imunoglobulina. Primeri postupaka koji se upotrebljavaju za generisanje humanizovanih antitela su opisani u U.S. Pat.

5,225,539 ili 5,639,641.

[0064] "Varijabilni region" antitela se odnosi na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo samostano ili u kombinaciji. Svaki od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca se sastoji od četiri uokvirujuća regiona (FR) koji su povezani sa tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poznatih i kao hipervarijabilni regioni. CDR regioni se u svakom lancu drže zajedno u neposrednoj blizini FR regiona i, sa CDR regionima drugog lanca, doprinose obrazovanju mesta za vezivanje antigena u okviru antitela. Postoje najmanje dve tehnike za utvrđivanje CDR: (1) pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama (tj. Kabat i saradnici, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5. izdanje, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); i (2) pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigen-antitelo (Al-lazikani i saradnici, J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)). Pored toga, kombinacije ova dva pristupa se ponekada koriste u oblasti tehnike za određivanje CDR sekvenci.

[0065] Kabatov sistem numeracije se generalno upotrebljava kada se označava ostatak u varijabilnom domenu (približno ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca) (npr. Kabat i saradnici, Sequences of Immunological Interest. 5. Izdanje, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[0066] Numeracija pozicija aminokiselina po Kabatu, odnosi se na sistem numeracije koji se upotrebljava za varijabilne domene teških lanaca ili varijabilne domene lakih lanaca iz kompilacije antitela u publikaciji Kabata i saradnika, Sequences of Immunological Interest. 5. Izdanje, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Upotrebom ovog sistema numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržavati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju, ili inserciji u, FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uklјučivati jedan aminokiselinski insert (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 u H2, kao i insertovane ostatke (npr. ostatke 82a, 82b i 82c itd., prema Kabatu) nakon ostataka 82 unutar FR teškog lanca. Kabatova numeracija ostataka može biti utvrđena za dato antitelo poravnavanjem regiona homologije sekvenci antitela sa "standardnom" numerisanom Kabatovom sekvencom. Umesto navedenog, numeracija po Čotiji se odnosi na lokaciju strukturalnih petlјi (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kraj CDR-H1 petlјe prema numeraciji po Čotiji, a kada se numeracija vrši upotrebom Kabatove konvencije za numeraciju, varira između H32 i H34, u zavisnosti od dužine petlјe (pošto šema numeracija po Kabatu postavlјa inserte na H35A i H35B; ukoliko ni 35A ni 35B nisu prisutni, petlja se završava na 32; ukoliko postoji samo 35A, petlјa se završava na 33; ukoliko su prisutni i 35A i 35B, petlјa se završava na 34). AbM hipervarijabilnih regiona predstavlјaju kompromis između numeracije CDR regiona po Kabatu i strukturnih petlji po Čotiji, a upotrebljava se u kompjuterskom programu za AbM modeliranje antitela kompanije Oxford Molecular.

[0067] Pojam "humano antitelo" označava antitelo proizvedeno od strane čoveka ili antitelo sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara antitelu proizvedenom od strane čoveka, a koje je napravlјeno upotrebom bilo koje tehnike koja je poznata u oblasti. Ovakva definicija humanog antitela obuhvata intaktna ili antitela pune dužine, njihove fragmente i/ili antitela koja sadrže najmanje jedan polipeptid teškog i/ili lakog lanca kao što je, na primer, antitelo koje sadrži polipeptide mišjeg lakog lanca i humanog teškog lanca.

[0068] Termin "himerna antitela" se odnosi na antitela u kojima je amino kiselinska sekvenca imunoglobulinskog molekula izvedena iz dve ili više vrsta. Uobičajeno je da varijabilni region i lakih i teških lanaca odgovara varijabilnom regionu antitela izvedenih iz jedne vrste sisara (npr. iz miša, pacova, zeca itd.) sa želјenom specifičnošću, afinitetom i sposobnošću, dok su konstantni regioni homologni sekvencama iz antitela koje je izvedeno iz druge vrste (obično su humani) da bi se izbegao imunski odgovor u toj vrsti.

[0069] Termini "epitop" ili "antigena detrminanta" se ovde upotrebljavaju naizmenično i odnose se na onaj deo antigena koji je u stanju da bude prepoznat i specifično vezan od strane određenog antitela. Kada je antigen polipeptid, epitopi mogu biti obrazovani kako od susedih aminokiselina, tako i od aminokiselina koje nisu susedne već prostorno jedne nasuprot drugih usled tercijarnog uvijanja proteina. Epitopi obrazovani od susednih aminokiselina se obično zadržavaju takvima nakon denaturacije proteina, dok se epitopi obrazovani tercijarnim uvijanjem obično gube nakon denaturacije proteina. Epitop obično obuhvata najmanje 3, a češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.

[0070] "Afinitet vezivanja" se generalno odnosi na jačinu ukupnog broja nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kako se ovde upotrebljava, "afinitet vezivanja" se odnosi na inherentni afinitet vezivanja koji odražava interakciju odnosa 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y, uglavnom može biti predstavlјen konstantom disocijacije (Kd). Afinitet može biti izmeren uobičajenim postupcima poznatim u oblasti tehnike, uklјučujući one koji su ovde opisani. Antitela niskog afiniteta se uglavnom vezuju za antigen polako i imaju tendenciju da se lako i disociraju, dok antitela visokog afiniteta uglavnom vezuju antigen brže i teže da duže ostanu vezana. U oblasti tehnike su poznati razni postupci merenja afiniteta vezivanja, od kojih bilo koji može biti uporebljen za svrhe predmetnog pronalaska. Ovde su opisani specifični ilustrativni primeri izvođenja.

[0071] Izraz "ili više", kada ovde upotrebljava u konekstu afiniteta vezivanja, odnosi se na jače vezivanje između molekula i njegovog vezujućeg partnera. Izraz "ili više", kada kada ovde upotrebljava u konekstu jačeg vezivanja, predstavlja vezivanje sa manjom brojčanom vrednošću Kd. Na primer, antitelo koje je sa afinitetom za antigen od "0,6 nM ili više" označava da je afinitet antitela za antigen <0,6 nM, tj. iznosti 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM itd. ili je bilo koja vrednost manja od 0,6 nM.

[0072] Izraz "suštinski sličan" ili "suštinski isti", kako se ovde upotrebljava, označava dovolјno visok stepen sličnosti dve numeričke vrednosti (uglavnom jedne koja je povezana sa antitelom pronalaska i druge koja je povezana sa referentnim/antitelom sa kojim se upoređuje) tako da bi stručnjak iz oblasti tehnike uzeo u razmatranje razliku između dve vrednosti kao one sa malom ili bez biološke aktivnosti i/ili statističke značajnosti unutar konteksta bioloških karakteristika koje se mere navedenim vrednostima (npr. Kd vrednostima). Razlika između dve navedene vrednosti je manja od oko 50%, manja od oko 40%, manja od oko 30%, manja od oko 20% ili manja od oko 10%, u kontekstu funkcije vrednosti za referentno/komparativno antitelo.

[0073] Polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koji su "izolovani" predstavljaju polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćeliju ili kompoziciju koji su u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovani polipeptidi, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije ili kompozicije obuhvataju one koji su prečišćeni do stepena u kome više nisu u obliku koji se može naći u prirodi. Antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koji su izolovani, mogu biti suštinski čisti.

[0074] Kao što se ovde upotrebljava, "suštinski čist" se odnosi na materijal koji je čist najmanje 50% (tj. oslobođen je kontaminanata), najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili je čist najmanje 99%.

[0075] Termini "kancer" i "kancerogeni" se odnose ili opisuju fiziološko stanje kod sisara u kome populaciju ćelija karakteriše neregulisan ćelijski rast. Primeri kancera obuhvaju, ali nisu ograničeni samo na, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Precizniji primeri takvih kancera obuhvataju kancer skvamoznih ćelija, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, kancer gastrointestinalnog sistema, kancer pankreasa, glioblastom, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, hepatom, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma ili materice, kancer plјuvačnih žlezda, kancer bubrega, kancer jetre, kancer vulve, kancer štitne žlezde, hepačni karcinom i razne tipove kancera glave i vrata.

[0076] "Tumor" i "neoplazma" se odnose na bilo koju masu tkiva koja je posledica prekomernog rasta ili proliferacije ćelija, bilo benignu (nekanceroznu) ili malignu (kanceroznu), uklјučujući prekancerozne lezije.

[0077] Termini "kancerska ćelija", "tumorska ćelija" i gramatički ekvivalenti, ovde se odnose na ukupnu populaciju ćelija koje su poristekle iz tumora ili prekancerozne lezije, uklјučujući i netumorske ćelije koje čine najveći deo populacije tumorskih ćelija, kao i tumorigene matične ćelije (kancerske matične ćelije). Kao što se ovde upotrebljava, termin "tumorska ćelija" će biti modifikovan terminom "ne-tumorigeni" kada se odnosi isključivo na one tumorske ćelije kojima nedostaje kapacitet obnavlјanja i diferencijacije, a da bi se ovakve tumorske ćelije razlikovale od kancerskih matičnih ćelija.

[0078] Pojam "subjekat" se odnosi na bilo koju životinju (npr. sisara), uklјučujući, ali ne ograničavajući se samo na lјude, primate različite od čoveka, glodare i slično, a koji će biti primaoc određenog tretmana. Uobičajeno je da se termini "subjekat" i "pacijent" ovde upotrebljavaju naizmenično u kontekstu subjekta koji je čovek.

[0079] Ćelijska "populacija" se može odnositi na pojedinačnu ćeliju ili na više ćelija. Ćelija ili ćelije mogu biti ćelije u kulturi ili ćelije u organizmu. Na primer, ćelijska populacija može biti populacija u subjektu ili pacijentu.

[0080] Pojam "farmaceutska formulacija" se odnosi na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka bude efektivna i koja ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatlјivo toksične za subjekta kome bi se formulacija primenila. Takva formulacija može biti sterilna.

[0081] "Efektivna količina" antitela, kako je ovde opisano, predstavlja količinu koja je dovoljan da se izvrši specifično navedena svrha. "Efektivna količina" može biti određena empirijski i na rutinski način, shodno svrsi koja je predviđena.

[0082] Izraz "terapijski efektivna količina" se odnosi na količinu antitela ili drugog leka koja je efektivna za "lečenje" oboljenja ili poremećaja kod subjekta ili sisara. U slučaju kancera, terapijski efektivna količina leka može smanjiti broj kancerskih ćelija; smanjiti veličinu tumora; inhibirati (tj. do određene mere usporiti i, u određenom primeru izvođenja, zaustaviti) infiltraciju kancerskih ćelija u periferne organe; inhibirati (tj. do određene mere usporiti i, u određenom primeru izvođenja, zaustaviti) metastazu tumora; inhibirati, u određenoj meri, rast tumora; i/ili do izvesne mere jedan ublažiti jedan ili više simptoma koji su povezani sa kancerom. Pogledati definiciju "lečenja" koja je ovde data. U meri u kojoj lek može sprečiti rast i/ili ubiti postojeće kancerske ćelije, on može biti citostatičan i/ili citotoksičan. "Profilaktički efektivna količina" se odnosi na količinu koja je efektivna, u dozama i tokom potrebnog perioda, za postizanje želјenog profilaktičkog rezultata. Uobičajeno je, ali nije nužno, pošto se profilaktička doza upotrebljava kod subjekata pre ili u ranijem stadijumu oboljenja, da profilaktički efektivna količina bude manja od terapijske efektivne količine.

[0083] Pojmovi kao što su „lečenje“ ili „lečiti“ ili „tretirati“ ili „ublažavanje“ ili „ublažavati“ odnose se i na 1) terapijske mere koje leče, usporavaju, smanjuju simptome i/ili zaustavlјaju napredovanje dijagnostikovanog patološkog stanja ili poremećaja i 2) profilaktičke ili preventivne mere koje sprečavaju i/ili usporavaju razvoj cilјanog patološkog stanja ili poremećaja. Prema tome, oni kojima je lečenje potrebno obuhvataju one koji već boluju od poremećaja; one koji su poremećaju skloni; kao i one kod kojih se planira prevencija poremećaja. U određenim primerima izvođenja, subjekat se uspešno „leči“ od kancera prema postupcima predmetnog pronalaska, ukoliko pacijent ispoljava jedno ili više od sledećeg: smanjenje kaheksije, povećanje vremena preživlјavanja, produženje vremena do progresije tumora, smanjenje u masi tumora, smanjenje u opterećenju tumorom i/ili produženje vremena do metastaza tumora, vremena do recidiva tumora, kao i odgovora tumora, potpunog odgovora, delimičnog odgovora, stabilnog oboljenja, progresivnog oboljenja, preživlјavanja bez progresije (PFS), sveukupnog preživljavanja (OS), pri čemu se svaki od ovih parametara meri prema standardima postavljenim od strane Nacionalnog institute za kancer SAD i Američke agencije za hranu i lekove za odobrenje novih lekova. Pogledati Johnson i saradnici, J. Clin. Oncol.21(7):1404-1411 (2003).

[0084] "Kombinacija" anti-CD20 antitela i selektivnog inhibitora PI3Kδ se odnosi na anti-CD20 antitelo ili njegov fragment i Jedinjenje A, kao što je ovde definisano, za koju je predviđeno da bude primenjena istoj populaciji ćelija ili istom subjektu istovremeno, sekevencijalno ili i istovremeno i sekvencijalno. Tako, na primer, primena anti-CD20 antitela ili njegovog fragmenta pre ili nakon primene Jedinjenja A (npr. u vremenskom periodu poput jednog sata, dana, nedelјe ili meseca), podrazumeva primenu kombinacije anti-CD20 antitela ili njegovog fragmenta i Jedinjenje A. Dodatno, istovremena primena anti-CD20 antitela ili njegovog fragmenta i Jedinjenja A takođe podrazumeva primenu kombinacije anti-CD20 antitela ili njegovog fragmenta i Jedinjenja A, bez obzira da li su anti-CD20 antitelo ili njegov fragment i Jedinjenje A primenjeni zajedno u jednoj farmaceutskoj formulaciji ili se primenjuju istovremeno u odvojenim farmaceutskim formulacijama, bilo istim ili različitim načinima primene.

[0085] Tumor koji „ne reaguje“, „slabo reaguje“ ili je „refraktoran“ na lečenje sa anti-CD20 antitelom, ne pokazuje statistički značajno pobolјšanje u odgovoru na lečenje sa anti-CD20 antitelom u poređenju sa slučajem kada se tretman ne primenjujue ili u poređenju sa placebo tretmanom u priznatom životinjskom modelu ili u kliničkom ispitivanju na lјudima, ili koji reaguje na početni tretman anti-CD20 antitelom, ali nastavkom lečenja dalje raste.

[0086] Sposobnost tumora ili ćelijskog tipa da reaguje na anti-CD20 antitelo može biti ispitana upotrebom ćelijskih linija kao što su Raji ili Wil2-S, ili donorskih ćelijskih linija pacijenata. Dodatno, aktivnost može biti izmerena upotrebom analiza deplecije B-ćelija, npr. u punoj krvi pacijenata.

[0087] "Polinukleotid" ili "nukleinska kiselina", kako se ovde naizmenično upotrebljavaju, odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine, a obuhvataju i DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji može biti ugrađen u polimer sa DNK ili RNK polimerazom. Polinukleotid može sadržavati modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Ukoliko je prisutna, modifikacija nukleotidne strukture može biti uvedena pre ili nakon udruživanja polimera. Sekvenca nukleotida može biti prekinuta nenukleotidnim komponentama. Polinukleotid može dalјe biti modifikovan nakon polimerizacije, kao što je konjugacijom sa komponentom za obeležavanje. Ostale vrste modifikacija obuhvataju, na primer, dodavanje "3' kapa", supstituciju jednog ili više nukleotida koji se javlјaju u prirodi sa analogom, internukleotidne modifikacije kao što su, na primer, one sa nenaelektrisanim vezama (npr. metil fosfonatne, fosfotioestarske, fofoamidatne, karbamatne itd.) i sa naelektrisanim vezama (npr. fosforotioatne, fosforoditioatne itd.), one koje uključuju bočne strukture, kao što su, na primer, proteini (npr. nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, pli-L-lizin itd.), one sa interkalirajućim grupama (npr. akridinskim, psoralenskim itd.), one koji sadrže helatore (npr. metale, radioaktivne metale, bor, oksidujuće metale itd.), one koji sadrže alkilatore, one sa modifikovanim vezama (npr. alfa anomerne nukleinske kiseline itd.), kao i nemodifikovane oblike polinukleotida. Nadalјe, bilo koja hidroksilna grupa koja je obično prisutna u šećerima može biti zamenjena, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, zaštićena standardnim zaštitnim grupama ili aktivirana za pripremu dodatnih veza sa dodatnim nukleotidima, ili može biti konjugovana za čvrste podloge. Hidroksilna grupa na 5’ i 3' kraju može biti fosforilisana ili supstituisana aminima ili organskim strukturama za dodavanje strukture kape na od 1 do 20 atoma uglјenika. Ostale hidroksilne grupe takođe mogu biti derivatizovane u standardne zaštitne grupe. Polinukleotidi takođe mogu sadržavati analogne oblike šećera riboze ili dezoksiriboze koji su opšte poznati u oblasti tehnike, uključujući, na primer, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- ili 2'-azido-ribozu, karbociklične analoge šećera, alfa-anomerne šećere, epimerne šećere kao što su arabinoza, ksiloze ili liksoze, piranozni šećeri, furanozni šećeri, sedoheptuloze, kao i aciklične analoge i abazne nukleozidne analoge poput metil ribozida. Ovakve alternativne grupe za povezivanje obuhvataju, ali nisu ograničene na, primere izvođenja gde je fosfat zamenjen sa P(O)S ("tioatom"), P(S)S ("ditioatom"), (O)NR2("amidatom"), P(O)R, P(O)OR', CO ili CH2("formacetalom"), u kome je svaki R ili R' nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 C), koji po izboru sadrži etarsku (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Nije potrebno da sve veze u polinukleotidu budu identične. Prethodni opis se odnosi na polipeptide koji su ovde naznačeni, uključujući RNK i DNK.

[0088] Termin "vektor" označava konstrukt koji je u stanju da isporuči i eksprimira jedan ili više do gena ili sekvenci od interesa u ćeliji domaćinu. Primeri vektora obuhvataju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, gole DNK ili RNA ekspresione vektore, plazmide, kozmide ili fagne vektore, DNK ili RNK ekspresione vektore povezane sa katjonskim sredstvima za kondenzovanje, DNK ili RNA ekspresione vektore inkapsulirane u lipozomima i određene eukariotske ćelije, kao što su ćelije proizvođači.

[0089] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" se ovde upotrebljavaju naizmenično da bi se označili polimeri aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može sadržavati modifikovane aminokiseline, a može biti i prekinut aminokiselinama koje nisu prave aminokiseline. Termini obuhvataju i aminokiselinski polimer koji je prirodno modifikovan ili je modifikovan primenom neke intervencije; na primer, obrazovanjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom poput konjugacije sa komponentom za obeležavanje. Unutar definicije su takođe uklјučeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uklјučujući, na primer, neprirodne aminokiseline itd.), kao i druge modifikacije koje su poznate u oblasti tehnike. Podrazumeva se da se u određenim primerima izvođenja, pošto su polipeptidi predmetnog pronalaska zasnovani na antitelima, polipeptidi mogu pojaviti u vidu jednolačanih ili udruženih lanaca.

[0090] Termini "identični" ili procenat "identičnost", u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptida, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili su sa definisanim procentom istih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka kada se uporede i poravnaju (uvođenjem praznina, gapova, ukoliko je potrebno) radi maksimalnog podudaranja, ali ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne aminokiselinske supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Procenat identičnosti može biti izmeren upotrebom kompjuterskog programa ili algoritama za poređenje sekvenci, ili njihovim vizuelnim pregledom. U oblasti tehnike su poznati razni algoritmi i kompjuterski programi koji mogu biti upotrebljeni da bi se dobilo poravnavanje aminokiselinskih ili nukleotidnih sekvenci. Jedan takav neograničavajući primer algoritma za poravnavanje sekvenci je algoritam opisan u Karlin i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci, 87:2264-2268 (1990), koji je modifikovan u Karlin i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci, 90: 5873-5877 (1993) i ugrađen u programe NBLAST i XBLAST (Altschul i saradnici, Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1991)). U određenim primerima izvođenja, može biti upotrebljen Gapped BLAST, kao što je opisano u Altschul i saradnici, Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1997). BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul i saradnici, Methods in Enzimology, 266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, Južni San Francisko, Kalifornija) ili Megalign (DNASTAR) su dodatni javno dostupni kompjuterski programi koji mogu biti upotrebljeni za poravnavanja sekvenci. Procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može biti utvrđen upotrebom GAP programa u GCG programu (npr. upotrebom NWSgapdna.CMP matrice i uvođenjem ograničennja gapova na 40, 50, 60, 70 ili 90 i ograničenja dužine na 1, 2, 3, 4, 5 ili 6). GAP program u kompjuterskom paketu GCG, u koji je ugrađen algoritam Needleman-a and Wunsch-a (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) može biti upotrebljen za određivanje procenta identičnosti između dve aminokiselinske sekvence (npr. upotrebom Blossum 62 matrice ili PAM250 matrice, kao i ograničenja praznina na 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i ograničenja dužine na 1, 2, 3, 4, 5). Alternativno, procenat identičnosti između nukleotidnih ili aminokiselinskih sekvenci može biti utvrđen upotrebom algoritma Myers-a i Miller-a (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Na primer, procenat identičnosti može biti utvrđen upotrebom programa ALIGN (verzija 2.0) i upotrebom PAM120 sa tabelom ostataka, ograničenjem dužine praznine od 12 i ograničenjem praznine od 4. Mogu biti utvrđeni i odgovarajući parametri za maksimalno poravnavanje od strane određenog kompjuterskog programa, shodno nalogu stručnjaka iz oblasti tehnike. Mogu biti upotrebljeni i zadati parametri programa za poravnavanje. Procenat identičnosti "X" prve aminokiselinske sekvence u odnosu na drugu aminokiselijsku sekvencu može biti izračunat kao 100 x (Y/Z), gde je Y broj aminokiselinskih ostataka koji su prebrojani kao oni sa identičnim preklapanjem prilikom poravnavanja prvih i drugih sekvenci (kao što je poravnanje vizualnim pregledom ili određenim programom za poravnavanje sekvenci), dok je Z ukupni broj ostataka u drugoj sekvenci. Ukoliko je dužina prve sekvence veća od druge sekvence, procenat identičnosti prve sekvence u odnosu na drugu sekvencu će biti veći od procenta identičnosti druge sekvence u odnosu na prvu sekvencu.

[0091] Kao neograničavajući primer da li je određeni polinukleotid sa određenim procentom identičnosti sekvence (npr. najmanje je 80% identičan, najmanje je 85% identičan, najmanje je 90% identičan i, na primer, najmanje je 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan) referentnoj sekvenci, može biti, u određenim primerima izvođenja, određeno upotrebom Bestfit programa (Wisconsin Sequence Analysis Package, verzija 8 za Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit koristi algoritam lokalne homologije osmišljen od strane Smith-a i Waterman-a, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), da bi se pronašao segment najbolјe homologije između dve sekvence. Prilikom upotrebe Bestfit programa ili bilo kog drugog program za poravnavanje sekvenci, da bi se utvrdilo da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična referentnoj sekvenci prema predmetnom pronalasku, parametri se postavlјaju tako da se procenat identičnosti izračunava celom dužinom referentne nukleotidne sekvence, kao i tako gapovi u homologiji iznost do 5% od ukupnog broja nukleotida u referentnoj sekvenci.

[0092] Dve nukleinske kiseline ili polipeptidi mogu biti suštinski identični, što označava da je identičnost nukleotida ili aminokiselinskih ostataka najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, a u pojedinim primerima izvođenja, najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, kada se iste upoređuju i poravnavaju u kontekstu maksimalnog preklapanja, što se meri upotrebom algoritma za poređenja sekvenci ili vizuelnim pregledom. Identičnost može biti prisutna duž regiona sekvenci koji su dužine od najmanje oko 10, oko 20, oko 40-60 ostataka, ili bilo koje cele vrednosti između njih, ili duž regiona koji su duži od 60-80 ostataka, odnosno najmanje su oko 90-100 ostataka, ili su sekvence suštinski identične celom dužinim sekvenci koje se upoređuju, kao što je, na primer, kodirujući region nukleotidne sekvence.

[0093] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji je sa sličnim bočnim lancem. Familije aminokiselinskih ostataka sa sličnim bočnim lancima su definisane u oblasti tehnike i obuhvataju bazne bočne lance (npr. lizina, arginina, histidina), kisele bočne lance (npr. asparaginske kiseline, glutaminske kiseline), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. asparagina, glutamina, serina, treonina, tirozina, cisteina), nepolarne bočne lance (npr. glicina, alanina, valina, leucina, izoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofana), beta-razgranate bočne lance (npr. treonina, valina, izoleucina) i aromatične bočne lance (npr. tirozina, fenilalanina, triptofana, histidina). Na primer, supstitucija fenilalanina tirozinom je konzervativna supstitucija. U određenim primerima izvođenja, konzervativne supstitucije u sekvencama polipeptida i antitela pronalaska ne ukidaju vezivanje polipeptida ili antitela koji tu aminokiselinsku sekvencu sadrže, za antigen(e), tj. FOLR1 za koji se polipeptid ili antitelo vezuje. Postupci identifikacije supstitucija nukleotida i aminokiselina koji ne eliminišu vezivanje antigena su dobro poznati u oblasti tehnike (pogledati npr. Brummell i saradnici, Biochem.32: 1180-1187 (1993); Kobayashi i saradnici. Protein Eng.12(10):879-884 (1999); i Burks i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).

[0094] Svi brojevi koji u ovom opisu ukazuju na količine, odnose materijala, fizičke osobine materijala i/ili upotrebu, potrebno je shvatiti kao modifikovane sa rečju „oko“, osim ukoliko nije drugačije eksplicitno naznačeno. Termin "oko", kada se odnosi na broj ili numerički opseg, označava da je navedeni broj ili numerički opseg aproksimacija unutar eksperimentalne varijabilnosti (ili unutar statističke eksperimentalne greške), odnosno da broj ili numerički opseg stoga može varirati od, na primer, između 1% i 15% od navedenog broja ili numeričkog opsega.

[0095] Jedinjenje pronalaska može sadržavati jedan ili više asimetričnih centara (hiralnih centara) i na taj način može biti osnov za enantiomere, dijastereomere i druge stereoizomerne oblike koji mogu biti definisani, u kontekstu apsolutne stereohemije, kao (R)- ili (S)-. Predviđeno je da predmetni opis obuhvata sve moguće oblike, kao i njihove racemske i rastvorene oblike i njihove smeše. Pojedinačni enantiomeri mogu biti razdvojeni, u kontekstu predmetnog opisa, postupcima koji su poznati u oblasti tehnike.

[0096] Kao što se ovde upotrebljava, pojam "stereoizomeri" je opšti termin za sve izomere pojedinačnih molekula koji se razlikuju samo u orijentaciji svojih atoma u prostoru. Obuhvataju stoga enantiomere i izomere jedinjenja koji sadrže više od jednog hiralnog centra i ne odnose se jedan prema drugom kao objekat i liku ogledalu (dijastereomeri).

[0097] Termin "hiralni centar" se odnosi na atom uglјenika za koga su vezane četiri različite grupe.

[0098] Termini "enantiomer" i "enantiomerni" se odnose na molekul koji ne može biti superponiran sa svojim likom u ogledalu i stoga je optički aktivan, pri čemu enantiomer rotira ravan polarizovane svetlosti u jednom smeru, dok jedinjenje koje odgovara liku u ogledalu rotira ravan polarizovane svetlosti u suprotnom smeru.

[0099] Termin "racemski" se odnosi na smešu enantiomera u jednakim delovima, pri čemu je smeša optički neaktivna.

[0100] Termin "rezolucija" se odnosi na razdvajanje, koncentrovanje ili depleciju jednog od dva enantiomerna oblika molekula.

[0101] Predmetni opis obuhvata solvate jedinjenja pronalaska. Solvati obično ne menjaju značajno fiziološku aktivnost ili toksičnost jedinjenja i kao takvi mogu delovati kao farmakološki ekvivalenti. Termin "solvat", kako se ovde upotrebljava, podrazumeva kombinaciju, fizičko udruživanje i/ili solvatizaciju jedinjenja predmetnog pronalaska sa molekulom rastvarača, npr. disolvat, monosolvat ili hemisolvat, gde je odnos molekula rastvarača i jedinjenja predmetnog opisa oko 2:1, oko 1:1 ili oko 1:2, tim redom. Ovakvo fizičko udruživanje podrazumeva varirajuće stepene jonskog i kovalentnog povezivanja, uključujući vodonične veze. U određenim slučajevima, solvat može biti izolovan, kao što je kada se jedan ili više molekula rastvarača ugrađuje u kristalnu rešetku čvrste kristalne supstance. Tako, „solvat“ obuhvata i solvate u vidu rastvora i solvate koji mogu biti izolovani. Jedinjenja pronalaska mogu biti prisutna u solvatnim oblicima sa farmaceutski prihvatlјivim rastvaračem, kao što je voda, metanol, etanol i slično, a predviđeno je da opis obuhvata i solvatne i oblike jedinjenja pronalaska koji nisu solvati. Jedna vrsta solvata je hidrat. "Hidrat" se odnosi na određenu podgrupu solvata u kojima je molekul rastvarača voda. Solvati obično mogu funkcionisati kao farmakološki ekvivalenti. Priprema solvata je poznata u oblasti tehnike. Pogledati npr. M. Caira i saradnici, J. Pharmaceut. Sci, 93(3):601-611 (2004); E. C. van Tonder i saradnici, AAPS Pharm. Sci. Tech. 5(1): Članak 12 (2004); i A. L. Bingham i saradnici, Chem. Commun. 603-604 (2001). Uobičajen, neograničavajući postupak pripreme solvata bi uklјučivao rastvaranje jedinjenja pronalaska u želјenom rastvaraču (organskom, vodi ili njihovoj smeši) na temperaturama od oko 20°C do oko 25°C, a zatim hlađenje rastvora brzinom koja je dovoljna da se obrazuju kristali, kao i dalje izolovanje kristala poznatim postupcima, npr. filtriranjem. Analitičke tehnike poput infracrvene spektroskopije mogu biti upotrebljene da bi se potvrdilo prisustvo rastvarača u kristalu solvata.

[0102] Termin "prolek" se odnosi na jedinjenje koje je neaktivan prekursor jedinjenja i koje se normalnim metaboličkim procesima u organizmu pretvara u svoj aktivni oblik. Dizajn prolekova se razmatra u opštim crtama u Hardma i saradnici (ur.), Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9. izdanje, str. 11-16 (1996). Detaljna diskusija se može naći u Higuchi i saradnici, Prodrugs as Novel Delivery Systems, vol. 14, ASCD Symposium Series, i u Roche (ur.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987). U svrhu ilustracije, prolekovi mogu biti prevedeni u farmakološki aktivan oblik hidrolizom, na primer, esterske ili amidne veze, čime se u dobijeni proizvod uvodi ili se izlaže funcionalna grupa. Prolekovi mogu biti dizajnirani tako da reaguju sa endogenim jedinjenjem da bi se obrazovao konjugat koji je rastvorlјiv u vodi, a što dalje pojačava farmakološke osobine jedinjenja, na primer, povećava poluživot u cirkulaciji. Alternativno, prolekovi mogu biti dizajnirani tako da podležu kovalentnoj modifikaciji funkcionalne grupe sa, na primer, glukuronskom kiselinom, sulfatom, glutationom, aminokiselinama ili acetatom. Rezultujući konjugat može biti inaktiviran i izlučen putem urina ili može biti učinjen potentnijim od matičnog jedinjenja. Konjugati visoke molekulske težine takođe mogu biti izlučeni u žuč, podvrgnuti enzimskom cepanju i oslobođeni nazad u cirkulaciju, čime se efektivno povećava biološki poluživot prvobitno primenjenog jedinjenja.

[0103] Predmetni opis takođe obuhvata jedinjanja koja se razlikuju samo po prisustvu jednog ili više od izotopski obogaćenih atoma, na primer, dobijaju se zamenom vodonika sa deuterijumom ili tricijumom ili zamenom uglјenika sa<13>C- ili<14>C-obogaćenim uglјenikom. Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu takođe sadržavati neprirodne proporcije atomskih izotopa u jednom ili u više atoma koji čine takva jedinjenja. Na primer, jedinjenja mogu biti radioaktivno obeležena radioaktivnim izotopima, kao što je na primer tricijum (<3>H), jod-125 (<125>J) ili uglјenik-14 (<14>C). Sve izotopske varijacije jedinjenja ovog pronalaska, bilo da su radioaktivne ili ne, obuhvaćene su obimom predmetnog pronalaska.

[0104] Predmetni opis dodatno obuhvata soli jedinjenja pronalaska, uklјučujući netoksične farmaceutski prihvatlјive soli. Primeri farmaceutski prihvatlјivih adicionih soli uklјučuju neorganske i organske kisele adicione soli i bazne soli. Farmaceutski prihvatlјive soli obuhvataju, ali nisu ograničene na, soli metala kao što su soli natrijuma, soli kalijuma, soli cezijuma i slične; soli zemnoalkalnih metala, kao što su soli kacijuma, soli magnezijuma i slične, organske aminske soli kao što su trietilaminska so, piridinska so, pikolinska so, etanolaminska so, trietanolaminska so, dicikloheksilaminska so, N,N'-dibenzil-etilendiaminska so i slične; soli neorganskih kiselina kao što su hidrohlorid, hidrobromid, fosfat, sulfat i slične; soli organskih kiselina kao što su citrat, laktat, tartarat, maleat, fumarat, mandelat, acetat, dihloroacetat, trifluoroacetat, oksalat, format, sukcinati, palmoati, benzoati, salicilati, askorbati, glicerofosfati, ketoglutarati i slične; sulfonati poput metansulfonata, benzensulfonata, p-toluensulfonata i sličnih; soli prirodnih aminokiselina kao što su glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, norleucin, tirozin, cistin, cistein, metionin, prolin, hidroksi prolin, histidin, omitin, lizin, arginin i serin; i soli neprirodnih aminokiselina kao što su D-izomeri ili supstituisane aminokiseline; soli guanidina; i soli supstituisanog guanidina gde su supstituenti izabrani između nitro, amino, alkil, alkenil, alkinil, amonijum ili supstituisanih amonijumskih soli i aluminijumskih soli.

[0105] Termin "selektivan inhibitor", kada se primenjuje u kontekstu biološki aktivnog sredstva, odnosi se na sposobnost sredstva da selektivno smanji cilјanu signalnu aktivnost u poređenju sa signalom aktivnošću izvan ciljanog dejstva, direktnom ili indirektnom interakcijom sa ciljnim molekulom.

[0106] Termin "selektivan inhibitor PI3Kδ" se odnosi na Jedinjenje A koje je ovde definisano, a koje selektivno inhibira aktivnost PI3K δ izoforme efektivnije od inhibicije ostalih izoformi iz PI3K familije (α, β i γ). Na primer, jedinjenje formule A može biti jedinjenje koje karakteriše inhibitorna koncentracija od 50% (IC50) u odnosu na δ tip PI3-kinaze, a koja je najmanje 20 puta niža od IC50inhibitora u odnosu na ostale PI3K izoforme (tj. α, β i γ).

[0107] Inhibicija PI3K δ može biti od terapijske koristi u lečenju raznovrsnih stanja, npr. stanja koje karakteriše inflamatorni odgovor uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, autoimuna oboljenja, alergijske bolesti i artritična oboljenja. Važno je napomenuti da deluje da inhibicija PI3K δ funkcije ne utiče na biološke funkcije kao što su vijabilnost i plodnost.

[0108] "Inflamatorni odgovor", kako se ovde upotrebljava, karakterišu crvenilo, vrućina, oticanje i bol (tj. inflamacija), a obično podrazumevai povredu ili uništavanje tkiva. Inflamatorni odgovor je obično lokalizovan, protektivan odgovor koji je izazvan povredom ili uništenjem tkiva i koji služi za uništavanje, razblaživanje ili uklanjanje (sekvestriranje) i štetnog agensa i povređenog tkiva. Inflamatorni odgovori su značajno povezani sa influksom leukocita i/ili leukocitnom hemotaksom (npr. neutrofilnom). Inflamatorni odgovori mogu biti posledica infekcije sa patogenim organizmima i virusima, dejstava neinfektivnih sredstava kao što su trauma ili reperfuzija nakon infarkta miokarda ili moždanog udara, a mogu biti posledica i imunskih odgovora na strane antigene i autoimunih oboljenja. Inflamatorni odgovori koji su podložni lečenju prema pronalasku, obuhvataju stanja povezana sa reakcijama specifičnog odbrambenog sistema, kao i stanja povezana sa reakcijama nespecifičnog odbrambenog sistema.

[0109] Terapijski postupci koji su ovde obezbeđeni obuhvataju postupke za lečenje stanja povezanih sa inflamatornom aktivacijom ćelija. "Inflamatorna aktivacija ćelija" se odnosi na indukciju stimulusom (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, citokine, antigene ili auto-antitela) proliferativnog ćelijskog odgovora, proizvodnje solubilnih medijatora (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, citokine, radikale kiseonika, enzime, prostanoide ili vazoaktivne amine, ili na ekspresiju na površini ćelija novog ili povećanog broja medijatora (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, glavne antigene histokompatibilnosti ili molekule ćelijske adhezije) u inflamatornim ćelijama (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, monocite, makrofage, T-limfocite, B-limfocite, granulocite (polimorfonuklearne leukocite, uklјučujući neutrofile, bazofile i eozinofile) mastocite, dendritične ćelije, Langerhansove ćelije i endotelne ćelije). Kao što stručnjaci iz oblasti tehnike mogu lako predvideti, aktivacija jednog ili kombinacija navedenih fenotipova u ovim ćelijama može doprineti pokretanju, perpetuaciji ili pogoršanju inflamatornog stanja.

[0110] Termin "autoimuna bolest", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koju grupu poremećaja u kojima je povreda tkiva povezana sa humoralnim ili ćelijski posredovanim odgovorima na konstituente samog organizma.

[0111] Termin "odbacivanje transplantata", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na imuni odgovor usmeren na transplantirano tkivo (uklјučujući organe ili ćelije, npr. kosnu srž, a koga karakteriše gubitak funkcije transplantiranog ili okolnog tkiva, bol, otok, leukocitoza i trombocitopenija).

[0112] Termin "alergijska bolest", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koje simptome, oštećenje tkiva ili gubitak funkcije tkiva koji su posledica alergije.

[0113] Termin "artritična bolest", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koju bolest koju karakterišu inflamatorne lezije zglobova koje mogu biti pripisane raznovrsnim etiologijama.

[0114] Termin "dermatitis", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koju od velikih familija oboljenja kože koju karakteriše inflamacija kože, koja može biti pripisana raznovrsnim etiologijama.

[0115] Termin "sinergistički efekat", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na terapijski efekat koji je veći od aditivnog i koji se proizvodi kombinacijom jedinjanja, pri čemu terapijski efekat koji se dobija kombinacijom prevazilazi aditivne efekte koji bi na drugi način bili rezultat pojedinačnih samostalnih primena jedinjenja. Primeri izvođenja pronalaska obuhvataju postupke proizvodnje sinergističkog efekta u lečenju hematološkog kancera, pri čemu je navedeni efekat najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50 %, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500% ili najmanje 1000% veći od odgovarajućeg aditivnog efekta.

[0116] "Terapijska sinergija", kako se ovde upotrebljava, označava da kombinacija anti-CD20 antitela sa Jedinjenjem A proizvodi terapijski efekat u lečenju koji je veći od aditivnih efekata anti-CD20 antitela i selektivnog inhibitora PI3Kδ kada se svaki od njih upotrebljava samostalno.

[0117] Kao što se upotrebljava u predmetnom opisu i patentnim zahtevima, jednine pojmova obuhvataju i množine istih, ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0118] Podrazumeva se da kad god su primeri izvođenja ovde opisani uz upotrebu reči "koji sadrži", takođe su opisani i analogni primeri izvođenja u kojima se može upotrebiti "koji se sastoje od" i/ili "koji se suštinski sastoji od".

II. Selektivni inhibitor PI3Kδ

[0119] Kao što je ovde obezbeđeno, selektivni inhibitor PI3Kδ koji se upotrebljava u kombinaciji sa anti-CD20 antitelima i njihovim fragmentima koji vezuju antigen, predstavlja jedinjenje formule A:

i njegov stereoizomer, njegove farmaceutski prihvatlјive soli ili solvate.

[0120] U jednom primeru izvođenja, Jedinjenje A koje se upotrebljava u kombinaciji sa anti-CD20 antitelima i njihovim fragmentima koji vezuju antigen je (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on ili su to njegove farmaceutski prihvatlјive soli ili solvati. Ovaj stereoizomer se ovde takođe označava kao "S-izomer jedinjenja formule A", "S-izomer", "TGR-1202" i "RP 5307".

[0121] U drugom primeru izvođenja, Jedinjenje A koje se upotrebljava u kombinaciji sa anti-CD20 antitelima i njihovim fragmentima koji vezuju antigen je (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on ili su to njegove farmaceutski prihvatlјive soli ili solvati.

[0122] Hemijske strukture ovih jedinjenja su prikazane ispod:

III. Anti-CD20 antitela

[0123] CD20 je transmembranski fosfo-protein koji četiri puta prolazi kroz ćelijsku membranu i pretežno se eksprimira u prekrusorskim B-ćelijama i u zrelim perifernim B-ćelijama kod lјudi i miševa. Kod ljudi, CD20 se takođe snažno i homogeno eksprimira na većini zrelih B-ćelijskih maligniteta.

[0124] Kao što je ovde obezbeđeno, anti-CD20 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom PI3Kδ.

[0125] Poznata su brojna anti-CD20 antitela, uklјučujući na primer ublituksimab rituksimab, ofatumumab (HuMax; Intracel), okrelizumab, veltuzumab, GA101 (obinutuzumab), AME-133v (Applied Molecular Evolution), okaratuzumab (Mentrik Biotech), PRO131921, tozitumomab, ibritumomab-tiuksetan, hA20 (Immunomedics, Inc.), BLX-301 (Biolex Therapeutics), Redituks (Dr. Reddy's Laboratories) i PRO70769 (opisan u WO2004/056312).

[0126] Ublituksimab (Utuxin™, LFB-R603, TG20, EMAB603) je monoklonsko antitelo koje cilјano deluje na specifičan i jedinstven epitop na CD20, a koje je genetičkim inženjeringom konstruisano tako da pojačava kliničku aktivnost i potenciju.

[0127] Rituksimab je himerno mišje/humano monoklonsko antitelo dobijeno genetičkim inženjeringom, koje usmereno deluje na CD20 antigen. Rituksimab je antitelo označeno i kao "C2B8" u U.S. Pat. No. 5,736,137. Aminokiselinska sekvenca rituksimab antitela i postupci njegove proizvodnje za primer, putem rekombinantne ekspresije u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), prijavljeni su u U.S. Pat. No.5,736,137.

[0128] Ofatumumab je anti-CD20 IgGlK humano monoklonsko antitelo. Studije ukazuju da ofatumumab disocira od CD20 sa brzinom koja je sporija u poređenju sa rituksimabom i da vezuje epitop koji se nalazi proksimalno u odnosu na membranu. Zhang i saradnici, Mabs 1: 326-331 (2009). Mapiranje epitopa je ukazalo da ofatumumab vezuje epitop koji se nalazi bliže N-kraju CD20 u poređenju sa lokacijom na koju ciljano deluje rituksimab, a koja uključuje vanćelijsku petlјu antigena.

[0129] Tako, u pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment su izabrani iz grupe koja se sastoji od antitela koja vezuju isti epitop kao ublituksimab rituksimab, ofatumumab, okrelizumab, veltuzumab, GA101, AME-133v, PRO131921, tozitumomab, hA20 ili PRO70769. U određenim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment je ublituksimab rituksimab, ofatumumab, okrelizumab, veltuzumab, GA101, AME-133v, PRO131921, tozitumomab, hA20, PRO70769 ili njegov fragment.

[0130] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment se vezuje za isti epitop kao i ublituksimab. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment se vezuje za sekvencu koja sadrži aminokiseline N153-S179 iz CD20. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment se vezuje za diskontinuiran epitop u okviru aminokiselina N153-S179 u CD20.

[0131] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment se vezuje za CD20 sa afinitetom koga karakteristiše konstanta disocijacije KD koja je manja od oko 10<-7>M, manja od oko 10<-8>M ili manja od oko 10<-9>M. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment se vezuje za CD20 sa afinitetom koga karakteristiše konstanta disocijacije KD od 10<-10>do 10<-9>M. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment se vezuje za CD20 sa afinitetom koga karakteristiše konstanta disocijacije KD od 0,7 x 10<-9>M. Kako se upotrebljava u kontekstu konstante disocijacije za vezivanje antitela, termin "oko" omogućava određeni stepen varijacije koji je svojstven postupcima koji se koriste za merenje afiniteta antitela. Na primer, u zavisnosti od nivoa preciznosti upotrebljenog instrumenta, standardne greške zasnovane na broju izmerenih uzoraka i zaokruživanja grešaka, termin „oko 10-2 M“ može obuhvatati, na primer, od 0,05 M do 0,005 M.

[0132] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ispoljava visoki afinitet prema FcgamaRIII (CD16). U pojedinim primerima izvođenja, kao rezultat njihovog visokog afiniteta za Fc region antitela na CD16, takva antitela se ne izmeštaju upotrebom IgG poliklonskih antitela, posebno IgG-a koji je prisutan u serumu krvi. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo se vezuje za CD16 (npr. eksprimiran na makrofagu) sa afinitetom od najmanje 2x10<6>M<-1>, najmanje 2x10<7>M<-1>, 2x10<8>M<-1>ili 2x10<7>M<-1>, npr. što se određuje Scatchard analizom ili BIAcore tehnologijom (tehnologija zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji bez obeležavanja).

[0133] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ispoljava obrazac glikozilacije koga karakteriše nizak sadržaj fukoze u njegovom Fc regionu. Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, kompozicija sadrži anti-CD20 antitela u kojima antitela sadrže lance šećera koji su povezani u vidu N-glikozida za mesto glikozilacije na Fc gama (Asn 297, EU numeracija), pri čemu je među lancima šećera koji su povezani u vidu N-glikozida u okviru svih antitela kompozicije, sadržaj fukoze manji od 65%, manji od 60%, manji od 55%, manji od 50%, manji od 45% ili manji od 40%. U određenim primerima izvođenja, među lancima šećera koji su povezani u vidu N-glikozida u okviru svih antitela kompozicije, sadržaj fukoze je od 15 do 45% ili od 20 do 40%.

[0134] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ispoljava snažnu in vitro ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo karakteriše ADCC plato na najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25% ili najmanje oko 30%, u koncentraciji od 50 ng/ml, upotrebom ćelija prirodnih ubica (NK) iz zdravih davalaca. Tehnike za merenje ADCC su poznate u oblasti tehnike i obezbeđeni su, na primer, u de Romeauf i saradnici, British Journal of Hematology 140: 635-643 (2008). U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo poizvodi ADCC plato na oko 35%, u koncentraciji od 50 ng/ml, upotrebom NK ćelije zdravih davalaca.

[0135] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo može smanjiti aktivnost NF-kapa-B. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo može smanjiti SNAIL ekspresiju. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo može povećati RKIP aktivnost. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo može povećati PTEN aktivnost. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo može povećati senzitizaciju ćelije na TRAIL-apoptozu.

[0136] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo je sa optimizovanim Fc-gama-RIIIA (CD16). Antitela koja su u stanju da aktiviraju Fc receptore tipa III i koja imaju određenu glikansku strukturu su opisana, na primer, u U.S. Patent No.7,931,895. Tako, u pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo je modifikovano na Asn 297 (EU numeracija), sa N-glikozilacijama biantenarnog i/ili oligomanozidnog tipa, kao što je opisano u U.S. Patent No. 7,931,895. Postupci za proizvodnju antitela sa jakim afinitetom za CD16 receptor efektorskih ćelija imunog sistema su obezbeđeni, na primer, u objavljenoj SAD prijavi br.2005/0271652.

[0137] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo je sa visokom ADCC aktivnošću. Postupci proizvodnje antitela sa visokom ADCC aktivnošću su obezbeđeni, na primer, u U.S. Patent No.

7,713,524.

[0138] Ublituksimab sadrži sekvence antitela koje su obezbeđene u nastavku teksta:

CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca: Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn (SEQ ID NO: 1)

CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca: Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr (SEQ ID NO: 2)

CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca: Ala Arg Tyr Asp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO: 3)

Varijabilni region teškog lanca:

[0139]

Konstantni region teškog lanca:

[0140]

CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca: Ser Ser Val Val Tyr (SEQ ID NO: 6)

CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca: Ala Thr Ser (SEQ ID NO: 7)

CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca: Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr (SEQ ID NO: 8)

Varijabilni region lakog lanca:

[0141]

Konstantni region lakog lanca:

[0142]

[0143] Shodno navedenom, u pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od varijabilnog domena imunoglobulinskog teškog lanca (VH domena), pri čemu je najmanje jedan (tj. jedan, dva ili tri ) od CDR regiona VH domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili je identična CDR1, CDR2 ili CDR3 regionu iz sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 ili 3, i pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže VH domen mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0144] U drugom primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od varijabilnog domena imunoglobulinskog teškog lanca (VH domena), pri čemu je najmanje jedan (tj. jedan, dva ili tri ) od CDR regiona VH domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je identična, osim u 1, 2, 3, 4 ili 5 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, sa CDR1, CDR2 ili CDR3 regionom iz sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 ili 3, pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže VH domen mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0145] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od VH domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična VH aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO: 4, pri čemu se antitelo ili fragment koji vezuje antigen, njihova varijanta ili derivat koji sadrže VH domen mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0146] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od teškog lanca koji je sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinoj sekvenci teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 4 i 5, pri čemu se antitelo ili njegov fragment koji vezije antigen, koji sadrže teški lanac, mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0147] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, sastoji se u osnovi od ili se sastoji od varijabilnog domena imunoglobulina lakog lanca (VL domen), pri čemu je najmanje jedan (tj. jedan, dva ili tri) od CDR regiona VL domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili je identična CDR1, CDR2 ili CDR3 regionu iz sekvenci SEQ ID NO: 6, 7 ili 8, pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže VL domen mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0148] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od varijabilnog domena imunoglobulinskog lakog lanca (VL domen), pri čemu je najmanje jedan (tj. jedan, dva ili tri) od CDR regiona VL domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je identična, osim u 1, 2, 3, 4 ili 5 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, sa CDR1, CDR2 ili CDR3 regionom iz SEQ ID NO: 6, 7 ili 8, a pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže VL domen mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0149] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od VL domena koji je sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična VL aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO: 9, pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže VL domen mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0150] U drugom primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od lakog lanca koji je sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinoj sekvenci teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 9 i 10, pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže laki lanac, mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0151] U određenim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od varijabilnog domena imunoglobulinskog teškog lanca (VH domena) i varijabilnog domena imunoglobulinskog lakog lanca (VL domena), pri čemu je najmanje jedan (tj. jedan, dva ili tri) do CDR regiona VH domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili je identična CDR1, CDR2 ili CDR3 regionu iz sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 ili 3, i pri čemu najmanje jedan (tj. jedan, dva ili tri) od CDR regiona VL domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili je identična CDR1, CDR2 ili CDR3 regionu iz sekvenci SEQ ID NO: 6, 7 ili 8, a pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže VH i VL domen, mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0152] U narednom primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od varijabilnog domena imunoglobulinskog teškog lanca (VH domena) i varijabilnog domena imunoglobulinskog lakog lanca (VL domena), pri čemu je najmanje jedan (tj. jedan, dva ili tri) do CDR regiona VH domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je identična, osim u 1, 2, 3, 4 ili 5 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, sa CDR1, CDR2 ili CDR3 regionom iz sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 ili 3, i pri čemu je najmanje jedan (tj. jedan, dva ili tri) od CDR regiona VL domena sa aminokiselinskom sekvencom koja je identična, osim u 1, 2, 3, 4 ili 5 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, sa CDR1, CDR2 ili CDR3 regionom iz SEQ ID NO: 6, 7 ili 8, a pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži VH i VL mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0153] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 region iz sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 i 3, kao i VL CDR1, CDR2 i CDR3 region iz sekvenci SEQ ID NO: 6, 7 i 8.

[0154] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od VH domena i VL domena, pri čemu je VH sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična VH aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO: 4, i pri čemu je VL domen sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična VL aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO: 9, a pri čemu se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže VH i VL domen mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0155] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 9.

[0156] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuju se za isti epitop kao i antitelo koje sadrži VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 9.

[0157] U sledećem primeru izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od teškog i lakog lanca, pri čemu je teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinoj sekvenci teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 4 i 5, i pri čemu je laki lanac koji sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinoj sekvenci teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 9 i 10, a pri čemu se antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže teški lanac, mogu specifično ili preferencijalno vezivati za CD20.

[0158] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 4 i 5 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 9 i 10.

[0159] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se vezuje za isti epitop kao i antitelo koje sadrži SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5.

[0160] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo je ublituksimab.

[0161] U pojedinim primerima izvođenja, antitelo je EMAB603 (pogledati WO2006/064121), proizveden od strane klona R603-12D11, deponovanog u Nacionalnoj kolekciji kultura mikroorganizama pod pristupnim brojem CNCM 1-3529.

[0162] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo se proizvodi u pacovskoj hibromskoj YB2/0 ćelijskoj liniji (YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 ćelije, registrovane u Američkoj kolekciji tipova kultura pod ATCC brojem CRL-1662).

[0163] Precizna hemijska struktura antitela sposobnog da specifično vezuje CD20 i zadrži želјenu aktivnost zavisi od brojnih faktora. Kako su jonizujuće amino i karboksilne grupe prisutne u molekulu, određeni polipeptid može biti dobijen u vidu kisele ili bazne soli ili u neutralnom obliku. Svi takvi preparati koji zadržavaju svoju biološku aktivnost kada se stave u pogodne uslove okruženja, uklјučeni su u definiciju anti-CD20 antitela, kao što ona se ovde upotrebljava. Dodatno, primarna aminokiselinska sekvenca antitela može biti povećana derivatizacijom, upotrebom šećernih ostataka (glikozilacije) ili drugih dodatnih molekula kao što su lipidi, fosfati, acetil grupe i slično. Povećanje može biti postignuto i konjugacijom sa saharidima. Određeni aspekti ovakvog povećanja se ostvaruje kroz post-translacione sisteme obrade u domaćinu proizvođaču; druge takve modifikacije mogu biti uvedene in vitro. U svakom slučaju, takve modifikacije su uklјučene u definiciju anti-CD20 antitela koja se ovde koristi, sve dok to ne doprinosi eliminisanju željenih osobina anti-CD20 antitela. Očekuje se da takve modifikacije mogu kvantitativno ili kvalitativno uticati na aktivnost, bilo pojačavanjem ili smanjenjem aktivnosti polipeptida u raznim analizama. Nadalјe, pojedinačni aminokiselinski ostaci u lancu mogu biti modifikovani oksidacijom, redukcijom ili drugačijom derivatizacijom, a polipeptid može biti podvrgnut cepanju da bi se dobili fragmenti koji zadržavaju aktivnost. Takve izmene koje ne uništavaju želјene osobine (npr. specifičnost vezivanja za CD20) ne uklanjaju polipeptidnu sekvencu iz definicije anti-CD20 antitela od interesa, kako se ovde ista upotrebljava.

[0164] Oblast tehnike obezbeđuje značajne smernice u vezi sa pripremom i upotrebom polipeptidnih varijanti. U pripremi varijanti molekula koji vezuje anti-CD20, npr. antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, varijante ili derivata, stručnjak iz oblasti tehnike lako može odrediti koje od modifikacija nukleotidne ili aminokiselinske sekvence nativnog protiena će rezultovati u varijanti koja je pogodna za upotrebu u vidu terapijski aktivne komponente farmaceutske kompozicije.

[0165] Mutacije je moguće uvesti samo u uokvirujuće regione ili samo u CDR regione molekula antitela. Uvedene mutacije mogu biti tihe ili neutralne mutacije, tj. one koje ne utiču ili malo utiču na sposobnost antitela da vezuje antigen. Ovakve vrste mutacija mogu biti korisne za optimizaciju upotrebe kodona ili za pobolјšanje proizvodnje antitela od strane hibridoma. Alternativno, mutacije koje nisu neutralne i tipa su izmene smisla, mogu izmeniti sposobnost antitela da vezuje antigen. Lokacija većine tihih i neutralnih mutacija tipa izmene smisla će veroatno biti u uokvirujućim regionima, dok će lokacije većine mutacija tipa izmene smisla kodona koje nisu neutralne verovatno biti u CDR sevenci, iako ove ne predstavlja apsolutan zahtev. Stručnjak iz oblasti tehnike će biti u stanju da dizajnira i ispita mutirane molekule sa željenim osobinama poput odsustva izmene u aktivnosti vezivanja antigena ili promena u aktivnosti vezivanju (npr. pobolјšanje u aktivnosti vezivanja antigena ili promena u specifičnosti antitela). Nakon mutageneze, kodirani protein može biti rutinski eksprimiran, a funkcionalna i/ili biološka aktivnost kodiranog proteina (npr. sposobnost imunospecifičnog vezivanja najmanje jednog epitopa CD20 polipeptida) može biti utvrđena upotrebom tehnika koje su ovde opisane ili rutiskim modifikujućim tehnikama koje su poznate u oblasti tehnike.

[0166] U određenim primerima izvođenja, anti-CD20 antitela sadrže najmanje jedan optimizovan region koji određuje komplementarnost (CDR). Predviđeno je da "optimizovan CDR" podrazumeva da je CDR modifikovan i da su optimizovane sekvence izabrane na osnovu zadržanog ili poboljšanog afiniteta vezivanja i/ili anti-CD20 aktivnosti koja se time dodeljuje anti-CD20 antitelu koja sadrži optimizovan CDR. "Anti-CD20 aktivnost" može obuhvatati, npr. aktivnost koja moduliše jednu ili više od sledećih aktivnosti povezanih sa CD20. npr. sposobnost indukcije apoptoze B-ćelija, sposobnost indukcije ADCC B-ćelija (npr. CLL ćelija), sposobnost inhibicije aktivnosti NF-kapa-B, sposobnost inhibicije Snail ekspresije, sposobnost ukidanja represije RKIP, sposobnost ukidanja represije PTEN, sposobnost senzibilizacije tumorskih ćelija na TRAIL-apoptozu ili bilo koju drugu aktivnost povezanu sa CD20. Takve aktivnosti su opisane, na primer, u Baritaki i saradnici, International Journal of Oncology 38: 1683-1694 (2011). Modifikacije mogu obuhvatati zamenu aminokiselinskih ostataka unutar CDR sekvenci tako da anti-CD20 antitelo zadržava specifičnost za CD20 antigen i sa pobolјšanim je afinitetom i/ili pobolјšanom anti-CD20 aktivnošću.

[0167] U pojedinim anti-CD20 antitelima ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen, najmanje frakcija jednog ili više od domena konstantnih regiona je uklonjena delecijom ili na drugi način izmenjena tako da se obezbede želјene biohemijske karakteristike, kao što su smanjenje efektorske funkcije, sposobnost nekovalentnog dimerizovanja, povećana sposobnost lokalizacije na mestu tumora, smanjenje poluživota u serumu ili povećanje poluživota u serumu u poređenju sa celovitim, neizmenjenim antitelom približno iste imunogenosti. Na primer, određena antitela su antitela kod kojih je delecijom uklonjen domen i koja sadrže polipeptidni lanac koji je sličan imunoglobulinskom teškom lancu, ali kome nedostaje najmanje deo jednog ili više domena teških lanaca. Na primer, u određenim antitelima, iz konstantnog regiona modifikovanog antitela će delecijom biti uklonjen jedan ceo domen, na primer, biće delecijom uklonjen celokupan ili deo CH2 domena.

[0168] U pojedinim anti-CD20 antitelima ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen, Fc deo može biti mutiran da bi se smanjila efektorska funkcija, upotrebom tehnika koje su poznate u oblasti tehnike. Na primer, modifikacije konstantog regiona mogu biti upotrebljene za modifikovanje disulfidnih veza ili oligosaharidnih ostataka koji omogućavaju bolјu lokalizaciju usled povećane specifičnosti antigena ili fleksibilnosti antitela. Rezultujući fiziološki profil, bioraspoloživost i drugi biohemijski efekti modifikacija, mogu lako biti izmereni i kvantifikovani upotrebom dobro poznatih imunoloških tehnika bez uvođenja nepotrebnih eksperimenata.

[0169] U određenim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen neće izazivati štetan imuni odgovor kod životinje koja će biti lečena, npr. kod čoveka. U jednom primeru izvođenja, anti-CD20 antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, mogu biti modifikovani tako da se smanji njihova imunogenost, upotrebom tehnika koje su priznate u oblasti tehnike. Na primer, antitela mogu biti humanizovana, primatizovana, deimunizovana ili se mogu napraviti himernim antitelima. Ovakve vrste antitela su izvedene iz antitela koje nije humano, obično iz mišjeg ili antitela primata, a koje zadržava ili značajno zadržava osobine vezivanja antigena matičnog antitela, ali koje je kod ljudi manje imunogeno. Navedeno može biti postignuto raznim postupcima, uključujući (a) transplantaciju čitavih varijabilnih domena koji nisu humani u humane konstantne regiona da bi se generisala himerna antitela; (b) transplantaciju najmanje dela jednog ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji nisu humani u humane uokviruće i konstantne regione, sa ili bez zadržavanja kritičnih ostataka uokvirujućeg regiona; ili (c) transplantaciju celokupnih varijabilnih domena koji nisu humani, ali i njihovo „maskiranje“ posredstvom sekrecije koja je nalik humanoj, zamenom površinskih ostataka. Navedeni postupci su prijavljeni u Morrison i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison i saradnici, Adv. Immunol.44:65-92 (1988); Verhoeyen i saradnici, Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994) i U.S. Pat. No. 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762. i 6,190,370.

[0170] Modifikovani oblici antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen mogu biti napravljeni od celokupnih prekusorskih ili matičnih antitela, upotrebom tehnika koje su poznate u oblasti tehnike.

[0171] Anti-CD20 antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu biti pripremljeni ili poizvedeni upotrebom tehnika koje su poznate u oblasti tehnike. U određenim primerima izvođenja, molekuli antitela ili njihovi fragmenti su „rekombinantno proizvedeni“, tj. proizvedeni su upotrebom tehnologije rekombinantne DNK. Anti-CD20 antitela ili njihovi fragmenti mogu biti generisani bilo kojim pogodnim postupkom koji je poznat u oblasti tehnike, uključujući generisanje poliklonskih antitela ili pripremu monoklonskih antitela, npr. upotrebom hibridoma ili prikaza u fagima.

[0172] Za ekspresiju molekula antitela, mogu biti iskorišćeni razni vekstorski sistemi za ekspresiju u domaćinu. Ćelija domaćina može biti istovremeno transfektovana sa dva ekspresiona vektora, prvim vektorom koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugim vektorom koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu sadržavati identične selektivne markere koji omogućavaju jednaku ekspresiju polipeptida teških i lakih lanaca. Alternativno, može biti upotrebljen jedan vektor koji kodira polipeptide i teškog i lakog lanca. U takvim situacijama, prednost je da laki lanac bude smešten ispred teškog lanca da bi se izbegala toksičnost slobodnog teškog lanca u višku (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77:2197 (1980)). Ćelija domaćin takođe može biti transfektovana sa jednim vektorom koji kodira polipeptid koji je izveden iz teškog lanca i polipeptid izveden iz lakog lanca. Kodirajuće sekvence za teške i lake lance mogu sadržavati cDNA ili genomsku DNK.

[0173] Ekspresioni vektor ili vektori mogu biti preneti u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama, a transfektovane ćelije mogu zatim biti gajene konvencionalnim tehnikama za proizvodnju antitela. Tako, obezbeđene su ćelije domaćini koje sadrže polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov teški ili laki lanac, operativno povezan sa hetrolognim promotorom. U određenim slučajevima, za ekspresiju dvolančanih antitela, vektori koji kodiraju i teški i laki lanac mogu biti istovremeno eksprimirani u ćeliji domaćinu radi ekspresije celokupnog imunoglobulinskog molekula.

[0174] Sistemi za ekspresiju u ćeliji domaćinu predstavljaju nosače kojima kodirajuće sekvence od interesa mogu biti proizvedene i naknadno prečišćene, ali takođe podrazumevaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transfektujuu sa odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, da eksprimiraju CD20 antitelo in situ. Oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme, poput bakterija (npr. E. coli, B. subtilis) transformisanih sa rekombinantnim bakteriofagnim DNK, plazmidnim DNK ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; poput kvasaca (npr. Saccharomices, Pichia) transformisanih sa rekombinantnim vektorima za ekspresiju u kvascima koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; poput ćelijskih sistema insekata inficiranih ekspresionim vektorima rekombinantnih virusa (npr. bakulovirusa) koji sadrže kodirajuće sekvence antitela; sistema bilјnih ćelija inficiranih vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr. mozaičnog virusa karfiola, CaMV; mozaičnog virusa duvana, TMV) ili transformisanih rekombinantnim plamidnim ekspresionim vektorima (npr. Ti plazmidom) koji sadrži kodirajuće sekvence antitela; ili ćelijskih sistema sisara (npr. COS, CHO, BLK, 293, 3T3 ćelije) koji sadrže rekombinantne ekspresione konstrukte sa promotorima izvedenim iz genoma sisarskih ćelija (npr. metalotioneinskim promotorom) ili iz virusa sisara (npr. kasni promotor adenovirusa; promotor virusa vakcinije od 7,5K). Bakterijske ćelije, kao što su Escherichia coli, ili eukariotske ćelije, npr. za ekspresiju celokupnih rekombinantnih molekula antitela, upotrebljavaju se za ekspresiju rekombinantnih molekula antitela. Na primer, sisarske ćelije poput ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), u kombinaciji sa vektorom kao što je glavni intermedijerni promotorski element ranog gena iz humanog citomegalovirusa, efektivan je ekspresioni sistem za antitela (Foecking i saradnici, Gene 45:101 (1986); Cockett i saradnici, Bio/Technology 8:2 (1990)). U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo se proizvodi u ćeliji domaćinu koja nije CHO ćelija.

[0175] Jednom kada je antitelo rekombinantno eksprimirano, može biti prečišćeno bilo kojim postupkom koji je poznat u oblasti tehnike za prečišćavanje imunoglobulinskih molekula, na primer, hromatografijom (npr. jonoizmenjivačkom, afinitetnom, a prevashodno afinitetnom za specifičan antigen nakon vezivanja za Protein A, kao i hromatografijom po veličini, upotrebom kolone), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina.

[0176] U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo se proizvodi od strane pacovske hibridoma ćelijske linije. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo se proizvodi u YB2/0 (ATCC CRL-1662).

IV. Farmaceutske kompozicije

[0177] Jedinjenje formule A i anti-CD20 antitela mogu biti primenjeni po bilo kom redosledu ili u bilo kom intervalu, što lako može odrediti stručnjak iz oblasti tehnike. Na primer, jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo mogu biti primenjivani sekvencijalno (bilo kojim redosledom), istovremeno ili bilo kojom kombinacijom sekvencijalnih i istovremenih primena. Jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo mogu biti primenjeni u istim farmaceutskim kompozicijama ili u odvojenim farmaceutskim kompozicijama.

[0178] Primena kombinacije, bilo istovremena, sekvencijalna (bilo kojim redosledom) ili oba, može biti izvedena prema bilo kom od brojnih željenih intervala u minutima (npr. 0-60 minuta), satima (npr.0-24 sata), danima (npr.0-7 dana) i/ili nedelјama (npr.0-52 nedelјe), što može biti odlučeno ili određeno od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. Doziranje takođe može varirati tokom vremena, na primer, počinjanjem sa primenom doze jednom nedelјno tokom određenog perioda (npr. tokom 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nedelјa), nakon čega sledi primena doze na svake dve nedelje, jednom na svake tri nedelјe, jednom na svake četiri nedelјe, jednom na svakih pet nedelјa ili jednom na svakih šest nedelјa.

[0179] Jedinjenje formule A i anti-CD20 antitela mogu biti formulisani u farmaceutske kompozicije za primenu sisarima, uklјučujući lјude. Farmaceutske kompozicije sadrže farmaceutski prihvatlјive nosače, uklјučujući, na primer, jonske izmenjivače, aluminu, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine, kao što je albumin iz seruma čoveka, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične gliceridne smeše zasićenih bilјne masnih kiseline, vode, soli ili elektrolita, poput protamin sulfata, dinatrijum hidrogen fosfata, kalijum hidrogen fosfata, natrijum hlorida, cinkovih soli, koloidnog silicijuma, magnezijum trisilikata, polivinil pirolidona, supstanci na bazi celuloze, polietilen glikola, natrijum karboksimetilceluloze, poliakrilata, voskova, polietilenpolioksipropilen-blok polimera, polietilen glikola i masti vune.

[0180] Kompozicije mogu biti primenjene bilo kojim pogodnim postupkom, npr. parenteralno, intraventrikularno, oralno, inhalacionim sprejem, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili upotrebom implantiranih rezervoara. U pojedinim primerima izvođenja, Jedinjenje formule A može biti primenjeno oralno. Termin "parenteralno", kako se ovde upotrebljava, obuhvata supkutane, intravenske, intramuskularne, intra-artikularne, intra-sinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intrahepatičke, intralezijske i intkranijalne injekcije ili tehnike infuzije.

[0181] Parenteralne formulacije mogu podrazumevati jednostruku bolusnu dozu, infuziju ili udarnu bolusnu dozu, nakon kojih sledi primena doze održavanja. Ovakve kompozicije mogu biti primenjivane u određenim fiksnim ili varijabilnim intervalima, npr. jednom dnevno ili shodno principu "prema potrebi". Anti-CD20 antitelo može biti primenjeno intravenski (IV).

[0182] Određene farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene oralno u prihvatlјivom doznom obliku, uklјučujući, na primer, kapsule, tablete, vodene suspenzije ili rastvore. Određene farmaceutske kompozicije mogu takođe biti primenjene u vidu nazalnog aerosola ili inhalacijom. Takve kompozicije mogu biti pripremljene kao rastvori u fiziološkom rastvoru, upotrebom benzil alkohol ili drugih pogodnih konzervanasa, promotera apsorpcije za pobolјšanje bioraspoloživosti i/ili drugih uobičajenih sredstva za rastvaranje ili dispergovanje.

[0183] Specifičan dozni režim i režim lečenja za bilo kog određenog pacijent zavisi od raznovrsnih faktora, uklјučujući konkretno terapijsko sredstvo koje se upotrebljava, starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol i ishranu pacijenta, kao i vreme primene, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova i ozbiljnost određenog oboljenja koje se leči. Procana medicinskih radnika o tavim faktorima je unutar iskustva stručnjaka iz oblasti tehnike. Količina će takođe zavisiti od karakteristika pojedinačnog pacijenta koji će biti lečen, načina primene, vrste formulacije, karakteristika upotrebljenog jedinjenja, težine kliničke slike oboljenja i želјenog efekta. Upotrebljena količina može biti određena po farmakološkim i farmakokinetičkim principima koji su dobro poznati u oblasti tehnike.

[0184] Anti-CD20 antitelo može biti primenjivano u dozi manjoj od 187,5 mg/m<2>, 75 mg/m<2>, 37,5 mg/m<2>, 15 mg/m<2.>7,5 mg/m<2>, 3,75 mg/m<2>. Primenjena doza može iznositi od 187,5 mg/m<2>do 75 mg/m<2>, od 75 mg/m<2>do 37,5 mg/m<2>, od 75 mg/m<2>do 15 mg/m<2>, od 75 mg/m<2>do 7,5 mg/m<2>ili od 75 mg/m<2>do 3,75 mg/m<2>.

[0185] Jedinjenje formule A može biti primenjivano u doznom opsegu od 10 do 2500 mg/dan, od 10 do 1500 mg/dan, od 50 do 1000 mg/dan, od 100 do 750 mg mg/dan, od 150 do 500 mg/dan dnevno.

Primenjena doza može iznositi od 200 do 400 mg dnevno. Primenjena doza može iznositi 500, 1000, 1500, 2000 ili 2500 mg/dan.

[0186] Dopunska aktivna jedinjenja takođe mogu biti ugrađena u kompozicije. Na primer, anti-CD20 antitelo i jedinjenje formule A mogu biti koformulisani sa i/ili istovremeno primenjeni sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih sredstava, kao što su anti-kancerska sredstva.

V. Kompleti

[0187] Predmetni pronalazak obezbeđuje komplete koji sadrže jedinjenje formule A, anti-CD20 antitela i po izboru druga sredstva, a koji mogu biti uporebljeni za izvođenje postupaka koji su ovde opisani i njihovih kombinacija. U skladu sa patentnim zahtevima, komplet sadrži najmanje jedno anti-CD20 antitelo i jedinjenje formule A.

[0188] Ovde su takođe obezbeđeni farmaceutski kompleti koji sadrže jedan ili više kontejnera koji su prethodno napunjeni sa jednim ili sa više sastojaka farmaceutskih jedinjenja i kompozicija predmetnog pronalaska, uklјučujući jedinjenje formule A i/ili jedno ili više anti-CD20 antitela. Takvi kompleti mogu takođe uključivati, na primer, druga jedinjenja i/ili kompozicije, uređaj(e) za primenu jedinjenja i/ili kompozicija, kao i napisana uputstva u obliku koji je propisala vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda.

[0189] Stručnjak iz oblasti će lako prepoznati da opisana antitela i jedinjenje formule A koji su ovde opisani mogu jednostavno biti ugrađeni u jedan od utvrđenih formata kompleta koji su dobro poznati u oblasti tehnike.

[0190] Dodatno su obezbeđeni kompleti koji sadrže (a) jedinjenje formule A, anti-CD20 antitelo ili njihovu kombinaciju i (b) dodatno anti-kancersko sredstvo. U određenim primerima izvođenja, dodatno anti-kancersko sredstvo je hemoterapijsko sredstvo.

VI. Postupci upotrebe kombinacija Jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela

[0191] Kombinacije jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela mogu biti upotrebljene u postupcima lečenja bolesti ili poremećaja kod subjekta. Stoga, u skladu sa patentnim zahtevima, obezbeđene su upotrebe jedinjenje formule A u proizvodnji medikamenta za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem gde se jedinjenje formule A primenjuje u kombinaciji (npr. sekvencijalno ili istovremeno) sa anti-CD20 antitelom. Dodatno, obezbeđene su i upotrebe anti-CD20 antitela u proizvodnji medikamenata za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem gde je anti-CD20 antitelo potrebno primeniti u u kombinacije (npr. sekvencijalno ili istovremeno) sa Jedinjenjem formule A. Pored toga, obezbeđena je terapijska kombinacija koja sadrži: (i) jedinjenje formule A, njegov stereoizomer ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat; i (ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u vidu medikamenta za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem.

[0192] Takođe je opisan postupak inhibicije PI3Kδ izoforme i/ili CD20 kod pacijenta, primenom efektivne količine kombinacije predmetnog pronalaska pacijentu.

[0193] Opisan je i postupak lečenja, prevencije i/ili inhibicije oboljenja, poremećaja ili stanja posredovanog sa PI3Kδ i/ili oboljenja, poremećaja ili stanja posredovanog sa CD20 kod pacijenta (kao što su kancer ili druge proliferativna oboljenja ili poremećaji), primenom efektivne količine kombinacije predmetnog pronalaska pacijentu.

[0194] Opisan je i postupak lečenja oboljenja, poremećaja ili stanja povezanog sa PI3Kδ izoformom i/ili CD20 kod pacijenta, primenom efektivne količine kombinacije predmetnog pronalaska pacijentu. U jednom primeru izvođenja, količina jedinjenja koja se primenjuje u kombinaciji je dovolјna za lečenje oboljenja, poremećaja ili stanja povezanog sa PI3Kδ izoformom i/ili CD20, selektivnom inhibicijom PI3K δ i/ili CD20

[0195] Takođe je opisan postupak za lečenje proliferativnog oboljenja, primenom pacijentu kome je takav tretman potreban, efektivne količine najmanje jednog Jedinjenja formule A i antitela predmetnog pronalaska. U jednom primeru izvođenja, količina jedinjenja koja se primenjuje u kombinaciji je dovolјna za lečenje proliferativnog oboljenja putem selektivne inhibicije PI3K δ i/ili inhibicije CD20.

[0196] Opisan je i postupak za lečenje proliferativnog oboljenja, primenom pacijentu kome je takav tretman potreban, efektivne količine kombinacije predmetnog pronalaska, u dodatnoj kombinaciji (istovremeno ili sekvencijalno) sa najmanje jednim drugim anti-kancerskim sredstvom. Količina Jedinjenja A koja se primenjuje je dovolјna za lečenje (ili olakšavanje lečenja) proliferativnog oboljenja putem selektivne inhibicije PI3K δ.

[0197] Kombinacije predmetnog pronalaska su korisne u lečenju raznovrsnih kancera, uklјučujući, ali se ne ograničavajući na sledeće:

• karcinom, uklјučujući karcinom mokraćne bešike, dojke, debelog creva, bubrega, jetre, pluća (uklјučujući sitnoćelijski kancer pluća), jednjaka, žučne kese, materice, jajnika, testisa, grklјana, usne šuplјine, gastrointestinalnog trakta (npr. jednjaka, želuca, pankreasa), mozga, grlića materice, štitne žlezde, prostate, krvi i kože (uklјučujući karcinom skvamoznih ćelija);

• hematopoetske tumore limfoidne loze, uklјučujući leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, B-ćelijski limfom, T-ćelijski limfom, Hočkinov limfom, ne-Hočkinsov limfom, limfom vlasastih ćelija i Burkitov limfom;

• hematopoetske tumore mijeloidne loze, uklјučujući akutne i hronične mijelogene leukemije, mijelodisplastičan sindrom i promijelocitnu leukemiju;

• tumore mezenhimskog porijekla, uklјučujući fibrosarkom i rabdomiosarkom;

• tumore centralnog i perifernog nervnog sistema, uklјučujući astrocitom, neuroblastom, gliom i švanom; i

• ostale tumore, uklјučujući melanom, seminom, teratokarcinom, osteosarkom, ksenoderom pigmentozum, keratoktantom, folikularni kancer štitne žlezde i Kapošijev sarkom.

[0198] Kombinacije predmetnog pronalaska kao modulatori apoptoze su korisne u lečenju, prevenciji i inhibiciji kancera (uklјučujući, ali se ne ograničavajući na one vrste koje su ovde pretnodno navedene).

[0199] Kombinacije predmetnog pronalaska su korisne u hemoprevenciji kancera. Hemoprevencija obuhvata inhibiranje razvoja invazivnog kancera blokiranjem početnog mutagenog događaja, blokiranjem progresije premalignih ćelija koje su već pretrpele oštećenje ili inhibiranjem recidiva tumora. Jedinjenja su takođe korisna u inhibiciji tumorske angiogeneze i metastaza. Takođe je opisan postupak inhibiranja tumorske angiogeneze ili metastaze kod pacijenta, primenom efektivne količine jednog ili više jedinjenja predmetnog pronalaska.

[0200] Opisan je postupak lečenja oboljenja povezanih sa imunim sistemom (npr. autoimunih oboljenja), bolesti ili poremećaja koji uklјučuju upale (npr. astme, hronične opstruktivne bolesti pluća, reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva, glomerulonefritisa, neuroinflamatornih oboljenja, multiple skleroze, uveitisa i poremećaja imunog sistema), kancera ili drugih proliferativnih oboljenja, kao i hepatične bolesti ili poremećaja ili bubrežne bolesti ili poremećaja. Postupak obuhvata primenu efektivne količine kombinacije predmetnog pronalaska.

[0201] Primeri imunih poremećaja koji mogu biti lečeni jedinjenjima predmetnog pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni samo na, psorijazu, reumatoidni artritis, vaskulitis, inflamatornu bolest creva, dermatitis, osteoartritis, astmu, inflamatornu bolest mišića, alergijski rinitis, vaginitis, intersticijski cistitis, sklerodermu, osteoporozu, ekcem, alogenu ili ksenogenu transplantaciju (organa, kosne srži, matičnih ćelija i drugih ćelija i tkiva) odbacivanje transplantata, bolest "kalem-protivdomaćina", eritemski lupus, inflamatorno oboljenje, dijabetes tipa I, plućnu fibrozu, dermatomiozitis, Sjogrenov sindrom, tiroiditis (npr. Hašimotov i autoimuni tiroiditis), mijasteniju gravis, autoimunu hemolitičku anemiju, multiplu sklerozu, cističnu fibrozu, hronični hepatitis sa recidivima, primarnu bilijarnu cirozu, alergijski konjuktivitis i atopijski dermatitis.

[0202] Takođe je opisan postupak lečenja leukemije kod pacijenta, primenom terapijski efektivne količine kombinacije predmetnog pronalaska. Na primer, postupci su efektivni u lečenju hronične limfocitne leukemije (CLL), ne-Hočkinovog limfoma (NHL), akutne mijeloidne leukemije (AML), multiplog mijeloma (MM), sitnoćelijsog limfocitnog limfoma (SLL) i indolentnog ne-Hočkinovog limfoma (I-NHL).

[0203] U prethodno navedenim postupcima lečenja, jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava može biti primenjivano u kombinacijama koje su ovde opisane. Na primer, kombinacija predmetnog pronalaska je korisna u kombinovanju (zajedničkoj ili sekvencijalnoj primeni) sa poznatim antikancerskim tretmanima, kao što su zračenje, ili primena jedno ili više od citostatskih, citotoksičnih ili antikancerskih agenasa, kao što su, na primer, DNK interagujući agensi, poput cisplatina ili doksorubicina; inhibitori topoizomeraze II, kao što je etopozid; inhibitori topoizomeraze I, poput CPT-11 ili topotekana; sredstva koja interaguju s tubulinom, kao što su paklitaksel, docetaksel ili epotiloni (na primer iksabepilon), bilo prirodni ili sintetički; hormonska sredstva, kao što je tamoksifen; inhibitori timidilat sintaze, kao što je 5-fluorouracil; i anti-metaboliti, poput metotreksata; drugi inhibitori tirozin kinaze kao što su Iressa i OSI-774; inhibitori angiogeneze; EGF inhibitori; VEGF inhibitori; CDK inhibitori; SRC inhibitori; c-Kit inhibitori; Her1/2 inhibitori i monoklonska antitela usmerena na receptore faktora rasta kao što su erbituks (EGF) i herceptin (Her2); i drugi modulatori proteinskih kinaze. Dodatno aktivno sredstvo može takođe biti inhibitor proteazoma, Bortezomib (Velcade®), Carfilzomib (PR-171), PR-047, disulfiram, laktacistin, PS-519, eponemicin, epoksomicin, aklacinomicin, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, vinil sulfonski tripeptidni inhibitori, ritonavir, PI-083, (+/-)-7-metilomuralid, (-)-7-metilomuralid, lenalidomid (Revlimid®), ili kombinacija istih.

[0204] Kombinacije predmetnog pronalaska su takođe korisne u kombinovanju (zajedničkoj ili sekvencijalnoj primeni) sa jednim ili sa više od steroidnih anti-inflamatornih lekova, nesteroidnih antiinflamatornih lekova (NSAID) ili imunoselektivnih anti-inflamatornih derivata (ImSAID).

[0205] U posebnom primeru izvođenja, kancer je hematološki malignitet i/ili solidan tumor. U drugom posebnom primeru izvođenja, hematološki malignitet je leukemija ili limfom.

[0206] U pojedinim primerima izvođenja, limfom je neoplazma zrelih (perifernoh) B-ćelija. U specifičnim primerima izvođenja, neoplazma zrelih (periferna) B-ćelija je izabrana iz grupe koju se sastoji od B-ćelijske hronične limfocitne leukemije/sitnoćelijskog limfocitnog limfoma; B-ćelijske prolimfocitne leukemije; limfoplazmacitnog limfoma; limfoma marginalne zone, kao što je B-ćelijski limfom marginalne zone slezine (+/-vilusni limfociti), limfom marginalne zone limfnih čvorova (+/-monocitoidne B-ćelije) i ekstrenodalni B-ćelijski limfom marginalne zone limfoidnog tkiva povezanog sa sluzokožom (MALT); leukemije vlasastih ćelija; mijeloma/plazmacita plazma ćelija; folikularnog limfoma, folikularnog centra; limfoma mantle ćelija; difuznog krupnoćelijskog B-limfoma (uklјučujući medijastinalni krupnoćelijski B-limfom, intravaskularni krupnoćelijski B-limfom i primarni efuzioni limfom); i Burkitovog limfom/Burkitove ćelijske leukemije.

[0207] U pojedinim primerima izvođenja, limfom je izabran iz grupe koja se sastoji od multiplog mijeloma (MM) i ne-Hočkinovog limfoma (NHL), limfoma mantle ćelija (MCL), folikularnog limfoma, Valdenstromove makroglobulinemije (WM) ili B-ćelijskog limfoma i difuznog krupnoćelijskog B-limfoma (DLBCL).

[0208] U dodatnom posebnom primeru izvođenja, leukemija je izabrana iz grupe koja se sastoji od akutne limfocitne leukemije/akutne limfoblastne leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije (CLL) i sitnoćelijskog limfocitnog limfoma (SLL). U pojedinim primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom (NHL) je agresivan NHL ili indolentan NHL. Primeri agresivnih NHL obuhvataju B-ćelijske neoplazme, difuzni krupnoćelijski B-limfom, T/NK ćelijske neoplazme, anaplastični krupnoćelijski limfom, periferni T-ćelijski limfom, prekursorsku B-limfoblastnu leukemiju/limfom, prekursorsku T-limfoblastnu leukemiju/limfom, Burkitov limfom, adultni T-ćelijski limfom/leukemiju (HTLV1+), primarni limfom CNS-a, limfom mantle ćelija, polimorfni post-transplantacioni limfoproliferativni poremećaj (PTLD), limfom povezan sa SIDA-om, prvi histiocitni limfom i blastični NK-ćelijski limfom. Najčešća vrsta agresivnog NHL-a je difuzni krupnoćelijski limfom. Neograničavajući primeri indolentnog NHL obuhvataju folikularni limfom, sitnoćelijski limfocitni limfom, limfom marginalne zone (kao što je limfom ekstranodalne marginalne zone (označen i kao limfom limfoidnog tkiva povezanog sa sluzokožom, MALT), limfom marginalne zone limfnih čvorova (monocitoidni B-ćelijski limfom), limfom marginalne zone slezine) i limfoplazmacitni limfom (Valdenstromova makroglobulinemija). U pojedinim primerima izvođenja, subjekt boluje od agresivnog NHL ili indolentnog NHL.

[0209] U pojedinim primerima izvođenja, pacijent je sa stanjem koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od limfoma mantle ćelija (MCL), difuznog krupnoćelijskog B-limfoma (DLBCL), folikularnog limfoma (FL), akutne limfocitne leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije (CLL) i sitnoćelijskog limfocitnog limfoma (SLL), multiplog mijeloma (MM) i limfoma marginalne zone.

[0210] U određenim primerima izvođenja, pacijent je sa recidivima ili refraktornim stanjem. U posebnom primeru izvođenja, subjekt je refraktoran na lečenje hemoterapijom ili u relapsu nakon lečenja hemoterapijom.

[0211] U određenim primerima izvođenja, kancer je rezistentan na lečenje sa rituksimabom. U pojedinim primerima izvođenja, kancer karakteriše smanjen odgovor na lečenje rituksimabom. U pojedinim primerima izvođenja, subjekt je prethodno tretiran sa rituksimabom.

[0212] U posebnom primeru izvođenja, postupci obuhvataju smanjenje nivoa aktivnosti NF-kapa-B, smanjenje SNAIL ekspresije, povećanje RKIP aktivnosti, povećanje PTEN aktivnosti, povećanje osetlјivosti tumora na TRAIL-apoptozu, smanjenje nivoa aktivnosti PI3K δ ili njihove kombinacije kod pacijenta.

[0213] U posebnom primeru izvođenja, kombinacija jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela dovodi do deplecije B-ćelija iz pune krvi čoveka. U pojedinim primerima izvođenja, kombinacija jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela dovodi do deplecije B-ćelije iz pune lјudske krvi u većoj meri od obima deplecije B-ćelija u humanoj punoj krvi koji se postiže samostalnim tretmanom bilo sa Jedinjenjem formule A ili anti-CD20 antitelom. U pojedinim primerima izvođenja, kombinacija jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela dovodi do deplecije B-ćelija u punoj humanoj krvi do obima koji je veći od zbira deplecije koja se dobija sa Jedinjenjem A i deplecije koja se dobija sa anti-CD20 antitelom.

[0214] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo su za upotrebu u postupku lečenja oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, pri čemu postupak obuhvata primenu jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela subjektu kome je to potrebno. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo su za upotrebu u postupku lečenja oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom aktivnošću B-ćelija, pri čemu postupak obuhvata primenu jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela subjektu kome je to potrebno. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje formule A i anti-CD20 antitelo su za upotrebu u postupku lečenja oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernim brojem B-ćelija, pri čemu postupak obuhvata primenu jedinjenja formule A i anti-CD20 antitela subjektu kome je to potrebno.

[0215] Jedinjenje formule A može biti pripremljeno upotrebom opštih sintetskih postupaka, kao što je prijavljeno u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2011/055215 A2 i publikaciji SAD patentne prijave br. 2011/0118257 A1, kao i specifičnom pripremom jedinjenja koja je prijavljena u privremenoj patentnoj prijavi u Indiji 2693/CHE/2012, podnetoj 4. jula 2012. godine, SAD privremenoj patentnoj prijavi serijskog broja 61/691,586, podnetoj 21. avgusta 2012. godine, PCT/US2013/055434 podentoj 2. jula 2013. godine i SAD serijskog broja 13/933,856, podnetog 2. jula 2013. godine.

PRIMERI

Sinteza jedinjenja formule A

[0216] Ukoliko nije drugačije naznačeno, prečišćavanje podrazumeva hromatografiju na koloni upotrebom silika gela kao stacionarne faze i smeše petrolej etra (tačka klјučanja 60-80°C) i etil acetata ili dihlorometana i metanola odgovarajuće polarnosti kao mobilnih faza. Termin "ST" se odnosi na amijentalnu (sobnu) temperaturu (25-28°C).

Intermedijer 1: 2-(1-bromoetil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on

[0217]

Korak-1 [1-(5-Fluoro-2-hidroksifenil)-2-(3-fluorofenil)etanon]: 3-fluorofenilsirćetna kiselina (7,33 g; 47,56 mmol) je rastvorena u 25 ml dihlorometana. U ovu smešu su zatim dodati oksalilhlorid (7,54 g; 59,46 mmol) i DMF (3 kapi) na 0°C, pa je smeša mešana tokom 30 min. Rastvarač je uparen i talog je rastvoren u 25 ml dihlorometana. U ovu smešu je dalje dodat 4-fluoroanizol (5,00 g; 39,64 mmol), nakon čega je smeša ohlađena do 0°C. Na 0°C je potom dodat AlCl3(7,95 g; 59,46 mmol), reakciona smeša je zagrejana do ST i mešana tokom 12 sati. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 2N HCl, nakon čega je smeša ekstrahovana etil acetatom, osušena upotrebom natrijum sulfata i koncentrovana. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (4,5 g; prinos 45%).<1>H-NMR (δ ppm, DMSO-D6, 400 MHz): δ 11,34 (s, 1H), 7,75 (dd, J=9,4; 3,1 Hz, 1H), 7,42 (m, 2H), 7,12 (m, 3H), 7,05 (dd, J=9,0; 4,5 Hz, 1H), 4,47 (s, 2H).

Korak-2 [2-Etil-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on]: 1-(5-fluoro-2-hidroksifenil)-2-(3-fluorofenil)etanon dobijen u Koraku-1 (3,00 g; 12,08 mmol) je presut u tikvicu sa okruglim dnom, pa su dodati trietilamin (25 ml) i propionski anhidrid (4,92 g; 37,82 mmol), nakon čega je smeša grejana na temperaturi refluksa tokom 24 sata. Nakon hlađenja do ST, reakciona smeša je zakišelјena dodavanjem IN rastvora HCl, pa je dalje ekstrahovana etil acetatom, isprana rastvorom natrijum bikarbonata, osušena upotrebom natrijum sulfata i koncentrovana. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao beličasta čvrsta supstanca (1,80 g; prinos 52%).<1>H-NMR (δ ppm, DMSO-D6, 400 MHz): δ 7,80 (m, 1H), 7,76 (m, 2H), 7,51 (dd, J=8,0; 6,4 Hz), 7,22 (m, 1H), 7,18 (m, 2H), 2,56 (q, J=7,6 Hz, 2H), 1,20 (t, J=7,6 Hz, 3H).

Korak-3: U rastvor 2-etil-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona dobijenog u Koraku-2 (1,80 g; 6,28 mmol), u uglјenik tetrahloridu (20 ml), dodat je N-bromosukcinimid (1,11 g; 6,28 mmol), pa je smeša zagrejana do 80°C. U reakcionu smešu je zatim na 80°C dodat azobisizobutironitril (10 mg). Nakon 12 sati, reakciona smeša je ohlađena do ST, razblažena dihlormetanom i isprana sa vodom. Organski sloj je osušen uporebom natrijum sulfata, pa je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (1,25 g; prinos 55%).<1>H-NMR (δ ppm, DMSO-D6, 400 MHz): δ 7,91 (dd, J=9,2; 4,3 Hz, 1H), 7,81 (dt, J=8,2; 2,8 Hz, 1H), 7,74 (dd, J=8,3; 3,1 Hz, 1H), 7,57 (m, 1H), 7,32 (dt, J=8,5; 2,4 Hz, 1H), 7,19 (m, 2H), 5,00 (q, J=6,8 Hz, 1H), 1,97 (d, J=6,8 Hz, 3H).

Intermedijer 2: 6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-2-(1-hidroksietil)-4H-hromen-4-on

[0218]

[0219] Rastvoru Intermedijera 1 (15,0 g; 40,84 mmol), u DMSO-u (150 ml), dodat je n-butanol (7,5 ml), pa je smeđa grejana na 120°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je zatim ohlađena do ST, reakcija je zaustavljena vodom i smeša je ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je osušen upotrebom natrijum sulfata i potom je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao beličasta čvrsta supstanca (7,90 g; 64%).<1>H-NMR (δ ppm, CDCl3, 400 MHz): 7,85 (dd, J = 8,1; 3 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 9,2; 4,2 Hz, 1H), 7,47-7,37 (m, 2H), 7,15-6,98 (m, 3H), 4,74 (kvintet, J = 6,8 Hz, 1H), 2,23 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 1,54 (d, J = 6,6 Hz, 3H).

Intermedijer 3: 2-acetil-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on

[0220]

[0221] U dihlorometan (40 ml) je dodat DMSO (5,60 ml; 79,14 mmol), pa je smeša ohlađena do -78°C, nakon čega je dodat oksalil hlorid (3,40 ml; 39,57 mmol). Nakon 10 minuta, u kapima je dodat i intermedijer 2 (6,00 g; 19,78 mmol) u dihlorometanu (54 ml) i smeša je mešana tokom 20 min. Dalje je dodat trietilamin (12 ml), pa je mešanje nastavljeno tokom 1 sata. Reakcija je zaustavljena vodom i smeša je ekstrahovana dihlorometanom. Organski sloj je osušen upotrebom natrijum sulfata, pa je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (4,2 g; 71%) koja je upotrebljena u sledećem koraku kao takva.

Intermedijer 4: (S)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-2-(1-hidroksietil)-4H-hromen-4-on

[0222]

[0223] U intermedijer 3 (2,00 g; 6,66 mmol) je dodat R-Alpin boran (0,5 M u THF-u; 20 ml) i smeša je grejana na 60°C tokom 20 sati. Reakcija je zaustavljena sa 2N HCl, pa je smeša ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je osušen upotrebom natrijum sulfata i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao beličasta čvrsta supstanca (1,51 g; 75%). Enantiomer u višku: 94,2%, obogaćen izomerom brzog eluata (retenciono vreme: 8,78 min), što je određeno HPLC postupkom na chiralpak AD-H koloni.

Intermedijer 5: (R)-1-(6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4-okso-4H-hromen-2-il)etil 4-hlorobenzoat

[0224]

[0225] U rastvor intermedijera 4 (1,45 g; 4,78 mmol) u THF-u (15 ml), dodati su 4-hlorobenzoeva kiselina (0,748 g; 4,78 mmol) i trifenilfosfin (1,88 g; 7,17 mmol), pa je smeša zagrejana do 45°C, nakon čega je dodat diizopropilazodikarboksilat (1,4 ml; 7,17 mmol). Nakon 1 sata, reakciona smeša je koncentrovana, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetate i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao beličasta čvrsta supstanca (1,81 g; 86%) koja je upotrebljena u sledećem koraku bez prečišćavanja.

Intermedijer 6: (R)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-2-(1-hidroksietil)-4H-hromen-4-on

[0226]

Postupak A

[0227] Intermedijer 5 (1,75 g; 3,96 mmol) u metanolu (17 ml) je ohlađen do 10°C, nakon čega je dodat kalijum karbonat (0,273 g; 1,98 mmol) i smeša je mešana tokom 30 minuta. Reakciona smeša je zatim koncentrovana, zakišeljena dodavanjem 2N rastvora HC1, pa je ekstrahovana etil acetatom, osušena upotrebom natrijum sulfata i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (1,05 g; prinos 87%). Enantiomer u višku: 93,6%, obogaćen izomerom kasnijeg eluata, što je određeno HPLC postupkom na chiralpak AD-H koloni.

Postupak B

[0228]

Korak-1 [(R)-2-(1-(benziloksi)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on]: U 1-(5-fluoro-2-hidroksifenil)-2-(3-fluorofenil)etanon (11,00 g; 44,31 mmol) u dihlorometanu, dodati su HATU (33,7 g; 88,63 mmol) i R-(+)2-benziloksipropionska kiselina (9,58 g; 53,17 mmol), pa je smeša mešana tokom 10 min. U kapima je zatim dodat trietilamin (66,7 ml; 0,47 mol) i nastavljeno je mešanje na ST tokom 24 sata. Reakcija je zaustavljena dodavanjem vode, nakon čega je smeša ekstrahovana dihlorometanom, osušena upotrebom natrijum sulfata i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao žuta čvrsta supstanca (10,5 g; prinos 60%).<1>H-NMR (δ ppm, CDCl3, 400 MHz): 7,85 (dd, J = 8,1,3 Hz, 1H), 7,58 (dd, J = 9,1; 4,1 Hz, 1H), 7,47-7,39 (m, 1H), 7,39-7,34 (m, 1H), 7,28-7,20 (m, 3H), 7,20-7,14 (m, 2H), 7,16-7,07 (m, 1H), 6,99-6,89 (m, 2H), 4,50-4,31 (m, 3H), 1,56 (d, J = 6,4 Hz, 3H).

Korak-2: (R)-2-(1-(benziloksi)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on dobijen u Koraku-1 (10,5 g; 26,69 mmol) u dihlorometanu (110 ml) je ohlađen do 0°C, pa je u porcijama dodat aluminijum hlorid (5,35 g; 40,03 mmol) i smeša je mešana na ST tokom 6 sati. Reakcija je zaustavljena sa 2N rastvorom HCl-a, nakon čega je smeša ekstrahovana dihlorometanom, osušena upotrebom natrijum sulfata i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobio intermedijer 6 kao žuta čvrsta supstanca (6,1 g; prinos 76%). Enantiomer u višku: 97,7%, obogaćen izovmerom kasnijeg eluata (retenciono vreme: 11,12 min.), što je određeno HPLC postupkom na chiralpak AD-H koloni.

Intermedijer 7: 4-bromo-2-fluoro-1-izopropoksibenzen

[0229]

[0230] U rastvor 4-bromo-3-fluorofenola (10 g; 52,35 mmol) u THF-u (100ml), dodati su izopropil alkohol (4,8 ml; 62,62 mmol) i trifenilfosfin (20,6 g; 78,52 mmol), pa je smeša zagrejana do 45°C, nakon čega je dodat diizopropilazodikarboksilat (15,4 ml; 78,52 mmol). Smeša je dalje grejana na temperaturi refluksa tokom 1 sata, pa je koncentrovana i ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bezbojna tečnost (13,1 g; prinos 99%), koja je upotrebljena u sledećem koraku bez prečišćavanja.

Intermedijer 8: 2-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan

[0231]

[0232] Kalijum acetat (10,52 g; 107,2 mmol) i bis(pinakolato)diboron (15 g; 58,96 mmol) su dodati u rastvor intermedijera 7 (10,52 g; 107,2 mmol) u dioksanu (125 ml), pa je rastvor degasiran tokom 30 min. Zatim je pod atmosferom azota dodat [1,1'-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloro paladijum(II) CH2Cl2(4,4 g; 5,36 mmol) i smeša je grejana na 80°C. Nakon 12 sati, reakciona smeša je profiltrirana kroz celitni sloj i koncentrovana. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše etil acetata i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao žuto ulјe (13,9 g; 99%) koje je upotrebljeno u sledećem koraku bez prečišćavanja.

Intermedijer 9: 3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amin

[0233]

[0234] U rastvor 3-jodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (11,0 g; 42,14 mmol) u DMF-u (110 ml), dodati su etanol (55 ml) i voda (55 ml), intermedijer 8 (23,4 g; 84,28 mmol) i natrijum karbonat (13,3 g; 126,42 mmol), pa je smeša degasirana tokom 30 min. Dalje je pod atmosferom azota dodat tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (2,4 g; 2,10 mmol) i smeša je grejana na 80°C. Nakon 12 sati, reakciona smeša je profiltrirana kroz celitni sloj, koncentrovana i ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je osušen upotrebom natrijum sulfata, pa je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je triturisan dietil etrom, profiltriran i osušen pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao svetlo smeđa čvrsta supstanca (3,2 g; prinos 26%) koja je kao takva upotrebljena u sledećem koraku.

(RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on

[0235] U rastvor intermedijera 9 (0,080 g; 0,293 mmol) u DMF-u (2 ml), dodat je kalijum karbonat (0,081 g; 0,587 mmol) i smeša je mešana na ST tokom 10 min. U ovu smešu je zatim dodat intermedijer 1 (0,215 g; 0,587 mmol), pa je mešanje nastavljeno tokom 12 sati. Reakciona smeša je dalje razblažena vodom i ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je osušen upotrebom natrijum sulfata, pa je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše metanola i dihlorometana, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0,045 g). TT: 175-177°C.<1>H-NMR (δ ppm, DMSO-D6, 400 MHz): δ 8,20 (s, 1H), 7,85 (dd, J = 81;. 3,0 Hz, 1H), 7,48-7,33 (m, 5H), 7,14 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 7,02 (m, 2H), 6,90 (m, 1H), 6,10 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 5,42 (s, 2H), 4,64 (kvintet, J = 6,0 Hz, 1H), 1,99 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,42 (d, J = 6,1 Hz, 6H).

(S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on ("S-izomer")

[0236] U rastvor intermedijera 9 (0,134 g; 0,494 mmol) u THF-u (2,0 ml), dodati su intermedijer 6 (0,150 g; 0,494 mmol) i trifenilfosfin (0,194 g; 0,741 mml), pa je smeša mešana na ST tokom 5 min. Zatim je dodat diizopropilazodikarboksilat (0,15 ml; 0,749 mmol) i smeša je grejana na 45°C. Nakon 2 sata, reakcija je zaustavljena sa vodom i smeša je ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je osušen upotrebom natrijum sulfata, pa je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše acetate i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao beličasta čvrsta supstanca (0,049 g; prinos 20%). TT: 139-142°C. Masa: 571,7 (M<+>). Enantiomer u višku: 89,8% što je određeno HPLC postupkom na chiralpak AD-H koloni, obogaćen izomerom brzog eluata (retenciono vreme = 10,64 min.).

(R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-ehromen-4-on

[0237] U rastvor intermedijera 8 (0,284 g; 0,989 mmol) u THF-u (5,0 ml), dodati su intermedijer 4 (0,250 g; 0,824 mmol) i tris(4-metoksi)fenilfosfin (0,435 g; 1,23 mml), pa je smeša mešana na ST tokom 5 min. Zatim je dodat diizopropilazodikarboksilat (0,25 ml; 1,23 mmol), nakon čega je mešanje smeše nastavljeno na ST. Nakon 12 sati, reakcija je zaustavljena dodvanjem vode i smeša je ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je osušen upotrebom natrijum sulfata, pa je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni, upotrebom smeše acetate i petrolej etra, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao beličasta čvrsta supstanca (0,105 g; prinos 22%). TT: 145-148°C. Masa: 571,7 (M<+>). Enantiomer u višku: 95,4%, što je određeno HPLC postupkom na chiralpak AD-H koloni, obogaćen izomerom kasnijeg eluata (retenciono vreme = 14,83 min.).

Biološka ispitivanja

Kombinacija Jedinjenja formule A i anti-CD20antitela

Primer 1: Kombinacije S-izomera Jedinjenja formule A i ublituksimaba dovode do deplecije B ćelija iz pune krvi

[0238] Analiza protočnom citometrijom je upotrebljena da bi se uporedile sposobnosti S-izomera Jedinjenja formule A, Ublituksimaba (Ubx) i njihovih kombinacija da dovedu do deplecije B ćelija iz humane pune krvi (HWB). U ovoj analizi, 50 µl HWB uzorka je tretirano bilo sa S-izomerom jedinjenja formule A (1000 nM), UBX (od 100 µg/ml do 0,1 µg/ml) ili UBX u kombinaciji sa S-izomerom jedinjenja formule A u koncentraciji od 1000 nM, pa je smeša inkubirana tokom 24 sata na 37°C i sa 5% CO2. U epruvetu za centrifugiranje od 1,5 ml je uzeto po 20 µl tretiranog uzorka koji je dalje obeležen sa CD45 FITC i CD19 PE ili sa CD20 FITC antitelom i inkubiran u mraku tokom 1 sata na ST. Zatim je dodat po 1 ml rastvora za liziranje crvenih krvnih ćelija (RBC), pa su epruvete centrifugirane na 3000 rpm tokom 10 minuta. Supernatant je izvučen aspiracijom i u talog je dodato 250 µl PBS-a. Epruvete su vorteksovane, nakon čega je 5000 događaja snimljeno na Guava® easyCyte™ protočnom citometru i analizirano upotrebom Incyte kompjuterskog programa.

[0239] Selektovana populacija ćelija pozitivnih na CD45 je dalјe analizirana na CD19. Izračunat je broj ćelija koje su bile pozitivni na CD45 i CD19, a podaci su izraženi kao procenat CD19 pozitivnih ćelija u populaciji. Populacije ćelija pozitivnih na CD20 su selektovane dalje fluorescencom pozitivnih minus neobeleženih ćelija i podaci su izraženi kao procenat ćelija u populaciji koje su pozitivne na CD20. Gubitak CD19 / CD20 populacije iz kontrole je izračunat i izražen kao % deplecije u odnosu na kontrolu.

[0240] Rezultati su prikazani na Slici 1. S-izomer jedinjenja formule A nije citotoksičan za B-ćelije u koncentracijama do 10 µM. Stoga, sa 1 µM S-izomera Jedinjenja formule A nije uočeno smanjanje HWB B-ćelija pozitivnih na CD19 ili pozitivnih na CD20. UBX anti-CD20 antitelo je rezultovalo u depleciji B-ćelija od samo 20-30%, u dozama od 1 do 100000 ng/ml, ali je prouzrokovao smanjenje CD20+ B-ćelija koje je bilo zavisno od doze. Kombinacija 1000 nM S-izomera Jedinjenja formule A sa 10 ng/ml UBX je dovela do potencijacije deplecije CD19+ ćelija, dok je kombinacija 1000 nM S-izomera Jedinjenja formule A sa koncentracijama UBX od 0,1-10 ng/ml rezultovala u umerenom aditivnom efektu na depleciju CD20+ ćelija. Ovi rezultati pokazuju da kombinacija S-izomera Jedinjenja formule A (1000 nM) sa UBX (10 ng/ml) ispoljava potencijaciju deplecije ćelija pozitivnih na CD19 i umerano dejstvo na depleciju ćelija pozitivnih na CD20.

Primer 2: Uticaj kombinacije S-izomera Jedinjenja formule A i UBX na proliferacije B-ćelija indukovanu sa LPS-om

[0241] Protočna citometrija je upotrebljena za ispitivanje dejstva S-izomera Jedinjenja formule A, Ubx i njihovih kombinacija na proliferaciju indukovanu sa LPS-om kod CD19 i CD20 ćelija u HWB. U ovim eksperimentima, 250 µl razblaženog (1:3,5; sa RPMI-HG medijumom) HWB uzorka je tretirano bilo sa S-izomerom jedinjenja formule A (od 10 µM do 0,1 µM), UBX (od 100 µg/ml do 0,1 pg/ml) ili UBX sa S-izomerom jedinjenja formule A u koncentraciji od 1000 nM tokom 15 minuta, nakon čega je sledila indukcija sa 20 µg/ml LPS-a i inkubacija tokom 72 sata na 37°C, sa 5% CO2. U epruvetu za centrifugiranje od 1,5 ml je uzeto po 20 µl tretiranog uzorka koji je dalje obeležen sa CD45 FITC i CD19 PE ili sa CD20 FITC antitelom i inkubiran u mraku tokom 1 sata na ST. Zatim je dodat po 1 ml RBC rastvora za liziranje i epruvete su centrifugirane na 3000 rpm tokom 10 minuta. Supernatant je izvučen aspiracijom i u talog je dalje dodato 250 µl PBS-a. Epruvete su vorteksovane, nakon čega je 5000 događaja snimljeno na Guava® easyCyte™ protočnom citometru i analizirano upotrebom Incyte kompjuterskog programa.

[0242] Selektovana populacija limfocitnih pozitivnih ćelija je dalјe analizirana na CD19 i CD20. Izračunate su ćelije pozitivne na CD19 i/ili CD20, pa su podaci izraženi kao procenat pozitivnih ćelija u populaciji. Gubitak pozitivne populacije u kontrolnom uzorku nakon indukcije sa LPS-om je izračunat i izražen kao % inhibicije u odnosu na kontrolu.

[0243] Rezultati su prikazani na Slikama 2 i 3. S-izomer jedinjenja formule A (1 µM) je prouzrokovao inhibiciju LPS-om indukovane proliferacije CD19+ B-ćelija u HWB koja je zavisila od doze (-60%). Dodavanje 1 µM S-izomera Jedinjenja formule A različitim koncentracijama UBX nije povećalo odgovor iznad -60% što je predstavljalo rezultat minimalnog efekta UBX na CD19+ ćelije. Ipak, zapažen je aditivni efekat kombinacije na proliferaciju CD19+ ćelija sa koncentracijom UBX od 100 ng/ml.

[0244] Nasuprot njegovom uticaju na proliferaćiju CD19+ ćelija, S-izomer jedinjenja formule A je ispoljio inhibiciju CD20+ ćelija od -40% u koncentraciji od 1 µM. Aditivan efekat kombinacije 1 µM S-izomera Jedinjenja formule A sa UBX je bio očigledan, prevashodno za dozu od 0,1 ng/ml.

Primer 3: Kombinacije S-izomera jedinjenja Formule A i UBX povećavaju apoptozu u kancerskim ćelijama

[0245] Da bi se utvrdilo dejstvo S-izomera Jedinjenja formule A, UBX i njihovih kombinacija na apoptozu u kancerskim ćelijama, upotrebljen je in situ komplet za kaspazu-3 (Millipore). Ćelije su zasejane na mikrotitarsku ploču sa 6 bunarića, u koncentraciji od 0,5 x 10<6>ćelije/ml, nakon čega su tretirane bilo sa S-izomerom jedinjenja formule A (1000 nM), UBX-om (od 100 µg/ml do 0,1 µg/ml) ili sa kombinacijom UBX-a i S-izomera Jedinjenja formule A u koncentraciji od 1000 nM, nakon čega su inkubirane 24 sata na 37°C sa 5% CO2. Ćelije su zatim prebaćene u epruvete za mikrofuge da bi primile 10 µl sveže pripremlјenog FLICA™ reagensa, pa su inkubirane jedan sat na 37°C i sa 5% CO2, zaštićene od svetlosti. Nakon obimnog ispiranja sa puferom za pranje, ispitivani uzorci su podešeni tako da se izjednači broj ćelija u PBS-u. Po 100 µl svake ćelijske suspenzije je dalje prebačeno u crne mikrotitar ploče sa 96 bunarića i fluorescencija je očitana u duplikatima, upotrebom ekscitacione talasne dužine od 490 nm i emisione talasne dužine od 520 nm u čitaču ploča. Intenzitet fluorescencije za DMSO kontrolu je oduzet od intenziteta koji je dobijen za ispitivana jedinjenja. Podaci su predstavljeni kao procenat maksimalnog odgovora (100%) i shodno tome su uneti u grafik.

[0246] Rezultati su prikazani na Slici 4. UBX je pokazao ograničenu sposobnost indukcije aktivnosti Kaspaze-3 u ispitivanim ćelijskim linijama. Aktivnost kaspaze-3 je bila povećana za 40-75% nakon inkubiranja ćelijskih linija sa 1 µM S-izomero Jedinjenja formule A. Primećen je sinergistički efekat kombinacije u koncentraciji UBX od 100 ng/ml u Daudi ćelijama, dok je aditivni efekat primećen u RPMI-8226, Raji i U226B1 ćelijskim linijama, sa višim koncentracijama (10 i 100 ng/ml) UBX-a.

Primer 4: Kombinacija S-izomera Jedinjenja formule A i UBX-a prouzrokuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa

[0247] Da bi se utvrdilo dejstvo S-izomera Jedinjenja formule A, UBX i njihovih kombinacija na ćelijski ciklus u kancerskim ćelijama, upotrebljen je reagens za ispitivanje ćelijskog ciklusa (Millipore). U ovim eksperimentima, ćelije su zasejane na mikrotitarsku ploču sa 6 bunarića, u koncentraciji od 0,5 x 10<6>ćelije/ml, nakon čega su tretirane bilo sa S-izomerom jedinjenja formule A (od 10 µM do 0,1 µM), UBX (od 100 µg/ml do 0,1 µg/ml) ili sa kombinacijom UBX-a i S-izomera jedinjenja formule A u koncentraciji od 1000 nM, pa inkubirane 72 sata na 37°C i sa 5% CO2. Ćelije su zatim prebačene u epruvete za mikrofuge da bi primile 50 µl reagensa za određivanje faze ćelijskog ciklusa, pa su inkubirane 30 minuta na ST, zaštićene od svetlosti. Ćelije su zatim razblažene sa 300-400 µl PBS-a i konačno je minimalno 10,000 događaja snimljeno na Guava® easyCite™ protočnom citometru. Podaci su analizirani upotrebom Express Pro programa, a procenat populacije ćelija u različitim fazama ćelijskog ciklusa u odnosu na kontrolu je predstavlјen na histogramima.

[0248] Slike 5-10 prikazuju rezultate dobijene za U266B1 i Raji ćelije. Dodatno, Tabele 1-12 koje su date ispod, obezbeđuju kvantitativne rezultate dobijene upotrebom U266B1, DB, Raji i Daudi ćelija.

Tabela 1: U266B1 ćelije - inkubacija tokom 72 h sa Jedinjenjem formule A

Tabela 2: U266B1 ćelije - inkubacija tokom 72 h sa UBX anti-CD20 antitelom

Tabela 3: U266B1 ćelije - inkubacija tokom 72 h sa UBX Jedinjenjem formule A (1000 nM)

Tabela 4: DB ćelije - inkubacija tokom 72 h sa Jedinjenjem formule A

Tabela 5: DB ćelije - inkubacija tokom 72 h sa UBX anti-CD20 antitelom

Tabela 6: DB ćelije - inkubacija tokom 72 h sa UBX Jedinjenjem formule A

Tabela 7: Raji ćelije - inkubacija tokom 72 h sa Jedinjenjem Formule A

Tabela 8: Raji ćelije - inkubacija tokom 72 h sa UBX anti-CD20 antitelom

Tabela 9: Raji ćelije - inkubacija tokom 72 h sa UBX Jedinjenjem formule A (1000 nM)

Tabela 10: Daudi ćelije - inkubacija tokom 72 h sa Jedinjenjem Formule A

Tabela 11: Daudi ćelije - inkubacija tokom 72 h sa UBX anti-CD20 antitelom

Tabela 12: Daudi ćelije - inkubacija tokom 72 h sa UBX Jedinjenjem formule A (1000 nM)

[0249] Ovi rezultati pokazuju da kontakt ćelija sa S-izomerom jedinjenja formule A ih zaustavlja u G2/M fazi i zavisi od doze. Dodatno, tretman sa UBX-om tokom 72 sata je prouzrokovao umereno zaustavljanje u G2/M fazi ćelijskog ciklusa u ćelijam difuznog krupnoćelijskog B-limfoma (DB) i u U266B 1 ćelijama, dok je broj Sub G0 ćelija bio povećan u Raji i Daudi ćelijama. Kombinacija sa 1 µM S-izomerom jedinjenja formule A naglašava UBX odgovor u ispitivanim ćelijskim linijama.

Primer 5: Kombinacije S-izomera Jedinjenja formule A i UBX sinergistički povećavaju apoptozu u kancerskim ćelijama

[0250] Da bi se utvrdilo dejstvo S-izomera Jedinjenja formule A, UBX i njihovih kombinacija na apoptozu u kancerskim ćelijama, upotrebljen je in situ komplet za kaspazu-3 (Millipore). Ćelije su zasejavane na mikrotitarsku ploču sa 6 bunarića, u koncentraciji od 0,5 x 10<6>ćelije/ml, nakon čega su tretirane bilo sa S-izomerom jedinjenja formule A (200-5000 nM), UBX (od 10,000 ng/ml do 10 ng/ml) ili sa kombinacijom UBX i S-izomera Jedinjenja formule A (kao što je naznačeno), nakon čega su inkubirane 24 sata na 37°C sa 5% CO2. Ćelije su zatim prebaćene u epruvete za mikrofuge da bi primile 10 µl sveže pripremlјenog FLICA™ reagensa, pa su inkubirane jedan sat na 37°C i sa 5% CO2, zaštićene od svetlosti. Nakon obimnog ispiranja sa puferom za pranje, ispitivani uzorci su podešeni tako da se izjednači broj ćelija u PBS-u. Po 100 µl svake ćelijske suspenzije je dalje prebačeno u crne mikrotitar ploče sa 96 bunarića i fluorescencija je očitana u duplikatima upotrebom ekscitacione talasne dužine od 490 nm i emisione talasne dužine od 520 nm u čitaču ploča. Intenzitet fluorescencije za DMSO kontrolu je oduzet od intenziteta koji je dobijen za ispitivana jedinjenja. Podaci su izraženi kao izračunat kombinacioni indeks (C.I.) za aktivnost kaspaze-3. Vrednost C.I. manja od jedan je ukazivala na sinergizam, vrednost od jedan je ukazivala na aditivne efekte, dok je veća vrednost ukazilava na antagonizam.

[0251] Rezultati su prikazani na Slici 11 i u Tabelama 13-15 za DBCL ćelijsku liniju LY1. UBX je indukovao aktivnost kaspaze-3 u LY1. Aktivnost kaspaze-3 je sinergistički povećana u prisustvu UBX (sve koncentracije) i S-izomera Jedinjenja formule A (1000 nM).

[0252] Rezultati su prikazani na Slici 12 i u Tabelama 16-18 za Raji ćelijsku liniju Burkitovog limfoma. UBX je indukovao aktivnost kaspaze-3 u Raji LY1. Aktivnost kaspaze-3 je sinergistički povećana u prisustvu UBX (svih koncentracija) i S-izomera Jedinjenja formule A (200 nM).

Tabela 13: LY1 ćelije inkubirane sa S-izomerom

Tabela 14: LY1 ćelije inkubirane sa UBX

Tabela 15: LY1 ćelije inkubirane sa S-izomerom i UBX

Tabela 16: Raji ćelije inkubirane sa S-izomerom

Tabela 17: Raji ćelije inkubirane sa UBX

Tabela 18: Raji ćelije inkubirane sa S-izomerom i UBX-om

[0253] Dejstvo kombinacija S-izomera Jedinjenja formule A i UBX na aktivnost kaspaze 3 su ispitani u tri dodatne ćelijske linije, LY10 (DLBCL), Toledo (DLBCL) i Daudi (Burkitov limfom), kao što je prethodno opisano. Rezultati su prikazani u Tabelama 19-21. Kombinacije su takođe pokazale sinergističku aktivaciju kaspaze 3.

Tabela 19: Ćelije LY10 inkubirane sa S-izomerom i UBX-om (DLBCL)

Tabela 20: Toledo ćelije inkubirane sa S-izomerom i UBX-om (DLBCL)

Tabela 21: Daudi ćelije inkubirane sa S-izomerom i UBX-om (Burkitov limfom)

[0254] Na tri ćelijske linije mantle limfoma (MCL), Jeko, Maver i Rec-1, ispitani su takođe efekti kombinacija S-izomera Jedinjenja formule A i UBX na aktivnost kaspaze 3, kao što je prethodno opisano. Rezultati su prikazani u Tabelama 22-24. Kombinacije su takođe pokazale sinergističku aktivaciju kaspaze 3, pri čemu je sinergistički efekata optimizovan sa višim koncentracijama S-izomera i UBX.

Tabela 22: Jeko ćelije inkubirane sa S-izomerom i UBX-om

Tabela 23: Maver ćelije inkubirane sa S-izomerom i UBX

Tabela 24: Rec-1 ćelije inkubirane sa S-izomerom i UBX

[0255] Sveukupno, navedeni rezultati pokazuju da S-izomer jedinjenja formule A i UBX ispoljavaju snažno sinergističko dejstvo u aktiviranju kaspaze 3, markera za apoptozu, u modelima B-ćelijskih limfoma.

Claims

Patentni zahtevi 1. In vitro postupak inhibicije proliferacije ćelijske populacije, koji obuhvata kontakt populacije sa kombinacijom koja sadrži (i) jedinjenje formule A,

njegov stereoizomer ili njegovu farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, i (ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde je navedeno anti-CD20 antitelo ublituksimab ili se vezuje za isti epitop kao ublituksimab ili je fragment koji vezuje antigen navedenog antitela.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde navedeno antitelo ili fragment sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 region iz sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 i 3, i VL CDR1, CDR2 i CDR3 region iz sekvenci SEQ ID NO: 6, 7 i 8, po izboru, gde anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, sadrži VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 9.
4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde je navedeno jedinjenje formule A (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on; ili (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, gde se populacija dovodi u kontakt sa kompozicijom koja sadrži (i) jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il) etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, i (ii) anti-CD20 antitelo.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, gde se populacija dovodi u kontakt sa (i) prvom kompozicijom koja sadrži jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, i (ii) drugom kompozicijom koja sadrži anti-CD20 antitelo.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, gde je anti-CD20 antitelo ublituksimab.
8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde je jedinjenje formule A (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.
9. Terapijska kombinacija koja sadrži: (i) jedinjenje formule A,

njegov stereoizomer, ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat; i (ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u vidu medikamenta za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem.
10. Jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, za upotrebu u vidu medikamenta u postupku za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem, postupak koji obuhvata primenu jedinjenja u kombinaciji sa anti-CD20 antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen.
11. Anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u vidu medikamenta u postupku za lečenje oboljenja ili poremećaja povezanog sa prekomernom proliferacijom B-ćelija, kancerom ili autoimunim oboljenjem ili poremećajem, pri čemu postupak obuhvata primenu anti-CD20 antitela ili fragmenta u kombinaciji sa Jedinjenjem formule (A) ili njegovim stereoizomerom, farmaceutski prihvatlјivom soli ili solvatom.
12. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-11, pri čemu je navedeno anti-CD20 antitelo ublituksimab ili se vezuje za isti epitop kao ublituksimab, ili je fragment koji vezuje antigen navedenog antitela.
13. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-11, pri čemu je navedeno anti-CD20 antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od rituksimaba, ofatumumaba, okrelizumaba, veltuzumaba, GA101, AME-133v, PRO131921, tozitumomaba, hA20 i PRO70769, ili je fragment koji vezuje antigen navedenog antitela.
14. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-13, pri čemu je jedinjenje izabrano od (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona.
15. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-12 ili 14, pri čemu je anti-CD20 antitelo ublituksimab.
16. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-15, pri čemu je jedinjenje formule A (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.
17. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-12 i 14-16, pri čemu je navedeno jedinjenje ptoluensulfonatna so (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofeniI)-4H-hromen-4-ona i navedeno anti-CD20 antitelo je ublituksimab.
18. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-17, pri čemu je kancer hematološki malignitet, po izboru, pri čemu je hematološki malignitet limfom ili leukemija, pri čemu je, po izboru, hematološki malignitet izabran iz grupe koja se sastoji od akutne limfocitne leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije ( CLL), sitnoćelijskog limfocitnog limfoma (SLL), multiplog mijeloma (MM), ne-Hočkinovog limfoma (NHL), limfoma mantle ćelija (MCL), folikularnog limfoma, Valdenstromove makroglobulinemije (WM), B-ćelijskog limfoma i difuznog krupnoćelijskog B-limfoma (DLBCL).
19. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-18, pri čemu kancer prekomerno eksprimira CD20 i/ili pri čemu je kancer refraktoran na hemoterapiju.
20. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-19, pri čemu je subjekat prethodno lečen hemoterapijom, rituksimabom ili njihovom kombinacijom.
21. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-20, pri čemu se navedeno jedinjenje i navedeno anti-CD20 antitelo ili fragment primenjuju subjektu sekvencijalno ili istovremeno, po izboru, gde su navedeno jedinjenje formule A i navedeno anti-CD20 antitelo ili fragment sadržani u istoj farmaceutskoj kompoziciji ili u odvojenim farmaceutskim kompozicijama.
22. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-21, pri čemu navedeni postupak obuhvata primenu ili navedena terapijska kombinacija sadrži najmanje jedno dodatno terapijsko sredstvo, po izboru, pri čemu je dodatno terapijsko sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od inhibitora proteazoma, Bortezomib-a (Velcade®), Carfilzomib-a (PR-171), PR-047, disulfirama, laktacistina, PS-519, eponemicina, epoksomicina, aklacinomicina, CEP-1612, MG-132, CVT-63417, PS-341, vinil sulfon tripeptidnih inhibitora, ritonavira, PI-083, (+/-)-7-metilomuralida, (-)-7-metilomuralida, lenalidomida i njihovih kombinacija.
23. Terapijska kombinacija, jedinjenje formule (A), ili njegov stereoizomer, njegova farmaceutski prihvatlјiva so ili solvat, ili anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9-22, pri čemu navedeni postupak obuhvata primenu ili navedena terapijska kombinacija sadrži najmanje dva dodatna terapijska sredstva izabrana iz grupe koju čine: a) CHOP (ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin, prednizon); b) R-CHOP (rituksimab-CHOP); c) hiperCV AD (hiperfrakcionisani ciklofosfamid, vinkristin, doksorubicin, deksametazon, metotreksat, citarabin); d) R-hiperCV AD (rituksimab-hiperCV AD); e) FCM (fludarabin, ciklofosfamid, mitoksantron); f) R-FCM (rituksimab, fludarabin, ciklofosfamid, mitoksantron); g) bortezomib i rituksimab; h) temzirolimus i rituksimab; i) temzirolimus i Velcade.RTM.; j) jod-131 tozitumomab (Bexxar.RTM.) i CHOP; k) CVP (ciklofosfamid, vinkristin, prednizon); l) R-CVP (rituksimab-CVP); m) ICE (ifosfamid, karboplatin, etopozid); n) R-ICE (rituksimab-ICE); o) FCR (fludarabin, ciklofosfamid, rituksimab); p) FR (fludarabin, rituksimab); i q) D.T. PACE (deksametazon, talidomid, cisplatin, adriamicin, ciklofosfamid, etopozid).
24. Komplet koji sadrži (i) jedinjenje formule A, njegov stereoizomer ili njegovu farmaceutski prihvatlјivu so ili solvat i (ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
25. Komplet prema patentnom zahtevu 24, gde je navedeno anti-CD20 antitelo ublituksimab ili se vezuje za isti epitop kao ublituksimab, ili je fragment koji vezuje antigen navedenog antitela.
26. Komplet prema patentnom zahtevu 24, gde je navedeno anti-CD20 antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od rituksimaba, ofatumumaba, okrelizumaba, veltuzumaba, GA101, AME-133v, PRO131921, tozitumomaba, hA20 i PRO70769, ili je fragment koji vezuje antigen navedenog antitela.
27. Komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 24-26, gde je jedinjenje formule A izabrano iz grupe koja se sastoji od (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il) etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona.
28. Komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 24, 25 ili 27, gde je navedeno anti-CD20 antitelo ublituksimab.
29. Komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 24-28, gde je navedeno jedinjenje formule A (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.
30. Komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 24, 25 ili 27-29, gde je navedeno jedinjenje ptoluensulfonatna so (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, a navedeno anti-CD20 antitelo je ublituksimab.
31. Komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 24-30, gde su navedeno anti-CD20 antitelo ili fragment i navedeno jedinjenje sadržani unutar iste kompozicije ili su u odvojenim kompozicijama.
32. Komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 24-31, koji dalje sadrži jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava.
33. Farmaceutski kompozicija koji sadrži (i) jedinjenje formule A izabrano iz grupe koja se sastoji od (RS)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona; i (R)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-ona, i (ii) anti-CD20 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
34. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 33, gde je navedeno anti-CD20 antitelo ublituksimab ili se vezuje za isti epitop kao ublituksimab ili je fragment koji vezuje antigen navedenog antitela.
35. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 33 ili 34, gde je navedeno jedinjenje formule A (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofenil)-4H-hromen-4-on.
36. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 33-35, gde je navedeno jedinjenje p-toluensulfonatna so (S)-2-(1-(4-amino-3-(3-fluoro-4-izopropoksifenil)-1H-pirazol[3,4-d]pirimidin-1-il)etil)-6-fluoro-3-(3-fluorofeniI)-4H-hromen-4-ona, a navedeno anti-CD20 antitelo je ublituksimab.