JPH11508125A - 繊維芽細胞増殖因子相同因子−１（ｆｈｆ−１）および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なタンパク質である繊維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−１をコードするポリヌクレオチド配列、および推定されるアミノ酸配列を開示する。さらに、ＦＨＦ−１ポリペプチド、ＦＨＦ−１ポリヌクレオチド配列、およびＦＨＦ−１と特異的に結合する抗体を用いる診断および治療方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 繊維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ−１） および使用方法 発明の背景 １．発明の利用分野 本発明は、一般的には増殖因子に関するものであり、より特定的には繊維芽細 胞増殖因子相同因子−１（fibroblast growth factor homologous factor-1:Ｆ ＨＦ−１）と称する繊維芽細胞増殖因子ファミリーの新規なメンバーおよびＦＨ Ｆ−１をコードするポリヌクレオチドに関するものである。 ２．関連技術の説明 繊維芽細胞増殖因子ファミリーは、in vivo およびin vitroにおいて広範囲の 増殖促進、生存および／または分化活性を有する、構造的に関係のあるタンパク 質の一群を包含する（Baird，A．and Gospodarowicz，D.，Ann N.Y．Acad．Sci. ，638: 1，1991; Eckenstein，F.P.，J．Neurobiology 25: 1467，1994; Mason ，I.，J．Cell，78: 547，1994 に論評されている）。１９９４年１２月現在で 、このファミリーの９つのメンバーが分子クローニングにより特性付けられてい る。特性付けられた最初の２つのメンバーである、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａ ＦＧＦ／ＦＧＦ−１）と塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）は 、例えば脳、眼、腎臓、胎盤、副腎を含めて、多数の組織で見いだされている（ Jayeら，Science 233: 541，1986; Abraham ら，Science 233: 545，1986）。こ れらの因子は、繊維芽細胞、内皮細胞、海馬および大脳皮質ニューロン、大グリ ア細胞を含めて、中胚葉および神経外胚葉由来のさまざまな組織の強力な分裂促 進因子および生存因子であることが判明している（Burgess，W.H．and Maciag， T.，Ann．Rev．Biochemistry 58: 575，1989）。ＦＧＦファミリーの追加のメン バーとしては、マウス乳癌ウイルスの通常の組込み部位の１つとして同定され、 それゆえ発癌因子であると推定されるｉｎｔ−２／ＦＧＦ−３(Smith ら，EMBO J．7: 1013，1988); NIH 3T3 トランスフェクションアッセイで形質転換遺伝子 とし て同定されたＦＧＦ−４（Delli-Boviら，Cell 50: 729，1987）およびＦＧＦ− ５(Zhan ら，Mol．Cell Biol．8，3487，1988); ＦＧＦ−４に対する相同性に基 づいて分子クローニングにより単離されたＦＧＦ−６(Maricsら，Oncogene 4: 3 35，1989); ケラチノサイトの分裂促進因子として同定されたケラチノサイト増 殖因子／ＦＧＦ−７(Finch ら，Science 245: 752，1989);乳癌細胞のアンドロ ゲン誘導分裂促進因子として同定されたＦＧＦ−８(Tanakaら，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 89: 8928，1992); および一次神経膠星状細胞の分裂促進因子とし てのＦＧＦ−９（Miyamotoら，Mol．Cell Biol．13: 4251，1993）などがある。 ａＦＧＦおよびｂＦＧＦを含めて数種のＦＧＦは古典的なシグナル配列をもたず 、それらの分泌機構は不明である。 ＦＧＦファミリーの全メンバーはおよそ２５％またはそれ以上のアミノ酸配列 同一性を有し、この相同度はそれらがほぼ同一の三次元構造を共有するらしいこ とを示唆する。この推論はＸ線回折により測定されたｂＦＧＦとインターロイキ ン１−βの三次元構造の比較により支持される（Erikssonら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 88: 3441，1991; Zhangら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88: 3446 ，1991; Agoら，J．Biochem．110: 360，1991）。これらのタンパク質はアミノ 酸同一性が１０％しかないが、２つの結晶構造のα炭素バックボーンは２オング ストローム未満の二乗平均の平方根の偏差でもって重ね合わせることができる(Z hang ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88: 3446，1991)。両タンパク質はほと んど完全にβシートから成っていて、３コピーの四本鎖β曲折モチーフから構成 されたバレルを形成している。ヘパリン結合性およびレセプター結合性と思われ る両領域が該タンパク質の一面上の近接した領域に位置づけられる。 ａＦＧＦ、ｂＦＧＦおよびＦＧＦ−７／ＫＧＦは、細胞表面のチロシンキナー ゼ受容体への高親和性結合を介して生物学的活性の一部または全部を発揮するこ とがわかっている(例えば、Lee，P.L．ら，Science 245: 57，1989; Johnson，D .E．and Williams，L.T.，Adv．Cancer Res．60: 1，1993)。また、ＦＧＦファ ミリーの多くのメンバーはヘパリンに強固に結合し、ヘパリンとＦＧＦと膜貫通 受容体の三成分複合体は生物学的に有意義なシグナル伝達種であり得る。これま でに、ＦＧＦファミリーのメンバーの受容体をコードする４種類の遺伝子が同定 されている。最近の研究から、細胞外リガンド結合ドメイン内の示差的ｍＲＮＡ スプライシングにより受容体多様性が増加することがわかり、異なるリガンド結 合特性をもつ複数の受容体イソ型が同一の遺伝子によってコードされ得るという 結果をもたらした（Johnson，D.E．and Williams，L.T.，Adv．Cancer Res．60: 1，1993）。組織培養系において、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦのその細胞表面受容 体への結合はホスホリパーゼＣ−γを活性化し（Burgess，W.H．ら，Mol．Cell Biol．10: 4770，1990）、このホスホリパーゼＣ−γはさまざまな分裂促進シグ ナルを統合することが知られている経路である。 ＦＧＦファミリーの新メンバーを同定し特性決定することにより、細胞や器官 がその増殖、生存、老化、分化、損傷からの回復をコントロールする作用機構を 解明することができよう。発明の概要 本発明は細胞の増殖、生存、分化因子としてのＦＨＦ−１および該因子をコー ドするポリヌクレオチド配列を提供する。この因子は中枢神経系（ＣＮＳ）およ び末梢組織の細胞の増殖、生存および／または分化に関与している。 本発明は、神経変性疾患または腫瘍性疾患の診断に役立つＦＨＦ−１遺伝子発 現における変化を検出する方法を提供する。もう一つの態様において、本発明は ＦＨＦ−１の発現または活性を調節することにより神経変性疾患または腫瘍性疾 患を治療する方法を提供する。図面の簡単な説明 図１は、ヒトＦＨＦ−１のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。 図２は、ヒトＦＨＦ−１のアミノ酸配列と、ＦＧＦファミリーの９つの他のメ ンバーのそれぞれのアミノ酸配列と、のアライメントを示す。保存された残基を 強調してある。ＦＧＦファミリーのメンバーは次のとおりである：ａＦＧＦ／Ｆ ＧＦ−１（Jayeら，Science 233: 541，1986）、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２(Abraham ら，Science 233: 545，1986)、ｉｎｔ−２／ＦＧＦ−３(Smith ら，EMBO J．7 : 1013，1988)、ＦＧＦ−４（Delli-Boviら，Cell 50: 729，1987）、 ＦＧＦ−５(Zhanら，Mol．Cell Biol．8，3487，1988)、ＦＧＦ−６(Maricsら， Oncogene 4: 335，1989)、ケラチノサイト増殖因子／ＦＧＦ−７（Finch ら，Sc ience 245: 752，1989）、ＦＧＦ−８(Tanakaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89: 8928，1992)、およびＦＧＦ−９（Miyamotoら，Mol．Cell Biol．13: 4251 ，1993）。 図３は、ＦＧＦファミリーのメンバーの任意の対をつなぐ直線の長さがその対 のアミノ酸配列の分岐度に比例する樹状図を示す。 図４は、ＦＨＦ−１をコードする遺伝子がヒト第３染色体上に位置しているこ とを示す。ヒト特異的ハイブリダイゼーションが第３染色体上に見られる。 図５は、トランスフェクトしたヒト胚腎細胞におけるＦＨＦ−１の産生を示す 。レーン１、３および５：全細胞タンパク質；レーン２、４および６：培地中に 存在するタンパク質（分泌タンパク質）。レーン１および２：ヒト成長ホルモン をコードするｃＤＮＡによるトランスフェクション；レーン３および４：ＦＨＦ −１をコードするｃＤＮＡによるトランスフェクション；レーン５および６：免 疫グロブリン定常部に融合した新規な表面受容体をコードするｃＤＮＡによるト ランスフェクション。タンパク質標品を左側に示してあり、上から下へ順に分子 量２２０、９７、６６、４６、３０、２１．５および１４．３ｋＤである。 図６は、ＦＨＦ−１発現の組織特異性を示す。図示したマウス組織由来の全Ｒ ＮＡ 10 μg を調製し(Chomczinski & Sacchi，Anal．Biochem．162: 156，1987 )、２１２塩基のエクソン１および隣接１００塩基のイントロン１にまたがるマ ウスＦＨＦ−１アンチセンスプローブを用いるＲＮアーゼプロテクション(Ausab el ら，Current Protocols in Molecular Biology; New York: Wiley Interscie nce，1987)において使用した。このプローブの２１２塩基のエクソン１領域（矢 印）について予測される大きさのＲＮアーゼプロテクションが脳、眼および精巣 由来のＲＮＡに関して観察された。発明の詳細な説明 本発明は増殖因子ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−１をコードするポリヌクレオチド 配列を提供する。ＦＨＦ−１は脳、眼および精巣の組織で高レベルに発現される 。 一つの態様において、本発明は、ＦＨＦ−１の発現または機能と関連がある中枢 神経系または精巣起源の細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。もう一つの 態様において、本発明は、ＦＨＦ−１の発現または活性を抑制または増強する薬 剤を用いることにより細胞増殖性疾患または免疫学的疾患を治療する方法を提供 する。 本発明のＦＨＦ−１タンパク質とＦＧＦファミリーのメンバーとの構造相同性 は、ＦＨＦ−１がこの増殖因子ファミリーの新メンバーであることを示す。多く の他のメンバーの公知の活性に基づくと、ＦＨＦ−１も診断および治療用の薬剤 として有用な生物学的活性を保有することが期待される。 多くの増殖因子は神経系の機能に関係する発現パターンまたは活性を有する。 例えば、ＴＧＦファミリーの一つの増殖因子、すなわちＧＤＮＦはドーパミン作 動性ニューロンの生存を促進することができる強力な神経栄養因子であることが わかった(Lin ら，Science 260: 1130)。もう一つのファミリーメンバーである ドーサリン−１は神経冠細胞の分化を促進することが可能である（Baslerら，Ce ll 73: 687，1993）。インヒビンおよびアクチビンは脳において発現されること が明らかになり（Meunier ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85: 247，1988; S awchenkoら，Nature，334: 615，1988）、アクチビンは神経細胞生存分子として 機能する能力をもつことがわかった(Schubertら，Nature，344 868，1990)。別 のＴＧＦファミリーメンバーであるＧＤＦ−１はその発現パターンが神経系特異 的であり(Lee，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88: 4250，1991)、また、いくつ かの他のファミリーメンバー、例えばＶｇｒ−１(Lyonsら，Proc．Natl．Acad． Sci．USA，86:4554，1989; Jonesら，Development，111:581，1991)、ＯＰ−１( Ozkaynak ら，J．Biol．Chem.，267:25220，1992)およびＢＭＰ−４(Jonesら，D evelopment，111:531，1991)も神経系で発現されることが知られている。 脳および眼内でのＦＨＦ−１の発現は、神経系の機能に関係する活性がＦＨＦ −１にもありうることを示唆する。ＦＨＦ−１は種々のニューロン集団に対して 神経栄養活性をもつのかもしれない。それゆえ、ＦＨＦ−１は筋萎縮性側索硬化 症のような神経変性疾患を治療したり、移植に先立って細胞または組織を培養下 で維持するといったin vitroおよびin vivo 用途をもつ可能性がある。 第一の態様において、本発明は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときの分 子量が約３０ｋＤでありかつ本質的に配列番号２のアミノ酸配列を有することに より特性付けられる、実質的に純粋な繊維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ −１）を提供する。本明細書中で用いる「実質的に純粋な」とは、他のタンパク 質、脂質、炭水化物またはＦＨＦ−１が天然で結合している他の物質を実質的に 含まないＦＨＦ−１のことである。当業者であれば、標準的なタンパク質精製法 を用いてＦＨＦ−１を純化することが可能である。実質的に純粋なポリペプチド は非還元性ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドをもたらすだろう。Ｆ ＨＦ−１ポリペプチドの純度はアミノ末端アミノ酸配列解析により測定すること もできる。ＦＨＦ−１の活性が残っている限り、ＦＨＦ−１ポリペプチドにはこ のポリペプチドの機能性断片も含まれる。ＦＨＦ−１の生物学的活性を有する小 型のペプチドは本発明に含まれる。 本発明はＦＨＦ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。 これらのポリヌクレオチドとして、ＦＨＦ−１をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡお よびＲＮＡ配列がある。ＦＨＦ−１の全部または一部をコードする全てのポリヌ クレオチドは、それらがＦＨＦ−１活性をもつポリペプチドをコードする限り、 本発明に含まれることを理解すべきである。このようなポリヌクレオチドとして は、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、意図的に操作さ れたポリヌクレオチドがある。例えば、ＦＨＦ−１ポリヌクレオチドを部位特異 的突然変異誘発にかけることができる。ＦＨＦ−１のポリヌクレオチド配列には アンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレオチドは遺伝子コードの結果 として縮重している配列を包含する。２０種類の天然アミノ酸があり、そのうち の大部分は２以上のコドンにより規定されている。したがって、あらゆる縮重ヌ クレオチド配列は、そのヌクレオチド配列によりコードされるＦＨＦ−１ポリヌ クレオチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限りでは、本発明に含まれ る。 ヒトＦＨＦ−１遺伝子をコードするＤＮＡ配列がここに詳細に開示される。こ の配列は長さが２４４アミノ酸からなるポリペプチドをコードする読取り枠（オ ープンリーディングフレーム）を含有する。図１の位置３３２−３３４に示され るヒトＦＨＦ−１の開始メチオニンコドンは、ヌクレオチド３２３−３２５の読 み枠内の停止コドンの後の最初のＡＴＧコドンであり、良好なコンセンサスリボ ソーム結合部位（ＴＧＧＣＣＡＴＧＧ；Kozak，Nucleic Acids Res.，15:8125， 1987）がこの位置に存在する。読取り枠内の次のメチオニンコドンは、推定上の 開始メチオニンコドンの８６コドン3'側にある。ａＦＧＦとｂＦＧＦの場合に観 察されるように、ＦＨＦ−１の一次翻訳産物のアミノ末端は、小胞体の膜を通過 する同時翻訳挿入(cotranslational insertion)を指令するシグナルペプチドの コンセンサス配列と一致しない。ＦＨＦ−１配列はアスパラギン結合グリコシル 化のための潜在的な asn-X-ser/thr部位を欠く。好ましくは、ヒトＦＨＦ−１ヌ クレオチド配列は配列番号１であり、推定アミノ酸配列は好ましくは配列番号２ である。 ＦＨＦ−１をコードするポリヌクレオチドは配列番号１だけでなく配列番号１ に相補的な核酸配列も含む。相補的配列にはアンチセンスヌクレオチドが含まれ 得る。この配列がＲＮＡであるときは、配列番号１のデオキシヌクレオチドＡ、 Ｇ、ＣおよびＴがそれぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵにより置き換え られる。鎖長が少なくとも１５塩基である上記核酸配列の断片も本発明に含まれ 、この１５塩基という鎖長は、断片が生理的条件下で配列番号２のタンパク質を コードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズすることを可能にするに十分である 。特に、これらの断片はストリンジェント条件下でＦＨＦ−１タンパク質をコー ドするＤＮＡにハイブリダイズすべきである。 ＦＨＦ−１に最も相同性の高いＦＧＦファミリーのメンバーはＦＧＦ−９であ り、ＦＧＦ−９は１０のギャップを加えてアライメントするとき、ＦＨＦ−１と ２７％のアミノ酸同一性を共有する。ＦＨＦ−１の一次アミノ酸配列のわずかな 修飾により、本明細書に記載するＦＨＦ−１ポリペプチドと比べて実質的に同等 の活性を有するタンパク質が得られる。このようなタンパク質には、「本質的に 配列番号２のアミノ酸配列を有する」という表現で規定されるタンパク質が含ま れる。こうした修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発によるように、意図的で あっても、自然発生的であってもよい。これらの修飾により産生されるポリペプ チドはすべて、ＦＨＦ−１の生物学的活性がまだ存在する限り、本発明に含まれ る。さらに、１以上のアミノ酸を欠失させることによっても、その生物学的活性 を有意に変えることなく、得られた分子の構造を修飾することができる。これは より広範な有用性を有する小型の活性分子の開発へとつながる。例えば、ＦＨＦ −１の生物学的活性にとって必要でないアミノ末端またはカルボキシ末端のアミ ノ酸を除くことができる。 本発明のポリヌクレオチドによりコードされる本発明のＦＨＦ−１ポリペプチ ドには、開示された配列（配列番号２）およびその保存的変異が含まれる。本明 細書中で用いる「保存的変異」という用語は、あるアミノ酸残基を生物学的に類 似した別のアミノ酸残基と置換することをいう。保存的変異の例として、イソロ イシン、バリン、ロイシン、メチオニンのような、ある疎水性残基の他の疎水性 残基による置換、または、ある極性残基の他の極性残基による置換、例えばアル ギニンのリシンによる置換、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換、グルタ ミンのアスパラギンによる置換などが挙げられる。「保存的変異」という用語は また、無置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含むが、こ の置換ポリペプチドに対して誘導された抗体は無置換ポリペプチドと免疫反応し なければならない。 本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法により得ることができる。例えば、当技 術分野で周知のハイブリダイゼーション技法を用いてＤＮＡを単離することがで きる。これらの技法として、１）相同なヌクレオチド配列を検出するためのプロ ーブとゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション、 ２）目的のＤＮＡ配列にアニーリングすることができるプライマーを用いるゲノ ムＤＮＡまたはｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および３） 構造的特徴を共有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリー の抗体スクリーニングがあるが、これらに限らない。 本発明のＦＨＦ−１ポリヌクレオチドは好ましくは哺乳動物に由来するもので あり、ヒトに由来するものが最も好ましい。核酸ハイブリダイゼーションによる スクリーニング法は、適当なプローブが入手可能であるという前提で、どのよう な生物からも任意の遺伝子配列を単離することを可能にする。問題のタンパク質 をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成 することができる。それには、短いオリゴペプチド領域のアミノ酸配列が既知で ある必要がある。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝子コードから推測す ることができるが、遺伝子コードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重 するときは混合付加反応を行うことが可能である。これは変性した二本鎖ＤＮＡ の異種混合物を含む。このようなスクリーニングの場合、一本鎖ＤＮＡまたは変 性二本鎖ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを実施することが好ましい。ハ イブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列の量が極 端に少ない供給源に由来するｃＤＮＡクローンを検出する際に特に有用である。 換言すると、非特異的結合を回避するように設定したストリンジェントなハイブ リダイゼーション条件を用いることにより、例えば、混合物中の単一プローブ（ 標的ＤＮＡの完全な相補鎖である）への標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションに より特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフによる可視化が可能である(W allace ら，Nucl．Acid Res.，9:879，1981; Maniatisら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y．1989)。 ＦＨＦ−１をコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖 ＤＮＡ配列の単離、２）目的のポリペプチドの必要なコドンを提供するＤＮＡ配 列の化学合成、および３）真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による 二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成、によっても得ることができる。後者の場合、 結局ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が形成され、これは一般的にｃＤＮＡと呼ば れている。 組換え法で使用する特定のＤＮＡ配列を得るための上記３つの方法のうち、ゲ ノムＤＮＡ分離物の単離は最も一般的でない。このことは、イントロンが存在す るために、哺乳動物ポリペプチドの微生物による発現を得ることが望まれる場合 には特に当てはまる。 ＤＮＡ配列の合成は、しばしば、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全 配列が既知である場合には最上の方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残 基の全配列が不明である場合には、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であって、最 上の方法はｃＤＮＡ配列の合成である。目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標 準的な方法は、中でも、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞内に豊富に存 在するｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミドまたはファージに担持される ｃＤＮＡライブラリーの作製である。ポリメラーゼ連鎖反応の技術と組み合わせ て用いると、稀な発現産物でさえもクローニングすることができる。ポリペプチ ドのアミノ酸配列のかなりの部分が知られている場合には、標的ｃＤＮＡ中に存 在すると推定される配列を複製する一本鎖または二本鎖の標識ＤＮＡまたはＲＮ Ａプローブ配列を作製して、一本鎖の形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化 コピーに対して実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法において使 用する（Jay ら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983）。 ＦＨＦ−１に特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトープを有するＦ ＨＦ−１ペプチドに関して、ラムダgt11のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーを間 接的にスクリーニングすることができる。このような抗体はポリクローナル的に 誘導されてもモノクローナル的に誘導されてもよく、ＦＨＦ−１のｃＤＮＡの存 在を示す発現産物の検出に用いられる。 ＦＨＦ−１をコードするＤＮＡ配列は適当な宿主細胞へのＤＮＡ移入によりin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」はベクターを増やすことができ かつそのＤＮＡを発現させることができる細胞である。この用語はその宿主細胞 のあらゆる子孫をも包含する。複製中に突然変異が起こることがあるので、全部 の子孫が親細胞と同一であるとは限らないことを理解すべきである。しかしなが ら、用語「宿主細胞」が用いられるときは、このような子孫も含まれる。安定し た移入法（外来ＤＮＡが宿主中に連続して維持されることを意味する）は当技術 分野で公知である。 本発明において、ＦＨＦ−１ポリヌクレオチド配列は組換え発現ベクター中に 挿入される。「組換え発現ベクター」という用語は、ＦＨＦ−１遺伝子配列の挿 入または組込みにより操作されたプラスミド、ウイルスまたは当技術分野で公知 の他の運搬体を意味する。このような発現ベクターは宿主の挿入遺伝子配列の効 率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベクターは典型的には 複製起点、プロモーター、さらに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特定の 遺伝子を含有する。本発明で使用するのに適したベクターとしては、細菌発現用 のＴ７ベースの発現ベクター（Rosenberg ら，Gene，56:125，1987）、哺乳動物 細胞発現用のpMSXND発現ベクター(Lee and Nathans，J．Biol．Chem.，263: 3521，1988)および昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクターがあるが 、これらに限らない。ＤＮＡセグメントは調節要素、例えばプロモーター（例： Ｔ７、メタロチオネインＩまたはポリヘドリンプロモーター）に機能的に連結さ れた状態でベクター中に存在する。 ＦＨＦ−１をコードするポリヌクレオチド配列は原核または真核生物内で発現 させることができる。宿主として、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げら れる。原核生物内で真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を発現さ せる方法は当技術分野で公知である。宿主内で発現および複製する能力を有する 、生物学的に機能性のウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で 公知である。本発明のＤＮＡ配列を組み入れるためにこの種のベクターが用いら れる。 組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に公知であるような慣用の 技術により行われる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡを取り 込む能力があるコンピテント細胞を調製するには、指数増殖期後に細胞を回収し 、その後当技術分野で公知の手順を用いるＣａＣｌ₂法により処理する。また、 ＭｇＣｌ₂やＲｂＣｌを使用してもよい。所望により、宿主細胞のプロトプラス トを形成した後で形質転換を行うこともできる。 宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクシ ョンやエレクトロポレーションなどの通常の機械的方法、リポソーム内に封入し たプラスミドの挿入、またはウイルスベクターのようなＤＮＡトランスフェクシ ョン法が用いられる。また、真核細胞は本発明のＦＨＦ−１をコードするＤＮＡ 配列および選択可能な表現型をコードする第二の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純 ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子）により同時形質転換することもで きる。もう一つの方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）やウシ乳頭腫ウイ ルスのような真核生物ウイルスベクターを用いて真核細胞を一時的に感染または 形質転換し、タンパク質を発現させるものである（例えば、Eukaryotic Viral V ectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman編，1982を参照されたい）。 本発明により提供される、微生物において発現されたポリペプチドまたはその 断片の単離および精製は、分離用クロマトグラフィー、モノクローナルまたは ポリクローナル抗体を用いる免疫学的分離を含めて慣用の手段により行うことが できる。 本発明のＦＨＦ−１ポリペプチドはまた、ＦＨＦ−１ポリペプチドのエピトー プと免疫反応するまたは結合する抗体を産生するためにも使用される。エピトー プ特異性が異なるモノクローナル抗体のプールから成る抗体、および明確に区別 されるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は当技術分 野で公知の方法によりタンパク質の抗原含有断片から作られる（Kohlerら，Natu re，256:495，1975; Current Protocols in Molecular Biology，Ausubelら編， 1989）。 本発明で用いる「抗体」という用語は、完全な分子だけでなく、エピトープ決 定基と結合する能力があるＦａｂ、Ｆ(ａｂ')₂、Ｆｖなどのそのフラグメントも 含む。これらの抗体フラグメントはその抗原または受容体と選択的に結合する能 力をいくらか保持しており、次のように定義される。 （１）Ｆａｂ、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含むこのフラグメ ントは、完全な抗体を酵素パパインで消化して無傷のＬ鎖とＨ鎖の一部を生成す ることにより得られる。 （２）Ｆａｂ’、抗体分子のこのフラグメントは完全な抗体をペプシンで処理 した後に還元して無傷のＬ鎖とＨ鎖の一部を生成することにより得られる。抗体 １分子につき２個のＦａｂ’フラグメントが得られる。 （３）Ｆ(ａｂ')₂、この抗体フラグメントは完全な抗体を酵素ペプシンで処理 する（後続の還元を行わない）ことにより得られる。Ｆ(ａｂ')₂は２つのＦａｂ ’フラグメントが２つのジスルフィド結合により一緒に結合した二量体である。 （４）Ｆｖ、２本の鎖として発現されたＬ鎖可変部とＨ鎖可変部を含む遺伝子 工学的に作製されたフラグメントとして定義される。 （５）単鎖抗体（single chain antibody:ＳＣＡ）、遺伝的に融合された単鎖 分子として適当なポリペプチドリンカーにより連結された、Ｌ鎖可変部とＨ鎖可 変部を含む遺伝子工学的に作製された分子として定義される。 これらのフラグメントの調製方法は当技術分野で公知である（例えば、参考と してここに組み入れられるHarlow and Lane，Antibodies: A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)を参照されたい）。 本発明で用いる「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗 原上の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基はアミノ酸や糖側鎖のような分 子の化学的に活性な表面グルーピング(groupings)から成り、特定の三次元構造 特性および特定の電荷特性をもつのが普通である。 本発明のＦＨＦ−１ポリペプチドと結合する抗体は、無傷のポリペプチドまた は関心のある小ペプチドを含む断片を免疫用抗原として用いて調製することがで きる。動物の免疫化に用いられるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたｃ ＤＮＡ（例えば実施例４および６参照）から、または所望により担体タンパク質 に結合させることができる化学合成により誘導される。ペプチドに化学的に結合 される慣用の担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チロ グロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風毒素などがある。その後、 結合したペプチドを用いて動物（例：マウス、ラット、ウサギ）を免疫する。 所望により、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、抗体の誘 導に使用したポリペプチドまたはペプチドを結合させたマトリックスに結合させ て、そのマトリックスから溶出することにより、さらに精製することができる。 当業者であれば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の精製および／また は濃縮に関する、免疫学の分野で公知のさまざまな技法を熟知しているだろう（ 例えば、参考として組み入れられる Coliganら，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1994を参照されたい）。 抗イディオタイプ技法を用いて、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を 作製することも可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製さ れた抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体が結合 するエピトープの「イメージ」である結合ドメインを超可変部にもつだろう。 「細胞増殖性疾患」という用語は、しばしば形態も遺伝子型も周囲の組織と違 っているような、悪性細胞と非悪性細胞の集団を表す。悪性細胞（すなわち、癌 ）は複数の過程を経て発生する。アンチセンス分子であるＦＨＦ−１ポリヌクレ オチドは種々の器官系の悪性疾患、特に、神経組織を含む中枢神経系、心臓、 眼の細胞の悪性疾患を治療するのに有用である。本質的に、ＦＨＦ−１発現の変 化と病因的に関連がある疾患はどれも、ＦＨＦ−１抑制剤を用いる治療に感受性 であると考えられる。このような疾患の一つが例えば悪性の細胞増殖性疾患であ る。 本発明の目的のため、ＦＨＦ−１に特異的な抗体または核酸プローブを用いて 生物学的組織または液体中のＦＨＦ−１ポリペプチド（抗体を使用）またはＦＨ Ｆ−１ポリヌクレオチド（核酸プローブを使用）を検出することができる。本発 明は、抗ＦＨＦ−１抗体または核酸プローブを、ＦＨＦ−１関連疾患が疑われる 細胞と接触させ、前記抗体または核酸プローブへの結合を検出することを含んで なる、神経組織または精巣の細胞増殖性疾患の検出方法を提供する。ＦＨＦ−１ と反応する抗体または核酸プローブはＦＨＦ−１への結合の検出を可能にする化 合物で標識することが好ましい。検出可能な量の抗原またはポリヌクレオチドを 含有するどのような検体を使用してもよい。本発明の好適なサンプルはＣＮＳ、 例えば神経組織もしくは髄液、精巣または眼の組織である。前記疾患が疑われる 細胞中のＦＨＦ−１のレベルを正常細胞におけるそのレベルと比較して、患者が ＦＨＦ−１関連細胞増殖性疾患をもつかどうか判定することができる。好ましく は患者はヒトである。 細胞成分が核酸である場合、ＦＨＦ−１特異的プローブとの結合に先立って核 酸を増幅することが必要になるかもしれない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） を使用することが好ましいが、他の核酸増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣ Ｒ）、連結活性化転写（ligated activated transcription:ＬＡＴ）および核酸 配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification:ＮＡＳＢＡ） を使用してもよい。 本発明の抗体は、in vitroまたはin vivo 免疫診断または免疫治療を施すこと が望まれるどのような患者にも使用することができる。本発明の抗体は、例えば 抗体を液相中でまたは固相担体に結合させて利用するイムノアッセイにおいて使 用するのに適している。さらに、これらのイムノアッセイでは抗体をさまざまな 方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗体を利用しうるイムノアッ セイの種類としては、直接または間接フォーマットでの競合および非競合イムノ アッセイがある。このようなイムノアッセイの例はラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明の抗体を 用いる抗原の検出は、生理学的サンプルに対する免疫組織化学的アッセイを始め とする、フォワード、リバースまたは同時モードで実施されるイムノアッセイを 用いて行うことができる。当業者であれば、他のイムノアッセイのフォーマット を熟知しており、また、過度の実験を行わなくとも他のフォーマットを容易に見 つけ出すことができよう。 本発明の抗体は、多種多様な担体に結合させて、本発明のポリペプチドを含む 抗原の存在を検出するために使用される。公知の担体の例として、ガラス、ポリ スチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラー ゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、磁鉄鋼が挙 げられる。担体の性質は本発明においては可溶性であっても不溶性であってもよ い。当業者であれば、抗体を結合させるのに適した他の担体について熟知してい るか、ルーチンな実験操作を用いてそのような担体を確認できるだろう。 さまざまな標識および標識化方法が当業者に公知である。本発明において使用 できる標識の種類として、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、 化学発光化合物、リン光化合物、生物発光化合物が挙げられる。当業者は抗体に 結合させるのに適した他の標識を熟知しているか、ルーチンな実験操作を用いて そのような標識を確認できるだろう。 より高い感度をもたらし得るもう一つの技法は、抗体を低分子量のハプテンに カップリングさせることから成る。その後これらのハプテンは第二の反応手段に より特異的に検出される。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的 な抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロフェニル、ピリドキサール、フルオレセ インのようなハプテンを用いることが一般的である。 抗原のin vivo 検出のために本発明のモノクローナル抗体を用いるにあたって 、検出可能に標識された抗体は診断的に有効な用量で投与される。「診断的に有 効」という用語は、検出可能に標識されたモノクローナル抗体の量が、本発明の ポリペプチド（これに対してモノクローナル抗体は特異的である）を含む抗原を 有する部位の検出を可能とするのに十分な量で投与されることを意味する。 検出可能に標識されたモノクローナル抗体の投与濃度は、該ポリペプチドを有 する細胞への結合がバックグラウンドに対して検出可能であるように十分なもの とすべきである。さらに、最良の標的対バックグラウンドのシグナル比を与える ために、検出可能に標識されたモノクローナル抗体はすみやかに循環系から排出 されることが望ましい。 一般に、検出可能に標識されたモノクローナル抗体のin vivo診断用の投与量 は個体の年齢、性別、疾患の重症度といった要因に応じて変化するだろう。例え ば、このような投与量は、注入が複数回行われるのか、抗原の負担量、当業者に 公知の他の要因に応じて変化しうる。 in vivo 診断映像化の場合は、利用可能な検出装置のタイプが特定のラジオア イソトープを選択する際に主な要因となる。選択されたラジオアイソトープは所 定の装置で検出できるタイプの崩壊を示す必要がある。in vivo 診断用のラジオ アイソトープを選択する上でさらに重要な要因は、宿主に対して有害な放射線を 最小限にすることである。理想的には、in vivo 映像化に用いるラジオアイソト ープは、粒子を発生しないが、通常のγカメラで容易に検出できる１４０〜２５ ０ｋｅＶの範囲で多数の光子を発生するものである。 in vivo 診断のために、ラジオアイソトープを直接、または中間官能基を用い て間接的に、免疫グロブリンに結合させることができる。金属イオンとして存在 するラジオアイソトープを免疫グロブリンに結合させるためにしばしば用いられ る中間官能基は二官能性キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴ ＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および類似の分子である。本発明 のモノクローナル抗体に結合させることができる金属イオンの代表的な例は¹¹¹ Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒおよび²⁰¹Ｔｌである。 本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴映像化（ＭＲＩ）または電子スピン 共鳴（ＥＳＲ）のようなin vivo 診断のために常磁性アイソトープで標識するこ ともできる。一般的に、診断用画像を可視化する従来の方法はどれも利用できる 。通常、カメラ映像化のためにはγ線および陽電子発生ラジオアイソトープが、 そしてＭＲＩのためには常磁性アイソトープが用いられる。こうした技術におい て特に有用な元素としては¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒおよび⁵⁶Ｆｅが挙 げられる。 本発明のモノクローナル抗体またはポリヌクレオチドは患者のＦＨＦ−１関連 疾患の回復過程をモニターするためにin vitroおよびin vivo で使用することが できる。こうして、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞の 数の増加または減少を測定するか、または種々の体液中に存在する前記抗原の濃 度の変化を測定することにより、ＦＨＦ−１関連疾患を軽減することに目標を定 めた特定の治療計画が果して有効であるのか否かを調べることができるだろう。 「軽減する」という用語は、治療を受ける患者においてＦＨＦ−１関連疾患の有 害作用が減少することを意味する。 本発明により、正常細胞における発現と比べて変化した方法で発現されるヌク レオチド配列を同定することができ、それゆえ、この配列に向けられた適当な治 療法または診断法を設計することが可能である。ＦＨＦ−１の上昇した発現レベ ルの検出は、ＦＨＦ−１関連増殖性疾患が疑われる細胞から単離した核酸を、本 発明のＦＨＦ−１ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより達成され る。ノーザンブロット分析のような分析を用いてＦＨＦ−１の発現を定量する。 その他の標準的な核酸検出法は当業者に公知である。 ＦＨＦ−１関連細胞増殖性疾患の治療として、ＦＨＦ−１遺伝子発現およびＦ ＨＦ−１活性を調節することが含まれる。「調節する」という用語は、ＦＨＦ− １が過剰発現されるときはＦＨＦ−１の発現を抑制し、ＦＨＦ−１が過小発現さ れるときはＦＨＦ−１の発現を増強することを意味する。細胞増殖性疾患がＦＨ Ｆ−１の発現と関連がある場合、ＦＨＦ−１の発現を翻訳レベルで妨害する核酸 配列が使用される。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム またはトリプレックス（三重らせん）薬剤を利用するもので、特定のＦＨＦ−１ ｍＲＮＡをアンチセンス核酸またはトリプレックス薬剤でマスクするか、または それをリボザイムで切断することにより、そのｍＲＮＡの転写または翻訳をブロ ックする。この種の疾患としては例えば神経変性疾患がある。 アンチセンス核酸は特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡま たはＲＮＡ分子である（Weintraub，Scientific American，262:40，1990）。細 胞において、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖 分子を形成する。この細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないであろうから、 アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨害することとなる。約１５ヌクレオチド のアンチセンス核酸が好適である。なぜならば、それらを容易に合成することが でき、しかも標的ＦＨＦ−１産生細胞に導入するとき、より大きな分子よりも問 題を引き起こす可能性が少ないからである。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するア ンチセンス法の使用は当技術分野で公知である（Marcus-Sakura，Anal．Biochem .，172:289，1988）。 転写を停止させるためのオリゴヌクレオチドの使用は、そのオリゴマーが二本 鎖ＤＮＡの回りに巻きついて三重らせんを形成することから、トリプレックス戦 略として知られている。したがって、これらのトリプレックス化合物は所定の遺 伝子のユニークな部位を認識するように設計される(Maher ら，Antisence Res.a nd Dev.，1(3):227，1991; Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6):569，1 991)。 リボザイムはＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似した方法で他の一本鎖ＲＮ Ａを特異的に切断する能力があるＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードす るヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列を認識 して切断する分子を作製することが可能である(Cech，J．Amer．Med．Assn.，26 0:3030，1988)。このアプローチの主な利点は、それらが配列特異的であるので 特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されるという点である。 リボザイムの基本的なタイプには２種類あり、すなわちテトラヒメナ型(Hasse lhoff，Nature，334:585，1988)と「ハンマーヘッド」型である。テトラヒメナ 型リボザイムは長さが４塩基である配列を認識し、一方「ハンマーヘッド」型リ ボザイムは長さが１１〜１８塩基の配列を認識する。認識配列が長くなればなる ほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種中に独占的に存在する可能性が高くなる。その 結果、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するにはハンマーヘッド型リボザイムの方が テトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、１８塩基の認識配列の方がより短い 認識配列よりも好ましい。 本発明はまた、ＦＨＦ−１タンパク質により媒介される細胞増殖性疾患または 免疫疾患を治療するための遺伝子治療を提供する。このような治療は、増殖性疾 患にかかっている細胞にＦＨＦ−１アンチセンスポリヌクレオチドを導入するこ とによりその治療効果を奏するだろう。アンチセンスＦＨＦ−１ポリヌクレオチ ドの送達は、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系 を用いて達成される。アンチセンス配列の治療的送達には標的化リポソームの使 用が特に適している。 本明細書において教示されるような遺伝子治療に利用できる種々のウイルスベ クターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ま しくは、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルスがある。好ましくは、レトロウ イルスベクターはマウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外 来遺伝子を挿入し得るレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウ イルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウ ス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）であるが、 これらに限らない。患者がヒトであるときは、テナガザル(gibbon ape)白血病ウ イルス（ＧａＬＶ）のようなベクターを利用することが好ましい。多数の追加の レトロウイルスベクターは複数の遺伝子を組み入れることができる。これらのベ クターはどれも、形質導入された細胞を同定して増やせるように、選択マーカー の遺伝子を組み入れることができる。目的のＦＨＦ−１配列を、特定の標的細胞 上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクター に挿入することにより、このベクターはまさに標的特異性となる。例えば、糖、 糖脂質またはタンパク質を結合させることで、レトロウイルスベクターを標的特 異性とすることができる。好適な標的化（ターゲッティング）は抗体を用いてレ トロウイルスベクターを標的特異性とすることにより達成される。当業者であれ ば、ＦＨＦ−１アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクタ ーの標的特異性送達を可能にするようにレトロウイルスゲノムに挿入し得るまた はウイルスエンベロープに結合し得る特定のポリヌクレオチド配列を熟知してい るか、または過度の実験操作を行うことなく容易に確認できるだろう。 組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるので、感染性のベクター粒子を産 生するには介助が必要である。この介助は例えばＬＴＲ内の調節配列の制御下に レトロウイルスの全構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を 用いることにより提供される。これらのプラスミドはパッケージング機構に包膜 用のＲＮＡ転写物を認識できるようにするヌクレオチド配列を欠失している。パ ッケージングシグナルを欠失しているヘルパー細胞系としては、例えばΨ２、Ｐ Ａ３１７およびＰＡ１２があるが、これらに限らない。これらの細胞系はゲノム がパッケージされないので中空ビリオンを産生する。レトロウイルスベクター（ パッケージングシグナルが無傷であるが、構造遺伝子が目的の他の遺伝子で置き 換えられている細胞）をこのような細胞に導入すると、そのベクターはパッケー ジされて、ベクタービリオンが産生される。 あるいは、NIH 3T3 または他の組織培養細胞を、慣用のリン酸カルシウムトラ ンスフェクションによりレトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ をコードするプラスミドで直接トランスフェクトすることもできる。次に、これ らの細胞を目的の遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクトする。得られ た細胞は培地中にレトロウイルスベクターを放出する。 ＦＨＦ−１アンチセンスポリヌクレオチドの別の標的送達系はコロイド分散系 である。コロイド分散系として、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビー ズ、水中油型エマルジョンを含む脂質ベースの系、ミセル、混合ミセルおよびリ ポソームを挙げることができる。本発明の好適なコロイド分散系はリポソームで ある。リポソームはin vitroおよびin vivo での送達用ビヒクルとして有用な人 工膜小胞である。サイズが 0.2〜4.0 μm である大型の単ラメラ小胞（ＬＵＶ） は大きな巨大分子を含有する水性バッファーを十分な割合でカプセル化すること ができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンを水性の内部にカプセル化して 、生物学的に活性な形で細胞に送達することができる（Fraleyら，Trends Bioch em.Sci.，6:77，1981）。哺乳動物細胞に加えて、植物、酵母および細菌細胞内 にポリヌクレオチドを送達するためにもリポソームが使用されている。リポソー ムが効率的な遺伝子移入ビヒクルであるためには、次の特性が存在する必要があ る。すなわち、（１）目的の遺伝子を高効率的にカプセル化するが、その生物学 的活性を損なわない；（２）非標的細胞と比べて標的細胞に優先的にかつ強固に 結合する；（３）小胞の水性内容物を標的細胞の細胞質に高効率的に送達する； および（４）遺伝情報を正確かつ効率よく発現させる、ことである（Mannino ら ， Biotechniques，6:682，1988）。 リポソームの組成は、通常ステロイド（特にコレステロール）と組み合わせた 、リン脂質（特に相転移温度が高いリン脂質）類の混合物である。他のリン脂質 や他の脂質を使用してもよい。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度およ び二価のカチオンの存在に影響を受ける。 リポソームの調製に有用な脂質の例として、ホスファチジル化合物、例えば、 ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、 ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガング リオシドが挙げられる。特に有用なものはジアシルホスファチジルグリセロール であり、脂質成分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含 み、飽和であるものである。リン脂質の例には卵のホスファチジルコリン、ジパ ルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが 含まれる。 リポソームの標的化（ターゲッティング）は解剖的および機械的要因に基づい て分類することができる。解剖的分類は選択性のレベル、例えば器官特異性、細 胞特異性およびオルガネラ（細胞小器官）特異性のレベルに基づいている。機械 的ターゲッティングはそれが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別する ことができる。受動的ターゲッティングはリポソームが洞様毛細血管を含む器官 の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布しやすいという傾向を利用するものである 。一方、能動的ターゲッティングはリポソームを特定のリガンド（例えば、モノ クローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質）に結合させることによるか、ま たは天然に存在する局在部位以外の器官または細胞型へのターゲッティングを達 成するためにリポソームの組成またはサイズを変えることによる、リポソームの 変更を含むものである。 標的送達系の表面をさまざまな方法で修飾してもよい。リポソーム標的送達系 の場合には、ターゲッティング用のリガンドをリポソーム二重層との安定した結 合状態に維持するために、リポソームの脂質二重層に脂質基を組み込むことがで きる。脂質鎖をターゲッティング用のリガンドに結合させるために種々の連結基 を用いることができる。 ＦＨＦ−１が精巣、眼および脳すなわち神経組織において発現されるため、こ れらの組織に関係した、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を 用いるさまざまな用途が存在する。そのような用途として、これらの組織と他の 組織に係わる細胞増殖性疾患および免疫疾患の治療がある。加えて、ＦＨＦ−１ は各種の遺伝子治療法にも有用でありうる。 精巣においてＦＨＦ−１が高レベルで発現されるため、この組織に関係した、 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を用いるさまざまな用途が 存在する。そのような用途として、精巣でのＦＨＦ−１発現と関連した細胞増殖 性疾患の治療がある。各種の精巣発達疾患または後天的な精巣疾患をＦＨＦ−１ 治療にかけることができる。それらにはウイルス感染（例：ウイルス睾丸炎）、 自己免疫疾患、精子の生産または機能不全、外傷、精巣の腫瘍が含まれるが、こ れらに限らない。精巣に高レベルのＦＨＦ−１が存在することにより、ＦＨＦ− １またはＦＨＦ−１類似体を用いて、男性の生殖能を高めたり低下させたりする ことが可能であることが示唆される。 ＦＧＦファミリーの新規メンバーの同定はＦＨＦ−１媒介疾患の診断、予後お よび治療戦略のための有用なツールを提供する。抗ＦＨＦ−１抗体を用いてＦＨ Ｆ−１レベルを測定することは、癌、卒中、神経変性疾患（例えば、パーキンソ ン病、アルツハイマー病）、網膜疾患（例えば、色素性網膜炎）またはウイルス 脳炎を含めて、神経系の疾患の進行または回復をモニターするのに有用である。 中枢神経系における高レベルのＦＨＦ−１の存在は、多くの末梢組織で観察され た低レベルのＦＨＦ−１が末梢神経におけるＦＨＦ−１を反映するため、抗ＦＨ Ｆ−１抗体を用いるＦＨＦ−１レベルの測定が末梢神経疾患の診断に役立つこと を示唆する。精巣における高レベルのＦＨＦ−１の存在は、抗ＦＨＦ−１抗体を 用いるＦＨＦ−１レベルの測定が精巣の癌の診断に有用であることを示唆する。 ＦＧＦファミリーの他のメンバーと同様に、ＦＨＦ−１は分裂促進活性および ／または細胞生存活性をもつようであり、それゆえ、ＦＨＦ−１またはＦＨＦ− １作用を模倣する類似体を用いて組織の修復または置換を促進することができる だろう。ＣＮＳにおけるＦＨＦ−１の存在は、卒中、神経変性疾患（例えば、パ ーキンソン病、アルツハイマー病）を含めた神経系の疾患、網膜変性疾患（例え ば、色素性網膜炎または黄斑変性）または末梢神経疾患におけるこのような治療 的役割を示唆する。反対に、抗ＦＨＦ−１抗体またはＦＨＦ−１アンタゴニスト を用いてＦＨＦ−１の作用をブロックすることは、過度の細胞増殖が病因となる 疾患（最も明白には癌）を遅延させたり軽減させたりするかもしれない。 以下の実施例は本発明を例示するためのもので、本発明を制限するものではな い。それらは使用可能な手順の代表であり、当業者に公知の他の手順を代わりに 使用することができる。 実施例１ ＦＧＦファミリーの新しいメンバーであるＦＨＦ−１の単離 ヒト網膜で発現する新規な遺伝子産物を同定するために、ヒト網膜ｃＤＮＡク ローンのランダムなセグメントを部分的に配列決定し、得られた部分配列を公の データベースで利用できる配列と比較した。 詳細には、ラムダgt10で構築した成人網膜ｃＤＮＡライブラリー(Nathansら， Science，232: 193，1986)を増幅し、EcoRIでの開裂によりｃＤＮＡインサート を大量に切除し、アガロースゲル電気泳動によって精製してベクターを除いた。 こうして精製したｃＤＮＡインサートを熱変性した後、５′端にEcoRI部位をも ち３′端に６つのランダムなヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチド（ 5'GACGAGATATTAGAATTCTACTCGNNNNNN）（配列番号３）をプライマーとして用いて 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片の存在下で連続して二回ＤＮＡ合成を行 なった。得られた二重鎖分子の増幅を、独特な５′フランキング配列に対応する プライマー（5'CCCCCCCCCGACGAGATATTAGAATTCTACTCG）（配列番号４）を用いた ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して行なった。元のｃＤＮＡインサート のランダムなサンプル採取に相当するこれらのＰＣＲ産物をEcoRIで開裂し、分 取用アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画化して長さが約５００ｂｐのセグ メントのみとし、ラムダgt10にクローン化した。この誘導体ライブラリーに由来 する３０００個の単一プラークを９６ウェルのトレーに並べ、これらのクローン から、フランキングベクタープライマーを用いたＰＣＲによりインサートを増幅 した後、ジデオキシ法と自動化蛍光検出(Applied Biosystems)を用いて配列決定 した。各インサートの一端から一回配列決定したものを３つの読み枠（リーディ ングフレーム）すべてにおいて両方の鎖上で概念的に翻訳し、得られた６つのア ミノ酸配列を使用して、BLASTX検索アルゴリズムを用いた重複のないGenBankタ ンパク質データベースで相同性を検索した。 すでに記載されているＦＧＦファミリーのメンバーに対して統計的に有意な相 同性を示す部分ｃＤＮＡ配列がひとつ見つかった。この部分ｃＤＮＡをプローブ として使用して、読取り枠（オープンリーディングフレーム）全体を含むもの２ つを含めて多数の独立したｃＤＮＡクローンをヒト網膜ｃＤＮＡライブラリーか ら単離し、この２つにつき、完全なヌクレオチド配列を決定した。 実施例２ ＦＨＦ−１の推定一次構造 ２つの独立したヒト網膜ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定された ヒトＦＨＦ−１の配列を図１に示す。ヒトＦＨＦ−１の一次翻訳産物は長さが２ ４４個のアミノ酸であると予想される。図１の３３２〜３３４位に示したヒトＦ ＨＦ−１開始メチオニンコドンは、ヌクレオチド３２３〜３２５にある枠内の停 止コドンの後にある最初のＡＴＧコドンである。この位置には良好なコンセンサ スリボソーム結合部位(CAGCTATGG（配列番号５）；Kozak，Nucleic Acids Res. ，15: 8125，1987)が見られる。読取り枠内にある次のメチオニンコドンは推定 開始メチオニンコドンの８６コドン３′側に見られる。ａＦＧＦとｂＦＧＦに対 して観察されているように、ＦＨＦ−１の一次翻訳産物のアミノ末端は、シグナ ルペプチドの小胞体膜を横切る同時翻訳挿入を指令するためのコンセンサス配列 と一致しない。ＦＨＦ−１配列は、アスパラギンに結合するグリコシル化のため のａｓｎ−Ｘ−ｓｅｒ／ｔｈｒ部位をもっていない。 ＦＨＦ−１をＦＧＦファミリーの公知の他のメンバーと並べて図２に示し、ま た、アミノ酸の類似度を示す樹上図を図３に示す。最も相同性の高いＦＧＦファ ミリーのメンバーは、１０のギャップをもって並べたときにＦＨＦ−１と２７％ のアミノ酸が同一であるＦＧＦ−９である。各々のポリペプチドの中央領域で、 ＦＨＦ−１も含めたすべてのＦＧＦファミリーのメンバーが１１個の不変アミノ 酸を共有していることに注目されたい。 実施例３ ＦＨＦ−１の染色体位置決定 各々が異なるヒト染色体(Oncor，Gaithersburg，MD)を含有している２４のヒ ト‐マウスおよびヒト‐ハムスター細胞系のパネルから誘導され制限酵素で消化 したＤＮＡを含有するサザンブロットを探査することによってＦＨＦ−１の染色 体位置を決定した。図４に示されているように、ヒトＦＨＦ−１プローブとヒト 、マウスおよびハムスターのゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって 異なるサイズのハイブリダイズ断片が生成する。これらのハイブリッドパネルの 中 で、ヒト特異的ハイブリダイゼーションパターンはヒト第３染色体を担持するハ イブリッド細胞系に相当するレーンのみに見られる。 実施例４ トランスフェクトしたヒト細胞でのＦＨＦ−１の産生 ヒト細胞でＦＨＦ−１を発現させるために、完全な読取り枠を真核発現ベクタ ーpCIS(Gorman ら，DNA Protein Eng．Tech.，2: 3，1990)に挿入した。翻訳の 効率を増大するために、所望の配列を担持するプライマーを用いたＰＣＲ増幅に よって、開始メチオニンコードのすぐ５′側の領域を最適なリボソーム結合部位 (CCACCATGG)に変換した。この発現構築物と、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０ ）ラージＴ抗原を発現するプラスミド(pRSV-TAg; Gormanら、上掲)とで、ヒト胚 腎細胞を一過性にトランスフェクションした後、血清の不在下６時間細胞を³⁵Ｓ メチオニンで代謝的に標識した。図５に示されているように、ＦＨＦ−１でトラ ンスフェクトした細胞は、関係のない２つの構築物の各々でトランスフェクトさ れた細胞では産生されない見掛け分子量が３０ｋＤである単一のポリペプチドを 豊富に合成する。このポリペプチドは、一次翻訳産物の予想された分子量２７． ４ｋＤに近接している。また図５には、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現プラス ミドでトランスフェクトされた細胞は効率良くｈＧＨを分泌するのに対して、Ｆ ＨＦ−１はトランスフェクトした細胞内に蓄積され、検出可能な量では分泌され ないことも示されている。 実施例５ ＦＨＦ−１のｍＲＮＡの組織分布 ＦＨＦ−１のｍＲＮＡの組織分布を決定するために、マウスの脳、眼、心臓、 腎臓、肝臓、肺、脾臓および精巣に由来する全ＲＮＡならびに酵母ｔＲＮＡ陰性 対照に対してＲＮアーゼプロテクション解析を実施した。使用したプローブは、 全長ヒトＦＨＦ−１ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって単離したマウ スＦＨＦ−１遺伝子のセグメントから誘導したものである。図６に示されている ように、ＦＨＦ−１の発現は脳、眼および精巣で最も高レベルである。腎臓、肝 臓および肺では、オートラジオグラムを５倍長く露出させても検出されたＦＨＦ −１の発現レベルは極めて低かった。 実施例６ ＦＨＦ−１に対して特異的な抗体の産生 抗ＦＨＦ−１抗体を生成するために、ＦＨＦ−１のカルボキシ末端の１９０個 のアミノ酸を含むＤＮＡセグメントを大腸菌発現ベクターpGEMEX(Studierら，Me th．Enzymol．185: 60，1990)に挿入した。Ｔ７遺伝子１０タンパク質とＦＨＦ −１のカルボキシ末端の１９０個のアミノ酸との組換え融合タンパク質を大腸菌 で産生させ、分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、これを用いてウ サギを免疫した。免疫血清から得た抗ＦＨＦ−１抗体を、ニトロセルロースに固 定化した融合タンパク質を用いてアフィニティー精製した。pGEMEX T7 遺伝子１ ０タンパク質融合相手に対する抗体をニトロセルロースに固定化した精製Ｔ７遺 伝子１０タンパク質に吸着させて除去した。ウェスタンブロットにより、このア フィニティー精製した抗ＦＨＦ−１抗体は大腸菌またはヒト胚腎細胞で産生した 組換えＦＨＦ−１を認識することが示された。また、免疫組織染色によると、こ れらの抗体は、上記ＦＨＦ−１発現プラスミドでトランスフェクトしたヒト胚腎 細胞で産生した組換えＦＨＦ−１を特異的に認識した。神経組織の免疫染色によ って、成熟マウスとマカクサルの網膜の神経節細胞層および内核層において、な らびに成熟マウス脳内の多数の領域において、抗ＦＨＦ−１免疫染色が示された 。 現状で好ましい態様に関して本発明を説明してきたが、本発明の範囲から逸脱 することなくさまざまな修正をすることができるものと理解されたい。したがっ て、本発明は請求の範囲によってのみ制限されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＬ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＬＤ 45/00 45/00 48/00 ＡＡＢ 48/00 ＡＡＢ 49/00 49/00 Ａ Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ０７Ｋ 14/50 16/22 16/22 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 スモールウッド，フィリップ エム. アメリカ合衆国 21297 メリーランド州 ウッドバイン，ウッドバイン ロード 5022 (72)発明者 マッケ，ジェニファー ピー. アメリカ合衆国 21045 メリーランド州 コロンビア，タリスマン ロード 7180

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ．還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときの分子量が約３０ｋＤであり、 ｂ．本質的に配列番号２のアミノ酸配列を有する、 ことを特徴とする実質的に純粋な繊維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ− １）。 ２．請求項１に記載のＦＨＦ−１ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌ クレオチド配列。 ３．ＦＨＦ−１ヌクレオチド配列が、 ａ．配列番号１（ここでＴはＵでもよい）； ｂ．配列番号１に相補的な核酸配列； ｃ．鎖長が少なくとも１５塩基であり、かつストリンジェント条件下で配列 番号２のＦＨＦ−１タンパク質をコードするＤＮＡと選択的にハイブリダイズす る、ａまたはｂの断片； よりなる群から選択される、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ４．前記ポリヌクレオチドが哺乳動物細胞から単離されたものである、請求項２ に記載のポリヌクレオチド配列。 ５．哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。 ６．請求項２に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。 ７．前記ベクターがプラスミドである、請求項６に記載のベクター。 ８．前記ベクターがウイルスである、請求項６に記載のベクター。 ９．請求項６に記載のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。 10．前記細胞が原核細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。 11．前記細胞が真核細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。 12．ＦＨＦ−１ポリペプチドと結合する抗体またはその免疫反応性フラグメント 。 13．前記抗体がポリクローナルである、請求項12に記載の抗体。 14．前記抗体がモノクローナルである、請求項12に記載の抗体。 15．ＦＨＦ−１関連細胞増殖性疾患が疑われる患者の検体を、ＦＨＦ−１と結合 する薬剤と接触させ、この薬剤のＦＨＦ−１への結合を検出することを含んで なる、ＦＨＦ−１関連細胞増殖性疾患の検出方法。 16．前記細胞が脳、精巣または眼の細胞よりなる群から選択される、請求項15に 記載の方法。 17．前記薬剤がＦＨＦ−１と結合する抗体である、請求項15に記載の方法。 18．前記薬剤がＦＨＦ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそ の断片である、請求項15に記載の方法。 19．前記検出をin vivo で行う、請求項15に記載の方法。 20．前記検出をin vitroで行う、請求項15に記載の方法。 21．前記薬剤が検出可能に標識されている、請求項17または18に記載の方法。 22．検出可能な標識が放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物および化学 発光化合物よりなる群から選択される、請求項21に記載の方法。 23．ＦＨＦ−１の発現と関連した細胞増殖性疾患を有するかまたは該疾患が疑わ れる細胞を、ＦＨＦ−１活性を抑制する薬剤と接触させることを含んでなる、Ｆ ＨＦ−１関連細胞増殖性疾患の治療方法。 24．前記薬剤が抗ＦＨＦ−１抗体である、請求項23に記載の方法。 25．前記薬剤がＦＨＦ−１アンチセンス配列である、請求項23に記載の方法。 26．前記細胞が精巣、脳または眼の細胞である、請求項23に記載の方法。 27．ＦＨＦ−１活性を抑制する薬剤がベクターを使って細胞に導入される、請求 項23に記載の方法。 28．前記ベクターがコロイド分散系である、請求項27に記載の方法。 29．コロイド分散系がリポソームである、請求項28に記載の方法。 30．リポソームが本質的に標的特異性である、請求項29に記載の方法。 31．リポソームが解剖的にターゲッティングされる、請求項30に記載の方法。 32．リポソームが機械的にターゲッティングされる、請求項30に記載の方法。 33．機械的ターゲッティングが受動的である、請求項32に記載の方法。 34．機械的ターゲッティングが能動的である、請求項32に記載の方法。 35．リポソームが糖、糖脂質およびタンパク質よりなる群から選択される成分と カップリングすることにより能動的にターゲッティングされる、請求項34に記載 の方法。 36．タンパク質成分が抗体である、請求項35に記載の方法。 37．前記ベクターがウイルスである、請求項27に記載の方法。 38．前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項37に記載の方法。 39．ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項38に記載の方法。 40．レトロウイルスが本質的に標的特異性である、請求項39に記載の方法。