ES2328640T3 - Neublastina conjugada con un polimero glicosilada. - Google Patents

Neublastina conjugada con un polimero glicosilada. Download PDF

Info

Publication number
ES2328640T3
ES2328640T3 ES07012662T ES07012662T ES2328640T3 ES 2328640 T3 ES2328640 T3 ES 2328640T3 ES 07012662 T ES07012662 T ES 07012662T ES 07012662 T ES07012662 T ES 07012662T ES 2328640 T3 ES2328640 T3 ES 2328640T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
neublastin
cells
cell
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES07012662T
Other languages
English (en)
Inventor
Dinah Wen-Yee Sah
Blake R. Pepinsky
Anthony Rossomando
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen Inc
Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Biogen Idec MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33310837&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2328640(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc, Biogen Idec MA Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2328640T3 publication Critical patent/ES2328640T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una neublastina humana funcional y un péptido señal heterólogo, en el que el polipéptido carece del prodominio de neublastina.

Description

Neublastina conjugada con un polímero glicosilada.
Ámbito de la invención
La invención se refiere a la química de proteínas, la biología molecular, la neurobiología, la neurología y el tratamiento del dolor.
\vskip1.000000\baselineskip
Antecedentes de la invención
Los factores neurótrofos son proteínas que se producen de forma natural que regulan la supervivencia neuronal durante el desarrollo y que regulan la plasticidad y la integridad estructural del sistema nervioso adulto. Se pueden clasificar estos factores neurótrofos en superfamilias, familias, subfamilias y especies individuales basándose en su estructura y función.
Las superfamilias de factores neurótrofos incluyen la superfamilia del factor del crecimiento del fibroblasto (FGF), la superfamilia de la neurotrofina y la superfamilia del factor \beta del crecimiento transformante (TGF-\beta). Los ligandos relacionados con el factor neurótrofo derivado de la estirpe de los neurogliocitos (GD-NF) son una familia de proteínas dentro de la superfamilia del TGF-\beta. Los ligandos relacionados con el GDNF incluyen el GDNF, la persefina (PSP), la neurturina (NTN) y la neublastina (NBN; conocida como artemina o enovina). Los miembros de la familia de los ligandos relacionados con el GDNF se distinguen por, entre otras cosas, sus siete restos de cisteína conservados. Estos restos forman puentes de disulfuro intramoleculares e intermoleculares y dan origen a la estructura terciaria y cuaternaria del ligando polipeptídico dimerizado. Los miembros de la familia también inducen la señalización a través de un complejo receptor formado por varios componentes que consiste en un correceptor anclado por glucosilfosfatidilinositol (GPI) de la familia GFR\alpha, un miembro de la subfamilia de ligandos relacionados con el GDNF, y el receptor con tirosina cinasa RET.
El RET activado inicia una cascada de transducción de señales que es responsable, al menos en parte, de los efectos de los ligandos relacionados con el GDNF sobre las etapas posteriores de la vía.
La neublastina se clasifica dentro de la familia del GDNF porque comparte regiones de homología con otros ligandos del GDNF, entre ellas el motivo siete cisteínas (por ejemplo, tal y como se describe en la patente europea n.º EP02/02691, las publicaciones PCT US02/02319 y US02/06388), y porque se une al receptor RET, y lo activa, como parte de un complejo GFR\alpha. La neublastina es muy selectiva a la hora de unirse al complejo receptor GFR\alpha-RET. En este sentido, la neublastina contiene subregiones únicas en su secuencia de aminoácidos en comparación con otros miembros de la familia de ligandos relacionados con el GDNF.
La administración de la neublastina es potencialmente útil en el tratamiento de enfermedades asociadas a la degeneración y la disfunción neuronal. Sin embargo, el cuerpo elimina rápidamente la neublastina, lo que puede afectar al paradigma de dosificación de la neublastina requerido en las aplicaciones terapéuticas. Es necesario que existan moléculas que muestren la actividad biológica de la neublastina al mismo tiempo que presenten una potencia
mejorada.
\vskip1.000000\baselineskip
Compendio de la invención
Se ha descubierto que cuando una proteína neublastina, es decir, un dímero, está glucosilada internamente y conjugada en el extremo amino a un polímero sintético hidrosoluble, por ejemplo el polietilenglicol (PEG), aumentan significativamente la biodisponibilidad y la semivida en el suero. Por lo tanto, la eficacia in vivo se consigue con dosis más bajas.
Basándose en este descubrimiento, la presente descripción da a conocer un dímero que contiene un primer polipéptido de neublastina y un segundo polipéptido de neublastina, en el que: a) al menos uno de los polipéptidos está glucosilado; b) al menos uno de los polipéptidos está conjugado en su extremo amino a un polímero sintético hidrosoluble, y c) ninguno de los polipéptidos está conjugado a un polímero sintético hidrosoluble en una posición que no sea el extremo amino.
El polipéptido o polipéptidos de neublastina pueden ser, por ejemplo, NBN113 (SEQ ID n.º 2), NBN140 (SEQ ID n.º 6), NBN116 (SEQ ID n.º 7), NBN112 (SEQ ID n.º 8), NBN111 (SEQ ID n.º 9), NBN110 (SEQ ID n.º 10), NBN109 (SEQ ID n.º 11), NBN108 (SEQ ID n.º 12), NBN107 (SEQ ID n.º 13), NBN106 (SEQ ID n.º 14), NBN105 (SEQ ID n.º 15), NBN104 (SEQ ID n.º 16), NBN103 (SEQ ID n.º 17), NBN102 (SEQ ID n.º 18), NBN101 (SEQ ID n.º 19), NBN100 (SEQ ID n.º 20) y NBN99 (SEQ ID n.º 21). Un polipéptido preferente para la incorporación en el dímero es NBN104 (SEQ ID n.º 16).
\newpage
En algunos casos, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido de neublastina y del segundo polipéptido de neublastina son la misma. Preferiblemente, el polímero sintético hidrosoluble es un polialquilenglicol, por ejemplo, polietilenglicol (PEG).
Preferiblemente, la masa molecular total media del resto o restos de polialquilenglicol conjugados al dímero es de 10 a 50 kDa; más preferiblemente de 15 a 45 kDa; y lo más preferiblemente de 20 a 40 kDa. El resto de polialquilenglicol puede ser lineal o ramificado.
La descripción da a conocer una composición que comprende el dímero y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La descripción da a conocer un método para tratar el dolor neuropático en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano. El método incluye administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un dímero de la descripción. La descripción da a conocer un método para tratar la alodinia táctil en un mamífero. El método incluye administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un dímero de la descripción. La descripción da a conocer un método para tratar la hiperalgesia térmica en un mamífero. El método incluye administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un dímero de la descripción. La descripción da a conocer un método para activar el receptor RET en un mamífero. El método incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de un dímero de la descripción.
En algunos casos de la descripción, la cantidad terapéuticamente eficaz es de 0,1 \mug/kg a 1000 \mug/kg. En algunos casos, la cantidad terapéuticamente eficaz es de 1 \mug/kg a 100 \mug/kg. En algunos casos, la cantidad terapéuticamente eficaz es de 1 \mug/kg a 30 \mug/kg. En algunos casos, la cantidad terapéuticamente eficaz es de 3 \mug/kg a 10 \mug/kg. Preferiblemente, la vía de administración es intramuscular o subcutánea.
A menos que se defina de otra manera, toda la terminología técnica y científica utilizada en la presente memoria tiene el mismo significado que entenderá habitualmente el experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria para poner en práctica la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, servirá de control la presente especificación, incluidas las definiciones.
A menos que se especifique de otra manera, toda referencia a un número de resto de aminoácido del polipéptido de neublastina corresponde a la numeración en la SEQ ID n.º 1.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, "neublastina consenso" se refiere a la secuencia de la SEQ ID
n.º 1.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, "polipéptido de neublastina" se refiere a un polipéptido que 1) muestra al menos una actividad biológica de neublastina cuando se dimeriza como un homodímero, y 2) incluye una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos al 90% a los aminoácidos 8 a 113 de la SEQ ID n.º 2.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, "polipéptido de neublastina de tipo salvaje" se refiere a un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es una secuencia de polipéptido de neublastina que se produce de forma natural. Ejemplos de neublastinas de tipo salvaje son la neublastina humana (SEQ ID n.º 2), la neublastina de ratón (SEQ ID n.º 3) y la neublastina de rata (SEQ ID n.º 4).
Se puede determinar el porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos utilizando el programa BLAST 2.0 (disponible en www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) o una versión posterior del mismo. Se puede realizar la comparación de secuencias utilizando un alineamiento sin huecos y utilizando los parámetros por defecto (matriz Blosum 62, un coste de la existencia de huecos de 11, un coste del hueco por residuo de 1 y un cociente lambda de 0,85). El algoritmo matemático utilizado en los programas de BLAST se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402.
Basándose en la descripción contenida en la presente memoria, la presente invención da a conocer un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una neublastina humana funcional, una célula aislada que comprende tal ácido nucleico y un método para expresar una neublastina humana funcional, tal y como se establece en las reivindicaciones anexas.
Serán evidentes otras características y ventajas de la invención a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico de líneas quebradas que resume los datos que muestran una reversión sustanciosa de la alodinia táctil totalmente establecida mediante la administración subcutánea de un homodímero de NBN104 en el que cada monómero está conjugado a un resto de PEG en su extremo amino, y está glucosilado en la posición 95 ("2 X 20 kDa PEG NBN104"), en ratas con una ligadura L5/L6 del nervio raquídeo.
La figura 2 es un gráfico de líneas quebradas que resumen datos que muestran una reversión significativa de la hiperalgesia térmica totalmente establecida mediante la administración subcutánea de 2 X 20 kDa PEG NBN104 a las ratas con ligadura L5/L6 del nervio raquídeo.
La figura 3 es un alineamiento de secuencias de neublastina de tipo salvaje y madura de humano, ratón y rata. También se muestra una secuencia consenso basada en las secuencias de humano, ratón y rata.
La figura 4 es una secuencia consenso basada en las secuencias de neublastina de humano, ratón y rata, en la que se indican las sustituciones de aminoácidos optativas.
La figura 5 es un alineamiento de la preprosecuencia de la neublastina humana de tipo salvaje y tres secuencias de neublastina humana madura diferentes producidas de forma natural por procesamiento postraduccional alternativo.
La figura 6 es un alineamiento de secuencias de aminoácidos de varios truncamientos de la forma de 113 aminoácidos de la neublastina humana de tipo salvaje que se pueden incorporar en los dímeros de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción detallada de la invención Dímeros de neublastina glucosilada y conjugada a polímero
Los dímeros de la descripción muestran actividad en los ensayos de la actividad biológica de la neublastina. Por ejemplo, los dímeros de la descripción son activos en los ensayos de activación de RET. Los dímeros de la descripción muestran una mejor biodisponibilidad y/o una mayor semivida en el suero respecto al dímero correspondiente sin la combinación de la conjugación a polímero ni la glucosilación. En los casos preferentes de la descripción, el dímero glucosilado y conjugado a polímero muestra un aumento significativo de la potencia in vivo respecto a la potencia del polipéptido correspondiente sin la conjugación a polímero ni la glucosilación.
Por lo general, los polipéptidos incorporados en los dímeros de la descripción conservan al menos una de las características siguientes:
1) siete restos de cisteína conservados en las posiciones que corresponden a los restos 16, 43, 47, 80, 81, 109 y 111 en la SEQ ID n.º 1;
2) restos de aminoácidos como sigue:
C en la posición 16, L en la posición 18, V en la posición 25, L en la posición 28, G en la posición 29, L en la posición 30, G en la posición 31, E en la posición 36, F en la posición 40, R en la posición 41, F en la posición 42, C en la posición 43, G en la posición 45, C en la posición 47, C en la posición 80, C en la posición 81, R en la posición 82, P en la posición 83, F en la posición 91, D en la posición 93, N en la posición 95, S en la posición 105, A en la posición 106, C en la posición 109 y C en la posición 111;
3) una repetición LGLG, un motivo FRFC, un motivo QPCCRP y un motivo SATACGC.
Preferiblemente, los polipéptidos conservan todas las características anteriores.
En la figura 3 se presentan ejemplos de secuencias de aminoácidos de polipéptidos de neublastina de tipo salvaje. Respecto a los polipéptidos y las secuencias de neublastina de tipo salvaje, véase la publicación PCT de la patente internacional WO 00/01815. En la figura 4 se presenta una secuencia consenso de neublastina (consenso en relación con humano, ratón y rata).
En la figura 5 se muestra la secuencia de la preproneublastina humana (SEQ ID n.º 5). Se han identificado tres formas maduras de neublastina humana que son el resultado de diferentes procesamientos postraduccionales. Las tres formas son:
1) el polipéptido de 140 AA denominado NBN140 (SEQ ID n.º 6);
2) el polipéptido de 116 AA denominado NBN116 (SEQ ID n.º 7); y
3) el polipéptido de 113 AA denominado NBN113 (SEQ ID n.º 2).
La figura 5 es un alineamiento que compara la secuencia de aminoácidos de la preproneublastina humana y las tres secuencias maduras. La línea 1 proporciona el polipéptido de la SEQ ID n.º 5, la línea 2 proporciona el polipéptido de la SEQ ID n.º 6, la línea 3 proporciona el polipéptido de la SEQ ID n.º 7 y la línea 4 proporciona el polipéptido de la SEQ ID n.º 2. Los siete restos de cisteína conservados están indicados con símbolos ("*", "#", "+" y "I") para indicar los puentes de disulfuro intramoleculares (* con *, # con # y + con +) e intermoleculares ("I") formados en el ligando de neublastina dimerizada madura.
Los polipéptidos de neublastina en los dímeros de la descripción pueden ser productos de una reacción de escisión de proteasas o una reacción de escisión química, o se puede expresar directamente a partir de una construcción de ADN recombinante. Alternativamente, se pueden sintetizar químicamente, por ejemplo, mediante un sintetizador comercial en fase sólida.
Un dímero de polipéptido de neublastina conjugado a polímero preferente es un homodímero de NBN104 en el que cada monómero está conjugado a un resto de PEG en su extremo amino y glucosilado en la posición 95 ("2 X 20 kDa PEG NBN104"). En algunos casos, el polipéptido en el dímero consiste esencialmente en los aminoácidos 8 a 113 de la SEQ ID n.º 1.
En realizaciones preferentes de la descripción, el dímero se une al GFR\alpha3 y estimula la fosforilación de la tirosina de un polipéptido de RET. En algunos casos, el dímero mejora la supervivencia de una neurona sensitiva o reduce o revierte los cambios patológicos de una neurona sensitiva. En algunas ocasiones, el dímero mejora la supervivencia de una neurona autónoma o de una neurona dopaminérgica.
La descripción da a conocer un método para fabricar un dímero de polipéptido de neublastina glucosilado y conjugado a polímero. El método incluye dar a conocer un dímero de neublastina glucosilado, por ejemplo de una célula eucariota, y conjugar al menos un polipéptido del dímero a un polímero sintético hidrosoluble, por ejemplo un resto de polialquilenglicol.
\vskip1.000000\baselineskip
Polipéptidos de neublastina
Se pueden producir polipéptidos de neublastina mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neublastina se puede introducir en un vector, por ejemplo, un vector de expresión, y se puede introducir el vector en una célula hospedadora adecuada. Las células hospedadoras adecuadas son las que glucosilan los polipéptidos. Se prefieren las células hospedadoras eucariotas. Sin embargo, al menos una bacteria, a saber, Campylobacter jejuni, contiene un sistema de N-glucosilación que se puede transferir a células hospedadoras bacterianas tales como E. coli (Wacker et al., 2002, Science 298: 1790-1793). Se puede conseguir in vitro la modificación química y/o extensión de una glucosilación bacteriana mediante los métodos y los materiales conocidos en la técnica. Por lo tanto, se puede utilizar opcionalmente un sistema bacteriano capaz de glucosilar correctamente para producir polipéptidos de neublastina que se utilizarán de acuerdo con la
descripción.
Se pueden producir polipéptidos de neublastina adecuados para su utilización de acuerdo con la descripción en una célula de mamífero, por ejemplo una célula renal embrionaria humana ("HEK") tal como una célula HEK 293, una célula BHK21 o una célula de ovario de hámster chino ("CHO"). Otras células de mamífero adecuadas incluyen las estirpes celulares PC12, HiB5 y RN33b, células progenitoras neurales humanas y otras células derivadas de células humanas, especialmente células neurales. Ejemplos de estirpes celulares humanas inmortalizadas útiles para llevar a la práctica la presente descripción, incluidos los aspectos relevantes de la presente invención, incluyen células del melanoma de Bowes (n.º de acceso de la ATCC CRL 9607), células Daudi (n.º de acceso de la ATCC CCL 213), células HeLa y derivados de las células HeLa (n.º de acceso de la ATCC CCL 2, CCL 2.1 y CCL 2.2), células HL-60 (n.º de acceso de la ATCC CCL 240), células HT-1080 (n.º de acceso de la ATCC CCL 121), células Jurkat (n.º de acceso de la ATCC TIB 152), células de carcinoma KB (n.º de acceso de la ATCC CCL 17), células de leucemia K-562 (n.º de acceso de la ATCC CCL 243), células del cáncer de mama MCF-7 (n.º de acceso de la ATCC BTH 22), células MOLT-4 (n.º de acceso de la ATCC 1582), células Namalwa (n.º de acceso de la ATCC CRL 1432), células Raji (n.º de acceso de la ATCC CCL 86), células RPMI 8226 (n.º de acceso de la ATCC CCL 155), células U-937 (n.º de acceso de la ATCC CRL 1593), células de la WI-38VA13 subestirpe 2R4 (n.º de acceso de la ATCC CLL 75.1) y células de carcinoma de ovario 2780AD (Van der Blick et al., Cancer Res. 48: 5927-5932, 1988). También se pueden utilizar cepas de fibroblasto humano secundarias, tales como WI-38 (n.º de acceso de la ATCC CCL 75) y MRC-5 (n.º de acceso de la ATCC CCL 171).
Las células hospedadoras adecuadas que no son de mamíferos incluyen ovocitos de Xenopus laevis ("XLO") y células de levadura tales como Pichia pastoris. En algunos casos de la descripción, por ejemplo en algunas realizaciones de la invención, la célula hospedadora es una célula de insecto tal como una célula Sf9.
La transformación de la célula hospedadora se puede realizar mediante cualquier método adecuado, incluida, por ejemplo, la infección (mediante un vector vírico), por transfección (mediante un vector plasmídico), mediante la precipitación con fosfato de calcio, la microinyección, la electroporación y la lipofección. En la técnica se conocen métodos y materiales para la transformación de células hospedadoras eucarióticas.
Los polipéptidos de neublastina producidos mediante células hospedadoras transformadas se pueden aislar de las células o del medio de cultivo de las células hospedadoras, mediante técnicas convencionales de purificación de proteínas. Se pueden emplear etapas de replegamiento cuando sea necesario.
Se pueden modificar los polipéptidos de neublastina mediante métodos y materiales convencionales. Uno de tales métodos es la mutagenia específica del sitio, en la que se cambian uno o más nucleótidos para efectuar una sustitución predeterminada de uno o más aminoácidos en un polipéptido de neublastina. En el mercado existen kits de mutagénesis específica del sitio adecuados, por ejemplo el kit de mutagenia transformadora específica del sitio (Clontech Laboratories, Palo Alto, California).
Algunos casos de la descripción, incluidas algunas realizaciones de la invención, se refieren a polipéptidos de neublastina que contienen sustituciones conservativas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen sustituciones dentro de los grupos siguientes: valina, alanina y glicina; leucina, valina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparragina y glutamina; serina, cisteína y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrófobos apolares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.
La neublastina glucosilada de la descripción se puede dar a conocer en cualquier forma bioactiva, incluida la forma de preproteínas, proproteínas, proteínas maduras, proteínas fosforiladas, proteínas sin fosforilar, formas truncadas o cualquier otra proteína modificada postraduccionalmente. En algunos casos, un polipéptido de la descripción tiene la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID n.º 6, que contiene un resto de asparragina glucosilada en la posición 122; o la secuencia de aminoácidos presentada como la SEQ ID n.º 14, que contiene un resto de asparragina glucosilada en la posición 95, o la posición análoga en cualquier polipéptido de neublastina cuando se alinea mediante, por ejemplo, el programa informático ClustalW.
Por lo general, un dímero aislado de una célula de mamífero, u otra tal célula capaz de glucosilar proteínas, se glucosilará en la posición del aminoácido 95. En la técnica se conocen métodos para glucosilar proteínas in vitro y se pueden emplear para glucosilar polipéptidos de neublastina o dímeros de polipéptidos de neublastina si así se desea.
La puesta en práctica de la presente descripción, incluida la invención, se puede realizar mediante técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas e inmunología. Tales técnicas se describen en referencias generales. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (Sambrook et al., eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Vol. I y II (Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (Gait, ed.), 1984; Mullis et al., patente de los Estados Unidos n.º 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (Haines et al., eds.), 1984; Transcription and Translation (Hames et al., eds), 1984; Culture of Animal Cells (Freshney, ed.) Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984; Meth. Enzymol., Vol. 154 y 155 (Wu et al., eds), Academic Press, Nueva York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller et al., eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer et al., eds.), Academic Press, Londres, 1987.
\vskip1.000000\baselineskip
Conjugación a polímero de los polipéptidos de neublastina
El polímero conjugado a un polipéptido de neublastina es hidrosoluble. Preferiblemente, el polímero es adecuado para su uso en una composición farmacéutica. Ejemplos de polímeros hidrosolubles adecuados incluyen PEG, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhidruro maleico, poliaminoácidos (bien homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona) PEG, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos.
La masa molecular media por cadena de polímero se elige de acuerdo con la masa molecular total media deseada del polímero o polímeros conjugados por dímero, por ejemplo 10 a 50 kDa, 15 a 45 kDa o 20 a 40 kDa por dímero. En las preparaciones con PEG, algunas moléculas pesan más, y otras menos, que la masa molecular mencionada. Por lo tanto, la masa molecular normalmente se especifica como "masa molecular media". Se conocen en la técnica diferentes métodos de conjugación. Véase, por ejemplo, la patente europea EP 0 401384 (acoplamiento de PEG a G-CSF); Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035, 1992 ("PEGylation of GM-CSF using tresyl chloride").
Se puede realizar la PEGilación mediante cualquier reacción de PEGilación que resulte adecuada. En la técnica se conocen varias químicas de PEGilación. Véase, por ejemplo, "Focus on Growth Factors", 3(2): 4-10, 1992; patente europea EP 0 154 316; patente europea EP 0 401 384; y las otras publicaciones citadas en la presente memoria que se refieren a la PEGilación. Se puede realizar la PEGilación a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (u otro polímero hidrosoluble reactivo adecuado).
La PEGilación mediante acilación generalmente implica hacer reaccionar un derivado éster activo del PEG. Se puede utilizar cualquier molécula de PEG reactiva conocida o descubierta posteriormente para realizar la PEGilación. Un éster de PEG activado preferente es el PEG esterificado a N-hidroxisuccinimida (NHS). Tal y como se utiliza en la presente memoria, la "acilación" incluye sin limitación los siguientes tipos de enlaces entre la proteína terapéutica y un polímero hidrosoluble tal como PEG: amida, carbamato, uretano y similares. Véase, Bioconjugate Chem. 5: 133-140; 1994. Se pueden seleccionar las condiciones de reacción de cualquiera de las conocidas en la técnica de PEGilación o las desarrolladas posteriormente, pero se deben evitar las condiciones tales de temperatura, disolvente y pH que inactiven la proteína neublastina o el polipéptido a modificar.
Por lo general, la PEGilación por acilación da lugar a un polipéptido poli-PEGilado. Sin embargo, en el caso de la neublastina, no existen restos de lisina. Por lo tanto, se puede emplear la PEGilación por acilación para obtener un polipéptido que esté PEGilado exclusivamente en el extremo amino. Se pueden separar los polipéptidos PEGilados y los polipéptidos que no reaccionaron de la mezcla de reacción mediante técnicas convencionales, por ejemplo, diálisis, precipitación con sales, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por filtración en gel y electroforesis.
La PEGilación por alquilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado aldehído terminal del PEG con un polipéptido de neublastina o un dímero en presencia de un reductor. Por lo general, la PEGilación por alquilación puede dar lugar a polipéptidos poli-PEGilados, y se pueden manipular las condiciones de reacción para favorecer la PEGilación en el extremo amino. Sin embargo, dado que la neublastina no contiene restos de lisina, no resulta necesario realizar tal manipulación. Los grupos PEG se unen preferiblemente a la proteína a través de un grupo -CH_{2}-NH-, es decir, a través de un enlace "alquilo".
Las moléculas de polímeros utilizadas en los métodos de acilación y de alquilación se pueden seleccionar entre polímeros hidrosolubles tal y como se describió anteriormente. Se debe modificar el polímero seleccionado para que tenga un solo grupo reactivo, tal como un éster activo para la acilación o un aldehído para la alquilación, preferiblemente, de tal forma que se pueda controlar el grado de polimerización tal y como se da a conocer en los métodos presentes. Un aldehído de PEG reactivo ejemplar es el propionaldehído de PEG que es estable en agua, o derivados monoalcoxi(C_{1}-C_{10}) o ariloxi de los mismos (véase la patente de los Estados Unidos n.º 5.252.714). El polímero puede estar ramificado o sin ramificar. Para las reacciones de acilación, el polímero o polímeros seleccionados deben tener un solo grupo éster reactivo. Para la presente alquilación reductora, el polímero o polímeros seleccionados deben tener un solo grupo aldehído reactivo. Para los propósitos de la descripción, el PEG puede ser una cualquiera de las formas de PEG conocidas en la técnica para la obtención de otras proteínas, que incluyen el monoalcoxi(C_{1}-C_{10})-PEG y ariloxi-PEG.
\vskip1.000000\baselineskip
Formulaciones
Las composiciones que contienen dímeros de la descripción pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados. Por ejemplo, pueden contener excipientes y/o auxiliares que faciliten el procesamiento de los dímeros en preparaciones diseñadas para la administración en el sitio de acción. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo, sales hidrosolubles. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas inyectables adecuadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, por ejemplo, carmelosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. También se pueden utilizar liposomas para encapsular las moléculas de la invención para la administración en células o espacios intersticiales. Vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares son disolventes fisiológicamente compatibles, medios de dispersión, recubrimientos, antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, agua, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares. En algunos casos, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. En algunos casos, las composiciones incluyen sustancias farmacéuticamente aceptables tales como humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones.
Las composiciones de la descripción pueden estar de diversas formas, incluidas, por ejemplo, líquidos (por ejemplo, disoluciones inyectables y disoluciones infundibles), dispersiones, suspensiones, y formas de dosificación semisólidas y sólidas. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.
Se puede formular la composición como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para contener una elevada concentración del fármaco. Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles al incorporar el ingrediente activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con un ingrediente de los enumerados anteriormente, o una combinación de ellos, según se necesite, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan por la incorporación del ingrediente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de la preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional desde una disolución estéril previamente filtrada. Se puede mantener la fluidez adecuada de una disolución, por ejemplo, mediante un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y mediante tensioactivo. Se puede conseguir la absorción lenta de las composiciones inyectables al incluir en la composición un agente que retrase la absorción. Ejemplos de tales agentes son las sales de monoestearato y la gelatina.
Se puede formular el ingrediente activo con una formulación o dispositivo de liberación controlada. Ejemplos de tales formulaciones y dispositivos incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles y biodegradables, por ejemplo, etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. En la técnica se conocen métodos para preparar tales formulaciones y dispositivos. Véase, por ejemplo, "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Se pueden fabricar formulaciones inyectables de liberación lenta mediante la formación de matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables, tales como poliláctido-poliglicólido. Según la proporción de fármaco por polímero, y la naturaleza del polímero empleado, se puede controlar la tasa de liberación del fármaco. Otros polímeros biodegradables ejemplares son poliortoésteres y polianhídridos. También se pueden preparar formulaciones inyectables de liberación lenta atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones.
En la formulación se pueden incorporar compuestos activos complementarios. Por ejemplo, un dímero de acuerdo con la descripción se puede coadministrar con un analgésico.
Se pueden ajustar las posologías de dosificación para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis tal y como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitarias por la facilidad de administración y por la uniformidad de la dosificación. Véase, de forma general, "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980).
Además de un dímero de la descripción, una forma de dosificación líquida puede contener ingredientes inertes tales como agua, etanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán.
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos de tratamiento
La presente descripción, incluida la invención, es útil para el tratamiento de neuronas sensitivas, células ganglionares retinianas, neuronas en los ganglios de las raíz posterior y neuronas en cualquiera de los tejidos siguientes: el geniculado, ganglios petroso y neumogástrico; el complejo vestibuloacústico del nervio auditivo; el polo ventrolateral del lóbulo maxilomandibular del ganglio de Gasser; y el núcleo mesencefálico del trigémino.
Se pueden utilizar composiciones y métodos de la descripción para tratar neuronas sensitivas, neuronas autónomas o ambas. Se pueden tratar las neuronas nocirreceptoras y mecanorreceptoras, por ejemplo, neuronas de la fibra A\delta, de la fibra C y de la fibra A\beta. Además, se pueden tratar las neuronas simpáticas y parasimpáticas del sistema neurovegetativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Dolor neuropático
Cuando se utilizan en el tratamiento del dolor neuropático, se puede administrar un dímero de la descripción en monoterapia o en politerapia con un analgésico. Ejemplos de analgésicos incluyen un opiáceo, un antiarrítmico, un analgésico tópico, un anestésico local, un anticonvulsivo, un antidepresivo, un corticoesteroide o un antiinflamatorio no esteroideo (AINE). Los analgésicos preferidos son gabapentina (ácido (1-aminometil)ciclohexanoacético); y pregabalina (ácido S-(+)-4-amino-3-(2-metilpropil)butanoico).
Los dímeros de la descripción se pueden utilizar en el tratamiento del dolor asociado a neuropatías periféricas. Las neuropatías periféricas que se pueden tratar de acuerdo con esta descripción incluyen neuropatías inducidas por un traumatismo, lesión física del cerebro, lesión física de la médula espinal y accidente cerebrovascular.
La descripción también proporciona tratamientos de neuropatías inducidas por la quimioterapia, neuropatías inducidas por otros fármacos, neuropatías inducidas por patógenos, neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por deficiencia de vitaminas; neuropatías idiopáticas; y neuropatías diabéticas. La descripción, incluida la invención, también se puede utilizar para el tratamiento de mononeuropatías, neuropatías monomultiplex y polineuropatías, incluidas las neuropatías axónica y desmielinizante.
Ejemplos de neuropatías inducidas por la quimioterapia incluyen neuropatías causadas por la exposición a quimioterápicos tales como taxol, docetaxel, cisplatino, nocodazol, vincristina, vindesina o vinblastina. Ejemplos de neuropatías inducidas por otros fármacos incluyen neuropatías causadas por ddI, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol e isoniazida. Ejemplos de neuropatías inducidas por toxinas incluyen las neuropatías inducidas por el alcoholismo, intoxicación por vitamina B6, intoxicación por hexacarburos, amiodarona, cloranfenicol, disulfiram, isoniazida, oro, litio, metronidazol, misonidazol y nitrofurantoína. Ejemplos de neuropatías inducidas por el virus incluyen las neuropatías causadas por un herpes zóster (que puede conducir a una neuralgia posherpética), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y virus del papiloma humano (PVH). Ejemplos de neuropatías inducidas por deficiencias de vitaminas son las causadas por la deficiencia de la vitamina B12, deficiencia de la vitamina B6 y deficiencia de la vitamina E. Otros tipos de neuropatías que se pueden tratar de acuerdo con la descripción incluyen daño en un nervio debido a la inflamación, neurodegeneración, neuropatía hereditaria, por ejemplo, ataxia de Friedreich, polineuropatía amiloide familiar, enfermedad de Tangier y enfermedad de Fabry, trastornos metabólicos, por ejemplo insuficiencia renal e hipotiroidismo, neuropatías infecciosas y víricas, por ejemplo dolor neuropático asociado a la lepra, y borreliosis de Lyme. Las neuropatías autoinmunitarias incluyen el síndrome de Guillain-Barré, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, gammopatía monoclonal de significación indeterminada y polineuropatía, neuralgia del trigémino y síndromes de compresión neural, por ejemplo síndrome del túnel carpiano y otros síndromes de dolor neuropático que incluyen neuralgia postraumática, dolor causado por el síndrome del miembro imaginario, dolor debido a esclerosis múltiple, síndromes de dolor regional complejo, por ejemplo algodistrofia, causalgia, dolor asociado a neoplasia, neuropatía vasculítica/angiopática, y ciática.
\vskip1.000000\baselineskip
Alodinia táctil
La alodinia táctil es una afección en la que el dolor está provocado por una estimulación de la piel (por ejemplo, palpación) que normalmente es inocua. La alodinia táctil se puede tratar administrando al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de un dímero de la descripción. Se puede administrar el dímero en monoterapia o politerapia con una cantidad eficaz de un analgésico.
Se puede coadministrar un dímero de la descripción junto a un fármaco tal como un fármaco antineoplásico o un antivírico. Ejemplos de fármacos antineoplásicos incluyen taxol, docetaxel, cisplatino, nocodazol, vincristina, vindesina y vinblastina. Ejemplos de antivíricos incluyen ddI, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol e isoniazida.
\vskip1.000000\baselineskip
Reducción de la pérdida de sensibilidad al dolor
Se pueden utilizar las composiciones de la descripción para reducir la pérdida de sensibilidad al dolor, por ejemplo pérdida de sensibilidad al dolor por temperatura, en un paciente con una neuropatía diabética. El tratamiento puede ser preventivo o terapéutico.
En un tratamiento preventivo, se administra un dímero de la descripción a un paciente que corre el riesgo de sufrir pérdida de sensibilidad al dolor, por ejemplo un paciente con una neuropatía en las etapas iniciales.
En el tratamiento terapéutico, se administra un dímero de la descripción a un paciente que ha experimentado una pérdida de sensibilidad al dolor como resultado de una neuropatía, por ejemplo, una neuropatía en etapas tardías.
\vskip1.000000\baselineskip
Neuropatías asociadas a virus
Se pueden utilizar las composiciones y los métodos de la descripción para el tratamiento preventivo de las neuropatías asociadas a una infección vírica o bacteriana. El tratamiento preventivo está indicado después de determinar la infección y antes del comienzo del dolor neuropático. Durante el tratamiento se administra un dímero de la descripción para prevenir la aparición de dolor neuropático, tal como un dolor neuropático asociado con la lepra, la borreliosis de Lyme o el dolor neuropático causado por un virus. Los virus que pueden causar dolor neuropático incluyen el virus del herpes zóster (que puede conducir a una neuralgia posherpética); el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); y el virus del papiloma humano (VPH).
Los síntomas de la infección vírica aguda a menudo incluyen la apariencia de una erupción. Otros síntomas incluyen, por ejemplo, dolor persistente en la zona afectada del cuerpo. Es una complicación habitual de una infección por el herpes zóster (culebrina). La neuralgia posherpética puede durar un mes o más, y puede aparecer varios meses después de que hayan desaparecido los síntomas similares a una erupción.
La descripción también da a conocer un tratamiento terapéutico del dolor neuropático asociado a una infección vírica o bacteriana. En el tratamiento terapéutico se administra un dímero de la descripción a un paciente que sufre dolor neuropático asociado a una infección.
\vskip1.000000\baselineskip
Neuropatía diabética dolorosa
Las composiciones y los métodos de la descripción se pueden utilizar para el tratamiento preventivo de la neuropatía diabética dolorosa. El tratamiento preventivo de las neuropatías diabéticas comenzaría después del diagnóstico inicial de la diabetes o de los síntomas asociados a la diabetes y antes del comienzo del dolor neuropático. El tratamiento preventivo de la neuropatía diabética dolorosa también puede comenzar al determinar que un sujeto corre el riesgo de padecer diabetes o los síntomas asociados a la diabetes. Se administra un dímero de la descripción para prevenir la aparición del dolor neuropático y/o para reducir la gravedad del dolor neuropático que ya ha aparecido.
La descripción también da a conocer un tratamiento terapéutico del dolor neuropático asociado a la diabetes. En el tratamiento terapéutico se administra un dímero de la descripción a un paciente que padece dolor neuropático asociado a la diabetes.
\vskip1.000000\baselineskip
Dosificación y vía de administración
Preferiblemente, se administra una formulación que comprende un dímero de la descripción a una dosis de 0,1 \mug/kg a 1000 \mug/kg de masa corporal del sujeto, por dosis. Preferiblemente, la dosis es de 1 \mug/kg a 100 \mug/kg de masa corporal del sujeto, por dosis. Más preferiblemente, la dosis es de 1 \mug/kg a 30 \mug/kg de masa corporal del sujeto, por dosis, por ejemplo, de 3 \mug/kg a 10 \mug/kg de masa corporal del sujeto, por dosis. Se pueden administrar cantidades terapéuticamente eficaces de la formulación de la descripción a un sujeto que lo necesite en una posología de dosificación determinable por el experto en la técnica, sin requerir experimentación.
La administración de un dímero de la descripción puede ser sistémica o local. Se puede administrar mediante algún sistema de administración adecuado, por ejemplo, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intrapulmonar, administración subcutánea y administración intraperitoneal, lo más preferiblemente a través de la administración intramuscular, la administración intravenosa o la administración subcutánea. También se puede administrar el dímero por vía intratecal.
La descripción y la invención se ilustran adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
Ejemplo 1
Expresión en células de mamífero
La neublastina humana madura (hNBN) se expresa de forma natural como una preproproteína. Este polipéptido contiene una secuencia de péptido señal para dirigir la proteína hacia la vía secretora, un prodominio que se escinde y se descarta durante la maduración, y una proteína madura. La proteína madura de 113 aminoácidos contiene una único sitio de glucosilación y siete restos de cisteína. Los siete restos de cisteína están implicados en tres puentes disulfuro intramoleculares más un único puente disulfuro intermolecular para formar un homodímero glucosilado y unido por un puente disulfuro.
Construcción del plásmido pJC070.14. Para expresar el ADNc de la neublastina humana en las células de ovario de hámster chino (CHO), se introdujo un fragmento de ADNc que codifica la forma prepro de la neublastina humana en el vector de expresión de mamíferos pEAG347 para generar el plásmido pJC070.14. El plásmido pEAG347 contenía en tándem el promotor temprano del SV40 y el promotor tardío principal del adenovirus (obtenidos del plásmido pAD2beta; Norton et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 281), un único sitio de clonación NotI seguido del terminador de la transcripción tardía de SV40 y señales de poliadenilación (obtenidas del plásmido pCMVbeta; MacGregor et al., 1989, Nucl. Acids. Res. 17: 2365). Además, el pEAG347 contenía un esqueleto plasmídico derivado de pUC19 y un gen dhfr obtenido de pSV2dhfr para la selección con MTX y la amplificación en células CHO
transfectadas.
Se generó el plásmido pJC070.14 en dos etapas. Primero, se aisló un fragmento que codifica la forma prepro de la neublastina humana del plásmido pUbilZ-NBN mediante la reacción en cadena de la polimerasa con los oligonucleótidos KD2-824 5' 100 3' (SEQ ID n.º: 22), KD2-825 5' 101 3' (SEQ ID n.º 23) y la polimerasa PFU. Se clonó el fragmento en el sitio SrfI del pPCR-Script Amp SK(+) para generar el plásmido pJC069. En la segunda etapa se realizó una digestión parcial con NotI del plásmido pJC069 para generar un fragmento de 685 pb (que contiene el gen de la neublastina) que se clonó en el sitio NotI del plásmido pEAG347 para generar el plásmido pJC070.14. Se controló la transcripción del gen de la neublastina en el plásmido pJC070.14 mediante el promotor tardío principal del adenovirus.
Estirpes celulares CHO que expresan la neublastina humana. Primero, se linealizaron 200 \mug de pJC070.14 mediante la digestión con MluI. A continuación se añadieron 200 \mug de ADN de esperma de salmón fragmentado por ultrasonidos. Se extrajo el ADN con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se precipitó con etanol. Se resuspendió el ADN linealizado en Hepes a 20 mM, pH 7,05, NaCl a 137 mM, KCl a 5 mM, Na_{2}HPO_{4} a 0,7 mM, dextrosa a 6 mM (HEBS) y se introdujo en células \sim4E7 CHO dukx B1(dhfr-) (p23) mediante electroporación (280 V y 960 \muF). Después de la electroporación se devolvieron las células al cultivo en medio de Eagle modificado (MEM) \alpha+ complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% durante dos días. Las células se trataron después con tripsina y se volvieron a sembrar en placas de 100 mm (100.000 células/placa) en \alpha-MEM (que carece de ribo- y desoxirribonucleósidos), complementado con FBS dializado al 10%, durante cinco días. Posteriormente, las células se dividieron a una densidad de 100.000 células/placa de 100 mm, y se seleccionaron en metotrexato a 200 nM. Se seleccionaron las colonias resistentes y se escalaron en placas de 6 pocillos; los medios condicionados de cada clon se cribaron con un ensayo específico para la neublastina que se describe a continuación.
Los doce clones que expresaban el mayor nivel de neublastina se escalaron a matraces T162 y posteriormente se volvieron a ensayar. Estas estirpes celulares CHO producían neublastina en el margen de 25 a 50 ng/(ml día). Las cuatro estirpes celulares que expresaban mejor la neublastina se amplificaron en metotrexato a 1200 nM y se adaptaron a un cultivo de suspensión en matraces en agitación. Los clones resultantes produjeron aproximadamente 2 \mug/ml en un cultivo en agitación de alta densidad.
Análisis del complejo ternario para la neublastina. Se evaluó la presencia de la neublastina en el medio de los sobrenadantes de las estirpes celulares CHO mediante una forma modificada de un ensayo de complejo ternario. El análisis fue descrito principalmente por Sanicola et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6238.
Expresión de NBN104 en las células CHO. Se expresó una forma de 104 aminoácidos de la hNBN madura en células de ovario de hámster chino (CHO) mediante el procedimiento siguiente. Se creó un gen hNBN sintético utilizando los codones que se utilizan con más frecuencia en la traducción de las proteínas de las células CHO. Se introdujo un único sitio de corte para una endonucleasa de restricción. Los codones para el péptido señal de la albúmina de rata (rAlb), es decir, 102 (SEQ ID n.º 24), y la secuencia de la hormona de crecimiento humana (hGH), es decir, 103 (SEQ ID n.º 25) se fusionaron independientemente a la hNBN para crear genes de fusión (el péptido señal está en un tipo normal y la secuencia de la NBN está en cursiva; el péptido señal de la hGH incluye un intrón). Cada gen de fusión se colocó bajo el control transcripcional de un promotor constitutivo y se transfectó en células CHO. Se aislaron transformantes estables.
Se analizó la expresión de la hNBN secretada por las estirpes celulares. Los datos del análisis SDS-PAGE reductora/inmunotransferencia demostraron la presencia de una banda de proteína que correspondía a la hNBN secretada en el medio. Un análisis adicional del medio condicionado mostró la presencia de un componente valorable tanto en un ensayo directo con anticuerpos como en un ensayo funcional indirecto con células.
La conclusión es que la hNBN funcional se puede expresar en las células CHO en ausencia de un prodominio y con secuencias de péptidos señal heterólogos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Expresión de la neublastina de rata en células CHO
Construcción del plásmido pCWEX017.1. Se generó un gen para la neublastina de rata ligando dos
fragmentos que codifican en conjunto la neublastina de rata. El plásmido pJC102 consistió en un fragmento
de ADN que codificaba los primeros 156 aminoácidos de la forma prepro de rata de la neublastina introducido en
el sitio de clonación TOPO del pCRII-TOPO r (Invitrogen). Se amplificó el fragmento a partir del ADNc
de hígado de rata con Marathon-Ready t (Clontech) mediante la reacción en cadena de la polimerasa con los
oligonucleótidos AP2 5' 104 3' (SEQ ID n.º 26) y KD3-171
5' 105 3' (SEQ ID n.º 27). Un fragmento que contiene el preprodominio y los primeros 29 aminoácidos de la forma madura de 113 aminoácidos de la neublastina se amplificó primero mediante la reacción en cadena de la polimerasa del plásmido pJC102 con los oligonucleótidos KD3-214 5' 106 3' (SEQ ID n.º 28) y KD3-247 5' 107 3' (SEQ ID
n.º 29). Se amplificó un segundo fragmento que codifica los aminoácidos 30 a 113 de la forma madura
de 113 aminoácidos de la neublastina a partir del pCWEX015 con los oligonucleótidos KD3-246 5'
108 3' (SEQ ID n.º 30) y KD3-219 5' 109 3' (SEQ ID n.º 31). Se generó el plásmido pCWEX015 introduciendo un fragmento BamHI-XhoI desde un singén en los sitios complementarios del plásmido de expresión pMJB134. Se mezclaron los fragmentos de ADN resultantes a una proporción 1:1 y se sometieron a una segunda reacción en cadena de la polimerasa con los oligonucleótidos KD3-214 y KD3-219 para generar la forma prepro de longitud completa de la neublastina de rata. Se clonó el fragmento de ADN resultante en el sitio de clonación TOPO del plásmido pCRII blunt-topo para generar el pCWEX016. Se aisló y se clonó un fragmento NotI que contiene la preproneublastina completa en el sitio NotI del pEAG347 para fabricar el pCWEX017.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia del gen sintético de neublastina de rata
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Estirpes celulares CHO que expresan la neublastina de rata. Se linealizaron 200 \mug del plásmido CWEX017.1 mediante digestión con la endonucleasa de restricción MluI. Después de la digestión se añadieron 200 \mug de ADN de esperma de salmón fragmentado por ultrasonidos y se extrajo la mezcla con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se precipitó con etanol. Se resuspendió el ADN linealizado en Hepes a 20 mM, pH 7,05, NaCl a 137 mM, KCl a 5 mM, Na_{2}HPO_{4} a 0,7 mM, dextrosa a 6 mM (HEBS) y se introdujo en células \sim4E7 CHO DG44 (dhfr-) (p8) por electroporación (280V y 960 \muF). Después de la electroporación se devolvieron las células al cultivo en medio de Eagle modificado (MEM) \alpha+ complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% durante dos días. A continuación se trataron las células con tripsina y se volvieron a sembrar en placas de 100 mm (100.000 células/placa) en \alpha-MEM (que carece de ribo- y desoxirribonucleósidos), complementado con FBS dializado al 10%. Después de seis días en cultivo, se reemplazó el medio y se seleccionaron las células en metotrexato a 200 nM. Se seleccionaron las colonias resistentes y se amplificaron a placas de 6 pocillos; el medio condicionado de cada clon se cribó mediante el ensayo de complejo ternario para la neublastina citado anteriormente. Los cinco clones que expresaban la mayor cantidad de neublastina se amplificaron en matraces T162 y posteriormente se volvieron a ensayar. Estas estirpes celulares CHO produjeron neublastina en el intervalo de 500 ng/(ml día). Posteriormente, las estirpes que expresaban la mayor cantidad se adaptaron al cultivo en suspensión y expresaron la neublastina a aproximadamente 2 \mug/ml en el cultivo en agitación de alta densidad.
Neublastina de rata obtenida de CHO y PEGilada. Se hicieron crecer 100 litros de células CHO que expresaban la NBN de rata (clon 33s) durante 10 días a 37ºC en medio BMC16 que contenía metotrexato a 200 nM. Se filtró el cultivo y concentró 10 veces. Se añadió Hepes, pH 7,5, a una concentración final de 10 nM y se cargó el medio durante una noche a 4ºC en una columna de SP-Sepharose de 120 ml (Pharmacia). Se lavó la columna con Hepes a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 100 mM, y la proteína unida se eluyó de la columna con un gradiente de NaCl (0,1 a 1 M) en Hepes a 10 mM, pH 7,5. Se analizaron las muestras por la absorbencia a 280 nm, por la proteína total mediante SDS-PAGE y por la NBN funcional mediante ELISA del complejo ternario RetL3. Se encontró actividad de NBN en la cola del pico de proteínas. Se reunieron las fracciones que contenía un pico de NBN de la columna de SP, se diluyeron 5 veces con Hepes a 10 nM pH 7,5, se cargaron en una columna de Sepharose heparina de 22 ml (Pharmacia). Se lavó la columna con 110 ml de Hepes a 10 mM, pH 7,5, 500 mM y se eluyó la NBN con Hepes a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 1 M. Se identificaron las fracciones que contenían la NBN mediante SDS-PAGE y se agruparon. Se diluyó la fracción agrupada con Hepes a 10 mM, pH 7,5, a una concentración salina final de 150 mM. Se cargó la proteína en una columna de SP-Sepharose de 20 ml y se eluyó de nuevo con un gradiente de NaCl. Se identificaron las fracciones que contenían la NBN mediante SDS-PAGE, se agruparon, se filtraron y se almacenaron a -70ºC. Se estimó el contenido de proteínas por absorbencia a 280 nm con un coeficiente de extinción de 0,5 para una disolución de 1 mg/ml. La NBN purificada de CHO migraba como una única banda ancha en SDS-PAGE en condiciones no reductoras con una masa aparente de 36 kDa, y en condiciones reductoras migró como una banda con una masa aparente de 18 kDa. El análisis de la secuencia del extremo amino reveló que el extremo amino del producto era heterogéneo debido a la escisión en sitios alternativos, lo que produce aductos des 1-4, des 1-7 y des 1-9.
Para retirar la heterogeneidad del extremo amino de la NBN purificada, se trató la proteína durante 2 horas a 37ºC a pH 8,5 con una proporción de tripsina por NBN de 1:100 (p/p) y se purificó en una columna de filtración en gel Superdex 75 en Hepes a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 300 mM. Se identificaron las fracciones que contenían un pico de NBN mediante SDS-PAGE, se agruparon (0,9 mg/ml final), se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mum, se distribuyeron en alícuotas y se guardaron a -70ºC para estudios posteriores. La secuenciación del extremo amino de la NBN después del tratamiento con tripsina reveló que la proteína se había convertido a una forma de 104 aminoácidos des 1-9, y comenzaba con la secuencia ATDARGC. Los datos de espectroscopia de masas para el producto reducido y desglucosilado reveló una masa de 11.104 Da, que concordaba exactamente con la masa predicha para la forma de NBN des 1-9.
La NBN des 1-9 purificada se descongeló a temperatura ambiente. Se añadió Hepes, pH 7,5, a 50 mM de una solución madre a 1 M y se añadió 20K NHS-SPA PEG (Shearwarter Polymers, Inc) a una concentración final de 8 mg de PEG/ml. La concentración final de la NBN en la reacción fue 0,7 mg/ml. Se incubó la muestra a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se dializó durante una noche a 4ºC frente a 50 volúmenes de Hepes a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 100 mM. Se purificó la forma diPEGilada de otros productos de reacción y del PEG libre mediante cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose a temperatura ambiente a una concentración de carga de 3 mg de NBN/ml de resina. Se lavó la columna con 4 fracciones de la mitad del volumen de la columna de Hepes a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 150 mM, y luego se eluyó el producto diPEGilado con 4 fracciones de la mitad del volumen de la columna de Hepes a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 200 mM. A continuación se eluyó la NBN PEGilada con Hepes a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 350 mM y la NBN que no reaccionó con Hepes a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 800 mM. Se evaluaron las fracciones que contenían la NBN mediante SDS-PAGE y se agruparon las fracciones que contenían >90% del producto diPEGilado, se dializaron durante una noche frente a PBS, y se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mum. Se midió la concentración de endotoxina y se determinó que estaba por debajo de 1 EU/mg. Se comprobó que el material funcionara en el KIRA ELISA y el ensayo de supervivencia neuronal, y se determinó que era completamente activa. El material final se distribuyó en alícuotas y se almacenó a -70ºC para análisis posteriores. En los primeros estudios, también se recogió el producto monoPEGilado para el análisis in vivo. Sin embargo, debido a las mejores propiedades del material diPEGilado, este se seleccionó de ahí en adelante Para aumentar el rendimiento del material diPEGilado, tratamos la NBN monoPEGilada además con PEG nuevo y, de nuevo, se purificó el producto diPEGilado a partir de la mezcla de reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Farmacocinética de la neublastina PEGilada y glucosilada
Se examinaron las propiedades farmacocinéticas de la neublastina PEGilada y glucosilada en rata y ratón. La PEGilación del extremo amino de la neublastina de rata truncada y glucosilada (truncamiento en el extremo amino de 9 aminoácidos; NBN104) con dos restos de PEG de 20.000 Da (2 X 20 kDa PEG NBN104) produjo una mejora significativa en la semivida y la biodisponibilidad de la neublastina. Después de una administración subcutánea de 1,5 mg/kg a ratones CD, se detectaron 97 ng/ml de neublastina glucosilada y PEGilada en el suero a las 24 horas. En cambio, después de una administración subcutánea de 1,5 mg/kg de NBN sin glucosilar PEGilada con dos PEG de 20.000 Da (2 X 20 kDa PEG) a ratones, la concentración de neublastina en el suero fue de 39 ng/ml a las 24 horas. La neublastina no era detectable a las 24 horas después de la administración subcutánea de 1,5 mg/kg de la NBN104 sin glucosilar y sin modificar a los ratones, lo que indicaba que la concentración de neublastina en el suero estaba por debajo de 5 ng/ml. Sorprendentemente, la concentración en el suero alcanzada con la neublastina glucosilada y PEGilada era aproximadamente 2,5 veces mayor que la concentración sérica alcanzada con la neublastina sin glucosilar y PEGilada.
En los estudios con ratas también se observó un aumento de la concentración sérica de la neublastina glucosilada y PEGilada en el extremo amino. Después de la administración s.c. de 1 mg/kg de 2 X 20 kDa PEG NBN104 a ratas Sprague-Dawley, se detectaron concentraciones máximas séricas de 50 ng/ml de la neublastina PEGilada a las 48 horas. Después de la administración subcutánea de 1 mg/kg de neublastina sin PEGilar, la concentración sérica a las 48 h estuvo por debajo de 2 ng/ml. Estos datos indicaban que la PEGilación en el extremo amino de la neublastina glucosilada (2 X 20 kDa PEG NBN104) daba lugar a una concentración máxima sérica de neublastina que era 19 veces mayor que la concentración máxima sérica alcanzada después de administrar neublastina glucosilada sin PEGilar. Estos datos demostraban que la combinación de la PEGilación en el extremo amino y la glucosilación en el aminoácido 95 producía una mejora sustancial de las propiedades farmacocinéticas y de la biodisponibilidad de la neublastina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Neublastina glucosilada y PEGilada en el modelo animal de dolor neuropático
Se estudió el efecto de reversión que tenía la neublastina glucosilada y PEGilada sobre la alodinia táctil y la hiperalgesia térmica en el modelo de ligadura L5/L6 del nervio raquídeo ("LNR") de Chung. Se dividieron las ratas macho Sprague-Dawley (200 a 250 g) en tres grupos. A todas las ratas se les realizó la ligadura del nervio raquídeo. A un grupo de ratas (n = 6) se les administró el vehículo mediante inyección subcutánea. A un segundo y tercer grupo de ratas (n = 6 por grupo) se les administró 3 y 30 \mug/kg de neublastina glucosilada y PEGilada, (2 X 20 kDa PEG NBN104) mediante inyección subcutánea, en las que la proteína se obtuvo de CHO y estaba truncada (truncamiento en el extremo amino de 9 aminoácidos; NBN104) y estaba PEGilada en cada extremo amino con PEG de 20.000 Da. Ya que la neublastina existe como dímero, cada dímero contiene dos PEG de 20.000 Da. El vehículo consistía en fosfato a 5 mM y cloruro de sodio a 150 mM a pH 6,5. Se administraron inyecciones subcutáneas los días 3, 5, 7, 10, 12 y 14 después de la intervención quirúrgica (posterior a LNR). Se utilizaron pruebas de conducta de Von Frey y Hargreaves (Chaplan et al., 1994, J. Neurosci. Meth. 53: 55-63; Hargreaves et al., 1988, Pain 32: 77-88) para monitorizar las respuestas al tacto y a la temperatura, respectivamente. Se monitorizaron estas respuestas del dolor antes de la ligadura del nervio raquídeo para establecer las respuestas basales y, luego, antes de la administración del fármaco en el día 3 tras la LNR y aproximadamente 1 hora después de la administración del fármaco los días 5, 7, 10, 12 y 14 después de la LNR. Para evaluar la importancia estadística del tratamiento farmacológico respecto al tratamiento con vehículo, se llevó a cabo un análisis de la varianza bifactorial de medidas repetidas (ANOVA MR bifactorial) seguido de una prueba de Student-Newman-Keuls (SNK) post hoc.
Los resultados se resumen en las figuras 1 y 2 (como medias \pm errores estándares de la media). Ambos tipos de comportamiento del dolor neuropático (alodinia táctil mostrada en la figura 1, e hiperalgesia a la temperatura mostrada en la figura 2) estaban completamente desarrolladas el día 3, tal y como se esperaba. La administración subcutánea de 3 ó 30 \mug/kg de 2 X 20 kDa PEG NBN104 (señalada mediante las flechas hacia abajo en las figuras 1 y 2) condujo a una reversión considerable y estadísticamente significativa de ambos tipos de dolor neuropático en las ratas con ligadura del nervio raquídeo. En las ratas con ligadura del nervio raquídeo, el efecto de la 2 X 20 kDa PEG NBN104 sobre la sensibilidad a la temperatura y la alodinia táctil se volvieron primero estadísticamente significativas en los días 4 y 7, respectivamente, después del inicio de la administración de neublastina glucosilada y PEGilada. El efecto de la 2 X 20 kDa PEG NBN104 sobre la sensibilidad a la temperatura y la alodinia táctil alcanzó un máximo estable a los aproximadamente 7 días del inicio de la administración de neublastina glucosilada y PEGilada. Los efectos de la 2 X 20 kDa PEG NBN104 no disminuyeron durante el intervalo de 2 a 3 días entre las administraciones. De hecho, se produjo una normalización sustancial de los comportamientos de dolor entre las administraciones de la neublastina glucosilada y PEGilada los días 5, 7 y 10.
Estos resultados demostraron que la 2 X 20 kDa PEG NBN104 tenía su potencia aumentada al menos 333 veces por encima de la de la neublastina no glucosilada ni PEGilada sobre los comportamientos de dolor de la alodinia táctil y la hiperalgesia a la temperatura en el modelo de la LNR.
<110> Biogen Idec MA Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NEUBLASTINA GLUCOSILADA Y CONJUGADA A UN POLÍMERO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P28237EP-D1-PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP07012662.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2004-04-16
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/463.899
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-04-18
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia consenso
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Arg
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 10, 11
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Asp
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 26, 33
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Arg o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 38, 76
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Ile
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Gin
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Arg o His
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip0,8cm
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip0,8cm
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip0,8cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actcactata gggctcgagc ggc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido para PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaccgctgc agaagcggaa acgtatc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggaaaaaa gcggccgcca tggaactggg acttggaga 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agttcgtcgg aagagtgtcc caggccgaga gcgctcaccg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggtgagcgc tctcggcctg ggacactctt ccgacgaact 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttttcctt ggcggccgct catcctagac agccacatg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo ejemplar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo ejemplar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo ejemplar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo ejemplar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
30

Claims (6)

1. Ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una neublastina humana funcional y un péptido señal heterólogo, en el que el polipéptido carece del prodominio de neublastina.
2. El ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que la neublastina humana funcional es NBN104 y el péptido señal heterólogo es el péptido señal de la albúmina de rata o el péptido señal de la hormona del crecimiento humana.
3. Célula aislada que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2.
4. La célula según la reivindicación 3, en la que la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
5. Método de expresión de una neublastina humana funcional, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 en un medio de cultivo de células en condiciones tales que la neublastina humana funcional se expresa y se secreta en el medio de cultivo de las células.
6. El método según la reivindicación 5, en el que la célula es una célula CHO.
ES07012662T 2003-04-18 2004-04-16 Neublastina conjugada con un polimero glicosilada. Expired - Lifetime ES2328640T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46389903P 2003-04-18 2003-04-18
US463899P 2003-04-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2328640T3 true ES2328640T3 (es) 2009-11-16

Family

ID=33310837

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07012662T Expired - Lifetime ES2328640T3 (es) 2003-04-18 2004-04-16 Neublastina conjugada con un polimero glicosilada.
ES04750200.0T Expired - Lifetime ES2479942T3 (es) 2003-04-18 2004-04-16 Neublastina glucosilada conjugada con polímero

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04750200.0T Expired - Lifetime ES2479942T3 (es) 2003-04-18 2004-04-16 Neublastina glucosilada conjugada con polímero

Country Status (11)

Country Link
US (2) US8163875B2 (es)
EP (3) EP2322205A1 (es)
JP (2) JP4742030B2 (es)
AT (1) ATE433759T1 (es)
AU (1) AU2004233079B2 (es)
CA (2) CA2864810A1 (es)
DE (1) DE602004021648D1 (es)
DK (1) DK1897552T3 (es)
ES (2) ES2328640T3 (es)
NZ (2) NZ543365A (es)
WO (1) WO2004094592A2 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) * 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
US20040077543A1 (en) * 2001-03-28 2004-04-22 Sah Dinah W. Y. Treatment using neublastin polypeptides
JP4571776B2 (ja) * 2002-11-05 2010-10-27 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 潤滑油組成物
ATE478891T1 (de) * 2003-01-31 2010-09-15 Biogen Idec Inc Neublastin-mutanten
CA2864810A1 (en) 2003-04-18 2004-11-04 Biogen Idec Ma, Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
ES2353457T3 (es) 2003-06-10 2011-03-02 Nsgene A/S Secreción mejorada de neublastina.
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
NZ553420A (en) 2004-08-19 2010-02-26 Biogen Idec Inc Refolding transforming growth factor beta family proteins
EP2238983B1 (en) * 2004-08-19 2014-07-23 Biogen Idec MA Inc. Neublastin variants
EP1937295A2 (en) * 2005-10-11 2008-07-02 NS Gene A/S Treatment of retinopathies using gfr 3 agonists
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
ES2450065T3 (es) * 2006-03-01 2014-03-21 Biogen Idec Ma Inc. Composiciones y métodos para la administración de proteínas de la familia de ligandos del GDNF
US8329655B2 (en) * 2007-05-01 2012-12-11 Biogen Idec Ma Inc. Methods for increasing vascularization
WO2009020964A2 (en) * 2007-08-08 2009-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-neublastin antibodies and uses thereof
EP2836518B1 (en) 2012-04-11 2019-01-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of detecting glycosaminoglycans

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4353888A (en) 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
US4407957A (en) 1981-03-13 1983-10-04 Damon Corporation Reversible microencapsulation of a core material
HU187037B (en) 1983-04-19 1985-10-28 Tibor Sinko Rope-stretching device
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
DE3829766A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Verfahren zur herstellung von membranen
DE3829752A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration
WO1990006952A1 (en) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
GB8927546D0 (en) 1989-12-06 1990-02-07 Ciba Geigy Process for the production of biologically active tgf-beta
US5084350A (en) 1990-02-16 1992-01-28 The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) Method for encapsulating biologically active material including cells
US5618531A (en) 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
EP0585368B1 (en) 1991-04-25 1997-08-06 Brown University Research Foundation Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products
JP3230056B2 (ja) 1991-07-02 2001-11-19 インヘイル・インコーポレーテッド 薬剤のエーロゾル化服用量を形成する装置
EP1243652A3 (en) 1991-09-20 2003-03-26 Amgen Inc., Glial derived neurotrophic factor
US5939524A (en) 1991-12-09 1999-08-17 The Scripps Research Institute Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use
US5414135A (en) 1991-12-30 1995-05-09 Sterling Winthrop Inc. Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins
US5785049A (en) 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
EP0679088B1 (en) 1992-09-29 2002-07-10 Inhale Therapeutic Systems Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone
US5349056A (en) 1992-10-09 1994-09-20 Regeneron Pharmaceuticals Modified ciliary neurotrophic factors
CA2092271C (en) 1993-03-09 2009-10-13 Eddie Reed Use of g-csf for treating taxol side-effects
DK0802800T3 (da) 1993-08-12 2002-10-07 Neurotech Sa Biokompatible immunoisolatoriske kapsler indeholdende genetisk ændrede celler for levering af biologisk aktive molekyler
DE4339605A1 (de) 1993-11-20 1995-05-24 Beiersdorf Ag Desodorierende Wirkstoffkombinationen auf der Basis von alpha, omega-Alkandicarbonsäuren und Fettsäurepartialglyceriden
US5834029A (en) 1994-07-20 1998-11-10 Cytotherapeutics, Inc. Nerve guidance channel containing bioartificial three-dimensional hydrogel extracellular matrix derivatized with cell adhesive peptide fragment
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5795716A (en) 1994-10-21 1998-08-18 Chee; Mark S. Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation
US5770577A (en) 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5780014A (en) 1995-04-14 1998-07-14 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin
US5654007A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Inhale Therapeutic Systems Methods and system for processing dispersible fine powders
US5739307A (en) 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
US5733729A (en) 1995-09-14 1998-03-31 Affymetrix, Inc. Computer-aided probability base calling for arrays of nucleic acid probes on chips
US5641749A (en) 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product
US6063757A (en) 1995-11-29 2000-05-16 Urso; Richard G. Wound treatment method with nerve growth factor
US6084076A (en) 1995-12-21 2000-07-04 Ajinomoto Co., Inc. Method of refolding human activin A
US6299895B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Neurotech S.A. Device and method for treating ophthalmic diseases
US6677135B1 (en) 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
US5754524A (en) 1996-08-30 1998-05-19 Wark; Barry J. Computerized method and system for analysis of an electrophoresis gel test
US6083725A (en) 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
EP0928336A1 (en) 1996-09-26 1999-07-14 Medical Research Council Chaperone fragments
KR100195886B1 (ko) 1996-11-01 1999-06-15 김상조 당뇨병 치료용 의약조성물
GB9718908D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Rowett Research Services Limit Proteins
US6653098B1 (en) 1998-02-23 2003-11-25 G. D. Searle & Co. Method of producing mouse and human endostatin
US20020055467A1 (en) * 1998-07-06 2002-05-09 Johansen Teit E. Novel neurotrophic factors
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
US7067473B1 (en) 1998-07-14 2006-06-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor
DK1640381T3 (da) 1998-07-14 2014-07-14 Janssen Pharmaceutica Nv Neurotrofisk vækstfaktor
WO2000017360A1 (en) 1998-09-22 2000-03-30 University Of Maryland, Baltimore Cystine knot growth factor mutants
US20020002269A1 (en) 1998-09-29 2002-01-03 Jeffrey D. Milbrandt Artemin, a neurotrophic factor
US6361771B1 (en) 1999-04-06 2002-03-26 Neurotech S.A. ARPE-19 as a platform cell line for encapsulated cell-based delivery
JP2003525916A (ja) 1999-04-22 2003-09-02 エイドゲントシッシュ テクニーシェ ホッシュール チューリッヒ モディファイドタンパク質マトリクス
DK1223966T3 (da) 1999-10-29 2003-08-18 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Anvendelse af GDNF til behandling af hornhindedefekter
CA2327208A1 (en) 2000-11-30 2002-05-30 The Government Of The United States Of America Methods of increasing distribution of therapeutic agents
IL140110A0 (en) * 2000-12-05 2002-02-10 Applied Research Systems Improvement of homogeneity and secretion of recombinant proteins in mammalian systems
EP1423139A2 (en) 2000-12-22 2004-06-02 Genentech, Inc. New use of artemin, a member of the gdnf ligand family
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
EA009771B1 (ru) 2001-02-01 2008-04-28 Байоджен Айдек Ма, Инк. Полипептид нейбластина, способы его получения и применения
US7276580B2 (en) 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
JP4499362B2 (ja) 2001-03-28 2010-07-07 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド ニューロパシーの疼痛を処置するためのニューブラスチンポリペプチドの使用
US20040077543A1 (en) 2001-03-28 2004-04-22 Sah Dinah W. Y. Treatment using neublastin polypeptides
WO2002092107A1 (en) 2001-04-24 2002-11-21 Purdue Research Foundation Method and compositions for treating mammalian nerve tissue injuries
US7164007B2 (en) 2001-06-20 2007-01-16 Genentech, Inc. Anti-PR020044 antibodies
US20040028613A1 (en) 2001-06-25 2004-02-12 Nastech Pharmaceutical Company Inc Dopamine agonist formulations for enhanced central nervous system delivery
US7129085B2 (en) 2001-10-11 2006-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding a human leucine-rich repeat domain containing protein, HLLRCR-1
GB0205022D0 (en) 2002-03-04 2002-04-17 Univ Cambridge Tech Materials and methods for the treatment of cns damage
JP4310608B2 (ja) 2002-04-25 2009-08-12 東洋紡績株式会社 Ｈｓｐ７０ファミリータンパク質基質結合ドメインフラグメントの利用方法
CA2864810A1 (en) 2003-04-18 2004-11-04 Biogen Idec Ma, Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
ES2353457T3 (es) 2003-06-10 2011-03-02 Nsgene A/S Secreción mejorada de neublastina.
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
US20050180957A1 (en) 2004-01-16 2005-08-18 Scharp David W. Method of using fibrin-bound angiogenic factors to stimulate vascularization of transplant site of encapsulated cells
EP1784486B1 (en) 2004-06-23 2011-10-05 TissueGene, Inc. Nerve regeneration
US7598356B2 (en) 2004-07-08 2009-10-06 Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily
NZ553420A (en) 2004-08-19 2010-02-26 Biogen Idec Inc Refolding transforming growth factor beta family proteins
EP2238983B1 (en) 2004-08-19 2014-07-23 Biogen Idec MA Inc. Neublastin variants
EP1937295A2 (en) 2005-10-11 2008-07-02 NS Gene A/S Treatment of retinopathies using gfr 3 agonists
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
ES2450065T3 (es) 2006-03-01 2014-03-21 Biogen Idec Ma Inc. Composiciones y métodos para la administración de proteínas de la familia de ligandos del GDNF
US7922999B2 (en) 2006-04-25 2011-04-12 The Regents Of The University Of California Administration of growth factors for the treatment of CNS disorders
US8329655B2 (en) 2007-05-01 2012-12-11 Biogen Idec Ma Inc. Methods for increasing vascularization

Also Published As

Publication number Publication date
EP2322205A1 (en) 2011-05-18
NZ543365A (en) 2009-02-28
JP4742030B2 (ja) 2011-08-10
JP2006523709A (ja) 2006-10-19
DE602004021648D1 (de) 2009-07-30
JP2011084567A (ja) 2011-04-28
EP1618179A4 (en) 2008-03-05
EP1618179A2 (en) 2006-01-25
US20120316109A1 (en) 2012-12-13
DK1897552T3 (da) 2009-10-05
ES2479942T3 (es) 2014-07-25
CA2522364A1 (en) 2004-11-04
WO2004094592A3 (en) 2006-04-27
CA2864810A1 (en) 2004-11-04
US8642732B2 (en) 2014-02-04
US8163875B2 (en) 2012-04-24
JP5415392B2 (ja) 2014-02-12
AU2004233079B2 (en) 2009-09-17
WO2004094592A2 (en) 2004-11-04
EP1897552B1 (en) 2009-06-17
ATE433759T1 (de) 2009-07-15
US20070238650A1 (en) 2007-10-11
NZ574121A (en) 2011-06-30
EP1618179B1 (en) 2014-05-07
AU2004233079A1 (en) 2004-11-04
EP1897552A1 (en) 2008-03-12
CA2522364C (en) 2014-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8642732B2 (en) Polymer-conjugated glycosylated neublastin
JP5241037B2 (ja) 截形グリア細胞系由来神経栄養因子
ES2349043T3 (es) Variantes de neublastina.
CN101321870B (zh) 在体内具有延长的半衰期和增强的红细胞生成活性的重组人EPO-Fc融合蛋白
KR101215697B1 (ko) 뉴블라스틴 변형체
JP2009161515A (ja) ニューロパシーの疼痛を処置するためのニューブラスチンポリペプチドの使用
JPH11505548A (ja) グリア細胞系由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）蛋白産物を用いたハンチントン病の治療方法
US20040077543A1 (en) Treatment using neublastin polypeptides
WO2015042580A1 (en) Compositions and methods for treatment of neuropathic pain