BRPI1006189A2 - uso de uma combinação terapêutica, formulação farmacêutica, artigo de manufatura, produto, método para determinar compostos a serem utilizados em combinação para o tratamento de uma malignidade hematopoiética e método para selecionar compostos a serem utilizados em combinação para o tratamento de câncer - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, ARTI-GO DE MANUFATURA, PRODUTO, MÉTODO PARA DETERMINAR COMPOSTOS A SEREM UTILIZADOS EM COMBINAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE UMA MALIGNI-DADE HEMATOPOIÉTICA E MÉTODO PARA SELECIONAR COMPOSTOS A SEREM UTILIZADOS EM COMBINAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER A presente invenção se refere a combinações de compostos inibidores de PI3K que possuem fórmula I e agentes quimioterápicos, incluindo estereoisômeros, isômeros geo-métricos, tautômeros, metabólitos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, que são úteis para o tratamento de malignidades hematopoiéticas. A presente invenção tam-bém se refere a métodos para uso de tais combinações para diagnóstico, prevenção ou tratamento in vitro, in situ, e in vivo de tais disfunções em células mamíferas, ou condi-ções patológicas associadas.

Description

"USO DE UMA COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, ARTIGO DE MANUFATURA, PRODUTO, MÉTODO PARA DETERMINAR COMPOSTOS A SEREM UTILIZADOS EM COMBINAÇÃO

PARA O TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE HEMATOPOIÉTICA E 5 MÉTODO PARA SELECIONAR COMPOSTOS A SEREM UTILIZADOS EM COMBINAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER"

REFERÊNCIA CRUZADA PARA OS PEDIDOS RELACIONADOS -Este pedido não provisório~depositado sob o 37 CFR~§1.53(b) reivindica o beneficio sob o título 35 da USC § 119(e) dos EUA ao Pedido de Patente Provisório n° 61/159.622 depositado em 12 de março de 2009, o qual é incorporado pela referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada de modo geral a combinações farmacêuticas de compostos com atividade contra malignidades hematopoiéticas e que incluem compostos que inibem a atividade de Pl3 quinase ou mTOR. A presente invenção também está relacionada aos métodos de uso dos compostos para o diagnóstico in vitro, in situ ou in vivo ou tratamento de mamíferos ou células de mamíferos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Os cânceres que envolvem células geradas durante a hematopoiese, um processo pelos quais são gerados os elementos celulares do sangue, tais como leucócitos, linfócitos, células assassinas naturais (natural kil/er), células plasmáticas, e células mieloides como neutrófilos e monócitos, são referidos como malignidades hematopoiéticas. Os linfócitos que podem ser encontrados no sangue e tecido linfático e são fundamentais para a resposta imune, são categorizados em duas principais classes de linfócitos. Linfócitos 8 (células 8) e linfócitos T (células T), que medeiam a imunidade humoral e celular, respectivamente. As células 8 são linfócitos que desempenham um grande papel na resposta imune humoral (em oposição à resposta imune mediada por célula, que é regida pelas células 8) As principais funções de células 8 são: produção de anticorpos contra antígenos desempenham o papel de Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e eventualmente se 5 desenvolvem em células 8 de memória após a ativação pela interação com o antígeno. As células 8 são um componente essencial do sistema imune adaptativo. As células 8 são maturadas dentro da medula óssea e deixam a medula óssea expressando- um anticorpo de ligação ao antígeno em suas superfícies. Quando uma célula 8 naive encontra pela primeira vez o antígeno para o qual seu anticorpo acoplado a membrana é específico, a célula começa a se dividir rapidamente e sua progênie se diferencia em células 8 de memória e células efetoras denominadas de "células plasmáticas". As células 8 de memória possuem uma vida útil maior e continuam a expressar o anticorpo acoplado a membrana com a mesma especificidade da célula progenitora original. As células plasmáticas não produzem o anticorpo acoplado a membrana, mas ao invés disso produz o anticorpo em uma forma que pode ser secretada. Os anticorpos secretados são as principais moléculas efetoras da atividade humoral.

Os !infamas não-Hodgkin são um grupo diverso de malignidades hematopoiéticas que abrangem qualquer linfoma que não seja o linfoma de Hodgkin. O linfoma é um tipo de câncer derivado de linfócitos, um tipo de -células brancas do sangue. Diversos subtipos de Iinfamas não-Hodgkin foram descritos; e estes são de modo geral agrupados de acordo com suas agressividades. Os !infamas não-Hodgkin menos agressivos podem ser doenças crônicas que permanecem por muitos anos, em quanto os !infamas não-Hodgkin mais agressivos podem ser rapidamente fatais sem tratamento. Os linfomas não-Hodkin são tratados por combinações de quimioterapia, anticorpos monoclonais, imunoterapia, radiação e transplante de células troncos hematopoiéticas. O linfoma é um tipo de neoplasia que se origina nos linfócitos (um tipo de células branca do sangue no sistema imune dos vertebrados) e nos linfonodos, se apresentando como um gânglio aumentado (um tumor). Os 5 linfomas estão intimamente relacionados com as leucemias linfóides, que também são originadas nos linfócitos, mas não formam tumores sólidos.

Existem muitos tipos de linfomas, e por sua vez, os linfomas são parte de um -- - - -- - grande grupo de malignidades hematopoiéticas denominadas de neoplasias hematológicas.

A leucemia mieloide aguda (LMA) compreende um grupo heterogêneo de distúrbios clonais malignos de células-tronco hematopoiéticas comprometidas com o desenvolvimento da linhagem mieloide. Existe um bloqueio na diferenciação hematopoiética normal, frequentemente combinada com a desregulação da proliferação e apoptose. Isto leva a uma insuficiência progressiva da hematopoiese normal resultando em uma anemia, neutropenia e trompocitopenia. ALMA representa cerca de 80% de todas as leucemias em adultos, e sua incidência global se estabilizou ou aumentou lentamente nos últimos 15-20 anos. O prognóstico da LMA continua sendo ruim, com uma taxa global de sobrevida em cinco anos de 15-30%, embora pacientes com LMA que desenvolvem síndrome mielodisplásica ou aqueles que têm idade aproximada de 60 anos tenham um prognóstico ainda pior com uma taxa de sobrevida em cinco anos menor do que 10% (Smith M. et a/ (2004) Crit. Rev.

Oncol. Hematol. 50:197-222). A abordagem terapêutica padrão para os pacientes com LMA é a quimioterapia de alta dose, consistindo principalmente de citarabina (Ara-C) e antibiótico antraciclina, tal como daunorubicina ou idarubucina. Normalmente, a LMA responde a quimioterapia inicial, mas a recidiva da doença ocorre na maioria dos pacientes. Apesar dos resultados de tratamentos da LMA tenha melhorado em pacientes jovens que toleram estratégias de tratamentos intensificadas, tem se observado alterações limitantes nos resultados entre os indivíduos que possuem cerca de 60 anos de idade. O limite da toxicidade aceitável para drogas quimioterápicas padrões utilizadas na LMA foi alcançado. Permanece, portanto, uma significante 5 necessidade não atendida de novas, racionalmente desenvolvidas e efetivas terapias para o tratamento da LMA (Fathi A.T. e Karp J.E. (2009) Curr. Oncol.

Rep. 11 :346-352; Stapnes et a/ (2009) Expert Opin. lnvestig. Drugs 18:433- 455). Combinações de terapêuticos farmacêuticos anti-câncer administrados simultaneamente ou sequencialmente em um regime de dosagem são atualmente comuns no tratamento do câncer. O sucesso de uma terapia combinada fornece um efeito melhorado e até mesmo sinérgico em comparação com a monoterapia, ou seja, o tratamento farmacêutico limitado a uma única droga (Ouchi et ai (2006) Cancer Chemother. Pharmacol. 57:693- 702; Higgins et a/ (2004) Anti-Cancer Drugs 15:503-512). A pesquisa pré-clinica foi a base para a predição da sinergia do estágio clínico nas combinações terapêuticas de fármacos anti-câncer como a capecitabina e taxanos para o tratamento do câncer de mama (Sawada et a/ (1998) Clin. Cancer Res. 4:1013- 1019). Algumas doses e esquemas de terapia combinada podem melhorar a segurança sem comprometer a eficácia (O'Shaughnessy et a/ (2006) Clin. Breast Cancer Apr 7(1 ):42-50). Os efeitos sinérgicos in vitro se correlacionou com a -sinergia do estágio clínico (Steinbach et a/ (2003) Clin. lnf. Ois. Out 1:37 Supi3:S188-224).

A fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) é uma importante sinalização linfonodal para os sinais essenciais de sobrevida e crescimento nos linfomas e está em oposição à atividade da fosfatase PTEN. A via da PI3K está desregulada nas formas agressivas de linfoma (Abubaker (2007) Leukemia 21 :2368-2370). Oito por cento de cânceres DLBCL (linfoma difuso de grandes

----------~--- -------- 5 células B) possuem mutações missense na PI3CA (subunidade alfa catalítica da fosfatidilinositol-3 quinase) e 37% são PTEN negativos pelo ensaio de imunohistoquímica. A fosfatidilinositol é uma dentre uma variedade de fosfolipídios 5 encontrados na membrana celular, e que participam na transdução de sinal intracelular. A sinalização celular via fosfoinositidas 3'-fosforiladas foi descrita por estar envolvida em uma variedade de processos celulares, por exemplo, transformação para a malig-nidade, sinalização de -fator de- crescimento, inflamação e imunidade (Rameh et a/ (1999) J. Biol Chem. 274:8347-8350). A 1o enzima responsável pela geração destes produtos da sinalização fosforilados, fosfatidilinositol 3-quinase (também referido como Pl 3-quinase ou PI3K), foi originalmente identificada como uma atividade associada com oncoproteínas virais e receptores tirosina quinase de fatores de crescimento que fosforilam o fosfatidilinositol (PI) e seus derivados fosforilados na hidroxila 3' do anel inositol 15 (Panayotou et a/ (1992) Trends Cell Biol 2:358-60). As fosfoinositida 3-quinase (PI3K) são lipídio-quinases que fosforilam lipídios no resíduo 3-hidroxila de um anel inositol (Whitman et ai (1988) Nature, 332:664). Os fosfolipídios 3- fosforilados (PIP3s) gerados pelas Pl3-quinases agem como segundos mensageiros recrutando quinases com domínios de ligação para lipídios 20 (incluindo as regiões de homologia da plequistrina (PH)), tal como Akt e PDK1, quinase - 1 dependente de fosfoinositida (Vivanco et a/ (2002) Nature Rev.

Cancer 2:489; Phillips et a/ (1998) Cancer 83:41).

A família da Pl3 quinase compreende pelo menos 15 enzimas diferentes sub-classificadas pela homologia estrutural e são divididas em 3 25 classes com base na homologia da sequência e produto formado pela catálise da enzima. As Pl3 quinases classe I são compostas de 2 subunidades: Uma subunidade catalítica de 110 kD e uma subunidade reguladora de 85 kD. As subunidades reguladoras possuem domínios SH 2 e se ligam aos resíduos de tirosina fosforilados pelos receptores de fatores de crescimento com uma atividade tirosina quinase ou produtos de oncogenes, induzindo dessa forma a atividade PI3K da subunidade catalítica que fosforila seu lipídio substrato. As Pl3 quinases classe I estão envolvidas em importantes eventos de transdução 5 de sinal a jusante de citocinas, integrinas, fatores de crescimento e imunoreceptores, sugerindo que o controle desta via pode levar a importantes efeitos terapêuticos, tal como a modulação da proliferação celular e a carcinogenese. As PI3Ks classe I podem fosforilar a fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol-4-fosfato, e fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) para produzir 1o fosfatidilinositol-3-fosfato (PIP), fosfatidilinositol-3,4-bifosfato e fosfatidilinositol- 3,4,5-trifosfato, respectivamente. As PI3Ks classe 11 fosforilam a Pl e fosfatidilinositol-4-fosfato. As PI3Ks classe 111 podem apenas fosforilar a Pl.

Uma isoforma chave da Pl3-quinase no câncer é a Pl3-quinase Classe I, p110a conforme indicado pelas mutações oncogênicas recorrentes no p11 Oa (Samuels et a/ (2004) Science 304:554). (US 5824492; US 5846824; US 6274327). Outras isoformas podem ser importantes no câncer e também estão envolvidas em doenças cardiovasculares e imuno-inflamatórias (Workman P (2004) Biochem Soe Trans 32:393-396; Patel et a/ (2004) Proc. Am. Assoe. of Cancer Res. (Resumo LB-247) 95th Annual Meeting, 27 a 31 de março, Orlando, Florida, EUA; Ahmadi K e Waterfield MD (2004) "Phosphoinositide 3- Kinase: Function and Mechanisms" Encyclopedia of Biological Chemistry (Lennarz W J, Lane M D eds) Elsevier/Academic Press), As mutações oncogênicas de p100 alfa foram encontradas com uma freqüência significativa em tumores de cólon, mama, cérebro, fígado, ovário, gástricos, de pulmão e tumores sólidos de cabeça e pescoço. As anormalidades de PTEN são encontradas em glioblastomas, melanoma, cânceres de próstata, endométrio, ovário, mama, pulmão, cabeça e pescoço, hepatocelulares e cânceres de tireoide.

A Pl3-quinase é um heterodímero de consiste das subunidades p85 e p110 (Otsu eta/(1991) Cell65:91-104; Hiles eta/(1992) Cell70:419-29).

Foram identificadas quatro PI3Ks classes I distintas, designadas P13K a (alfa), J3 (beta), õ (delta), y (gama), cada uma consistindo de uma subunidade 5 catalítica de 11 O kDa distinta e uma subunidade reguladora. Cada umas das três das subunidades catalíticas, ou seja, p11 O alfa, p11 O beta e p11 O delta, interage com a mesma subunidade reguladora, p85, enquanto a p110 gama interage -com uma súbunidade reguladora distinta, a p1 01. Os padrões de expressão de cada uma destas PI3Ks nas células e tecidos humanos são distintos. Em cada um dos subtipos de PI3K alfa, beta e delta, a subunidade p85 age localizando a Pl3 quinase na membrana plasmática pela interação de seu domínio SH2 com os resíduos de tirosina fosforilados (presentes em uma sequência contexto adequada) na proteína alvo (Rameh et a/ (1995) Cell, 83:821-30; Volinia et a/ (1992) Oncogene, 7:789-93). A via da Pl3 quinase/AkUPTEN é um alvo atrativo para o desenvolvimento de fármacos para o tratamento do câncer, já que se espera que tais agentes inibam a proliferação celular, reprimam os sinais a partir das células estremais que fornecem sobrevivência e quimioresistência para as células cancerosas, revertam a repressão da apoptose e trasponham a resistência intrínseca das células cancerosas aos agentes citotóxicos. Os inibidores da Pl3 quinase foram descritos (Yaguchi et a/ (2006) Jour. of the Nat.

_cancer lnst. 98(8):545-556; US 7.173.029; US 7.037.915; US 6.608.056; US

6.608.053; us 6.838.457; us 6.770.641; us 6.653.320; us 6.403.588; wo 2006/046031; wo 2006/046035; wo 2006/046040; wo 2007/042806; wo 2007/042810; wo 2004/017950; us 2004/092561; wo 2004/007491; wo 2004/006916; wo 2003/037886; 'us 2003/149074; wo 2003/035618; wo 2003/034997; US 2003/158212; EP 1417976; US 2004/053946; JP 2001247477; JP 08175990; JP 08176070). Os análogos de Wortmanina possuem atividade P13 quinase em mamíferos (US 6.703.414; WO 97/15658). Os compostos Tienopirimidina de Fórmula I possuem uma ligação p110 alfa, atividade inibitória de Pl3 quinase, e inibem o crescimento 5 de células de câncer (US 2008/0207611; US 2008/0039459; US 2008/0076768; us 2008/0076758; us 2008/0242665; us 2008/0269210).

(o)

N

I Um exemplo de composto de Fórmula I, GDC-0941 (CAS Reg. N° 957054-30-7, Genentech Inc.), é um inibidor de PI3K seletivo, biodisponível pela administração oral com promissoras propriedades farmacêuticas e farmacocinéticas (Folkes et ai (2008) Jour. of Med. Chem. 51(18):5522-5532; US 2008/0076768; Belvin et ai, American Association for Cancer Research Annual Meeting, 99°: 15 de Abril de 2008, Resumo 4004; Folkes et ai, American Association for Cancer Research Annual Meeting 14 de abril de 2008, Resumo LB-146; Friedman et ai, American Association for Cancer Research Annual Meeting 99° :14 de abril de 2008, Resumo LB-110). Os compostos de Fórmula I exemplares, GDC-0941, exibem atividade sinergística in vitro e in vivo em combinação com certos agentes quimioterápicos contra linhagens de células de tumores sólidos (US Ser. No. 12/208,227, Belvin et ai "Combinations Of Phosphoinositide 3-Kinase lnhibitor Compounds And Chemotherapeutic Agents, And Methods Of Use", depositado em 1O de setembro de 2008).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO A invenção está relacionada de modo geral aos compostos tienopirimidina de Fórmula I com atividade anti-câncer, e mais especificamente com atividade inibitória Pl3 quinase ou mTOR, administrada em combinação com 5 agentes de anticorpo monoclonal ou agentes quimioterápicos para inibir o crescimento de malignidades hematopoiéticas. Algumas combinações de compostos de Fórmula I com agentes quimioterápicos exibem efeitos sinérgicos na inibição do crescimento de células de câncer hematopoiéticas in vitro e in vivo.

As combinações e métodos da invenção podem ser úteis no tratamento das malignidades hematopoiéticas. As composições podem inibir o crescimento tumoral em mamíferos e podem ser úteis para o tratamento de câncer em pacientes humanos.

Em um aspecto, a invenção inclui um método para o tratamento de uma malignidade hematopoiética que compreende a administração de uma combinação terapêutica como uma formulação combinada ou com alternação a um mamífero, em que a combinação terapêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que possui Fórmula I, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, predisona, mefalan, lenalidomida, bortezomib, rapamicina e citarabina.

() N

I A invenção também está relacionada aos métodos de uso das combinações terapêuticas para o diagnóstico ou tratamento in vitro, in situ ou in vivo de células de mamíferos, organismos, ou condições patológicas associadas relacionadas com as malignidades hematopoiéticas.

Um aspecto da invenção fornece combinações terapêuticas compreendendo 4-(2-( 1H-indazol-4-il)-6-( (4-(metilsulfonil)piperazin-1- 5 il)metil)tieno[3,2-d]pirimidin-4-il)morfolina (US 2008/0076768; US 2008/0207611; Folkes et a/ (2008) Jour. of Med. Chem. 51 (18):5522-5532), também conhecido como GDC-0941 (Genentech, Inc.) e possuindo a Fórmula la e uma quantidade -tefapeuticamente eficaz de um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina. (o)

N \ __) /N~~NNH N ''<:::: O N .-9 ~ / /s~ H3C O la Um aspecto da invenção fornece combinações terapêuticas compreendendo (S)-1-(4-( (2-(2-aminopirimidin-5-il)-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2- d]pirimidin-6-il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona (US 2008/0242665) possuindo a Fórmula lb e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina.

H~Ho (o) ' N> N \_N~"N ~~~ N "N I N-ÁN~ lb Os compostos de Fórmula I incluem todos os estereoisômeros,

isômeros geométricos, tautômeros, metabólitos e sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Alguns compostos de fórmula I são potentes inibidores de PI3K com propriedades fisicoquímicas e farmacocinéticas similares aos de fármacos (drug-like). Alguns compostos de Fórmula I exibem seletividade para 5 PI3Ks de classe la sobre a classe lb, especialmente para o subtipo p11 O alfa. Os compostos de Fórmula la e lb são biodisponíveis pela administração oral e possuem um único agente com atividade antitumoral em diversos modelos de cânceres humanos.

As composições farmacêuticas e combinações terapêuticas da invenção compreendem um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina.

As composições farmacêuticas da invenção podem compreender adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.

Outro aspecto da invenção fornece métodos de tratamento de malignidades hematopoiéticas moduladas pelas Pl3 quinases, compreendendo a administração de quantidades eficazes de um composto de fórmula I e um agente quimioterápico a um mamífero que necessite de tal tratamento. O compostos de Fórmula I e o agente quimioterápico podem ser co-formulados para a administração em uma combinação na forma de uma composição farmacêutica ou eles podem ser administrados separadamente por alternação (de- maneira seqüencial ou consecutiva) na forma de uma combinação farmacêutica.

Outro aspecto da invenção fornece métodos de tratamento de malignidades hematopoiéticas compreendendo a administração de tal quantidade eficaz do composto de Fórmula I e um agente quimioterápico a um mamífero que necessite de tal tratamento.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método de uso de uma composição farmacêutica da invenção para tratar uma malignidade hematopoiética seja doença ou condição modulada pela Pl3 quinase em um mamífero.

Um aspecto adicional da presente invenção é o uso de uma 5 composição farmacêutica da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de uma malignidade hematopoiética, doença ou condição modulada pela Pl3 quinase em um mamífero.

Outro aspecto da presente invenção inclui artigos de manufatura ou kits compreendendo o composto com Fórmula I, um agente quimioterápico, um recipiente e opcionalmente uma bula ou rótulo indicando um tratamento para uma malignidade hematopoiética. Outro aspecto da invenção é um produto que compreende um composto de Fórmula I, e um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina; como uma preparação combinada para o uso separado, simultâneo ou sequencial no tratamento de uma malignidade hematopoiética. Outro aspecto da invenção inclui um método para determinar compostos a serem utilizados em combinação para o tratamento de câncer que compreende: (a) administrar uma combinação terapêutica que compreende um composto de Fórmula I, e um agente quimioterápico em uma linha de células hematopoiéticas malignas in vitro com uma ou mais mutações, e (b) medir um efeito sinérgico ou não sinérgico.

Outro aspecto da invenção são métodos para tratar terapeuticamente um mamífero com uma malignidade hematopoiética, onde o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma combinação terapêutica ao mamífero, resultando no tratamento terapêutico eficaz da malignidade hematopoiética, tal como linfoma não-

Hodgkin, linfoma difuso de grandes células hematopoiéticas, linfoma folicular, linfoma de células do manto, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, LMA, e LMC. Em um exemplo de realização, a combinação terapêutica inibe uma ou mais isoformas de P13K. Em um exemplo de realização, a combinação 5 terapêutica inibe mTOR. Em um aspecto, a invenção fornece um método para inibir o crescimento de um linfoma não-Hodgkin compreendendo a administração de -uma combinação terapêutica. para um paCiente com linfõma- não-Hodgkin, -âe modo que o crescimento do linfoma é inibido. Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibição do crescimento de um linfoma não-Hodgkin compreendendo a administração de uma combinação terapêutica a uma célula de linfoma, ou uma célula presente ou adjacente ao linfoma, de modo que o crescimento do linfoma é inibido. Em um exemplo de realização, a dita célula não é uma célula de linfoma não- Hodgkin (por exemplo, não é uma célula T ou B), por exemplo, a dita célula pode ser uma célula do estroma.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 exibe a redução de marcadores farmacodinâmicos (PD) medidos por citometria de fluxo de células DoHH2, WSU-DLCL2, OPM2 e U266, tratadas (coluna da direita) e não tratadas (coluna da esquerda) com a Fórmula la (GDC-0941). As células foram tratadas in vitro com 5 IJM de GDC- 0941 por 4 hrs.

A Figura 2 exibe a redução de marcadores farmacodinâmicos (PD) p-AKT, p-S6RP, p-Bad, e beta-actina em células DoHH2, WSU-DLCL2, OPM2 e U266 medido por eletroforese em gel SDS-poliacrilamida e western blotting em linhagens de células tratadas in vitro com 5 IJM de GDC-0941 por 4 hrs.

A Figura 3 exibe o efeito do inibidor de P13K na forma de agente único, Fórmula la (GDC-0941), e em combinação com dexametasona (Dex) e doxorrubicina (Dox), sobre linhagens de células B-NHL: DoHH2. Os ensaios de sobrevida celular in vitro e ensaios de proliferação (Cell-Titer Glo, Promega) mediu células viáveis sobre as variáveis concentrações de inibidores 1o-5 a 1O s Unidades Relativas do IC 50 anteriormente determinado (aproximadamente), a Fórmula la, dexametasona, doxorrubicina e combinações de Fórmula la e dexametasona; e Fórmula la e doxorrubicina. A Fig-ura-4--exibe o efeito de inibidores dePI3K na como agente único em células de linfoma folicular primário de células de paciente NHL600- 1o A876 pelo teste de sobrevivência in vitro das células e ensaios de proliferação (Ceii-Titer Glo®, Promega Corp, Madison, Wl), medindo as células viáveis sobre as variadas concentrações (10-5 a 10 IJMolar) de Fórmula la (GDC-0941), GDC-0464, e LY294002.

A Figura 5 exibe o efeito de um inibidor da PI3K como agente único, Fórmula la (GDC-0941), e em combinação com a doxorrubicina, em células de linfoma primário difuso de grandes células B (LDGCB) de paciente NHL640-A055. A viabilidade celular foi medida por testes de sobrevivência celular in vitro e ensaios de proliferação celular (Cell-Titer Glo®) sobre concentrações variantes (1 o-5 a 20 IJMolar) de Fórmula la, doxorrubicina, e a combinação Fórmula la e doxorrubicina. A Figura 6 exibe o efeito do inibidor de PI3K como agente único de Fórmula la (GDC-0941 ), e em combinação com a dexametasona, sobre células de mieloma múltiplo OPM2 no teste de sobrevivência celular in vitro e ensaios de proliferação (Ceii-Titer Glo®) medindo as células viáveis sobre as variadas concentrações (1 o-5 a 1O !JMolar) de Fórmula la, dexametasona, e a combinação Fórmula la e dexametasona.

A Figura 7 exibe a variação do volume tumoral médio sobre 20 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma

----------------- 15 WSU-DLCL2 administrados no dia O com veículo (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween-80 em água DI), 73 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941 ), 5 mg/kg de rituximab, CHOP, e as combinações de 73 mg/kg de Fórmula la e 5 mg/kg de rituximab, e 73 mg/kg de Fórmula la e CHOP. Os camundongos foram tratados 5 uma vez com CHOP, começando no dia O, e rituximab nos dias O, 7 e 14, enquanto a Fórmula la foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. Regime CHOP: ciclofosfamida (30 mg/kg, iv, qd x1 ), doxorrubicina (2,475 mg/kg, iv, qd x1 ), vincristina (0,375 mg/kg, iv, qd x1 ), prednisona (0, 15 mg/kg, po, qd x5). Ciclofosfamida, doxorrubicina e vincristina foram administradas uma vez no dia O e a prednisona foi administrada nos dias O, 1, 2, 3 e 4.

A Figura 8 exibe a variação do volume tumoral médio durante 35 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma DoHH-2 administrados no dia O com: Veículo (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween-80 em água DI), 73 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941 ), 5 mg/kg de rituximab, CHOP, e as combinações de 73 mg/kg de Fórmula la e 5 mg/kg de rituximab, e 73 mg/kg de Fórmula la e CHOP. Os camundongos foram tratados com rituximab no dia O, 7 e 14 (semanalmente 3x) por via intravenosa, CHOP começando no dia 1, enquanto a Fórmula la foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. Regime CHOP: ciclofosfamida (30 mg/kg, iv, qd x1), doxorrubicina (2,475 mg/kg, iv, qd x1 ), vincristina (0,375 mg/kg, iv, qd x1 ), prednisona (0, 15 mg/kg, po, qd x5). Ciclofosfamida, doxorrubicina e vincristina foram administradas uma vez no dia O e a prednisona foi administrada nos dias O, 1, 2, 3 e 4. A Figura 9 exibe a variação do volume tumoral médio durante 27 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma DoHH2 tratados no dia O com: Os veículos (0,5% Metilcelulose: 0,2% Tween- 80 em água DI), 75 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941), CHOP, e as combinações de 75 mg/kg de Fórmula la e CHOP, 75 mg/kg de Fórmula la e

30 mg/kg de ciclofosfamida, 75 mg/kg de Fórmula la e 2,47 mg/kg de doxorrubicina, 75 mg/kg de Fórmula la e 0,38 mg/kg de vincristina, e 75 mg/kg de Fórmula la e O, 15 mg/kg de prednisona. Os camundongos foram tratados com CHOP no dia O, ciclofosfamida no dia O, doxorrubicina no dia O, vincristina 5 no dia O, e prednisona diariamente nos dias 0-4, enquanto a Fórmula la foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. Os componentes do regime CHOP foram: ciclofosfamida (30 mg/kg, iv, qd x1), doxorrubicina (2,475 ~ ----~---- mg/kg, iv, qd x1 ), vincristina (0,375 mg/kg, iv, qd x1 ), prednisona (0, 15 mg/kg, po, qd x5).

A Figura 1O exibe a variação do volume tumoral médio durante 25 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma BJAB tratados no dia O com: Veículos (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), 73 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941), CHOP, e a combinação de Fórmula la 73 mg/kg e CHOP. Os camundongos foram tratados uma vez com CHOP, começando no dia O, enquanto a Fórmula la e os veículos foram administrados diariamente por 21 dias por gavagem oral. Regime CHOP: ciclofosfamida (30 mg/kg, iv, qd x1), doxorrubicina (2,475 mg/kg, iv, qd x1), vincristina (0,375 mg/kg, iv, qd x1 ), prednisona (0, 15 mg/kg, po, qd x5).

Ciclofosfamida, doxorrubicina e vincristina foram administradas uma vez no dia O e a prednisona foi administrada nos dias O, 1, 2, 3 e 4. A Figura 11 exibe a variação do volume tumoral médio durante 25 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma BJAB tratados no dia O com: Veículos (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), 75 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941 ), 5 mg/kg de rituximab, e a combinação de 75 mg/kg de Fórmula la e 5 mg/kg de rituximab. Os camundongos foram tratados com rituximab nos dias O, 7 e 14, enquanto a Fórmula la e o veículo foram administrados diariamente por 21 dias (po, qd x21) por gavagem oral.

A Figura 12 exibe a variação do volume tumoral médio durante 22 dias. em coortes de 1O camundongos com xenoenxerto de mieloma múltiplo BJAB tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), e as terapias com agente único: 73 mg/kg de 5 Fórmula la (GDC-0941), 1 mg/kg de bortezomib, 25 mg/kg de lenalidomida, e 1O mg/kg de dexametasona. A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. O bortezomib foi administrado por ~ -···- - ··- via intravenosa, nos dias O, 3, 7, 10, 14 e 17. A lenalidomida foi administrada diariamente por 21 dias por meio de injeção intraperitoneal. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias O, 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9 e 10.

A Figura 13 exibe a variação do volume tumoral médio durante 24 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de células de mieloma múltiplo OPM-2 tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), terapias com agente único: 73 mg/kg de Fórmula la GDC- 0941 (po, qd x21), 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x3), 25 mg/kg de lenalidomida (ip, 5 dias de administração/2 dias sem administração/5 dias com administração/2 dias sem administração/5 dias com administração), e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5 dias de administração/2 dias sem administração/5 dias de administração); e as combinações de: 73 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21) e 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/sem. x3); 73 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21) e -25 mg/kg lenalidomida (ip, 5/2/5/2/5) e 73 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21) e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5). A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. O bortezomib foi administrado por via intravenosa, nos dias O, 3, 7, 10, 14 e 17. A lenalidomida foi administrada nos dias 0-4, 7-11 e 14-18 por injeção intraperitoneal. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7-11. A Figura 14 exibe a variação do volume tumoral médio durante 27

------ 18 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de células de mie lo ma múltiplo MM1.s tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), 73 mg/kg de Fórmula la GDC- 0941 (po, qd x21 ), 1 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x2.5), 25 mg/kg de 5 lenalidomida (ip, qd x21) e 10 mg/kg de dexametasona (po, 5 dias de administração/ 2 dias sem administração/5 dias de administração). A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. O -- ·~-·-------- bortezomib foi administrado por via intravenosa, -noS-dias 0~-3, 7, 10 e 14. A lenalidomida foi administrada diariamente por 21 dias por meio de injeção 10 intraperitoneal. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7-

11.

A Figura 15 exibe a variação do volume tumoral médio durante 40 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de células de mieloma múltiplo MM1.s tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de 15 metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), terapias com agente único: 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ), 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x3), e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5); e as combinações: 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ) e 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x3), e 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ) e 3 mg/kg 20 de dexametasona (po, 5/2/5 ). A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. O bortezomib foi administrado por via intravenosa, nos dias O, 3, 7, 10, 14 e 17. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7-11.

A Figura 16 exibe a variação do volume tumoral médio durante 33 25 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de células de mieloma múltiplo H929 tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI) terapias com agente único: 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ), 0,5 mg/kg de bortezomib (iv,

2x/sem. x3), 25 mg/kg de lenalidomida (ip, 5/2/5/2/5), e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5); e as combinações: 75 mg/kg de Fórmula la GDC - 0941 (po, qd x21 ) e 0,5 mg/kg bortezomib (iv, 2x/sem. x3), 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ) e 25 mg/kg de lenalidomida (ip, 5/2/5/2/5) e 5 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x14) e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5). A fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem, exceto quando combinado com dexametasona em que foi - - - administrada por 14 dias. O bortezomib foi administrado por via intravenosa, nos dias O, 3, 7, 10, 14 e 17. A lenalidomida foi administrada nos dias 0-4, 7-11 1o e 14-18 por injeção intraperitoneal. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7-11.

A Figura 17 exibe a variação do volume tumoral médio durante 33 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma DoHH2 tratados no dia O com: Veículo (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), 6 mg/kg de rapamicina (ip, semanalmente x 3), 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21), 100 mg/kg de Fórmula IA GDC- 0941 (po, qd x21 ), 2,5 mg/kg de Fórmula lb (po, qd x21), 4 mg/kg de Fórmula lb (po, qd x21 ) e as combinações: 6 mg/kg de rapamicina (ip, semanalmente x 3) e 75 mg/kg de Fórmula la GDC - 0941 (po, qd x21 ) e 6 mg/kg de rapamicina (ip, semanalmente x 3) e 2,5 mg/kg de Fórmula lb (po, qd x21). A Fórmula 1a GDC-0941 e Fórmula 1b foram cada uma administradas diariamente por 21 diaS por gavagem oral. A rapamicina foi administrada por via intravenosa, nos dias O, 7 e 14.

A Figura 18 exibe a variação do volume tumoral médio durante 21 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma WSU-DLCL2 tratados no dia O com veículo (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), 6 mg/kg de rapamicina (ip, sem. x 3), 60 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21), 1 mg/kg de Fórmula lb (po, qd x21) e as combinações: 6 mg/kg de rapamicina (ip, seman. x 3) e 60 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x18 ) e 6 mg/kg de rapamicina (ip, seman. x 3) e 1 mg/kg de Fórmula lb (po, qd x18).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 5 DEFINIÇÕES As palavras "compreendem", "compreendendo", "incluem", "incluindo" e "contém" quando usadas no presente relatório descritivo e nas - - - reivindicações destinam-se a especificar a presença de características, números inteiros, componentes ou etapas indicadas, mas não excluem a presença ou a adição de uma ou mais características, números inteiros, componentes e etapas diferentes daquelas que foram indicadas, ou os agrupamentos destas.

Os termos "tratar" e "tratamento" referem-se tanto ao tratamento terapêutico e profiláctico quanto as medidas preventivas, onde o objetivo é prevenir ou desacelerar (reduzir) uma alteração fisiológica indesejada ou distúrbio, tais como o crescimento, desenvolvimento ou a propagação do câncer. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já apresentam o distúrbio, bem como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles em que o distúrbio deve ser evitado. Para os propósitos da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estabilização (ou seja, a não piora) do estado de doença, atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (seja ela parcial ou total), seja esta detectável ou indetectável. "Tratamento" também pode prolongar a sobrevida média, quando comparada com expectativa de sobrevida, se o tratamento não é administrado. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já apresentam a doença ou distúrbio, bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles em que a doença ou distúrbio deve ser evitado.

Um paciente ou mamífero é "tratado" com sucesso para uma malignidade hematopoiética, tal como linfoma não-Hodgkin, se após receber uma quantidade terapêutica da combinação terapêutica de acordo com os 5 métodos da invenção, o paciente apresenta um ou mais de: (i) redução observável e/ou considerável no número de células de câncer ou ausência de células cancerosas, (ii) ~ed_ução do tamanho do tumor; inibição (ou seja, diminuição até certo ponto e, preferencialmente a parada) de infiltração de células de câncer para órgãos periféricos incluindo a disseminação do câncer em tecidos moles e osso, (iii) inibição (ou seja, diminuição até certo ponto e, preferencialmente a parada) da metástase tumoral, (iv) inibição, em certa medida, do crescimento tumoral, ou (v) alívio em alguma extensão de um ou mais sintomas associados com o câncer específico, incluindo a redução da morbidade e mortalidade e melhora na qualidade de vida. A medida que a combinação terapêutica pode impedir o crescimento e/ou matar as células cancerígenas já existentes, ela pode ser considerada citostática e/ou citotóxica.

A redução destes sinais ou sintomas também pode ser sentida pelo paciente.

Os parâmetros acima para avaliar o sucesso do tratamento e melhoria da doença são facilmente medidos por procedimentos de rotina familiares para um médico. Na terapia para o câncer, a eficácia pode ser medida, por exemplo, avaliando o tempo de progressão da doença (TTP) e/ou determinando a taxa de resposta (RR). A metástase pode ser determinada por testes de estadiamento e por cintilografia óssea e testes para determinar o nível de cálcio e outras enzimas para determinar se houve a disseminação para os ossos. A tomografia computadorizada também pode ser realizada para procurar a disseminação para a pélvis e linfonodos na área. Radiografia de tórax e medida dos níveis de enzimas hepáticas por métodos conhecidos são usados para procurar metástases nos pulmões e fígado, respectivamente.

A expressão "malignidade hematopoiética" refere-se a um câncer ou distúrbio hiperproliferativo gerados durante a hematopoiese envolvendo células, como leucócitos, linfócitos, células assassinas naturais (natural killer), células plasmáticas e células mieloides, como neutrófilos e monócitos. As 5 neoplasias malignas hematopoiéticas incluem as doenças listadas na Tabela 1, a classificação da OMS de Neoplasias Malignas Hematopoiéticas Humanas; -Tumores do tecido hematopoiético e Unfoi9e_ (Jaffe ES, Harris NL, Stein H., Vardiman JW (Eds.) (2001 ): World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Hematopoietic and Lymphoid Tissues IARC Press: Lyon) com o código de morfologia da Classificação Internacional de Doenças (CID-O). Comportamento é codificado 13 para tumores malignos e 11 para lesões de potencial maligno baixo ou incerto.

TABELA 1

DOENÇAS MIELOPROLIFERATIVAS CRONICAS Leucemia mieloide crônica - ICD-0 987513 Leucemia neutrofílica crônica - ICD-0 996313 Leucemia eosinofílica crônica I síndrome hipereosinofílica '" ICD-0 996413 Policitemia vera - ICD-0 995013 Mielofibrose idiopática crônica- ICD-0 996113 Trombocitemia essencial - ICD-0 996213 Doença mieloproliferativa crônica, não classificável - ICD-0 997513 11 DOENÇAS MIELODISPLÁSICAS I MIELOPROLIFERATIVAS Leucemia mielomonocítica crônica - ICD-0 998013 Leucemia mieloide crônica atípica - ICD-0 987613 Leucemia mielomonocítica juvenil - ICD-0 994613 Doenças mielodisplásicas I mieloproliferativas, não classificáveis - ICD-0 997513 111 SÍNDROMES MIELODISPLÁSICAS Anemia refratária- ICD-0 998013 Anemia refratária com sideroblastos em anel - ICD-0 998213 Citopenia refratária com displasia multilinear- ICD-0 998513 Anemia refratária com excesso de blastos - ICD-0 998313 Síndrome mielodisplásica associada com anormalidade do cromossomo isolado del(5q)- ICD-0 998613 Síndrome mielodisplásica, não classificável 998913

IV LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDA

Leucemias mieloides agudas com anomalias citogenéticas recorrentes LMA com t(8;21)(q22;q22), LMA1/ETO- ICD-0 9896/3 LMA com inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22), CBFb/MYH11 - ICD-0 9871/3 Leucemia promielocítica aguda (LMA com t(15;17) (q22;q12), PML-RARa e variantes) - ICD-0 9866/3 LMA com anomalias em 11q23 (MLL) -ICD-0 9897/3 Leucemia mieloide aguda com displasia em múltiplas linhagens - ICD-0 9895/3 Leucemia mieloide aguda e síndrome mielodisplásica, relacionados a terapêutica - _ICD-0 9920/3 - Leucemia mieloide aguda não categorizada de outra forma Leucemia mieloide aguda, minimamente diferenciada - ICD-0 9872/3 Leucemia mieloide aguda, sem maturação - ICD-0 9873/3 Leucemia mieloide aguda, com a maturação- ICD-0 9874/3 Leucemia mielomonocítica aguda- ICD-0 9867/3 Leucemia monocítica e monoblástica aguda- ICD-0 9891/3 Leucemia eritróide aguda - ICD-0 9840/3 Leucemia megacarioblástica aguda- ICD-0 9910/3 Leucemia basofílica aguda - ICD-0 9870/3 Panmielose aguda com mielofibrose - ICD-0 9931/3 Sarcoma mieloide - ICD-0 9930/3 Leucemia aguda de linhagem ambígua - ICD-0 9805/3

V NEOPLASIAS DE CÉLULAS B Neoplasia de precursores hematopoiéticos Leucemia linfoblástica de precursor B I- ICD-0 9835/3 Linfoma - ICD-0 9728/3 Neoplasia hematopoiéticas maduras Leucemia linfocítica crônica/- ICD-0 9823/3 Leucemia prolinfocítica hematopoiética - ICD-0 9833/3 Linfoma linfoplasmocitário- ICD-0 9671/3 Linfoma de zona marginal esplênica - ICD-0 9689/3 Leucemia tipo células pilosas - ICD-0 9940/3 Mie/ama plasmocítico/plasmocitoma- ICD-0 9732/3 Plasmocitoma solitário ósseo - ICD-0 9731/3 Plasmocitoma extraósseo - ICD-0 9734/3 Linfoma da zona marginal extralinfonodal hematopoiética do tecido linfoide associado à mucosa (linfoma MALT) - ICD-0 9699/3 Linfoma da zona marginal linfonadal hematopoiética - ICD-0 9699/3 Linfoma folicular - ICD-0 9690/3 Linfoma de células do manto - ICD-0 9673/3 Linfoma difuso de grandes células hematopoiéticas - ICD-0 9680/3 Linfoma de grandes células B mediastinal (tímico)- ICD-0 9679/3 Linfoma hematopoiético de grandes células intravascular- ICD-0 9680/3

Linfoma de efusão primaria - ICD-0 9678/3 Linfoma de Burkitt I - ICD-0 9687/3 Leucemia- ICD-0 9826/3 Proliferações hematopoiéticas de potencial maligno incerto Granulomatose linfomatóide - ICD-0 9766/1 Doença linfoproliferativas pós-transplante, pleomórfica - ICD-0 9970/1 linfoma linfocítico pequeno - ICD-0 9670/3

VI NEOPLASIAS DE CÉLULAS TE CÉLULAS NK Neoplasias de precursores de células T Leucemia linfoblástica de precursor de células TI- ICD-0 9837/3 Linfoma - ICD-0 9729/3 Linfoma-blástico de células NK- ICD=0-9727/3 Neoplasias de células Te células NK maduras Leucemia prolinfocítica de células T - ICD-0 9834/3 Leucemia linfocítica de grandes células T granulares- ICD-0 9831/3 Leucemia de células NK agressiva - ICD-0 9948/3 Leucemia I linfoma de células T adultas- ICD-0 9827/3 Linfoma extralinfonodal de células NKIT, tipo nasal- ICD-0 9719/3 Linfoma de células T, tipo enteropático- ICD-0 9717/3 Linfoma Hepatoesplênico de células T- ICD-0 9716/3 Linfoma subcutâneo de células T paniculite-símile - ICD-0 9708/3 Micose fungóide - ICD-0 9700/3 Síndrome de Sézary- ICD-0 9701/3 Linfoma cutâneo anaplásico de células grandes - ICD-0 9718/3 Linfoma de células T periférico, não especificado -ICD-0 9702/3 Linfoma de células T angioimunoblástico - ICD-0 9705/3 Linfoma anaplásico de células grandes- ICD-0 9714/3 Proliferação de células T de potencial maligno incerto Papulose linfomatóide - ICD-0 9718/1 VIl LINFOMA DE HODGKIN Linfoma de Hodgkin nodular linfócito predominante - ICD-0 9659/3 Linfoma de Hodgkin clássico - ICD-0 9650/3 LinfÇ>ma de Hodgkin clássico do subtipo Esclerose Nodular- ICD-0 9663/3 Linfoma de Hodgkin clássico do subtipo rico em linfócitos- ICD-0 9651/3 Linfoma de Hodgkin clássico do subtipo celularidade mista - ICD-0 9652/3 Linfoma de Hodgkin clássico do subtipo linfócitos depletados - ICD-0 9653/3

VIII NEOPLASIAS HISTIOCÍTICAS E DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Neoplasia histiocitária I de Macrófagos Sarcoma histiocítico - ICD-0 9755/3 Neoplasias de células dendríticas Histiocitose das células de Langerhans- ICD-0 9751/1 Sarcoma de células de Langerhans - ICD-0 9756/3 Sarcoma /tumor de células dendríticas lnterdigitantes- ICD-0 9757/3 /1

Sarcoma /tumor de células dendríticas foliculares - ICD-0 9758/3 /1 Sarcoma de células dendríticas, não especificadas- ICD-0 9757/3 IX. MASTOCITOSE Mastocitose cutânea Mastocitose sistêmica indolente- ICD-0 9741/1 Mastocitose sistêmica associada com doença hematológica clonal de linhagem não-mastocítica- ICD-0 9741/3 Mastocitose sistêmica agressiva- ICD-0 9741/3 Leucemia mastocítica- ICD-0 9742/3 Sarcoma mastocítico- ICD-0 9740/3 Mastocitoma extracutâneo- ICD-0 9740/1 Uma "célula 8" é um linfócito maturado dentro da medula óssea, e inclui uma célula 8 narve, célula 8 de memória ou célula 8 efetora (células plasmáticas). A célula 8 na presente invenção é uma célula 8 normal ou não maligna.

5 O termo "anticorpo" na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente os anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formado por pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos desde que estes exibam a atividade biológica desejada.

A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade do composto da presente invenção que é capaz de (i) tratar a determinada doença, condição ou distúrbio, (ii) atenuar, melhorar ou eliminar um ou mais sintomas da doença, condição, distúrbio em particular, ou (iii) prevenir ou retardar o aparecimento de um ou mais sintomas da doença, condição ou distúrbio em particular descritos no presente. No caso do câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento pode reduzir o número de células do câncer, reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, de preferência, parar) a infiltração de células do câncer em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, de preferência, parar) a metástase do tumor, inibir, em alguma extensão, o crescimento tumoral e/ou aliviar em alguma extensão, um ou mais sintomas associados com o câncer. À medida que a droga pode impedir o crescimento e/ou matar as células cancerígenas já existentes, ela pode ser considerada citostática e/ou citotóxica, conforme medido pelo TTP e/ou taxa de resposta (RR).

5 Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se, ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que normalmente é caracterizada pelo crescimento de células de maneira não regulada. Um "tumor" compreende uma ou mais células cancerígenas. Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemias ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células epiteliais escamosas), câncer de pulmão incluindo o câncer de pulmão de pequenas células e o câncer de pulmão de não pequenas células ("NSCLC"), adenocarcinoma de pulmão e carcinoma escamoso de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago incluindo o câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer de colo do útero, câncer de ovário, câncer hepático, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de reto, câncer colorretal, câncer de endométrio ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, rins ou câncer renal, câncer de próstata, cânceres vulvares, câncer da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pênis, bem como câncer de cabeça e pescoço.

A administração "crônica" refere-se à administração do(s) agente(s) em um modo contínuo, ao contrário de um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo prolongado. A administração "intermitente" é o tratamento que não é feito consecutivamente sem interrupção, mas é de natureza cíclica.

Os "mamíferos" para fins de tratamento I alivio dos sintomas de um câncer se refere a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e agrícolas, de zoológico, desportivos ou animais de companhia, como cães, gatos; bovinos, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, e etc., e o mamífero é preferencialmente 5 humano.

A administração "em combinação com" um ou mais agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) inclui a administração simultânea (concomitante) e consecutiva (alternância) em qualquer ordem.

Um "agente quimioterápico" é um composto biológico (molécula grande) ou químico (molécula pequena) útil no tratamento do câncer, independentemente do mecanismo de ação. As classes de agentes quimioterápicos incluem, mas não estão limitadas a: agentes alquilantes, antimetabólitos, alcaloides de espinhos de plantas venenosas, antibióticos citotóxicos/antitumorais, inibidores da topoisomerase, proteínas, anticorpos, fotossensibilizadores e inibidores da quinase. Os agentes quimioterápicos incluem os compostos utilizados na "terapia direcionada" e quimioterapia não direcionada convencional.

Exemplos de agentes quimioterápicos incluem: dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina e citarabina.

Exemplos de agentes quimioterápicos também incluem: erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi- Aventis), 5-FU (fluorouracil, 5-fluorouracil, CAS N°: 51-21-8), gemcitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS N°.: 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cis- diamina,dicloroplatia(ll), CAS N°.: 15663-27-1 ), carboplatina (CAS N°.: 41575- 94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristoi-Myers Squibb Oncology), temozolomida (4- metil-5-oxo- 2,3,4,6,8-pentazabiciclo (4,3,0)nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida, CAS N°.: 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®' Schering Plough), tamoxifeno

1---

28

((Z)-2-[4-(1 ~2-difenilbut-1-enil)fenoxi]-N~N-dimetil-etanaminal NOLVADEX®I ISTUBAL®I VALODEX®)I doxorrubicina (ADRIAMYCIN®)~ Akti-1/21 HPPDI rapamicina e lapatinib (TYKERB®I Glaxo SmithKiine). Mais exemplos de agentes quimioterápicos incluem: Oxaliplatina

5 (ELOXATIN®I Sanofi) 1 bortezomib (VELCADE®I Millennium Pharm.) 1 sutent

(SUNITINIB®I SU11248 1 Pfizer)~ letrozolo (FEMARA®I Novartis)l imatinib mesijatq_ (G~EEVEC®I Noyar!!S) 1 XL-518 (inibidor da MEKI Exelixisl documento

WO 2007/044515) 1 ARRY-886 (inibidor da MEKI AZD6244 1 Array BioPharmal

Astra Zeneca)~ SF-1126 (inibidor da PI3K 1 Semafore Pharmaceuticals) 1 BEZ-

10 235 (inibidor da PI3K 1 Novartis)~ XL-147 (inibidor da PI3K 1 Exelixis)~ ABT-869

(inibidor multi- alvo de receptor tirosina quinases da família VEGF e PDGFI

Abbott Laboratories e Genentech) 1 ABT-263 (inibidor de Bci-2/Bcl-xll Abbott

Laboratories e Genentech)~ PTK787/ZK 222584 (Novartis)~ fulvestrant

(FASLODEX®I AstraZeneca)l leucovorin (ácido folínico) 1 lonafarnib

15 (SARASAR™~ SCH 66336 1 Schering Plough)l sorafenib (NEXAVAR®I BAY43-

90061 Bayer Labs)~ gefitinib (IRESSA®I AstraZeneca)~ irinotecano

(CAMPTOSAR®I CPT-11 I Pfizer)l tipifarnib (ZARNESTRA ™I Johnson & Johnson)l capecitabina (XELODA®I Roche)l ABRAXANE™ (livres de

Cremofor)~ formulação do paclitaxel desenvolvidas com nanopartículas de

20 albumina (American Pharmaceutical Partnersl Schaumbergl 11) 1 vandetanib (riNNI ZD6474 1 ZACTIMA®I AstraZeneca)l cloranmbucilal AG1478 1 AG1571

(SU 5271; Sugen)l temsirolimus (TORISEL®I Wyeth)l pazopanib

(GiaxoSmithKiine)~ canfosfamida (TELCYTA®I Telik)~ tioTepa e ciclosfosfamida

(CYTOXAN®I NEOSAR®); sulfonato de alquila como busulfanl improsulfan e

25 piposulfan; aziridinas como benzodopal carboquonal meturedopal e uredopa;

etileniminas e metilamelaminas incluindo altretaminal trietilenemelaminal trietilenefosforamidal trietilenetiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas

(especialmente a bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1 065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas

(especialmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina

(incluindo seus análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina;

5 pancratistatina; a sarcodictiina; espongistatina; mostardas do nitrogênio como clorambucila, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida,

mecloretamina, cloridrato de óxido de _mecloretamina, melfalam, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostardas da uracila; nitrosoureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos eledina (por exemplo,

caliceamicina, caliceamicina gama11, caliceamicina omegal1; dinemicina,

dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; uma esperamicina; bem como neocarzinostatina cromóforo e antibióticos cromóforos de enedina relacionados a cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,

bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,

cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-

norleucina, morfolina-doxorrubicina, cianomorfolina-doxorrubicina, 2-pirrolino-

doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirubicina, esorubicina,c idarubicina,

marcellomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico,

nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina,

quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina,

ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos como o metotrexato e 5-

fluorouracil (5-FU); análogos do ácido fólico como a denopterina, metotrexato,

pteropterina, trimetrexato; análogos da purina como fludarabina, 6-

mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina como ancitabina,

azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina,

enocitabina, floxuridina; andrógenos como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais como

•. 30 aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; 5 etoglucida; nitrato de gália; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinóides como a maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; -- 2-etilhicfrazida; --procarbazina; PSK® complexo -p-olissacarídeo (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirana; espirogermanio; ácido 10 tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente a toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tioTEPA; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina como a cisplatina e carboplatina; vinblastina; 15 etoposida (VP-16); fosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; CPT-11; topoisomerase inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides como ácido retinóico; e os sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos 20 acima mencionados.

Também incluídos nesta definição de "agentes quimioterápicos" estão: (i) agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores, tais como anti-estrógenos e moduladores seletivos de receptores de estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno 25 (incluindo o NOLVADEX® tamoxifen), raloxifeno, droloxifeno, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON toremifeno; (ii) inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, o qual regula a produção de estrógeno pelas glândulas adrenais, como por exemplo,

4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® (exemestana, Pfzer) formestano, fadrozolo, RIVISOR® (vorozolo), FEMARA® (letrozolo, Novartis), e ARIMIDEX® (anastrozole; AstraZeneca); (iii) anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e 5 goserelina; bem como, troxacitabina (um análogo da citisona 1,3-dioxolano nucleosideo); (iv) inibidores da proteína quinase, tal como inibidores da MEK quinase 0JVO 2007/044515); (v) inibidores do lípidio quinase, (vi) oligonudeotídeos antisense, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes envolvidos na via de sinalização da proliferação celular aberrante, 1o tais como, PKC-alfa, Ralf e H-Ras, tal como oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribizimas, tais como inibidores de expressão da VEGF, (por exemplo, ribozima AGIOZYME®) e inibidores da expressão de HER2 , (viii) vacinas tais como, vacinas de terapia gênica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rll-2; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes anti-angiogênicos, tais como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); e (x) sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis e derivados dos acima mencionados.

Também estão incluídos na definição de "agente quimioterápico" anticorpos terapêuticos como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuximab (ERBITUX®, lmclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituximab (RITUXAN Genentech/Biogen ldec), pertuzumab (OMNITARG®, rhuMab 2C 4 , Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), e o conjugado droga-anticorpo, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth).

Anticorpos monoclonais humanizados com potencial terapêutico como agentes quimioterápicos em combinação com os inibidores de PI3K da invenção incluem: alemtuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab,

bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, 5 labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, -·-- - -pectuzumab, pertuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, trastuzumab, tucotuzumab celmoleucina, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab, e visilizumab.

O termo "mamífero" inclui, mas não está limitado a, seres humanos, camundongos, ratos, cobaias, macacos, cães, gatos, cavalos, vacas, porcos, ovelhas e aves.

O termo "alquila" conforme utilizado na presente invenção, refere- se a um radical hidrocarboneto monovalente saturado linear ou de cadeia ramificada de um a doze átomos de carbono, em que o radical alquila pode ser opcionalmente substituído de maneira independente com um ou mais substituintes descrito abaixo. Exemplos de grupos alquila incluem, mas não estão limitados a, metila (Me,-CH 3), etila (Et,-CH2CH3), 1-propila (n-Pr, n- propila, -CH 2CH 2CH 3), 2-propila (i-Pr, i-propila, -CH(CH3)2), 1-butila (n-Bu, n-butila, -CH 2CH 2CH 2CH 3), 2-metil-1-propila (i-Bu, i-butila, -CH2CH(CH3)2), 2-butila (s-Bu, s-butila, -CH(CH 3)CH2CH3), 2-metil-2-propila (t-Bu, t-butila,- C(CH 3)3), 1-pentila (n-pentila, -CH2CH 2CH2CH2CH3), 2-pentila (- CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentila (-CH(CH 2CH 3)2), 2-metil-2-butila (- C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butila (-CH(CH 3)CH(CH 3)2), 3-metil-1-butila (-

CHzCH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butila (-CH2CH(CH 3)CH2CH3), 1-hexila (- CHzCH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexila (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexila (- CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentila (-C(CH3)2CHzCH2CH3), 3- metil-2-pentila (-CH(CH 3)CH(CH 3)CH2CH 3), 4-metil-2-pentila (- 5 CH(CH 3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentila (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3- pentila (-CH(CH2CH3)CH(CH 3)z), 2,3-dimetil-2-butila (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butila (-CH(CH 3)C(CH 3)3, 1-heptila, 1-octila, e similares.

O termo "alquenila" refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada de dois a doze átomos de carbono com pelo menos um sítio insaturado, ou seja, uma dupla ligação carbono- carbono, sp 2 , onde o radical alquenila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos no presente, e inclui os radicais com orientações "eis" e "trans" ou, alternativamente, orientações "E" e "Z". Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, etilenila ou vinila (-CH=CHz), alila (-CH 2CH=CH2), e similares. O termo "alquinila" refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada de dois a doze átomos de carbono com pelo menos um sítio de insaturação, ou seja, uma ligação tripla sp, carbono-carbono, onde o radical alquinila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos no presente.

Exemplos incluem, mas não estão limitados a, etinila (-C=CH), propinila (propargila, -CH 2C=CH), e similares.

Os termos "carbociclo", "carbociclil", "anel carbocíclico" e "cicloalquil" referem-se a anéis saturados ou parcialmente insaturados, monovalentes não aromáticos de 3 a 12 átomos de carbon, tal como um anel monocíclico ou 7 a 12 átomos de carbono como um anel bicíclico. Bicíclicos carbocíclicos contendo 7-12 átomos podem ser organizados, por exemplo, como um sistema biciclo (4,5), (5,5), (5,6) ou (6,6) e bicíclico carbocíclicos contendo 9 ou 1O átomos no anel podem ser organizados como um sistema biciclo (5,6) ou (6,6), ou como sistemas de ponte, tal como biciclo (2,2, 1) heptano, biciclo (2,2,2) octano e biciclo (3,2,2) nonano. Exemplos de carbocíclicos monocíclicos incluem, mas não estão limitados a, ciclopropil, 5 ciclobutil, ciclopentil, 1-ciclopento-1-enil, 1-ciclopento-2-enil, 1-ciclopento-3- enil, ciclohexil, 1-ciclohex-1-enil, 1-ciclohex-enil-2, 1-ciclohex-3-enil, ciclohexadienil, cicloheptil, ciclooctil, ciclononil, ciclodecil, cicloundecil, ciclodoâecil~ e similares. Os termos "heterociclo", "heterociclil" e "anel heterocíclico" são utilizados no presente de forma intercambiável e referem-se a um radical carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado (ou seja, contendo uma ou mais ligações duplas e/ou triplas no anel) de 3 a 20 átomos no anel, no qual, pelo menos um átomo do anel é um heteroátomo selecionado a partir de hidrogênio, oxigênio e enxofre, os átomos restantes do anel são C, no qual um ou mais átomos do anel é (são) opcionalmente substituído(s) de maneira independente por um ou mais dos substituintes descrito abaixo. Um heterociclo pode ser um monociclo contendo de 3 a ?membros de anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S), ou um bicíclico com 7 a 1O membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 6 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S), por exemplo: um sistema biciclo (4,5), (5,5), (5,6) ou (6, 6). Heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; "Principies of Modern Heterocíclicos Chemistry" (WA Benjamin, Nova Iorque, 1968), especialmente nos capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; "The Chemistry of Heterocyclic Coumpounds, A Series Monography"(John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1950), em especial nos volumes 13, 14, 16, 19 e 28, e J. Am. Chem.

Soe. (1960) 82:5566. O termo "heterociclo" inclui heterocicloalcóxi. Os "Heterocíclicos" também incluem radicais em que os radicais heterociclos são fundidos com um anel saturado, parcialmente insaturado ou carbocíclico aromático ou anel heterocíclico. Exemplos de anéis heterocíclicos incluem, mas não estão limitados a, pirrolidinila, tetrahidrofuranila, dihidrofuranila, tetra hid rotien ila, tetrahidropiranila, dihidropiranila, tetrahidrotiopiranila, piperidina, morfolina, tiomorfolina, tioxanila, piperazinila, homopiperazinila, 5 azetidinila, oxetanila, tietanila, homopiperidinila, oxepanila, tiepanila, oxazepinila, diazepinila, tiazepinila, 2-pirrolinila, 3-pirrolinila, indolinila, 2H- piranila, 4H-piranila, dioxanila, 1,3-dioxolanila, pirazolinila, ditianila, ditiolanila, - - ~- - - ditiidropiranila, dihidrotienila, dihidrofuranila, pirazolidinilimidazolinila, imidazolidinila, 3-azabicico(3, 1,O)hexanila, 3-azabiciclo(4, 1,O)heptanila, e azabiciclo(2,2,2)hexanila, 3H-indolila quinolizinila e N-piridil ureia. Moléculas Spiro também não estão incluídas escopo desta definição. Exemplos de um grupo heterocíclico no qual 2 átomos de carbono do anel substituídos por moléculas oxo (= O) são pirimidinonil e 1, 1--dioxo-tiomorfolinil. Os grupos heterciclos no presente são opcionalmente substituídos de forma independente por um ou mais substituintes descritos no presente.

"Arila" indica um radical de hidrocarboneto aromático monovalente de 6-20 átomos de derivados da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parenta!.

Alguns grupos arila são representados nas estruturas exemplares como "Ar".

Arila inclui radicais biciclos compreendendo um anel aromático fundido a um anel saturado ou parcialmente insaturado, ou anéis aromáticos carbocíclicos ou heterocíclicos. Grupos arila típicos incluem, mas não estão limitados a, radicais derivados de benzeno (fenila}, benzenos substituídos, naftaleno, antraceno, bifenila, indenila, indanila, 1,2--dihidronaptaleno, 1,2,3,4-tetrahidronaptil, e similares. Os grupos arilas são opcionalmente substituídos de forma independente por um ou mais substituintes descritos no presente.

O termo "heteroarila" refere-se a um radical aromático mo nova lente, de 5-, 6-, ou 7- membros de anel, e inclui sistemas de anéis fundidos (onde pelo menos um deles é aromático) de 5-20 átomos, contendo um ou mais heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Exemplos de grupos heteroarila são piridinila (incluindo, por exemplo, 2-hidroxipiridinila), imidazolila, imidazopiridinila, 5 pirimidinil (including, for example, 4-hidroxipirimidinil), pirazolila, triazolila, pirazinila, tetrazolila, furila, tienila, isoxazolila, tiazolila, oxazolila, isotiazolila, pirrolila, quinolinila, isoquinolinila, indolila, benzimidazolila, benzofuranila, Cinôlinila; iridazôlila, indolizinilá, ftâlaiinila, -piriâazinila, triazinila, isoindolila, pteridinila, purinila, oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, tiadiazolila, furazanila, benzofurazanila, benzotiofenila, benzotiazolila, benzoxazolila, quinazolinila, quinoxalinila, naftiridinila e furopiridinila. Os grupos heteroarilas são grupos opcionalmente substituídos de forma independente por um ou mais substituintes descritos no presente.

Os grupos heterociclo ou heteroarila podem ser acoplados ao carbono (ligado ao carbono), nitrogênio (ligado ao nitrogênio) ou oxigênio (ligado ao oxigênio) caso seja possível. A título de exemplo, mas não se limitando a, grupos heterociclo ou heteroaril acoplados a carbono são ligados nas posições 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5 ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4, 5, ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4 ou 5 de um furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrolo ou tetrahidropirrolo, posição 2, 4 ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4 ou 5 de uma isoxazol, pirazole, ou isotiazole, posição 2 ou 3 de uma aziridina, posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolína ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de um isoquinolina.

A título de exemplo, mas não se limitando, grupos heterociclo ou heteroaril acoplados a nitrogênio estão ligados na posição, 1 de um aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazólicos, imidazolidina,

2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indólicos, indolina, 1H-indazol, posição 2 de uma isoindol, ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina, e posição 9 de uma carbazol, ou ~-carbolina.

5 Uma "heteroarila monocíclica ligada a carbono" refere-se a um radical heteroarila monocíclico com cinco ou seis membros, não substituído ou substituído, que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos do anel selecionados independentemente a partir de N, O e S. A heteroarila monocíclica ligada a carbono está acoplada a posição C-2 do anel pirimidina de acordo com as fórmulas I em qualquer átomo de carbono do grupo R3 da heteroarila monocíclica. Os radicais heteroarila monocíclicos ligados a carbono incluem, mas não estão limitados a: 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 3-isoxazolila, 4- isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, 3-pirazolila, 4-pirazolila, 2- pirrolila, 3-pirrolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, 3-piridazinila, 4-piridazinila, 5-piridazinila, 2-pirimidinila, 5-pirimidinila, 6-pirimidinila, 2-pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 5-oxazolila, 2-furanila, 3-furanila, 2-tienila, 3-tienila, 3-triazolila, 1- triazolila, 5-tetrazolila, 1-tetrazolila e 2-tetrazolil. As heteroarilas carbono - ligadas são opcionalmente substituídas de forma independente por um ou mais substituintes descritos no presente.

"Heterociclila C3-C 20 bicíclica fundida ligada a carbono" e "heteroarila C1-C2o bicíclica fundida ligada a carbono" contendo um ou mais heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio e enxofre, diferem apenas por seu caráter aromático, e possuem dois anéis fundidos, ou seja, compartilham uma ligação comum. Os radicais heterociclila e heteroarila bicíclicas fundidas ligada a carbono estão ligadas na posição C-2 do anel pirimidina de acordo com as fórmulas I em qualquer átomo de carbono do grupo R3 da heterociclila bicíclica fundida ligada a carbono e heteroarila bicíclica fundida ligada a carbono. Os radicais heteroarila e heterociclila bicíclicos carbono-ligados incluem, mas não estão limitados a: 1H-indazol, 1H- indol, indolin-2-ona, 1-(indolin-1-il)etanona, 1H-benzo[d][1,2,3]triazol, 1H- pirazolo[3,4-b]piridina, 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina, 1H-benzo[d]imidazol, 1H- benzo[d]imidazoi-2(3H)-ona, 1H-pirazolo[3,4-c]piridina, 1H-pirrolo[2,3-c]piridina, 5 3H-imidazo[4,5-c]piridina, 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina, 7H-purina, 1H- pirazolo[4,3-d]pirimidina, 5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina, 2-amino-1 H-purin-6(9H)- ona, quinolina, quinazolina, quinoxalina, isoquinolina, isoquinolin-1 (2H)-ona, 3,4-dihidroisoquinolin-1 (2H)-ona, 3,4-dihidroquinolin-2(1 H)-ona, quinazolin- 2(1 H)-ona, quinoxalin-2(1 H)-ona, 1,8-naftiridina, pirido[3,4-d]pirimidina, e pirido[3,2-b]pirazina. Heterociclos bicíclicos fundidos e heteroarilas bicíclicas fundidas são opcionalmente substituídas de forma independente com um ou mais substituintes descritos na presente invenção.

Os grupos substituintes de alquila, alquenila, alquinila, carbociclila, heterociclila, arila, heteroarila, heterociclila C4-C 20 bicíclico fundido, e heteroarila C1-C 20 bicíclico fundido são opcionalmente substituídos por F, Cl, Br, I, CN, CF3, -N02, oxo, R10 , -C(=Y)R 10 , -C(=Y)OR 10 , -C(=Y)NR 10 R11 , - (CR14R1s)nNR1oR11, -(CR14R1s)nOR1o, -NR1oR11, -NR12C(=Y)R1o, NR12C(=Y)OR11, -NR12C(=Y)NR1oR11, -NR12S02R1o, =NR12, OR1o, OC(=Y)R 10 , -OC(=Y)OR 10 , -OC(=Y)NR 10 R11 , -OS(0)2(0R 10), OP(=Y)(OR 10)(0R 11 ), -OP(OR 10)(0R 11 ), SR 10 , -S(O)R 10 , -S(0)2R 10 , - S(0)2NR 10 R11 , -S(O)(OR 10), -S(0)2(0R 10), -SC(=Y)R 10 , -SC(=Y)OR 10 , - SC(=Y)NR 10 R11 , alquila C1-C 12 opcionalmente substituída, alquenila C2-Cs opcionalmente substituída, alquinila C2-C 8 opcionalmente substituída, carbociclila C3-C 12 opcionalmente substituída, heterociclila C2-C2o opcionalmente substituída, arila C6-C 20 opcionalmente substituída, heteroarila C1-C2o opcionalmente substituída, -(CR 14 R15)t-NR 12C(=O)(CR 14 R15)NR 10R11 , e (CR4R5)t-NR 10 R11 .

Um "metabólito" é um produto produzido através do metabolismo do corpo de um composto específico ou sal deste. Metabólitos de um composto podem ser identificados por meio técnicas rotineiras conhecidas no estado da técnica e sua atividade pode ser determinada utilizando testes como os aqui descritos. Esses produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, 5 hidrólise, amidação, desamidação, esterificação, desesterificação, clivagem enzimática, e processos similares, do composto administrado.

Consequentemente, a invenção abrange os metabó_litqs _dos compostos da . - invenção, incluindo compostos produzidos por um processo que compreende a exposição do composto da presente invenção a um mamífero por um período 1o de tempo suficiente para produzir um produto metabólico deste.

O termo "bula" da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, administração, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.

A expressão "sal farmaceuticamente aceitável" da forma com é utilizada no presente refere-se aos sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um composto da invenção. Exemplos de sais incluem, mas não são limitados a, sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfeto, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tannato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanosulfonato "mesilato", etanosulfonato, benzenosulfonato, p-toluenosulfonato e pamoato (ou seja, 1,1' metileno-bis -(2 hidroxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula tal como um íon de acetato, um íon de sucinato ou outro contra-íon. O contra-íon pode ser qualquer fração orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga no composto de origem. Além disso, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais de um átomo carregado em sua estrutura. Os exemplos onde os átomos carregados múltiplos são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter múltiplos contra-íons. Portanto, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um 5 ou mais contra-íons.

Se os compostos da invenção são bases, os sais farmaceuticamente aceitáveis desejados podem ser preparados por qualquer _ _método adequado disponível no estado -da técnica, por exemplo, o tratamento da base livre com um ácido inorgânico, como o ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanossulfônico, ácido fosfórico e similares, ou com um ácido orgânico, como o ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malônico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, um ácido piranosidil, tal como o ácido glucurônico ou ácido galacturônico, um ácido alfa hidróxi, tais como o ácido cítrico ou ácido tartárico, um aminoácido, como o ácido aspártico e ácido glutâmico, um ácido aromático, como o ácido benzóico ou ácido cinâmico, um ácido sulfônico, tais como o ácido p-toluenosulfônico ou ácido etanossulfônico ou similares. Ácidos que de modo geral são considerados adequados para a formação de sais farmaceuticamente úteis ou aceitáveis a partir de compostos farmacêuticos básicos são discutidos, por exemplo, em P. Stahl et a/, Camille G. (eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts. Properties, Selection and Use. (2002) Zurich: Wiley-VCH; S. Berge et a/, Joumal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1 19; P. Gould, /ntemational J. of Pharmaceutics (1986) 33 201 217; Anderson et a/, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, Nova Iorque; Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., (1995) Mack Publishing Co., Easton PA; e em: The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C. em seu site). Estas divulgações são incorporadas ao presente pela referência.

Se os compostos da invenção são ácidos, os sais farmaceuticamente aceitáveis desejados podem ser preparados por qualquer método adequado disponível no estado da técnica, por exemplo, o tratamento do ácido livre, com uma base orgânica ou inorgânica, como uma amina 5 (primária, secundária ou terciária), um hidróxido de metais alcalinos ou hidróxido de metais alcalino-terrosos, ou similares. Exemplos de sais adequados incluem, mas não estão limitados a, sais orgânicos derivados de - ·-- aminoácidos, tais como a glicina e arginina, amônia, aminas primárias, secundárias, terciárias, aminas cíclica, como a piperidina, morfolina e piperazina, e sais inorgânicos derivados de sódio, cálcio, potássio, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, alumínio e lítio.

A expressão "farmaceuticamente aceitável" indica que a substância ou composição deve ser compatível quimicamente e/ou toxicologicamente com os outros ingredientes que compreendem uma formulação, e/ou para o mamífero a ser tratado com estes.

O termo "sinergético" conforme utilizado no presente refere-se a uma combinação terapêutica que é mais eficaz do que os efeitos aditivos dos dois ou mais agentes individuais. A determinação de uma interação sinérgica entre um composto de Fórmula I, e um ou mais agentes quimioterápicos pode basear-se nos resultados obtidos pelos ensaios descritos na presente invenção. Os resultados destes ensaios são analisados usando o método de comólriação de Chou e Talalay e análise de dose-efeito com o software CalcuSyn a fim de obter um Índice de Combinação (Chou e Talalay, Trends Pharmacol. Sei. 4:450-454; Chou, T.C. (2006) Pharmacological Reviews 68(3):621-681; Chou e Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55). As combinações fornecidas por esta invenção foram avaliadas em vários sistemas de ensaio, e os dados podem ser analisados utilizando um programa padrão para quantificar o sinergismo, aditivismo, e antagonismo entre os agentes anticancerígenos. Um programa exemplar utilizado é descrito por Chou e Talalay, em "New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy", Academic Press, 1987, Capítulo 2. Valores de Índice de combinação inferiores a 0,8 indicam sinergia, valores superiores a 1,2 indicam antagonismo e valores 5 entre 0,8 a 1,2 indicam efeitos aditivos. A terapia combinada pode proporcionar "sinergia" e se provar "sinérgica", ou seja, o efeito obtido quando os ing.redientes atiy_os_ ut~iz~do_s em co~junto são maiores que a soma dos efeitos ··- - resultante da utilização dos compostos separadamente. Um efeito sinérgico pode ser alcançado quando os ingredientes ativos são: (1) coformulados e administrados ou entregue simultaneamente em uma formulação de dosagem combinada, unitária, (2) entregue por alternância ou paralelamente, na forma de formulações distintas, ou (3) por algum outro regime. Quando entregue na forma de terapia alternada, um efeito sinérgico pode ser atingido quando os compostos são administrados ou entregues sequencialmente, por exemplo, por injeções diferentes em seringas separadas. Em geral, durante o tratamento com alternância (terapia alternada), uma dose eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, ou seja, serialmente, enquanto que na terapia combinada, a dose eficaz de dois ou mais ingredientes ativos são administradas juntas.

Os "veículos" conforme utilizado no presente incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes e/ou estabilizantes, que são atóxicos para as células ou para os mamíferos que são expostos nas mesmas dosagens e concentrações utilizadas. Muitas vezes, o veículo fisiologicamente aceitável é de uma solução aquosa com pH tamponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, como o fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (inferior a cerca de 1O resíduos); proteínas, tal como albumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos como a glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo manose, glicose, ou amidos; agentes quelantes, como o EDTA; alcoóis de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal como sódio; 5 tensoativos e/ou tensoativos não iônicos, como TWEEN®, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS®.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma - - ---·- -~- --· ·- ·--·-·------ quantidade de uma combinação terapêutica eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio em um paciente ou mamífero. No caso do câncer, a quantidade 1o terapeuticamente eficaz do antagonista pode reduzir o número de células do câncer, reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, de preferência, parar) a infiltração de células do câncer em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, de preferência, parar) a metástase do tumor, inibir, em alguma extensão, o crescimento tumoral e/ou aliviar em alguma extensão, um ou mais sintomas associados com o câncer. Vide a definição de "tratamento" no presente. À medida que a droga pode impedir o crescimento e/ou a destruição das células de câncer já existentes, ela pode ser considerada citostática e/ou citotóxica.

Uma "quantidade inibidora do crescimento" de uma combinação terapêutica é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente um tumor, por exemplo, células de cânceres, seja essa inibição de modo in vitro ou in vivo. Uma "quantidade inibidora do crescimento" da combinação terapêutica para fins de inibição do crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de forma rotineira.

Uma "quantidade citotóxica" de uma combinação terapêutica é uma quantidade capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente uma célula de tumor, por exemplo, células de cânceres, seja essa destruição de maneira in vitro ou in vivo.

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que normalmente é caracterizada por um aumento não regulado no número de células (geralmente referido na presente invenção como crescimento celular), que pode ser devido ao aumento anormal 5 na proliferação celular, diminuição anormal da morte celular, ou um desequilíbrio nos valores de proliferação celular e morte celular. Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a, cânceres hematopoiéticos ou --- ..

cânceres relacionados com o sangue, tais como linfomas, leucemias, mielomas ou neoplasias linfoides, bem como câncer do baço e câncer de gânglios linfáticos.

O termo "hiperproliferativo" refere-se a distúrbios que estão associados em algum grau com a proliferação celular anormal. Em um exemplo de realização, um distúrbio hiperproliferativo é o câncer.

"Tumor", como utilizado no presente, refere-se a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, seja estas malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos. Os termos "câncer", "canceroso", "distúrbio da proliferação celular", "distúrbio proliferativo" e "tumor" não são mutuamente exclusivos tal como referido na presente invenção.

O termo "linfoma não-Hodgkin" ou "NHL", conforme utilizado no presente, refere-se a um câncer do sistema linfático que não seja linfoma de Hodgkin. Os linfomas de Hodgkin geralmente podem ser distinguidos dos linfomas não-Hodgkin pela presença de células de Reed- Sternberg nos linfomas de Hodgkin e a ausência das ditas células nos linfomas não-Hodgkin. Exemplos de linfomas não-Hodgkin que são abrangidos pelo termo utilizado na presente invenção inclui qualquer linfoma que seria identificada por um técnico no assunto (por exemplo, um oncologista ou patologista), de acordo com esquemas de classificação conhecidos no estado da técnica, tal como o Revisado Europa-América de classificação do linfoma conforme descrito no Atlas Colorido de Hematologia Clínica (Terceira Edição), A. Victor Hoffbrand e John E. Pettit (eds.) (Harcourt Pub/ishers Ltd., 2000) (vide especialmente a FIG 11.57,

11.58 e/ou 11,59 ). Exemplos mais específicos incluem, mas não estão 5 limitados a, LNH recorrente ou refratário, LNH de baixo grau de primeira linha, LNH de estadio 111/IV, LNH resistente à quimioterapia, leucemia linfoblástica precursora 8 e/ou linfoma, linfoma linfocítico de pequenas células, leucemia linfocítica crônica de células 8 e/ou leucemia prolinfocítica e/ou linfoma linfocítico de pequenas células, linfoma prolinfocítico de células 8, imunocitoma e/ou linfoma linfoplasmático, linfoma de células 8 da zona marginal, linfoma da zona marginal esplênica, linfoma MALT - zona marginal extralinfonodal, linfoma de zona marginal linfonodal, leucemia do tipo células pilosas, plasmocitoma e/ou mieloma de células plasmáticas, linfoma folicular/baixo grau, LNH folicular/grau intermediário, linfoma de célula do manto, linfoma do centro folicular (folicular), LNH difuso de grau intermediário, linfoma difuso de grandes células hematopoiéticas, LNH agressivo (incluindo LNH agressivo a primeira linha e LNH agressivo recidivado), LNH reincidente ou refratário, após o transplante de células-tronco autólogas, linfoma primário do mediastino de grandes células 8, linfoma de efusão primária, LNH imunoblástico de alto grau, LNH linfoblástico de alto grau, LNH de células pequenas não clivadas de alto grau, doença volumosa por LNH, linfoma de 8urkitt, linfoma e/ou leucemia linfobástica de precursores de células T (periféricos), linfoma e/ou leucemia de células T adultas, leucemia linfocítica crônica de células T e/ou leucemia prómielocítica, leucemia linfocítica de grandes células granulares, micose fungóide e/ou síndrome de Sézary, linfoma de células T/ natural killer extralinfonodal (tipo nasal), linfoma de células T tipo enteropático, Linfoma Hepatoesplênico de células,

Linfoma subcutâneo de células T paniculite-símile, linfoma de pele (cutâneo), linfoma anaplásico de grandes células, linfoma angiocêntrico, linfoma de células T intestinais, linfoma de células T periféricas (não especificados) e linfoma de células T angioimunoblástico.

5 O linfoma não-Hodgkin inclui, portanto, linfoma hematopoiético, linfoma de células B, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma linfocítico de pequenas células, linfoma maligno, linfoma de células T --·· - - -·- -~ -- - maligno, linfoma anaplásico de grandes células, e linfoma do tecido linfoide associado à mucosa.

COMPOSTOS DE FóRMULA I A presente invenção inclui combinações terapêuticas incluindo compostos de Fórmula I que possuem as estruturas: (o) R' /s~~ R3 yN~ R2

I ou estereoisômeros, isômeros geométricos, tautômeros, ou sais farmaceuticamente aceitávis dos mesmos, em que: R1 é selecionado a partir de H, F, Cl, Br, I, CN, - (CR14R1s)mNR1oR11, -C(R14R1s)nNR12C(=Y)R10, -(CR14R1s)nNR12S(0)2R1o, - (CR14R1s)mOR1o, -(CR14R1s)nS(0)2R1o, -(CR14R1s)nS(0)2NR1oR11, C(OR 10)R 11 R14 , -C(=Y)R 10 , -C(=Y)OR 10 , -C(=Y)NR 10 R 11 , -C(=Y)NR 12 0R 10 , - C(=O)NR 12 S(0)2R 10 , -C(=O)NR 12(CR 14 R15)mNR 10 R 11 , -N02, -NR 12C(=Y)R 11 , - NR 12C(=Y)OR 11 , -NR 12 C(=Y)NR 10 R11 , -NR 12 S(0)2R 10 , -NR 12S0 2NR 10 R11 , - SR 10 , -S(0)2R 10 , -S(0) 2NR 10 R11 , -SC(=Y)R 10 , -SC(=Y)OR 10 , alquila C1-C12.

alquenila C2-C 8 , alquinila C2-Ca, carbociclila C3-C12, heterociclila C2-C2o, arila Cs-C2o. e heteroarila C1-C2o; R2 é selecionado a partir de H, F, Cl, Br, I, CN, CF 3, -N02, -

' -

15 10 11 C(=Y)R 10 , -C(=Y)OR 10 , -C(=Y)NR 10 R11 , -(CR 14 R )mNR R , (CR14R1s)nOR1o, -(CR14R1s)t-NR12C(=O)(CR14R1s)NR1oR11, -NR12C(=Y)R1o, _ 10 10 NR 12 C(=Y)OR 10 , -NR 12C(=Y)NR 10 R11 , -NR 12S0 2R10 , OR , -OC(=Y)R , - 10 11 OC(=Y)OR 10 , -OC(=Y)NR 10R1\ -OS(0)2(0R 10), -OP(=Y)(OR )(0R ), - 10 11 10 5 OP(OR 10)(0R 11 ), SR 10 , -S(O)R 10 , -S(0)2R 10 , -S(0)2NR R , -S(O)(OR ), -

S(0)2(0R 10), -SC(=Y)R 10 , -SC(=Y)OR 10 , -SC(=Y)NR 10 R11 , alquila C1-C12,

alquenila - - -· C2-Ca, -- - alquinila - C2-Ca, carbociclila C3-C12, heterociclila C2-C2o, arila

C5-C2o, e heteroarila C1-C2o; R3 é uma heteroarila monocíclica ligada a carbono, uma

10 heterociclila C3-C 20 bicíclica fundia ligada a carbono, ou uma heteroarila C1-

C2o bicíclica fundia ligada a carbono, em que a heteroarila monocíclica,

heterociclila C3-C 20 bicíclica fundia, e heteroarila C1-C2o bicíclica fundia são opcionalmente substituídas por um ou mais grupos selecionados a partir de F, 11 Cl, Br, I, -CN, -NR 10 R 11 , -OR 10 , -C(O)R 10 , -NR 1°C(O)R 11 , -N(C(O)R )2, - 11 15 NR 1°C(O)NR 10 R 11 , -NR 12 S(0)2R 10 , -C(=O)OR 10 , -C(=O)NR 10 R , C1-C12 alquila e (C1-C12 alquila)-OR 10 ;

R10 , R 11 e R12 são independentemente H, alquila C1-C12, alquenila

C2-C 8 , alquinila C2-Cs, carbociclila C3-C12, heterociclila C2-C2o, arila C5-C2o,

ou heteroarila C1-C2o,

20 ou R 10 e R 11 juntamente com o nitrogênio ao qual eles estão ligados formam um anel heterocíclico C 2-C 20 opcionalmente substituído por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de oxo, 12 12 (CH2)mOR 12 , NR 12 R 12 , CF 3, F, Cl, Br, I, S0 2R 12 , C(=O)R 12 , NR C(=Y)R ,

NR 12 S(0)2R 12 , C(=Y)NR 12 R 12 , alquila C 1-C 12 , alquenila C2-Cs, alquinila C2-

25 C 8 , carbociclila C3-C12, heterociclila C2-C2o, aril C5-C2o e heteroarila C1-

R 14 e R15 são independentemente selecionados a partir de H,

alquila C1-C12, ou -(CH2)n-arila,

ou R 14 e R 15 juntamente com os átomos aos quais estão ligados formam um anel carbocíclico C 3-C 12 saturado ou parcialmente insaturado ;

em que a dita alquila, alquenila, alquinila, carbociclila,

5 heterociclila, arila, e heteroarila, são opcionalmente substituídas por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de F, Cl, Br, I, 10 10 11 CN, CF3, --N02, oxo, 8 10 , -C(='()R 10 , -C(=Y)OR , -C(=Y)NR R , (CR14R1s)nNR1oR11, -(CR14R15)nOR1o, -NR1oR11, -NR12C(=Y)R1o. 14 12 10 12 NR 12 C(=Y}OR 11 , -NR 12 C(=Y)NR 10 R 11 , -(CR R 15 )mNR S02R , =NR , 10 OR 10 , -OC(=Y)R 10 , -OC(=Y)OR 10 , -OC(=Y)NR 10 R 11 , -OS(0)2(0R ), - 10 OP(=Y)(OR 10 )(0R 11 ), -OP(OR 10 )(0R 11 ), -SR 10 , -S(O)R 10 , -S(0)2R , - 10 S(0)2NR 10 R 11 , -S(O)(OR 10 ), -S(0)2(0R 10 ), -SC(=Y}R 10 , -SC(=Y)OR , -

SC(=Y)NR 10 R 11 , alquila C1-C12, alquenila C2-Ca, alquinila C2-Ca,

carbociclila C 3-C12, heterociclila C2-C2o. arila Ca-C2o. e heteroarila C1-

C2o;

Y é O S ou NR 12 · ' ' ' m é O, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; e n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Realizações exemplares de compostos de Fórmula I 10 incluem aquelas em que R 1 é -(CR 14 R 15 )mNR 10 R 11 em que m é 1, e R e R 11 juntamente com o nitrogênio ao qual eles estão ligados formam um anel heterocíclico C 3-C 20 opcionalmente substituído.

O anel heterocíclico C 3-C 20 pode ser piperazinila, opcionalmente substituído 10 11 por um ou mais grupos selecionados a partir de NR R , CF 3, F, Cl, Br, 10 11 I, S02R 10 , C(=O)R 10 , NR 12 C(=Y)R 11 , NR 12 S(0)2R 11 , C(=Y)NR R , e alquila C1-C12· Realizações exemplares de compostos de Fórmula I incluem aquelas em que R 1 não é H.

Realizações exemplares de compostos de Fórmula I incluem aquelas em que R2 é H, CH 3 , carbociclila C3-C 12 , heterociclila C2-C2o. arila Cs-C2o, ou heteroarila C1-C2 0 . A heteroarila C1-C2o pode ser um grupo heteroarila monociclico selecionado a partir de 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 5 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, 3- pirazolila, 4-pirazolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, 3,piridazinila, _ 4-pirida~ini~a, _5-piridazinila, 2-pirimidinila, 5-pirimidinila, 6- pirimidinila, 2-pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 5-oxazolila, 2-furanila, 3- furanila, 2-tienila, 3-tienila, 3-triazolila, 1-triazolila, 5-tetrazolila, 1-tetrazolila, e 2-tetrazolila.

Realizações exemplares de compostos de Fórmula I incluem aquelas em que R3 é 2-aminopirimidin-5-ila.

Realizações exemplares de compostos de Fórmula I incluem aquelas em que R 3 é um grupo heteroarila bicíclico selecionado a partir de 1 H-indazol, 1 H-indol, indolin-2-ona, 1-(indolin-1-il)etanona, 1 H- benzo[d][1 ,2,3]triazol, 1 H-pirazolo[3,4-b]piridina, 1 H-pirazolo[3,4- d]pirimidina, 1 H-benzo[d]imidazol, 1 H-benzo[d]imidazoi-2(3H)-ona, 1 H- pirazolo[3,4-c]piridina, 1H-pirrolo[2,3-c]piridina, 3H-imidazo[4,5- c]piridina, 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina, 7H-purina, 1 H-pirazolo[4,3- d]pirimidina, 5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina, 2-amino-1 H-purin-6(9H)-ona, quinolina, quinazolina, quinoxalina, isoquinolina, isoquinolin-1 (2H)-ona, 3,4-dihidroisoquinolin-1 (2H)-ona, 3,4-dihidroquinolin-2(1 H)-ona, - quinazolin-2(1 H)-ona, quinoxalin-2(1 H)-ona, 1 ,8-naftiridina, pirido[3,4- d]pirimidina, e pirido[3,2-b]pirazina. Realizações exemplares de compostos de Fórmula I incluem aquelas em que R3 é 1H-indazol-4-ila.

Um exemplo de composto de Fórmula I é nomeado como 4-(2- ( 1H-indazol-4-il)-6-( (4-(metilsulfonil)piperazin-1-il)metil)tieno[3 ,2-d]pirimid in-

4-il)morfolina; registrado como CAS Reg.

No. 957054-30-7; descrito e reivindicado na patente US 2008/0076768; divulgado em Folkes et a/ (2008)

Jour. of Med.

Chem. 51(18):5522-5532;; Belvin et a/, 99° American

Association for Cancer Research Annual Meeting 2008: 15 de abril, Resumo

4004; Folkes et a/, 99° American Association for Cancer Research Annual

Meeting 2008, 14 de abril, Resumo LB-146; Friedman et a/, 99° American

Association for Cancer Research Annual Meeting 2008, 14 de abril, Resumo LB-110; e possui a Fórmula~la:

()N \ /N~~-NNH _) N I~ O N ...-9 ~ / /s~ H3C O la

Outro exemplo de composto de Fórmula I é denominado como

1o (S)-1-(4-( (2-(2-aminopirimidin-5-il)-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6-

il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona; e divulgado e reivindicado na patente US 2008/0242665; e possui a Fórmula lb:

HO~O (O) ' N) N \_N~"N ~~~ N "N I N~NH2 lb PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS DE FóRMULA I

Os compostos de Fórmula I podem ser sintetizados por rotas sintéticas que incluem processos análogos aos processos bem conhecidos nas artes químicas.

As matérias primas são disponíveis de modo geral por fontes comerciais, tal como pela Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl) ou são facilmente preparadas usando métodos conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto (por exemplo, preparado por métodos geralmente descrito em Louis F. Fieser e Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, N.Y. (1967-1999 ed.), ou Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer- 5 Verlag, Berlin, incluindo suplementos (também disponível através do banco de dados online da "Beilstein")).

Os compostos de Fórmula I podem ser preparados por meio de procedimentos para preparar o-Ütrõs tiofenos e pirimidinás (US

6.608.053; us 6.492.383; us 6.232.320; us 6.187.777; us 3.763.156; us

3.661.908; US 3.475.429; US 5.075.305; US 2003/220365; GB 1393161; WO 93/13664 ) e outros heterociclos, que estão descritos em: Comprehensive Heterocyc/ic Chemistry, Editores Katritzky e Rees, Pergamon Press, 1984.

Os compostos de fórmula I podem ser convertidos em um sal farmaceuticamente aceitável, e um sal pode ser convertido no composto de base livre, por métodos convencionais. Os compostos de Fórmula I podem ser terapeuticamente eficazes como uma base livre ou como um sal farmaceuticamente aceitável, dependendo das propriedades desejadas, tais como solubilidade, dissolução, natureza higroscópica, e farmacocinética. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais com ácidos inorgânicos, como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico e ácido fosfórico e ácidos orgânicos como o ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiônico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido etanossulfônico, ácido aspártico e ácido glutâmico. O sal pode ser um mesilato, um cloridrato, um fosfato, um benzenossulfonato ou um sulfato. Os sais podem ser mono-sais ou bis- sais. Por exemplo, o sal mesilato pode ser o mono-mesilato ou o bis- mesilato.

Os compostos de Fórmula I e sais também podem existir na forma 5 de hidratos ou solvatos. A proteção de grupos funcionais (por exemplo, amina, primária ou secundária) de intermediários pode ser necessária na preparação de compostos de Fórmula I. A necessidade de tal proteção pode variar dependendo da natureza da funcionalidade remota e das condições dos métodos de preparação. Grupos amino protetores adequados incluem grupos acetil, trifluoroacetil, t-butoxicarbonil (BOC), benziloxicarbonil (CBZ) e 9-fluorenilmetilenoxicarbonil (Fmoc). A necessidade de tal proteção é facilmente determinada por um técnico hábil no assunto. Para uma descrição de grupos protetores e seu uso, vide, T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" 2a Ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque,

1991.

Para fins ilustrativos, os Esquemas de 1 a 7 exibem métodos para a preparação dos compostos da presente invenção, bem como intermediários essenciais. Para uma descrição mais detalhada das etapas de reação individuais, consulte a seção Exemplos abaixo. Os técnicos hábeis no assunto irão apreciar que outras vias sintéticas podem ser usadas para sintetizar os compostos inventivos. Embora matérias-primas e reagentes específicos estejam representados nos esquemas e discutidos a seguir, outras matérias-primas e reagentes podem ser facilmente substituídos para fornecer uma variedade de derivados e/ou condições de reação. Além disso, muitos dos compostos preparados pelos métodos descritos a seguir podem -ser modificados em função desta divulgação usando a química convencional bem conhecida pelos técnicos

- --~ -------- 53 - - - - - - - - - - - - - - - - - - ...

hábeis no assunto.

53 51 ESQUEMA 1 O Esquema 1 exibe um método geral para a preparação dos intermediários tienopirimidina (53) a partir de 2-carboxiéster, reagentes 3-amino s tiofeno (51), em que Hal é C I, Br ou I; e R1 , R2 e R10 são conforme definido para os compostos de Fórmula I, ou precursores ou pró-drogas dos mesmos.

() () «N

N N Hai I R'i=Cl R2 N Hal

H R1 R2

Á Hai 55 54 ESQUEMA2 O Esquema 2 exibe um método geral para a preparação dos intermediários tienopirimidina (53) a partir de 2-carboxiéster, reagentes 3- 10 a mino tiofeno (51), em que H ai é C I, Br ou I; e R 1 , R2 e R 10 são conforme definido para compostos de Fórmula I, ou precursores ou pró-drogas deste.

base 56

ESQUEMA3 O Esquema 3 exibe um método geral para a derivatização na posição 6 de compostos 2- halo, 4-morfolino, 6-hidrogenotienopirimidina (56), em que R1 é H. O tratamento de (56) com um reagente de litiação para 5 remover o próton de posição 6, seguido pela adição de um reagente de acilação R1°C(O)Z, onde Z é um grupo de saída, tais como iodetos, ésteres NHS, carboxilato, __ ou dialqutlamino, fq_ema~do c_9mp~stos 2- halo, 4-morfolina, 6-acil tienopirimidina (57), em que Hal é Cl, Br ou I e R2 e R10 são conforme definidos para os compostos de Fórmula I, ou precursores ou pró-drogas destes. Um exemplo de R1°C(O)Z para preparar compostos 6-formil (R 10 = H) é N, N'- dimetilformamida (DMF).

(Hy)-B(OR 15), Catalisador de Pd Pd catalyst 58 59 ESQUEMA4 O esquema 4 exibe um método geral para o acoplamento tipo Suzuki de intermediários 2-halo pirimidina (58) com um reagente heteroarila monocíclico, heterociclila bicíclico fundido ou heteroarila bicíclico fundido ácido boronato (R 15 = H) ou éster (R 15 = alquila) para preparar os compostos (Hy) 2-substituído, 4- morfolino tienopirimidina (59) de Fórmula I em que Hal é Cl, Br ou I; e R 1 e R 2 são conforme definidos para compostos de Fórmula I ou precursores ou pró-drogas destes. Para revisões da reação de Suzuki, vide: Miyaura et a/. (1995) Chem. Rev. 95:2457-2483; Suzuki, A. (1999) J. Organomet. Chem.

576:147-168; Suzuki, A. em Meta/-Catalyzed Cross-Coupling Reactions, Diederich, F., Stang, P.J., Eds., VCH, Weinheim, DE (1998), págs. 49-

97. O catalisador de paládio pode ser qualquer um que normalmente é usado para acoplamentos cruzados do tipo Suzuki, como PdCI2 (PPH 3)2, 5 Pd(PPH3)4, Pd(OAc)2, PdCI2 (dppf)-DCM, Pd2(dba)3/Pt- Bu)3 (Owens et a/ (2003) Bioorganic & Med C hem Letters 13:4143-4145;. Molander et a/ (2002) Organic Letters 4 (11 ):t86Z::1870; US 6.448.433). _ base 61 61 62

ESQUEMAS O esquema 5 exibe um método geral para a síntese de alei nos (61 ), que podem ser usados para preparar derivados alquinilados de compostos (63). Aminas propargilicas (61) podem ser preparadas pela reação de brometo de propargil (60) com uma amina de fórmula R 10 R11 NH (em que R10 e R 11 são independentemente selecionados a partir de H, alquila, arila e heteroarila ou R10 e R 11 juntamente com o nitrogênio ao qual eles acoplados formam um anel heterocíclico) na presença de uma base apropriada (Cs2C03 ou similar). Para revisões de aminas alquinila e sínteses relacionadas vide Booker-Milburn, K.l., Comprehensive Organic Functional Group Transformations (1995), 2:1039-1074; e Viehe, H.G., (1967) Angew. Chem., lnt. Ed. Eng., 6(9):767-778. Alcinos (61) poderão ser posteriormente reagidos com intermediários (62) (X2 = bromo ou iodo) 2 via acoplamento de Sonogashira, para fornecer compostos (63), onde R e R3 são conforme definido para compostos de Fórmula I ou precursores ou pró-drogas dos mesmos.

CuCI, base 65 65 66 5 ESQUEMAS O esquema 6 exibe um método geral para a síntese de alcinos (65), que podem ser usados para preparar derivados alquinilados de compostos (66). Gem-dialquil aminas propargilica (65) pode ser preparada utilizando os métodos descritos por Zaragoza et a/ (2004) J. Med. Chem., 47:2833. De acordo com o esquema 6, cloreto de gem-dialquil (64) (R 14 e R 15 são independentemente metila, etila ou outro grupo alquila) pode ser reagido com uma amina de fórmula R 10 R11 NH (em que R 10 e R 11 são selecionados independentemente a partir de H, alquila, arila e heteroarila ou R 10 e R 11 juntamente com o nitrogênio ao qual eles estão acoplados formam um anel heterocíclico) na presença de CuCI e uma base apropriada (por exemplo, TEA ou similar) para fornecer o alcino (65). Os alcinos (65) poderão ser posteriormente reagidos com intermediários (62) (por meio de 2 acoplamento de Sonogashira) para fornecer compostos (66), onde R e R 3 são conforme definido para os compostos de Fórmula I ou precursores ou pró-drogas dos mesmos.

calor 68 68 62 69 ESQUEMA 7 O esquema 7 exibe um esquema geral para a síntese de alcinos (68), que podem ser usados para preparar derivados alquinilados de compostos (69). But-3-in-1-aminas (68) (em que R14 e R15 são 5 independentemente H, alquila, arila, heteroarila ou R14 e R15 , juntamente com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um anel carbocíclico ou heterocíclico) podem ser preparadas a partir de reação de alcinos (67) (LG = tosilato ou outro grupo de saída) com uma amina de fórmula R10 R11 NH (em que R10 e R11 são independentemente selecionados a partir de H, alquila, arila e heteroarila ou R10 e R11 juntamente com o nitrogênio ao qual eles estão ligados formam um anel heterocíclico), utilizando o protocolo descrito por Olomucki M.

et a/ (1960) Ann. Chim. 5:845. Os alcinos (68) poderão ser posteriormente reagidos com intermediários (62) por meio do acoplamento de Sonogashira, de acordo com as descrições fornecidas para os esquemas 5 e 6 para fornecer compostos (69), respectivamente, em que R2 e R3 são conforme definido para os compostos de Fórmula I ou precursores ou pró-drogas dos mesmos.

Um sal farmaceuticamente aceitável de um composto de Fórmula tienopirimidina pode ser preparado usando técnicas convencionais.

Tipicamente o processo compreende o tratamento da tienopirimidina de Fórmula I definida acima com um ácido adequado em um solvente adequado.

No processo da invenção conforme definido acima, tanto as etapas de aminação como as etapas de acoplamento cruzado mediado por Pd ocorrem sob condições convencionais. O catalisador de paládio pode ser qualquer um que normalmente é usado para acoplamentos cruzados do tipo 5 Suzuki, como PdCI2( PPH 3 )2. O agente redutor é tipicamente um borohidreto, como NaBH(OAc)3, NaBH4 ou NaCNBH4.

AGENTES QUIMIOTERÁPICOS Alguns agentes quimioterápicos têm demonstrado propriedades surpreendentes e inesperados em combinação com compostos de Fórmula I na inibição da proliferação celular in vitro e in vivo. Tais agentes quimioterápicos incluem: dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina e citarabina.

A dexametasona é um potente hormônio esteróide glicocorticóide, com atividade anti-inflamatória e imunossupressora. Na oncologia, a dexametasona é dada a pacientes com câncer submetidos à quimioterapia, para combater certos efeitos colaterais do tratamento antitumoral. A dexametasona pode aumentar o efeito antiemético dos antagonistas do receptor 5-HT3, como o ondansetron. A dexametasona também é usada em certas neoplasias hematológicas, especialmente no tratamento do mieloma múltiplo, em que a dexametasona é administrada isoladamente ou em conjunto com a talidomida (Thai-Dex) ou uma combinação de adriamicina (doxorrubicina) e vincristina (VAD). Em tumores cerebrais (primários ou metastáticos), a dexametasona é usada para neutralizar o desenvolvimento de edema, que pode eventualmente comprimir outras estruturas do cérebro. A dexametasona é denominada como (8S,9R, 10S, 11S, 13S, 14S, 16R, 17R)-9-fluoro-11, 17-dihidroxi-17-(2-hidroxiacetil)- 10, 13, 16-trimetil- 6,7,8, 11, 12, 14, 15,16- octahidrociclopenta[a]fenantren-3-ona (CAS Reg. No. 50-02-2) e tem a estrutura:

~~ -------~ - - - - - - - - - - - 59

OH o O tioTEPA (tespa, tiofosfoamida, tespamina, TSPA, tifosil, THIOPLEX®) é um agente quimioterápico alquilante usados no tratamento do câncer de mama, câncer de ovário e câncer de bexiga (Maanen et a/ (2000) Can-cer Trate Rev 26 (4f257-68; US 2~-670.347). É- usado tamt>érri como -- 5 condicionamento para transplante de medula óssea. O tioTEPA é nomeado como N,N'N'-trietilenotiofosforamida, fosfinotioilidinetrisaziridina, ou 1,1',1"- fosforotioiltriaziridina (CAS Reg. No. 52-24-4) e tem a estrutura: \7

N 5==~-N~

I

N ü A doxorrubicina (adriamicina®, hidroxildaunorubicina) é uma droga que interage com o DNA, amplamente utilizada na quimioterapia desde 1960. É 1o um antibiótico antraciclina e estruturalmente relacionado com a daunomicina, que também intercala o DNA. A doxorrubicina é comumente usada no tratamento de uma ampla gama de cânceres. A doxorrubicina é nomeada (8S,1 OS)-1 0-(4-amino-5-hidroxi-6-metil-tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)-6,8,11- trihidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-1-metoxi-7,8,9,1 0-tetrahidrotetraceno-5,12-diona, (CAS Reg. No. 23214-92-8) e possui a estrutura:

O OH O OH õ~ ~---OH -- NH2

A vincristina (22 Oxovincaleucoblastina; leurocristina, VCR, forma LCR sulfatada: Sulfato de vincristina, Kyocristine, Oncovin® (Lilly), Vincosid, Vincrex), é um alcaloide da vinca Catharanthus roseus pervinca de Madagascar, primeiramente Vinca rosea (Johnson et a/ (1963) Cancer 5 Res. 23:1390-1427; Neuss et a/ (1964) J. Am. Chem. Soe. 86:1440).

Juntamente com derivados semissintéticos, vindesina e vinorelbina (NAVELBINE®), a vincristina inibe a mitose em metáfase pela ligação à tubulina, impedindo a célula de produzir os fusos necessários para mover os cromossomos da célula que se divide. A vincristina é um medicamento quimioterápico que é dado como um tratamento para alguns tipos de câncer, inclusive a leucemia, linfoma, câncer de mama e de pulmão. A vincristina (leurocristina, VCR) é mais eficaz no tratamento de leucemias infantis e linfomas não-Hodgkin, enquanto a vinblastina (vincaleucoblastina , VLB) é usada para tratar a doença de Hodgkin. A vincristina (número CAS 57-22-7) tem a estrutura: O Rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen ldec;. MABTHERA®, Roche, REDITUX®, CAS Reg. No. 174722-31-7 ) é um anticorpo monoclonal geneticamente modificado quimérico murino/humano direcionado contra o antígeno CD20. O Rituximab é o anticorpo denominado de "C2B8" na Patente US 5. 736.137. O Rituximab é indicado para o tratamento de pacientes com LNH de células B CD20-positivas, foliculares ou de baixo grau refratário ou recidivado. O rituximab se liga ao CD-20 da superfície das células e resulta na

--------- 61 -..,..- -- depleção de células B (Cartron et a/ (2002) Blood 99: 754-758; ldusogie et a/ (2000) J. lmmunol. 164: 4178-4184; Grillo-López AJ, et a/ (1999) Semin Oncol; 26:66-73; US 5736137). O RITUXAN (US 5.677.180; US 5.736.137) é o anticorpo monoclonal mais amplamente utilizado nas doenças malignas 5 hematopoiéticas e está estabelecido de maneira generalizada na prática clínica. RITUXAN recebeu a primeira aprovação da FDA em 1997 para o tratamento do linfoma não-Hodgkio _ (LNH) de __cE§Iulas B ÇQ?~O-positivas,_ foliculares ou de baixo grau refratário ou recidivado. Foi também aprovado na União Europeia em junho de 1998 sob o nome comercial MabThera®. Em 10 fevereiro de 2006, o RITUXAN também recebeu a aprovação do FDA em combinação com o metotrexato para reduzir sinais e sintomas em pacientes adultos com artrite reumatoide de atividade moderada a severa que tiveram respostas inadequadas a uma ou mais terapias com antagonistas de TNF. A sequência de aminoácidos de anticorpo rituximab (também designado C2B8) e 15 os métodos exemplares para a sua produção através de expressão recombinante em células de ovário de hamster chinês (CHO) estão divulgados na Patente US 5.736.137.

A ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar, Revimmune, ciclofosfano, B- 518, Cycloblastin, Cyclostin, Endoxan, Procytox, Sendoxan, citofosfano) é um 20 agente alquilante de mostarda nitrogenada, a partir dos grupos oxazoforinas usados para tratar vários tipos de cânceres e algumas doenças autoimunes ("A Review of Cyc/ophosphamide", DL Hill (1975) Charles C. Thomas, Springfield, págs, 340; IARC Monographs (1975) 9:135-156; Fraiser et a/ (1991) Drugs 42:781-795;. Colvin, OMM (1999 ) Curr. Pharmaceut. Design 5:555-560). A 25 ciclofosfamida é um pró-fármaco convertido no fígado para uma forma ativa que possui atividade quimioterápica. O principal uso da ciclofosfamida é juntamente com outros agentes quimioterápicos no tratamento de linfomas, algumas formas de leucemia e alguns tumores sólidos (Shanafelt et a/ Cancer

(2007) 109(11):2291-8; Brock N (1996) Cancer 78 (3):542-7). É um medicamento quimioterápico que funciona diminuindo ou parando o crescimento celular e diminuindo a resposta do sistema imunológico em diversas doenças.

5 A ciclofosfamida é nomeada como N,N-bis(2-cloroetil)-1 ,3,2- oxazafosfinan-2-amina 2-oxido, N,N-bis(2-cloroetil)tetrahidro-2H-1 ,3,2- oxazafosforin-2-amina-2-oxido; _monohidrato de 1-bis(2::cloroetil)amino-1-oxo-2_- . __ aza-5-oxafosforidina; éster de bis(2-cloroetil)-fosfamida cíclico propanolamida; ou ácido N,N-bis(beta-cloroetii)-N',O-propilenofosfórico éster diamida, incluindo as formas hidrtadas (CAS number 50-18-0), e possui a estrutura: Prednisona (Meticorten, Sterapred, DS Sterapred, retrocortina, Colisona, Cortancila, Dacortin, Decortin, Deltacortene, Deltacortone, Deltasone, Deltison, Di - Adreson, Encorton, Hostacortin, Meticorten, Orasone, Rectodelt, Sone, ou Ultracorten) é uma droga corticosteróide sintética (US 2.897.216; US

2.837.464; US 3.134.718; US 2.579.479 ). A prednisona é um pró-fármaco convertido no fígado em prednisolona (CAS Reg. No. 50-24-8), um análogo 11- hidroxila, e possui um efeito principalmente glicocorticóide. A prednisona pode ser administrada por via oral ou por injeção. A prednisona é particularmente eficaz como um imunossupressor e é usada para tratar doenças autoimunes, doenças inflamatórias (como asma grave, alergias, hera venenosa, dermatite, lúpus, artrite reumatoide e doença de Crohn, e para prevenir e tratar a rejeição em transplante de órgãos. A prednisona é usada para tratar o câncer, incluindo a leucemia linfoblástica aguda, linfomas não-Hodgkin e mieloma múltiplo.

Prednisona é nomeada como 17-hidroxi-17 -(2-hidroxiacetil)-1 O, 13-dimetil- 7 ,8,9, 1O, 12, 13, 14, 15, 16,17-decahidro-6H- ciclopenta[a]fenantreno-3, 11-diona;

ou 17,21-dihidroxipregna-1 ,4-dieno-3, 11 ,20-triona; 1,4-pregnadieno-17alfa,21- diol-3, 11 ,20-triona; (número CAS 53-03-2), e possui a estrutura: o

OH --- 0 melfalam (mostarda de L- fenilalanina; mostarda nitrogenada de alanina, L-AM; melfalam; L-sarcolisina; NSC- 8806; CB -3025; Alkeran® 5 (Giaxo SmithKiine ); Sarcoclorina) é um tipo de agente alquilante de mostarda nitrogenada quimioterápico (US 3.032.584; US 3.032.585 ). O melfalam é usado principalmente para o tratamento do mieloma múltiplo, câncer de ovário e melanoma (IARC Monographs (1975) 9:167-180;. Furner et a/ (1980) Cancer. Treat Rep. 64:559-574). Melfalam é nomeado como ácido 2-amino-3-[4-[bis(2-cloroetil)amino]fenil]-propanóico; 4-[bis(2- cloroetil)amino]-L-fenilalanina; ou p-di(2-cloroetil)amino-L-fenilalanina (CAS Reg. No. 148-82-3 ) e tem a estrutura:

CI ( N~CI

HO o Lenalidomida (REVLIMID®, CC 50 13, Revimid, Celgene Inc.) é um derivado da talidomida e introduzido em 2004 (US 5635517, US 6281230) para tratar tanto doenças inflamatórias como o câncer. Existem vários mecanismos de ação, incluindo um efeito anti-tumor direto, inibição do apoio do microambiente para as células tumorais, e um papel imunomodulador. In vitro, a lenalidomida induz a apoptose de células tumorais, direta e indiretamente pela inibição das células estromais de suporte da medula óssea, por efeitos anti-ang iogên icos e anti-osteoclastogê nicos, e pela atividade imunomoduladora. A lenalidomida foi inicialmente concebida como um tratamento para o mieloma múltiplo, para o qual a talidomida é uma modalidade terapêutica aceita, mas também tem demonstrado eficácia na classe de 5 doenças hematológicas conhecidas como síndromes mielodisplásicas (Richardson et a/ (2002) Blood 100:3063; Bartlett et a/ (2004) Nature Rev.

4:314-322; Mitsiades et a/ (2004) Curr. Opin.Jnvest. Drugs 5:635-647; Armoiry et a/. (2008) J of Clin Pharmacy & Therapeutics 33:219-226; List et a/ (2005) N. Engl. Jour. Med. 352:549-57). A lenalidomida é nomeada como 3-(4-amino-1- 1o oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona; 3-(4-amino-1 ,3-dihidro-1-oxo-2H- isoindol-2-il)-2,6-piperidinadiona; 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-4- aminoisoindolina (CAS Reg. No. 191732-72-6) e tem a estrutura: NH2 O H o N-b=o O bortezomib (MG -341, PS -341, VELCADE®, Millennium Pharm.) é um inibidor proteassoma ácido borônico aprovado nos EUA para o tratamento da recidiva do mieloma múltiplo e linfoma de células do manto.

(documento WO 96/13266; Patente US 5780454; Patente US 6083903; Patente US 6297217; Patente US 6617317; Patente US 6713446; Patente US 6747150; Patente US 6958319; Patente US 7119080). O átomo de boro no bortezomib se liga ao sítio catalítico do proteassoma 26S com alta afinidade e especificidade. Em células normais, o proteassoma regula a expressão da proteína e a função pela degradação de proteínas ubiquitinizadas, e também limpa a célula de proteínas anormais ou deformadas. (Adams et a/ (2004) Cancer lnvest 22(2):304-11; Bonvini (2007). Leukemia 21 (4):838-42). O bortezomib é nomeado como ácido [(1 R)-3-metii-1-({(2S)-3-fenil-2-[(pirazin-2-

• ilcarbonil)amino ]propanoil}amino)butil]borônico; ácido (R)-3-metil-1-( (S)-3-fenil- 2-(pirazina-2-carboxamido)propanamido)butilborônico; ou ácido [(1 R)-3-metil-1- [[(28)-1-oxo-3-fenil-2-[(pirazinilcarbonil)amino]propil]amino]butil]-borônico (CAS Reg. No. 179324-69-7) e tem a estrutura: ~ o (:f'~

H N'-.../B(OHh -- -=

N o y 5 A rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®) é uma droga imunossupressora utilizada para evitar a rejeição no transplante de órgãos, e é especialmente útil nos transplantes de rim. A rapamicina é um antibiótico macrolídeo produzido pela bactéria Streptomyces hygroscopicus em uma amostra de solo obtida a partir de uma ilha chamada Rapa Nui, mais 10 conhecida como Ilha de Páscoa (Pritchard DI (2005) Drug Discovery Today 10(1 0):688-691 ). A rapamicina inibe a resposta a interleucina-2 (IL-2) e, assim, bloqueia a ativação de células Te hematopoiéticas. O modo de ação da rapamicina é pela ligação da proteína citosólica Proteína de Ligação FK 12 (FKBP12). O complexo rapamicina-FKBP12 inibe a via alvo da 15 rapamicina no mamífero (mTOR) através da ligação direta do mTOR Complexo1 (mTORC1). O mTOR é também denominado de FRAP (FKBP- proteína associada à rapamicina) ou RAFT (rapamicina e FKBP alvo). Os análogos da rapamicina ("Rapalogs") incluem Temsirolimus (CCI -779, Wyeth), Everolimus (RAD001, Novartis), Deforolimus ( AP23573, MK- 8669, 20 Ariad, Merck). A rapamicina é nomeada como (3S,6R,7E,9R, 1OR, 12R, 14S, 15E, 17E, 19E,21 S,23S,26R,27R,34aS)- 9, 10, 12, 13,14,21 ,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-hexadecahidro-9,27- d ihid roxi-3-[ ( 1R)-2 -[ ( 1S, 3 R,4R)-4-h id roxi-3-metoxiciclohexi 1]-1-meti Ieti 1]-

10,21-dimetoxi-6,8, 12, 14,20,26-hexametil-23,27-epoxi-3H-pirido[2, 1-c][1 ,4]- oxaazaciclohentriacontina-1 ,5, 11 ,28,29(4H,6H,31 H)-pentona (CAS Reg. No.

53123-88-9), e tem a estrutura: A citarabina (citosina arabinosídeo, Ara -C, CYTOSAR -U®, Upjohn) é usada principalmente no tratamento de doenças hematológicas malignas, incluindo leucemia mieloide aguda (LMA) e NHL (US 3.116.282; Shen et a/ (1965) J. Org. Chem. 835); Capizzi, R.L. (1996) lnvest. New Drugs 14:249-256; Grant S. (1998) Adv. Cancer Res. 72:197-233). A citarabina é nomeada como 4-amino-1-((2R,3S,4S,5R)-3,4-dihidroxi-5- (hidroximetil)tetrahidrofuran-2-il)pirimidin-2(1 H)-ona; 4-amino-1-beta-D- arabinofuranosil-2(1 H)-pirimidinona; 1-beta-D-arabinofuranosilcitosina; (CAS Reg. No. 147-94-4) e tem a estrutura: NH2 r( HO}:~(i

HO OH O CHOP é um acrônimo para um regime de quimioterapia utilizada no tratamento do linfoma não-Hodgkin e inclui a ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona/prednisolona (Fisher et a/ (1993) N Engl J Med 328 (14):1002-6). O CHOP é geralmente administrado em ciclos de 4 semanas. Um esquema de tratamento comum é por pelo menos 6 ciclos.

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AVALIAÇÃO BIOLÓGICA Alguns compostos de Fórmula I se ligam especificamente a isoformas de Pl3 quinase e inibem o crescimento de células tumorais (US 2008/0207611; us 2008/0039459; us 2008/0076768; us 2008/0076758; us 5 2008/0242665; US 2008/0269210). Certos exemplos de compostos de Fórmula I têm a atividade de ligação ao PI3K com valores IC50 menores que 1O nM. Certos compostos de Fórmula I têm atividade baseados em células tumorais com valores EC 5 inferiores a 1ÓO nM. - - -- --- ------- --- ------ -- - --- - 0 Algumas combinações terapêuticas exemplares de compostos de Fórmula I e agentes quimioterápicos descritos na presente invenção foram testados quanto a atividade in vitro contra células tumorais (Exemplo 15).

Alguns compostos de Fórmula I se ligam a isoforma p110a com uma IC 50 menor que 1 micromole e exibem um único agente na inibição do crescimento tumoral in vivo em modelos de camundongos xenoenxertados. Assim, os compostos de Fórmula I podem ser utilizados para tratar uma doença ou distúrbio decorrentes do crescimento anormal das células, ou comportamento como agentes únicos ou em terapia de combinação com um ou mais agentes quimioterápicos.

As mutações no KRAS, NRAS, BRAF e PIK3CA ativam duas das principais vias que medeiam a proliferação e a sinalização anti-apoptótica nas células cancerosas. Como tal, as mutações nestes genes podem constituir - testes diagnósticos de acompanhamento para agentes alvos que inibem os nós fundamentais nestas vias, uma vez que a presença de uma mutação pode servir como um sinal de ativação patológica e dependência de uma dada via em um tumor específico. O estado de mutação para esses genes, e outros, em um grande painel de linhagem de células de diversos tecidos de origem pode resultar em uma correlação com resposta a inibidores seletivos da MEK e Pl3 quinase. Além disso, a detecção das mutações pode ser realizada em

--~~ ~ -- amostras clínicas consistindo de pequenas quantidades de tecidos tumorais heterogêneos fixados, que podem ser analisados mediante ensaios Taqman alelo específicos para as substituições mais prevalente em KRAS, NRAS, BRAF e Pl3 quinase.

5 A Figura 1 exibe a redução de marcadores farmacodinâmicos (PD) medidos por citometria de fluxo FACS de células DoHH2 (células de linfoma), WSU-DLCL2 (células de linfoma), OPM2 (células de mieloma múltiplo) e-Ú26-6 (células de mieloma múltiplo), tratadas-(colu-na da direita) e não tratadas (coluna da esquerda) com a Fórmula la (GDC-0941). O Exemplo 18 fornece um protocolo FACS para detecção intracelular de fosfo- AKT (p-Akt) e proteína ribossomal p-S6 (p-S6RP) pós-tratamento com GDC 0941. As células foram tratadas in vitro com 5 1-1M de GDC-0941 por 4 hrs. Três das linhagens celulares mostraram evidências de ativação da via PI3K conforme evidenciado pelos altos níveis de p-AKT e todas as quatro exibiram evidências de ativação da via distai conforme evidenciado pelos altos níveis de sinal de proteína ribossomal fosfo-S6 em células não tratadas (colunas à esquerda). Na coluna da direita, as células tratadas com GDC-0941 aboliram o sinal p- AKT e reduziram ou aboliram sinal p- S6RP. Os sinais restantes para pS6rp são consistentes com um modelo em que a atividade PI3K é parcialmente responsável por este evento de fosforilação. Coletivamente, estes dados indicam que a via PI3K está ativada nesses tipos de células e que o GDC-0941 tem potente atividade inibitória sobre a via PI3K em células intactas.

A Figura 2 exibe a redução de marcadores farmacodinâmicos (PD) p-AKT, p-S6RP, p-Bad, em células DoHH2, WSU-DLCL2, OPM2 e U266 medido por eletroforese em gel SDS-poliacrilamida e western b/otting em linhagens de células tratadas in vitro com 5 1-1M de GDC-0941 por 4 hrs. O Exemplo 17 fornece um protocolo para a detecção por Western blotting da p- Akt, p-BAD e proteína ribossomal p-S6 pós tratamento com GDC-0941 das linhagens de células 8 e linhagens de células de mieloma. As células foram tratadas conforme indicado e os lisados foram analisados por Western Blotting.

O b/otting da Beta Actina indica uma carga aproximadamente igual de lisados em cada pista. Três das linhagens celulares mostraram evidências de ativação 5 da via PI3K conforme evidenciado pelos altos níveis de p-AKT e todas as quatro exibiram evidências de ativação da via distai conforme evidenciado pelos altos níveis de sinal de fosfo-S6RP em células não tratadas. Os sinais para amfios- 6-s p-AKT e p-S6RP foram significativaménte reduzidos (se presentes) pelo tratamento com GDC-0941, indicando que a via PI3K foi 1o ativada nestas células e que o GDC-0941 tem atividade inibitória significativa na via em células intactas. Os níveis de ambos os marcadores PD seguem mesma ordem de classificação e estão bem correlacionados entre Figura 1 e Figura 2.

As propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) foram medidas para certos compostos exemplares por ensaios, incluindo: Caco-2 Permeabilidade, Clearence de Hepatócito, Inibição do Citocromo P450, Indução do Citocromo P450, ligação com proteínas plasmáticas, e bloqueio de canais hERG.

A invenção inclui um método para determinar os compostos a serem utilizados em combinação para o tratamento do câncer compreendendo: (a) a administração de uma combinação terapêutica de um composto possuindo Fórmula I, e um agente quimioterápico para uma linhagem de célula tumoral in vitro com e (b) medir um efeito sinérgico ou não sinérgico.

ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO A atividade citotóxica ou citostática de compostos de Fórmula I exemplares foi medida pelo: Estabelecimento de uma linhagem de células tumorais de mamíferos proliferante em um meio de cultura celular, adição de um composto de Fórmula I, cultivo das células por um período de cerca de 6 ----------

horas a cerca de 5 dias, e medição da viabilidade celular (Exemplo 15).

Ensaios in vitro baseados em células foram utilizados para medir a viabilidade, ou seja, a proliferação (IC 5o), citotoxicidade (EC 50 ), e indução da apoptose (ativação da caspase).

5 A potência in vitro das combinações de compostos de Fórmula I com agentes quimioterápicos foi medida pelo ensaio de proliferação celular do Exemplo 15; usando o Ensaio luminescente de viabilidade celular CeiiTiter - Glo® Luminescent Cell Viability Assay, comercialmente disponível -pela Promega Corp, Madison, Wl. Este método de ensaio homogêneo é baseado na expressão recombinante de luciferase de Coleoptera (US 5583024; US 5674713; US 5700670) e determina o número de células viáveis na cultura com base na quantificação de ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et a/ (1993) J. lmmunol Meth 160:81-88; US

6.602.677). O ensaio CeiiTiter-Gio® Assay foi realizado em placas 96 ou 384 poços, tornando-o passível de ser submetido a triagem automatizada de alto rendimento (HTS) (Cree et a/ (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404). O procedimento de ensaio homogêneo que envolve a adição do único reagente (Reagente CeiiTiter-Gio®) diretamente nas células cultivadas no meio suplementado com soro. A lavagem das células, remoção de meio e diversas etapas de pipetagem não são necessárias. O sistema detecta apenas 15 células/poço em placas no formato de 384 poços em 1O minutos após a adição do reagente e mistura.

O formato homogêneo "adicionar-misturar-medir" resulta na lise celular e geração de um sinal luminoso proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade de ATP é diretamente proporcional ao número de células presentes na cultura. O ensaio CeiiTiter -Gio® Assay gera um sinal luminoso "tipo incandescente", produzido pela reação da luciferase, que tem uma meia-vida, geralmente superior a cinco horas, dependendo do tipo de célula e meio utilizado. As células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativa (RLU). O substrato, luciferina de besouro, é oxidativamente descarboxilado pela luciferase do vaga-lume recombinante com a conversão concomitante de ATP em AMP e geração de fótons. A meia-vida 5 estendida elimina a necessidade de usar injetores de reagentes e oferece flexibilidade para o processamento de modo contínuo ou descontínuo de múltiplas placas. Este ensaio de proliferação celular pode ser usado em diferentes formatos com diversos poços,~por~ exemplo, 96 ou 384 poços. Os~ dados podem ser gravados por luminômetro ou outro dispositivo de imagem cp, câmera CCD. A saída da luminescência é apresentada como unidades de luz relativa (RLU), medida ao longo do tempo.

Os efeitos anti-proliferativos de compostos exemplares de Fórmula I e combinações com agentes quimioterápicos foram medidos pelo ensaio CeiiTiter-Gio® Assay (Exemplo 15) contra as linhas de células tumorais nas Figuras 3-6. Os valores EC 50 foram estabelecidos para os compostos e combinações testadas. A faixa de atividade em potência de células in vitro foi de cerca de 100 nM a cerca de 10 mM.

Os valores EC 50 individuais medidos dos compostos de Fórmula I e do agente quimioterápico contra a célula em particular são comparados com o valor de EC 50 da combinação. O escore do índice de combinação (CI) é calculado pelo método de Chou e Talalay (Chou, T. e Talalay, P. (1984) Adv.

Enzyme Reg ui. 22:27-5 5). Uma CI inferior a 0,8 indica sinergia. Uma CI entre 0,8 e 1,2 indica aditividade. Uma CI superior a 1,2 indica antagonismo. A força da sinergia é avaliada de acordo com Chou e Talalay. Certas combinações terapêuticas nas Figuras 4-6 exibem propriedades de sinergia surpreendente e inesperadas nos ensaios de proliferação in vitro de celular com linhagens de células tumorais, incluindo de linfoma não-Hodgkin (LNH), linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) e mieloma múltiplo. Outras combinações não apresentam sinergia, e só mostram mera aditividade ou antagonismo. Algumas combinações são sinérgicas com um ou mais tipos de tumores, mas não com outros. A sinergia demonstrada nos ensaios de proliferação in vitro de células fornece uma base para esperar uma sinergia correspondente no tratamento do 5 câncer hematopoiético, incluindo, mas não se limitado a, linfoma e mieloma múltiplo em pacientes humanos.

A Figura 3 exibe o efeito do inibidor de PI3K na forma de agente único, Fórmula la (GDC-0941 ), e em combinação com dexametasona (Dex) e doxorrubicina (Dox), sobre linhagens de células 8-NHL: DoHH2. Os ensaios de sobrevida celular in vitro e ensaios de proliferação (Ceii-Titer Glo, Promega) mediu células viáveis sobre as variáveis concentrações de inibidores 1o-5 a 1O Unidades Relativas do IC 50 anteriormente determinado (aproximadamente), a Fórmula la, dexametasona, doxorrubicina e combinações de Fórmula la e dexametasona; e Fórmula la e doxorrubicina. Note-se que a extensão da morte celular na concentração mais elevada de inibidores variou de um agente para outro. No caso da doxorrubicina, a adição de GDC-0941 causou uma modesta alteração da curva dose-resposta para a esquerda, indicando um aumento da sensibilidade das células para o tratamento combinado. Um índice de combinação (CI) de - 0,75 foi calculado para esta combinação, indicando aditividade ou sinergia. A atividade relativamente impotente de agente único dexametasona é refletida como um maior valor de IC 50 , bem como uma fraca extensão do sinal de redução no ensaio, talvez apontando para um efeito citostático ou apenas uma fraca atividade citotóxica. No entanto, em combinação com o GDC-0941, uma surpreendente e altamente significativa alteração da curva dose-resposta para a esquerda foi obtida em todas as concentrações. O valor de Cl calculados no ponto IC 50 foi - 0,3, indicando uma sinergia imprevisível e inesperadamente forte, raramente vista entre agentes teste.

A Fórmula la (GDC-0941) é citotóxica para muitas linhagens de células de linfoma B, induzindo uma robusta apoptose como agente único, de acordo com a Tabela 2. TABELA 2 Linhagem celular Tipo de tumor ECso (JJM) SUDHL6 DL8CL 0,01

Rl1 8-NHL 0,04

SUDHL5 DL8CL 0,08- - --

WSUDLCL2 DL8CL 0,13

MC116 NHL 0,16

WSUNHL NHL 0,16

Rec1 8-NHL 0,16

Granta519 LMC 0,21

Farage DL8CL 0,24

DoHH2 DL8CLIFLL 0,26

Ocily19 DL8CL 0,32

Jeko1 LMC 0,32

8jab De 8urkit 0,33

SUDHL4 DL8CL 1,35

HT DL8CL 2,84

D8 DL8CL 10

Ramos De 8urkit 10

SC1 DL8CL 10

Toledo DL8CL 10

Os dados da tabela 2 indicam que GDC-0941 é amplamente citotóxico e potente contra linhagens de células de linfoma em doses que poderiam ser clinicamente viáveis.

Experimentos como aqueles da Figura 2 foram estendidos para linhagens de células adicionais e para combinações de GDC-0941 com tiotepa,

doxorrubicina, vincristina e dexametasona.

Os escores do Índice de

Combinação (CI) foram calculados pelo método de Chou-Talalay (Tabela 3).

Em nenhum caso encontramos valores de CI > 1, o que indicaria que o GDC- 0941 antagonizou os outros agentes, quando testado em combinação. Em geral, o GDC-0941 combinou bem com esses outros agentes mostrando pelo menos aditividade. Para combinações com dexametasona, valores Cl 5 surpreendentes e altamente significativos de cerca de 0,3 ou menos foram obtidos em todas as linhagens.

TABELA3 --·-·- ·I· ·-· ·--- · -linhagem de ECso (JJM) Cl no EC50 Cl no EC50 Cl no EC50 Cl no EC50 células 8 - LNH GDC-0941 (agente tioTEPA Dox vincristina Oex único) Bjab 0,33 0,88 0,64 0,83 0,30 Não DoHH2 0,16 0,65 0,75 0,31 determinado Não WSU-DLCL2 0,17 0,69 0,81 0,12 determinado A Figura 4 exibe o efeito de inibidores de PI3K na como agente único em células de linfoma folicular primário de células de paciente NHL600 1o conforme determinado pelos ensaios in vitro de sobrevivência celular e proliferação (Ceii-Titer Glo®, Promega Corp, Madison, Wl), medindo as células viáveis sobre as variadas concentrações (1 o-s a 1O IJMolar) de Fórmula la (GDC-0941 ), GDC-0464, e LY294002. Como os dados da citoxicidade de linhagem celular são comumente considerados por superestimarem a potência destes compostos, os dados indicam que a Fórmula la (GDC-0941) tem um grau surpreendente e inesperado de potência contra células primárias de câncer humano. O GDC -0464 (Genentech, Inc.) é um potente inibidor da PI3K tienopirimidina (US 2008/0076758). LY294002 (Eii Lilly & Co., CAS Reg. N o 154447-36-6 ) também é um potente inibidor das Pl3 quinases (WO 2003/035099).

A Figura 5 exibe o efeito de um inibidor da PI3K como agente único, Fórmula la (GDC-0941 ), e em combinação com a doxorrubicina, em células de linfoma primário difuso de grandes células 8 (LDGCB) de paciente NHL640-A055. A viabilidade celular foi medida por testes de sobrevivência 5 celular in vitro e ensaios de proliferação celular (Cell-Titer Glo®) sobre concentrações variantes (1 o-5 a 20 IJMolar) de Fórmula la, doxorrubicina, e a combinação Fórmula la e doxorrubicina. As antracilinas são a espinha dorsal -- - - ····- da maioria dos regimes de quimioterapia e, como tal, são consideradas compostos altamente ativos. Estes resultados indicam que para esta amostra de tumor primário in vitro, que GDC-0941 foi significativamente mais potente do que a doxorrubicina e em surpreendente contraste com os resultados obtidos com linhagens de células in vitro, a combinação não foi significativamente melhor do que o GDC-0941 como agente único.

A Figura 6 exibe o efeito do inibidor de PI3K como agente único de Fórmula la (GDC-0941), e em combinação com a dexametasona, sobre células de mieloma múltiplo OPM2 pelos ensaios in vitro de proliferação celular (Ceii-Titer Glo®) medindo as células viáveis sobre as variadas concentrações de fármacos (expresso como uma função de seus valores IC 50 previamente determinados, ou seja, "1" = [drogas] que fornecem uma resposta ICso) de Fórmula la, dexametasona (Dex), e a combinação de Fórmula la e dexametasona a taxas fixas. A resposta relativamente fraca para a dexametasona é bastante reforçada pela combinação com o GDC-0941, tanto em termos de potência, como em termos de extensão da resposta, e um valor Cl de 0,45 é obtido indicando uma forte sinergia entre os dois agentes. A Tabela 4 exibe os escores do Índice de Combinação, calculado pelo método de Chou & Talalay, de tratamento de várias linhagens de células de mieloma múltiplo pelas combinações terapêuticas de composto de Fórmula la (GDC- 0941) e um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona (Dex),

doxorrubicina (Dox), melfalam, lenalidomida, e bortezomib. Certas combinações exibem sinergia (IC<0,8), aditividade (0,8-1,2), ou antagonismo ( > 1,2). Estes dados indicaram que o GDC-0941 não combina tão bem com todas as quimioterapias. Os Cls obtidos com GDC-0941 e Bortezomib foram, 5 em geral, na faixa de 0,8 e superior, enquanto que o Cl obtido com GDC-0941 e dexametasona foram menores e indicaram tanto uma resposta sinérgica como mais prevalente entre as linhagens celulares testadas. - - TABELA4 Linhagem de células ECso Clno Cl no EC 50 Cl no EC50 Cl no EC50 Cl noEC50 de mieloma (JJM) EC 50 múltiplo GDC- 0941 Dex Dox melfalam lenalidomida bortezomib (agente único) Não Não Não EJM 1,5 0,57 0,78 determinado determinado determinado Não MM1,S 0,22 0,55 0,68 0,92 1'18 determinado Não MOLP-8 0,06 1 '19 0,85 0,59 0,90 determinado Não Não NCI-H929 0,43 0,45 1,00 0,48 determinado determinado OPM2 1,23 0,45 0,99 2,00 0,47 0,92 RPMI-8226 2,53 0,17 0,83 0,75 0,59 1,00 Não Não KSM-12-BM >5 0,52 0,30 0,68 determinado determinado

TABELAS COMBINAÇÃO DE GDC-0941 E VINCRISTINA Linhagem celular Cl no ED50 Cl no ED75 Cl no ED90 Bjab 0,84 0,63 0,58 DoHH2 0,92 0,94 1,03

Linhagem celular Cl no ED50 Cl no ED75 Cl no ED90 WSU-DHL4 0,53 0,47 0,42 WSU-DLCL2 0,63 0,60 0,56 A Tabela 5 exibe os escores do Índice de Combinação, calculado pelo método de Chou e Talalay, de diferentes linhagens de células de linfoma pelas combinações terapêuticas do composto de Fórmula la GDC-0941 e do ~ge_!lte __qui~ioterápico vincristina. Algumas combinações exibem sinergia (IC < - -- - 5 0,8), aditividade (0,8-1 ,2), ou antagonismo(> 1,2). Os dados indicam queGDC- - 0941 combina muito favoravelmente com a vincristina particularmente nas linhagens BJAB, WSU-DHL4 e WSU-DLCL2. O valor Cl é mostrado em três pontos diferentes na curva dose-resposta, o ED50, ED75, e ED90 e o fato de que valores semelhantes de Cl são obtidos nesses pontos diferentes na curva dose-resposta indica que os dados são robustos e toda a curva de resposta foi deslocada para produzir uma resposta biológica aumentada no caso da combinação de agentes.

A Tabela 6 exibe os escores dos Índices de Combinação, calculados pelo método de Chou & Talalay, do tratamento de várias linhagens de células de malignidades hematopoiéticas na presença ou ausência de fatores de crescimento IL-6 e IGF-1 pela combinação terapêutica do composto de Fórmula la (GDC-0941) e dexametasona. Algumas combinações exibem sinergia (I C < 0,8), aditividade (0,8-1 ,2), ou antagonismo (> 1,2). Os dados indicam que GDC-0941 combina favoravelmente com a dexametasona. O valor Cl é mostrado em três pontos diferentes na curva dose-resposta, o ED50, ED75, e ED90 e o fato de que valores semelhantes de Cl são obtidos nesses pontos diferentes na curva dose-resposta indica que os dados são robustos e toda a curva de resposta foi deslocada para produzir uma resposta biológica aumentada no caso da combinação de agentes. As células MM1.s são conhecidas por serem sensíveis a dexametasona e exibiram uma clara sinergia quando combinado com GDC-0941. A variante MM1.r desta linhagem celular é conhecida por ser resistente a dexametasona, e em consonância com essa propriedade, valores globais de Cl inferiores foram observados. As citocinas IL- 6 e IGF-1 são importantes fatores de crescimento no microambiente da medula 5 óssea do mieloma múltiplo e estão envolvidas na mediação de sinais pela via P13KIAKT. Acredita-se que os fatores de crescimento IL-6 e IGF-1 proporcionam quimiorr~sistê~cia e a adição de citocinas em cada uma das linhagens de células aumentou os valores do Índice de Combinação.

TABELA 6 COMBINAÇÃO DE Goc-0941 E DEXAMETASONA Linhagem celular Cl no ED50 Cl no ED75 Cl no ED90 MM1.S (sem IL6 ou IGF1) 0,15 0,17 0,19 MM1.S (+ IL6, + IGF1) 0,53 0,54 0,54 MM1.R (sem IL6 ou IGF1) 0,77 1,01 1,34 MM1.R (+ IL6, + IGF1) 0,85 0,92 1,00 OPM2 (sem IL6 ou IGF1) 0,46 0,37 0,30 OPM2 (+ IL6, + IGF1) 0,93 1,10 1,30 NCIH929 (sem IL6 ou IGF1) 0,48 0,41 0,35 NCIH929 (+ IL6, + IGF1) 1,08 1,39 1,80 KMS-11 (sem IL6 ou IGF1) 0,14 0,10 0,08 KMS-11 (+ IL6, + IGF1) 0,31 0,27 0,23 RPMI-8826 (sem IL6 ou 0,45 0,47 0,49 IGF1) RPMI-8826 (+ IL6, + IGF1) O, 19 0,09 0,04 U266 (sem IL6 ou IGF1) 1,45 4,74 15 Não Não Não U266 (+ IL6, + IGF1) calculado calculado calculado A Tabela 7 exibe os escores dos Índices de Combinação, calculados pelo método de Chou & Talalay, do tratamento de várias linhagens de células de malignidades hematopoiéticas na presença ou ausência de fatores de crescimento IL-6 e IGF-1 pela combinação terapêutica do composto de Fórmula la (GDC-0941) e lenalidomida. Algumas combinações exibem sinergia (IC < 0,8), aditividade (0,8-1,2), ou antagonismo (> 1,2). Os dados indicam que GDC-0941 combina favoravelmente com a lenalidomida. O valor Cl é mostrado em três pontos diferentes na curva dose-resposta, ED50, ED75, 5 e ED90 e para algumas linhagens de células, o fato de que valores Cl semelhantes são obtidos nesses diferentes pontos na curva dose-resposta, ~ndi~a que os ~ados são robustos e toda a curva de resposta foi deslocada para produzir uma resposta biológica aumentada no caso da combinação de agentes. Acredita-se que os fatores de crescimento IL-6 e IGF-1 proporcionam quimiorresistência e a adição de citocinas em cada uma das linhagens de células aumentou os valores do Índice de Combinação.

TABELA 7 COMBINACÃO DE GDC-0941 E LENALIDOMIDA Linhagem celular Cl no EDSO Cl no ED75 Cl no ED90 MM1,S (sem IL6 ou IGF1) 0,37 0,89 2,14 MM1,S (+ IL6, + IGF1) 1,01 1,06 1,11 MM1,R (sem IL6 ou IGF1) 0,61 0,74 0,91 MM1,R (+ IL6, + IGF1) 0,85 0,92 1,00 OPM2 (sem IL6 ou IGF1) 0,59 0,60 0,60 OPM2 (+ IL6, + IGF1) 0,70 0,78 0,86 NCIH929 (sem IL6 ou IGF1) 0,54 0,63 0,74 NCIH929 (+ IL6, + IGF1) 0,79 0,95 1,13 KMS-11 (sem IL6 ou IGF1) 0,53 0,72 0,96 KMS-11 (+ IL6, + IGF1) 0,89 0,96 1,04 RPMI-8826 (sem IL6 ou IGF1) 0,45 0,64 0,91 RPMI-8826 (+ IL6, + IGF1) 1,86 2,13 2,45 As respostas apoptóticas aos agentes únicos compostos Figura la e lb, e as combinações de: (i) composto de Figura la (GDC - 0941) e rapamicina, e (ii) composto de Figura lb e rapamicina em linhagens de células de mieloma múltiplo e linhagem de células de LMA, incluindo OPM2 e H929, foram medidos pela análise anexina V- FACS. As condições de seleção para a

--! 80 dosagem da IC50 s absoluta compreendeu: Dia1 - células em placas a 10.000 células/poço em uma placa de 384 poços em meio com 10% de SFB; Dia2 - Dosagem de células com a configuração do composto indicado. Quando a rapamicina foi utilizada em combinação com compostos de Figura la ou Figura 5 lb, a concentração de rapamicina nos meios de cultura foi de 0,1 IJM, e DiaS- ensaio Celltiter-Gio®. As populações apoptóticas medidas demosntraram sinergia com as combinações (i) e (ii). . --- -- Em células blásticas de pacientes com LMA, a combinação de Figura la GDC-0941 e um agente quimioterápico citarabina ou daunorrubicina 1o mostrou maior atividade anti-leucêmica em comparação com o GDC-0941 na forma de agente único, e a eficácia apopitótica melhorada com apenas 30% e 22% de células vivas remanescentes, respectivamente.

EFICÁCIA IN VIVO EM TUMORES XENOENXERTADOS A eficácia das combinações da invenção pode ser medida in vivo por meio da implantação de aloenxertos ou xenoenxertos de células de câncer em roedores e tratando os animais portadores de tumor com as combinações.

Resultados variáveis são esperados dependendo da linhagem de células, presença ou ausência de certas mutações nas células tumorais, sequencia de administração do composto de Fórmula I e agente quimioterapêutico, regime de dosagem, e outros fatores. Os camundongos sujeitos foram tratados com droga(s) ou controle (veículo) e monitorados ao longo de várias semanas ou mais para medir o tempo de duplicação do tumor, log de destruição de celular, e inibição do tumor (Exemplo 16). A Figura 7 exibe a variação do volume tumoral médio sobre 20 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma WSU-DLCL2 administrados no dia O com veículo (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween-80 em água DI), 73 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941 ), 5 mg/kg de rituximab, CHOP, e as combinações de 73 mg/kg de Fórmula la e 5 mg/kg de rituximab, e 73 mg/kg de Fórmula la e CHOP. Os camundongos foram tratados com CHOP, começando no dia O, e rituximab nos dias O, 7 e 14, enquanto a Fórmula la foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. Regime CHOP: ciclofosfamida (30 mg/kg, iv, qd x1), doxorrubicina (2,475 mg/kg, iv, qd 5 x1 ), vincristina (0,375 mg/kg, iv, qd x1 ), prednisona (0, 15 mg/kg, po, qd x5).

Ciclofosfamida, doxorrubicina e vincristina foram administradas uma vez no dia O e a prednisona foi administrada nos dias O, 1, 2, 3 e 4. Neste modelo, GDC- 0941, e a quimioterapia de combinação baseada em CHOP tiveram apenas atividade modesta. O tratamento com rituximab foi significativamente mais diferente do veículo (p < 0,01 pelo teste-t de Dunnett Controle). A combinação de GDC-0941 com rituximab foi significativamente melhor do que GDC-0941, mas não diferente do rituximab como monoterapia pela análise de log-rank. A combinação do GDC-0941 e CHOP deu uma melhoria significativa na eficácia em comparação com qualquer um dos agentes isolados.

A Figura 8 exibe a variação do volume tumoral médio sobre 34 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores DoHH-2 administrados no dia O com: Veículo (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween-80 em água DI), 73 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941 ), 5 mg/kg de rituximab, CHOP, e as combinações de 73 mg/kg de Fórmula la e 5 mg/kg de rituximab, e 100 mg/kg de Fórmula la e CHOP. Os camundongos foram tratados com rituximab no dia O, 7 e 14 (semanalmente 3x) por via intravenosa, CHOP começando no dia 1, enquanto a Fórmula la foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. Regime CHOP: ciclofosfamida (30 mg/kg, iv, qd x1), doxorrubicina (2,475 mg/kg, iv, qd x1), vincristina (0,375 mg/kg, iv, qd x1), prednisona (0, 15 mg/kg, po, qd x5). Ciclofosfamida, doxorrubicina e vincristina foram administradas uma vez no dia O e a prednisona foi administrada nos dias O, 1, 2, 3 e 4. Os coortes de quimioterapia CHOP ou GDC-0941 como monoterapia foram significativamente diferentes do veículo. A monoterapia com rituximab foi relativamente mais eficaz causando 2 respostas parciais e 4 respostas completas durante o tratamento. GDC-0941 não antagonizou significativamente a atividade do rituximab, no entanto, não forneceu atividade antitumoral adicional. Em contraste, a combinação de GDC-0941 com a 5 quimioterapia CHOP forneceu um aumento muito significativo do benefício sobre a atividade de qualquer agente único e produziu duas respostas parciais e 2 respostas completas. ~ ~- - --" -- - -- A Figura 9 exibe a variação do volume tumoral médio durante 27 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores DoHH2 tratados no dia O com: Veículo (0,5% Metilcelulose: 0,2% Tween-80 em água DI), 75 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941 ), CHOP, e as combinações de 75 mg/kg de Fórmula la e CHOP, 75 mg/kg de Fórmula la e 30 mg/kg de ciclofosfamida, 75 mg/kg de Fórmula la e 2,47 mg/kg de doxorrubicina, 75 mg/kg de Fórmula la e 0,38 mg/kg de vincristina, e 75 mg/kg de Fórmula la e O, 15 mg/kg de prednisona. Os camundongos foram tratados com CHOP no dia O, ciclofosfamida no dia O, doxorrubicina no dia O, vincristina no dia O, e prednisona diariamente nos dias 0-4, enquanto a Fórmula la foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. Os componentes do regime CHOP foram: ciclofosfamida (30 mg/kg, iv, qd x1), doxorrubicina (2,475 mg/kg, iv, qd x1 ), vincristina (0,375 mg/kg, iv, qd x1 ), prednisona (0, 15 mg/kg, po, qd x5).

Este experimento confirma e amplia os resultados da Figura 8 para demonstrar que. isoladamente GDC-0941 ·e CHOP possuem apenas atividade similar e moderada no modelo. Como antes, GDC-0941 combina com CHOP para fornecer um aumento muito significativo na atividade antitumoral.

Surpreendentemente, como isso não foi previsto a partir de experimentos in vitro, essencialmente toda a sinergia observada entre GDC-0941 e CHOP pode ser atribuída à combinação apenas do GDC-0941 com a vincristina, enquanto os outros três componentes do CHOP testado aos pares com o GDC-0941 não apresentaram maior eficácia.

A Figura 1O exibe a variação do volume tumoral médio durante 25 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma BJAB tratados no dia O com: Veículos (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween 5 80 em água DI), 73 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941), CHOP, e a combinação de Fórmula la 73 mg/kg e CHOP. Os camundongos foram tratados uma vez com CHOP, começando no dia O, enquanto a Fórmula la e os veículos foram -- - ·--- - -- -·- --- - -- administrados diariamente por 21 dias por gavagem oral. Regime CHOP: ciclofosfamida (30 mg/kg, iv, qd x1), doxorrubicina (2,475 mg/kg, iv, qd x1), vincristina (0,375 mg/kg, iv, qd x1 ), prednisona (0, 15 mg/kg, po, qd x5).

Ciclofosfamida, doxorrubicina e vincristina foram administradas uma vez no dia O e a prednisona foi administrada nos dias O, 1, 2, 3 e 4. Estes dados mostram no modelo de linfoma BJAB que o GDC-0941 ou a quimioterapia CHOP têm apenas atividade modesta e que a combinação destes aumentou a atividade, embora nenhum grupo tenha atingido significância estatística.

A Figura 11 exibe a variação do volume tumoral médio durante 25 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de tumores de linfoma BJAB tratados no dia O com: Veículos (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI ), 75 mg/kg de Fórmula la (GDC-0941 ), 5 mg/kg de rituximab, e a combinação de 75 mg/kg de Fórmula la e 5 mg/kg de rituximab. Os camundongos foram tratados com rituximab nos dias O, 7 e 14, enquanto a FórmtJia la e o veículo foram administrados diariamente por 21 dias (po, qd x21) por gavagem oral. Como na Figura 10, GDC-0941 como agente único teve apenas atividade modesta neste modelo de linfoma BJAB. A atividade do rituximab foi modesta em comparação com o GDC-0941 como agente único e não foi aumentada pela combinação com o GDC-0941. Neste estudo todos os grupos são significativamente diferentes de veículo pela análise log-rank.

A Figura 12 exibe a variação do volume tumoral médio durante 22 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxerto de mieloma múltiplo BJAB tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), e terapias de agentes únicos: 73 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21), 1 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x3), 25 mg/kg 5 de lenalidomida (ip, qd x21) e 10 mg/kg de dexametasona (po, 5 dias de administração/ 2 dias sem administração/4 dias de administração). A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. O bo-rtezomib foi administrado por v-ia intravenÕsa, nos dÍas O, 3, 7, fO, 14 e 17~ A lenalidomida foi administrada diariamente por 21 dias por meio de injeção 1o intraperitoneal. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7- 1O. Este experimento estabeleceu a atividade do GDC-0941 como agente único de similar aos tratamentos com lenalidomida ou dexametasona como agentes únicos, que foram ultrapassados pela eficácia do bortezomib. O bortezomib como tratamento de agente único resultou em três respostas parciais neste estudo.

A Figura 13 exibe a variação do volume tumoral médio durante 24 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de células de mieloma múltiplo OPM-2 tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de Metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), terapias com agente único: 73 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21), 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x3), 25 mg/kg de lenalidomida (ip, 5 dias de administração/2 dias sem administração/5 dias com administração/2 dias sem administração/5 dias com administração), e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5 dias de administração/2 dias sem administração/5 dias de administração); e as combinações de: 73 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21) e 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/Sem. x3); 73 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21) e 25 mg/kg lenalidomida (ip, 5/2/5/2/5 ) e 73 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ) e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5). A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. O bortezomib foi administrado por via intravenosa, nos dias O, 3, 7, 10, 14 e 17. A lenalidomida foi administrada nos dias 0-4, 7-11 e 14-18 por injeção intraperitoneal. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7-11. Uma dose 5 reduzida de bortezomib neste experimento resultou em uma resposta sub- clínica, que não foi diferente da encontrada com a administração do veículo. Os coortes tratados com agente único GDC-0941, lenalidomida ou dexametasona -·-- - tiveram uma atividade tumoral moderada e indistinguível, embora a adição dê GDC-0941 à dexametasona tendeu a um aumento da atividade antitumoral.

1o Este resultado foi previsto a partir dos estudos in vitro anteriores com linhagens de células, mas não previsível a partir de estudos anteriores publicados na literatura.

A Figura 14 exibe a variação do volume tumoral médio durante 27 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de células de mieloma múltiplo MM1.s tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), 73 mg/kg de Fórmula la GDC- 0941 (po, qd x21), 1 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x2.5), 25 mg/kg de lenalidomida (ip, qd x21) e 10 mg/kg de dexametasona (po, 5 dias de administração/ 2 dias sem administração/5 dias de administração). A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem oral. O bortezomib foi administrado por via intravenosa, nos dias O, 3, 7, 10 e 14. A lenalidomida foi administrada diariamente por 21 dias por meio de injeção intraperitoneal. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7-

11. Este experimento estabeleceu a atividade do GDC-0941 na forma de agente único como semelhante aos tratamentos com lenalidomida, bortezomib, ou dexametasona como agentes únicos. A Figura 15 exibe a variação do volume tumoral médio durante 40 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de células de mieloma múltiplo MM1.s tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), terapias com agente único: 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21), 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x3), e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5); e as combinações: 75 5 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ) e 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/semana x3), e 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21) e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5). A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 diàs-por gavagem oral. O bortezomib foi àdministrado por via intravenosa, nos dias O, 3, 7, 10, 14 e 17. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7-11. O modelo MM1.s foi relativamente refratário a estes tratamentos com agentes únicos e combinações com uma exceção; consistente com os experimentos in vitro, pela combinação de GDC-0941 e dexametasona que apresentaram excelente atividade em comparação com os componentes administrados como agentes únicos. Surpreendente e inesperadamente, durante o tempo que o coorte GDC - 0941 e dexametasona estavam em tratamento como drogas combinadas, os tumores regrediram produzindo 7 respostas parciais. Nenhum outro grupo neste estudo produziu respostas objetivas. Quando o tratamento com dexametasona foi interrompido no dia 11, os tumores deixaram de regredir e cresceram a uma taxa consistente com o GDC-0941 a continuado. Estes dados indicam claramente a eficácia inesperada da combinação de dexametasona e GDC-0941.

A Figura 16 exibe a variação do volume tumoral médio durante 33 dias em coortes de 1O camundongos com xenoenxertos de células de mieloma múltiplo NCL-H929 tratados no dia O com: Veículo (po, qd x21) (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI) terapias com agente único: 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ), 0,5 mg/kg de bortezomib (iv, 2x/sem. x3), 25 mg/kg de lenalidomida (ip, 5/2/5/2/5), e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5); e as combinações: 75 mg/kg de Fórmula la GDC -

0941 (po, qd x21 ) e 0,5 mg/kg bortezomib (iv, qd. x3), 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21 ) e 25 mg/kg de lenalidomida (ip, 5/2/5/2/5) e 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x14) e 3 mg/kg de dexametasona (po, 5/2/5).

A Fórmula 1a GDC-0941 foi administrada diariamente por 21 dias por gavagem 5 oral. O bortezomib foi administrado por via intravenosa, nos dias O, 3, 7, 10, 14 e 17. A lenalidomida foi administrada nos dias 0-4, 7-11 e 14-18 por injeção intraperitoneal. A dexametasona foi administrada por via oral nos dias 0-4 e 7-

11. No modelo H929, a adição de GDC-0941 nos grupos de combinação aumentou significativamente a atividade modesta do bortezomib, lenalidomida e dexametasona como agentes únicos. A Figura 17 exibe a variação do volume tumoral médio durante 33 dias para coortes experimentais de 1O camundongos por grupo carregando xenoenxertos de linhagem de célula tumoral de linfoma humano DoHH2 tratados no dia O com: Veículo (po, qd x 20) (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), terapias de agentes únicos: 75 mg/kg ou 100mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x20 ), 2,5 mg/kg ou 4 mg/kg Fórmula lb (po, qd x20 ), 6 mg/kg de rapamicina (ip, qseman. x3), ou terapias de combinação: 75 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x20) mais 6 mg/kg de rapamicina (ip, qsemanal. x3), ou 2,5 mg/kg de Fórmula lb (po, qd x20) mais 6 mg/kg rapamicina ( ip, semanal. x3). A rapamicina exibiu pouco ou nenhum efeito significativo sobre o crescimento do tumor, enquanto que os tratamentos com agentes únicos mostram inibição dose-dependente do crescimento tumoral, enquanto ambas as combinações mostram uma supressão aumentada de forma significativa no crescimento do tumor. A Figura 18 exibe a variação do volume tumoral médio durante 25 dias para coortes experimentais de 1O camundongos por grupo carregando xenoenxertos de linhagem de célula tumoral de linfoma humano WSU-DLCL2 pré-estabelecidos tratados no dia O com: Veículo (po, qd x 20) (0,5% de metilcelulose: 0,2% de Tween 80 em água DI), terapias de agentes únicos: 60mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x21), 1 mg/kg de Fórmula lb (po, qd x21), 6 mg/kg de rapamicina (ip, qd x21), ou terapias de combinação: 60 mg/kg de Fórmula la GDC-0941 (po, qd x18) mais 6 mg/kg de rapamicina (ip, qd x18), 5 ou 1 mg/kg de Fórmula lb (po, qd x18) mais 6 mg/kg rapamicina (ip, qd. X18).

Os tratamentos com agentes únicos mostram pouco efeito sobre o crescimento do tumor, enquanto as combinações exibiram um significativo aumento na supressão do crescimento do tumor.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS As composições ou formulações farmacêuticas da presente invenção incluem combinações de compostos de formula I, um agente quimioterápico e um ou mais veículos, deslizantes (glidants), diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos de fórmula I e agentes quimioterápicos de acordo com a presente invenção podem existir tanto em formas solvatadas quanto não solvatadas com solventes farmaceuticamente aceitáveis tais como água, etanol e similares, e pretende-se que a invenção inclua tanto formas solvatadas quanto não solvatadas.

Os compostos de fórmula I e agentes quimioterápicos de acordo com a presente invenção podem existir em diferentes formas tautoméricas, e todas as formas estão englobadas no escopo da presente invenção. O termo "tautômero" ou "forma tautomérica" refere-se a isômeros estruturais de energias diferentes, que são interconversíveis por uma barreira de baixa energia. Por exemplo, tautômeros de próton (também conhecidos por tautômeros prototrópicos) incluem interconversões pela migração de um próton, tal como isomerizações ceto-enol e imina-enamina. Tautômeros de valência incluem interconversões pela reorganização de alguns elétrons de ligação.

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As composições farmacêuticas incluem tanto composição em massa (bulk) quanto unidades de dosagem individual compreendidas de mais de um (por exemplo, dois) agentes farmaceuticamente ativos incluindo um composto de fórmula I e um agente quimioterápico selecionados a partir da 5 lista de agentes adicionais descrita no presente, em conjunto com qualquer excipiente, diluente, veículo ou deslizante farmaceuticamente inativo. A composição em massa e cada unidade de dosagem individual pode conter quantidades fixadas dos agentes farmaceuticamente ativos descritos acima. A composição em massa é um material que ainda não foi formado em unidades de dosagem individuais. Uma unidade de dosagem ilustrativa é uma unidade de dosagem oral tais como comprimidos, pílulas, cápsulas, e similares. De forma similar, os métodos de tratamento de um paciente pela administração de uma composição farmacêutica são também destinados a compreender a administração da composição em massa e unidades de dosagem individuais.

As composições farmacêuticas também incluem compostos isotopicamente marcados da presente invenção, que são idênticos aos compostos aqui descritos, exceto pelo fato de que um ou mais átomos são substituídos por um átomo que possui uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa normalmente encontrado na natureza. Todos os isótopos de qualquer átomo ou elemento particular, como especificado, são contemplados pelo escopo dos compostos da presente invenção, e seus usos. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da presente invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flúor, cloro e iodo, tais como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 150, 170, 1aO, 32p, 33p, 35S, 1aF, 36CI, 1231 e 125 1. Certos compostos isotopicamente marcados da presente invenção (tais como os compostos marcados com 3H e 14C) são úteis em ensaios de distribuição do composto e/ou substrato no tecido. Isótopos tritiados eH) e de carbono- 14 C4 C) são úteis pela sua facilidade de preparação e detectabilidade. Ainda, substituição com isótopos mais pesados, como o deutério eH) pode oferecer certas vantagens terapêuticas resultantes de uma maior estabilidade metabólica (por exemplo, aumento da meia vida in vivo ou requisitos de 5 dosagem reduzidos) e, portanto, pode ser preferível, em algumas 15 13 11 18 circunstâncias. Isótopos emissores de pósitrons, tais como 0, N, Ce F são úteis para estudos de tomografia de emissão de pósitrons (PET), para "-~" examinar a ocupação dos receptores do substrato. Os compostos isotopicamente marcados da presente invenção podem geralmente ser 1o preparados seguindo-se procedimentos análogos aos descritos nos esquemas e/ou exemplos da presente invenção descritos abaixo no presente, pela substituição de um reagente isotopicamente marcado por um reagente não isotopicamente marcado.

Os compostos de fórmula I e agentes quimioterápicos são formulados de acordo com práticas farmacêuticas padrões para uso na combinação terapêutica para tratamento terapêutico (incluindo tratamento profiláctico) de disfunções hiperproliferativas em mamíferos, incluindo humanos. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula I em associação com um ou mais veículos, deslizantes, diluentes, aditivos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Veículos, diluentes, aditivos e excipientes apropriados são bem conhecidos dos técnicos no assunto e incluem materiais tais como carboidratos, ceras, polímeros solúveis e/ou expansíveis em água, materiais hidrofílicos ou hidrofóbicos, gelatina, óleos, solventes, água e similares. O veículo, diluente ou excipiente particular utilizado dependerá dos meios e propósitos para os quais o composto da presente invenção está sendo aplicado. Os solventes são geralmente selecionados com base em solventes reconhecidos pelos técnicos no assunto como seguros (GRAS) a serem administrados em mamíferos. De forma geral, solventes seguros são solventes aquosos não tóxicos tais como água e outros solventes não tóxicos que são solúveis ou miscíveis em água. Solventes aquosos apropriados incluem água, 5 etanol, propilenoglicol, polietilenoglicol (por exemplo, PEG 400, PEG 300), dimetilsulfóxido (DMSO), cremofor (por exemplo, CREMOPHOR EL®, BASF), e suas misturas. As formulações podem ainda incluir um ou mais tampões, ----· --- agentes estabilizantes, tensoativos, agentes umectantes, agentes lubrificantes, emulsificantes, agentes de suspenção, conservantes, antioxidantes, agentes opacificantes, deslizantes, agentes auxiliares, colorantes, adoçantes, agentes de perfume, agentes aromatizantes, e outros aditivos conhecidos para fornecer uma apresentação adequada da droga (por exemplo, um composto da presente invenção ou composição farmacêutica do mesmo) ou auxiliar na fabricação do produto farmacêutico (por exemplo, medicamento).

As formulações podem ser preparadas utilizando dissolução convencional e procedimentos de mistura. Por exemplo, a substância de droga em massa (tal como o composto da presente invenção) ou uma forma estabilizada do composto (tal como um complexo com um derivado de ciclodextrina ou outro agente conhecido de formação de complexo) é dissolvida em um solvente apropriado na presença de um ou mais dos excipientes descritos acima. O composto da presente invenção é tipicamente formulado em formas de dosagens farmacêuticas para fornecer uma dosagem facilmente controlável da droga e para permitir a aceitação do paciente para com o regime prescrito.

A composição farmacêutica (ou formulação) para aplicação pode ser embalada de uma variedade de formas, dependendo do método utilizado para administração da droga. De forma geral, um artigo para distribuição inclui um recipiente sobre o qual foi depositada a formulação farmacêutica em uma forma apropriada. Recipientes apropriados são bem conhecidos dos técnicos no assunto e incluem materiais tais como garrafas (plástica e de vidro), sachês, ampolas, bolsas plásticas, cilindros metálicos e similares. O recipiente pode ainda incluir um conjunto inviolável para evitar o acesso indiscriminado ao 5 conteúdo do pacote. Ainda, o recipiente contém um rótulo que descreve os componentes presentes no recipiente. O rótulo pode também incluir recomendações apropriadas. --- As formulações farmacêuticas dos compostos da presente invenção podem ser preparadas para diversas vias ou tipos de administração. 1o Por exemplo, um composto de fórmula I que possui o grau desejado de pureza pode opcionalmente ser misturado com diluentes, veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences (1995) 18th edition, Mack Publ. Co., Easton, PA), na forma de uma formulação liofilizada, pó moído ou uma solução aquosa. A formulação pode ser conduzida pela mistura a temperatura ambiente e em pH apropriado, e a um grau de pureza desejado, como veículos fisiologicamente aceitáveis, tais como veículos que são não tóxicos aos pacientes nas dosagens e concentrações empregadas. O pH da formulação depende principalmente do uso particular e da concentração do composto, mas pode variar de cerca de 3 a cerca de 8. A formulação farmacêutica é preferencialmente estéril. Em particular, as formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Tal esterilização é facilmente alcançada pela filtração através de membranas de filtração estéreis.

A formulação farmacêutica pode normalmente ser armazenada como composição sólida, formulação liofilizada ou como uma solução aquosa. As formulações farmacêuticas da presente invenção serão dosadas e administradas conforme um estilo, ou - seja, quantidades,

_, concentrações, horários, curso, veículos e via de administração consistentes com as boas práticas médicas. Fatores para consideração neste contexto incluem a disfunção particular a ser tratada, o mamífero especifico a ser tratado, a condição clínica do paciente específico, a causa de doença, o local 5 de fornecimento do agente, o método de administração, e outros fatores conhecidos dos técnicos no assunto. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do composto a ser administrado será determinada com base em tais considerações, e é a mínima quantidade necessária para prevenir, -melhorar, ou tratar a disfunção mediada por fator de coagulação. Tal quantidade é 10 preferencialmente abaixo da quantidade que é tóxica ao hospedeiro ou que torna o hospedeiro significativamente mais suscetível ao sangramento.

A quantidade farmaceuticamente eficaz inicial do composto de fórmula I administrado oralmente ou parenteralmente por dose estará na faixa de cerca de 0,01 a 1000 mg/kg, em particular cerca de O, 1 a 20 mg/kg do peso 15 corporal do paciente por dia, com a faixa inicial típica do composto utilizado sendo de 0,3 a 15 mg/kg/dia. A dose do composto de fórmula I e a dose do agente quimioterápico a ser administrado pode variar, para cada uma, de cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg por forma de dosagem unitária, ou de cerca de 1O mg a cerca de 100 mg por forma de dosagem unitária. As doses do composto 20 de fórmula I e do agente quimioterápico podem ser administradas em uma razão de cerca de 1:50 a cerca de 50:1 em peso, ou em uma razão de cerca de a 1:1 o cerca de 10:1 em peso.

Os diluente, veículos, excipientes e estabilizantes aceitáveis são não tóxicos aos pacientes nas dosagens e concentrações empregadas, e 25 incluem tampões, tal como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabenos; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 1O resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como 5 polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos il}clulndo- glicose, - manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais -· - . - - como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose, ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN®, CREMOPHOR EL®' PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Os ingredientes farmaceuticamente ativos pode ainda ser colocados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas coloidais de fornecimento de droga (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, (1995) Mack Publ. Co., Easton, PA.

Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada de compostos de fórmula I. Exemplos apropriados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo um composto de fórmula I, em que as matrizes estão na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2- hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinil álcool)}, polilactídeos (US 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etii-L-glutamato, acetato de etileno- vinil não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRON DEPO-r® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli- O(-) 3-hidroxibutírico.

As formulações farmacêuticas incluem aquelas apropriadas para 5 as vias de administração detalhadas no presente. As formulações podem, convenientemente, ser apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. As técnicas e formulações são geralmente encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences 18a Ed. (1995) Mack Publishing Co., Easton, PA. Tais métodos incluem a etapa de associação do ingrediente ativo com o veículo, que constitui um ou mais ingredientes acessórios. De forma geral, as formulações são preparadas pela associação íntima e uniforme do ingrediente ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos, ou ambos, e então, se necessário, o produto é moldado.

As formulações de um composto de fórmula I e/ou agente quimioterápico apropriadas para administração oral podem ser preparadas como unidades distintas, tais como pílulas, macias ou rígidas, tais como cápsulas de gelatina, capsulas (cachets), pastilhas (troches), pastilhas (lozenges), suspensões oleosas ou aquosas, pós ou grânulos dispersíveis, emulsões, xaropes ou elixires, cada uma contendo uma quantidade previamente determinada de um composto de fórmula I e/ou um agente quimioterápico. A quantidade do composto de fórmula I e a quantidade do agente quimioterápico podem ser formuladas em uma pílula, cápsula, solução ou suspensão como uma formulação combinada. De forma alternativa, o composto de fórmula I e o agente quimioterápico podem ser formulados de forma separada em uma pílula, cápsula, solução ou suspensão para administração alternada. As formulações podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido no estado da técnica para a fabricação de composições farmacêuticas e tais composições podem conter um ou mais agentes incluindo agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes, e agentes conservantes, a fim de fornecer uma preparação saborosa. Comprimidos 5 obtidos por compressão podem ser preparados pela compressão em uma máquina apropriada do ingrediente ativo em uma forma livre de corrente, tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um aglutinante, lubrificante, dilUente inerte, consêrvante, tensoativo, o-ü--agente dispersanfe: - Comprimidos moldados podem ser produzidos pela moldagem em uma máquina apropriada de uma mistura do ingrediente ativo em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos ou protegidos e, opcionalmente, são formulados de forma a fornecer uma liberação controlada ou retardada do ingrediente ativo dos mesmos.

Os excipientes de comprimidos de uma formulação farmacêutica da presente invenção podem incluir: carga (ou diluente) para aumentar o volume em massa da droga em pó de forma a produzir o comprimido; desintegrantes, para estimular o comprimido a quebrar-se em pequenos fragmentos, idealmente em partículas individuais da droga, quando ingerido e promove a rápida dissolução e absorção da droga; um aglutinante para assegurar que os grânulos e comprimidos possam ser formados com a força mecânica necessária e para manter o comprimido junto após ter sido comprimido, prevenindo assim que ele se quebre em seus componentes em pó durante a embalagem, transporte e manuseio de rotina; um deslizante para aprimorar a fluidez do pó que compõe o comprimido durante a produção; um lubrificante para assegurar que o pó a ser comprimido não fique aderido ao equipamento utilizado para pressionar o comprimido durante a fabricação. Ele aprimora o fluxo das misturas de pó através das prensas e minimizam o atrito e quebra como os comprimidos acabados são ejetados do equipamento; um antiaderente com função similar a do deslizante, reduzindo a adesão entre o pó que compõe o comprimido e a máquina utilizada para dar forma ao comprimido durante a fabricação; um sabor incorporado aos comprimidos para dar um sabor mais aceitável ou mascarar um sabor desagradável, e colorante para 5 ajudar a identificação e para aceitação do paciente.

Os comprimidos que contém o ingrediente ativo em combinação com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos que são apropriados para a fabricação de comprimidos são aceitàvéis. Tais excipientes podem ser~ por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio ou sódio, lactose, fosfato de cálcio ou sódio, agentes desintegrantes e de granulação, tais como amido de milho, ou ácido algínico; agentes aglutinantes, tais como amido, gelatina ou acácia; e agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos a partir de técnicas conhecidas, incluindo microencapsulação para retardar a desintegração e adsorção no trato gastrointestinal e fornecendo assim uma ação sustentada por um período mais longo. Por exemplo, pode ser empregado um material de retardo de tempo tal como monoestearato de gliceril ou diestearato de gliceril sozinho ou com uma cera.

Para o tratamento dos olhos ou outros tecidos externos, tais como boca e pele, as formulações são preferencialmente aplicadas como um óleo ou creme tópico contendo o ingrediente ativo em uma quantidade de, por exemplo, de~ 0,075 a 20% p/p. Quando formulada como óleo, os ingredientes ativos podem ser empregados com uma base oleosa miscível em água ou base parafínica. De modo alternativo, os ingredientes ativos podem ser formulados em um creme, com uma base cremosa óleo-em-água.

A fase aquosa da base cremosa pode incluir álcool polihídrico, tal como um álcool que possui dois ou mais grupos hidroxila, tais como propilenoglicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol e polietilenoglicol

---------- 98 (incluindo PEG 400) e suas misturas. As formulações tópicas podem incluir, de forma desejada, um composto que aumenta a absorção ou penetração do ingrediente ativo através da pele ou outras áreas afetadas. Exemplos de tais compostos que aprimoram a penetração dermal incluem sulfóxido de dimetila e 5 análogos relacionados. A fase oleosa das emulsões da presente invenção pode ser constituída por ingredientes conhecidos de uma maneira conhecida, incluindo uma mistura de pelo menos um emulsificante com uma gordura ou um óleo, ou com ambos a gordura e o óleo. De forma preferencial, um emulsificante 1o hidrofílico é incluído junto com um emulsificante lipofílico que atua como estabilizante. Juntos, os emulsificantes com ou sem estabilizantes compõem uma cera emulsificante, e a cera junto com o óleo e a gordura compreende uma base oleosa emulsificante que forma_ a fase oleosa dispersa das formulações cremosas. Os emulsificantes e estabilizantes de emulsão 15 apropriados para uso na formulação da presente invenção incluem Tween® 60, Span® 80, álcool cetoestearílico, álcool benzílico, álcool miristílico, mono- estearato de gliceril e laurilsulfato de sódio.

Suspensões aquosas das formulações farmacêuticas da presente invenção contém os materiais ativos em mistura com excipientes apropriados 20 para a fabricação de suspensões aquosas. Tais excipientes incluem agentes de suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, croscarmelose, povidona, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia, e agentes umectantes ou de dispersão, tais como fosfatida de ocorrência natural (tal como lecitina), um 25 produto de condensação de um óxido de alquileno com um ácido graxo (tal como estearato polioxietileno), um produto de condensação de um óxido de etileno com um álcool alifático de cadeia longa (tal como heptadecaetilenooxicetanol), um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um anidrido de hexitol (tal como monooleato de polioxietileno sorbitan). A suspensão aquosa pode ainda conter um ou mais conservantes tais como p-hidroxibenzoato de etil ou n- propil, um ou mais agentes colorantes, um ou mais agentes aromatizantes, e 5 um ou mais agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina.

As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma preparação injetável estéril, tal como uma suspensão aquosa ou oleosa injetável estéril. Tal suspensão pode ser formulada de acordo com o estado da técnica utilizando os agentes umectantes e de dispersão apropriados e agentes de suspensão descritos acima. A preparação injetável estéril pode ser uma solução ou uma suspensão em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não tóxico, tal como uma solução em 1,3-butanodiol ou preparada a partir de pó liofilizado. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão a água, a solução de Ringer e a solução de cloreto de sódio isotônica. Ainda, óleos fixados estéreis podem ser convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixado suave pode ser empregado, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, os ácidos graxos tais como ácido oléico podem da mesma forma ser utilizados na preparação de injetáveis.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com o material carreador para produzir uma forma de dosagem unitária irá variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração particular. Por exemplo, uma formulação de liberação temporal destinada a administração oral em humanos pode conter aproximadamente 1 a 1000 mg do material ativo composto com uma quantidade conveniente e apropriada de material carreador que pode variar de cerca de 5 a cerca de 95% das composições totais (peso:peso). A composição farmacêutica pode ser preparada para fornecer quantidades facilmente medidas para administração. Por exemplo, uma solução aquosa destinada infusão intravenosa pode conter de cerca de 3 a 500 IJg de ingrediente ativo por mililitro da solução, a fim de que ocorra uma infusão de volume adequado a uma velocidade de cerca de 30 mllhr. Formulações apropriadas para administração parenteral 5 incluem soluções injetáveis estéreis não aquosas e aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que geram a formulação isotônica com o sangue do sujeito destinado; e suspensões estéreis aquosas e não aquosa·s- que podem incluir a·gentes.de suspensão e agentes espessantes.

Formulações apropriadas para administração tópica para os olhos incluem ainda colírios, em que o ingrediente ativo é dissolvido ou suspendido em um veículo apropriado, especialmente um solvente aquoso para o ingrediente ativo. O ingrediente ativo está preferencialmente presente em tais formulações em uma concentração de cerca de 0,5 a 20% p/p, por exemplo cerca de 0,5 a 10% p/p, por exemplo cerca de 1,5% p/p.

Formulações apropriadas para administração tópica na boca incluem pastilhas que compreendem o ingrediente ativo em uma base aromatizada, normalmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas que compreendem o ingrediente ativo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e soluções para bochechas que compreende o ingrediente ativo em um veículo líquido apropriado.

Formulações para administração retal podem estar presentes como um supositório com uma base apropriada que compreende, por exemplo, manteiga de cacau ou salicilato.

Formulações apropriadas para administração nasal ou intrapulmonar possuem um tamanho de partícula, por exemplo, na faixa de O, 1 a 500 mícron (incluindo tamanhos de partículas na faixa de O, 1 a 500 mícron em mícron intermediários, tais como 0,5, 1, 30 mícron, 35 mícron,

etc.), que é administrado por inalação rápida pela passagem nasal ou inalação pela boca, de forma a alcançar os sacos alveolares. Formulações apropriadas incluem soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo.

Formulações apropriadas para administração aerossol ou de pó seco 5 podem ser preparadas de acordo com métodos convencionais e podem ser fornecidas com outros agentes terapêuticos tais como compostos até agora _utili~ado_s no tratamento ou profilaxia de doenças conforme descritos abaixo.

As formulações apropriadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em spray contendo, além do ingrediente ativo, veículos conhecidos no estado da técnica como apropriados.

As formulações podem ser embaladas em recipientes de múltiplas dosagens ou de dosagem unitária, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenados em uma condição de congelamento a seco (liofilizadas) que requer apenas a adição de veículo líquido estéril, por exemplo, água, para injeção imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões de injeção extemporâneas são preparadas a partir de pós-estéreis, grânulos e comprimidos dos tipos anteriormente descritos. Formulações em dosagem unitárias preferidas são aquelas que contêm uma dose diária ou uma sub-dose diária unitária, conforme citado acima no presente, ou sua fração apropriada, do ingrediente ativo.

A presente invenção fornece adicionalmente composições veterinárias que compreendem pelo menos um ingrediente ativo conforme definido acima, junto com um veículo veterinário do mesmo. Veículos veterinários são materiais úteis para os propósitos de administração da composição, e podem ser materiais sólidos, líquidos ou gasosos que são, de maneira diferente, inertes ou aceitáveis no estado da técnica da veterinária e são compatíveis com o ingrediente ativo. Tais composições veterinárias podem ser administradas parenteralmente, oralmente ou por qualquer outra via desejada.

TERAPIA COMBINADA 5 Os compostos de fórmula I podem ser empregados em combinação com certos agentes quimioterápicos para o tratamento de malignidade - - hematopoiética, junto com disfunções hiperproliferativas não ~ - ·- malignas ou não neoplásicas e pré-malignas. Em algumas realizações, um composto de fórmula I é combinado em uma formulação de combinação 1o farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia combinada, com um agente quimioterápico que possui propriedades anti-hiperproliferativas ou que é útil para o tratamento da malignidade hematopoiética. O agente quimioterápico da formulação de combinação farmacêutica ou do regime de dosagem possui preferencialmente atividades complementares ao composto de fórmula I, e de forma que não afetem de forma adversa um ao outro. Tais compostos da combinação terapêutica podem ser administrados em quantidade que são eficazes para os propósitos desejados. Em uma realização, uma formulação farmacêutica da presente invenção compreende um composto de fórmula I e um agente quimioterápico tal como descrito no presente. Em outra realização, a combinação terapêutica é administrada por um regime de dosagem em que a quantidade terapeuticamente eficaz do composto de fórmula I é administrada em uma faixa que varia de duas vezes ao dia até uma vez a cada três semanas (qsem 3x), e a quantidade terapeuticamente eficaz do agente quimioterápico é administrada separadamente, em alternação, em um faixa que vai de duas vezes ao dia até uma vez a cada três semanas. Combinações terapêuticas da presente invenção incluem um produto que compreende um composto de fórmula I e um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina,

vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina, como uma preparação combinada para uso separado, simultâneo ou sequencial no tratamento de uma disfunção hiperproliferativa.

5 A terapia combinada pode ser administrada como um regime simultâneo ou sequencial. Quando sequencialmente administrada, a _combinação_ po_de _§er _adm_inist_rad~_ em duas ou mais administrações. A administração combinada inclui coadministração, utilizando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica unitária, e administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferencialmente há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.

Dosagens apropriadas para qualquer um dos agentes coadministrados acima são aquelas atualmente utilizadas e podem ser mais baixas devido a ação combinada (sinergia) do novo agente identificado e outros agentes quimioterápicos ou tratamentos, de forma a aumentar o índice terapêutico ou mitigar a toxicidade ou outros efeitos ou consequências colaterais.

Em uma realização particular de terapia anticâncer, a combinação terapêutica pode ser combinada com terapia cirúrgica e radioterapia, como terapia adjuvante. As terapias combinadas de acordo com a presente invenção incluem a administração de pelo menos um composto de fórmula I e um ou mais métodos ou modalidades adicionais de tratamento. As quantidades de compostos de fórmula I e agentes quimioterápicos e os relativos tempos de administração serão selecionados a fim de alcançar o efeito terapêutico combinado desejado.

ADMINISTRAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS As combinações terapêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer via apropriada para a condição a ser tratada. Vias apropriadas incluem oral, parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, inalação, intradermal, intratecal, epidural, e técnicas de infusão), transdermal, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), 5 vaginal, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal. A administração tópica pode ainda envolver o uso de administração transdermal tal como emplastros transdermais ou dispositivos iontoforese. A formulação de drogas é discutida ~~· ·-- -- ------ ---- em Remington's Pharmaceutical Sciences, 183 Ed., (1995) Mack Publishing Co., Easton, PA. Outros exemplos de formulações de drogas podem ser encontrados em Liberman, H. A. e Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Mareei Decker, Vol 3, 2nd Ed., New York, NY. Para tratamento lmunossupressor local, os compostos podem ser administrados por administração intralesional, incluindo perfusão ou outro tipo de contato com o enxerto com o inibidor antes do transplante. Será apreciado que a via preferida irá variar de acordo com, por exemplo, a condição do paciente. Onde o composto é administrado oralmente, ele pode ser formulado como uma pílula, cápsula, comprimido, etc. com um veículo, deslizante ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Onde o composto é administrado parenteralmente, ele pode ser formulado com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, e em uma forma de dosagem injetável unitária, conforme detalhado abaixo.

Uma dosagem para o tratamento de pacientes humanos pode variar de cerca de 1O mg a cerca de 1000 mg do composto de fórmula I, tal como cerca de 100 mg a cerca de 300 mg do composto. Uma dosagem pode ser administrada uma vez ao dia (QD), duas vezes ao dia (810), ou mais frequentemente, dependendo das propriedades de farmacocinética (PK) e farmacodinâmica (PD), incluindo absorção, distribuição, metabolismo, e excreção do composto particular. Ainda, os fatores de toxicidade podem

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influenciar a dose e a administração do regime de dosagem. Quando administrado oralmente, a pílula, cápsula ou comprimido podem ser ingeridos duas vezes ao dia, uma vez ao dia, ou menos frequentemente tal como semanalmente ou uma vez a cada duas ou três semanas por um período de 5 tempo específico. O regime de dosagem pode ser repetido por uma série de ciclos terapêuticos.

MÉTODOS DE TRATAMENTO Combinações terapêuticas de: (1) um composto de fórmula I e (2) um agente quimioterápico são úteis para o tratamento de doenças, condições 10 e/ou disfunções incluindo, mas sem limitar-se a, aquelas caracterizadas pela ativação da via de Pl3 quinase. Desta forma, outro aspecto da presente invenção inclui métodos para o tratamento de doenças ou condições que podem ser tratadas pela inibição das quinases lipídicas, incluindo Pl3. Em uma realização, um método para o tratamento de uma malignidade hematopoiética 15 compreende a administração de uma combinação terapêutica como uma formulação combinada, ou por alternação, a um mamífero, em que a combinação terapêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes quimioterápicos selecionados a partir de dexametasona, 20 tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina. As combinações terapêuticas de: (1) um composto de fórmula I ou 11 e (2) um agente quimioterápico podem ser empregadas para o tratamento de doenças ou disfunções hiperproliferativas incluindo tumores, cânceres, e tecidos 25 neoplásicos, junto com disfunções hiperproliferativas não malignas ou não neoplásicas e pré-malignas. Em uma realização, um paciente humano é tratado com uma combinação terapêutica e um veículo, adjuvante, ou carreador farmaceuticamente aceitável, em que o composto de fórmula I, ou seu metabólito, de dita combinação terapêutica está presente em uma quantidade para inibir de forma detectável a atividade de Pl3 quinase. Malignidades hematopoiéticas incluem linfoma não- Hodgkin, linfoma difuso de grandes células hematopoiéticas, linfoma folicular, linfoma 5 de células do manto, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, LMA, LMC.

Outro aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutiCa ou co-mbinaÇão terápêutica-para uso no fratamento das -doenças ou condições descritas no presente em mamíferos, por exemplo, um humano, que sofre de tal doença ou condição. É ainda fornecido o uso de uma composição farmacêutica na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças e condições descritas no presente em um animal de sangue quente, tal como mamífero, por exemplo, um humano, que sofre de tal disfunção.

METABÓLITOS DE COMPOSTOS DE FóRMULA I Faz ainda parte do escopo de proteção da presente invenção os produtos metabólicos in vivo dos compostos de fórmula I descritos no presente. Tais produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, hidrólise, amidação, deamidação, esterificação, desesterificação, clivagem enzimática, e similares, do composto administrado. Desta forma, a presente invenção inclui os metabólitos dos compostos de fórmula I, incluindo compostos produzidos por um processo que compreende colocar o composto da presente invenção em contato com um mamífero por um período de tempo suficiente para gerar um produto metabólico do mesmo.

Produtos metabólitos são tipicamente identificados pela preparação de um isótopo radiomarcado (tal como 14C ou 3H) de um composto da presente invenção, administrando o mesmo de forma parenteral em uma dosagem detectável (tal como superior a cerca de 0,5 mg/kg) a um anima tal como rato, camundongo, porquinho da índia, macaco, ou homem, permitindo tempo suficiente para que o metabolismo ocorra (tipicamente cerca de 30 segundos a 30 horas) e isolando seus produtos de conversão a partir da urina, sangue ou 5 outras amostras biológicas. Tais produtos são facilmente isolados uma vez que são marcados (outros são isolados pelo uso de anticorpos capazes de se ligar a epítopos que sobreviveram no metabolismo). As estruturas do metabolito são --·- ---- determinadas de forma convencional, tal como por análise MS, LC/MS ou RMN.

De forma geral, a análise dos metabólitos é realizada da mesma forma de estudos do metabolismo de drogas convencionais, bem conhecidos no estado da técnica. Os produtos metabólitos, desde que não sejam de outra maneira encontrados in vivo, são úteis para os ensaios de diagnóstico para dosagem terapêutica dos compostos da presente invenção.

ARTIGOS DE MANUFATURA Em outra realização da presente invenção, é fornecido um artigo de manufatura ou "kit", contendo compostos de fórmula I úteis para o tratamento das doenças e disfunções descritas acima. Em uma realização, o kit compreende um recipiente que contém um composto de fórmula I. O kit pode adicionalmente compreender um rótulo ou uma bula, no recipiente ou associado ao mesmo. O termo "bula" é utilizado com relação às instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contém informação sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos com relação ao uso de tais produtos terapêuticos. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, embalagem blister, etc. O recipiente pode ser formado a partir de uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente pode conter um composto de fórmula I ou uma formulação do mesmo que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter um local de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição é um composto de fórmula I. O rótulo ou bula indica que a 5 composição é utilizada para o tratamento da condição de interesse, tal como câncer .. Em uma realização, o rótulo ou bula indica que a composição que compreende o composto de fórmula I pode ser utilizada para o tratamento de uma disfunção resulti:mfe-do-cres-Cime-nt6 celular anormal. O rótulo ou bula pode ainda indicar que a composição pode ser utilizada para o tratamento de outras disfunções. De forma alternativa, o adicionalmente, o artigo de manufatura pode ainda compreender um segundo recipiente que contém um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas. O kit pode compreender adicionalmente indicações para a administração do composto de fórmula I e, se presente, da segunda formulação farmacêutica. Por exemplo, se o kit compreende uma primeira composição contendo um composto de fórmula I e uma segunda formulação farmacêutica, o kit pode compreender ainda indicações para a administração simultânea, sequencial ou separada da primeira e da segunda composição a um paciente que necessite das mesmas.

Em outra realização, os kits são apropriados para o fornecimento de formas orais sólidas de um composto de fórmula I, tal como comprimidos ou cápsulas. Dito kit preferencialmente inclui uma série de unidades de dosagens.

Tais kits podem incluir um cartão que possui as formas de dosagens orientadas na ordem do uso pretendido. Um exemplo de tal kit é uma "embalagem" blister.

Embalagens blister são bem conhecidas no estado da técnica de embalagens e são amplamente utilizadas para a embalagem de formas de dosagens unitárias farmacêuticas. Se desejado, um auxílio de memória pode ser fornecido, como por exemplo, na forma de números, letras ou outras marcas, ou com um 5 calendário interno, designando os dias na agenda de tratamento no qual as dosagens podem ser administradas.

De acordo com uma realização, um kit pode compreender (a) um primeiro recipiente com um com-posto de fórmula I ali contido; e opcionalmente (b) um segundo recipiente com uma segunda formulação farmacêutica ali contida, em que a segunda formulação farmacêutica compreende um segundo composto com atividade anti-hiperproliferativa.

De forma alternativa, ou adicionalmente, o kit pode ainda compreender um terceiro recipiente contendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas.

Onde o kit compreende uma composição de fórmula I e um segundo agente terapêutico, tal como um agente quimioterápico, o kit pode compreender um recipiente para conter as composições separadas, tal como uma garrafa dividida ou um pacote de papel alumínio dividido, entretanto, as composições separadas podem também estar contidas em um recipiente único, não dividido. Tipicamente, o kit compreende indicações para a administração dos componentes separados. A forma do kit é particularmente vantajosa quando os componentes separados são preferencialmente administrados em diferentes formas de dosagens (tal como oral e parenteral), são administrados em diferentes intervalos de dosagem, ou quando a titulação dos componentes individuais da combinação é desejada pelo técnico no assunto.

11 o

PROCEDIMENTOS GERAIS PARA A PREPARAÇÃO PROCEDIMENTO GERAL A-1: ACOPLAMENTO DE SUZUKI +t- o, os. . . ~N V-N: H 7 5 --catalisador de Pd A reação de acoplamento do tipo Suzuki é útil para ligar um heterociclo bicíclico fundido ou heteroarila na posição 2 do anel pirimidina (vide 5 esquema 4). De forma geral, 2-cloro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina substituído (5) pode ser combinado com 1,5 equivalentes de 4-(4,4,5,5- tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolan-2-il)1 H-indazol (7), e dissolvido em 3 equivalentes de carbonato de sódio como uma solução 1 molar em água e um volume igual de acetonitrila. O intermediário (7) foi preparado de acordo com os métodos descritos em US 2008/0039459; US 2008/0076768; US 2008/0076758; US 2008/0207611, incorporados ao presente como referência. Uma quantidade catalítica, ou mais, de um reagente de paládio de baixa valência, tal como dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (11), é adicionada. Uma série de ácidos borônicos ou ésteres borônicos pode ser utilizada no lugar do éster borônico indazol indicado. Ainda, alternativamente, o nitrogênio do indazol pode ser protegido, por exemplo, com um grupo tetrahidropiranil. Em alguns casos, acetato de potássio foi utilizado no lugar de carbonato de sódio para ajustar o pH da camada aquosa. A reação foi então aquecida para cerca de 140 a 150- C sob pressão em um reator de microondas Biotage Optimizer (Biotage, Inc.) por 1O a 30 minutos. Os conteúdos são extraídos com acetato de etila ou outro solvente orgânico. Após evaporação da camada orgânica, o produto (8) pode ser purificado sobre HPLC de sílica ou fase reserva.

PROCEDIMENTO GERAL A-2: ACOPLAMENTO DE SUZUKI

Catalisador de Pd 5 Pd catalyst

A reação de acoplamento--do- tipo Suzuki é útil para ligarüma heteroarila monocíclica na posição 2 do anel pirimidina (vide esquema 4). De forma geral, 2-cloro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina substituída (5)

5 pode ser combinada com 1,5 equivalentes de 5-(4,4,5,5-tetrametil-1 ,3,2-

dioxaborolan-2-il)pirimidin-2-amina (7a), e dissolvida em 3 equivalentes de carbonato de sódio ou potássio como uma solução 1 molar em água e um volume igual de acetonitrila.

O intermediário (7a) foi preparado de acordo com os métodos descritos nos documentos US 2008/026921 O; US

2008/0242665, incorporados ao presente como referência.

Uma quantidade catalítica, ou mais, de um reagente de paládio de baixa valência, tal como dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (11) é adicionada.

Uma série de ácidos borônicos ou ésteres borônicos pode ser utilizada no lugar do éster borônico pinacol indicado.

Ainda, alternativamente, o nitrogênio do pirimidin-2-amina pode ser protegido, por exemplo, com um grupo tetrahidropiranil.

Em alguns-casos, acetato de potássio foi utilizado no lugar de carbonato de sódio para ajustar o pH da camada aquosa.

A reação foi então aquecida, por exemplo, para cerca de 100 a 150 -C sob pressão em um reator de microondas Biotage Optimizer (Biotage, Inc.) por 1O a 30 minutos.

Os conteúdos são extraídos com acetato de etila, ou outro solvente orgânico.

Após a evaporação da camada orgânica, o produto (8a)

pode ser purificado em HPLC de sílica ou de fase reversa.

PROCEDIMENTO GERAL 8: ACOPLAMENTO DE AMIDA Ácido 2-(1 H-lndazol-4-il)-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina-6- carboxílico (13)·-é tratado com 1,5 eq HATU, 3 eq de alquilamina e 3 eq de DIPEA em DMF para uma concentração de aproximadamente 0,1 M. A reação 5 é agitada até se completar e extraída em etilacetato com solução de bicarbonato saturada uma vez. A camada orgânica é seca, filtrada e concentrada para gerar o intermediário bruto. Este intermediário é purificado por HPLC de fase reversa para gerar o produto (15).

PROCEDIMENTO GERAL 8-1: ACOPLAMENTO DE AMIDA ()

N q, ,s0N R-N~N~ 15a l .NJ Ácido 4-Morfolino-2-(piridin-3-il)tieno[3,2-d]pirimidina-6- carboxílico (13a) é tratado com 1,5 eq HATU, 3 eq de uma alquilamina (R- NH2) e 3 eq de DIPEA em DMF para uma concentração de aproximadamente 0,1 M. A reação é agitada até se completar e extraída em etilacetato com solução de bicarbonato saturada uma vez. A camada orgânica é seca, filtrada, e concentrada para gerar o intermediário bruto.

Este intermediário é purificado por HPLC de fase reversa para gerar o produto (15a).

PROCEDIMENTO GERAL 8-2: ACOPLAMENTO DE AMIDA

RC0 2 H, HATU

~~Cioro-4-morfolino-6::o((ejperazin-1-il)metil)!i_~!:lo[3,2-d]pirimidif1a~--~­ tratada com cerca de 1,5 eq de um reagente de acoplamento tal como HATU,

cerca de 3 eq de um ácido carboxílico (RC0 2 H) e um excesso de uma base 5 amina tal como DIPEA em DMF para uma concentração de aproximadamente

O, 1 M.

A reação é agitada até se completar e extraída em acetato de etila com uma solução de bicarbonato saturada uma vez.

A camada orgânica é seca,

filtrada e concentrada para gerar o intermediário bruto.

PROCEDIMENTO GERAL 8-3: AMINACÃO REDUTIVA

HNR2

Na(OAchBH

2-Cioro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina-6-carbaldeído é dissolvido em uma concentração de 0,2 M de dicloroetano.

A esta solução é adicionado 1,5 a 2,0 equivalentes de uma amina secundária ou primária (R2 NH), cerca de 1O equivalentes de trimetilortoformato, e cerca de 1 equivalente de ácido acético.

A mistura é seguida para agitação por 2 a 6 horas antes de adicionar 1,5 equivalentes de triacetoxiborohidreto de sódio.

Após 12 a 16 horas de agitação, a reação foi derramada em bicarbonato de sódio saturado e extraída diversas vezes com acetato de etila para gerar o intermediário de aminação redutiva que é purificado em sílica gel ou utilizado bruto na próxima reação.

PROCEDIMENTO GERAL C: FORMAÇÃO DE SULFONAMIDA 17 18 Cloreto de 2-cloro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina-6-sulfonila (17) -é suspendido em--DCM antes da adiÇão de cerca de-2 eq de amina (I=-INR2 ) e cerca de 3 eq de uma base amina, tal como DIPEA. As reações são 5 monitoradas por LCMS até se completarem. As misturas reacionais brutas são diluídas com acetato de etila, extraídas com cloreto de amônia saturada e volta a ser extraída uma vez com acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas até aridez. Os intermediários de sulfonamida bruta (18) são utilizados diretamente nos acoplamentos Suzuki subsequentes.

PROCEDIMENTO GERAL 0: SíNTESE DE ÁLCOOL

1. nBuLi 4 12 2-Cioro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina (4) é suspendida para uma concentração de 0,2 molar em THF e então resfriada para -50 oc em um- oaiiho de acetonitrila/gelo seco antes da adição de 2 equivalentes dé 2,5 M nBuli em hexanos. Após 15 minutos, 3,0 molar equivalentes de uma cetona cíclica ou acíclica (R 2 C(=O) é adicionado na solução. A reação continuou para agitação a -50 oc por 1 hora e então, na maioria dos casos, foi permitido alcançar oo C. Após o término da reação por TLC ou espectrometria em massa (mass spec.) ela é interrompida em uma solução de cloreto de amônia saturada e extraída duas vezes com EtOAc. A camada orgânica é concentrada e usada como uma mistura bruta, purificada em sílica ou o produto (12) poderia ser dissolvido em uma quantidade mínima de acetonitrila e filtrada para remover o material de partida (4) remanescente.

PROCEDIMENTO GERAL E: REMOÇÃO DO GRUPO T-BUTOXILCARBONILA (BOC) o o Boc,N~ (N) Boc,N~ (N) ( \_N )~ S ~N (10eq)4NHCI ( \_N )~ S ~N ~ I Á emdioxano ~ I Á --· N....:: R3 6. .... N...-:: R3 5 Dez ou mais equivalentes de 4N HCI em dioxano, com ou sem diclorometano como co-solvente, são adicionados ao material de partida (esquema geral exibido acima mas também com o uso de arcabouços similares). O aquecimento para até 40°C por diversas horas é ocasionalmente necessário para remover o grupo Boc. A reação é concentrada até aridez e pode ser utilizada bruta em reações subsequentes.

PROCEDIMENTO GERAL F: REAÇÕES DE ACOPLAMENTO SUZUKI EM UM RECIPIENTE 19 5 7 2-Cioro-6-iodo-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina (19) (1 eq), ácido fenilborônico ou ácido heterocicloborônico (R 1-B(OH)2, 1.1 eq) e dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (li) (0.1 eq) em solução aquosa de 1M Na 2 C0 3 (3 eq) e acetonitrila (3eq) foram aquecidos em 100 °C em um reator de microondas vedado por 1O a 40 minutos para gerar (5). Até se completar, 4-(4,4,5,5- tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolan-2-il)-1 H-indazol (7) (1.3 eq) e dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (11) (0.1eq) foram adicionados no mesmo recipiente. A mistura reacional foi aquecida a 150 °C em um reator de microondas vedado por 1O a 15minutos. A mistura foi extraída com acetato de etila (3 x 5 ml). As camadas orgânicas combinadas foram concentradas para gerar (8) bruto.

5 PROCEDIMENTO GERAL G: REAÇÃO DE ACOPLAMENTO DE AMIDA 22 23 2-Cioro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6-amina 22 (1 eq), cloreto ácido (cerca de 2 eq) e trietilamina (2eq) em diclorometano foram agitados. A reação foi monitorada por LC/MS até se completar. A mistura foi evaporada para gerar a amida bruta (23), que foi diretamente utilizada para a próxima 1o etapa de reação sem purificação.

PROCEDIMENTO GERAL H: PREPARAÇÃO DE ACETAMIDA, BENZAMIDINAS E

SULFONAMIDAS o Co) 0 ~-R CN)

N -

RCOCI -N~N ~ I Á -J~N~ I Á N Cl N Cl O~Y-R c:) - RS0 2CI -J~N ~ I Á N Cl A uma solução de 0,25 a 0,40 M de 1-(2-cloro-4- morfolinotieno[2,3-d]pirimidin-6-ii)-N-metilmetanamina em DCM resfriada a O °C, foi adicionado 1,5 eq. de TEA, seguido pela adição por gota a gota de 1,O a 1,5 eq. de um cloreto ácido de alquila ou arila ou um sulfonilcloreto, diluído em DCM. A reação é agitada a temperatura ambiente e monitorada até se completar por LCMS. Após o término, o volume da reação é aumentado com DCM, e bicarbonato sódio aquoso diluído é adicionado à solução. As camadas aquosas e orgânicas são separadas. Finalmente, a camada orgânica é lavada com salmoura e seca (MgS04). A solução orgânica seca é concentrada em vácuo e o produto é purificado por cromatografia em sílica, se necessário.

PROCEDIMENTO GERAL 1: REAÇÃO DE ACOPLAMENTO DE AMIDA PARA BENZENAMINA HATU,HOAT DIPEA, DMF 24 25 5 3-(2-Cioro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6-il)benzenamina (24) (1eq), ácido carboxílico (1 ,5 eq), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (0,2 eq), 0-(7 -azabenzotriazol-1-ii)-(N, N,N' ,N' -tetrametilurônio hexafluorofosfato) (HATU, 1.5 eq), e N,N-diisopropiletilamina (2,5 eq) em DMF foram agitados a temperatura ambiente. A reação foi monitorada por LC/MS até se completar. A mistura reacional foi diluída com acetato de etila, lavada com bicarbonato de sódio saturado e salmoura. A camada orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e evaporada para gerar o produto amida (25). PROCEDIMENTO GERAL J: DESLOCAMENTO DE 6-IODO E ACOPLAMENTO 2-SUZUKI 1) ArNH 2 , Cs 2C03, Pd 2 (dba)3 XANTPHOS, 110 °C, 30 min 2) 7, Pd(PPh 3) 4 , Na 2 C0 3 , CH 3CN 140 °C 15 min 19 26 A uma solução de 2-cloro-6-iodo-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina (19) (0,05 g, 0,13 mmol) em DMF (1,00 ml) foi adicionada a anilina apropriada (200 moi%), Cs2C03 (50 moi%), Pd2(dba)3 (5 moi%), e XANTPHOS (1 O moi%). A reação foi aquecida a 11 O o c sob pressão em um reator de microondas otimizador Biotage por 30 min. A solução resultante foi concentrada in vácuo para gerar (26), seguindo posteriormente o procedimento geral A.

PROCEDIMENTO GERAL K: ACILACÃO DE 6-AMINOALQUILA E ACOPLAMENTO 2-

SUZUKI 2) 7, Pd(PPh 3)4 , Na 2C03, CH 3CN 140 °C 15 min 27- 28 A uma solução de (2-cloro-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin- 5 6-il)metanamina (27) (50 mg, 0,2 mmol) em CH 2CI2 (4 ml) foi adicionado Et3N (84 !JL, 0,6 mmol) e o cloreto ácido apropriado ou sal HCI do mesmo (0,3 mmol). A reação foi agitada por 18 a 48 horas a temperatura ambiente antes de ser interrompida com água. A camada aquosa foi extraída com EtOAc. Os orgânicos combinados foram secos em Na2S04 e concentrados in vacuo. O produto bruto 2-cloro foi acoplado com o reagente boronato (7) e catalisador de paládio de acordo com o procedimento geral A para gerar (28) que foi purificado por purificação de HPLC em fase reversa.

Alternativamente, a uma solução de (2-cloro-4- morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6-il)metanamina (27) (111 mg, 0,39 mmol) em DMF (5 ml) foi adicionada 2,6-lutidina (48,2 !JL, 0,41 mmol) e o cloreto ácido apropriado ou sal de HCI do mesmo (0,39 mmol). A reação foi agitada por 18 a 72 horas a temperatura ambiente antes de ser interrompida com água. A camada aquosa foi extraída com EtOAc.

Os orgânicos combinados foram secos sobre MgS04 e concentrados in vacuo. O produto bruto 2-cloro foi acoplado com reagente boronato (7) e catalisador de paládio de acordo com o procedimento geral A para gerar 20 mg de (28) que foi purificado por purificação de HPLC em fase reversa.

PROCEDIMENTO GERAL L: SUBSTITUIÇÃO DE AMINA EM FLUOROPIRIDINA R / H-N R "N

H I F I) HN N~CI DIPEA; NMP Uma mistura de 2-cloro-6-(6-fluoropiridin-3-il)-4- ·-----·- -- - morfolinotieno[3,2-d]pirimidina, cerca de quatro equivalentes de uma 5 amina primária ou secundária (R = H, alquila C 1-C 12 , alquenila C2-C 8 , alquinila C2-Ca, carbociclila C3-C12. heterociclila C2-C2o. arila C5-C2 0 , ou heteroarila C1-C2 0 ), e cerca de dois equivalentes de diisopropiletilamina em N-metilpirrolidina (- 0,1M) é aquecida até cerca de 130 a 140 oC em um reator de microondas vedado por aproximadamente 1O a 40 minutos, seguida pela remoção dos voláteis sob alto vácuo. A mistura bruta é purificada por cromatografia em flash para gerar o intermediário 2-cloro-6- (6-aminopiridin-3-il)-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina, que pode sofrer acoplamento Suzuki com uma heteroarila monocíclica, heterociclo bicíclico fundido ou reagente boronato heteroarila, seguindo o procedimento geral A.

EXEMPLOS Os seguintes exemplos são incluídos ao presente a fim de ilustrar a presente invenção. Entretanto, deve-se compreender que estes exemplos não limitam a presente invenção e apenas sugerem um método de realização da presente invenção. Os técnicos no assunto reconhecerão que as reações químicas descritas podem ser facilmente adaptadas para preparar uma série de outros inibidores de PI3K da presente invenção, e métodos alternativos para a preparação dos compostos da presente invenção estão inseridos no escopo de proteção da presente invenção. Por

- - - - - - ------- 120 exemplo, a síntese de compostos não exemplificados de acordo com a presente invenção pode ser realizada com sucesso pelas modificações aparentes aos técnicos no assunto, tal como pela proteção adequada dos grupos de interferência, pelo uso de outros reagentes apropriados 5 conhecidos na técnica diferentes daqueles descritos, e/ou pela realização de modificações de rotina das condições reacionais. De forma alternativa, outras reações aqui descritas ou conhecidas na técnica serão reconhecidas-como tendo aplicabilidade para a preparação de-outros compostos da invenção.

EXEMPLO 1 2,4-DICLORO-TIEN0[3,2-0)PIRIMIDINA (3) o CI lYC02CH3 ,s_}lNH ,s~N ~ ~~U . A U .A N Cl NH2 N O 1 H 2 3 Uma mistura de meti I 3-amino-2-tiofenocarboxilato (1) (13,48 g, 85,85 mmol) e ureia (29,75 g, 5 eq.) foi aquecida a 190 oc por 2 horas. A mistura reacional quente foi derramada sobre solução de hidróxido de sódio e qualquer material insolúvel foi removido por filtração. A mistura foi então acidificada (H CI, 2N) para gerar 1H-tieno [3,2-d]pirimidina-2,4-diona (2) como um precipitado branco, que foi coletado por filtração e seco ao ar (9,49g, 66%).

H1-RMN õ 400 MHz, d6-DMSO) 6,90 (1H, d, J=5,2Hz), 8,10 (1H, d, J=5,2Hz), 11,60-11,10 (2H, brs).

A mistura de 1H-tieno[3,2-d]pirimidina-2,4-diona (2) (9,49g, 56,49mmol) e oxicloreto fosforoso (150 ml) foi aquecida até refluxo por 6 horas. A mistura reacional foi então resfriada e derramada sobre gelo/água com agitação vigorosa rendendo um precipitado. A mistura foi então filtrada para gerar 2,4-dicloro-tieno[3,2-d]pirimidina (3) como um sólido branco (8,68 g,

75%). H1-RMN -(400 MHz, CDCI3) 7,56 (1H, d, J=5,5Hz), 8,13 (1H, d, J=5,5Hz). EXEMPLO 2 2-CLOR0-4-MORFOLIN-4-IL-TIEN0[3 12-D]PIRIMIDINA {4} Co) Co)

CI N oCN

N

H ,.... c(:ICI 3

N

Á 4 Cl 5 Uma mistura de 2,4-dicloro-tieno[3,2-d]pirimidina (3), (8,68 g, 42,34 mmol), morfolina (8, 11 ml, 2,2 eq.) e MeOH (150 ml) foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora. A mistura reacional foi então filtrada, lavada com água e MeOH, para gerar 2-cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidina (4) como um sólido branco (11 ,04 g, 100%). H1-RMN õ (400 MHz, d6-DMSO) 3,74 (4H, t, J=4,9Hz), 3,90 (4H, t, J=4,9Hz), 7,40 (1 H, d, J=5,6Hz), 8,30 (1 H, d, J=5,6Hz).

EXEMPL03 2-CLOR0-4-MORFOLIN-4-IL-TIEN0[3 12-D]PIRIMIDINA-6-CARBALDEÍDO ( 10} 10 A uma suspensão de 2-cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidina (4) (1 ,75 g, 6,85 mmol) em THF seco (40 ml) a -78°C foi adicionada uma solução de 2,5M de n-butil-lítio (nBuli) em hexano (3,3 ml, 1,2 equivalente).

Após agitação por 1 hora, DMF seco (796 1-JI, 1,5 equivalente) foi adicionado. A mistura reacional foi agitada por 1 hora a -78 oc e então foi aquecida lentamente até a temperatura ambiente. Após mais 2 horas adicionais a temperatura ambiente, a mistura reacional foi derramada sobre gelo/água gerando um precipitado amarelo. O mesmo foi coletado por filtração e seco ao ar para gerar 2-cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidina-6-carbaldeído (10) 5 (1 ,50 g, 77%). H1-RMN -(400 MHz, d6-DMSO) 3,76 (4H, t, J=4,9), 3,95 (4H, t, J=4,9), 8,28 (1 H, s), 10,20 (1 H, s).

EXEMPL04 2-CLOR0-6-IOD0-7 -METIL-4-MORFOLINOTIEN0[3,2-D]PIRIMIDINÃ.(41 )~ ()N 1) n-Buli, THF ... 2) 12 , THF 39 41 A uma solução de 2-cloro-7-metil-4-morfolinotieno[3,2- d]pirimidina (39) (3,0 g, 11,1 mmol; preparada de acordo com o procedimento para a síntese de 2-cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidina mas iniciando com éster etílico de ácido 3-amino-4-metil-tiofeno-2- carboxílico) em THF (60 ml) a -78 oc foi adicionado n-Buli (8,9 ml, 2,5 M em Et 2 0). A calda resultante foi aquecida para -40 oc e agitada por 50 min. A mistura reacional foi então resfriada para -78 oc e uma solução de 12 (5,6 g, 22,2 mmol) em THF (30 ml) foi adicionada. A solução foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada por 5 horas. A reação foi extinta pela adição de água. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com CH 2 Cb. Os orgânicos combinados foram lavados com solução aquosa de Na2S203 saturada, seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada in vacuo para fornecer 2-cloro-6-iodo-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina (41) (3,8 g, 84% de rendimento).

EXEMPLO 5 4-(2-CLOR0-6-(PIPERAZIN-1-ILMETIL)TIEN0[3,2-D]PIRIMIDIN-4-IL)MORFOLINA (30) ()N ,sJN ri__L__ _,I r-N Njl_CI HN_) 30 - Uma mistura de 2-cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidina-6- carbaldeído (1 O) (3,5 g), 1-BOC-piperazina (2, 76 g) e trimetilortoformato 5 (4,05 ml) foi agitada em 1,2-dicloroetano (300 ml) por 1 hora a temperatura ambiente. A esta mistura foi adicionado triacetoxiborohidreto de sódio (3,92 g) e a mistura reacional foi agitada por 24 horas a temperatura ambiente. A mistura foi então resfriada com salmoura, extraída com diclorometano, seca (MgS0 4 ) e o solvente removido in vacuo. O resíduo foi purificado utilizando cromatografia em flash para gerar éster terc-butílico de ácido 4-(2-cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidin-6- ilmetil)-piperazina-1-carboxílico (3,4 g). O tratamento com HCI em diclorometano /metano! gerou 4-(2-cloro-6-(piperazin-1-ilmetil)tieno[3,2- d]pirimidin-4-il)morfolina (30).

EXEMPLO 6 () N OKX:-...;::N ~ I H N~CI h 10 35 2-C lo ro-4-morfol inotieno[3, 2-d ]p i rim id i na-6-ca rbalde ido (1 O) (2,0 g) foi dissolvido em 50 ml de tolueno e 50 ml de THF,

seguido pela adição de 20 ml de 40% de metilamina em H20. A mistura reacional foi agitada a temperatura ambiente sob N2 por 24 horas. Os solventes foram removidos in vacuo e o resíduo foi dissolvido em 50 ml de metanol e 50 ml de THF e o NaBH4 5 adicionado em porções. Esta mistura reacional foi agitada a temperatura ambiente sob N2 por 24 horas e o término da reação foi confirmado por LCMS. Os solventes foram removidos in vacuo e o produfo bruto foi purificado por cromato-grafia em flash (EtOAc/EtOH) para gerar 1,12 g (35) (53% de rendimento). MS (01) 300 (M+).

EXEMPLO 7 (2-CLOR0-7-METIL-4-MORFOLINOTIENO [3, 2-0] PIRIMIDIN-6-IL)-N- METILMETANAMINA (37)

2. NaBH 4 , MeOH, THF 36 37 2-Cioro-7 -metil-4-morfolinotieno-[3,2-d] pirimidina-6- carbaldeído (36) foi dissolvido em 20 ml de tolueno e 20 ml de THF, seguido pela adição de 15 ml de 40% metilamina em H20 e a reação foi agitada por 24 horas. A mistura reacional foi concentrada in vacuo e o resíduo dissolvido em 30 ml de metanol e 30 ml de THF, seguido pela adição de NaBH 4 . A reação foi agitada a temperatura ambiente por pelo menos 24 horas e a formação do produto foi confirmada por LCMS. Os solventes foram removidos in vacuo e o produto bruto foi purificado por cromatografia em flash para gerar 2,53 g de (2-cloro-7-metil-4- morfolinotieno [3,2-d] pirimidin-6-ii)-N-metilmetanamina (37) (70% de rendimento) MS (01) 314 (M) +.

EXEMPLOS 4-(2-CLOR0-6-((4-(METILSULFONIL)PIPERAZIN-1-IL)METIL)TIEN0(3,2-D]PIRIMIDIN- 4-IL)MORFOLINA (31) ()

N (N rd:N

NACI - N_) o~; o~s \ 31 A reação entre N-BOC-piperazina e cloreto de sulfonil metano em 5 diclorometano e trietilamina gerou éster terc-butílico de ácido 4-metanossulfonil- piperazina-1-carboxílico. A clivagem do grupo protetor BOC utilizando HCI (2M) em diclorometano gerou sal HCI de 1-metanossulfonil-piperazina.

A mistura de 2-cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidina-6- carbaldeído (1 O) (1 ,00 g), 1-metanossulfonil-piperazina (750 mg) e 1o trimetilortoformato (3,80 ml) foi agitada em 1,2-dicloroetano (30m L) por 6 horas a temperatura ambiente. A esta mistura foi adicionado triacetoxiborohidreto de sódio (900 mg) e a mistura reacional foi agitada por 24 horas a temperatura ambiente. A mistura foi então resfriada com salmoura, extraída com diclorometano, seca (MgS04) e o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi triturado com acetato de etila quente para gerar 4-(2-cloro-6-((4-(metilsulfonil)piperazin-1-il)metil)tieno[3,2- d]pirimidin-4-il)morfolina (31) como um sólido branco (1.01 g).

EXEMPLO 9 4-(4,4,5,5-TETRAMETIL-[1,3,2]010XABOROLAN-2-IL)-1H-INDAZOL (7)- ROTA 1

OÚN \ o--B NH~ ::::,. I 1 O intermediário (7) foi preparado de acordo com os métodos dos documentos US 2008/0076768; US 2008/0076758; WO 2006/046031,

incorporados ao presente como referência. EXEMPLO 10 1-(TETRAHIDR0-2H-PIRAN-2-IL)-4-(4,4,5,5-TETRAMETIL-1 ,3,2-DIOXABOROLAN-2- IL)-1 H-INDAZOL (40) *o, . . o

B ~N 5 040 O intermediário (40) foi preparado de acordo com os métodos descritos pelos documentos US 2008/0039459; US 2008/0076768; US 2008/0076758; US 2008/0207611, incorporados ao presente como referência.

EXEMPLO 11 2-(1 H-INDAZOL-4-IL)-4-MORFOLIN-4-IL-TIEN0[3,2-D]PIRIMIDINA-6-CARBALDEÍDO 10 11 Uma mistura de 2-cloro-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidina- 6-carbaldeído (1 O) (1 00 mg, 0,35 mmol), 4-(4,4,5, 5-tetrametil- [1 ,3,2]dioxaborolan-2-il)-1 H-indazol (70) (95 mg, 0,39 mmol) e carbonato de sódio (112 mg) foi suspendida em tolueno (2,5 ml), etanol (1 ,5 ml) e água (0,7 ml). A tal mistura foi adicionado cloreto de bis(trifenilfosfina) paládio (11) (13,5 mg) e o vaso reacional foi lavado com argônio. A mistura reacional foi submetida a microondas a 120 oc por 1 hora e então particionado entre DCM e água, a camada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e evaporada in vacuo.

O resíduo resultante foi purificado utilizando cromatografia em flash para gerar 2-(1 H-indazol-4-il)-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidina-6- carbaldeído (11) (97 mg). EXEMPLO 12 5 4-(2-(1 H-INDAZOL-4-IL)-6-((4-(METILSULFONIL)PIPERAZIN-1-IL)METIL)TIEN0[3,2- 0]PIRIMIDIN-4-IL)MORFOLINA (FóRMULA IA. Goc-0941): () N /Nr-{(:lé(-NNH \ _) N I~ O N ú ~I ~s~ H3C O la Uma mistura de 4-(2-cloro-6-((4-(metilsulfonil)piperazin-1- il)metil)tieno[3,2-d]pirimidin-4-il)morfolina (31) do exemplo 4 (2,00 g), 4- (4,4,5,5-tetrametil-[1 ,3,2]dioxaborolan-2-il)-1 H-indazol (7) (2,26 g), tolueno (24 ml), etano! (12 ml), água (6 ml), carbonato de sódio (1 ,72 g) e PdCI2(PPH 3 )2 (325 mg) foi aquecida a 130 °C em microondas por 90 minutos (US 2008/0076768; WO 2006/046031, incorporados ao presente como referência).

A mistura reacional foi resfriada, diluída com clorofórmio, lavada com salmoura, seca (MgS04) e o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi purificado utilizando cromatografia em flash (acetato de etila e então 5% de acetato de etila/metanol) e então triturado com éter, gerando o composto de fórmula la, GDC-0941 (1 ,4 g). dados MS : (ESI+): MH+ 514.

Dados H1-RMN : (CDCI3): 2,67-2,71 (4H, m), 2,81 (3H, s), 3,29-3,33 (4H, m), 3,89 (2H, s), 3,89-3,93 (4H, m), 4,08-4,12 (4H, m),7,41 (1H, s), 7,51 (1H, t, J=7,2), 7,60 (1 H, d, J=8,3), 8,28 (1 H, d, J=7,5), 9,02 (1 H, s), 1O, 1O (1 H, br).

~---------

EXEMPLO 13 (S)-1-(4-((2-(2-AMINOPIRIMIDIN-5-IL)-7-METIL-4-MORFOLINOTIEN0[3,2-0)PIRIMIDIN· 6-IL)METIL)PIPERAZIN-1-IL)-2-HIDROXIPROPAN-1-0NA (FÓRMULA IB): HO~O (O) ' N) N \_N~~N ~ I -Á...~ N ~ ~N - . - .LNÁNH2 lb 2-Cioro-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidina-6-carbaldeído 5 (36) (495 mg) foi reagido com Boc-piperazina por meio do procedimento geral B-3 para gerar terc-butil 4-((2-cloro-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6- il)metil)piperazina-1-carboxilato.

Terc-butil 4-( (2-cloro-7 -metil-4-morfolinotieno[3 ,2-d]pirimidin-6- il)metil)piperazina-1-carboxilato (777 mg) foi submetido ao procedimento geral E para gerar o sal HCI de 2-cloro-7-metil-4-morfolino-6-((piperazin-1- il)metil)tieno[3,2-d]pirimidina. O sal HCI de 2-cloro-7-metil-4-morfolino-6- ((piperazin-1-il)metil)tieno[3,2-d]pirimidina (590 mg) foi reagido com ácido láctico por meio do procedimento geral B-2 para gerar (S)-1-(4-((2-cloro-7-metil- 4-morfolinotieno[3,2-d]pirim id in-6-il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona.

(S)-1-(4-( (2-Cioro-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6- il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona (60 mg) foi reagido com 50 mg de 5-(4,4,5,5-tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolan-2-il)pirimidin-2-amina por meio do procedimento geral A-2 para gerar 1O mg de composto de fórmula lb (US 2008/0242665, incorporado ao presente como referência). MS (Q1) 499.3 (M)+.

EXEMPLO 14 ENSAIO DE LIGAÇÃO DE P11 Oa (ALFA) P13K Ensaios de ligação: experimentos de polarização iniciais foram realizados em um Analista HT 96-384 (Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA.).

Amostras para medidas de afinidade de polarização por fluorescência foram preparadas pela adição de diluições em série de 1:3 de p11 Oalfa PI3K (Upstate Cell Signaling Solutions, Charlottesville, VA), iniciando a uma concentração final de 201Jg/ml no tampão de polarização (10 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCI, 4mM 5 MgCI2, 0,05% Chaps, e 1 mM DTT) para concentração final de 1OmM PIP2 (Echelon-lnc., Salt Lake City, UT.). Após um tempo de incubação de 30 minutos a temperatura ambiente, as reações foram interrompidas pela adição de sondas - -- - --- --- GRP-1 e PIP3-TAMRA (Echelon-lnc., Salt Lake City, UT.), concentrações finais de 100 nM e 5 nM, respectivamente. Leitura com filtros de corte padrão para o fluoróforo de rodamina (Aex = 530 nm; Àem = 590 nm) em placas proxi pretas de baixo volume e 384 poços (PerkinEimer, Wellesley, MA.). Os valores da polarização por fluorescência foram plotados como uma função da concentração de proteína, e os valores EC 50 foram obtidos pela comparação dos dados para uma equação de 4 parâmetros utilizando o software KaleidaGraph (Synergy software, Reading, PA). Este experimento também estabelece a concentração apropriada de proteína para uso nos experimentos de competição subsequentes com inibidores.

Os valores ICso do inibidor foram determinados pela adição de 0,04mg/ml p11 Oalfa PI3K (concentração final) combinado com PIP2 (concentração final de 1OmM) para poços contendo diluições seriadas de 1:3 dos antagonistas em uma concentração final de 25mM ATP (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) no tampão de polarização. Após um tempo de incubação de 30 minutos a temperatura ambiente, as reações foram interrompidas pela adição de sondas GRP-1 e PIP3-TAMRA (Echelon-lnc., Salt Lake City, UT.) em concentrações finais de 1OOnM e 5nM, respectivamente. A leitura com filtros de corte padrões para o fluoróforo de rodamina (Aex = 530 nm; Aem = 590 nm) em placas proxi de baixo volume, pretas, de 384 poços (PerkinEimer, Wellesley, MA.). Os valores da polarização por fluorescência foram plotados como uma função da concentração de antagonista, e os valores IC 50 foram obtidos pela comparação dos dados para uma equação de parâmetro 4 no software de ensaio Explorer (MDL, San Ramon, CA.).

De modo alternativo, a inibição de PI3K foi determinada em um 5 ensaio de radiometria utilizando uma enzima recombinante purificada e ATP a uma concentração de 1 J..IM. O composto foi diluído em série em 100% de DMSO. A reação da quinase foi incubada por 1 hora a temperatura ambiente, e ~- - --~~ ---- --· a reação foi terminada pela adição de PBS. Valores IC 50 foram subsequentemente determinados utilizando ajuste de curva de resposta de dose sigmoidal (inclinação variável).

EXEMPLO 15 ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VtTRO A eficácia dos compostos de fórmula I ou 11 foi medida pelo ensaio de proliferação celular empregando o protocolo a seguir (Mendoza et a/ (2002) Cancer Res. 62:5485-5488). Ensaios de viabilidade celular luminescente CeiiTiter-Gio®, incluindo reagentes e protocolo, são comercialmente disponíveis (Promega Corp., Madison, Wl, Technical Bulletin TB288). O ensaio acessa a capacidade dos compostos de entrar nas células e inibir a proliferação celular.

O princípio do ensaio é baseado na determinação do número de células viáveis presentes, através da quantificação da ATP presente em um ensaio homogêneo onde a adição do reagente Ceii-Titer Glo resulta na lise celular e geração de um sinal luminescente através da reação luciferase. O sinal luminescente é proporcional à quantidade de ATP presente.

PROCEDIMENTO Dia 1 - Semear as células em placas (placas TC, microlimpas, fundo claro, 384 poços pretos com tampa da Falcon #353962), colher as células, células embrionárias a 1000 células por 54 J..ll ou em placas de células de 384 poços para ensaio de 3 dias. Meio de cultura celular: RPMI ou DMEM com alta glicose, 1O% de soro bovino fetal, 2mM de L-Giutamina, P/S.

Incubado 0/N a 37°C, 5% C02.

Dia 2 -Adicionar drogas às células, diluição do composto, placas DMSO (séries 1:2 para 9 pontos), adicionar 20 IJI de compostos a 1O mM na 5 segunda coluna da placa de 96 poços. Realização em série de 1:2 ao longo da placa (1 ÜIJI + 201JI 100% DMSO) para um total de 9 pontos utilizando precisão.

Placas de meio, placas de polipropileno de fundo cônico com 96 poços da Nunc (cat.# 249946) (diluição de 1:56). Adldonar-147-~lcfe m-eiõ êm- todos os poços. Transferir 31JI de DMSO + composto a partir de cada poço na placa DMSO para cada poço correspondente na placa de meio utilizando Rapidplate.

Para estudos combinados de 2 drogas, transferir uma droga, 1,51JI de DMSO + composto, de cada poço na placa DMSO para cada poço correspondente na placa de meio utilizando Rapidplate. Desta forma, transferir 1 ,5 IJI de outra droga para a placa de meio.

Adição de droga às células, placa celular (diluição de 1:10), adicionar 6 IJI de meio + composto diretamente às células (541JI de meio nas células prontas). Incubar por 3 dias a 37 °C, 5% de C0 2 em um incubador que não será aberto com frequência.

Dia 5 - Placas de desenvolvimento, descongelar o tampão do Cell Titer Glo em temperatura ambiente. Remover as placas celulares a 37 oc e equilibrar a temperatura ambiente por cerca de 30 minutos. Adicionar tampão do Cell Titer Glo ao substrato do Cell Titer Glo (garrafa para garrafa). Adicionar 30 IJI de reagente Cell Titer Glo (Promega cat.# G7572) para cada poço de células. Colocar no agitador de placas por cerca de 30 minutos. Ler a luminescência no leitor de placa HT de análise (meio segundo por poço).

Ensaios de viabilidade celular e ensaios de combinação: As células foram semeadas em 1000 a 2000 células/poço em placas de 384 poços por 16 horas. No segundo dia, nove diluições do composto em série 1:2 foram realizadas em DMSO em uma placa de 96 poços. Os compostos foram adicionalmente diluídos em meio de crescimento utilizando um robô Rapidplate (Zymark Corp., Hopkinton, MA). Os compostos diluídos foram então 5 adicionados nos poços em quadruplicadas em placas celulares de 384 poços e incubados a 37°C e 5% C02. Após 4 dias, números relativos de células viáveis foram levantados por luminescência utilizando o titulador celular Glo (Promega) -- de acordo com instruções do fabricante e leitura em um leitor Wallac Multilabel (PerkinEimer, Foster City). Os valores EC 50 foram calculados utilizando o software Prism 4.0 (GraphPad, San Diego). As drogas em ensaios de combinação foram dosadas iniciando em concentrações de 4X EC 50 . Se teve casos onde o EC 50 da droga foi >2,5 IJM, a concentração mais alta utilizada foi 1O IJM. lnibidores PI3K e agentes quimioterápicos foram adicionados simultaneamente ou separadamente por 4 horas (uma antes da outra) em todos os ensaios.

Um exemplo adicional dos ensaios da proliferação celular in vitro inclui as seguintes etapas:

1. Uma alíquota de 100 IJI de cultura celular contendo cerca de 104 células (vide figuras 1A-C para linhagens celulares e tipo de tumor) no meio foi depositado em cada poço de uma placa de extremidades opacas e 384 poços.

2. Os poços controles foram preparados contendo meio e não c6ritendo células.

3. O composto foi adicionado aos poços experimentais e incubado por 3 a 5 dias.

4. As placas foram equilibradas para temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos.

5. Foi adicionado um volume de reagente Cell Titer Glo igual ao volume do meio de cultura celular presente em cada poço.

6. Os conteúdos foram misturados por 2 minutos em um agitador orbital para induzir a lise celular.

7. A placa foi incubada a temperatura ambiente por 10 minutos para estabilizar o sinal de luminescência.

5 8. A luminescência foi registrada e reportada em gráficos como RLU =unidades de luminescência relativa.

9. Análise utilizando o método de combinação de Chou e Talalay e análise do efeito da dosagem com o software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK), a fim de se obter um índice de combinação.

1o De forma alternativa, as células foram semeadas em uma densidade ótima na placa de 96 poços e incubadas por 4 dias na presença de um composto teste. Alamar BlueTM foi subsequentemente adicionado ao meio de ensaio e as células foram incubadas por 6 horas antes da leitura em excitação 544nm, emissão 590nm. Valores EC 50 são calculados utilizando um ajuste de curva de resposta de dosagem sigmoidal.

De forma alternativa, a proliferação/viabilidade foram analisadas após 48 horas do tratamento com a droga, utilizando um reagente Cell Titer Glo (Promega Inc., Madison, Wl). O tratamento DMSO foi utilizado como controle em todos os ensaios de viabilidade. Os valores ICso foram calculados utilizando o software de ajuste XL (IDBS, Alameda, CA) As linhagens celulares AML AP-1 060, EOL-1, FKH-1, GF-D8, HEL, HL-60, HNT-34, Kasumi-1, KG-1, ME-1, ML-2, MOLM-13, MOLM-16, MV4-11, NOM0-1, OCI-AML2, OCI-AML3, OCI-AML5, OCI-M1, OCI-M2, PL- 21, SET-2, SIG-M5, SKM-1, THP-1, UKE-1, e UT-7 foram obtidas a partir de ATCC ou DSMZ. As células são mantidas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS inativado pelo calor (Sigman-Aidrich) e 2 moi/L de L-glutamina. Os anticorpos para Western blotting foram obtidos a partir da tecnologia de sinal celular, com a exceção do anticorpo p11 Oa que foi obtido a partir de Epitomics.

O inibidor GDC-0941 foi sintetizado pela Genentech. Rapamicina, Ara-C, e daunorubicin foram obtidos a partir da Sigma. Todos os compostos foram preparados como soluções de estoque em DMSO, e diluídos em um ensaio tampão mediante uso. Células blásticas foram isoladas a partir do sangue 5 periférico de paciente LMA ou amostras de medula óssea por separação Ficoll.

Após lavagem em PBS, as células isoladas foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% FBS e um coquetel de citocina conforme indicado (IGF-1, SCF, GMCSF, e IL-3 a 1O ng/ml cada).

Linhagens celulares de mieloma múltiplo humano foram todas obtidas a partir da coleção Americana de cultura de tipos (ATCC, Manassas, VA) e também mencionadas em estudos anteriores (). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 unidades/ml de penicilina, 2 mM de L-glutamina, e 100 mg/ml de estreptomicina (Life Technology, Grand lsland, NY) a 37°C sob 5% C0 2 .

EXEMPLO 16

EFICÁCIA DO XENOENXERTO DE TUMOR DE CAMUNGONDOS IN VIVO Camundongo: camundongos fêmeas com imunodeficiência combinada severa (Fox Chase SCID®, C.B-17/IcrHsd, Harlan) de 8 a 9 semanas de idade e uma faixa BW de 15,1 a 21,4 gramas no Dia O do estudo.

Os animais foram alimentados com água à vontade (osmose reversa, 1 ppm Cl) e NIH 31 modificado e Lab Diet® irradiada, consistindo de 18,0% de proteína bruta, 5,0% de gordura bruta, e 5,0% de fibras brutas. Os camundongos foram criados em camas para animais de laboratório ALPHA- Dri® bed-o'cobs® irradiadas em microisolantes estáticos com um ciclo de 12 horas de luz a 21 a 22 oc (70 a 72 °F) e 40 a 60% de umidade. PRC cumpre especificamente com as recomendações do guia para cuidado e uso de animais de laboratório com relação com relação a restrição, criação, procedimentos cirúrgicos, alimentação e regulação de fluidos, e cuidados veterinários. O cuidado de animais e uso do programa a PRC é acreditado pela associação para Avaliação e Credibilidade de Cuidado Internacional de Animais de Laboratório (AAALAC), o que assegura o cumprimento com padrões aceitáveis para o cuidado e uso de animais de laboratório.

5 Implantação do tumor: xenoenxertos foram iniciados com células cancerígenas. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 IJg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 IJg/mL de gentamicina. As células foram coletadas durante crescimento exponencial e ressuspendidas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 5 x 107 células/ml. No dia do implante tumoral, cada camundongo testado recebeu 1 x 107 células (0,2 ml) subcutaneamente implantadas no flanco direito, e o crescimento do tumor foi monitorado conforme o crescimento médio alcançava a faixa alvo de 100 a 150 mm3. 21 dias após o implante do tumor, designado como Dia O do estudo, os camundongos foram separados em quatro grupos, cada um consistindo de dez camundongos com volumes de tumor individuais variando de 75 a 172 mm3 e volumes de tumor médio do grupo de 120 a 121 mm3 (vide apêndice A). O volume foi calculado utilizando a seguinte fórmula: Volume de Tumor (mm3) =(w2 x 1)/2 onde w = largura e I =comprimento do tumor em mm. O peso do tumor pode ser estimado assumindo que 1 mg é equivalente a 1 mm3 do volume tumoral.

Agentes terapêuticos: o composto de fórmula la (GDC-0941, Genentech, Inc.) foi fornecido como um pó seco na forma de sal, que continha 73% de agente ativo, e foi armazenado a temperatura ambiente protegido da luz. As doses da droga foram preparadas semanalmente em 0,5% de metilcelulose: 0,2%

Tween 80 em água deionizada ("veículo", MC!Tw80) e armazenadas a 4°C. A forma de sal contendo 73% de agente ativo representou na formulação de doses G-

033829. Rituximab (Rituxan® 1O mg/ml para injeção, Genentech, Lot #M79901) foi comprado como droga clínica. Doses de rituximab foram preparadas em cada dia 5 de dosagem pela diluição de uma alíquota de estoque com solução salina estéril {0,9% NaCI). Todas as doses foram formuladas para fornecer a dosagem determinadas em mglkg em um volume de 0,2 ml por 20 gramas de peso corporal (10 ml/kg).

Tratamento: Todas as dosagens foram escaladas para o peso corporal dos animais individuais e foram fornecidas por uma via indicada em cada uma das figuras.

Ponto final: Os tumores foram medidos duas vezes a cada semana utilizando compassos. Os camundongos foram monitorados individualmente, e cada animal sofreu eutanásia quando o tumor alcançou um volume de 1500 mm 3 ou ao final do estudo no Dia 40, o que acontecer primeiro. Entretanto, devido ao crescimento auto-limitador dos tumores controle, o ponto final foi reduzido para 1000 mm 3 para análise. O tempo para o ponto final (TTE) para cada camundongo foi calculado a partir da seguinte equação: TTE (dias)= [log10 (volume ao ponto final, mm3)-b]/m onde b é o interceptador e m é o decline da linha obtida pela regressão linear de um conjunto de dados de crescimento de tumor transformado por log. O conjunto de dados era compreendido da primeira observação que excedia o estudo do volume do ponto final e as três observações consecutivas que imediatamente precederam a realização do volume do ponto final. Aos animais que não alcançaram o ponto final são atribuídos um valor TTE igual ao último dia de estudo. Os animais classificados como mortes NTR (não relacionada ao tratamento) devido a acidentes (NTRa)

ou devido a causas desconhecidas (NTRu) foram excluídos do cálculo TTE (e todas as análises adicionais). Aos animais classificados como morte TR (relacionada ao tratamento) ou NTRm (morte não relacionada ao tratamento devido a metástases) são atribuídos um valor TTE igual ao dia da morte. O 5 resultado do tratamento foi avaliado pelo retardo no crescimento do tumor (TGD), que é definido como um aumento no tempo médio do ponto final (TTE) no grupo de tratamento relacionado ao grupo controle: TGD=T-C expressos em dias ou como porcentagem do TTE médio do grupo controle: %TGD = (T-C)/C X 100 onde: T = TTE médio para o grupo de tratamento, C= TTE médio para o grupo controle (Grupo 1). O tratamento pode causar regressão parcial (PR) ou regressão completa (CR) do tumor em um animal. Em uma resposta PR, o volume de tumor é 50% ou menos do seu volume do Dia 1 para três medidas consecutivas durante o curso de estudo, e igual ou maior do que 13,5 mm3 para um ou mais destas três medidas. Em uma resposta CR, o volume tumoral é inferior a 13,5 mm3 para três medidas consecutivas durante o curso do estudo. Um animal com resposta CR ao término do estudo é adicionalmente classificado como um sobrevivente livre de tumor (TFS). Os animais foram monitorados quanto as respostas de regressão.

Toxicidade: Os animais foram pesados diariamente pelos primeiros 5 dias de estudo e, depois, duas vezes por semana. Os camundongos foram observados frequentemente para sinais evidentes de qualquer efeito adverso, efeitos colaterais relacionados ao tratamento e sinais clínicos de toxicidade foram registrados quando observados. A toxicidade aceitável é definida como uma perda de peso corporal médio do grupo (BW) de menos do que 20% durante o estudo e não mais do que uma morte relacionada ao tratamento (TR) entre os 1O animais tratados. Qualquer regime de dosagem que resulte em alta toxicidade é considerada acima da dose máxima tolerada (MTD). A morte é classificada como TR se atribuível aos efeitos colaterais do tratamento como evidenciado pelos sinais clínicos e/ou necropsia, ou pode 5 também ser classificada como TR se devida a causas desconhecidas durante o período de dosagem ou dentro de 1O dias da última dose. A morte é classificada como NTR se não há qualquer evidência de que a morte foi relacionada aós~efeifos colaterais do tratamento.

EXEMPLO 17 WESTERN BLOTTING PARA DETECÇÃO DE PROTEÍNAS RIBOSSOMAIS P-AKT, P-BAD E P-56 APÓS TRATAMENTO GDC-0941 DE LINHAGENS CELULARES DE MIELOMA E

CÉLULAS B Materiais: todos os reagente para eletroforese e estoques de tampão para blotting são da lnvitrogen.

As linhagens de células 8 (DoHH2 e WSU-DLCL2) e linhagens celulares de mieloma (OPM2 e U266) foram mantidas em RPMI-1640/10% FBS na presença de Pen/Estrep e Glutamina.

Protocolo: 1) Semear 107 células de cada linhagem celular em 10 ml de meio de cultura em placa de petri de1 O em, 2 placas para cada linhagem celular.

2) Adicionar 5 J.JL de 10 mM GDC-0941 estoque (em DMSO) a uma placa de 1O ml de cultura para droga final de 5 J.JM e adicionar 5 J.JL de DMSO à outra placa como controle.

3) Manter as células a 37 °C, incubador 5%C0 2 por 4 horas antes da coleta. 4) Coletar 9 ml de cultura (equivalente a 9 x 106 células) a 15 ml de tubo cônico e pellet e preparar lisatos celulares com tampão da amostra 1x

SDS. Transferir o outro 1 mL de cada condição (equivalente a 1 x 106 células) para tubo 5 mL FACS (80) para FACS. 5) Lavar as células uma vez com PBS gelado.

6) Medir a 00 das amostras de proteína e preparar as amostras 5 com reagentes do sistema de eletroforese NuPAGE para carregar 20 tJg de cada. 7) Misturar cada amostra de proteína para eletroforese com uma quantidade apropriada de tampão de amostra NuPAGE LOS e agente redutor e aplicar um calor de 70 o c por 1O minutos. 8) Carregar 1O fJL de SeeBiue Plus2 previamente marcado padrão e 20 tJg de cada amostra em 4 a 12% de gel NuPAGE Norvex Bis-Tris e rodar com tampão MES-SDS na presença de antioxidante (135 volts por 1 hora em aparelho XCell SureLock Mini-Cell). 9) Transferir os géis para a membrana de blotting utilizando aparelho iBiot.

1O) Lavar uma vez com tampão 1X TBST.

11) Bloquear a membrana com 20 mL de 1x TBST 5% de leite sem gordura por 2 horas. 12) Lavar três vezes com tampão 1X TBST. 13) Incubar a membrana em 10 mL de 1X TBST 5% BSA e anticorpo primário (p-Akt, clone 193H12, p-BAD, clone 185010 e p-S6RP, clone 057.2.20, beta-actina, clone 13E5, Cell Signaling) em uma diluição apropriada a 4C 0/N. Anticorpos p-Akt e p-6SRP e beta-actina de coelho foram adicionadas à mesma membrana e outras, cada um em membranas separadas (géis múltiplos são anteriormente gerados).

14) Lavar três vezes com tampão 1X TBST.

15) Incubar a membrana com anticorpo anti-coelho, de cabra, conjugado a HRP a uma diluição apropriada em 10 mL tampão1X TBST /5% de leite sem gordura a temperatura ambiente por 2 horas.

16) Lavar três vezes com tampão 1X TBST. 17) Incubar a membrana com 3 mL de LumiGLO por 3 minutos, drenar o excesso de solução e expor a filme de raio X.

5 De modo alternativo, 1O X 106 de células para cada condição foram colocadas nas placas de 1Ocm2, e as células foram tratadas utilizando GDC-0941, dexametasona, ou lenalidomida, e/ou em combinações. Tratamento DMSO foi utilizado como controle. As células foram lavadas uma vez com PBS gelado e lisadas utilizando 1 X de tampão de lise celular (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Uma quantidade igual de proteína foi novamente dissolvida utilizandq géis Nupage Bis-Tris (lnvitrogen, Carlsbad, CA). A análise de Western blot foi realizada utilizando anti-fosfo-Akt (Serina 473), anti-PTEN, anti-fosfo-BAD (serina136), anti-fosfo-FoXO 1/3a, Bim, caspase clivada 9, caspase clivada 3, p27, e anticorpos PARP clivados (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Níveis totais de AKT, BAD, Foxo3a e 13-actina (Sigma) foram utilizados como controles de carga.

EXEMPLO 18

PROTOCOLO DE FACS PARA DETECÇÃO INTRACELULAR DE PROTEÍNA RIBOSSOMAL P-AKT E P-56 APÓS TRATAMENTO COM GDC-0941 Linhagens de células B (DoHH2 e WSU-DLCL2) e linhagens celulares de mieloma (OPM2 -e U266) foram mantidas em RPMI-1640/1 O% FBS na presença de Pen/Estrep e Glutamina.

Protocolo: 1) Semear 107 células de cada linhagem celular em meio de cultura 1O mL em placas de petri de 1O em, 2 placas para cada linhagem celular. 2) Adicionar 5 IJL de 10 mM GDC-0941 estoque (em DMSO)

para 1O mL de cultura para droga final 5 ~M e adicionar 5 ~L de DMSO à outra placa como controle. 3) Manter as células a 37 °C, incubador S%C02 por 4 horas antes da coleta. 5 4) Transferir 1 mL de cada condição (equivalente a 106 células) a um tubo de 5 mL FACS (BD) e girar a 1200 rpm por 5 minutos antes da fixação (çoh~ta _de d~s ?ut~os__ 9 mL de 9 x 106 de células da cultura para 15 mL de tubo cônico para Western). 5) Aspirar o sobrenadante e fixas as células a uma temperatura ambiente com meio A Fix/Perm (CAT# GAS001 S-1 00) por 15 minutos.

6) Lavar as células com PBS/2%FBS 1x. 7) Aspirar o sobrenadante e permeabilizar as células a temperatura ambiente com meio B Fix/Perm (CAT# GAS002S-100) por 15 min.

8) Lavar as células com PBS/2%FBS 1x.

9) Ressuspender as células com 300 ~L de PBS/2%BSA e dividir as células em 3 tubos de 100 ~L cada (um para lgG de coelho isotipo Alexa Flúor-647 e um para p-Akt Alexa Flúor-647 clone 193H12 e um para p-S6RP Alexa Flúor-647 clone D57.2.2E, todos anticorpos de coelho são da Cell Signaling). 1O) Adicionar 50 ng de cada anticorpo ao tubo correspondente e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.

11) Lavar as células com PBS/2%FBS 1x.

12) Ressuspender as células com 300 ~L PBS/2%BSA e obter dados sobre FACSCalibur (BD) utilizando o programa CeiiQuest. 13) Análise dos dados utilizando o programa FlowJo e exibir os dados em histogramas. ,

EXEMPLO 19

PROTOCOLO DE FACS PARA MEDIR A FLUORESCÊNCIA QUANTITATIVA DE CÉLULAS APOPTÓTICAS E VlÁVEIS APÓS TRATAMENTO GDC-0941 Células viáveis e apoptóticas foram medidas para análise de 5 fluorescência quantitativa utilizando um ensaio de seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) com o mínimo de modificações (Munugalavadla et a/.

(2008) Moi. Cell Biol. 28(23):7182-7198). Diversas linhagens celulares de ~- - - -" - mieloma múltiplo (1 X 106) foram tratadas com DMSO ou várias concentrações da Figura la GDC-0941 por 24 horas, as células foram então marcada 1o utilizando o kit Annexin-V-APC /PI (BD Biosciences, San Jose, CA) de acordo com instruções do fabricante e analisadas por citometria de fluxo. No caso de amostra de paciente com mieloma múltiplo primário, 2 milhões de células BM nucleadas foram semeadas em placas com 6 poços em 2 ml de advanced- RPMI (lnvitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 2% de soro de crescimento bovino inativado pelo calor (Hyclone, Waltham, MA) e 2 ng/ml de IL6 recombinante (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN). As células foram tratadas com veículo (DMSO), 1 IJM ou 1O IJM GDC-0941 por 72 horas e então analisadas por citometria de fluxo para avaliar apoptose induzida pela droga.

Os seguintes reagentes foram utilizados: CD45RA-FITC, CD38-APC e lodido propidio (todos da BD Pharmingen, San Jose, CA). Os dados foram obtidos em um instrumento CyanADP, (Dako Cytomation) e analisados utilizando software FlowJo (Tree Star). Células plasmáticas vivas foram identificadas como CD38hiCD45RA- e Pl-. EXEMPL020

ANÁLISE DO CICLO CELULAR A análise do ciclo celular foi realizada utilizando o kit de ensaio de citometria Click-iTTM Edu (lnvitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência foi medida em BD LSR-11 e os dados

,------~-- --- - 143 foram analisados utilizando um software FlowJo (Becton Dickinson).

EXEMPLO 21

MEDIDA DE PAKT EM CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA MM PRIMÁRIAS UTILIZANDO O ENSAIO MESO SCALE DISCOVERY (MSD) 5 Células mononucleares de medula óssea (BM-MNC) de doadores MM foram cultivadas durante a noite em 1O ml RPMI suplementado com 10% FBS. Após incubação, as células foram lavadas uma vez com meio de ·- ·-··~ ~* -- ·-· crescimento e ressuspendidas em 1 ml de meio. Para cada doador, as células foram divididas em alíquotas de 500 ml e foram tratadas com DMSO ou GDC- 1o 0941 a 1 mM por 1 hora a 3rC. Após tratamento, os pellets celulares foram coletados a 1200 rpm por cinco minutos e os pellets foram lavados uma vez com PBS gelado. Os pellets celulares foram novamente suspendidos com 60 ml 1X Mesoscale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland) de tampão de lise e os lisatos foram limpos por centrifugação a 4°C a 14000 rpm por 10 minutos.

15 Os lisatos celulares limpos foram utilizados para avaliar fosfo-Akt (SeR473 ) e Akt total, usando o kit MSD de acordo com as instruções do fabricante com modificações mínimas.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. USO DE UMA COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA, caracterizado pelo fato de é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma malignidade hematopoiética, em que a combinação 5 terapêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que possui fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes quimioferápicos selecionados a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina; em que o composto de fórmula I é 4-(2-(1 H-indazol-4-il)-6-((4- (metilsulfonil)piperazin-1-il)metil)tieno[3,2-d]pirimidin-4-il)morfolina que possui fórmula la: ou (S)-1-(4-( (2-(2-aminopirimidin-5-il)-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2- d]pirimidin-6-il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona que possui fórmula lb: H~Yo (o) ' N) N \_N~"N ~~~ N "N I N.ÁNH2 lb.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é dexametasona.

3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é tioTEPA.

4. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é doxorrubicina. 5

5. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é vincristina.

6. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo lato de que o agente quimioterápicoe -rituximab.

7. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é ciclofosfamida.

8. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é prednisona.

9. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é melfalam.

10. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é lenalidomida.

11. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é bortezomib.

12. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é rapamicina.

13. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de_que o agente quimioterápico é citarabina.

14. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a combinação terapêutica compreende ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, e prednisona.

15. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula I é selecionado a partir de um sal formado com ácido clorídrico,

ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiônico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maléico, ácido láctico, ácido málico, ácido 5 tartárico, ácido cítrico, ácido etanossulfônico, ácido aspártico e ácido glutâmico.

16. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a administração da combinação terapêutica resulta em um efeito sinérgico.

17. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a malignidade hematopoiética é selecionada a partir de linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células hematopoiéticas, linfoma folicular, linfoma de células do manto, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, LMA e LMC.

18. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula I e o agente quimioterápico são, cada um, administrados em uma quantidade que varia de cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg por forma de dosagem unitária.

19. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula I e o agente quimioterápico são administrados em uma razão de cerca de 1:50 a cerca de 50:1 em peso.

20. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende um composto de fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina e citarabina; e um ou mais veículos, deslizantes, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis;

em que o composto de fórmula I é 4-(2-(1 H-indazol-4-il)-6-((4- (metilsulfonil)piperazin-1-il)metil)tieno[3,2-d]pirimidin-4-il)morfolina que possui fórmula la: ou 5 (S)-1-( 4-( (2-(2-aminopirimidin-5-il)-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2- d]pirimidin-6-il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona que possui fórmula lb: H~Ho (o) ' N) N \_N~"N ~~~ N "N I NANH2 lb.

21. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula I é selecionado a partir de um sal formado com ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiônico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maléico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido etanossulfônico, ácido aspártico e ácido glutâmico.

22. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o composto de fórmula I é 4- (2-( 1H-indazol-4-il)-6-( (4-( metilsu lfonil)piperazin-1-il)metil)tieno[3,2 -d]pirimid in-

4-il)morfolina que possui a fórmula la: (o)

N ,S~N ...-N /Nr-\-l ..~~NH _) ,~

N \ O N ~ ~ / /s~ H3C O la.

23. FORMULAÇÃO_ FAR_MAC~UTIÇ_A, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o composto de fórmula I é (S)- 1-(4-((2-(2-aminopirimidin-5-il)-7-metil-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6- 5 il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona que possui fórmula lb: HO~O (O) ' N> N \__N~"N ~'y N "N I ) 'N~NH 2 lb.

24. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada pelo fato de que compreende um deslizante farmaceuticamente aceitável selecionado a partir de dióxido de silício, celulose em pó, celulose microcristalina, estearatos metálicos, aluminossilicato de sódio, 1o benzoato de sódio, carbonato de cálcio, silicato de cálcio, amido de milho, carbonato de magnésio, talco livre de asbestos, stearowet C, amido, amido 1500, laurilsulfato de magnésio, óxido de magnésio, e suas combinações.

25. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo uma das reivindicações 20 a 24, caracterizada pelo fato de que o composto de fórmula I e o agente quimioterápico compreendem, cada um, uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg por forma de dosagem unitária.

26. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo uma das reivindicações 20 a 25, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método de tratamento de uma malignidade hematopoiética selecionada a partir de linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células hematopoiéticas, linfoma folicular, linfoma de células do manto, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, LMA e LMC.

5 27. ARTIGO DE MANUFATURA, para o tratamento de uma malignidade hematopoiética, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma combinação terapêutica conforme definida em uma - das reivindicãções 1 a-14; e (b) instruções para uso.

28. PRODUTO, caracterizado pelo fato de que compreende um composto que possui fórmula I e um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina; como uma formulação combinada para uso separado, simultâneo ou sequencial no tratamento de uma malignidade hematopoiética selecionada a partir de linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células hematopoiéticas, linfoma folicular, linfoma de células do manto, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, LMA e LMC; em que o composto de fórmula I é 4-(2-(1 H-indazol-4-il)-6-((4- (metilsulfonil)piperazin-1-il)metil)tieno[3,2-d]pirimidin-4-il)morfolina que possui fórmula la: ou (S)-1-(4-( (2-(2-aminopirimidin-5-il)-7 -metil-4-morfolinotieno[3,2-

d]pirimidin-6-il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona que possui fórmula lb: H~Ho (o) ' N) N \_N~-..;;:N ~'y N "'N I ) 'N~NH 2 lb.

29. MÉTODO PARA DETERMINAR COMPOSTOS A SEREM UTILIZADOS- EM- COMBINAÇÃO -PARA O TRATAMENTO DE UMA MALIGNIDADE HEMATOPOIÉTICA, caracterizado pelo fato de que 5 compreende: (a) tratar uma linhagem celular de tumor hematopoiético in vitro com uma combinação terapêutica de um composto que possui fórmula I, e um agente quimioterápico, e (b) medir um efeito sinérgico ou não-sinérgico; por meio do qual uma combinação terapêutica sinérgica para o tratamento de câncer é determinada; em que o composto de fórmula I é 4-(2-(1 H-indazol-4-il)-6-((4- (metilsulfonil)piperazin-1-il)metil)tieno[3,2-d]pirimidin-4-il)morfolina que possui fórmula la: la ou (S)-1-(4-((2-(2-aminopirimidin-5-il)-7-metil-4-morfolinotieno[3,2- d]pirimidin-6-il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroxipropan-1-ona que possui fórmula lb:

lb.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é selecionado a ~partir -de - dexametason-a, tioTEPA, -doxorrubicina,- vincri-sti~a. rituximab, ciclofosfamida, prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, s e citarabina.

31. MÉTODO PARA SELECIONAR COMPOSTOS A SEREM UTILIZADOS EM COMBINAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar uma combinação terapêutica de um composto selecionado a partir de fórmula la e fórmula lb: () N /Nr-{J(:\5-NNH \ I N ~

O ~, N_) .-9 ,. ~ H3C O la HO O -o

H : :' N) C) \_N lb e um agente quimioterápico selecionado a partir de dexametasona, tioTEPA, doxorrubicina, vincristina, rituximab, ciclofosfamida,

prednisona, melfalam, lenalidomida, bortezomib, rapamicina, e citarabina em células tumorais;

(b) medir uma redução nos níveis de p-Akt; e

(c) selecionar uma combinação terapêutica sinérgica que exibe uma redução em níveis de p-Akt.