CN113501874B

CN113501874B - 一种抗人cd47蛋白的抗体、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113501874B
Application number: CN202110911101.4A
Authority: CN
Inventors: 付康; 李胡丹
Original assignee: SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd
Current assignee: SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd
Priority date: 2021-08-09
Filing date: 2021-08-09
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2041-08-09
Also published as: CN113501874A

Abstract

本发明公开了一种抗人CD47蛋白的抗体、检测试剂盒及其应用，涉及抗体技术领域。该抗体可以特异性地结合人CD47蛋白，对人CD47蛋白具有较高的亲和力，该抗体与CD47蛋白具有较高的结合特异性和灵敏度。本发明为解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用提供了更为丰富的抗体选择，以期重新恢复机体免疫细胞功能，达到抑制肿瘤生长的效果。

Description

一种抗人CD47蛋白的抗体、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗人CD47蛋白的抗体、检测试剂盒及其应用。

背景技术

肿瘤是全球第二大导致人类死亡的病因。无论在发达国家还是在发展中国家，肿瘤导致的癌症都是死亡率最高的疾病，并且其死亡率和发病率仍不断增高。全球癌症疾病报告显示：过去十年里，全球癌症发病率升高了33％。仅2015年，就有1520万人被诊断为癌症，并有880万人因此死亡；而发展中国家的癌症死亡率高于发达国家，患病人数占到全球的57％，死亡人数高达全球的65％，因此抗肿瘤药物市场的潜力十分巨大。

几乎所有的肿瘤细胞都具有通过提高自身CD47蛋白表达，不但使其周围多种免疫细胞正常免疫杀伤功能受到抑制，而且表现出促进肿瘤组织扩增和转移的特性，这种特性能够导致患者病情进一步恶化。相关研究表明，阻断肿瘤细胞CD47相关的信号通路，能够解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，从而激活肿瘤微环境中免疫细胞，尤其是巨噬细胞的杀伤功能，杀伤肿瘤细胞；活化的巨噬细胞通过吞噬靶细胞，发挥其抗原提呈的功能，特异性的活化T细胞，通过活化的T细胞发挥的细胞毒作用，进一步杀伤肿瘤细胞。

利用抗体结合细胞表面蛋白靶点治疗多种肿瘤和类风湿等免疫疾病已取得显著的效果；截至目前，经FDA批准上市的相关药物已超过60种。相关研究已经证明，利用抗CD47单克隆抗体，在体内特异性结合肿瘤细胞表面高表达的CD47蛋白，能够有效解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，重新恢复机体免疫细胞功能，达到抑制肿瘤生长的效果。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人CD47蛋白的抗体、检测试剂盒及其应用，该抗体可以特异性地结合人CD47蛋白，对人CD47蛋白具有较高的亲和力，该抗体与CD47蛋白具有较高的结合特异性和灵敏度。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种抗人CD47蛋白的抗体或其功能性片段，抗体或其功能性片段包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；

互补决定区CDR-VH1为DYYIN；

互补决定区CDR-VH2为DINPGRGKTYYIEKFKG；

互补决定区CDR-VH3为GGLRRFDY；

互补决定区CDR-VL1为RASSSVSSSYLH；

互补决定区CDR-VL2为STSTLAS；

互补决定区CDR-VL3为QQYSGYPYT。

发明人发现：具有上述互补决定区结构的抗体或其功能性片段，可以使得抗体或其功能性片段能够特异性结合抗人CD47蛋白，对其具有较好的亲和力，该抗体或其功能性片段能特异性识别人族分化抗原47(CD47)，能够作为免疫活化物刺激机体的免疫反应，有可能产生抗肿瘤等疾病的效果。本发明为解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用提供了更为丰富的抗体选择，以期重新恢复机体免疫细胞功能，达到抑制肿瘤生长的效果。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示或其具有至少80％同源性的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8或其具有至少80％同源性所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

在一种实施方式中，上述抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8)可以具有至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述抗体还包括恒定区。

在一种可选的实施方式中，上述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

在一种可选的实施方式中，上述恒定区的种属来源为小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。

在一种可选的实施方式中，上述功能性片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

在一种可选的实施方式中，上述抗体或其功能性片段与人CD47蛋白以K≤0.67×10⁹L/mol的亲和力结合。

在一种可选的实施方式中，K≤0.6×10⁹L/mol、K≤0.5×10⁹L/mol、K≤0.4×10⁹L/mol、K≤0.3×10⁹L/mol、K≤0.2×10⁹L/mol、K≤0.1×10⁹L/mol、K≤0.9×10⁸L/mol、K≤0.8×10⁸L/mol、K≤0.7×10⁸L/mol、K≤0.6×10⁸L/mol、K≤0.5×10⁸L/mol、K≤0.4×10⁸L/mol、K≤0.3×10⁸L/mol、K≤0.2×10⁸L/mol或K≤0.1×10⁸L/mol。

在一种可选的实施方式中，K≤0.13×10⁹L/mol。

本发明还提供了一种检测试剂盒，试剂盒含有上述的抗体或其功能性片段。

在一种可选的实施方式中，抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。

可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

可被检测的标记物包括不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在可选的实施方式中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的抗体或其功能性片段。

本发明还提供了一种重组细胞，其含有重组载体，重组载体含有上述的核酸分子。

本发明还提供了一种制备上述抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养上述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到抗体或其功能性片段。

在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

本发明还提供了上述抗体或其功能性片段在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，肿瘤的诊断标志物为人CD47蛋白。

本发明还提供了上述抗体或其功能性片段在制备由人CD47蛋白介导的相关疾病的药物中的应用。

人CD47蛋白与多种胞内外蛋白如凝血栓蛋白1(TSP1)和信号调节蛋白α(SIRPα)发生相互作用，参与多种信号通路的调控，这些信号通路在多种疾病如肿瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。

信号通路包括不限于NO/cGMP信号通路。

在一种实施方式中，由人CD47蛋白介导的相关疾病包括如下疾病中的至少一种：肿瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病。

上述心血管疾病主要的临床表现包括卒中、黄斑变性、外周血管病、高血压、心脏和其他关键器官衰竭、心脏病、伤口愈合不良等。

自身免疫性疾病包括不限于：实验性变态反应性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)、细菌或胶原诱导的关节炎、接触性超敏反应、结肠炎和克罗恩病。

此外，上述抗体或其功能性片段可以制备噬血细胞综合征药物中的用途。

本发明还提供了含有上述的抗体或其功能性片段的免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的抗人CD47的抗体及其功能性片段具有较高的亲和力，能特异性识别人类细胞系MD-MB-231及Jurkat等细胞中表达的CD47蛋白。本发明提供的抗CD47的抗体一定浓度下不引起人红细胞凝集。发明人研究表明，本发明提供的抗CD47的抗体对Jurkat细胞具有显著的抑制作用。本发明为解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用提供了更为丰富的抗体选择，以期重新恢复机体免疫细胞功能，达到抑制肿瘤生长的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为单克隆细胞株7G7流式细胞仪检测结果图；

图2为抗体浓度的对数与OD450曲线图；

图3为抗体与人类细胞系MD-MB-231及Jurkat细胞中表达的CD47蛋白的结合的流式细胞仪检测结果图；

图4为红细胞凝集实验结果图；

图5为CD47抗体与Jurkat细胞共孵育第24h、48h、72h后的450nm处吸光值统计结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例通过融合杂交瘤技术获得特异性抗CD47的小鼠单克隆抗体。

(1)动物免疫：

根据文献中(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)通用的方法免疫小鼠。免疫原为生工生物工程(上海)股份有限公司表达的重组人CD47带his标签的蛋白。同时以它作为血清效价和杂交瘤筛选用的检测抗原。取适量重组蛋白经PBS稀释后与福氏佐剂等体积混合，电动搅拌器充分乳化后使抗原形成稳定油包水的溶液，而后取6-8周龄balb/c小鼠，背部皮下多点注射免疫。加强免疫后7-10天进行小鼠效价检测，选择效价高的免疫小鼠进行腹腔注射冲击免疫，冲击免疫三天后进行细胞融合。

(2)杂交瘤融合和筛选：

细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,扩增至一定数量，调整细胞至对数生长期。处死免疫小鼠，无菌环境取脾，根据文献中的方法使用PEG化学融合脾B细胞和SP2/0骨髓瘤细胞。融合后的细胞铺96孔细胞培养板，根据细胞生长情况，7～10天对融合板进行全量换液，全量换液后1～2天，取各孔上清，用ELISA方法进行检测。

方法如下：抗原用CBS(pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释至1ug/ml，加入ELISA板条，100ul/孔，4℃过夜。弃去包被液，加入3％的脱脂奶粉-PBS，200ul/孔，置于37℃下2小时。融合板克隆上清依次加入包被好的ELISA板中，然后置37℃中孵育1.5小时。弃去板孔中溶液，ELISA洗液洗涤三次。加入1:7500稀释的羊抗鼠IgG-HRP，100ul/孔，37℃中孵育1小时。弃去板孔中溶液，ELISA洗液洗涤三次。加入ELISA显色液，100ul/孔，37℃中孵育10min。加入ELISA终止液，50ul/孔，酶标仪读取OD值。

ELISA阳性的克隆，继续取上清进行流式检测。方法如下：取培养好的MDA-MB-231细胞，消化离心后调整细胞浓度至1×106个/ml，100ul/孔加入96孔板中。设置阴性对照，阳性对照，然后依次加入阳性克隆上清，100ul/孔，室温反应1小时。1200rpm离心5分钟，去上清，用3％FBS-PBS洗2次。加入1:500羊抗鼠IgG-CY3,100ul/孔,室温避光反应1小时。1200rpm离心5分钟，去上清，用3％FBS-PBS洗2次，最后一次加200ul 3％的FBS-PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。流式检测阳性的克隆，采用有限稀释法进行克隆化，筛选出单克隆。再经过连续两次流式检测阳性的单克隆即可建株并扩培保种。通过这种方法我们得到了1株流式阳性的单克隆细胞株7G7。

流式细胞仪检测结果参照图1所示。

实施例2

通过DNA克隆和测序，获得抗人CD47单克隆抗体的可变区基因序列。

使用Trizol试剂提取实施例1中的杂交瘤细胞株7G7中的总RNA。收集在9cm皿中培养的细胞到15ml离心管中，离心去上清。加入1ml的Trizol试剂并将细胞吹打均匀使细胞裂解，将裂解后样品转至1.5ml离心管室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12000rpm4℃离心10min。吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。12000rpm4℃离心10min，弃上清。加入1ml75％乙醇洗涤沉淀。12000rpm4℃离心3min，弃上清。室温干燥5-10min。加入30-50ulRNase-free ddH₂O。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。

选用AMV第一链cDNA合成试剂盒把总RNA逆转录为cDNA。实验体系配制如下，6ul的总RNA+1ul Oligo dT+4ul RNase-free水(共11ul)。轻轻混匀后离心3-5s，反应混合物在65℃温浴5min预变性后，冰浴30s，然后离心3-5s，接着冰浴2min。在冰浴状态下加入4ul的5◇缓冲液+1ul的dNTP混合物+1ul的RNase抑制剂+1ul逆转录酶(总共20ul体系)，轻轻混匀后离心3-5s，在PCR仪上42℃50分钟，85℃5min，完成cDNA合成。随机引物适合于500bp以下的短链cDNA的合成，所转录的RNA模板无需poly(A)尾，可转录5`端区域。

轻链与重链的PCR扩增。对于扩增抗体轻链可变区序列，配置PCR反应体系：2×Taq酶缓冲液25ul+FP-VL 1ul+RP-VL 1ul+cDNA2ul+ddH₂O 21ul。对于扩增抗体重链可变区序列，配置PCR反应体系：2◇Taq酶缓冲液25ul+FP-VH 1ul+RP-VH 1ul+cDNA 2ul+ddH₂O21ul。重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复35个循环)：

步骤1-预变性94℃，4min；

步骤2-变性94℃，30sec；

步骤3-退火55℃，45sec；

步骤4-延伸72℃，60sec；

步骤5-72℃，10min；

步骤6-保存4℃。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH的约为375bp，VL的约为325bp)，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA提取。

简述如下：从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重；加入胶块重量3-6倍的buffer B2，50℃水浴5-10分钟溶胶；将溶胶液移入吸附柱中，8000g离心30秒；倒掉收集管中的液体；柱中加入500ul wash Solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中液体；再重复加wash solution一次，倒掉液体；孔吸附柱于9000g离心1分钟；将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40ul Elution Buffer,室温静置1分钟后，离心1分钟。获得制备的DNA溶液，纯化PCR产物经过测序获得抗体的可变区序列。测序结果见下表1所示。

表1单克隆细胞株7G7分泌的鼠抗人CD47单克隆抗体的VH和VL的氨基酸序列及其编码核苷酸序列。

实施例3

本实施例进行抗体亲和力检测。

将实施例1重组人CD47带his标签的蛋白按照3mg/L、1.5mg/L、0.75mg/L、0.375mg/L包板；调整抗体浓度至10^-7mol/L水平，然后倍比稀释1:2～1:256，加至不同抗原包被量的孔中；加入二抗，TMB显色，检测450nm吸光值。根据抗原抗体结合S曲线，求出不同抗原浓度下，半数吸光值的抗体浓度。半数吸光值的抗体浓度可通过IGOR软件计算获得。这样就有四个抗体浓度(mol/L)，AB1，AB2，AB3，AB4。代入公式K＝(N-1)/(N*AB’-AB)计算亲和力常数。AB’代表抗原浓度为AG’时，产生半数吸光值的抗体浓度。N＝AG/AG’(AG>AG’)。当N＝2时，可以得到3个K值；当N＝4时，可以得到2个K值；当N＝8时，可以得到1个K值。求出6个K值的平均值即为最终结果。

根据ELISA检测结果计算出各抗原包被浓度下的OD450的抗体浓度，结果如下表所示，抗体浓度的对数与OD450曲线图参照图2所示(X轴表示抗体浓度的对数，Y轴表示OD₄₅₀)：

6个K值的平均值如下表所示，由下表可知，抗体亲和力常数为K＝1.39×10⁸L/mol。

实施例4

与天然蛋白的结合鉴定。

通过流式细胞术测定CD47抗体与表达CD47的细胞系MDA-MB-231及Jurkat的结合。实验方法：将收集上述细胞离心去上清，稀释至1×10⁶个/ml,100ul/孔加入96孔板中，即1×10⁵个细胞/孔。抗CD47抗体稀释至10ug/ml，按100ul/孔加入到上述细胞中，室温孵育60min。离心去上清，用10％FBS-PBS洗两次。加入1:500稀释的羊抗鼠IgG-CY3，100ul/孔，室温孵育1小时。离心去上清，用10％FBS-PBS洗两次，最后一次加200ul 10％FBS-PBS重悬细胞。空白对照用10％FBS-PBS代替。使用流式细胞仪上机检测，检测结果参照图3所示。

图3结果显示：与Jurkat结合时，空白对照平均荧光强度(MFI)154，检测抗体平均荧光强度(MFI)142036；与MDA-MB-231结合时，空白对照平均荧光强度(MFI)1631，检测抗体平均荧光强度(MFI)249614，表明本发明提供的抗体能特异性识别人类细胞系MD-MB-231及Jurkat细胞中表达的CD47蛋白。

检测结果参照如下表所示：

编号	平均荧光强度(MFI)
		1.fcs	154
2.fcs	142036
		6.fcs	1631
7.fcs	249614

实施例5

本实施例进行红细胞凝集实验。

待检抗体按100ug/ml浓度，进行倍比稀释，加入96孔U型板中，设置100ul/孔。将新鲜人全血用生理盐水稀释5倍，混匀后加入上述U型96孔板中，20ul/孔。室温反应1小时后观察结果。

结果判定按照如下标准进行：

++++:100％红细胞凝集,凝集颗粒均匀地分布在整个孔底，呈薄状。

+++:75％红细胞凝集,孔底红细胞呈滴状，凝集边缘不整齐。

++:50％红细胞凝集,孔底形成环状,周围有凝集颗粒,但不成膜状。

+:25％红细胞凝集,孔底形成-一个小团，但小团边缘不整齐,周围有少量凝集。

-:红细胞完全不凝集,红细胞在孔底形成小团，小团边缘整齐,周围无凝集颗粒。

红细胞凝集实验结果参照图4以及下表所示，结果显示，抗CD47-7G7在浓度在100ug/ml时仍为一个“+”，低于0.39ug/ml时红细胞完全不凝集。

抗体浓度

100ug/ml

50ug/ml

25ug/ml

12.5ug/ml

6.25ug/ml

3.123ug/ml

结果判定

+

抗体浓度

1.56ug/ml

0.78ug/ml

0.39ug/ml

0.2ug/ml

0.1ug/ml

0.05ug/ml

结果判定

+

-

实施例6

本实施例进行细胞增殖抑制实验。

实验方法：将Jurkat细胞以8×10³个/孔的密度种植于96孔板，每孔加入100μl含10％FBS的1640培养基。37℃5％CO₂培养过夜，分别用终浓度为25、50、100μg/ml的实施例1中的CD47-7G7抗体处理细胞，抗体用10％FBS的1640培养基稀释，每孔加入100μl。空白对照(Control)仅加入等量培养基。分别于加入抗体后第24h、48h、72h加入20μl/孔的CCK8工作液，培养箱中孵育3h后检测450nm处吸光值。

结果参照图5所示，CD47-7G7抗体处理对Jurkat细胞具有显著的抑制作用，并呈现一定的剂量和时间依赖性。抗体处理24小时后，浓度在50ug/ml有显著性抑制作用；抗体处理48小时后，浓度在100ug/ml有显著性抑制作用；抗体处理72小时后，浓度在25ug/ml有显著性抑制作用(ns:无显著性差异；*：P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 生工生物工程（上海）股份有限公司

<120> 一种抗人CD47蛋白的抗体、检测试剂盒及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Val Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Asp Ile Asn Pro Gly Arg Gly Lys Thr Tyr Tyr Ile Glu Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Leu Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Val Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 11

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcaaactgc agcagtcagg agctgagctg gcgaggcccg gggcttcagt gaagctgtcc 60

tgcacggctt ctggctacac cttcactgac tactatataa actgggtgag gcagaggact 120

ggacagggcc ttgagtggat tggagacatt aatcctggaa gaggtaaaac ttactacatt 180

gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240

cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag agggggattg 300

cgacgttttg actactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348

<210> 12

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gacattgagc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgtat ctccagggga aaaggtcacc 60

atgacctgca gggccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

tcaggtgtct cccccaaact ctggatttat agcacatcca ccttggcttc tggagtccct 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagtgtggag 240

gctgcagatg ctgccactta ttactgccag cagtacagtg gttacccata cacgttcgga 300

gggggcacca aggtggaaat taaacgg 327

Claims

1.一种抗人CD47蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括互补决定区CDR-VH1、互补决定区CDR-VH2、互补决定区CDR-VH3、互补决定区CDR-VL1、互补决定区CDR-VL2和互补决定区CDR-VL3；

互补决定区CDR-VH1为DYYIN；

互补决定区CDR-VH2为DINPGRGKTYYIEKFKG；

互补决定区CDR-VH3为GGLRRFDY；

互补决定区CDR-VL1为RASSSVSSSYLH；

互补决定区CDR-VL2为STSTLAS；

互补决定区CDR-VL3为QQYSGYPYT。

2.根据权利要求1所述的抗人CD47蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示或其具有至少80%同源性的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8或其具有至少80%同源性的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

3.根据权利要求1所述的抗人CD47蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体还包括恒定区。

4.根据权利要求3所述的抗人CD47蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

5.根据权利要求3所述的抗人CD47蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。

6.根据权利要求1所述的抗人CD47蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

7.根据权利要求1所述的抗人CD47蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段与人CD47蛋白以K≤0.67×10⁹L/mol的亲和力结合。

8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-7任一项所述的抗体或其功能性片段。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

11.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-7任一项所述的抗体或其功能性片段。

12.一种重组细胞，其特征在于，其含有重组载体，所述重组载体含有权利要求11所述的核酸分子。

13.一种制备如权利要求1-7任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求12所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。

14.权利要求1-7任一项所述的抗体或其功能性片段在制备肿瘤诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述肿瘤的诊断标志物为人CD47蛋白。

15.权利要求1-7任一项所述的抗体或其功能性片段在制备由人CD47蛋白介导的相关疾病的药物中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述由人CD47蛋白介导的相关疾病包括如下疾病中的至少一种：肿瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病。

17.含有权利要求1-7任一项所述的抗体或其功能性片段的免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。