MXPA98009309A - Compuestos que promueven el crecimiento de tejido - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican un ligante Ret (RetL), asícomo a los métodos para estimular el crecimiento neural y renal mediante el tratamiento de células y sujetos mamíferos con RetL ADN o proteína. La invención proporciona una molécula de ADN purificada y aislada que codifica un RetL, que tiene la secuencia de nucleótidos de cualquier RetL, que tiene la secuencia de nucléotidos de cualquier RetL, pero incluyendo específicamente retL1 cADN (SEQ ID NO:1) de rata, RetL1 cADN (SEQ ID NO:8) parcial humano, retL1 cADN (SEQ ID NO:10) de cadena completa humano, retL2 cADN (SEQ ID NO:12) humano, retL3 cADN (SEQ ID NO:12) de murino o retL3 cADN (SEQ ID NO:16) humano, retL3 cADN (SEQ ID NO:18) parcial humano o retL3 cADN (SEQ ID NO:20) humano. La invención proporciona también una proteína RetL, con una secuencia de aminoácidos que comprende la del RetL1 (SEQ ID NO:2) de rata, RetL1 (SEQ ID NO:9) parcial humano, RetL (SEQ ID NO:11) de cadena completa humano, RetL2 (SEQ ID NO:13) humano, RetL3 (SEQ ID NO:17) de murino, RetL3 (SEQ ID NO:19) parcial humano o RetL3 (SEQ ID NO:21) humano.

Description

COMPUESTOS QUE PROMUEVEN EL CRECIMIENTO DE TEJIDO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican un ligando Ret (RetL) , así como a los métodos de estimulación de crecimiento neural y renal mediante el tratamiento de células y sujetos mamíferos con RetL ADN o proteína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una de las metas de la investigación actual sobre señalización celular y activación de receptores es permitir la modulación terapéutica de los procesos involucrados en el crecimiento y supervivencia celular. Tales procesos determinan resultados en diversas condiciones médicas entre las que se incluyen insuficiencia de órganos, desarrollo fetal y crecimiento tumoral entre otros. Cada una de éstas condiciones es de importancia clínica mundial y tiene limitadas opciones de tratamiento eficaz. Es un objeto de la invención proporcionar composiciones y métodos para promover la regeneración o supervivencia de tejido dañado así como para tratar trastornos qtie involucren el crecimiento y desarrollo anormales de tejidos. La pérdida de tejido o insuficiencia de un órgano en etapa terminal afecta a millones de personas en el mundo cada año y se suma en forma considerable a los costos del cuidado de la salud. La pérdida de órganos o de te idos usualmente se trata mediante el transplante de órganos a partir de donadores, por cirugía reconstructiva o con dispositivos mecánicos. Cada uno de éstos remedios tiene sus puntos débiles. El transplante está limitado por la escasez de donadores, la cirugía reconstructiva puede originar a largo plazo otros problemas y los dispositivos mecánicos no pueden llevar a cabo todas las funciones de un órgano y por lo tanto, no pueden prevenir el deterioro progresivo. De esta manera, existe una necesidad médica real de nuevas soluciones para éstos problemas . Los factores proteicos que afectan el crecimiento, diferenciación y/o supervivencia de las células pueden ser útiles en el tratamiento de alteraciones de órganos que contienen células sensibles . Los factores o ligandos que interactúan con receptores de la familia de la proteína receptora tirosina cinasa (RPTK) son de particular interés a este respecto. Estos receptores están involucrados en muchos programas celulares entre los que se incluyen crecimiento y diferenciación celular y la génesis de muchas neoplasias . Así los factores o ligandos que interactúan con esos receptores pueden demostrar ser útiles para tratar alteraciones de ciertos órganos en los que el tejido se ha dañado. Alternativamente, puede ser útil bloquear la interacción de éstos factores con sus receptores para bloquear crecimiento tumoral . El proto-oncogén Ret codifica una tirosina cinasa receptora que se expresa durante el desarrollo en una variedad de tejidos, entre los que se incluyen los sistemas nervioso periférico y nervioso central y de los ríñones. Las anormalidades presentes en el ret nulo de ratones sugiere que el Ret es crítico para la migración e inervación de las neuronas entéricas al epigastrio y para la proliferación y ramificación del epitelio de la yema uretérica durante el desarrollo de los ríñones (Nature 367, 380-383, 1994) . La búsqueda de un componente clave de la ruta de señalización del Ret, el ligando Ret, ha sido un área de investigación intensiva.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona una molécula de ADN purificada y aislada que codifica para un RetL, que tiene la secuencia de nucleótidos de cualquier RetL, pero que incluye específicamente retLl cADN (SEQ ID NO:l) de rata, retLl cADN (SEQ ID NO: 8) parcial humano, retLl cADN (SEQ ID NO: 10) de longitud completa humano, retL2 cADN (SEQ ID NO: 12) humano, retL3 cADN (SEQ ID NO: 16) de murino, retL3 cADN (SEQ ID NO: 18) parcial humano o retL3 cADN (SEQ ID NO: 20) humano. La invención proporciona además una proteína P715 RetL, con una secuencia de aminoácidos que comprende las de RetLl (SEQ ID NO: 2) de rata, RetLl (SEQ ID NO: 9) parcial humano, RetLl (SEQ ID NO: 11) de longitud completa humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino, RetL3 (SEQ ID NO: 19) parcial humano o RetL3 (SEQ ID NO : 21 ) humano . En otra modalidad, la invención incluye una secuencia de ADN que abarca la secuencia (retLl cADN (SEQ ID NO: 8) parcial humano) del inserto de ADN del clon HRL20 el cual es ATCC No.97604, o la secuencia del inserto de ADN del clon #230-5A-86-17 (retLl cADN (SEQ ID NO:l) de rata), el cual es ATCC No.98047. En otra modalidad de la invención, una molécula de ADN purificada y aislada para uso en expresión segura en una célula anfitriona procariote o eucariote de un producto polipéptido tiene por lo menos una parte de la conformación estructural primaria y la actividad biológica del RetL; el ADN puede ser a) una molécula de ADN que comprende retLl cADN de rata, retLl cADN parcial humano, retLl cADN de longitud completa humano, retL2 cADN humano, retL3 cADN de murino o retL3 cADN humano o la hebra complementaria de retLl cADN de rata, retLl cADN parcial humano, retLl cADN de longitud completa humano, retL2 cADN humano, retL3 cADN de murino o retL3 cADN humano; b) moléculas de ADN que se hibridan bajo condiciones estrictas a las moléculas de ADN descritas en a) o a fragmentos de las mismas; o c) moléculas de ADN las cuales, por la degeneración del código genético, podrían hibridarse a las moléculas de ADN descritas en a) y b) . Una molécula de ADN purificada y aislada codificante para un fragmento de polipéptido o una variante del RetL humano que tiene la actividad biológica de un RetL está también dentro de la invención. Cualquiera de las moléculas de ADN recombinantes de la invención puede estar operablemente unida a una secuencia de control de expresión. También se incluyen dentro de la invención vectores y sistemas de distribución los cuales abarcan las moléculas de ADN o construyen las que se definen en otra parte en esta especificación. El vector puede abarcar una molécula de ADN que codifica un RetL o una variante de un RetL. La invención incluye células anfitrionas eucariotes y procariotes transformadas establemente o transfectadas por un vector que comprende una molécula de ADN que codifica un RetL nativo o una variante de RetL. Un RetL humano purificado y aislado prácticamente libre de otras proteínas humanas está específicamente dentro de la invención, ya que es un proceso para la producción de un producto polipéptido que tiene una parte o todo de la conformación estructural primaria y de la actividad biológica de un RetL. Tal proceso puede incluir los pasos de desarrollar, bajo condiciones de cultivo adecuadas, células anfitrionas eucariotes o procariotes transformadas o transfectadas con cualquier molécula de ADN de la invención, en cierto modo que permita la expresión de tal producto polipéptido y la recuperación de un RetL. Se incluye también el producto polipéptido de la expresión del ADN en una célula anfitriona eucariote o procariote. La invención incluye también proteínas y fragmentos de proteínas, variantes y derivados, sean solubles o limitados por membrana. En las modalidades seleccionadas, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que comprende RetLl de rata, RetLl parcial humano, RetLl de longitud completa humano, RetL2 humano, RetL3 de murino o RetL3 humano o es una variante de una de estas secuencias. En otras modalidades, la proteína es una proteína de fusión que incluye un Ret o un RetL, fusionada con otra molécula o fragmento de molécula, como inmunoglobulina, toxina, compuesto representable o radionúclido. Incluye también moléculas quiméricas de RetL. Otras modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales específicos de un RetL de la invención. Un anticuerpo tal puede asociarse con una toxina, un compuesto representable o un radionúclido. La invención incluye también líneas celulares de hibridomas las cuales producen anticuerpos específicos para Ret, entre los que se incluyen AA.F9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD . G4 , AG.E7, BD.G6 y BH.G8, así como los subclones de estos hibridomas y los anticuerpos producidos por estos hibridomas o subclones de estos hibridomas . La invención incluye además un método para promover el crecimiento de tejido nuevo o promover la supervivencia de tejido dañado en un sujeto, que incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que interactúa con un Ret celular y que por esto induce la autofosforilación del Ret. El compuesto puede ser RetLl, RetL2 o RetL3 , un fragmento o un RetL de longitud completa o un anticuerpo que se une al Ret. El compuesto se puede administrar conjuntamente con una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo compuesto, como GDNF, neurturin o una molécula relacionada con GDNF. En tanto que los tejidos de interés para éstos métodos pueden incluir cualquier tejido, los tejidos que se prefieren incluyen te ido renal, te ido neural, corazón, estómago, intestino delgado, médula espinal o pulmones. En una modalidad, el -RetL es un RetL soluble. El sujeto de los métodos puede ser humano. En otro método de la invención, la señal de transducción del Ret entre una primera célula que expresa un Retí y una segunda célula se inhibe mediante el contacto de la primera célula con una proteína Ret soluble o con un anticuerpo para el RetL. La proteína Ret soluble puede ser una proteína de fusión. La invención incluye también un método para dirigir una toxina, un compuesto representable o un radionúclido a una célula de expresión de Ret, que incluye poner en contacto la célula con una proteína de fusión RetL o un anticuerpo anti-Ret conjugado a una toxina, un compuesto representable o un radionúclido. La RetL puede ser RetLl, RetL2 o RetL3. En otro método, el crecimiento de una célula tumoral de expresión de Ret se suprime, siendo un paso del método poner en contacto la célula con una proteína de fusión de un RetL y una toxina o un radionúclido o un anticuerpo anti-Ret conjugado a una toxina o radionúclido. La célula puede estar dentro de un sujeto y la proteína o el anticuerpo conjugado se administra al sujeto. También se abarca dentro de la invención un método para dirigir una toxina, un compuesto representable o radionúclido a una célula que exprese un RetL, que comprende poner en contacto la célula con una proteína de fusión que comprende Ret y una toxina, un compuesto representable o radionúclido o un anticuerpo anti-RetL conjugado a una toxina, un compuesto representable o radionúclido. Otra modalidad incluye el método para suprimir el crecimiento de una célula tumoral que expresa una Retí, que comprende poner en contacto la célula con una proteína de fusión de Ret y una toxina o radionúclido o con un anticuerpo anti-RetL conjugado a una toxina o radionúclido; la célula puede estar dentro de un sujeto y administrarse al mismo la proteína. El RetL para cualquiera de los métodos de la invención puede ser ReTLl, ReL2 o RetL3 o una variante o fragmento de RetLl, RetL2 o RetL3. Los métodos de terapia genética también están dentro de la invención. Una modalidad es un método para tratar a un sujeto con una alteración del metabolismo Ret, que comprende administrar al sujeto un vector que consta una molécula de ADN que codifica un RetL, asía como u método para promover el crecimiento de tejido nuevo en un sujeto, que comprende administrar tal vector al sujeto. Otra modalidad incluye un método para promover la supervivencia de tejido dañado en un sujeto, uno de los pasos del método es administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector que codifica un RetL.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 es una secuencia de cADN (SEQ ID P715 NO:l) y una secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 2) de RetLl de rata. La secuencia de nucleótidos se prolonga a partir del par de bases 201 a través del par de bases 1700 de SEQ ID NO : 1 y contiene el marco de lectura abierto completo. La FIGURA 2A es una secuencia parcial de cADN (SEQ ID NO: 8) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de RetLl humano. Esta secuencia es la del inserto del clon HRL20, depositado como ATCC No.97604. La FIGURA 2B es una combinación de la secuencia de ADN de longitud completa (SEQ ID NO: 10) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de RetLl humano. La FIGURA 3A es una comparación de la secuencia de nucleótidos de RetLl humano (línea superior de la secuencia) con la de la secuencia de RetLl de rata (línea inferior de la secuencia) . Las líneas verticales entre los nucléotidos muestran identidad en la posición, en tanto que un punto indica una diferencia en esa posición. La FIGURA 3B es una comparación de la secuencia de aminoácidos del RetLl humano (línea superior de la secuencia) con la secuencia del RetLl de rata (línea inferior de la secuencia. Las líneas verticales entre los aminoácidos correspondientes muestran identidad en ése residuo, en tanto que un punto indica una sustitución conservadora en ése residuo.

P715 La FIGURA 4a es un diagrama esquemático de un posible rol para Ret y RetL en la interacción entre un célula mesénquima metanéfrica y una célula de la yema uretérica. La FIGURA 4B es un diagrama esquemático de un método de tamizado de una biblioteca de transfectantes de ADN para clones que expresan un RetL . La presencia del RetL expresado sobre los transfectantes se detecta mediante la evaluación del enlace de esos transfectantes ya sea con la proteína de fusión Ret/IgG o con la proteína de fusión Ret/fosfatasa alcalina. La FIGURA 5 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de los plásmidos usados para expresar la proteína de fusión Ret/IgG de rata. La FIGURA 6 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de los plásmidos usados para expresar la proteína de fusión Ret/IgG humana. La FIGURA 7 es una secuencia de cADN (SEQ ID NO: 12) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de RetL2 humano, como se encuentra en el clon DSW240. El marco de lectura de la proteína está contenido dentro de los nucelótidos 25 a 1416. La FIGURA 8 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de RetL2 humano (línea superior de la secuencia) con la secuencia del RetLl humano (línea P715 inferior de la secuencia) . Las líneas verticales entre aminoácidos indican identidad en ésa posición, en tanto que un punto indica diferencias en esa posición. La FIGURA 9 es una secuencia de cADN (SEQ ID NO: 16) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de RetL3 de murino. La FIGURA 10 es una secuencia de cADN (SEQ ID NO: 20) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) de RetL3 humano.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Números de Identificación de Secuencia A las secuencias de nucleótidos y aminoácidos referidas en esta especificación se les ha dado los siguientes números de identificación de secuencia: SEQ ID NO:l - retLl cADN de rata SEQ ID NO: 2 - retLl aa de rata SEQ ID NO: 3 - oligómero kid-13 SEQ ID NO: 4 - oligómero kid-14 SEQ ID NO: 5 - oligómero kid-15 SEQ ID NO : 6 - retLl cADN extracelular de rata SEQ ID NO: 7 - retLl aa extracelular de rata SEQ ID NO: 8 - retLl cADN parcial humano SEQ ID NO: 9 - retLl aa parcial humano S?Q ID NO: 10 - retLl cADN humano P715 SEQ ID NO: 11 - retLl aa humano SEQ ID NO: 12 - retL2 cADN humano SEQ ID NO: 13 - retL2 aa humano SEQ ID NO: 14 - retL3 cADN parcial de murino (EST AA50083) SEQ ID NO: 15 - retL3 aa parcial de murino SEQ ID NO: 16 - retL3 cADN de murino SEQ ID NO: 17 - retL3 aa de murino SEQ ID NO: 18 - retL3 cADN parcial humano SEQ ID NO: 19 - retL3 aa parcial humano SEQ ID NO: 20 - retL3 cADN humano SEQ ID NO: 21 - retL3 aa humano Definiciones Como se usa en la presente, el término "RetL" significa cualquier proteína que interactúa específicamente con la proteína receptora Ret y que interactúa con disparadores de Ret de dimerización Ret y/o autofosforilación del dominio tirosina cinasa de la Ret. Las secuencias de ADN que codifican para RetL y para Ret son denominadas "retL" y "ret", respectivamente. Un ligando puede ser soluble o presentarse como una molécula limitada por una membrana en la misma célula o en una diferente así como la molécula Ret para la cual se dispara la autofosforilación. En ciertos usos o interacciones con la P715 Ret, el ligando puede requerir moléculas adicionales para disparar la autofosforilación. Los ligandos de la invención incluyen co-receptores o cofactores ligandos accesorios, Los ligandos de la invención incluyen además anti-Ret mAbs los cuales actúan como antagonistas de la Ret, activadores de dimerización de la Ret y autofosforilación. El ligando también puede modificarse de varias maneras, como ser incorporado como una porción de una proteína de fusión, como una toxina o radionúclido . Por "alineamiento de secuencias" se entiende el posicionamiento de una secuencia, ya sea un nucleótido o un aminoácido, con el de otro, para permitir una comparación de la secuencia de las porciones relacionadas de una con respecto a la otra. Un ejemplo de un -método de éste procedimiento se da en Needleman et al. (J.Mol .Biol . 48:443-453, 1970). El método se puede implementar en forma conveniente mediante programas de cómputo como el programa Align (DNAstar, Inc.). Como será comprensible para los expertos en la técnica, las secuencias homologas o funcionalmente equivalentes incluyen arreglos funcionalmente equivalentes de los residuos de cisteína dentro del esqueleto de cisteína conservado, incluyendo inserciones de aminoácidos o eliminaciones las cuales alteran el arreglo linera de estas cisteínas, pero no perjudican en forma importante su relación dentro de la estructura plegada de la proteína. Por lo tanto, las diferencias internas y las inserciones de aminoácidos en la secuencia candidata se ignoran para el propósito de calcular el nivel de homología de la secuencia de aminoácidos o la identidad entra el candidato y las secuencias de referencia. Una característica frecuentemente utilizada para establecer la homología de proteínas es la similitud del número y ubicación de los residuos de cisteína entre una proteína y otra. Por "clonación" se entiende el uso in vitro de técnica de recombinación para insertar un gen particular u otra secuencia de ADN en una molécula vector. Para clonar exitosamente un gen deseado, es necesario emplear métodos para generar fragmentos de ADN, para unir los fragmentos a las moléculas vector, para introducir la molécula de ADN compuesta en una célula anfitriona en la cual se pueda replicar y para seleccionar el clon que tiene el gen blanco entre las células anfitrionas receptoras. Por "cADN" se entiende ADN complementario o copia producido a partir de un patrón de Arn por la acción de una ADN polimerasa dependiente de ARN (reverso transcriptasa) . Asía un "clon cADN" significa una secuencia de ADN dúplex complementaria a una molécula de ARN de interés, transportada en un vector de clonación. Por "biblioteca de cADN" se entiende una P715 colección de moléculas de ADN recombinante que contienen insertos de cADN que juntos constituyen una representación de moléculas de mARJN presentes en un organismo completo o en un tejido, dependiendo de la fuente de los patrones de ARN. Esa biblioteca de cADN puede prepararse por los métodos conocidas por los expertos en la técnica, que se describen por ejemplo, en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. En general, el ARN primero se aisla de las células de un organismo de cuyo genoma se desea clonar un gen particular. Para los propósitos de la presente invención se prefieren los mamíferos y particularmente las líneas celulares humanas. Alternativamente, el ARN se puede aislar a partir de una célula tumoral, derivada de un tumor animal y de preferencia de un tumor humano, De éste modo, se puede preparar una biblioteca, por ejemplo a partir de un tumor adrenal humano, pero se puede usar cualquier tumor. Como se usa en la presente, el término "polimorfismo de ADN" se refiere a la condición en la cual dos o más secuencias de diferentes nucleótidos pueden existir en un sitio particular en el ADN. "Vector de expresión" incluye los vectores que son capaces de expresar las secuencias de ADN contenidas en la presente. Aunque no siempre se establece explícitamente, se implica que éstos vectores de expresión deben ser replicables e los organismos anfitriones ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico. Un elemento útil, pero no necesario en un vector de expresión efectivo, es una secuencia marcadora de codificación , la cual es una secuencia que codifica una proteína que da por resultado una propiedad fenotípica (por ejemplo, resistencia a tetraciclina) de las células que contienen la proteína lo que permite que ésas células sean identificadas fácilmente. En resumen, "vector de expresión" está dado como una definición funcional y cualquier secuencia de ADN que sea capaz de realizar la expresión de un código contenido en un ADN especificado se incluye en éste término, en la misma forma que se aplica a la secuencia especificada. Tales vectores están frecuentemente en la forma de plásmidos, de ésta manera "plásmidos" y "vector de expresión" frecuentemente se usan indistintamente. Sin embargo, la invención está proyectada para incluir otras formas de vectores de expresión, incluyendo fagos, que atienden funciones equivalentes y que con el tiempo empiezan a conocerse en la técnica. En forma similar, un "derivado funcional" de un gen de cualquiera de las proteínas de la presente invención se entiende que incluye "fragmentos", "variantes" y "análogos" del gen, que pueden ser "esencialmente similares" en la secuencia de nucleótidos y que codifican P715 una molécula que tiene actividad similar. "Molécula relacionada con GDNF" significa cualquier molécula que es por lo menos 40% homologa ya sea a GDNF o a neurturin y es también capaz de unirse específicamente a RetL. El término "gen" significa una secuencia de polinucleótido que codifica un péptido. Por "homogéneo" se entiende, con referencia a un péptido o a una secuencia de ADN, que la estructura molecular primaria (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos nucleótidos) prácticamente de todas las moléculas presentes es idéntica. El término "oligonucleótido" como se usa en la presente con referencia a sondas, fragmentos de oligómeros detectables, oligómeros de control, oligómeros bloqueadores sin etiqueta y primarios para amplificación de secuencias se define como una molécula que consta de más de tres desoxiribonucleótidos . Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función o uso final del oligonucleótido. El término "sonda" se refiere a un ligando de cualidades conocidas capaz de unirse selectivamente a un blanco antiligando. En la misma forma que se aplica a los ácidos nucleicos, el término "sonda" se refiere a una hebra de ácido nucleico que tiene una secuencia de bases P715 complementaria a la hebra blanco . "Células anfitrionas recombinantes" se refiere a las células que han sido transformadas con vectores construidos utilizando técnicas recombinantes de ADN. Como se define en la presente, el anticuerpo o modificación del mismo producido por una célula anfitriona recombinante, está en virtud de ésta transformación, más bien en cantidades reducidas, o más comúnmente, en cantidades menos que detectables, que las que se producirían por anfitrionas no transformadas. Como se utilizan en la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas cada una de las cuales cortan el ADN de cadena doble en o cerca de una secuencia de nucleótido específica. Como se usa en la presente, el término "polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción" ("RFPL") se refiere a las diferencias entre individuos en las longitudes de un fragmento de restricción particular. Se dice que un molécula es "esencialmente similar" a otra molécula si la secuencia de aminoácidos en ambas moléculas es prácticamente la misma y si ambas moléculas tienen una actividad biológica similar. Así, partiendo de que dos moléculas tienen actividad similar, éstas se consideran variantes, de la misma forma ése P715 término se usa en la presente aún si una de las moléculas contiene residuos de aminoácidos adicionales que no se encuentran en la otra o si la secuencia de residuos de aminoácidos no es idéntica. Como se usa en la presente, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando ésa contiene mitades químicas adicionales que normalmente no son parte de la molécula. Tales mitades pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica, etc. de la molécula. Las mitades alternativamente pueden disminuir la toxicidad de la molécula, eliminar atenuar cualquier efecto lateral indeseable de la misma, etc. Se describen las mitades capaces de mediar tales efectos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. , Mack Publishing Co., Easton Penn. (1980). Por "vector" se entiende una molécula de ADN, derivada de un plásmido o bacteriófago en cuyos fragmentos de ADN se puede insertar o clonar. Un vector contendrá uno o mas sitios de restricción únicos y puede ser capaz de' replicación autónoma en un anfitrión u organismo vehículo definidos en forma tal que la secuencia clonada sea reproducible . Por "prácticamente pura" se entiende cualquier proteína de la presente invención o cualquier gen codificante de cualquier proteína, que esté esencialmente P715 libre de otras proteínas o genes, respectivamente, o de otros contaminantes con los cuales se puede encontrar normalmente en la naturaleza y de aquéllos que no se encuentran en la misma.

Compuestos de la Invención La invención incluye cADN codificante para un RetL, como la secuencia de nucleótidos de retL cADN de rata, retLl cADN parcial humano, retLl cADN de cadena completa humano, retL2 cADN humano, retL3 cADN de murino o retL3 cADN de humano. Además, los compuestos de la invención incluyen secuencias que incluyen las secuencias de arriba o son derivados de una de éstas secuencias. La invención incluye también vectores, liposomas y otros vehículos transportadores que abarcan una de éstas secuencias o un derivado de una de éstas secuencias. La invención incluye también proteínas transcritas y traducidas a partir de retLl cADN de rata, retLl cADN parcial humano, retLl cADN de cadena completa humano, retL2 cADN humano, retL3 cADN de murino o retL3 cADN de humano, entre las que se incluyen en forma no exclusiva RetLl de rata, RetLl parcial humano, RetLl de cadena completa humano, retL2 humano, retL3 de murino o retL3 de humano y sus derivados y variantes . Una modalidad de la invención incluye variantes P715 solubles de un RetL. Las variables solubles carecen por lo menos de una porción de la sección intramembrana del RetL nativo. En algunos ejemplos, la variante soluble carece del eslabonamiento fosfatidilinositol glicano del RetL nativo. Las variantes solubles incluyen proteínas de fusión las cuales abarcan derivados de RetL que carecen de un motivo fosfatidilinositol . Las variantes pueden ser diferentes del RetL que se presenta naturalmente, en la secuencia de aminoácidos o en formas que no involucren la secuencia o en ambos. Las variantes en la secuencia de aminoácidos se producen cuando uno o más aminoácidos en el RetL que se presenta naturalmente se sustituyen con un aminoácido natural diferente o un derivado de aminoácido o un aminoácido no-nativo. Particularmente, las variantes que se prefieren incluyen RetL presente en la naturaleza o fragmentos activos biológicamente del RetL presente en la naturaleza, cuyas secuencias sean diferentes de la secuencia tipo silvestre en una o más sustituciones de aminoácidos conservadores, las cuales típicamente tienen una influencia mínima en la estructura secundaria y naturaleza hidrofóbica de la proteína o péptido. Las variantes también pueden tener secuencias que sean diferentes en una o más sustituciones de aminoácidos no-conservativos, eliminaciones o inserciones que no anulen la actividad P715 biológica del RetL. Las sustituciones conservativas típicamente incluyen la sustitución de un aminoácido por otro con características similares como las sustituciones con los grupos siguientes: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, rginina; y fnilalanina, tirosina. Los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina . Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Otras sustituciones conservativas pueden tomarse de la tabla abajo y aún otras se describen por Dayhoff en el Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).

P715 TABLA 1: SUSTITUCIONES CONSERVATIVAS DE AMINOÁCIDOS P715 P715 Otras variantes dentro de la invención son aquéllas con modificaciones que aumentan la estabilidad del péptido. Tales variantes pueden contener, por ejemplo, uno o más enlaces no peptídicos (que sustituyen los enlaces peptídicos) en la secuencia del péptido. También se incluyen: variantes que contienen residuos distintos a los L-aminoácidos que se presentan naturalmente, como los D-aminoácidos o los aminoácidos que no están presentes naturalmente o aminoácidos sintéticos como los beta o gama aminoácidos y variantes cíclicos. La incorporación de D- en lugar de L-aminoácidos en el polipéptido puede aumentar su resistencia a las proteasas. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5,219,990. Los péptidos de ésta invención también pueden modificarse mediante diversos cambios como inserciones, eliminaciones y sustituciones, ya sea conservativas o no conservativas en donde tales cambios pueden proporcionar ciertas ventajas en sus uso. Las variantes de empalme se incluyen específicamente en ésta invención. Adicionalmente a los polipéptidos de longitud casi total, la presente invención proporciona fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos. Un polipéptido RetL o un fragmento es biológicamente activo si presenta la actividad biológica del RetL que se presenta naturalmente. Tales actividades biológicas incluyen la actividad de P715 enlazar específicamente la porción extracelular de Ret, con una afinidad que es por lo menos 50% y de preferencia por lo menos igual a la afinidad del RetL que se presenta naturalmente por la porción extracelular del Ret. Otra actividad biológica es la habilidad de enlazarse a un anticuerpo que está dirigido a un epítopo que está presente en el RetL natural . En otras modalidades, variantes con sustituciones de aminoácidos que son menos conservativas también pueden dar por resultado los derivados deseados, por ejemplo, mediante cambios en cargas, conformación y otras propiedades biológicas. Tales sustituciones podrían incluir por ejemplo, sustitución de residuos hidrofílicos por un residuo hidrofóbico, sustitución de una cisteína o prolina por otro residuo, sustitución de un residuo que tiene carga neta positiva por un residuo que tiene carga neta negativa. Cuando el resultado de una sustitución dada no se puede predecir con certeza, los derivados pueden determinarse fácilmente según los métodos expuestos en la presente para determinar la presencia o ausencia de las características deseadas . En general, las sustituciones de las que se puede esperar induzcan cambios en las propiedades funcionales de los polipéptidos Ret son aquéllas en las cuales: (I) un residuo hidrofílico, por ejemplo, serina o treonina se P715 sustituye por un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un residuo de cisteína se sustituye en lugar de (o por) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, se sustituye en lugar de (o por) un residuo que tiene una carga electronegativa, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, se sustituye en lugar de (o por) una que no tiene una cadena lateral así, por ejemplo, glicina. Las variantes dentro del alcance de la invención incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos sesenta porciento de homología con el RetLl (SEQ ID NO : 2 ) de rata, RetLl (SEQ ID NO : 9 ) parcial humano, RetLl (SEQ ID NO: 11) de cadena completa humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino, RetL3 (SEQ ID NO: 19) parcial humano o RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano. Con mayor preferencia la homología de la secuencia es por lo menos ochenta, por lo menos noventa o por lo menos noventa y cinco porciento. Para los propósitos de determinar homología la longitud de las secuencias de comparación será generalmente de por lo menos 8 residuos de aminoácidos, usualmente por lo menos 20 residuos de aminoácidos. Las variantes de los compuestos de la P715 invención incluyen también cualquier proteína que 1) tenga una secuencia de aminoácidos que sea por lo menos cuarenta porciento homologa a una proteína RetL de la invención y también que 2) después de que se coloca en un alineamiento óptimo con la secuencia del RetL (como se describió para RetLl y ReL2 en la figura 8), tiene por lo menos 80% de sus residuos de cisteína alineados con cisteínas en la proteína RetL de la invención. Justo como sea posible para reemplazar sustituyentes del andamiaje, también se pueden sustituir grupos funcionales que se enlazan al andamiaje con grupos caracterizados por particularidades similares. Tales modificaciones no alteran la secuencia primaria. Estas serán en principio conservativas, por ejemplo, el grupo de reemplazamiento tendrá aproximadamente el mismo tamaño, forma, hidrofobicidad y carga que el grupo original. Las modificaciones no secuenciales pueden incluir, por ejemplo, derivación química in vivo o in vitro de porciones de RetL natural, así como cambios en acetilación, metilación, fosforilación, carboxilación o glicosilación. También se incluyen dentro de la invención agentes que se enlazan específicamente a una proteína de la invención o a un fragmento de esa proteína. Estos agentes incluyen proteínas de fusión Ig y anticuerpos (entre los que se incluyen (cadenas simples, cadenas dobles, P715 fragmentos Fab y otros sean nativos, humanizados, primatizados o quiméricos) . Descripciones adicionales a estas categorías de agentes se encuentran en la solicitud PCT 95/16709, la especificación de la cual se incorpora en la presente como referencia.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Panorámica de la Estrategia La estrategia general usada para clonar RetLl se muestra en las Figuras 4A y 4B. Nuestra estrategia se baso en la premisa de que por lo menos un RetL se expresa en el mesénquima etanéfrico del riñon en desarrollo como una proteína de membrana (aunque es posible que el ligando se exprese también en una forma soluble; Figura 4A) . El RetL interactúa con el receptor Ret en la célula de la yema uretérica, activando el dominio citoplásmico de la tirosina cinasa y enviando una señal al núcleo, el cual a su vez activa los genes involucrados en el crecimiento y ramificación de la yema uretérica. Por lo tanto, las proteínas que contienen el dominio extracelular de Ret fusionadas ya sea con la porción Fc de inmunoglobulina humana Gl (IgGl) o con la fosfatasa alcalina (AP) pueden usarse como parte de una estrategia para clonar el RetL como se muestra en la Figura 4B. Las proteínas de fusión, las bibliotecas de expresión y otros reactivos usados en la P715 clonación de RetLl se describen abajo. Nosotros aislamos primero un cADN para el RetLl de rata y después lo usamos como sonda para aislar un cADN para el RetLl. Subsecuentemente se aislaron cADNs para RetL2 y RetL3.

Generación de los Reactivos Requeridos para la Clonación por Expresión Directa de los Ligandos Ret. 1. Aislamiento de cADN de Codificación del Dominio Extracelular del Ret de Rata Para identificar RetLl, se generan proteínas de fusión que constan de dominios extracelulares ya sea de Ret de rata o humano fusionados a una proteína, en un ejemplo a la porción Fc de IgGl humana y en otro ejemplo a la fosfatasa alcalina. Ambas parejas de fusión pueden determinarse fácilmente para detectar células que expresen el ligando como se ilustra en la Figura 4B. Ya que un cADN codificante para Ret de rata no se ha descrito nunca, nosotros aislamos un cADN de codificación del dominio extracelular del receptor Ret de rata utilizando el método de Reacción en Cadena Transcriptasa Inversa-Polimerasa (RT-PCR) . Comparamos las dos secuencias de nucleótidos para el ret humano (Genbank Accession números M57464 y X15262) y el ret de murino (Genbank Accession número X67812) y diseñamos P715 oligonucleótidos cebadores de las regiones de alta identidad entre las dos secuencias . Un oligómero de sentido denominado kid-013 (SEQ ID NO: 3; que contiene nucleótidos 150-169 de secuencia Genbank X15262) se elige a partir de las terminaciones 5 'de la secuencia del ret cADN humano traslapando el codón de iniciación ATG. Este incluye nucleótidos en sus extremos 5 ' y codifica un sitio de restricción Not 1 para los propósitos de clonación. Dos oligómeros antisentido denominados kid-014 (SEQ ID NO : 4 ; contiene e complemento de nucelótidos 1819-1839 de la secuencia Genbank M57464) y kid-015 (SEQ ID NO: 5; contiene el complemento de nucleótidos 1894-1914 de la secuencia Genbank X67812) se eligen, respectivamente, a partir de las secuencias de cADN humano y de murino inmediatamente 5 ' a las secuencias que codifican los dominios de transmembrana. Los oligómeros kid-014 y kid-015 contienen nucleótidos adicionales en sus terminaciones 5 ' que codifican un sitio de restricción Salí para el propósito de clonación. ARN total se aisla a partir de riñon de embrión de rata del día 14 y mARN se purifica utilizando cromatografía oligo-dT. MARN se convierte a cADN usando transcriptasa inversa AMV y el cADN se convierte a cADN de doble cadena y se amplifica utilizando Taq polimerasa en una reacción en cadena de polimerasa estándar con oligómeros kid-013 y kid-015. La síntesis de un fragmento P715 1942 bp PCR se confirma mediante la corrida de una alíquota del PCR de reacción en un gel de agarosa al 1%. El resto del fragmento de PCR se digiere con Notl y Salí y se clona en pSABl32 previamente digerido con Notl y Salí. El plásmido resultante se denomina pJCOll. El inserto completo de plásmido pJCOll contenido entre los sitios Notl y Salí está secuenciado, y se presenta como retLl cADN, SEQ ID NO: 6 extracelular de rata. Una traducción de ésta secuencia revela la secuencia del péptido (SEQ ID NO: 7) para RetLl extracelular de rata. A causa de que los oligómeros para PCR se escogieron a partir de secuencias de ret humano y de ratones, es posible que la secuencia de nucleótido que se muestra igual a la del ret cADN extracelular de rata y la secuencia de péptido que se muestra como la del Ret extracelular de rata, puede ser diferente de las secuencias del nucleótido ret natural de rata y del péptido Ret en las regiones de las secuencias de kid-013 y kid-015. Subsecuentemente, los clones ret cADN se aislan a partir de una biblioteca de cADN de riñon embrionario de rata de 18 días y se observan cambios en las regiones cebadoras dando por resultado cambios en dos aminoácidos . Un cambio es en la secuencia de señal (arginina en la posición 5 a treonina) y el otro cambio está cerca del final del dominio extracelular (ácido glutámico en la posición 633 a alanina) . Ninguno de estos cambios afecta el enlace del P715 ligando. 2. Proteínas de fusión Ret/IgG Se generan proteínas de fusión que consisten de los dominios extracelulares de los receptores Ret de rata (residuos aa #1-637) y humanos (residuos aa #1-636) fusionados a la porción Fc de IgGl humana. La construcción de los plásmidos utilizados para expresar la proteína de fusión Ret/IgG de rata se muestra esquemáticamente en la Figura 5. Para construir un gen de codificación de la proteína de fusión Ret/IgG de rata, digerimos pJCOll (descrito arriba) que contiene el dominio extracelular del Ret de rata con Salí y lo ligamos a un fragmento 700 bp Salí del plásmido 2-4, para generar el plásmido pJC012. Este fragmento Salí contiene parte del dominio Fc de la IgGl humana derivada originalmente del plásmido pSAB144. El plásmido 2-4 se creó previamente vía tres maneras de ligación: un fragmento Not - Salí generado por PCR que contiene el dominio extracelular del receptor de TGF-beta tipo II de conejo; un fragmento 693 bp Salí -Notl de pSABl44 que contiene parte del dominio Fc de IgGl humana; y Notl digerido pSAB132. Como se muestra en la Figura 5, un fragmento que contiene el dominio Fc puede liberarse a partir del plásmido 2-4 como un fragmento 700 bp Salí. El PJC012 es transfectado a las células COS y la P715 proteína de fusión Ret/IgGl de rata se purifica a partir del medio 48 horas más tarde utilizando cromatografía Proteína-A Sepharose. Para hacer una línea celular estable que produzca la proteína Ret/IgG de rata, el fragmento 2612 bp Notl del pJC012 que contiene la proteína de fusión Ret/IgG completa se aisla y se clona en el sitio Notl del vector de expresión pMDR901. El plásmido resultante se denomina pJC022. El plásmido pJC022 es transfectado en las células CHO para generar líneas celulares estables . La línea celular de producción máxima se adapta a suspensión. Los rendimientos típicos de la línea de Ret/IgG CHO de rata son de 75 mg/L. La construcción de los plásmidos utilizadas para expresar la proteína de fusión Ret/IgGl humana se muestra esquemáticamente en la Figura 6. Para construir un gen de codficación de la proteína de fusión Ret/IgG humana, obtenemos un plásmido que contiene un cADN que codifica el receptor Ret humano del Dr. M. Takahashi (Departamento de Patología, Universidad de Nagoya, Escuela de Medicina, Nagoya, Japón) . Un fragmento PCR se trata con un fragmento Klenow seguido por digestión con Notl para producir un fragmento PCR con un extremo cohesivo Notl y un extremo despuntado. Este fragmento se clona en el vector pGEMl lzf (+) previamente digerido con EcoRl , tratado con un fragmento Klenow y digerido con Notl, para generar un P715 extremo cohesivo Notl y un extremo despuntado . El plásmido resultante se denomina pJC013. El fragmento 1916 bp Notl del pJC013 se aisla después de una digestión completa con Notl y una digestión parcial con Salí y se enlaza al fragmento 693 bp Salí - Notl del pSABl44 que contiene una parte del dominio Fc de la IgGl humana y el vector de expresión pSABl32 se digiere con Notl. El plásmido resultante se denomina pJC015. El inserto en el plásmido pJC013 es secuenciado y se encuentra que contiene una sola diferencia del nucléotido que cambia un aminoácido en el dominio extracelular del Ret humano (la secuencia Genbank M57464 tiene una C en la posición 812, mientras que el pJC013 tiene una T en la posición correspondiente; esto da por resultado un cambio en aminoácidos de alanina a valina en la posición 294 de la secuencia de la proteína Ret humana) . Este nucleótido se corrige en el residuo C especificado por la secuencia Genbank M57464 por mutagénesis específica del sitio del plásmido pJC013, produciéndose el plásmido pJC023. Un fragmento 585 bp BstE2 del pJC023 que contiene la secuencia de nucleótido reparada se aisla y se clona en el plásmido pJC015 del cual se ha eliminado el fragmento 585 bp BstE2 que contiene el nucleótido variante. El nuevo plásmido se denomina pJC024. El fragmento 2609 bp Notl del pJC024 que contiene la proteína de fusión Ret/IgG humana completa se aisla y se P715 clona en el sitio Notl del vector de expresión pMDR901. El plásmido resultante se denomina pJC025. El plásmido pJC=25 es transfectado en las células CHO para generar líneas celulares estables . La línea celular de máxima producción se adapta a suspensión. Los rendimientos típicos para la línea Ret/IgG CHO humana son 6 mg/L. Detalles adicionales sobre la producción de los vectores empleados en los métodos de la invención se da en las solicitudes PCT 94/01456 y 92/02050, las especificaciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia. 3. Bioactividad de las Proteínas de Fusión Ret/IgG Para determinar si las proteínas de fusión Ret/IgG que producimos son bioactivas y por lo tanto podrían ser buenas como reactivos de tamizado para la clonación de un RetL, realizamos varios ensayos de cultivo de órganos para bioactividad. El ensayo de cultivo de órganos consiste en desarrollar ríñones embrionarios del día 13-14 de rata en cultivo de órganos por 3-5 días en presencia de la proteína de fusión Ret/IgG a una concentración de 50 ug/ml. Los ríñones se cultivan también en presencia de LFA-3TIP/IgG o una solución vehículo amortiguadora. Después del período de cultivo, algo de los P715 ríñones se tiñe con la lectina fluorescente Dolichos Biflorus Agglutinnin (lectina DB) la cual tiñe los conductos recolectores de los tejidos, que son células epiteliales derivadas de las yemas uretéricas. Esto proporciona una valoración gruesa de la proteína de fusión Ret/IgG en el crecimiento y desarrollo del riñon embrionario. Hay una clara diferencia en la morfología y el desarrollo de los conductos de recolección entre los ríñones que se han cultivado con LFA-3TIP y aquéllos cultivados con la proteína de fusión Ret/IgG. Los ríñones tratados con Ret/IgG tienen conductos de recolección que muestran ramificación significativamente menor y típicamente sobre todo son más pequeños . Se preparan secciones parafínicas de otros ríñones para examen histológico. Los ríñones embrionarios se tratan con soluciones reguladoras de control o con Ret/IgG, y se tiñen con hematoxilina y eosina. El riñon embrionario tratado con Ret/IgG muestra menos ramificación de los conductos recolectores que los ríñones tratados con la solución reguladora de control. Además , los ríñones tratados con Ret/IgG tienen menos túbulos. También hemos observado éste efecto con la proteína de fusión Ret/IgG humana. Estas observaciones son consistentes con las proteínas de fusión bloqueadoras de la señal inductiva entre el mesénquima y la yema uretérica. Por lo tanto, P715 concluimos que la proteína de fusión es un buen reactivo para clonar un RetL. 4. Proteina de Fusión Ret/fosfatasa alcalina Las proteínas de fusión Receptor/fosfatasa alcalina (AP) se han usado con éxito para identificar y clonar ligandos para c-kit (Cell 63:185, 1990), ligandos para miembros de la familia eph de receptores huérfanos (Cell 79:157, 1994) y recientemente para clonar un receptor para leptina, el producto del gen ob (Cell 83:1263, 1995). Los plásmidos que codifican la proteína de fusión Ret/AP de rata se construyen y la proteína Ret/AP de rata se produce en células C0S7 en fábricas de células. Subsecuentemente, una línea celular estable NIH3T3 se genera expresando en promedio 10 mg/L de proteína de fusión. El análisis SDS-PAGE de la proteína Ret/AP de rata indica que su tamaño es consistente con el peso molecular pronosticado y el análisis por filtración en gel indica que se produce como dímero. Se lleva a cabo purificación "parcial por cromatografía por afinidad en una columna anti-AP.

. Anticuerpos Anti-Ret Un anticuerpo policlonal de conejo se genera contra la proteína de fusión Ret/IgG de rata. El anticuerpo funciona en bandas Western, análisis FACS de líneas P715 celulares positivas de Ret e inmunohistoquímica de secciones de riñon embrionario. Se genera un tablero de anticuerpos monoclonales Ret anti-rata de hámster. Proteína de fusión Ret/IgG de rata, acoplada a Protein A Sepharose, se usa para inmunizar hámsters armenios. Se obtienen 316 clones después de la fusión y se tamizan por su habilidad para enlazarse a proteínas de fusión Ret de rata y/o IgG humana en una prueba ELISA. 11 clones producen anticuerpos que se enlazan solamente al Ret/IgG de rata (y Ret/AP de rata) pero no a la IgG humana. La reactividad cruzada al Ret humano se prueba por FACS; cuatro clones producen anticuerpos que pueden enlazarse a la línea celular humana Ret positiva THP-1. La siguiente tabla resume las propiedades de enlace al Ret de doce anticuerpos monoclonales .

P715 6. Bibliotecas de Expresión de cADN Preparamos bibliotecas de cADN a partir de ríñones embrionarios de rata, uno en el vector CDM8 que utiliza el origen SV40 para amplificación y otro en un vector modificado In Vitrogen, pCEP4, que utiliza el origen EBV para amplificación. Este vector modificado, CH269, tiene la secuencia el gen EBNA-1 eliminada. La proteína P715 EBNA-1 interactúa con el origen EBV, pero el gen no se necesita en el vector cuando se usan células que expresan establemente la proteína EBNA. La biblioteca en el vector CDM8 contiene 1.5 X 106 clones con un tamaño promedio del inserto de 1.18 kb, mientras que la biblioteca en el vector CH269 contiene aproximadamente 1 X 106 clones con un tamaño promedio de inserto de 1.5 kb.

Expresión de Clonación del Ligando Ret RetLl A. Clonación del Ligando Ret RetLl de Rata 1. Intentos Iniciales en la Expresión de Clonación del Ligando Ret RetLl- Varios métodos de expresión directa se han intentado para clonar RetLl. Todos éstos métodos están basados en el concepto ilustrado en la Figura 4B. cADNs a partir de la biblioteca de cADN se introducen en células de mamíferos; las células que reciben RetLl pueden identificarse utilizando las proteínas de fusión Ret. Aunque las tres aproximaciones descritas abajo no fueron exitosas, se adquirieron conocimientos importantes y experiencia, los cuales se desplegaron en aproximaciones subsecuentes que tuvieron éxito. a. Método de Toma Panorámica con Ret/IgG - La proteína de fusión Ret/IgG de rata se usa en un intento P715 para aislar RetLl por clonación de expresión directa utilizando un método de toma panorámica (Aruffo an Seed, Proc. Nati. Acad. Sci. 84:8753-8757 (1987). Se usa una biblioteca de cADN de riñon embrionario de 18 días de rata en CDM8 para el método de toma panorámica. Depósitos de cADNs de ésta biblioteca (5,000-10,000 cADNs por depósito) se introducen en células COS utilizando el método DEAE-dextrana. Después de 48 horas, las células se retiran de las placas con EDTA, se incuban con la proteína de fusión y subsecuentemente se transfieren en placas recubiertas con un anticuerpo anti-humano IgG... El ADN se recupera a partir de las células a las que está adherido, se transforma en retroceso a E.coli y subsecuentemente se aisla para una segunda vuelta de toma panorámica. Estamos inhabilitados para ver cualquier enlace celular después de la tercera ronda de toma panorámica y muy pocos clones se obtienen después de la transformación en retroceso del ADN Hirt en E.coli. Un cADN VCAM, usado conjuntamente con un anticuerpo monoclonal anti-VCAM como un control positivo, puede solo diluirse a una proporción de 1:100 y aún se detecta, lo que indica que nuestros tamaños de depósitos probablemente son demasiado grandes. El análisis de algunos de los clones que se obtienen después de la segunda ronda de toma panorámica, indica que los clones están teniendo rearreglo y eliminación.

P715 b. Método Preparativo FACS con Ret/IgG - 80,000 clones de cADN de la biblioteca de ríñones embrionarios de 18 días de rata (vector CDM8) se introducen en células COS7 y se someten a FACS preparativa utilizando la proteína Ret/IgG de rata seguida por un anticuerpo secundario marcado con flúor. El máximo de células fluorescentes 0.5% y 0.9% se recolectan y el plásmido ADN se recupera por lisis de Hirt. El ADN se electropora para regresarlo a E.coli: se obtienen 228 clones para el depósito 0.5% y 752 clones para el depósito 0.9%. El ADN se recupera de los clones bacterianos y se realiza una segunda ronda de FACS preparativa. Los plásmidos recuperados de los clones bacterianos al final de la segunda ronda se analizan y se encuentra que contienen grandes eliminaciones y rearreglos. c. Método de Detección Colorimétrico con Ret/AP - Células COS son transfectadas con 400 depósitos de los clones de cADN (1000 clones por depósito) de la biblioteca de cADN de ríñones embrionarios de 18 días de rata (vector CDM8) y se tiñen con la proteína Ret/AP y un sustrato colorimétrico para fosfatasa alcalina. Las células transfectadas se examinan bajo un microscopio para señales positivas. En un experimento, cinco positivos potenciales se reanalizaron, pero todos fueron negativos. Como un control para la proteína Ret/AP, se produce una proteína VCAM/AP por fusión de los primeros dos P715 dominios del VCAM humano con el N-terminal del Ap placentario. (VCAM se enlaza a la integrin VLA4, que está compuesta de dos cadenas, alfa-4 y beta-1) . Transfecciones transitorias de células COS producen suficiente proteína VCAM/AP para experimentos de control . La proteína VCAM/AP se compara a la VCAM/IgG directamente acoplada a AP y a la VACM/IgG más un anticuerpo secundario acoplado a AP, para valorar su habilidad para detectar VLA4 en células transfectadas con la cadena cADN alfa-4 (las células COS ya expresan la cadena beta-1) . Los resultados muestran que mientras la proteína VCAM/AP puede detectar VLA4 en células transfectadas, la detección mejor se permite por la proteína VCAM/IgG en combinación con un anticuerpo secundario acoplado a AP. d. Conclusiones Metodológicas; Tres conclusiones importantes surgen de éstas tentativas iniciales de clonación: 1) Los métodos que requieren que el plásmido ADN se recupere para rondas subsecuentes (por ejemplo toma panorámica y FACS preparativa) no son adecuados cuando la abundancia del cADN blanco es baja, debido a los rearreglos y eliminaciones que ocurren durante éstas rondas subsecuentes. Con base en la baja expresión de Ret, hay una buena razón para sospechar que la expresión de RetLl es también baja. La aproximación que se prefiere es P715 transfectar en depósitos y usar un método de detección que permita identificar un depósito positivo. El depósito original puede entonces romperse, sin necesidad de recuperar de las células transfectadas el ADN expresado transitoriamente. 2) La proteína Ret/IgG cuando se acopla a un reactivo secundario permite una mejor capacidad de detección que la proteína Ret/AP. 3) Experimentos de control con una proteína de control VCAM/IgG (y un anticuerpo secundario acoplado a AP) y el cADN alfa-4 integrin (diluido en el vector CDM8 y tansfectado en las células COS) indica que nuestra capacidad de detección es justo una en mil (por ejemplo, el tamaño de deposito no puede exceder de 1000 clones) . Para conseguir un nivel mejorado de sensibilidad, cambiamos de un vector basado en el origen SV40 (expresado en células COS) a un vector basado en origen EBV (expresado en líneas celulares EBNA positivas) Los vectores basados en el origen EBV se mantienen como episomas y no son tóxicos a las células como los vectores basados en el origen SV40 después de la amplificación. Existe considerable evidencia que los genes pueden expresarse a niveles mayores en estos vectores y que el cADN puede diluirse mucho más (por ejemplo de 1 hasta 80,000) y todavía detectarse.

P715 2. Tamizado de Depósitos de la biblioteca de cADN Basado en el Origen EBV Tamizamos depósitos de clones de la biblioteca de cADN de ríñones embrionarios de 18 días de rata (vector CH269 con el origen EBV) con la proteína de fusión Ret/IgG de rata. En un experimento, se generan 256 depósitos, conteniendo cada uno 5000 clones de la biblioteca. Brevemente, se titula una alícuota de la biblioteca de cADN, 5000 células se depositan (256 veces) y se desarrollan durante la noche. Las colonias se raspan en un medio: parte del cultivo se usa para generar un suministro de glicerol para el depósito (almacenado a -70) y parte para la preparación del plásmido. Los ADNs de los 256 depósitos se tansfectan individualmente en células 293 /EBNA (8 X 105 en una placa de 60 mm) utilizando el método de lipofección. Después de 48 horas, las células se lavan dos veces con amortiguador HBHA (0.5 mg/ml BSA, 0.1% NaN3, 20 mM HEPES (pH 7.0)) y se incuba con 20 ug/ml de Ret/IgG de rata en solución salina Tris- regulada más 1 mM de MgCl2 y CaCl2 por 60-90 min a TA. Enseguida de ésta incubación, las células se lavan cuatro veces con amortiguador HBHA y se fijan entonces con acetona 60%/formaldehído 3%/20 mM HEPES (pH 7.0) por 30 seg. Enseguida dos lavados con solución amortiguadora HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7.0)), las células se incuban con un anticuerpo secundario acoplado a P715 AP (anti-humano IgG Fc-gama-específico F(ab')2 de cabra (Jackson Immuno Research Laboratories; catálogo #109-056-098; dilución 1:5000 en solución salina Tris-regulada más lmM de MgCl2 y CaCl2 ) por 60 min a TA. Las células se lavan entonces dos veces con amortiguador HBS y dos veces con sustrato amortiguador AP (100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) que contiene supresor 2X Pierce Immuno Puré® Phosphatase (catálogo #35002) . El último lavado se deja por 15 min. Los sustratos AP NBT (0.33 mg/ml) y BCIP (0.17 mg/ml) se añaden entonces en un sustrato amortiguador AP que contiene el inhibidor de AP Pierce e incubados con las células por 5-20 min. Las placas se lavan entonces dos veces con agua. Las placas se examinan bajo un microscopio de disección para detectar la presencia de células teñidas de púrpura. De un análisis de los 256 depósitos, 17 depósitos positivos se identifican en el tamizado primario. El ADN de cada depósito positivo es re-transfectado en células 293 /EBNA y el procedimiento de arriba se repite junto con experimentos de control adicionales para confirmar que la tinción observada es específica para Ret/IgG. 10 fuera de los 17 depósitos positivos solo muestran tinción con la proteína de fusión Ret/IgG y no con otra proteína de fusión IgG.

P715 3. Rompimiento del Depósito #230 Como un ejemplo, uno de los depósitos positivos descritos arriba, designado como #230 se rompe en sub-depósitos más pequeños para identificar el cADN dentro del depósito que está otorgando el enlace a la proteína de fusión Ret/IgG. 600 células del suministro de glicerol para el depósito #230 se depositan (10 veces) y se desarrollan durante la noche. Las colonias de ésas placas se raspan en el medio: una décima parte del cultivo se usa para generar suministro de glicerol y la porción restante se usa para la preparación de ADN. Los diez sub-depósitos de 600 clones se designan 230-1A hasta 230-5A y 230-1B hasta 230-5B. Los ADNs de estos sub-depósitos son transfectados en las células 293 /EBNA y el procedimiento descrito arriba para tinción con la proteína de fusión Ret/IgG se repite. Un subpozo #230-5A es positivo para la tinción con la proteína Ret/IgG. El depósito #230-5A se rompe después para identificar el cADN con éste subpozo que está otorgando el enlace a la proteína de fusión Ret/IgG. Las células del suministro de glicerol del depósito 230-5A se depositan y se desarrollan durante la noche. Las colonias se seleccionan en los pozos de siete Bioblocks® de 96-pozos y se desarrollan durante la noche. De cada Bioblock de 96-pozos, se hacen 4 depósitos de 20 clones y 1 depósito de 16 P715 clones. De ésta manera se generan 35 depósitos a partir de los siete Bioblocks® designados 230-5A-71 a 230-5A-105. Los ADNs se preparan a partir de cada uno de éstos depósitos y son transfectados en las células 293 /EBNA y re-ensayados con la proteína de fusión Ret/IgG como se describe arriba. El depósito #230-5A-86 es positivo. El depósito #230-5A-86 se rompe regresando el Bioblock e identificando los 20 clones que se mezclaron para hacer éste depósito. Los ADNs se hacen de los veinte clones y se transfectan individualmente en las células 293 /EBNA para hacer éste depósito y se re-ensayan para Ret/IgG como se describe arriba. El depósito #230-5A-86-17 se encuentra que es positivo. 4. Caracterización del Clon #230-5A-86-17 El clon #230-5A-86-17 (denominado retL-17 o clon 17 y depositado como ATCC 98047) se analiza después por secuenciación de ADN. La secuencia del nucleótido completa del inserto de éste clon es SEQ ID NO:l (retLl cADN de rata) y parte de la secuencia del nucleótido se muestra en la Figura 1. Dentro de ésta secuencia de nucleótido, encontramos un marco de lectura de codificación para una proteína de 468 aminoácidos (RetLl de rata) . La proteína pronosticada tiene una secuencia de señal con una escisión pronosticada después del aminoácido 24 (Von Hei ne et al., P715 Nucí. cid Res. 14:14683 (1986)). La terminal-C hidrofóbica indica que la proteína puede enlazarse a la célula vía el enlace fosfatidilinositol glicano. Hay tres sitios previsibles de glicosilación N-enlazada. Estas propiedades son consistentes con aquéllas esperadas para un ligando para Ret . Podemos expresar formas solubles de la proteína RetLl de rata truncando el gen antes de la terminal-C. Por ejemplo, esto puede hacerse truncando después de Lisina 435 (RetLl de rata) . La truncación ascendente de éste aminoácido debe también dar por resultado la expresión de una forma soluble de la proteína RetLl de rata. La proteína RetLl soluble de rata puede expresarse por sí misma o como una parte de la fusión con inmunoglobulina humana, una marca de histidina o un epítope pequeño que es reconocido por un anticuerpo.

B. Clonación del Ligando Ret RetLl Humano. Una biblioteca de cADN embrionario humano en el vector lambda gt 10 se adquiere de Clontech (catálogo #HL5004A) . Una placa de un millón que forma unidades del suministro de fagos se deposita en placas 10 Nunc™. Se hacen levantamientos de duplicados de placas en filtros Schleicher y Schuell Optitran™. Se genera una sonda por digestión de plásmido P715 RetLl de rata con una enzima de restricción PvuII, seguida por el aislamiento en gel de agarosa de un fragmento que corresponde a nt 242-1582 de la secuencia de nucleótido RetL de rata (retLl cADN de rata) .' Esta sonda codificadora de región se marca P32 por un cebador aleatorio (Feinberg y Vogelstein, Anal Biochem. 137:266-267, 1984). Los filtros se hibridan toda la noche en 300 ml amortiguador PSB de tamiz de placa (50 mM Tris pH 7.5, ImM NaCl, pirofosfato sódico 0.1%, PVP 0.2% y Ficoll 0.2%) que contiene sulfato de dextrana 10%, 100 ug/ml tARN y 6.7 XlO7 CPM de la sonda de rata, a 55C. Se lavan dos veces con el amortiguador de tamiz de placa y dos veces con 2XSSC/SDS1% a 55C y se exponen a la película a -70C con una pantalla de intensificación . Los duplicados positivos se retiran de las placas maestras en SM (100 mM NaCl, 10 mM S04, 50mM Tris pH 7.5) más gelatina. 24 de éstos positivos son purificados en placa. Minipreparación de ADN lambda de las placas candidatas purificadas se digieren con Notl, se someten a electroforésis en gel de agarosa al 1% y a la absorción de Southern. La absorción de Southern se híbrida con la sonda codificadora de región de RetLl de rata. El clon HRL20 tiene el inserto más largo (4.4 kb) que se híbrida intensamente a la sonda de rata. La secuencia de ADN (retLl cADN parcial humano; SEQ ID NO : 8 ; Figura 2A) y la secuencia P715 de péptido deducida (RetLl parcial humano; SEQ ID NO: 9, Figura 2A) se han obtenido a partir de éste clon, confirmando que es el homólogo humano. Este clon codifica la mayoría de las regiones de codificación, incluyendo el fina 3 'de la región de codificación. Para obtener el extremo 5 'del cADN humano, un kit cADN de riñon fetal humano Marathon-Ready™ se adquiere de Clontech (catálogo #7423-1) . Se sintetizan oligonucleótidos antisentido Kid-155, que corresponde al complemento de nucleótidos 62-81 de SEQ ID NO: 8 (retLl cADN parcial humano) y Kid-154, que corresponde al complemento de nucleótidos 17-43 de SEQ ID NO : 8 (retLl cADN parcial humano) . PCR se lleva a cabo utilizando el kit Advantage™ cADN PCR (Clontech catálogo #8417-1) combinado con reactivos para cADN Marathón™ y los oligonucleótidos Kid-155 o Kid-154. La primera reacción PCR se establece como sigue 35.5 ul H20; 5.0 ul 10X Klen Taq Buffer; 1.0 ul 10 mM mezcla dNTP ; 1.0 ul mezcla 50X Advantage™ Klen Taq Polimerasa. Estos reactivos se combinan y se mezclan. Se añaden entonces 5.0 ul Maratahon-Ready™ Fetal Kidney cDNA; 1.0 ul 10 uM API cebador y 1.5 ul 6.4uM Kid-155 (volumen final=50 ul) . PCR se lleva a cabo en un equipo Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 con las siguientes condiciones de ciclo: 1 ciclo de 94C por 1 min; 30 ciclos de 94C por 30 seg, 55C por 30 seg, 68C por 4 min. Se lleva a cabo un PCR P715 anidado utilizando el producto de la primera reacción PCR. Primero, 5 ul del producto PCR #1 se diluye 50 veces con TE (volumen final 250 ul) . La reacción PCR anidada contiene 35.5 ul de H20; 5.0 ul 10X Klen Taq Buffer; 1.0 ul mezcla lOmM dNTP; 1.0 ul mezcla 50X Advantage™ Klen Taq Polymerase. Estos reactivos se mezclan como arriba. Se añaden entonces 5.0 ul del producto PCR #1 diluido; 1.0 ul lOuM AP2 cebador y 1.5 ul 6.9uM Kid-154. Las condiciones de ciclos son iguales a las de arriba. El producto resultante de aproximadamente 700 bp se purifica en un gel de agarosa de baja fusión al 1% y se extrae con fenol. El ADN purificado se clona en el sitio EcoR5 de pZErO™ (Invitrogen catálogo #K2510-01) . La información de la secuencia se obtiene de múltiples aislados, entre los que se incluyen los clones denominados HRL7G6 y HRL7G8. La secuencia obtenida del clon HRL7G8 se encuentra traslapada con la secuencia del clon HRL20 (retLl cADN parcial humano), mostrada también en la Figura 2B. La secuencia de nucleótidos del clon HRL20 representa los nucleótidos 460 a 1682 del retLl cADN de cadena completa humano. La secuencia del clon HRL7G8 se confirma secuenciando otro clon (GJ102) de cADN de la biblioteca de riñon embrionario humano lambda gtlO cAD descrita arriba, utilizando una sonda derivada del clon HRL7G. Los nucleótidos 118 a 1497 contienen el marco de lectura de la P715 proteína del retLl cADN de cadena completa humano. La secuencia de aminoácidos completa del RetLl humano también se muestra en la Figura 2B. Como se muestra por el análisis BESTFIT descrito en la Figura 3A, el retLl cADN humano es 88.2% idéntico al del retLl cADN de rata. La comparación de péptidos (Figura 3B) muestra que la secuencia del péptido putativo humano es 93.3% idéntica y 97.2% similar a la de rata.

Clonación del Ligando Ret RetL2 A. Clonación de RetL2 humano La secuencia del péptido RetLl de rata (RetLl de rata) se usa en la búsqueda en la base de datos GenBank con el programa BLAST para identificar las proteínas relacionadas. BLAST o Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (Basic Local Alignment Search Tool) , utiliza el método de Altschul et al. (J.Mol. Biol. 215:403-410, 1990) para buscar similitudes entre una secuencia consultada y todas las secuencias en la base de datos. La secuencia de consulta y la base de datos en la que se busca pueden ser de péptidos o de nucleótidos o de cualquier combinación. Cuando la secuencia del péptido RetLl de rata se consulta en la base de datos de nucleótidos Expressed Sequence Tag (EST), se obtienen dos respuestas. Una es con GenBank Accession #R02249, un 229 bp EST de un hígado fetal P715 humano y una biblioteca de cADN de bazo combinados y la otra es con Genbank Accession #H12981, un 521 bp EST de una biblioteca de cADN de cerebro de infante humano. Los dos ESTs comparten 99% de identidad en una región de traslape que indica que provienen del mismo cADN. Los oligonucleótidos se generan a partir de el H12981 EST:KID-228 (GAA TGA CA CTG CA GAA GCT GCG CTC CTC; que corresponde a los nucleótidos 38-67 y también a los nucleótidos 534-563 de SEQ ID NO: 12) y el oligonucleótido antisentido KID-229 (CTG TAC TCG CTG GGC ACC CG; que corresponde al complemento de nucleótidos 156-175 y también al complemento de nucleótidos 652-671 de SEQ ID NO : 12 ) . 1X106 unidades formadoras de placa de una biblioteca de lambda GT10 cADN Clontech Human Fetal Liver 5'-Stretch Plus (cat # HL5003a) se tamizan en duplicados en filtros OPTITRANTM. Los filtros se hibridan con oligonucleótidos 32P-marcados KID-228 y KID-229 en 400 mis de una solución reguladora de tamizado de placa (50mM Tris pH 7.5, ÍM NaCl, pirofosfato sódico al 0.1%, Polivinilpirrolidona al 0.2% y Ficoll 0.2%) que contiene sulfato de Dextran al 10% y 100 ug/ml de tARN y 80 pmol de cada oligonucleótido 3P-marcado a 65C durante la noche. Se lavaron dos veces con 2X SSC/SDS 1% y dos veces con IX SSC/SDS 1% y se expusieron a la película. Se purificaron 11 duplicados positivos. El ADN de cada uno de éstos clones se P715 analiza por digestión de enzimas de restricción y a continuación por electroforesis en gel de agarosa y absorción de Southern. Los filtros de hibridan a KID-228 y KID-229 para confirmar que los insertos hibridan a la sonda. El inserto del clon DSW240 es secuenciado completamente (retL2 cADN humano SEQ ID NO: 12) y se muestran en la Figura 7. Los nucleótidos 25-1416 contienen el marco de lectura de la proteína retL2 cADN humano, que codifica una proteína de 464 aminoácidos (RetL2 humano; SEQ ID NO: 13) y se muestra en la Figura 7. Como se muestra por el análisis BESTFIT descrito en la Figura 8, la proteína RetL2 humana es 49.1% idéntica y 63.7% similar a la proteína RetLl humana. Esta tiene en común con la RetLl una terminal-N indicativa de una secuencia de señal y una terminal-C hidrofóbica indicativa de un motivo de enlace fosfatidilinositol glicano. Además, 30 cisteínas fuera de las 30 que se presentan se conservan en cada proteína.

B. Demostración de gue el RetL2 es un Ligando para Ret Demostramos que el RetL2 es un ligando para Ret por transfección de células 293 /EBNA con un plásmido de expresión que contiene el inserto del clon DSW240 y mostrando que las células pueden enlazar una proteína de fusión Ret/IgG soluble.

P715 El inserto de DSW240 se elimina usando Notl y se clona en el vector de expresión CH259 que contiene un origen EBV y permite alta expresión en líneas celulares positivas EBNA. Se realizan digestiones de restricción para identificar clones que tienen la orientación correcta. Se prepara un plásmido de ADN de un clon que tiene la orientación correcta. Los plásmidos de ADNs (el plásmido de expresión retL2 , un plásmido de expresión retLl como control positivo y un plásmido de expresión que contiene una proteína no relacionada como control negativo) se transfectan en células 293 /EBNA (8 X 105 en una placa de 60 mm) utilizando el método de lipofección. Después de 48 horas, las células se lavan dos veces con amortiguador HBHA (0.5 mg/ml BSA, 0.01% NaN3, 20 mM HEPES (pH 7.0)) y se incuban con 20 ug/ml Ret/IgG de rata en solución salina Tris-amortiguada mas 1 mM MgCl2 y CaCl2 por 60-90 min a temperatura ambiente. Enseguida de ésta incubación las células se lavan cuatro veces con amortiguador HBHA y se fijan entonces con una solución 60% acetona/3% formaldehído/ 20 mM HEPES (pH 7.0) por 30 seg. A continuación se hacen dos lavados con amortiguador HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7.0)), las células se incuban con un anticuerpo secundario acoplado a AP (IgG Fc-gama-específico F (ab')2 de cabra) (Jackson Immuno Research Laboratories; catálogo # 109-056-098; P715 dilución 1;5000 en solución salina Tris-amortiguada más 1 mM MgCl2 y CaCl2) por 60 min a TA. Las células se lavan después dos veces con amortiguador HBS y dos veces con amortiguador de sustrato AP (100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgC12) que contiene supresor 2X Pierce Immuno Pure®Phosphatase (catálogo #35002) . El último lavado se deja por 15 min. Los sustratos AP NBT (0.33 mg/ml) y BCIP (0.17 mg/ml) se añaden entonces en un amortiguador de sustrato AP que contiene el inhibidor de AP Pierce y se incuba con las células por 15-20 min. Las placas se lavan entonces con agua. Se examinan después bajo un microscopio de disección para detectar la presencia de células teñidas de púrpura . La presencia de células teñidas de púrpura indica que la proteína de fusión/Ret se ha enlazado a las células y que la proteína RetL2 es un ligando para Ret. Células teñidas de púrpura también se observan después de la transfección con el vector de expresión retLl pero no con el vector de control negativo .

Clonación del Ligando Ret RetL3 A. Ret 3 de Murino Una búsqueda en la base de datos EST con la secuencia de aminoácidos del RetLl de rata revela dos ESTs con homología a los ligandos ret. Estos ESTs son AA049894 y AA050083 (que es un retL3 cADN parcial de rata, SEQ ID P715 NO-14). Los plásmidos que codifican éstos ESTs se obtienen de Genome Systems Inc. (Catalog #475791 y #475497) como cultivos de asa bacterianos . El plásmido ADN se prepara de colonias simples que se obtienen por estriado de los cultivos sobre placas LB Amp. Los insertos de éstos plásmidos son secuenciados en su totalidad. La comparación de las dos secuencias demuestra que AA049894, el cual tiene un inserto de 1.4 kb, está contenido dentro de AA050083, el cual tiene un inserto de 1.9 kb. La traducción de la secuencia del ADN de AA050083 indica que hay un marco de lectura abierto continuo de NT205 a Ntl242 (RetL3 parcial de murino; SEQ ID NO: 15). Este ORF tiene 37.5% de identidad con el retLl de rata y 40.2% de identidad con el retL2 de rata. Sin embargo, el marco de lectura abierto no codifica una Met (metionina) o una secuencia de señal en el extremo 5 ' . Examinamos los ORFs 5 'ascendentes de ésta región y encontramos una Met (metionina) en el contexto de una secuencia de consenso Kozak para iniciación de la traducción y una secuencia de señal potencial para expresión superficial/secreción. Este ORF está fuera del marco con el ORF descendente que indica que EST AA050083 contiene una mutación potencial, como una inserción, eliminación, intrón o un artefacto de clonación, en su extremo 5 ' . Para obtener el extremo 5 'correcto, empleamos P715 Marathón RACE. cADN de embrión de ratón de 11 días Marathon-Ready™ (cat . #7458-1) y un Kit Advantage™ (cat . #8417-1) se adquieren de Clontech. Se sintetizan oligonucleótidos antisentido, Kid-366, que corresponden al complemento de nucleótidos 847-866 de SEQ ID NO: 14 y Kid-365, que corresponden al complemento de nucleótidos 589-615 de SEQ ID NO: 14. PCR se lleva a cabo utilizando un kit cADN PCR Advantage™ (Clontech cat. #8417-1) combinado con reactivos Marathón™ cADN y el oligonucleótido Kid-366. La primera reacción PCR se establece como sigue: 35.3 ul H20; 5.0 ul 10X Klen Taq Buffer; 1.0 ul 10 mM mezcla dNTP ; 1.0 ul mezcla 50X Advantage™ Klen Taq Polimerasa. Estos reactivos se combinan y se mezclan. Se añaden entonces 5.0 ul cDNA de embrión de 11 días de ratón Marathon-Ready™; 1.0 ul lOuM API cebador y 1.7 ul 5.88uM Kid-366 (volumen final=50 ul) . PCR se lleva a cabo en un equipo Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 con las siguientes condiciones de ciclo: 1 ciclo de 94C por 1 min; 5 ciclos de 94C por 30 seg, 72C por 4 min; 5 ciclos de 94C por 30 seg, 70C por 4 min; 25 ciclos 94C por 30 seg, 68C por 4 min. Se lleva a cabo un PCR anidado utilizando el producto de la primera reacción PCR. Primero, 5 ul del producto PCR #1 se diluye 50 veces con TE (volumen final 250 ul) . La reacción PCR anidada contienen 35.5 ul de H20; 5.0 ul 10X Klen Taq Buffer; 1.0 ul mezcla lOmM dNTP; 1.0 ul mezcla 50X P715 Advantage™ Klen Taq Polymerase. Estos reactivos se mezclan como arriba. Se añaden entonces 5.0 ul del producto PCR #1 diluido; 1.0 ul lOuM AP2 cebador y 3.6 ul 2.8uM Kid-365. Las condiciones de ciclos son iguales a las de arriba. El producto resultante de aproximadamente 665 bp se purifica en un gel de agarosa de baja fusión al 1% y se extrae con Qiaex II (Qiagen cat#20021) . El ADN purificado se clona en pNoTA/T7™ utilizando el sistema de clonación PRIME PCR CLONERTM (5 Prime->3 Prime cat . #1-755029) . La información de la secuencia se obtiene de múltiples aislados, entre los que se incluyen los clones denominados DSW252 y DSW253. Se encontró que la secuencia de DSW252 se traslapa con SEQ ID NO: 14 excepto que está presente una T adicional entre NT252 y NT 253 de la secuencia SEQ ID NO: 14. Esta T también está presente en los otros aislados DSW251 y DSW53. La inserción de ésta base adicional corrige el ORF de tal manera que se obtiene un 1191 bp ORF simple que (contando desde la primera Met) codifica 397 aminoácidos. Este ORF codifica un Met en el contexto de una secuencia de consenso de iniciación de traducción canónica (Kosak) e incluye una secuencia de señal para expresión superficial/secreción. Para obtener un clon de murino de cadena completa que se capaz de ser expresado, se purifica un fragmento 630 bp Notl-BamHl de AA050083 y se enlaza a un vector de P715 expresión CH269 digerido en Notl. La ligación se transforma en E.coli XLl-Blue (Statagene cat #200236).

Minipreparaciones Qiawell Ultra se realizan en los transformados resultantes. Estos se analizan por digestión de restricción y por electroforesis en gel para tamaño correcto y para orientación. Esta construcción se denomina DSW254. El inserto de DSW254 es secuenciado en su totalidad (retL3 de murino; SEQ ID NO: 16) y el ORF se confirma a medida que codifica una proteína de 397 aminoácidos (RetL3 de murino; SEQ ID N0:17). Estas secuencias se muestran también en la Figura 9. La terminal-C de RetL3 es hidrofóbica e indicativa de un motivo de enlace fosfatidilinositol glicano.

B. RetL3 Humano Para encontrar una fuente de tejido candidata para la clonación de RetL3 humano, utilizamos tejidos de ratón de la técnica de transferencia Northern para determinar el patrón de expresión del RetL3 de murino. De los tejidos estudiados, la expresión de RetL3 es mayor en el tejido de corazón. Se adquiere una biblioteca de cADN de corazón humano adulto en el vector lambda gtlO de Clontech (catálogo#HL3026a) . Un millón de unidades formadoras de placa del suministro de fagos se depositan sobre placas Nunc. Se hacen levantamientos de duplicados de placa en P715 filtros Schleicher y Schuell Optitran™. Se genera una sonda por PCR con cebadores Kid-366 y Kid-367 que corresponden a los nucleótidos 397-420 de la secuencia AA050083. La reacción de PCR se establece como sigue: se mezclan 10 ul 10X PFU Buffer, 2.0 ul mezcla lOmM dNTP, 72.1 ul H20, 3.1 ul 13.2 uM Kid-367, 6.8 ul 5.88 uM Kid-366, 5.0 ul 0.1 ug/ul AA050083 ADN y 2.0 ul 2.5 Unidades/ul PFU (Statagene catalog#600154) . PCR se lleva a cabo en el equipo Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 con las siguientes condiciones: 25 ciclos de 94c por 1 min, 53C por 1 min, 72C por 4 min. El producto se purifica mediante extracción con fenol, cloroformo, alcohol isoamílico 50:49:1 seguida por electroforesis en gel de agarosa de baja fusión y purificación QiaexII del fragmento de excisión. Esta sonda codificadora de región se marca con P32 por cebado aleatorio (Feinberg y Vogelstein) . Los filtros se hibridan toda la noche a 65 C en un amortiguador de tamizado de placa que contiene sulfato de dextrana al 10%, 100 ug/ml tARN y 1.8 X 108 CPM de la sonda de ratón. Se lavan dos veces con el amortiguador de tamizado de placa, dos veces con 2XSSC/SDS 1%, dos veces con 1XSSC/SDS 1% a 65C y se exponen a la película a 70C con una pantalla de intensificación. Los duplicados positivos son purificados en la placa. Minipreparaciones de ADN lambda de las placas purificadas candidatas se digieren con EcoRl, se P715 someten a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se someten a absorción de Southern. La resultante de la absorción Southern se híbrida con la sonda de ratón. El clon GJ128 el cual tiene un inserto de 1.3 kb se híbrida intensamente a la sonda de la región de codificación de ratón. La secuencia de ADN (retL3 cADN parcial humano; SEQ ID NO: 18) y la secuencia de péptido deducida (RetL3 cADN parcial humano; SEQ ID NO: 19) se obtienen de éste clon, confirmando que éste es el homólogo humano. Este clon codifica la mayoría de las regiones de codificación, incluyendo el extremo 3 'de la región de codificación. El inserto 1.3 kb de GJ128 se purifica, se marca con P32 y se usa para tamizar la biblioteca de corazón humano adulto Clontech para obtener un clon con el extremo 5 ' . No se obtienen clones que contengan el extremo 5 ' en un tamiz de 2 X 106 placas de ésta biblioteca. El análisis Northern de bandas mARN de tejido humano adulto (Clontech catálogo #7760-1, 7759-1 y 7767-1) hibridadas con la misma sonda, usando protocolos suministrados por el fabricante, indica que el RetL3 se expresa en médula espinal, estómago, corazón, páncreas, intestino delgado, colon, próstata y testículos de humano adulto. Una biblioteca de cADN de médula espinal de humano adulto (catálogo #50OÍA) se tamiza con el inserto GJ128. 3 clones independientes se purifican y el más largo, GJ135 se secuencia. La secuencia del P715 inserto de GJ135 se traslapa con el inserto de GJ128, permitiendo la generación de una secuencia compuesta de retL3 cADN humano de cadena completa (SEQ ID NO: 20) y la determinación del RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano de cadena completa. Estas secuencias se muestran también en la Figura 10. El RetL3 humano es 34.3% y 34.9% idéntico al RetLl humano y al RetL2 humano, respectivamente. Tiene 76.8% de identidad con el RetL3 de murino.

USOS TERAPÉUTICOS DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN RetL's, anticuerpos anti-RetL, anticuerpos anti-Ret y proteínas de fusión de Ret y de RetL's nativas o variantes pueden tener utilidad terapéutica en situaciones en las que es deseable bloquear o activar la ruta de señalización de Ret, para estimular el crecimiento o supervivencia celular renal y/o neuronal en situaciones de alteración en las que esas células se pierden o se dañan o para suprimir el crecimiento o eliminar células indeseables como las células tumorales que expresan Ret o un RetL. En general, compuestos de la invención que se unen a Ret, induciendo dimerización y/o autofosforilación de Ret, son útiles para estimular el crecimiento de o limitar el daño a los tejidos que expresan- Ret. Los compuestos de la invención son útiles para estimular el crecimiento y/o supervivencia de tejido renal, soporte de P715 la función renal y minimizar el daño al tejido renal después de diversos traumas. Los estados particulares que se pueden tratar benéficamente con los compuestos de la invención incluyen insuficiencia renal aguda, nefritis aguda, insuficiencia renal crónica, síndrome nefrótico, defectos en los túbulos renales, transplantes de riñon, lesiones tóxicas y trauma. Los defectos en los túbulos renales incluyen tanto los de naturaleza hereditaria como los adquiridos, como trastorno renal poliquístico, trastorno quístico medular y riñon de esponja medular. Esta lista no está limitada y puede incluir otros muchos trastornos renales (ver, por ejemplo, Harrison 's Principies of Internal Medicine, 13th ed.,1994, el cual se incorpora en la presente como referencia) . En otras aplicaciones, los genes y proteínas de la invención pueden usarse para tratar estados en los que son deseables el crecimiento y la regeneración neuronal. Esto podría incluir cualquier estado que involucre trastornos de degeneración neural, como el trastorno de Alzheimer, de Parkinson, de Hungtinton, de Tourette, esclerosis lateral amiotrófica así como trastorno de las neuronas motoras, trastornos desmielinantes como la esclerosis múltiple, trastornos bacterianos como meningitis, abscesos o epiema, trastornos virales como mielopatía asociada a HIV, trastornos de prion entre los P715 que se incluye Creutzfeldt-Jakob. También se incluyen los trastornos por daños al tejido neural, sean causados por choque neoplásico, trauma o eventos cerebrovasculares como hemorragias o embolia. Los trastornos de los nervios craneales y de la médula espinal, entre los que se incluyen alteraciones que involucran etiologías traumáticas, inflamatorias, congénitas o vasculares, se incluyen específicamente, como son los trastornos que afectan el sistema nervioso autónomo. También se incluyen los trastornos del desarrollo neural como retraso mental, autismo, síndrome alcohólico fetal, síndrome de Down y parálisis cerebral. Los compuestos de la invención pueden usarse también para tratar síndromes que involucran el sistema nervioso periférico. Estos trastornos incluyen aquéllos causados por cualquiera de los factores listados previamente y específicamente se incluyen el trastorno Lyme, neuropatías asociadas a HIV, polimiositis, distrofia muscular y miastenia grave. Los anticuerpos anti-RetL y las proteínas de fusión de la invención, que se unen específicamente a la proteína RetL de rata, RetLl parcial humano, RetLl de cadena completa humano, RetL2 humano, RetL3 de murino o RetL3 humano o fragmentos de estas proteínas, son útiles en varios métodos. Los compuestos se pueden usar terapéuticamente para inhibir o bloquear - la señalización P715 del receptor Ret, como para bloquear el crecimiento de tumores que dependen de la activación de la señalización de Ret para crecer. Estos agentes también pueden fusionarse a marcadores detectables, como sustancias fluoroscópicamente o radiográficamente opacas y administrarse a sujetos para permitir la creación de imágenes de los tejidos que expresan un RetL. Los agentes también pueden unirse a sustancias, como peroxidasa de rábano que pueden usarse tinciones inmunicitoquímicas para permitir la visualización de áreas de células RetL-positivas en las secciones histológicas. Un anticuerpo específico solo puede ser usado de esta manera y los sitios en los que se une pueden visualizarse en un ensayo en emparedado utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina el cual está por sí mismo unido a un marcador detectable. Los anticuerpos específicos para cualquier RetL son también útiles en inmunoensayos para cuantificar la sustancia para la cual tiene especificidad un anticuerpo dado. Los anticuerpos específicos para un RetL también pueden unirse a soportes sólidos, como perlas o paltos y utilizarse para retirar al ligando de una solución, ya sea para uso en purificar la proteína o clarificarla a partir de la solución. Cada una de estas técnicas son de rutina para los expertos en las técnicas inmunológicas. Otro método de la invención incluye modular la P715 señalización Ret-RetL mediante poner en contacto Ret con un anticuerpo monoclonal anti-Ret. El efecto de ese contacto mAb-Ret puede ya sea bloquear o estimular la activación de la ruta de señalización de Ret, dependiendo de las características de la interacción de cada mAb con Ret particular. Ciertos mAbs interactúan con Ret como agonistas, con el enlace del agonista mAb-Ret disparando la dimerización y autofosforilación de Ret. Otros mAbs actúan como antagonistas de Ret. La interacción de Ret con un antagonista mAb previene la activación de la señalización de Ret por otros RetL's o por complejos que contienen RetL's que de otro modo activarían la ruta de señalización de Ret. Un RetL y/o anticuerpos para Ret o para una proteína de fusión Ret pueden usarse para permitir la creación de imágenes de tejidos que expresan Ret o en los métodos inmunohistológicos o preparativos descritos arriba para los anticuerpos para un RetL. Las proteínas de fusión que abarcan un RetL y/o anticuerpos anti-Ret se pueden usar para orientar específicamente terapias médicas contra cánceres y tumores que expresan Ret. Esos tumores pueden incluir varios diferentes fenotipos tumorales que se han asociado con mutaciones en Ret (N.Engl. J.Med. 335:943-951, 1996; Nature 367:319-320, 1996; Trends Gen. 12:138-144, 1996). Las intervenciones terapéuticas contra neoplasias que expresan un RetL utiliza proteínas de fusión que incorporan Ret y/o un anticuerpo anti-RetL. El anticuerpo anti-Ret o anticuerpo anti-RetL puede ser efectivo por sí mismo a través de una citolisis anticuerpo-dependiente y complemento-dependiente mediada por el dominio Fc. Tales ligandos híbridos y anticuerpos pueden hacerse más efectivos como terapéuticos para cáncer utilizándolos como vehículos de distribución para medicamentos neoplásicos, toxinas y citocidal radionúclidos, como itrio 90. Células efectoras citotóxicas pueden dirigirse a las células tumorales utilizando anticuerpos heteroconjugados, en donde un anticuerpo específico ya sea para Ret o para un RetL expresado por un tumor es acoplado covalentemente a un anticuerpo dirigido contra una proteína de superficie en células efectoras citotóxicas, como células NK o CTLs . Un ejemplo de un anticuerpo anti-Ret o terapia RetL es conjugar la cadena A tóxica de ricino o a una forma de cadena completa modificada de ricino (la cual ya no puede enlazarse a células) con un RetL o con un anticuerpo dirigido contra el polipéptido Ret expresado en la superficie de las células malignas. En otra modalidad, una toxina se conjuga con un Ret o un anticuerpo anti-REtL para dirigir selectivamente y matar células RetL-positivas, como un tumor que expresa un RetL. Tal aproximación ha probado P715 tener éxito con ricino bloqueado conjugada con un anticuerpo monoclonal contra el antígeno CD19 expresado en la mayoría de las células neoplásicas (Grossbard et al., Blood 79:576, 1992). Otras toxinas son igualmente útiles, como es sabido por los expertos en la técnica. Esas toxinas incluyen, en forma no exclusiva, exotoxina de pseudomonas, toxina de difteria y saporina. Esta aproximación debe probar aun más éxito usando un REtL o un anticuerpo anti-Ret, en contraste con la aproximación antígeno anti-CDl9 conocida, porque el Ret se expresa en un número muy limitado de tejidos. Las aproximaciones de arriba, que utilizan fusiones de ricino u otras toxinas, son igualmente aplicables a los conjugados tóxicos de RetL o de un anticuerpo anti-Ret; estos son útiles para dirigir selectivamente o matar células Ret-positivas, como células tumorales que expresa Ret . Otra aproximación a tales terapias médicas es usar RetL marcado con radioisótopo o anticuerpos anti-Ret. Tales compuestos radiomarcados dirigirán preferencialmente la radiocatividad a los sitios en las células del tumor que expresan Ret, reservando los tejidos normales. Dependiendo del radioisótopo empleado, la radiación emitida desde un anticuerpo radiomarcado unido a una célula tumoral también puede matar las células tumorales malignas cercanas que no expresan Ret. Se pueden utilizar una variedad de radionúclidos. Los isótopos que emiten partículas ß (por ejemplo, 1311) han tenido éxito cuando se emplean con anticuerpos monoclonales en contra de CD20 presente en linfomas de células-B (Kaminski et al., N.Engl .J.Med. 329:459 (1993); Press et al., N.Engl. J.Med. 329:1219 (1993)). Radinúclidos que emiten partículas ß generan emisiones radiactivas que son tumoricidas sobre distancias que abarcan varios diámetros celulares, que permiten la erradicación de células negativas de antígeno y disminuyen las consecuencias de la depositación no homegénea del anticuerpo o ligandos en los tumores . También se pueden emplear radionúclidos que emitan partículas a. La baja dosificación de irradiación generada por el radionúclido marcado REtL o anticuerpos anti-Ret puede ser terapéuticamente más efectiva que la irradiación instantánea distribuida externamente en la terapia de radiación convencional. La baja dosificación de irradiación puede inducir apoptosis (muerte celular programada) en ciertas líneas celulares (Macklis et al., Radiat. Res. 130:220 (1992); Maklis et al., Radiopharm. 5:339 (1992) ) . Los compuestos de la invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas, que quiere decir una cantidad de un compuesto la cual produce un resultado P715 médico deseable o ejerce una influencia en la condición particular que se trata. El término "sujeto" utilizado en la presente se usa para referirse a cualquier mamífero al cual puede que se administre un ligando Ret o un gen. Los sujetos específicamente destinados para tratamiento con el método de la invención incluyen humanos, así como no humanos primates, ovejas, caballos, ganado vacuno, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, conejillos de indias, hámsters, gerbos, ratas y ratones, así como los órganos, tumores y células derivadas u originadas a partir de estos anfitriones .

Uso de los Compuestos de la Invención en Terapia Genética Los genes RetL de la invención se introducen en el tejido dañado para estimular la producción de un RetL por las células transfectadas, para promover crecimiento celular y/o supervivencia de células que expresen Ret. En una modalidad específica de un método de terapia genética un gen RetL puede introducirse en un tejido blanco renal o neural que se haya seleccionado. Un RetL podría entonces expresarse establemente y estimular a las células positivas-receptoras de Ret para crecer, dividirse o diferenciarse y/o potenciar la supervivencia celular. Además, los genes RetL pueden introducirse en un P715 célula blanco utilizando una diversidad de métodos bien conocidos que utilizan estrategias con base viral o no-viral . Los métodos no-virales incluyen electroporación, fusión de membrana con liposomas, bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN, incubación con precipitado fosfato de calcio-ADN, transfección mediada con DEAE-dextrana y micro-inyección directa en las células solas. Por ejemplo, un gen RetL puede introducirse en una célula por coprecipitación con fosfato de calcio (Pillicer et al., Science, 209:1414-1422 (1980) ) ; microinyección mecánica y/o aceleración de partículas (Anderson et al., Proc. Nal. Acad. Sci USA, 77:5399-5403 (1980)); transfrencia de ADN basada en liposomas (por ejmplo, transfección mediada con LIPOFECTINA - Fefgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84:471-477, 1987; Gao y Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179:280-285, 1991; transfección mediada con DEAE Dextran; electroporación (Patente de los Estados Unidos 4,956,288); o métodos basados en polilisina en la cual el ADN se conjuga para distribuir ADN preferencialmente a los hepatocitos del hígado (Wolff et al., Science, 247: 465-468, 1990; Curiel et al., Human Gene Therapy 3:147-154, 1992) . Células blanco se pueden transfectar con los P715 genes de la invención por transferencia directa de gen. Veer, por ejemplo Wolff et al., "Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo", Science 247:1465-68, 1990. En muchos casos, será deseable la transfección mediada con vector. Se pueden usar cualquiera de los métodos conocidos en a técnica para la inserción de secuencias de polinucleótidos en un vector. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. iley & Sons, NY (1992), ambos se incorporan en la presente como referencia. El promotor de activación puede ser un tejido específico o inducible por un producto metabólico o una sustancia administrada. Tales promotores/intensificadores incluyen, pero no de manera exclusiva, el promotor RetL nativo, el promotor/intensificador citomegalovirus inmediato-temprano (Karasuyama et al., J . Exp .Med. , 169:13 (1989); el promotor beta-actin humano (Gunning et al., Proc .Nat .Acad. Sci . USA, 84:4831 (1987); el promotor glucocorticoide - inducible presente en el virus con repetición terminal larga de tumor mamario de ratón (MMTV LTR) (Klesig et al., Mol .Cell .Biol . , 4:1354 (1984); las secuencias de repetición de terminal larga del virus de leucemia de murino Moloney (MuLV LTR) (Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)); el promotor P715 SV40 de región temprana (Bernoist and Chambón, Nature, 290:304 (1981); el promotor del virus d sarcoma de Rous (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22:787 (1980)); el promotor timidina cinasa del virus herpes simplex (HSV) (Wagner et al., Proc . at .Acad . Sci . USA, 78:1441 (1981)); el promotor de adenovirus (Yamada et al., Proc .Nat .Acad. Sci .USA, 82:3567 (1985) ) . Los genes RetL también se pueden introducir por vectores virales específicos para usarse en sistemas de transferencia genética que están ahora bien establecidos. Ver por ejemplo: Madzak et al., J. Gen.Virol . , 73:1533-36, 1992 (Papovavirus SV40) ; Berkner et al., Curr . op .Microbiol . Immunol . , 158:39-61, 1992 (adenovirus); Hoffman et al., Proc .Nati .Acad. Sci .92 : 10099-10103 , 1995 (baculovirus); Moss et al., Curr . op .Microbiol . Immunol . , 158:25-38, 1992 (virus de vacuna); Muzyczka, Curr . op .Microbiol . Immunol . , 158:97-123, 1992 (virus adeno-asociado); Margulskee, Curr . op .Microbiol . Immunol . , 158:67-93, 1992 (virus herpes simplex (HSV) y virus Epstein-Barr (HBV); Miller, Curr . Top .Microbiol . Immunol . , 158:1-24, 1992 (retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol . Cell . Biol . , 4:749-754, 1984 (retrovirus); Miller et al., Nature, 357: 455-450, 1992 (retrovirus); Anderson, Science, 256:808-813, 1992 (retrovirus) , Current Protocols in Molecular Biology: Sections 9.10-9.14 (Ausubel et al . , Eds . ) , Greene Publishing P715 Associates, 1989, de los cuales se incorporan en la presente como referencia. Los vectores que se prefieren son virus de ADN que incluyen adenovirus (de preferencia vectores basados en Ad-2 o Ad-5) , baculovirus, virus de herpes (de preferencia vectores basados en virus de herpes simplex) y parvovirus (de preferencia vectores basados en parvovirus "defectuosos" o no autónomos, con mayor preferencia vectores basados en virus adeno-asociados, con preferencia superlativa vectores basados en AAV-2). Ver por ejemplo, Ali et al.. Gene Therapy 1:367-384, 1994; Patente de los Estados Unidos 4,797,368 y 5,399,346 y la discusión abajo. La selección de un sistema vector particular para transferir, por ejemplo, una secuencia de RetL, dependerá de una diversidad de factores. Un factor importante es la naturaleza de la población de células blanco. Aunque los vectores retrovirales se han estudiado ampliamente y usado en varias aplicaciones de terapia genética, generalmente son no aptos para infectar células que no están divididas pero pueden ser útiles en terapia de cáncer ya que ellos solo integran y expresan sus genes en las células de replicación. Son útiles para aproximaciones ex-vivo y son atractivas a este respecto debido a su integración estable en el genoma celular blanco . Los adenovirus son virus ADN eucariotes que P715 pueden modificarse para distribuir eficientemente un transgen terapéutico o reportero a una diversidad de tipos de células. Los adenovirus generales tipos 2 y 5 (Ad2 y Ad5 respectivamente) , que causan trastornos respiratorios en humanos, se han desarrollado actualmente para la terapia genética de Distrofia Muscular Duschenne (DMD) y Fibrosis Quística (CF) . Tanto Ad2 como Ad5 pertenecen a una subclase de adenovirus que no están asociados con malignidades en humanos . Los vectores de adenovirus son capaces de proporcionar niveles sumamente elevados de distribución de transgen prácticamente a todos los tipos de células, sin tener en cuenta el estado mitótico. Se pueden generar fácilmente altos títulos (1013 unidades formadoras de placa/ml) de virus recombinante en 293 células (un adenovirus transformado, línea celular de complementación de riñon embrionario humano: ATCC CRL1573) y crio-almacenada por periodos largos sin pérdidas apreciables . La eficacia de este sistema en distribuir un transgen terapéutico in vivo que complemente un desequilibrio genético se ha demostrado en modelos animales de diversos trastornos. Ver Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268 (1986); K.Tanzawa et al., FEBS Letters, 118(1) :81-84 (1980); J.L. Golasten et al., New Engl. J.Med., 309 (11983): 228-296 (1983); S.Ishibashi et al., J. Clin. Invest . 92:883-893 (1993); y S.Ishibashi et al., J . Clin. Invest . , 93: 1889- P715 1893 (1994) , de los cuales todos se incorporan en la presente como referencia. En efecto, adenovirus recombinante de replicación defectuosa que codifica un cADN para el regulador transmembrana de fibrosis quística (CFTR) se ha aprobado para uso en por lo menos dos pruebas clínicas CF en humanos. Ver, por ejemplo, J.Wilson, Nature, 365: 691-692 (Oct., 21, 1993). Un soporte adicional en la seguridad de adenovirus recombinantes para la terapia genética es la extensa experiencia de vacunas de adenovirus vivo en poblaciones humanas. Los adenovirus humanos constan de un genoma linear de ADN de dos cadenas de aproximadamente 36 kb, el cual está dividido en 100 unidades mapa (m.u.), cada una de las cuales es de 360 bp de longitud. El ADN contiene repeticiones terminales invertidas cortas (ITR) en cada extremo del genoma que se requieren para la replicación del ADN viral. Los productos del gen están organizados en regiones tempranas (El a E4) y tardías (Ll a L5), basadas en la expresión antes o después de la iniciación de la síntesis del ADN viral. Ver, por ejemplo, Horwitz, Virology, 2na.edit., ed. B.N.Fields, Raven Press Ltd., New York (1990) . La primera generación de adenovirus recombinantes de replicación deficiente que se han desarrollado para terapia genética de DMD y otros trastornos hereditarios P715 contienen eliminaciones de la región completa Ela y parte de la región Elb. Este virus de replicación defectuosa se desarrolla en 293 células que contienen un gen de adenovirus funcional Ela que proporciona una proteína de acción trans Ela. Los virus eliminados El son capaces de replicarse y producir virus infecciosos en las 293 células, que proporcionan productos en trans de las regiones Ela y Elb del gen. Los virus resultantes son capaces de infectar muchos tipos de células y pueden expresar el gen introducido (con tal que transporte su propio promotor) , pero no puede replicarse en una célula que no transporte la región El de ADN a menos que la célula esté infectada a muy elevada multiplicidad de infección. Los adenovirus tienen la ventaja de que tienen una amplia variedad de anfitriones, pueden infectar células inactivas o diferenciadas terminalmente como neurona y parecen esencialmente no-oncogénicas . Los adenovirus parecen no integrarse en el genoma del anfitrión. A causa de que ellos existen extracromosómicamente, el riesgo de mutagénesis insersional se reduce enormemente. Ali et al., supra, en 373. Los adenovirus recombinantes (rAdV) producen títulos muy altos, las partículas virales son moderadamente estables, los niveles de expresión son altos y se pueden infectar una amplia variedad de células. Sus células anfitrionas naturales son el epitelio de vías aéreas, de P715 tal manera que ellos son útiles para terapia de cánceres de pulmones . La transferencia mediada de baculovirus tiene varias ventajas. La transferencia del gen baculoviral puede ocurrir en células de replicación y en células de no-replicación y puede ocurrir en células renales, así como en hepatocitos, células neurales, bazo, piel y músculo. El baculovirus es de no-replicación y no patógeno en células de mamíferos . Los humanos carecen de anticuerpos pre-existentes para baculovirus recombinantes los cuales podrían bloquear la infección. Además, los baculovirus son capaces de incorporar y transducir insertos de ADN muy largos . Los virus adeno-asociados (AAV) también se han empleado como vectores para terapia genética somática. AAV es un virus pequeño con ADN de cadena simple (ss) con una organización genómica simple (4.7 kb) que lo hace un sustrato ideal para ingeniería genética. Dos marcos de lectura abiertos codifican series de polipéptidos rep y cap . Polipéptidos rep (rep 78, rep 68, rep 62 y rep 40) están involucrados en replicación, rescate e integración del genoma AAV. Las proteínas cap (VPl, VP2 y VP3 ) forman el virión del cápsido. Flanqueo de los marcos de lectura abiertos de rep y cap en los extremos 5 ' y 3 ' son 145 bp repeticiones terminales invertidas (ITRs) , las primeras 125 P715 bp de las cuales son capaces de formar estructuras dúplex de formas Y- o T- . De importancia para el desarrollo de los vectores AAV, los dominios completos rep y cap pueden someterse a excisión y reemplazarse con un transgen terapéutico o reportero. Ver B.J. Cárter, en Handbook of Parvoviruses, ed. , P. Tijeser, CRC Press, p. 155-168 (1990) . Se ha demostrado que los ITRs representan la secuencia mínima requerida para replicación, rescate, empaque e integración del genoma AAV. El ciclo de vida del AAV es bifásico, compuesto de episodios latentes y líticos. Durante una infección latente, los viriones AAV entran a la célula como un ssADN encapsilado, y poco después son distribuidas al núcleo en donde el AAV ADN se integra establemente en un cromosoma anfitrión sin la necesidad aparente de la división celular del anfitrión. En ausencia de un virus auxiliar, el genoma integrado AAV permanece latente pero capaz de ser activado y rescatado. La fase lítica del ciclo de vida empieza cuando una célula que hospeda un provirus AAV es desafiada con una infección secundaria por un . herpesvirus o adenovirus que codifica funciones auxiliares que son reclutadas por un Aav para ayudar en su excisión a partir de la cromatina del anfitrión (B.J. Cárter, supra) . El ssADN precursor de infección se expande a ADNs de forma de replicación dúplex (RF) en una manera rep dependiente. Los P715 genomas AAV rescatados se empacan en cápsidos de proteína preformada (simetría icosaédrica aproximadamente 20 nm de diámetro) y se liberan como viriones infecciosos que tienen empacados genomas de ssADN ya sea + o - y enseguida una lisis celular. Los virus adeno-asociados (AAV) tienen potencial significativo en la terapia genética. Las partículas virales son muy estables y las AAVs recombinantes (rAAV) tienen características "análogas a fármacos" de que se pueden purificar por pelletización o por bandeo con gradiente de CsCl. Son estables al calor y se pueden liofilizar a polvo y rehidratarse para actividad total. Su ADN se integra establemente en los cromososmas anfitriones así la expresión es de largo plazo . La diversidad de sus anfitriones es amplia y no causa trastornos conocidos, de esta manera los vectores recombinantes no son tóxicos. Una vez que se introduce en un célula blanco, las secuencias de interés se pueden identificar por métodos convencionales como hibridación de ácido nucleico utilizando sondas que contienen secuencias que son homologas/complementarias a las secuencias del gen insertado del vector. En otra aproximación, la secuenci (s) puede identificarse por la presencia o ausencia de una función del gen "marcadora" (por ejemplo, actividad timidina cinasa, resistencia a antibióticos y lo semejante) P715 ocasionada por la introducción del vector de expresión en la célula blanco . Formulaciones y Administración Los compuestos de la invención pueden administrarse de cualquier forma médicamente aceptable. Estas pueden incluir inyecciones, por rutas parenterales como intravenosa, intravascular, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intratumor, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural u otras, así como oral, nasal, oftálmica, rectal o tópica. La administración de liberación sostenida está incluida específicamente en la invención, por medios como inyecciones depósito o implantes desgastables . La administración localizada se contempla particularmente, por medios como administración vía catéter a una o más arterias, como la arteria renal o un vaso que suministre un tumor localizado. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más ingredientes orgánicos o inorgánicos, naturales o sintéticos, con los cuales el proto-oncogen mutante u oncoproteína mutante se combina para facilitar su aplicación. Un vehículo" adecuado incluye solución salina estéril aunque otras soluciones estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles que se sabe que son farmacéuticamente aceptables son conocidas por los expertos en la técnica. A este respecto, el término P715 "vehículo" abarca liposomas y la proteína HIV-1 tat (Ver Chen et al., Anal .Biochem. 227:168-175, 1995) así como cualquier plásmido y vectores de expresión viral. Una "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad que es capaz de mejorar o retardar la progresión de la condición de trastorno, degenerativa o de daño. Una cantidad efectiva puede determinarse sobre una base individual y estará en parte, basada en la consideración de los síntomas a tratar y los resultados esperados . Una cantidad efectiva puede determinarse por cualquiera de los que conocen la técnica empleando tales factores y utilizando no más que la experimentación de rutina. El sistema de liposomas puede ser cualquiera de las variedades de vesículas unilamelares, multilamelares o plurilamelares estables y pueden prepararse y administarse según los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, de conformidad con lo que enseñan las Patentes de los Estados Unidos 5,169,637, 4,762,915, 5,000,958 o 5,185,154. Además, sería deseable expresar los polipéptidos nuevos de esta invención, así como otros polipéptidos selectos, como lipoproteínas, para intensificar sus enlaces con los liposomas. Como un ejemplo, el tratamiento de la insuficiencia renal aguda en humanos con RetL encapsulado en liposoma puede realizarse in vivo por introducción de RetL en las células que necesitan de tal tratamiento, P715 utilizando liposomas . Los liposomas se pueden suministrar vía catéter a la arteria renal. La proteína RetL recombinante se purifica, por ejemplo, de células CHO por cromatografía de inmunoafinidad o cualquier otro método conveniente, se mezclan entonces con liposomas y se incorporan en ellos con elevada eficiencia. La proteína encapsulada se puede probar in vitro para cualquier efecto sobre la estimulación del crecimiento celular. La invención contempla también que el polipéptido nuevo de esta invención puede administrarse a un animal vía un sistema de suministro por liposoma para intensificar su estabilidad y/o inmunogenicidad. El suministro de los nuevos polipéptidos vía liposomas puede ser particularmente ventajoso porque los liposomas se pueden internalizar por las células fagocíticas en los animales tratados. Tales células, consumen la membrana liposómica y subsecuentemente presentan los polipéptidos al sistema inmune conjuntamente con otras moléculas requerida para fomentar una fuerte respuesta inmune. Cualquiera de los nuevos polipéptidos RetL de esta invención se pueden utilizar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos y bases adecuadas que son capaces de formar sales con los polipéptidos de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen ácidos y bases orgánicos e P715 inorgánicos . Aunque la invención anteriormente mencionada se ha descrito con cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad en la comprensión, será evidente para los expertos en la técnica que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de la invención, limitada solo por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

P715 LISTADOS DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: doherty, jodi (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS QUE PROMUEVEN EL CRECIMIENTO DE TEJIDO (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 21 (iv) DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Biogen, Inc. (B) CALLE: 14 Cambridge Center (C) CIUDAD: Cambridge (D) ESTADO: MA (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 02142 (v) FORMA PARA LA LECTURA EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión # 1.30 (vi) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-MAYO-1997 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE (?) NOMBRE: Lovin, Los] io M.. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 35,245 (C) REFERENCIA/EXPEDIENTE: A008 PCT CIP (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN (A) TELÉFONO: 617-679-2400 (B) TELEFAX: 617-679-2838 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3616 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 257..1660 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 GCGGCCGCAG GTTGGGTCGG ??CTG??CCC CTG???GCGG GTCCGCC CC CGCCCTCGCC- GO CCCGCCCGGA TCTGAGTCGC TGGCGGCGGT GGGCGGCAGA GCGACGGGGA GTCTGCTCTC 120 ACCCTGGATG GAGCTGAACT TTGAGTGGCC AGAGGAGCGC AGTCGCCCGG GGATCGCTGC 180 ACGCTGAGCT CTCTCCCCGA GACCGGGCGG CGGCTTTGGA TTTTGGGGGG GCGGGGACCA 2-0 GCTGCGCGGC GGCACC ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA 289 Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro 1 5 10 CTC CTG GAT TTG CTG ATG TCC GCC GAG GTG AGT GGT GGA GAC CGT CTG 337 Leu Leu Asp Leu Leu Met Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu 15 20 . 25 GAC TGT GTG AAA GCC AGC GAT CAG TGC CTG AAG GA? CAG AGC TGC ?GC 385 Asp Cys Val Lys Ala Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser 30 35 40 ACC AAG TAC CGC ACA CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC ?AG G?A ACC AAC 433 Thr Lys Tyr Arg Thr Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn 45 50 55 TTC AGC CTG ACA TCC GGC CTT GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGT AGC GCC - 481 Phe Ser Leu Thr Ser Gly Leu Glu Alá Lys Asp Glu Cys ?rg Ser Ala 60 65 70 75 ATG GAG GCC TTG AAG CAG AAG TCT CTG TAC A?C TGC CGC TGC AAG CGG 529 Met Glu Ala Leu Lys sln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys ?rg 80 85 90 GGC ATG AAG AAA GAG AAG AAT TGT CTG CGT ATC TAC TGG AGC ATG TAC 577 Gly Met Lys Lys Glu Lys Asn Cys Leu Arg lie Tyr Trp Ser Met Tyr 95 100 105 CAG AGC CTG CAG GGA ?AT GAC CTC CTG GAA G?T TCC CCG TAT GAG CCG 625 Gln Ser Leu Gln Gly Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro 110 l15 120 GTT AAC ?GC AGG TTG TCA GAT ATA TTC CGG GCA GTC CCG TTC AT? TCA 673 Val Asn Ser Arg Leu Ser Asp lie Phe Arg Ala Val Pro Phe He Ser 125 130 135 GAT GTT TTC CAG CAÁ GTG GAA CAC ATT TCC AAA GGG AAC AAC TGC CTG 721 Asp Val Phe Gln Gln Val Glu His He Ser Lys Gly Asn Asn Cys Leu 140 145 150 155 GAC GCA GCC AAG GCC TGC AAC CTG GAC GAC ACC TGT AAG AAG TAC AGG 769 Asp Ala Ala Lys Ala Cye Asn Leu Asp Asp Thr Cys Lys Lys Tyr Arg 160 165 170 TCG GCC TAC ATC ACC CCC TGC ACC ACC AGC ATG TCC AAC GAG GTC TGC 817 Ser Ala Tyr He Thr Pro Cye Thr Thr Ser Met Ser Asn Glu Val Cys 175 180 185 AAC CGC CGT AAG TGC CAC AAG GCC CTC AGG CAG TTC TTC GAC AAG GTT 865 Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val 190 195 200 CCG GCC AAG CAC AGC TAC GGG ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC ATC 913 Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp He 205 210 215 GCC TGC ACC GAG CGG CGG CGA CAG ACT ATC GTC CCC GTG TGC TCC TAT 961 Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr He Val Pro Val Cys Ser Tyr 220 225 230 235 GAA GAA CGA GAG AGG CCC AAC TGC CTG AGT CTG CAÁ GAC TCC TGC AAG 1009 Glu Glu Arg Glu Arg Pro Asn Cys Leu Ser Leu Gln Asp Ser Cys Lys 240 245 250 ACC AAT TAC ATC TGC AGA TCT CGC CTT GCA GAT TTT TTT ACC AAC TGC 1057 Thr Asn Tyr He Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys 255 260 265 CAG CCA GAG TCA AGG TCT GTC AGC AAC TGT CTT AAG GAG AAC TAC GCA 1105 Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Asn Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala 270 275 280 GAC TGC CTC CTG GCC TAC TCG GGA CTG ATT GGC ACA GTC ATG ACT CCC 1153 Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu He Gly Thr Val Met Thr Pro 285 290 295 AAC TAC GTA GAC TCC AGC AGC CTC AGC GTG GCA CCA TGG TGT GAC TGC 1201 Asn Tyr Val Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys 300 305 310 315 •AGC AAC AGC GGC AAT GAC CTG GAA GAC TGC TTG AAA TTT CTG AAT TTT 1249 Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Asp Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe 320 325 330 TTT AAG GAC AAT ACT TGT CTC AAA AAT GCA ATT CAÁ GCC TTT GGC AAT 1297 Phe I,ya Asp Aan Thr Cya Leu Lyo Aon Ala He Gln Ala Phe Gly Asn 335 340 345 GGC TCA GAT GTG ACC ATG- TGG CAG CCA GCC CCT CCA GTC CAG ACC ACC 1345 Gly Ser Asp Val Thr Met Trp'Gln Pro Ala Pro Pro Val Gln Thr Thr 350 355 360 ACT GCC ACC ACT ACC ACT GCC TTC CGG GTC AAG AAC AAG CCT CTG GGG 1393 Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Phe Arg Val Lye Asn Lye Pro Leu Gly 365 370 375 CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAG ATC CCC ACA CAC GTT TTA CCA CCC TGT 1441 Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu He Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys 380 385 390 395 GCG AAT TTG CAG GCT CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGT AGC ACA 1489 Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Ser Thr 400 405 410 CAC CTC TGT CTT TCT GAT AGT GAT TTC GGA AAG GAT GGT CTC GCT GGT 1537 His Leu Cys Leu Ser Asp Ser Asp Phe Gly Lys Asp Gly Leu Ala Gly 415 420 425 GCC TCC AGC CAC ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCC AGC TGC 1585 Ala Ser Ser Hie He Thr Thr Lye Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cye 430 435 440 AGT CTG AGC TCA CTG CCG GTG CTG ATG CTC ACC GCC CTT GCT GCC CTG 1633 Ser Leu Ser Ser Leu Pro Val Leu Met Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu 445 450 455 TTA TCT GTA TCG TTG GCA GAA ACG TCG TAGCTGCATC CGGGAAAACA 1680 Leu Ser Val Ser Leu Ala Glu Thr Ser 460 465 GTATGAAAAG ACAAAAGAGA ACCAAGTATT CTGTCCCTGT CCTCTTGTAT ATCTGAAAAT ' 1740 CCAGTTTTAA AAGCTCCGTT GAGAAGCAGT TTCACCCAAC TGGAACTCTT TCCTTGTTTT 1800 TAAGAAAGCT TGTGGCCCTC AGGGGCTTCT GTTGAAGAAC TGCTACAGGG CTAATTCCAA 1860 ACCCATAAGG CTCTGGGGCG TGGTGCGGCT TAAGGGGACC ATTTGCACCA TGTAAAGCAA 1920 GCTGGGCTTA TCATGTGTTT GATGGTGAGG ATGGTAGTGG TGATGATGAT GGTAATTTTA 1980 ACAGCTTGAA CCCTGTTCTC TC ACTGGTT AGGAACAGGA GATACTATTG ATAAAGATTC 2040 TTCCATGTCT TACTCAGCAG CATTGCCTTC TGAAGACAGG CCCGCAGCCT AGTGTGAATG 2100 ACAAGTGGAG GTTGGCCTCA AGAGTGGACT TGGCAGACTC TACCTTGTAG TAATGTTCAC 2160 CTTTCCGTGT ATGGTCTCCA CAGAGTGTTT ATGTATTTAC AGACTGTTCT GTGATCCCCC 2220 AACAACAACA ACCACAAATT CCTTGGTCAC CTCCAAATGT AACCGGTCCT TTAGCCCAGT 2280 AGAGGAGGGT GGGTGTGGCC CTGGCACAGC TCCCGGATTG TTGATGGGCA CTCTCCTGAG 2340 CTTTGCTTGA GTGAGAAGCT GAATGTAGCT GAAAATCAAC TCTTCTTACA CTTCTTACTG 2400 CTTCGTTCAC TTACGAGGTC ACATATAGAA CAAACATCAC CAACTATTAG CTTACCGTTA 2460 GCTTCCCAAC TATTAGCTTT CTATGTTTTG AAAÜCAGTGT TGCTG?CCCC ATGTTTTA?T 2520 Q?TOOTTT?? T?C?TGC?GC CCTTTCCTCT C?TCGGT??C ?CT?GCTCC? ?C?TC??C -"T ? *"•H P CATGCATQTa QCTCTC?AAA GC?GGCCCCA AGAAGCCCAG TTCTTT?GG? G???GCTGCG 2640 TCCTGTTTCT GTGGACAGGC AGGAGGAAAC AGAGCAGCCT GCCCGTGGTG TCTTTATCTG 2700 TTTTGA?ATC ??GGCTGCCT GTGTGT?AGs A?TGGTTC?? TTCTT?T??? GGGTGCC?CT 27G0 GTTGATGCCA CAACTGGCAG TTGGTCTAGC TCCAGGACAC CGGTTTCC?T GTTGCCTGGC 2820 AGAG?C?GCT TTG?TTGGGA CTGGCTGGCC ACAAGGGATG GGATG??GAT GTGCTGCCCT 2880 CTC.TTTCAAA GTTGAGCCCT GCCAGGGCAC ATAGAAGCAT CTTTGCTCCT GACCACAACG 2940 TAGA?C?GCT TGG?TTC??G GTC?TCA?GC GTCTCCTGT? CATTGCTCTG TG?CCTTC?T 3000 AACAGACTGT CCCGCACAAA AGGAACGGCA GTTTATGGAT CTAGAGTGGG AGCACAGGGT 3060 CTGGAA?GGT GA?CCG?TTG GCA?AATACA C?G?AC?GGA GGG?G?GTCT C??GCCG?G? 3120 CATCTTGCTT ACTAGCCACA CACCATCTCC TGGAGCCCTC CTCCTGACCT GGGCAG?CCC 3180 TTAGGTsTAT ATCT???G?C CTCTTC??TG TTC?GGTTCA OAATCTGT?? ?TGGTTGCGT 3240 CCTGGCACCC ATTCCTGAAA ACTGAACAAA GGAGAGGATA TCTTTCCTCC ATTG?GCCCT 3300 G???GTATGA CTGGCTTCTC ACCCTCCC?C ?G?GC?GGG? GCCCTGGTGC ?C?C?GTCTC 33G0 CTGATATCCT CCCTGCTCTT TGAGGTTTGC CTTGGGAGAA AATGATTCAC CTCGGG?GGG 3420 GACGCTTTGG TGTCTG?AGT ?CGTTT?TAT CGA??TGTTA ATGAAT?CCC ?TGT????T? 3480 CTCAATAGCC ACCTTTCTTC CCTTCACAAT GTTTTCGAGG GGAATGCATC CAACATCC?A 3540 GTGTACCTGG TCAGTGGGAA GT CCATGAA GACTCATACA TTGAATAAAC ?TATTCG?TG 3600 TGCCGAAAGC GGCCGC 3616 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 468 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu 1 5 10 15 Met Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp A9rg5 Leu Asp Cys Val Lys Ala 25 30 Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr 35 40 45 Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Thr Ser 50 55 60 Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lye 65 70 75 80 Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lye Lye Glu 85 90 95 Lys Asn Cys Leu Arg He Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly 100 105 110 Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu 115 120 125 Ser Asp lie Phe Arg Ala Val Pro Phe He Ser Asp Val Phe Gln Gln 130 135 140 Val Glu His He Ser Lys Gly Asn Asn Cye Leu Aep Ala Ala Lye Ala 145 150 155 160 Cys Asn Leu Asp Asp Thr Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr He Thr 165 170 175 Pro Cys Thr Thr Ser Met Ser Aen Glu Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys 180 185 190 His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys Hie Ser 195 200 205 Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp He Ala Cys Thr Glu Arg 210 215 220 • Arg Arg Gln Thr He Val Pro Val Cyß Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Arg 225 230 235 240 Pro Asn Cys Leu Ser Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr He Cys 245 250 255 Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg 260 265 270 Ser Val Ser Aen Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala 275 280 285 Tyr Ser Gly Leu He Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Val Asp Ser 290 295 300 £>er Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn 305 310 315 320 Asp Leu Glu Aap Cyo Leu Lyo Phe Leu Aon Phe Phe I-yr. ?r¡p ?r-n Thr 325 330 335 Cys Leu Lys Asn Ala lie Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr 340 345 350 Met Trp Gln Pro Ala Pro Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr 355 360 365 Thr Ala Phe Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu 370 375 380 Asn Glu He Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala 385 390 395 400 Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Ser Thr His Leu Cys Leu Ser 405 410 415 Aep Ser Aep Phe Gly Lye Asp Gly Leu Ala Gly Ala Ser Ser Hie He 420 425 430 Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Ser Leu Ser Ser Leu 435 440 445 Pro Val Leu Met Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ser Val Ser Leu 450 455 460 Ala Glu Thr Ser 465 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 39 pares de bases ( B ) TI PO : ácido nucleico ( C ) TI PO DE CADENA : simple ( D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG 39 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACVAGCTCGTC GCA 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC AACAGCGCATC ACA 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1926 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple . (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 10..1920 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: GCGGCCGCC ATG GCG AAG GCG ACG TCC GGC GCC GCA GGG CTG GGG CTG 48 Mefc Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu 470 475 4B0 AAG CTG TTT TTG CTG CTG CCG CTA CTG GGA GAA GCC CCG CTG GGT CTC 96 Lys Leu Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Glu Ala Pro Leu Gly Leu 485 490 495 TAC TTC TCA AGG GAT GCT TAC TGG GAG AGG CTG TAT GTG GAC CAG CCA 144 Tyr Phe Ser Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Arg Leu Tyr Val Asp Gln Pro 500 505 510 GCT GGC ACA CCT CTG CTC TAT GTC CAT GCC CTA CQG GAT GCC CCT GGA 192 Ala Gly Thr Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Gly 515 520 525 GAA GTG CCC AGC TTC CGC CTG GGC CAG TAT CTC TAT GGC GTC TAC CGC 240 Glu Val Pro Ser Phe Arg Leu Gly Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Tyx Arg 530 535 540 545 ACG CGT CTG CAT GAG AAT GAC TGG ATC CAC ATC GAT GCG GGC ACT GGC 288 Thr Arg Leu His Glu Asn Asp Trp He His He Asp Ala Gly Thr Gly 550 555 560 CTC CTC TAC CTC AAT CAG AGC CTG GAC CAT AGT TCC TGG GAG CAG CTC 336 Leu Leu Tyr Leu Asn Gln Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Gln Leu 565 570 575 AGC ATC CGA AAT GGC GGC TTC CCC TTG CTC ACC GTC TTC CTC CAG GTC 384 Ser lie Arg Asn Gly Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Phe Leu Gln Val 580 585 590 TTC CTG GGG TCC ACÁ GCC CAG AGA GAG GGA GAG TGT CAT TGG CCA GGC 432 Phe Leu Gly Ser Thr Ala Gln Arg Glu Gly Glu Cye Hie Trp Pro Gly 595 600 605 TGT GCC CGT GTG TAC TTC TCC TTC ATC AAC GAC ACC TTC CCA AAT TGT 480 Cys Ala Arg Val Tyr Phe Ser Phe He Asn Asp Thr Phe Pro Asn Cye 610 615 620 625 AGC TCC TTC AAA GCC CGG GAT CTC TGC ACC CCA GAG ACG GGT GTG TCC 528 Ser Ser Phe Lys Ala Arg Asp Leu Cys Thr Pro Glu Thr Gly Val Ser 630 635 640 TTC CGC ATC AGG GAG AAC AGG CCC CCT GGC ACC TTC TAC CAG T C CGC 576 Phe Arg He Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe Tyr Gln Phe Arg 645 650 655 ATG CTA CCT GTG CAG TTC CTT TGT CCT AAC ATC AGT GTG AAG TAC AAA 624 Met Leu Pro Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn He Ser Val Lys Tyr Lye 660 665 670 CTC TTA GAA GGG GAC GGT CTG CCC TTC CGT TGT GAC CCC GAC TGT CTG 672 Leu Leu Glu Gly Asp Gly Leu Pro Phe Arg Cys Asp Pro Asp Cye Leu 675 680 685 GAG GTG AGC ACG CGG TGG GCA CTG GAT CGG GAG CTT CAG GAG AAG TAT 720 Glu Val Ser Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Leu Gln Glu Lys Tyr 690 695 700 705 GTG CTG GAG GCT GAG TGC GCA GTG GCA GGC CCT GGA GCC AAC AAG GAG 768 Val Leu Glu Ala Glu Cys Ala Val Ala Gly Pro Gly Ala Asn Lys Glu 710 715 720 AAG GTG GCC GTG TCC TTC CCG GTG ACG GTG TAT GAT GAA GAC GAC TCC 816 Lys Val Ala Val Ser Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser 725 730 735 CCG CCC ACC TTC TCC GGA GGT GTG GGC ACC GCC AGT GCT GTG GTG GAG 864 Pro Pro Thr Phe Ser Gly Gly Val Gly Thr Ala Ser Ala Val Val Glu 740 745 750 TTT AAG CGG AAG GAG GGC ACT GTG GTA GCC ACT CTG CAG GTG TTT GAT 912 Phe Lye Arg Lys Glu Gly Thr Val Val Ala Thr Leu Gln Val Phe Aep 755 760 765 GCA GAT GTG GTG CCA GCA TCT GGG GAG CTG GTG AGG CGG TAC ACA AGC 960 Ala Asp Val Val Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser 770 775 780 785 ACA CTA CTC TCA GGG GAT TCC TGG GCC CAG CAG ACC TTC CGG GTG GAG 1008 Thr Leu Leu Ser Gly Asp Ser Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu 790 795 800 CAC ACA CCC AAC GAG ACC TTG GTC CAG TCC AAC AAC AAC TCC GTG CGG 1056 His Thr Pro Asn Glu Thr Leu Val Gln Ser Asn Asn Asn Ser Val Arg 805 810 815 GCA ACC ATG CAC AAT TAC AAG CTG GTT CTC AAC AGG AGC CTG TCC ATC 1104 Ala Thr Met His Asn Tyr Lys Leu Val Leu Asn Arg Ser Leu Ser He 820 825 830 • TCA GAG AGC CGA GTC CTG CAG CTA GTA GTC CTG GTC AAT GAC TCA GAC 1152 Ser Glu Ser Arg Val Leu Gln Leu Val Val Leu Val Asn Asp Ser Asp 835 840 845 TTC CAG GGG CCT GGG TCA GGT GTT CTC TTC CTC CAT TTC AAC GTG TCT 1200 Phe Gln Gly Pro Gly Ser Gly Val Leu Phe Leu His Phe Asn Val Ser 850 855 860 865 GTG CTG CCT GTC ACC CTG AAC CTA CCC ATG GCC TAC TCC TTC CCA GTG 1248 Val Leu Pro Val Thr Leu Asn Leu Pro Met Ala Tyr Ser Phe Pro Val 870 875 880 AAT AGG AGA GCC CGC CGT TAT GCC CAG ATT GGG AAA GTT TGC GTG GAG 1296 Asn Arg Arg Ala Arg Arg Tyr Ala Gln He Gly Lys Val Cys Val Glu 885 890 895 AAC TGC CAG GAG TTC AGC GGT GTC TCC ATC CAG TAC AAG CTG CAG CCC 1344 Asn Cys Gln Glu Phe Ser Gly Val Ser He Gln Tyr Lys Leu Gln Pro 900 905 910 TCC AGC ACC AAC TGC AGT GCC CTA GGT GTG GTC ACC TCA ACA GAA GAC 1392 Ser Ser Thr Asn Cys Ser Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Thr Glu Asp 915 920 925 ACC TCA GGG ACC CTA TAT GTA AAT GAC ACG GAG GCC CTG CGG CGA CCT 1440 Thr Ser Gly Thr Leu Tyr Val Aen Asp Thr Glu Ala Leu Arg Arg Pro 930 935 940 945 GAG TGT ACC GAG CTT CAG TAC ACA GTG GTA GCC ACT GAC CGG CAG ACC 1488 Glu Cys Thr Glu Leu Gln Tyr Thr Val Val Ala Thr Asp Arg Gln Thr 950 955 960 CGC AGG CAG ACC CAÁ GCT TCG TTA GTC GTC ACÁ GTG GAG GGG ACA TAC 1536 Arg Arg Gln Thr Gln Ala Ser Leu Val Val Thr Val Glu Gly Thr Tyr 965 970 975 ATT GCA GAA GAA GTG GGC TGC CCC AAG TCC TGT GCA GTA AAC AAG AGG 1584 He Ala Glu Glu Val Gly Cye Pro Lys Ser Cys Ala Val Aen Lye Arg 980 985 990 CGA CCT GAG TGT GAG GAG TGT GGT GGC CTG GGT TCT CCA ACT GGC AGA 1632 Arg Pro Glu Cys Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg 995 1000 1005 TGT GAG TGG CGT CAG GGA GAT GGT AAA GGG ATC ACC AGG AAC TTC TCC 1680 Cys Glu Trp Arg Gln Gly Asp Gly Lye Gly He Thr Arg Asn Phe Ser 1010 1015 1020 1025 ACC TGT TCT CCT AGC ACC AGG ACC TGT CCT GAT GGC CAC TGT GAT GCT 1728 Thr Cye Ser Pro Ser Thr Arg Thr Cye Pro Aep Gly Hie Cys Asp Ala 1030 1035 1040 CTG GAG AGC CGG GAT ATC AAC ATT TGC CCC CAG GAC TGT CTC CGT GGC 1776 Leu Glu Ser Arg Asp He Asn He Cys Pro Gln Asp Cye Leu Arg Gly 1045 1050 1055 CCC ATT GTT GGC GGG CAT GAG CGA GGG GAG CGC CAG GGG ATT AAA GCC 1824 Pro He Val Gly Gly Hie Glu Arg Gly Glu Arg Gln Gly He Lye Ala 1060 1065 1070 GGC TAT GGC ATC TGC AAC TGT TTC CCT GAT GAG AAG AAG TGC TTC TGC 1872 Gly Tyr Gly He Cys Asn Cys Phe Pro Asp Glu Lys Lye Cye Phe Cye 1075 1080 1085 GAG CCA GAG GAC AGC CAG GGC CCA TTG TGT GAT GCG CTG TGC CGC ACG 1920 Glu Pro Glu Asp Ser Gln Gly Pro Leu Cys Asp Ala Leu Cys Arg Thr 1090 1095 1100 1105 GTCGAC 1926 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 637 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 7 : Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu Lys Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Glu Ala Pro Leu Gly Leu Tyr Phe Ser 20 25 30 Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Arg Leu Tyr Val Asp Gln Pro Ala Gly Thr 40 45 Pro Leu Leu Tyr Val Hie Ala Leu Arg Asp Ala Pro Gly Glu Val Pro 50 55 60 Ser Phe Arg Leu Gly Gln Tyx Leu Tyr Gly Val Tyr Arg Thr Arg Leu 65 70 75 80 Hie Glu Asn Asp Trp He Hie He Asp Ala Gly Thr Gly Leu Leu Tyr 85 90 95 Leu Asn Gln Ser Leu Asp Hie Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ser He Arg 100 105 110 Asn Gly Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Phe Leu Gln Val Phe Leu Gly 115 120 125 Ser Thr Ala Gln Arg Glu Gly Glu Cys HÍB Trp Pro Gly Cys Ala ?rg 130 135 140 Val Tyr Phe Ser Phe He Asn Aep Thr Phe Pro Asn Cys Ser Ser Phe 145 150 155 160 Lys Ala Arg Aep Leu Cys Thr Pro Glu Thr Gly Val Ser Phe Arg He 165 170 175 Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe Tyr Gln Phe Arg Met Leu Pro 180 185 190 Val Gln Phe Leu Cys Pro ?sn He Ser Val Lys Tyr Lys Leu Leu Glu 19S 200 205 Gly Asp Gly Leu Pro Phe Arg Cys Asp Pro Asp Cys Leu Glu Val Ser 210 215 220 Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Leu Gln Glu Lys Tyr Val Leu Glu 225 230 235 240 Ala Glu Cys Ala Val Ala Gly Pro Gly Ala Asn Lys Glu Lys Val Ala 245 250 255 Val Ser Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp A-sp Ser Pro Pro Thr 260 '265 270 Phe Ser Gly Gly Val Gly Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lye Arg 275 280 285 Lys Glu Gly Thr Val Val Ala Thr Leu Gln Val Phe Aep Ala Aep Val 290 295 300 Val Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu 305 310 315 320 Ser Gly Aep Ser Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu Hie Thr Pro 325 330 335 Aen Glu Thr Leu Val Gln Ser Asn Asn Asn Ser Val Arg Ala Thr Met 340 345 350 His Aen Tyr Lye Leu Val Leu Asn Arg Ser Leu Ser He Ser Glu Ser 355 360 365 Arg Val Leu Gln Leu Val Val Leu Val Asn Aep Ser Asp Phe Gln Gly 370 375 380 Pro Gly Ser Gly Val Leu Phe Leu Hie Phe Asn Val Ser Val Leu Pro 385 390 395 400 Val Thr Leu Asn Leu Pro Met Ala Tyr Ser Phe Pro Val Aen Arg Arg 405 410 415 Ala Arg Arg Tyr Ala Gln lie Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln 420 425 430 Glu Phe Ser Gly Val Ser He Gln Tyr Lye Leu Gln Pro Ser Ser Thr 435 440 445 Asn Cys Ser Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Thr Glu Asp Thr Ser Gly 450 455 460 Thr Leu Tyr Val Asn Asp Thr Glu Ala Leu Arg Arg Pro Glu Cye Thr 465 470 475 480 Glu Leu Gln Tyr Thr Val Val Ala Thr Asp Arg Gln Thr Arg Arg Gln 485 490 495 Thr Gln Ala Ser Leu Val Val Thr Val Glu Gly Thr Tyr He Ala Glu 500 505 510 Glu Val Gly Cys Pro Lys Ser Cye Ala Val Asn Lye Arg Arg Pro Glu 515 520 525 Cye Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp 530 535 540 Arg Gln Gly Asp Gly Lys Gly He Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cyß Ser 545 550 • 555 560 Pro Ser Thr Arg Thr Cys Pro Asp Gly p -r Cys Asp Ala Leu Glu Ser 565 570 575 Arg Aep He Asn He Cys Pro Gln Aep Cye Leu Arg Gly Pro He Val 580 585 590 Gly Gly Hie Glu Arg Gly Glu Arg Gln Gly He Lye Ala Gly Tyr Gly 595 600 605 He Cye Aen Cye Phe Pro Aep Glu Lys Lye Cye Phe Cye Glu Pro Glu 610 615 620 Asp Ser Gln Gly Pro Leu Cye Asp Ala Leu Cye A g Thr 625 630 635 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ I D NO : 8 : . ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 1223 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 10..1038 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: CTG CTG GAG GAT TCC CCA TAT GAA CCA GTT AAC AGC AGA TTG TCA GAT 48 Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu Ser Aep 640 645 650 ATA TTC CGG GTG GTC CCA TTC ATA TCA GTG GAG CAC ATT CCC AAA GGG 96 He Phe Arg Val Val Pro Phe He Ser Val Glu His He Pro Lye Gly 655 660 665 AAC AAC TGC CTG GAT GCA GCG AAG GCC TGC AAC CTC GAC GAC ATT TGC 144 Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala Cys Asn Leu Asp Asp He Cys 670 675 680 685 AAG AAG TAC AGG TCG GCG TAC ATC ACC CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC 192 Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr He Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser 690 695 700 AAC GAT GTC TGC AAC CGC CGC AAG TGC CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC 240 Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe 705 710 715 TTT GAC AAG GTC CCG GCC AAG CAC AGC TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC 288 Phe Asp Lys Val Pro Ala Lye His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser 720 725 730 TGC CGG GAC ATC GCC TGC ACA GAG CGG AGG CGA CAG ACC ATC GTG CCT 336 Cys Arg Asp He Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr He Val Pro 735 740 745 GTG TGC TCC TAT GAA GAG AGG GAG AAG CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG 384 Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cye Leu Aen Leu Gln 750 755 760 765 GAC TCC TGC AAG ACG AAT TAC ATC TGC AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT 432 Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr He Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe 770 775 780 TTT ACC AAC TGC CAG CCA GAG TCA AGG TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG 480 Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lye 785 790 795 GAA AAC TAC GCT GAC TGC CTC CTC GCC TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA 528 Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu He Gly Thr 800 805 810 GTC ATG ACC CCC AAC TAC ATA GAC TCC AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA 576 Val Met Thr Pro Asn Tyr He Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro 815 820 825 TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGT ' GGG AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA 624 Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cye Leu Lye 830 835 840 845 TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAÁ 672 Phe Leu Asn Phe Phe Lye Aep Aen Thr Cye Leu Lye Aen Ala He Gln 850 855 860 GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA 720 Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro 865 870 875 GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC 768 Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu -Arg Val Lys Asn 880 885 890 AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT 816 Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu He Pro Thr His Val 895 900 905 TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG 864 Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val 910 915 920 925 TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA 912 Ser Gly Asn Thr His Leu Cys He Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu 930 935 940 GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC ACÁ AAA TCA ATG GCT GCT CCT 960 Gly Leu Gly Ala Ser Ser His He Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro 945 950 955 CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG 1008 Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu 960 965 970 TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA ACA TCA TAGCTGCATT AAAAAAATAC 1058 Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser 975 980 AATATGGACA TGTAAAAAGA CAAAAACCAA GTTATCTGTT TCCTGTTCTC TTGTATAGCT 1118 GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA ACAGTTCCAT TCAACTGGAA CATTTTTTTT 1178 TTTTCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC TTCGGGGCTT CTGTG 1223 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ I D NO : 9 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 34 6 aminoácidos ( B) TI PO : ácido nucleico ( D) TOPOLOGÍA : lineal ( ii ) T I PO DE MOLÉCULA : proteína ( xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ I D NO : 9 : Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Aen Ser Arg Leu Ser Asp 1 5 10 15 He Phe Arg Val Val Pro Phe He Ser Val Glu Hie He Pro Lye Gly 20 25 30 Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala Cye Asn Leu Asp Asp He Cye 35 40 45 Lye Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr He Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser 50 55 60 Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys His Lya Ala Leu Arg Gln Phe 65 70 75 80 Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser 85 90 95 Cys Arg Asp He Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr He Val Pro 100 105 110 Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln 115 120 125 Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr He Cys A g Ser A-tg Leu Ala Asp Phe 130 135 140 Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys 145 150 155 160 Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu He Gly Thr 165 170 175 Val Met Thr Pro Asn Tyr He Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro 180 185 190 Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn Aep Leu Glu Glu Cys Leu Lys 195 200 205 Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala He Gln 210 215 220 Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro 225 230 235 240 Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys ?sn 245 250 255 Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Aen slu lie Pro Thr His Val 260 265 270 Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser ?sn Val 275 280 285 Ser Gly Asn Thr His Leu Cys He Ser Aen Gly Aen Tyr Glu Lye Glu 290 295 300 Gly Leu Gly Ala Ser Ser His He Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro 305 310 315 320 Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu 325 330 335 Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser 340 345 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1682 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 118..1 97 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: GGGCGGCCAG AGCAGCACAG CTGTCCGGGG ATCGCTGCAT GCTGAGCTCC CTCGGCAAGA 60 CCCAGCGGCG GCTCGGGATT TTTTTGGGGG GGCGGGGACC AGCCCCGCGC CGGCACC 117 ATG TTC CTG GCG ACC CTG TAC TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC 165 Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu 350 355 360 CTG TCG GCC GAA GTG AGC GGC GGA GAC CGC CTG GAT TGC GTG AAA GCC 213 Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala 365 370 375 AGT GAT CAG TGC CTG AAG GAG CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC ACG 261 Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lye Tyr Arg Thr 380 385 390 CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAG ACC AAC TTC AGC CTG GCA TCC 309 Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lye Glu Thr Aen Phe Ser Leu Ala Ser 395 400 405 410 GGC CTG GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGC AGC GCC ATG GAG GCC CTG AAG 357 Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cye Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lye 415 420 425 CAG AAG TCG CTC TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG GGT ATG AAG AAG GAG 405 Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu 430 435 440 AAG AAC TGC CTG CGC ATT TAC TGG AGC ATG TAC CAG AGC CTG CAG GGA 453 Lys Asn Cys Leu Arg He Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly 445 450 455 AAT GAT CTG CTG GAG GAT TCC CCA TAT GAA CCA GTT AAC AGC AGA TTG 501 Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu 460 465 470 TCA GAT ATA TTC CGG GTG GTC CCA TTC ATA TCA GTG GAG CAC ATT CCC 549 Ser Asp He Phe Arg Val Val Pro Phe He Ser Val Glu His He Pro 475 400 485 490 AAA GGG AAC AAC TGC CTG GAT GCA GCG AAG GCC TGC AAC CTC GAC GAC 597 Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala Cys Asn Leu Aep Asp 495 500 505 ATT TGC AAG AAG TAC AGG TCG GCG TAC ATC ACC CCG TGC ACC ACC AGC 645 He Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr He Thr Pro Cys Thr Thr Ser 510 515 520 GTG TCC AAC GAT GTC TGC AAC CGC CGC AAG TGC CAC AAG GCC CTC CGG 693 Val Ser Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys cys Hie Lye Ala Leu Arg 525 530 535 CAG TTC TTT GAC AAG GTC CCG GCC AAG CAC AGC TAC GGA ATG CTC TTC 7 1 Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe 540 545 550 TGC TCC TGC CGG GAC ATC GCC TGC ACA GAG CGG AGG CGA CAG ACC ATC 789 Cys Ser Cys Arg Asp He Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr He 555 560 565 570 GTG CCT GTG TGC TCC TAT GAA GAG AGG GAG AAG CCC AAC TGT TTG AAT 837 Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cye Leu Asn 575 580 585 TTG CAG GAC TCC TGC AAG ACG AAT TAC ATC TGC AGA TCT CGC CTT GCG 885 Leu Gln Asp Ser Cys Lye Thr Asn Tyr He Cys Arg Ser Arg Leu Ala 590 595 600 QJtf -J.Q.J, 933 Aep Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cye 605 610 615 CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC CTC CTC GCC TAC TCG GGG CTT ATT 981 Leu Lye Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu He 620 625 630 GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC ATA GAC TCC AGT AGC CTC AGT GTG 1029 Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr lie Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val 635 640 645 650 GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGT GGG AAC GAC CTA GAA GAG TGC 1077 Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cye 655 660 665 TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT AAA AAT GCA 1125 Leu Lye Phe Leu Aen Phe Phe Lye Aep Aen Thr Cye Leu Lye Asn Ala 670 675 680 ATT CAÁ GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG CAG CCA GCC 1173 lie Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala 685 690 695 TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC ACT GCC CTC CGG GTT 1221 Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val 700 705 710 AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA ATT CCC ACT 1269 Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu He Pro Thr 715 720 725 730 CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG CTG AAA TCC 1317 His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser 735 740 745 AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGt ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA 1365 Asn Val Ser Gly Aen Thr His Leu Cys He Ser Asn Gly Asn Tyr Glu 750 755 760 AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT 1413 Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser Hie He Thr Thr Lye Ser Met Ala 765 770 775 GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG GTC CTG GTG GTA ACC 1461 Ala Pro Pro Ser Cye Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr 780 785 790 GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA ACA TCA TAGCTGCATT 1507 Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser 795 800 805 AAAAAAATAC AATATGGACA TGTAAAAAGA CAAAAACCAA GTTATCTGTT TCCTGTTCTC 1567 TTGTATAGCT GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA ACAGTTCCAT TCAACTGGAA 1627 CATTTTTTTT TTTTCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC TTCGGGGCTT CTGTG 1682 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 460 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lye Ala 20 25 30 Ser Asp Gln Cye Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr A-rg Thr 35 40 45 Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser 50 55 60 Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys 65 70 75 80 Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu 85 90 95 Lys A n Cye Leu Arg He Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly 100 105 110 Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu 115 120 125 Ser Asp lie Phe Arg Val Val Pro Phe He Ser Val Glu His He Pro 130 135 140 Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lyß Ala Cys Asn Leu Asp Asp 145 150 155 160 He Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr He Thr Pro Cys Thr Thr Ser 165 170 175 Val Ser Asn Asp Val Cye Asn Arg Arg Lys Cys Hie Lys Ala Leu Arg 180 185 190 Gln Phe Phe Asp Lye Val Pro Ala Lye Hie Ser Tyr Gly Met Leu Phe 195 200 205 Cye Ser Cye Arg Aep He Ala Cye Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr He • 210 215 220 Val Pro Val Cye Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lye Pro Asn Cys Leu Asn 225 230 235 240 Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr He Cys Arg Ser Arg Leu Ala 245 250 255 Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cye 260 265 270 Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu He 275 280 285 Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr He Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val 290 295 300 Ala Pro Trp Cys Asp Cye Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cye 305 310 315 320 Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cye Leu Lys Asn Ala 325 330 335 He Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala 340 345 350 Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val 355 360 365 Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu He Pro Thr 370 375 380 His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Qln Lys Leu Lys Ser 385 390 395 400 Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys He Ser Asn Gly Aen Tyr Glu 405 410 415 Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His He Thr Thr Lye Ser Met Ala 420 425 430 Ala Pro Pro Ser Cye Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr 435 440 445 Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser 450 455 460 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 12 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 1888 pares de bases ( B ) TI PO : ácido nucleico (C) TI PO DE CADENA : simple ( D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 25..1416 ( xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ I D NO : 12 .

AAAAAACGGT GGGATTTATT TAAC ATG ATC TTG GCA AAC GTC TTC TGC CTC 51 Met He Leu Ala Aen Val Phe Cye Leu 465 TTC TTC TTT CTA GAC GAG ACC CTC CGC TCT TTG GCC AGC CCT TCC TCC 99 Phe Phe Phe Leu Asp Glu Thr Leu Arg Ser Leu Ala Ser Pro Ser Ser 470 475 480 485 CTG CAG GGC CCC GAG CTC CAC GGC TGG CGC CCC CCA GTG GAC TGT GTC 147 Leu Gln Gly Pro Glu Leu His Gly Trp Arg Pro Pro Val Asp Cys Val 490 495 500 CGG GCC AAT GAG CTG TGT GCC GCC GAA TCC AAC TGC AGC TCT CGC TAC 195 Arg Ala Asn Glu Leu Cys Ala Ala Glu Ser Asn Cys Ser Ser Arg Tyr 505 510 515 CGC ACT CTG CGG CAG TGC CTG GCA GGC CGC GAC CGC AAC ACC ATG CTG 243 Arg Thr Leu Arg Gln Cys Leu Ala Gly Arg Asp Arg Asn Thr Met Leu 520 525 530 GCC AAC AAG GAG TGC CAG GCG GCC TTG GAG GTC TTG CAG GAG AGC CCG 291 Ala Asn Lys Glu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Val Leu Gln Glu Ser Pro 535 540 545 CTG TAC GAC TGC CGC TGC AAG CGG GGC ATO AAG AAG GAG CTG CAG TGT 339 Leu Tyr Aep Cye Arg Cye Lye Arg Gly Met Lys Lys Glu Leu Gln Cye 550 555 560 565 CTG CAG ATC TAC TGG AGC ATC CAC CTG GGG CTG ACC GAG GGT GAG GAG 387 Leu Gln He Tyr Trp Ser He His Leu Gly Leu Thr Glu Gly Glu Glu 570 575 580 TTC TAC GAA GCC TCC CCC TAT GAG CCG GTG ACC TCC CGC CTC TCG GAC 435 Phe Tyr Glu Ala Ser Pro Tyr Glu Pro Val Thr Ser Arg Leu Ser Asp 585 590 595 ATC TTC AGG CTT GCT TCA ATC TTC TCA GGG ACA GGG GCA GAC CCG GTG 483 He Phe Arg Leu Ala Ser He Phe Ser Gly Thr Gly Ala Asp Pro Val 600 605 610 GTC AGC GCC AAG AGC AAC CAT TGC CTG GAT GCT GCC AAG GCC TGC AAC 531 Val Ser Ala Lys Ser Asn His Cys Leu Asp Ala Ala Lye Ala Cys Asn 615 620 625 CTG AAT GAC AAC TGC AAG AAG CTG CGC TCC TCC TAC ATC TCC ATC TGC 579 Leu Asn Asp Asn Cye Lye Lye Leu Arg Ser Ser Tyr lie Ser lie Cys 630 635 640 645 AAC CGC GAG ATC TCG CCC ACC GAG CGC TGC AAC CGC CGC AAG TGC CAC 627 Aen Arg Glu He Ser Pro Thr Glu Arg Cye Aen Arg Arg Lye Cye Hie 650 655 eso AAG GCC CTG CGC CAG TTC TTC GAC CGG GTG CCC AGC GAG TAC ACC TAC 675 Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Aep Arg Val Pro Ser Glu Tyr Thr Tyr 665 670 675 CGC ATG CTC TTC TGC TCC TGC CAÁ GAC CAG GCG TGC GCT GAG CGC CGC 723 Arg Met Leu Phe Cye Ser Cye Gln Asp Gln Ala Cys Ala Glu Arg Arg 680 685 690 CGG CAÁ ACC ATC CTG CCC AGC TGC TCC TAT GAG GAC AAG GAG AAG CCC 771 Arg Gln Thr He Leu Pro Ser Cys Ser Tyr Glu Aep Lys Glu Lys Pro 695 700 705 AAC TGC CTG GAC CTG CGT GGC GTG TGC CGG ACT GAC CAC CTG TGT CGG 819 Asn Cys Leu Asp Leu Arg Gly Val Cys Arg Thr Asp His Leu Cys Arg 710 715 720 725 TCC CGG CTG GCC GAC TTC CAT GCC AAT TGT CGA GCC TCC TAC CAG ACG 867 Ser Arg Leu Ala Asp Phe His Ala Asn Cys Arg Ala Ser Tyr Gln Thr 730 735 740 GTC ACC AGC TGC CCT GCG GAC AAT TAC CAG GCG TGT CTG GGC TCT TAT 915 Val Thr Ser Cye Pro Ala Asp Asn Tyr Gln Ala Cys Leu Gly Ser Tyr 745 750 755 GCT GGC ATG ATT GGG TTT GAC ATG ACÁ CCT AAC TAT GTG GAC TCC AGC- 963 Ala Gly Met He Gly Phe Asp Met Thr Pro Asn Tyr Val Asp Ser Ser 760 765 770 CCC ACT GGC ATC GTG GTG TCC CCC TGG TGC AGC TGT CGT GGC AGC GGG 1011 Pro Thr Gly He Val Val Ser Pro Trp Cys Ser Cye Arg Gly Ser Gly 775 780 785 AAC ATG GAG GAG GAG TGT GAG AAG TTC CTC AGG GAC TTC ACC GAG AAC 1059 Asn Met Glu Glu Glu Cys Glu Lys Phe Leu Arg Asp Phe Thr Glu Asn 790 795 800 805 CCA TGC CTC CGG AAC GCC ATC CAG GCC TTT GGC AAC GGC ACG GAC GTG 1107 Pro Cys Leu Arg Asn Ala He Gln Ala Phe Gly Asn Gly Thr Asp Val 810 815 820 AAC GTG TCC CCA AAA GGC CCC TCG TTC CAG GCC ACC CAG GCC CCT CGG 1155 Asn Val Ser Pro Lye Gly Pro Ser Phe Gln Ala Thr Gln Ala Pro Arg 825 830 835 GTG GAG AAG ACG CCT TCT TTG CCA GAT GAC CTC AGT GAC AGT ACC AGC 1203 Val Glu Lys Thr Pro Ser Leu Pro Asp Asp Leu Ser Asp Ser Thr Ser 840 845 850 TTG GGG ACC AGT GTC ATC ACC ACC TGC ACG TCT GTC CAG GAG CAG GGG 1251 Leu Gly Thr Ser Val He Thr Thr Cys Thr Ser Val Gln Glu Gln Gly 855 860 865 CTG AAG GCC AAC AAC TCC AAA GAG TTA AGC ATG TGC TTC ACA GAG CTC 1299 Leu Lys Ala Asn Asn Ser Lys Glu Leu Ser Met Cys Phe Thr Glu Leu 870 875 880 885 ACG ACÁ AAT ATC ATC CCA GGG AGT AAC AAG GTG ATC AAA CCT AAC TCA 1347 Thr Thr Asn He He Pro Gly Ser Asn Lys Val He Lye Pro Asn Ser 890 895 900 GGC CCC AGC AGA GCC AGA CCG TCG GCT GCC TTG ACC GTG CTG TCT GTC 1395 Gly Pro Ser Arg Ala Arg Pro Ser Ala Ala Leu Thr Val Leu Ser Val 905 910 915 CTG ATG CTG AAA CTG GCC TTG TAGGCTGTGG GAACCGAGTC AGAAGATTTT 1446 Leu Met Leu Lys Leu Ala Leu 920 TGAAAGCTAC GCAGACAAGA ACAGCCGCCT GACGAAATGG AAACACACAC AGACACACAC 1506 ACACCTTGCA AAAAAAAAAT TGTTTTTCCC ACCTTGTCGC TGAACCTGTC TCCTCCCAGG 1566 TTCTTCTCT GGAGAAGTTT TTGTAAACCA AACAGACAAG CAGGCAGGCA GCCTGAGAGC 1626 TGGCCCAGGG GTCCCCTGGC AssGGAAACT C GGTGCCGG GGAGGGCACG AGGCTCTAGA 1686 AATGCCCTTC ACTTTCTCCT GGTGTTTTTC TCTCTGGACC CTTCTGAAGC AGAGACCGGA 1746 CAAGAGCCTG CAGCGGAAGG GACTCTGGGC TGTGCCTGAG GCTGGCTGGG sGCAGGACAA 1806 CACAGCTGCT TCCCCAGGCT GCCCACTCTG GGGACCCGCT GGGGGCTGGC AGAGGGCATC 1866 GGTCAGCGGG GCAGCGGGGC TG 1888 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 464 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína • (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: Met He Leu Ala Asn Val Phe Cys Leu Phe Phe Phe Leu Asp Glu Thr 1 5 10 15 Leu Arg Ser Leu Ala Ser Pro Ser Ser Leu Gln Gly Pro Glu Leu Hie 20 25 30 Gly Trp Arg Pro Pro Val Asp Cys Val Arg Ala Aen Glu Leu Cye Ala 35 40 45 Ala Glu Ser Aen Cys Ser Ser Arg Tyr Arg Thr Leu Arg Gln Cye Leu 50 55 60 Ala Gly Arg Asp Arg Asn Thr Met Leu Ala Aen Lye Glu Cye Gln Ala 65 70 75 80 Ala Leu Glu Val Leu Gln Glu Ser Pro Leu Tyr A p Cye Arg Cye Lye 85 90 95 Arg Gly Met Lye Lys Glu Leu sln Cys Leu Gln He Tyr Trp Ser He 100 105 110 His Leu Gly Leu Thr Glu Gly Glu Glu Phe Tyr Glu Ala Ser Pro Tyr 115 120 125 Glu Pro Val Thr Ser Arg Leu Ser Asp He Phe Arg Leu Ala Ser He 130 135 140 Phe Ser Gly Thr Gly Ala Asp Pro Val Val Ser Ala Lys Ser Asn His 145 150 155 160 Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala Cys Aan Leu Asn Asp Asn Cys Lys Lys 165 170 175 Leu Arg Ser Ser Tyr He Ser He Cys Asn Arg Glu He Ser Pro Thr 180 185 190 Glu Arg Cys Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe 195 200 205 Asp Arg Val Pro Ser Glu Tyr Thr Tyr Arg Met Leu Phe Cys Ser Cys 210 215 220 Gln Asp Gln Ala Cys Ala Glu Arg Arg Arg Gln Thr He Leu Pro Ser 225 230 235 240 Cys Ser Tyr Glu Asp Lys Glu Lys Pro Asn Cys Leu Asp Leu Arg Gly 245 250 255 Val Cys Arg Thr Asp His Leu Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe His 260 265 270 Ala Asn Cys Arg Ala Ser Tyr Gln Thr Val Thr Ser Cys Pro Ala A=p 275 280 285 Asn Tyr Gln Ala Cys Leu Gly Ser Tyr Ala Gly Met He Gly Phe Aep .290 295 300 Met Thr Pro Aen Tyr Val Aep Ser Ser Pro Thr Gly He Val Val Ser 305 310 315 320 Pro Trp Cys Ser Cye Arg Gly Ser Gly Asn Met Glu Glu Glu Cye Glu 325 330 335 Lye Phe Leu Arg Asp Phe Thr Glu Asn Pro Cys Leu Arg Asn Ala He 340 345 350 Gln Ala Phe Gly Asn Gly Thr Asp Val Aen Val Ser Pro Lye Gly Pro 355 360 365 Ser Phe Gln Ala Thr Gln Ala Pro Arg Val Glu Lye Thr Pro Ser Leu 370 375 380 Pro Asp Asp Leu Ser Asp Ser Thr Ser Leu Gly Thr Ser Val He Thr 385 390 395 400 Thr Cys Thr Ser Val Gln Glu Gln Gly Leu Lye Ala Asn Asn Ser Lye 405 410 415 Glu Leu Ser Met Cys Phe Thr Glu Leu Thr Thr Asn He He Pro Gly 420 425 430 Ser Asn Lys Val He Lys Pro Asn Ser Gly Pro Ser Arg Ala Arg Pro 435 440 445 Ser Ala Ala Leu Thr Val Leu Ser Val Leu Met Leu Lys Leu Ala Leu 450 455 460 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1878 pares de bases (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : cADN ( ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE : CDS ( B ) LOCALIZACIÓN : 205 . . 1242 ( xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ' l D NO : 14 : CGCGGCGCCC AGCGCAGGCA GAGCGCTGTC GCATCCCGGG CGÍCCACCCG CCATGGGGCT 60 CTCCTGGAGC CCGCGACCTC CACTGCTGAT GATCCTGCTA CTGGTGCTGT CGTTGTGGCT 120 GCCACTTGGA GCAGGAAACT CCCTTGCCAC AGAGAACAGG TTTGTGAACA GCTGTACCCA 180 GGCCAGAAAG AAATGCGAGG CTAA TCC CGC TTG CAÁ GGC TGC CTA CCA GCA 231 Ser Arg Leu Gln Gly Cye Leu Pro Ala 465 470 CCT GGG CTC CTG CAC CTC CAG TTA AGC AGG CCG CTG CCC TTA GAG GAG 279 Pro Gly Leu Leu Hie Leu Gln Leu Ser Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu 475 480 485 TCT GCC ATG TCT GCA GAC TGC CTA GAG GCA GCA GAA CAÁ CTC AGG AAC 327 Ser Ala Met Ser Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Glu Gln Leu Arg A=n 490 495 500 505 AGC TCT CTG ATA GAC TGC AGG TGC CAT CGG CGC ATG AAG CAC CAÁ GCT 375 Ser Ser Leu He Asp Cye Arg Cys Hie Arg Arg Met Lys Hie Gln Ala 510 515 520 ACC TGT CTG GAC ATT TAT TGG ACC GTT CAC CCT GCC CGA AGC CTT GGT 423 Thr Cys Leu Asp He Tyr Trp Thr Val Hie Pro Ala Arg Ser Leu Gly 525 530 535 GAC TAC GAG TTG GAT GTC TCA CCC TAT GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA 471 Asp Tyr Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lye 540 545 550 CCC TGG AAA ATG AAT CTT AGC AAG TTG AAC ATG CTC AAA CCA GAC TCG 519 Pro Trp Lys Met Asn Leu Ser Lys Leu Aen Met Leu Lys Pro Asp Ser 555 560 565 GAC CTC TGC CTC AAA TTT GCT ATG CTG TGT ACT CTT CAC GAC AAG TGT 567 Asp Leu Cys Leu Lys Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu His Asp Lye Cye 570 575 580 585 GAC CGC CTG CGC AAG GCC TAC GGG GAG GCA TGC TCA GGG ATC CGC TGC 615 Aep Arg Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly He Arg Cys 590 595 600 CAG CGC CAC CTC TGC CTA GCC CAG CTG CGC TCC TTC TTT GAG AAG GCA 663 Gln Arg His Leu Cys Leu Ala Gln Leu Arg Ser Phe Phe Glu Lys Ala 605 610 615 GCA GAG TCC CAC GCT CAG GGT CTG CTG CTG TGT CCC TGT GCA CCA GAA 711 Ala Glu Ser His Ala Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Glu 620 625 630 GAT GCG GGC TGT GGG GAG CGG CGG CGT AAC ACC ATC GCC CCC AGT TGC 759 Asp Ala Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg Asn Thr He Ala Pro Ser Cys 635 640 645 GCC CTG CCT TCT GTA ACC CCC AAT TGC CTG GAT CTG CGG AGC TTC TGC 807 Ala Leu Pro Ser Val Thr Pro Asn Cys Leu Asp Leu Arg Ser Phe Cys 650 655 660 665 CGT GCG GAC CCT TTG TGC AGA TCA CGC CTG ATG GAC TTC CAG ACC CAC 855 Arg Ala Asp Pro Leu Cys Arg Ser Arg Leu Met Asp Phe Gln Thr Hie 670 675 680 TGT CAT CCT ATG GAC ATC CTT GGG ACT TGT GCA ACT GAG CAG TCC AGA 903 Cye Hie Pro Met Aep He Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg 685 690 695 TGT CTG CGG GCA TAC CTG GGG CTG ATT GGG ACT GCC ATG ACC CCA AAC 951 Cys Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Leu He Gly Thr Ala Met Thr Pro Aen 700 705 710 TTC ATC AGC AAG GTC AAC ACT ACT GTT GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA 999 Phe He Ser Lys Val Asn Thr Thr Val Ala Leu Ser Cys Thr Cye Arg 715 720 725 • GGC AGC GGC AAC CTA CAG GAC GAG TGT GAA CAG CTG GAA AGG TCC TTC 1047 Gly Ser Gly Aen Leu Gln Asp Glu Cys Glu Gln Leu Glu Arg Ser Phe 730 735 740 745 TCC CAG AAC CCC TGC CTC GTG GAG GCC ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTC 1095 Ser Gln Asn Pro Cys Leu Val Glu Ala He Ala Ala Lye Met Arg Phe 750 755 760 CAC AGA CAG CTC TTC TCC CAG GAC TGG GCA GAC TCT ACT TTT TCA GTG 1143 His Arg Gln Leu Phe Ser Gln Asp Trp Ala Asp Ser Thr Phe Ser Val 765 770 775 GTG CAG CAG CAG AAC AGC AAC CCT GCT CTG AGA CTG CAG CCC AGG CTA 1191 Val Gln Gln Gln Asn Ser Aen Pro Ala Leu Arg Leu Gln Pro Arg Leu 780 785 790 CCC ATT CTT TCT TTC TCC ATC CTT CCC TTG ATT CTG CTG CAG ACC CTC 1239 Pro He Leu Ser Phe Ser He Leu Pro Leu He Leu Leu Gln Thr Leu 795 800 805 TGG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCCT CTCCACCACA CCCAGACTGA 1292 Trp 810 TTTGCAGCCT GTGGTGGGAG AGAACTCGCC AGCCTGTGGA AGAAGACGCA GCGTGCTACA 1352 CAGCAACCCG GAACCAACCA GGC?TTCCGC AGCACATCCC GTCTGCTCCA GAAGAGGTCT 1412 TAGAAGTGAG GGCTGTGACC CTTCCGATCC TGAGCGGCÍA GTTTTCAAAC CTCCCTTGCC 1472 CCTGCTTCCT TCTGGCTCAG GCTGCTCCTC CTTAGGACTT TGTGGGTCCA GTTTTGCCTT 1532 CTGTTCTGAT GGTGATTAGC GGCTCACCTC CAGCGCTTCT TCCTGTTTCC CAGGACCACC 1592 CAGAGGCTAA GGAATCAGTC ATTCCCTGTT GCCTTCTCCA GGAAGGCAGG CTAAGGGTTC 1652 TGAGGTGACT GAGAAAAATG TTTCCTTTGT GTGGAAGGCT GGTGCTCCAG CCTCCACGTC 1712 CCTCTGAATG GAAGATAAAA ACCTGCTGGT GTCTTGACTG CTCTGCCAGG CAATCCTGAA 1772 CATTTGGGCA TGAAGAGCTA AAGTCTTTGG GTCTTGTTTA ACTCCTATTA CTGTCCCCAA 1832 ATTCCCCTAG TCCCTTGGGT CATGATTAAA CATTTTGACT TAAAAA 1878 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NÓ : 15 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 34 6 aminoácidos ( B ) TI PO : aminoácidos ( D ) TOPOLOGÍA : l ineal ( i i ) TI PO DE MOLÉCULA : proteína ( xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ I D NO : 15 : Ser Arg Leu Gln Gly Cys Leu Pro Ala Pro Gly Leu Leu Hie Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu Ser Ala Met Ser Ala Asp Cys 20 25 30 Leu Glu Ala Ala Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Leu He Asp Cys Arg 35 40 45 Cys His Arg Arg Met Lys His Gln Ala Thr Cys Leu Asp He Tyr Trp 50 55 60 Thr Val His Pro Ala Arg Ser Leu Gly Asp Tyr Glu Leu Asp Val Ser 65 70 75 80 Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lys Met Asn Leu Ser 85 90 95 Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu Cys Leu Lys Phe Ala 100 105 110 Met Leu Cys Thr Leu His Asp Lys Cys Asp Arg Leu Arg Lys Ala Tyr 115 120 125 Gly Glu Ala Cys Ser Gly He Arg Cys Gln Arg Hie Leu Cys Leu Ala 130 135 140 Gln Leu Arg Ser Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Ser Hiß Ala Gln Gly 145 150 155 160 Leu Leu Leu Cye Pro Cye Ala Pro Glu Asp Ala Gly Cye Gly Glu Arg 165 170 175 Arg Arg Asn Thr He Ala Pro Ser Cye Ala Leu Pro Ser Val Thr Pro 180 185 190 Asn Cye Leu Asp Leu Arg Ser Phe Cye Arg Ala Aep Pro Leu Cye Arg 195 200 205 Ser Arg Leu Met Asp Phe Gln Thr Hie Cys Hie Pro Met Asp He Leu 210 215 220 Gly Thr Cye Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cye Leu Arg Ala Tyr Leu Gly 225 230 235 240 Leu He Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe He Ser Lye Val Aen Thr 245 250 255 -, c- Thr Val Ala Leu Ser Cye Thr Cye Arg Gly Ser Gly Aen Leu Gln A=p 260 265 270 Glu Cys Glu Gln Leu Glu Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Cye Leu Val 275 280 285 Glu Ala He Ala Ala Lye Met Arg Phe Hie Arg Gln Leu Phe Ser Gln 290 295 300 0 Asp Trp Ala Asp Ser Thr Phe Ser Val Val Gln Gln Gln Aen Ser Asn 305 310 315 320 Pro Ala Leu Arg Leu Gln Pro Arg Leu Pro He Leu Ser Phe Ser He 325 330 335 Leu Pro Leu He Leu Leu Gln Thr Leu Trp 340 345 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1889 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 0 (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 41..1231 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: CGCAGGCAGA GCGCTGTCGC ATCCCGGGCG TCCACCCGCC ATG GGG CTC TCC TGG 55 Met Gly Leu Ser Trp 350 AGC CCG CGA CCT CCA CTG CTG ATG ATC CTG CTA CTG GTG CTG TCG TTG 103 Ser Pro Arg Pro Pro Leu Leu Met He Leu Leu Leu Val Leu Ser Leu 355 360 365 TGG CTG CCA CTT GGA GCA GGA AAC TCC CTT GCC ACÁ GAG AAC AGG TTT 151 Trp Leu Pro Leu Gly Ala Gly Asn Ser Leu Ala Thr Glu Asn Arg Phe 370 375 380 GTG AAC AGC TGT ACC CAG GCC AGA AAG AAA TGC GAG GCT AAT CCC GCT 199 Val Asn Ser Cys Thr Gln Ala Arg Lys Lye Cys Glu Ala Asn Pro Ala 385 390 395 TGC AAG GCT GCC TAC CAG CAC CTG GGC TCC TGC ACC TCC AGT TTA AGC 247 Cys Lys Ala Ala Tyr Gln His Leu Gly Ser Cye Thr Ser Ser Leu Ser 400 405 410 415 AGG CCG CTG CCC TTA GAG GAG TCT GCC ATG TCT GCA GAC TGC CTA GAG 295 Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu Ser Ala Met Ser Ala Aep Cys Leu Glu 420 425 430 GCA GCA GAA CAÁ CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GAC TGC AGG TGC CAT 343 Ala Ala Glu Gln Leu Arg Aen Ser Ser Leu He Aep Cye Arg Cye His 435 440 445 CGG CGC ATG AAG CAC CAÁ GCT ACC TGT CTG GAC ATT TAT TGG ACC GTT 391 Arg Arg Met Lys His Gln Ala Thr Cys Leu Asp He Tyr Trp Thr Val 450 455 460 CAC CCT GCC CGA AGC CTT GGT GAC TAC GAG TTG GAT GTC TCA CCC TAT 439 His Pro Ala Arg Ser Leu Gly Asp Tyr Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr 465 470 475 GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA CCC TGG AAA ATG AAT CTT AGC AAG TTG 487 Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lys Met Asn Leu Ser Lys Leu 480 485 490 495 AAC ATG CTC AAA CCA GAC TCG GAC CTC TGC CTC AAA TTT GCT ATG CTG 535 Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu Cys Leu Lys Phe Ala Met Leu 500 505 510 TGT ACT CTT CAC GAC AAG TGT GAC CGC CTG CGC AAG GCC TAC GGG GAG 583 Cys Thr Leu His Asp Lys Cys Asp Arg Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu 515 520 525 GCA TGC TCA GGG ATC CGC TGC CAG CGC CAC CTC TGC CTA GCC CAG CTG 631 Ala Cys Ser Gly He Arg Cys Gln Arg His Leu Cys Leu Ala Gln Leu 530 535 540 CGC TCC TTC TTT GAG AAG GCA GCA GAG TCC CAC GCT CAG GGT CTG CTG 679 Arg Ser Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Ser His Ala Gln Gly Leu Leu 545 550 555 CTG TGT CCC TGT GCA CCA GAA GAT GCG GGC TGT GGG GAG CGG CGG CGT 727 Leu Cys Pro Cys Ala Pro Glu Asp Ala Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg 560 565 570 575 AAC ACC ATC GCC CCC AGT TGC GCC CTG CCT TCT GTA ACC CCC AAT TGC 775 Asn Thr He Ala Pro Ser Cys Ala Leu Pro Ser Val Thr Pro Asn Cys 580 585 590 CTG GAT CTG CGG AGC TTC TGC CGT GCG GAC CCT TTG TGC AGA TCA CGC 823 Leu Asp Leu Arg Ser Phe Cys Arg Ala Asp Pro Leu Cys Arg Ser Arg 595 600 605 CTG ATG GAC TTC CAG ACC CAC TGT CAT CCT ATG GAC ATC CTT GGG ACT 871 Leu Met Asp Phe Gln Thr His Cys His Pro Met Asp He Leu Gly Thr 610 615 620 TGT GCA ACT GAG CAG TCC AGA TGT CTG CGG GCA TAC CTG GGG CTG ATT 919 Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cye Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Leu He 625 630 635 GGG ACT GCC ATG ACC CCA AAC TTC ATC AGC AAG GTC AAC ACT ACT GTT 967 Gly Thr Ala Met Thr Pro Aen Phe He Ser Lys Val Asn Thr Thr Val 640 645 650 655 GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC AGC GGC AAC CTA CAG GAC GAG TGT 1015 Ala Leu Ser Cys Thr Cye Arg Gly Ser Gly Asn Leu Gln Asp Glu Cye 660 665 670 GAA CAG CTG GAA AGG TCC TTC TCC CAG AAC CCC TGC CTC GTG GAG GCC 1063 Glu Gln Leu Glu Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Cys Leu Val Glu Ala 675 680 685 ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTC CAC AGA CAG CTC TTC TCC CAG GAC TGG 1111 He Ala Ala Lye Met Arg Phe Hie Arg Gln Leu Phe Ser Gln Asp Trp 690 695 700 GCA GAC TCT ACT TTT TCA GTG GTG CAG CAG CAG AAC AGC AAC CCT GCT 1159 Ala Asp Ser Thr Phe Ser Val Val Gln Gln Gln Asn Ser Asn Pro Ala 705 710 715 CTG AGA CTG CAG CCC AGG CTA CCC ATT CTT TCT TTC TCC ATC CTT CCC 1207 Leu Arg Leu Gln Pro Arg Leu Pro He Leu Ser Phe Ser He Leu Pro 720 725 730 735 TTG ATT CTG CTG CAG ACC CTC TGG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCCT 1261 Leu He Leu Leu Gln Thr Leu Trp 740 CTCCACCACA CCCAGACTGA TTTGCAGCCT GTGGTGGGAG AGAACTCGCC AGCCTGTGGA 1321 AG??G?CGC? GCGTGCT?CA C?GCA?CCCG G??CC??CCA GGC?TTCCGC ?GC?C?TCCC 1381 GTCTGCTCCA GAAGAGGTCT TAGAAGTGAG GGCTGTGACC CTTCCGATCC TGAGCGGCTA 1441 GTTTTCAAAC CTCCCTTGCC CCTGCTTCCT TCTGGCTCAG GCTGCTCCTC CTTAGGACTT 1501 TGTGGGTCCA GTTTTGCCTT CTGTTCTGAT GGTGATTAGC GGCTCACCTC CAGCGCTTCT 1561 TCCTGTTTCC CAGGACCACC CAGAGGCTAA GGAATCAGTC ATTCCCTGTT GCCTTCTCCA 1621 GGAAGGCAGG CTAAGGGTTC TGAGGTGACT GAGAAAAATG TTTCCTTTGT GTGGAAGGCT 1681 GGTGCTCCAG CCTCCACGTC CCTCTGAATG GAAGATAAAA ACCTGCTGGT GTCTTGACTG 1741 CTCTGCCAGG CAATCCTGAA CATTTGGGCA TGAAGAGCTA AAGTCTTTGG GTCTTGTTTA 1801 ACTCCTATTA CTGTCCCCAA ATTCCCCTAG TCCCTTGGGT CATGATTAAA CATTTTGACT 1861 TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1889 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 397 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: Met Gly Leu Ser Trp Ser Pro Axg Pro Pro Leu Leu Met He Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Ser Leu Trp Leu Pro Leu Gly Ala Gly Asn Ser Leu Ala 20 25 30 Thr Glu Asn Arg Phe Val Asn Ser Cye Thr Gln Ala Arg Lye Lye Cye 35 40 45 Glu Ala Asn Pro Ala Cye Lys Ala Ala Tyr Gln Hie Leu Gly Ser Cye 50 55 60 Thr Ser Ser Leu Ser Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu Ser Ala Met Ser 65 70 75 80 Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Leu He 85 90 95 Asp Cys Arg Cys His Arg Arg Met Lys His Gln Ala Thr Cys Leu Asp 100 105 110 He Tyr Trp Thr Val His Pro Ala Arg Ser Leu Gly Asp Tyr Glu Leu 115 120 125 Asp Val Ser Pro Tyr Glu Aep Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lye Met 130 135 140 Asn Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lye Pro Aep Ser Asp Leu Cye Leu 145 150 155 160 Lys Phe Ala Met Leu Cye Thr Leu His Aep Lye Cye Asp Arg Leu Arg 165 170 175 Lye Ala Tyr Gly Glu Ala Cye Ser Gly He Arg Cys Gln Arg Hie Leu 180 185 190 Cys Leu Ala Gln Leu Arg Ser Phe Phe Glu Lye Ala Ala Glu Ser Hie 195 200 205 Ala Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Glu Aep Ala Gly Cye • 210 215 220 Gly Glu Arg Arg Arg Asn Thr He Ala Pro Ser Cys Ala Leu Pro Ser 225 230 235 240 Val Thr Pro Asn Cye Leu Asp Leu Arg Ser Phe Cye Arg Ala A=p Pro 245 250 255 Leu Cye Arg Ser Arg Leu Met Asp Phe Gln Thr Hie Cye Hie Pro Met 260 265 270 Asp He Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu Arg Ala .275 280 285 Tyr Leu Gly Leu He Gly Thr Ala Met Thr Pro Aen Phe He Ser Lye 290 295 300 Val Asn Thr Thr Val Ala Leu Ser Cye Thr Cye Arg Gly Ser Gly Asn 305 310 315 320 Leu Gln Asp Glu Cys Glu Gln Leu Glu Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro 325 330 335 Cyß Leu Val Glu Ala He Ala Ala Lyp Met Arg Phe His ?rg Gln Leu 340 345 350 Phe Ser GÍn Asp Trp Ala Asp Ser Thr Phe Ser Val Val Gln Gln Gln 355 360 365 Asn Ser Asn Pro Ala Leu Arg Leu Gln Pro Arg Leu Pro He Leu Ser 370 375 380 Phe Ser He Leu Pro Leu He Leu Leu Gln Thr Leu Trp 385 390 395 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1271 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 2..946 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: C GGC TAC TGT GAA ACA CCT CAÁ CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GGC 46 Gly Tyr Cye Glu Thr Pro Gln Leu Arg Aen Ser Ser Leu He Gly 400 405 410 TGC ATG TGC CAC CGG CGC ATG AAG AAC CAG GTT GCC TGC TTG GAC ATC 94 Cys Met Cye Hie Arg Arg Met Lye Aen Gln Val Ala Cye Leu Asp He 415 420 425 TAT TGG ACC GTT CAC CGT GCC CGC AGC CTT GGT AAC TAT GAG CTG GAT 142 Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn Tyr Glu Leu Aep 430 435 440 GTC TCC CCC TAT GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA CCC TGG AAA ATG AAT 190 Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lye Met Aen 445 450 455 460 CTC AGC AAA CTG AAC ATG CTC AAA CCA GAC TCA GAC CTC TGC CTC AAG 238 Leu Ser Lye Leu A=n Met Leu Lye Pro Asp Ser Aep Leu Cye Leu Lys 465 470 475 TTT GCC ATG CTG TGT ACT CTC AAT GAC AAG TGT GAC CGG CTG CGC AAG 286 Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Aep Lye Cye Aep Arg Leu Arg Lys 480 485 490 GCC TAC GGG GAG GCG TGC TCC GGG CCC CAC TGC CAG CGC CAC GTC TGC 334 Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln Arg His Val Cys 495 500 505 CTC AGG CAG CTG CTC ACT TTC TTC GAG AAG GCC GCC GAG CCC CAC GCG 382 Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Pro Hie Ala 510 515 520 CAG GGC CTG CTA CTG TGC CCA TGT GCC CCC AAC GAC CGG GGC TGC GGG 430 Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg Gly Cys Gly 525 530 • 535 540 GAG CGC CGG CGC AAC ACC ATC GCC CCC AAC TGC GCG CTG CCG CCT GTG 478 Glu Arg Arg Arg Asn Thr He Ala Pro Asn Cys Ala Leu Pro Pro Val 545 550 555 GCC CCC AAC TGC CTG GAG CTG CGG CGC CTC TGC TTC TCC GAC CCG CTT 526 Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser Asp Pro Leu 560 565 570 TGC AGA TCA CGC CTG GTG GAT TTC CAG ACC CAC TGC CAT CCC ATG GAC 574 Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cye His Pro Met Asp 575 580 585 ATC CTA GGA ACT TGT GCA ACA GAG CAG TCC AGA TGT CTA CGA GCA TAC 622 He Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr 590 595 600 CTG GGG CTG ATT GGG ACT GCC ATG ACC CCC AAC TTT GTC AGC AAT GTC 670 Leu Gly Leu He Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val Ser Asn Val 605 610 615 620 AAC ACC AGT GTT GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC AGT GGC AAC CTG 718 Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cye Thr Cye Arg Gly Ser Gly Aen Leu 625 630 635 CAG GAG GAG TGT GAA ATG CTG GAA GGG TTC TTC TCC CAC AAC CCC TGC 766 Gln Glu Glu Cye Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser Hie Aen Pro Cye 640 645 650 CTC ACG GAG GCC ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTT CAC AGC CAÁ CTC TTC 814 Leu Thr Glu Ala He Ala Ala Lye Met Arg Phe His Ser Gln Leu Phe 655 660 665 TCC CAG GAC TGG CCA CAC CCT ACC TTT GCT GTG ATG GCA CAC CAG AAT 862 Ser Gln Asp Trp Pro Hie Pro Thr Phe Ala Val Met Ala His Gln Asn 670 675 680 GAA AAC CCT GCT GTG AGG CCA CAG CCC TGG GTG CCC TCT CTT TTC TCC 910 Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser Leu Phe Ser 685 690 695 700 TGC ACG CTT CCC TTG ATT CTG CTC CTG AGC CTA TGG TAGCTGGACT 956 Cys Thr Leu Pro Leu He Leu Leu Leu Ser Leu Trp 705 710 TCCCCAGGGC CCTCTTCCCC TCCACCACAC CCAGGTGGAC TTGCAGCCCA CAAGGGGTGA 1016 GGAAAGGACA GCAGCAGGAA GGAGGTGCAG TGCGCAGATG AGGGCACAGG AGAAGCTAAG 1076 GGTTATGACC TCCAGATCCT TACTGGTCCA GTCCTCATTC CCTCCACCCC ATCTCCACTT 1136 CTGATTCATG CTGCCCCTCC TTGGTGGCCA CAATTTAGCC ATGTCATCTG GTGCCTGTGG 1196 GCCTTGCTTT ATTCCTATTA TTGTCCTAAA GTCTCTCTGG GCTCTTGGAT CATGATTAAA 1256 CCTTTGACTT AAAAA 1271 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 315 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: Gly Tyr Cye Glu Thr Pro Gln Leu Arg Aen Ser Ser Leu He Gly Cye 1 5 10 15 Met Cye Hie Arg Arg Met Lye Aen Gln Val Ala Cye Leu Asp He Tyr 20 25 30 Trp Thr Val Hie Arg Ala Arg Ser Leu Gly Aen Tyr Glu Leu Asp Val 35 40 45 Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lye Met Aen Leu 50 55 60 Ser Lye Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu Cye Leu Lye Phe 65 70 75 80 Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Aep Arg Leu Arg Lye Ala 85 90 95 Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cye Gln Arg Hie Val Cye Leu 100 105 lio Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Pro His Ala Gln 115 120 125 Gly Leu Leu Leu Cye Pro Cye Ala Pro A n Asp Arg Gly Cys Gly Glu 130 135 140 Arg Arg Arg Asn Thr He Ala Pro Aen Cys Ala Leu Pro Pro Val Ala 145 150 155 160 Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser Asp Pro Leu Cys 165 170 175 Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys Hie Pro Met Asp He 180 185 190 Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr Leu 195 200 205 Gly Leu He Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val Ser Aen Val Asn 210 215 220 Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu Gln 225 230 235 240 Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser His Asn Pro Cys Leu 245 250 255 Thr Glu Ala He Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser Gln Leu Phe Ser 260 265 270 Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala Hie Gln Asn Glu 275 280 285 Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser Leu Phe Ser Cye 290 295 300 Thr Leu Pro Leu He Leu Leu Leu Ser Leu Trp 305 310 315 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ I D NO : 20 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 1699 pares de bases ( B ) TI PO : ácido nucleico ( C ) TIPO DE CADENA : simple ( D) TOPOLOGÍA : lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : cADN ( ix ) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 175..1374 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20 TGTGGACGCG CGCTTCGGAG TTGGAGGGCG GCGCCCAGGA CCCTGGTGGG AGAGTGTGTG 60 CGTCGCGCTG GAGGGCGGGA GGCGGGOGCG GGAGGTGCCG GTCGAGGGAG CCCCGCTCTC 120 AGAGCTCCAG GGGAGGAGCG AGGGGAGCGC GGAGCCCGGC GCCTACAGCT CGCC ATG 177 Met GTG CGC CCC CTG AAC CCG CGA CCG CTG CCG CCC GTA GTC CTG ATG TTG 225 Val Arg Pro Leu Asn Pro Arg Pro Leu Pro Pro Val Val Leu Met Leu 320 325 330 CTG CTG CTG CTG CCG CCG TCG CCG CTG CCT CTC GCA GCC GGA GAC CCC 273 Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp Pro 335 340 345 CTT CCC ACA GAA AGC CGA CTC ATG AAC AGC TGT CTC CAG GCC AGG AGG 321 Leu Pro Thr Glu Ser Arg Leu Met Asn Ser Cys Leu Gln Ala Arg Arg 350 355 360 AAG TGC CAG GCT GAT CCC ACC TGC AGT GCT G C TAC CAC CAC CTG GAT 369 Lys Cys Gln Ala Aep Pro Thr Cys Ser Ala Ala Tyr Hie Hie Leu Aep 365 370 375 380 TCC TGC ACC TCT AGC ATA AGC ACC CCA CTG CCC TCA GAG GAG CCT TCG 417 Ser Cys Thr Ser Ser He Ser Thr Pro Leu Pro Ser Glu Glu Pro Ser 385 390 395 GTC CCT GCT GAC TGC CTG GAG GCA GCA CAG CAÁ CTC AGG AAC AGC TCT 465 Val Pro Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Gln Gln Leu Arg Asn Ser Ser 400 405 410 CTG ATA GGC TGC ATG TGC CAC CGG CGC ATG AAG AAC CAG GTT GCC TGC 513 Leu He Gly Cys Met Cye Hie Arg Arg Met Lye Aen Gln Val Ala Cys 415 420 425 TTG GAC ATC TAT TGG ACC GTT CAC CGT GCC CGC AGC CTT GGT AAC TAT 561 Leu Asp He Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn Tyr 430 435 440 10 GAG CTG GAT GTC TCC CCC TAT GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA CCC TGG 609 Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr Glu Aep Thr Val Thr Ser Lye Pro Trp 445 450 455 460 AAA ATG AAT CTC AGC AAA CTG AAC ATG CTC AAA CCA GAC TCA GAC CTC 657 Lye Met Aen Leu Ser Lye Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu 465 470 475 TGC CTC AAG TTT GCC ATG CTG TGT ACT CTC AAT GAC AAG TGT GAC CGG 705 -¡ p Cys Leu Lys Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cye Aep Arg 480 485 490 CTG CGC AAG GCC TAC GGG GAG GCG TGC TCC GGG CCC CAC TGC CAG CGC 753 Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln Arg 495 500 505 CAC GTC TGC CTC AGG CAG CTG CTC ACT TTC TTC GAG AAG GCC GCC GAG 801 His Val Cys Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu 510 515 520 0 CCC CAC GCG CAG GGC CTG CTA CTG TGC CCA TGT GCC CCC AAC GAC CGG 849 Pro His Ala Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg 525 530 535 540 GGC TGC GGG GAG CGC CGG CGC AAC ACC ATC GCC CCC AAC TGC GCG CTG 897 Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg Asn Thr He Ala Pro Asn Cys Ala Leu 545 ' 550 555 CCG CCT GTG GCC CCC AAC TGC CTG GAG CTG CGG CGC CTC TGC TTC TCC 945 c Pro Pro Val Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser 560 565 570 GAC CCG CTT TGC AGA TCA CGC CTG GTG GAT TTC CAG ACC CAC TGC CAT 993 Asp Pro Leu Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys Hie 575 580 585 CCC ATG GAC ATC CTA GGA ACT TGT GCA ACÁ GAG CAG TCC AGA TGT CTA 1041 Pro Met Asp He Leu Gly Thr Cye Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cye Leu 590 595 600 CGA GCA TAC CTG GGG CTG ATT GGG ACT GCC ATG ACC CCC AAC TTT GTC 1089 Arg Ala Tyr Leu Gly Leu He Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val 605 610 615 620 AGC AAT GTC AAC ACC AGT GTT GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC AGT 1137 Ser Asn Val Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser 625 630 635 GGC AAC CTG CAG GAG GAG TGT GAA ATG CTG GAA GGG TTC TTC TCC CAC 1185 Gly Asn Leu Gln Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser Hie 640 645 650 AAC CCC TGC CTC ACG GAG GCC ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTT CAC AGC 1233 Asn Pro Cys Leu Thr Glu Ala He Ala Ala Lys Met Arg Phe Hie Ser 655 660 665 CAÁ CTC TTC TCC CAG GAC TGG CCA CAC CCT ACC TTT GCT GTG ATG GCA 1281 Gln Leu Phe Ser Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala 670 675 680 ' CAC CAG AAT GAA AAC CCT GCT GTG AGG CCA CAG CCC TGG GTG CCC TCT 1329 His Gln Asn Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser 685 690 695 700 CTT TTC TCC TGC ACG CTT CCC TTG ATT CTG CTC CTG AGC CTA TGG 1374 Leu Phe Ser Cys Thr Leu Pro Leu He Leu Leu Leu Ser Leu Trp 705 710 715 TAGCTGGACT TCCCCAGGGC CCTCTTCCCC TCCACCACAC CCAGGTGGAC TTGCAGCCCA 1434 CAAGGGGTGA GGAAAGGACA GCAGCAGGAA GGAGGTGCAG TGCGCAGATG AGGGCACAGG 1494 AGAAGCTAAG .GGTTATGACC TCCAGATCCT TACTGGTCCA GTCCTCATTC CCTCCACCCC 1554 ATCTCCACTT CTGATTCATG CTGCCCCTCC TTGGTGGCCA CAATTTAGCC ATGTCATCTG 1614 GTGCCTGTGG GCCTTGCTTT ATTCCTATTA TTGTCCTAAA GTCTCTCTGG GCTCTTGGAT 1674 CATGATTAAA CCTTTGACTT AAAAA 1699 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 400 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos ( D) TOPOLOGÍA : lineal ( ii ) TI PO DE MOLÉCULA : proteína ( xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ I D NO : 21 Met Val Arg Pro Leu Asn Pro Arg Pro Leu Pro Pro Val Val Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ala Ala Gly Aep 20 25 30 Pro Leu Pro Thr Glu Ser Arg Leu Met Asn Ser Cys Leu Gln Ala Arg 35 40 45 Arg. Lye Cye Gln Ala Asp Pro Thr Cys Ser Ala Ala Tyr Hie His Leu 50 55 60 Aep Ser Cye Thr Ser Ser He Ser Thr Pro Leu Pro Ser Glu Glu Pro 65 70 75 80 Ser Val Pro Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Gln Gln Leu Arg Asn Ser 85 90 95 Ser Leu He Gly Cye Met Cys His Arg Arg Met Lye A=n Gln Val Ala 100 105 110 Cys Leu Aep He Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Aen 115 120 125 Tyr Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr Glu Aep Thr Val Thr Ser Lye Pro 130 135 140 Trp Lye Met Asn Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lye Pro Asp Ser Asp 145 150 155 160 Leu Cye Leu Lys Phe Ala Met Leu Cye Thr Leu Asn Asp Lys Cye Asp 165 170 175 Arg Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro HÍB Cys Gln 180 185 190 Arg His Val Cys Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lye Ala Ala 195 200 205 Glu Pro His Ala Gln Gly Leu Leu Leu Cye Pro Cys Ala Pro Asn Asp 210 215 220 Arg Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg ?sn Thr He Ala Pro Asn Cys Ala 225 230 235 240 Leu Pro Pro Val Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe 245 250 255 Ser Asp Pro Leu Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr HÍB Cys 260 265 270 His Pro Met Asp He Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cye 275 280 285 Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Leu He Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe 290 ' 295 300 Val Ser Asn Val Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cye Thr Cye Arg Gly 305 310 315 320 Ser Gly Aen Leu Gln Glu Glu Cye Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser 325 330 335 His Asn Pro Cys Leu Thr Glu Ala He Ala Ala Lys Met Arg Phe Hie 340 , 345 350 Ser Gln Leu Phe Ser Gln Aep Trp Pro Hie Pro Thr Phe Ala Val Met 355 360 365 Ala His Gln Asn Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro ' 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Cye Thr Leu Pro Leu He Leu Leu Leu Ser Leu Trp 385 390 395 400

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES; 1. Acido nucleico que codifica a un ligando c-Ret, dicho ligando comprende un polipéptido de por lo menos aproximadamente 400 aminoácidos, que tiene una secuencia de señal N-terminal hidrofóbica y una secuencia C-terminal hidrofóbica que comprende un motivo de enlace fosfatidilinositol glicano.
2. 2. Acido nucleico de la reivindicación 1 que codifica a un ligando c-Ret seleccionado del RetLl (SEQ ID NO: 2) de rata, RetLl (SEQ ID NO: 11) humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino y RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano.
3. 3. Acido nucleico de la reivindicación 1 que codifica una variante de sustitución de aminoácido de un ligando c-Ret seleccionado de RetLl (SEQ ID NO: 2) de rata, RetLl (SEQ ID NO: 11) humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino y RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano .
4. 4. Acido nucleico de la reivindicación 3 en donde dicha variante de sustitución, cuando se alinea con un ligando c-Ret seleccionado de RetLl (SEQ ID NO: 2) de rata, RetLl (SEQ ID NO: 11) humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino y RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano, comparte por lo menos 40% de similaridad de secuencia con esa, en donde además dicha variante de P715 sustitución comparte por lo menos 80% de residuos de cisteína alineadas con dicho ligando c-Ret.
5. 5. Acido nucleico de la reivindicación 3 en donde dicha variante de sustitución, cuando se alinea con un ligando c-Ret seleccionado de RetLl (SEQ ID NO: 2) de rata, RetLl (SEQ ID NO: 11) humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino y RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano, comparte por lo menos 80% de similaridad de secuencia con ese.
6. 6. Acido nucleico de la reivindicación 1 que codifica una variante de truncación de un ligando c-Ret seleccionado de RetLl (SEQ ID NO : 2 ) de rata, RetLl (SEQ ID NO: 11) humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino y RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano.
7. 7. Acido nucleico de la reivindicación 4, en donde dicha variante de truncación carece de dicho motivo de enlace fosfatidilinositol glicano.
8. 8. Acido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido que comprende : (a) una secuencia seleccionada de retLl cADN (SEQ ID N:l) de rata, retLl cADN (SEQ ID NO: 8) parcial humano, retLl cADN (SEQ ID NO: 10) humano, retL2 (SEQ ID NO: 12) humano, retL3 (SEQ ID NO: 16) de murino, retL3 (SEQ ID NO: 18) parcial humano y retL3 (SEQ ID NO: 20) humano; o (b) una variante degenerada de una secuencia P715 seleccionada de retLl cADN (SEQ ID N:l) de rata, retLl cADN (SEQ ID NO: 8) parcial humano, retLl cADN (SEQ ID NO: 10) humano, retL2 (SEQ ID NO: 12) humano, retL3 (SEQ ID NO: 16) de murino, retL3 (SEQ ID NO: 18) parcial humano y retL3 (SEQ ID NO: 20) humano; o (c) una variante polimorfica de una secuencia seleccionada de retLl cADN (SEQ ID N:l) de rata, retLl cADN (SEQ ID NO: 8) parcial humano, retLl cADN (SEQ ID NO: 10) humano, retL2 (SEQ ID NO: 12) humano, retL3 (SEQ ID NO: 16) de murino, retL3 (SEQ ID NO: 18) parcial humano y retL3 (SEQ ID NO: 20) humano.
9. 9. Un vector que tiene el ácido nucleico de las reivindicaciones 1, 2, 3, 6, 7 u 8 presente como un inserto en este, dicho vector opcionalmente comprende una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a dicho inserto.
10. 10. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 9.
11. 11. Un método de producción de polipéptido, que consiste en los pasos de: cultivar las células anfitrionas de la reivindicación 10 en un medio de cultivo celular; y recuperar un polipéptido ligando c-Ret expresado del vector inserto dentro de dichas células anfitrionas.
12. 12. Un polipéptido ligando c-Ret que comprende por lo menos 400 aminoácidos, que tiene una secuencia de P715 señal N-terminal hidrofóbica y una secuencia C-terminal hidrofóbica que comprende un motivo de enlace fosfatidilinositol glicano.
13. 13. Un polipéptido ligando c-Ret que comprende por lo menos 400 aminoácidos, que tienen una secuencia C-terminal hidrofóbica que comprende un motivo de enlace fosfatidilinositol glicano, dicho polipéptido se ha procesado por eliminación de una secuencia de señal N-terminal hidrofóbica.
14. 14. Un polipéptido ligando c-Ret de la reivindicación 13, el cual cuando se une a c-Ret, dispara la dimerización o autofosforilación del mismo.
15. 15. Un ligando c-Ret seleccionado de: (a) RetLl (SEQ ID NO : 2 ) de rata, REtLl (SEQ ID N0:9) parcial humano, RetLl (SEQ ID NO: 11) humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 15) parcial de murino, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino, RetL3 (SEQ ID NO: 19) parcial humano y RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano; o (b) variantes de sustitución de aminoácidos de RetLl (SEQ ID NO: 2) de rata, REtLl (SEQ ID NO: 9) parcial humano, RetLl (SEQ ID NO: 11) humano, RetL2 (SEQ ID NO: 13) humano, RetL3 (SEQ ID NO: 15) parcial de murino, RetL3 (SEQ ID NO: 17) de murino, RetL3 (SEQ ID NO: 19) parcial humano y RetL3 (SEQ ID NO: 21) humano.
16. 16. Un polipéptido ligando c-Ret truncado, P715 soluble que comprende por lo menos 400 aminoácidos, que tiene una secuencia C-terminal hidrofóbica que comprende un motivo de enlace fosfatidilinositol glicano, dicho polipéptido se ha procesado por eliminación de una secuencia de señal N-terminal hidrofóbica y por eliminación de dicho motivo de enlace fosfatidilinositol glicano.
17. 17. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido ligando c-Ret de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 o 16, fusionada con un polipéptido inmunoglobulina o un polipéptido toxina.
18. 18. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido c-Ret, fusionado con un polipéptido inmunoglobulina o un polipéptido toxina.
19. 19. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido ligando c-Ret de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 o 16.
20. 20. Un anticuerpo que bloquea la unión de dicho polipéptido ligando c-Ret a dicho polipéptido c-Ret.
21. 21. Un anticuerpo de la reivindicación 20 que se une específicamente a u polipéptido c-Ret.
22. 22. Uso en terapia de un polipéptido ligando c-Ret de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 o 16.
23. 23. Uso en terapia de una proteína de fusión de las reivindicaciones 17 o 18.
24. 24. Uso en terapia de una anticuerpo de las P715 reivindicaciones 19, 20 o 21.
25. 25. Un método para estimular el crecimiento del tejido que expresa c-Ret o de limitación del daño del mismo en un sujeto, que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido ligando c-Ret de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15 o 16 o una proteína de fusión inmunoglobulina de las reivindicaciones 17 o 18 o un anticuerpo de las reivindicaciones 20 o 21, a dicho sujeto.
26. 26. El método de la reivindicación 25 en donde dicho polipéptido ligando c-Ret se administra conjuntamente con un polipéptido relacionado con GDNF.
27. 27. El método de la reivindicación 25 en donde dicho tejido de expresión de c-Ret es tejido renal o tejido neural.
28. 28. Un método para suprimir el crecimiento de una célula tumoral que expresa c-Ret, que comprende el paso de poner en contacto dicha célula con una cantidad efectiva de un polipéptido ligando c-Ret de la reivindicación 16, una proteína de fusión de la reivindicación 17 o un anticuerpo de las reivindicaciones 20 o 21.
29. 29. Un método para suprimir el crecimiento de una célula tumoral que expresa un polipéptido ligando c-. Ret, que comprende el paso de poner en contacto dicha célula con una cantidad efectiva de un polipéptido ligando P715 c-Ret de la reivindicación 16, una proteína de fusión de la reivindicación 18 o un anticuerpo de las reivindicaciones 19 o 20.
30. 30. Un método para modular la transducción de señal c-Ret que involucra una célula que expresa ya sea un polipéptido c-Ret o un polipéptido ligando c-Ret, que comprende el paso de poner en contacto dicha célula con un polipéptido ligando c-Ret de la reivindicación 16, una proteína de fusión de las reivindicaciones 17 y 18 o un anticuerpo de la reivindicación 20.
31. 31. Un método para dirigir una toxina, un compuesto representable o un radionúclido a una célula que expresa ya sea un polipéptido c-Ret o un polipéptido ligando c-Ret, que comprende los pasos de poner en contacto dicha célula con: un polipéptido ligando c-Ret de la reivindicación 16 conjugado con dicha toxina, compuesto representable o radionúclido; una proteína de fusión de las reivindicaciones 17 o 18; o un anticuerpo de 1 reivindicación 20 conjugado con dicha toxina, compuesto representable o radionúclido.
32. 32. Un método para suprimir el crecimiento de una célula tumoral que expresa ya sea polipéptido c-Ret o polipéptido ligando c-Ret, que comprende el paso de poner en contacto dicha célula con: un polipéptido ligando c-Ret de la reivindicación 16 conjugado con una toxina o P715 radionúclido; una proteína de fusión de las reivindicaciones 17 o 18; o un anticuerpo de la reivindicación 20 conjugado a una toxina o radionúclido.
33. 33. Uso en terapia de un vector de la reivindicación 9.
34. 34. Un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo c-Ret, que comprende el paso de administrar un vector de la reivindicación 9 a dicho sujeto .
35. 35. Un método para estimular el crecimiento del tejido que expresa c-Ret o limitar el daño a los mismos, en un sujeto, que comprende el paso de administrar un vector de la reivindicación 9 a dicho sujeto.
36. 36. El método de la reivindicación 35 en donde el tejido que expresa c-Ret es tejido renal o tejido neural . P715