CN115991779B - 一种抗人ace2的抗体、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人ACE2的抗体、检测试剂盒及其应用，涉及生物医学技术领域。通过基因合成、载体构建，表达纯化人ACE2重组蛋白，以该重组蛋白为抗原免疫小鼠，制备单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得小鼠抗人ACE2单克隆抗体，筛选获得能够中和、阻断人ACE2的抗人ACE2单克隆抗体。此外，表达出的人源化人鼠嵌合抗体同样具有有效中和新型冠状病毒和冠状病毒的感染活性，能够阻断由新冠病毒(SARS‑Cov‑2)、冠状病毒(SRAS‑Cov)以及所有通过ACE2进入细胞的病毒对人体的感染。该单克隆抗体可用于人ACE2蛋白的检测以及以人ACE2作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种抗人ACE2的抗体、检测试剂盒及其应用。
背景技术
目前已知新型冠状病毒（SARS-CoV-2）进入人体细胞的主要受体蛋白是血管紧张素转化酶2（ACE2），该受体也是2003年爆发的引起蝙蝠源性严重急性呼吸综合征（SARS）的冠状病毒SARS-CoV的受体[1,2]。细胞表面受体是病毒感染并进入人体细胞的必需通道，受体缺陷或者利用抗体将受体封闭均可以阻断病毒的感染。ACE2也称为ACEH，该基因编码的蛋白属于二肽基羧基二肽酶的血管紧张素转换酶家族，与人血管紧张素转换酶1具有相当大的同源性。ACE2与Ang II的1型和2型受体有很强的亲和力，在体内参与调节血压、体液平衡、炎症、细胞增殖、肥大和纤维化。同时该基因的器官和细胞的特异性表达提示其可能在调节心血管和肾脏功能发挥作用[3,4]。ACE2基因敲除研究发现小鼠敲除ACE2后没有明显的异常，但在ACE2和ApoE双敲除的小鼠中呈现出增加的血管炎症和动脉粥样硬化症状；且ACE2敲除小鼠对于Ang II诱导的高血压更加易感[5,6]。这些研究说明暂时性的通过抗体封闭ACE2应该不会引起严重的副反应（病毒感染通常病程较短，不需要长期封闭），提示ACE2可以作为治疗SARS-CoV-2、SARS-CoV以及其他利用该受体感染宿主的病毒治疗靶点。
目前已有较多研究通过单克隆封闭抗体靶向新冠病毒的Spike蛋白，阻断病毒结合细胞受体从而抑制新冠病毒感染，但是随着病毒变体的不断出现这些针对Spike蛋白单抗的有效性逐渐受到限制。但是针对宿主受体蛋白ACE2进行阻断抗体研发将会很大程度上避免此类情况的发生。通过中和抗体阻断ACE2蛋白其中一个风险是可能会导致机体产生一定的副反应，但是从ACE2敲除小鼠的研究看来，暂时性封闭ACE2的副反应可能会导致血压升高，其风险是可控的（病毒感染通常进程较短，不需要长期封闭）。临床上已有不少抗体药物针对宿主表面蛋白进行封闭，如针对EGFR、VEGFR、PD-1的单抗药物等，均取得了较好的治疗效果，且副作用可控。
研发针对ACE2为靶点的中和抗体相比研发针对病毒蛋白单抗的优势是：针对ACE2为靶点的中和抗体能够阻断所有通过该靶点进入细胞的病毒感染宿主，例如已知的SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒；另外，冠状病毒是RNA病毒，容易产生变异，因此，针对病毒的疫苗和抗体类药物容易产生耐药。而针对病毒受体ACE2的抗体药物不会产生耐药。因此，针对ACE2为靶点开发阻断抗体具有更广泛的应用价值。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗人ACE2的抗体、检测试剂盒及其应用，一方面为新型冠状病毒（SARS-CoV-2）或冠状病毒（SARS-CoV）感染导致的疾病的治疗提供了预防和治疗药物；另一方面为所有通过ACE2受体感染宿主的病毒提供预防和治疗药物。本发明提供的抗人ACE2的抗体对于人ACE2具有较强的结合特异性和亲和力，能够有效中和新型冠状病毒和冠状病毒的感染活性，此外，表达出的人源化人鼠嵌合抗体同样具有有效中和新型冠状病毒和冠状病毒的感染活性，能够阻断由新冠病毒（SARS-Cov-2）、冠状病毒（SRAS-Cov）以及所有通过ACE2进入细胞的病毒对人体的感染。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗人ACE2的单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如下三个重链互补决定区CDR-VH1，CDR-VH2和CDR-VH3，轻链可变区包括如下三个轻链互补决定区CDR-VL1，CDR-VL2和CDR-VL3，CDR-VH1，CDR-VH2和CDR-VH3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示，CDR-VL1，CDR-VL2和CDR-VL3的氨基酸序列如SEQ IDNO：4-6所示。
CDR-VH1，SEQ ID NO：1的序列为：DYYMS；
CDR-VH2，SEQ ID NO：2的序列为：
FIRNKPNDYTTEYSASVKG；
CDR-VH3，SEQ ID NO：3的序列为：
DRGLRWAMDY；
CDR-VL1，SEQ ID NO：4的序列为：
SASSSVSFMH；
CDR-VL2，SEQ ID NO：5的序列为：DTSKLAS；
CDR-VL3，SEQ ID NO：6的序列为：
QQWSFNPLT。
本发明通过基因合成、载体构建，表达纯化人ACE2重组蛋白，以该重组蛋白为抗原免疫小鼠，制备单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得小鼠抗人ACE2单克隆抗体，筛选获得能够中和、阻断人ACE2的抗人ACE2单克隆抗体。经过测序，发现该抗体具有上述重链互补决定区和轻链互补决定区。该单克隆抗体可用于人ACE2蛋白的检测以及以人ACE2作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体选自嵌合抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法（包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在一种可选的实施方式中，将上述抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子量更小的单链抗体（ScFv），该抗体同样能够特异性识别人ACE2。
在一种可选的实施方式中，抗人ACE2的抗体为抗人ACE2人鼠嵌合单克隆抗体；
在一种可选的实施方式中，抗体包括轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。 FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4的序列依次如SEQ ID NO：7-10所示，FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4的序列依次如SEQ ID NO：11-14所示。
FR-L1 ，SEQ ID NO：7：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC。
FR-L2，SEQ ID NO：8：WYQQKSDTSPKRWIY。
FR-L3，SEQ ID NO：9：
GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC。
FR-L4，SEQ ID NO：10：FGAGTKLELKRA。
FR-H1，SEQ ID NO：11：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFSFT。
FR-H2，SEQ ID NO：12：WVRQPPGKALEWLG。
FR-H3，SEQ ID NO：13：
RFTISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCAR。
FR-H4，SEQ ID NO：14：WGQGTSVTVSS。
需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的单克隆抗体的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
在一种可选的实施方式中，抗体还包含抗体恒定区。
在一种可选的实施方式中，抗体恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
在一种可选的实施方式中，抗体恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、或人。
在一种可选的实施方式中，抗体恒定区的种属来源为人；
在一种可选的实施方式中，抗体恒定区选自人IgG4。
本发明以小鼠抗体可变区和人抗体IgG4恒定区组成克隆号为7-H7-B1的人鼠嵌合单克隆抗体，并验证了其具有有效中和新型冠状病毒和冠状病毒的感染活性，能够阻断由新冠病毒（SARS-Cov-2）、冠状病毒（SRAS-Cov）以及所有通过ACE2进入细胞的病毒对人体的感染。
第二方面，本发明还提供了一种人ACE2检测试剂或试剂盒，其包括上述的抗人ACE2的单克隆抗体。
检测试剂例如抗人ACE2的单克隆抗体试剂、标记有容易被检测的标记物的抗体试剂，本发明提供的单克隆抗体可以特异性结合ACE2，可用于以ACE2为标志物的相关疾病诊断或辅助诊断，这些疾病的包括但不限于肺炎、味觉和嗅觉减退或丧失、肠炎、脑炎等。
抗体标记有可被检测的标记物。
可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物（例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素（FAM）、四氯光素（TET）等或其类似物）、罗丹明类染料及其衍生物（例如包括但不限于红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等或其类似物）、Cy系列染料及其衍生物（例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物）、Alexa系列染料及其衍生物（例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物）和蛋白类染料及其衍生物（例如包括但不限于藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）、别藻蓝蛋白（APC）、多甲藻黄素-叶绿素蛋白（preCP）等）。
在可选的实施方式中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
第三方面，本发明还提供了一种ACE2阻断剂，其包括上述的抗人ACE2的单克隆抗体。
第四方面，本发明还提供了一种预防或治疗疾病的药物，药物包括上述的抗人ACE2的单克隆抗体，疾病是指通过ACE2进入人细胞的病毒感染所造成的疾病；
在一种可选的实施方式中，病毒选自新冠病毒（SARS-Cov-2）或冠状病毒（SRAS-Cov）；
在一种可选的实施方式中，疾病选自新冠病毒感染、味觉和嗅觉减退或丧失、肠炎或脑炎。
在可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒中所述单克隆抗体或其
第五方面，本发明还提供了一种抗人ACE2的单克隆抗体在制备预防或治疗疾病的药物中的应用，疾病是指通过ACE2进入人细胞的病毒感染所造成的疾病。
在一种可选的实施方式中，病毒选自新冠病毒（SARS-Cov-2）或冠状病毒（SRAS-Cov）。
在一种可选的实施方式中，疾病选自新冠病毒感染、味觉和嗅觉减退或丧失、肠炎或脑炎。
第六方面，本发明还提供了一种表达盒或载体，其含有编码上述的抗人ACE2的单克隆抗体的基因。
第七方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的载体。
第八方面，本发明还提供了上述抗人ACE2的单克隆抗体、表达盒或载体、宿主细胞在制备具有如下1）-4）至少一种功能的产品中的应用：
1）治疗或抑制新冠病毒（SARS-Cov-2）或冠状病毒（SRAS-Cov）；
2）中和新冠病毒（SARS-Cov-2）或冠状病毒（SRAS-Cov）；
3）结合新冠病毒（SARS-Cov-2）或冠状病毒（SRAS-Cov）的S蛋白；
4）阻断新冠病毒（SARS-Cov-2）或冠状病毒（SRAS-Cov）与被侵染宿主细胞表面ACE2的结合。例如具体通过阻断新冠病毒（SARS-Cov-2）的S蛋白与宿主细胞表面的ACE2的结合，通过封闭宿主细胞表面的ACE2，以阻断S蛋白与宿主细胞的表面的ACE2的结合。
第九方面，本发明还提供了一种生产上述的抗人ACE2的单克隆抗体的方法，其包括：
培养上述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到抗人ACE2的单克隆抗体。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术（化学合成、杂交瘤细胞）制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗人ACE2的单克隆抗体的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
本发明具有以下有益效果：
本发明一方面为新型冠状病毒（SARS-CoV-2）或冠状病毒（SARS-CoV）感染导致的疾病的治疗提供了预防和治疗药物；另一方面为所有通过ACE2受体感染宿主的病毒提供预防和治疗药物。本发明提供的抗人ACE2的抗体对于人ACE2具有较强的结合特异性和亲和力，能够有效中和新型冠状病毒和冠状病毒的感染活性，此外，表达出的人源化人鼠嵌合抗体同样具有有效中和新型冠状病毒和冠状病毒的感染活性，能够阻断由新冠病毒（SARS-Cov-2）、冠状病毒（SRAS-Cov）以及所有通过ACE2进入细胞的病毒对人体的感染。
本发明提供单克隆抗体可用于人ACE2蛋白的检测以及以人ACE2作为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为抗人ACE2的人鼠嵌合单克隆抗体抑制新冠病毒（SARS-Cov-2）感染293T-hACE2细胞的统计结果图。
图2为抗人ACE2的人鼠嵌合单克隆抗体抗抑制冠状病毒（SARS-Cov）感染293T-hACE2细胞的统计结果图。
图3为抗人ACE2人鼠嵌合单克隆抗体抑制新冠病毒（SARS-Cov-2）感染293T-hACE2细胞的IC50值测定结果图。
图4为抗人ACE2人鼠嵌合单克隆抗体抑制冠状病毒（SARS-Cov）感染293T-hACE2细胞的IC50值测定结果图。
图5 为抗人ACE2鼠单克隆抗体抑制新冠病毒（SARS-Cov-2）感染293T-hACE2细胞的统计结果图。
图6 为抗人ACE2鼠单克隆抗体抑制冠状病毒（SARS-Cov）感染293T-hACE2细胞的统计结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
人ACE2重组蛋白及小鼠抗人ACE2单克隆抗体的制备。
1.制备人ACE2重组蛋白。
利用基因工程技术构建人ACE2基因表达载体。我们将人ACE2 cDNA构建入pATX2(酶切位点EcoRI/NotI)表达载体，转化，摇菌，提取无内毒素质粒。转染质粒（500 μg）到500ml 293F细胞，待细胞活率降至50%左右，收集细胞培养上清, 1000 rpm离心5分钟去除细胞和细胞碎片，再10000 rpm高速离心5钟后用0.45uM滤膜过滤细胞培养上清。将细胞培养上清过镍柱，利用镍树脂亲和纯化人ACE2-His蛋白。
2、制备小鼠抗人ACE2单克隆抗体
（1）人ACE2重组蛋白免疫小鼠
用制备的人ACE2重组蛋白免疫3只Balb/c小鼠，在小鼠腋窝、脚掌和腹股沟皮下注射1mg/0.025 ml 抗原进行免疫。先进行初次免疫，再进行2-4次加强免疫，每一次的免疫间隔时间均为14天，最后一次加强免疫后第七天取小鼠血清测效价，测定效价符合标准则腹腔注射0.5ml 200 ug/ml抗原溶液进行冲击免疫，三天后取脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合。
（2）细胞融合
选取进行了冲击免疫并且血清效价符合的小鼠，摘除眼球取血用于杂交瘤筛选的阳性对照，然后颈部脱臼处死小鼠置于75％的酒精中消毒至少30秒，取小鼠脾脏制备成脾细胞悬液并计数，另取SP2/0骨髓瘤细胞并计数，将脾细胞和骨髓瘤细胞按5:1的比例混合在50 ml 离心管中，1000 rpm 离心5 min，弃去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀，将离心管置于37℃水浴中，向细胞沉淀内匀速加入已预热的PEG（1min内加入1ml），加入PEG 过程中，一边转动离心管一边用枪头的尖端温柔地搅拌，静止90s。匀速加入已预热的1640 基本培养基（第一次），1 min 内加入1 ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640 基本培养基（第二次），1 min 内加入2 ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640 基本培养基（第三次），3 min 内加入9 ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640 基本培养基，边加边温柔地搅拌直至40 ml，将离心管置于37℃水浴中静置3 min。已融合的细胞悬液经800 rpm 离心5 min，去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀，根据脾细胞数加入适量的HAT培养基，吹打混匀，接种到96 孔细胞培养板，HAT选择培养基维持7～10天后换用HT培养液。在选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，收集细胞培养上清开始检测特异性抗体，筛选出含有阳性抗体的孔。
（3）ELISA检测抗体
利用ACE2重组蛋白抗原溶液100μl（2 ug/ml）包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天去除包被液，加入5% 脱脂牛奶300ul/孔室温封闭1小时，去除封闭液，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加一抗100ul/孔37℃孵育60分钟，去除一抗，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加入二抗100ul/孔37℃孵育30分钟，去除二抗，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加入TMB显色液100ul/孔37℃孵育5-20 min，观察显色情况，加入终止液2 M 盐酸50ul/孔，选择450-620 nm波长，酶标仪读取吸光值。
（4）杂交瘤亚克隆
通过有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行亚克隆。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内重悬起来计数，调整为10个细胞/ml，每孔加入稀释细胞100μl，置于37℃ 8% CO2培养箱，培养8-9 天收培养液上清检测抗体活性，选择单克隆杂交瘤生长良好的阳性孔，转移到24 孔板再做亚克隆或扩大培养。
（5）生产小鼠抗人ACE2单克隆抗体
提前7-21天给小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂，收集杂交瘤细胞，密度调整为2×106个/ml，选取注射过不完全佐剂的小鼠腹腔注射杂交瘤细胞2×106/0.5ml/只，细胞注射后7-12 天收集小鼠腹水，将小鼠腹水过Protein G亲和层析纯化柱，用0.1M 甘氨酸溶液（pH 2.5）进行洗脱，用1 M Tris-HCl（pH 9.0）溶液进行中和，PH试纸测试洗脱液是否为中性，然后过50KD的超滤柱，将抗体置换在PBS中，测定抗体浓度，同时取2ug抗体跑胶考染验证抗体纯度。
（6）筛选具有阻断SARS-Cov-2以及SARS-CoV假病毒感染的小鼠抗人ACE2单克隆抗体
将新冠假病毒（SARS-Cov-2）感染表达人ACE2的293T细胞，同时加入对照抗体和小鼠抗人ACE2单克隆抗体（10 ug/ml），37度培养箱孵育48小时收集细胞，通过荧光素酶活性测定检测SARS-Cov-2假病毒感染情况。将冠状病毒假病毒（SARS-Cov）感染表达人ACE2的293T细胞，同时加入对照抗体和小鼠抗人ACE2单克隆抗体（10 ug/ml），37度培养箱孵育48小时收集细胞，通过荧光素酶活性测定检测SARS-Cov假病毒感染情况。
通过细胞感染实验，我们筛选出1株能够同时阻断SARS-Cov-2以及SARS-CoV病毒感染的小鼠抗人ACE2单克隆抗体：克隆号为E13D47。
3、杂交瘤细胞测序/可变区基因测序
待杂交瘤细胞长至对数生长期收集细胞（克隆号为E13D47），提取杂交瘤细胞总RNA，利用3’RACE技术与5’RACE技术，RT-PCR得到与全长mRNA互补的第一链cDNA，以合成的cDNA作为模板，PCR扩增获得抗体重链与轻链可变区基因，将抗体可变区基因连接至T载体，转化并挑选阳性克隆进行测序，通过生物信息学分析测序结果，得到抗体可变区基因序列，如SEQ ID NO：1-6所示。
实施例2
ACE2重组抗体的制备
1、表达重组抗体质粒构建
将人IgG4抗体的重链和轻链的恒定区克隆入pCAGGS载体，再将获得的小鼠抗人ACE2的鼠源抗体的重链和轻链可变区插入含有人IgG4抗体恒定区的pCAGGS表达载体中，构建成重组抗体表达载体，转染293F哺乳动物细胞进行重组抗体表达（500 ug/500 ml）。克隆号为7-H7-B1的人鼠嵌合单克隆抗体是由小鼠抗体可变区和人抗体IgG4恒定区组成。
2、重组抗体的表达与纯化
转染293F细胞后继续培养5-6天，收集细胞培养上清，利用Protein G亲和层析纯化柱纯化上清中的抗ACE2重组人鼠嵌合抗体。
实施例3
抗ACE2重组人鼠嵌合抗体的特性鉴定
1、使用抗ACE2人鼠嵌合抗体进行阻断新冠病毒假病毒（SARS-Cov-2）感染表达人ACE2的细胞实验：
将新冠病毒假病毒（SARS-Cov-2）感染表达人ACE2的293T细胞，加入ACE2人鼠嵌合单克隆抗体（E13D47, 0.5 ug/ml，5 ug/ml），37度培养箱孵育48小时收集细胞， 利用Promega公司的Luciferase Assay System（Cat.#E1501）进行荧光素酶活性测定检测病毒感染情况。
结果参照图1和图3所示，结果显示，加入ACE2人鼠嵌合单克隆抗体能够显著抑制病毒的感染，阻断新冠病毒假病毒（SARS-Cov-2）感染。且具有一定的浓度依赖性，ACE2人鼠嵌合单克隆抗体的浓度越高，阻断效果越好。
2、使用抗ACE2人鼠嵌合抗体进行阻断冠状病毒（SARS-Cov）感染表达人ACE2的细胞实验：
将冠状病毒（SARS-Cov）感染表达人ACE2的293T细胞，加入ACE2人鼠嵌合单克隆抗体（E13D47, 10 ug/ml），37度培养箱孵育48小时收集细胞，利用Promega公司的LuciferaseAssay System（Cat.#E1501）进行荧光素酶活性测定检测病毒感染情况。
结果参照图2和图4所示，结果显示，加入ACE2人鼠嵌合单克隆抗体能够显著抑制病毒的感染，阻断冠状病毒（SARS-Cov）感染。且具有一定的浓度依赖性，ACE2人鼠嵌合单克隆抗体的浓度越高，阻断效果越好。
发明人还对实施例1中鼠抗人单抗进行单独的性能检测，实验方法同本实施例使用抗ACE2人鼠嵌合抗体进行阻断新冠病毒假病毒（SARS-Cov-2）或冠状病毒（SARS-Cov）感染表达人ACE2的细胞实验，区别在于抗体不同。
图5和图6所示，结果显示加入小鼠抗人ACE2单克隆抗体能够显著抑制病毒的感染，阻断新冠病毒假病毒（SARS-Cov-2）感染以及冠状病毒（SARS-Cov）的感染。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
参考文献
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Claims (17)
1.一种抗人ACE2的单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区包括如下三个重链互补决定区CDR-VH1，CDR-VH2和CDR-VH3，所述轻链可变区包括如下三个轻链互补决定区CDR-VL1，CDR-VL2和CDR-VL3，CDR-VH1，CDR-VH2和CDR-VH3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3所示，CDR-VL1，CDR-VL2和CDR-VL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示。
2.根据权利要求1所述的抗人ACE2的单克隆抗体，其特征在于，所述抗人ACE2的单克隆抗体为抗人ACE2人鼠嵌合单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的抗人ACE2的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4，FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4的序列依次如SEQ ID NO：7-10所示，FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4的序列依次如SEQ ID NO：11-14所示。
4.根据权利要求1所述的抗人ACE2的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体还包含抗体恒定区。
5.根据权利要求4所述的抗人ACE2的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体恒定区选自人IgG4。
6.一种人ACE2检测试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的抗人ACE2的单克隆抗体。
7.一种ACE2阻断剂，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的抗人ACE2的单克隆抗体。
8.一种预防或治疗疾病的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1-5任一项所述的抗人ACE2的单克隆抗体，所述疾病是指通过ACE2进入人细胞的病毒感染所造成的疾病。
9.根据权利要求8所述的预防或治疗疾病的药物，其特征在于，所述病毒选自新冠病毒或冠状病毒。
10.根据权利要求8所述的预防或治疗疾病的药物，其特征在于，所述疾病选自新冠病毒感染、味觉和嗅觉减退或丧失、肠炎或脑炎。
11.如权利要求1-5任一项所述的抗人ACE2的单克隆抗体在制备预防或治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病是指通过ACE2进入人细胞的病毒感染所造成的疾病。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述病毒选自新冠病毒或冠状病毒。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述疾病选自新冠病毒感染、味觉和嗅觉减退或丧失、肠炎或脑炎。
14.一种表达盒或载体，其特征在于，其含有编码权利要求1-5任一项所述的抗人ACE2的单克隆抗体的基因。
15.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求14所述的载体。
16.权利要求1-5任一项所述的抗人ACE2的单克隆抗体、权利要求14所述表达盒或载体或权利要求15所述的宿主细胞在制备具有如下1）-4）至少一种功能的产品中的应用：
1）治疗或抑制新冠病毒或冠状病毒；
2）中和新冠病毒或冠状病毒；
3）结合新冠病毒或冠状病毒的S蛋白；
4）阻断新冠病毒或冠状病毒与被侵染宿主细胞表面ACE2的结合。
17.一种生产权利要求1~5任一项所述的抗人ACE2的单克隆抗体的方法，其特征在于，其包括：
培养权利要求15所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述抗人ACE2的单克隆抗体。
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