JPH11505548A - グリア細胞系由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）蛋白産物を用いたハンチントン病の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産物を投与することで、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アゴニスト介在神経細胞死を防止あるいは軽減するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産物を 用いたハンチントン病の治療方法 発明の背景発明の分野 本発明は一般的に、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産物を治 療有効量投与することで、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体 アゴニスト介在型細胞死に関連する神経変性病を治療する方法に関する。特に、 本発明はハンチントン病の様な神経変性疾患の治療に関する。背景 神経栄養因子は神経系あるいは神経系の支配を受けている非神経組織中に見ら れる天然蛋白質で、神経及び／又はグリアル細胞の生存を促進し、表現型分化を 維持する機能を有する天然蛋白である（Ｖａｒｏｎら．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１：３２７．１９７９；Ｔｈｏｅｎｅｎら．，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ，２２９：２３８，１９８５）。神経栄養因子は神経損傷に起因する神経 細胞の変性や分化機能の消失の治療に有効であることが知られている。神経損傷 は（１）損傷近傍 の軸索突起および／又は神経細胞体の変性を引き起こす物理的損傷、（２）発作 の様な神経系の一部への血流の一時的あるいは永続的中断（虚血）、（３）それ ぞれ癌とＡＩＤＳに対する化学治療薬であるシスプラスチンやジデオキシシチジ ン（ｄｄＣ）の様な神経毒素への意図的あるいは偶発的な暴露、（４）糖尿病や 腎不全の様な慢性代謝性疾患、あるいは（５）パーキンソン病やアルツハイマー 病、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の様な特定の神経集団が退化すことに起 因する神経退行性疾患、を含む１つ以上の型の神経細胞の存続および／あるいは 正常な機能を障害する条件により引き起こされる。特定の神経栄養因子だけがあ る神経傷害の治療に潜在的に有用であるために、損傷を受けた神経細胞の属がこ の因子に対して反応性でなければならず、異なる神経栄養因子は典型的に異なる 属の神経細胞に厳密に作用する。 同定された最初の神経栄養因子は神経成長因子である（ＮＧＦ）。一群の栄養 因子として同定された最初の一員であり、ＮＧＦはニューロトロフィンと呼ばれ る、現在この群には脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３ （ＮＴ−３）、ＮＴ−４／５ならびにＮＴ−６が含まれている （Ｔｈｏｅｎｅ，Ｔｒｅｎｄｓ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１４：１６５−１７０， １９９１；Ｌａｐｃｈａｋら．，Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３：１−１０、 １９９３；Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８：２ ２３−２５３，１９９５）。これらのニューロトロフィンはｔｒｋチロシンキナ ーゼ受容体ファミリー、すなわちｔｒｋＡ，ｔｒｋＢ，ｔｒｋＣならびに低親和 性ｐ７５受容体を介して作用することが知られている（Ｌａｐｃｈａｋら．，Ｒ ｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３：１−１０、１９９３；Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ａｎ ｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８；２２３−２５３，１９９５；Ｃｈａｏ ら．，ＴＩＮＳ １８：３２１−３２６，１９９５）。 グリアル細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、試験管内で中脳のドーパミ ン作動性ニューロンの伝達表現形の生存を促進、刺激作用を促進したアッセーに より同定、精製された、最近発見された蛋白質である（Ｌｉｎら．，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ，２６０：１１３０−１１３２，１９９３）。ＧＤＮＦはグリコシル化した ジスルフィド結合を有するホモダイマーで、神経栄養蛋白質ファミリーの形質転 換成長因子−β（ＴＧＦ−β）フ ァミリーに近い構造上の相同性を有している（Ｌｉｎら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ ６０：１１３０−１１３２，１９９３；Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎら．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：７３６−７４２，１９９５；Ｐｏｕｌｓｅｎら，Ｎｅｕｒｏｎ， １３：１２４５−１２５２，１９９４）。生体内では外因性のＧＤＮＦ処理によ り黒質神経のドーパミン作動性表現形を刺激すること、そしてパーキンソン病の 動物モデルでは軸索除去により誘導された、あるいはドーパミン性神経毒による 機能欠損が保存される（Ｈｕｄｓｏｎら．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．３ ６：４２５−４３２，１９９５；Ｂｅｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：３３９− ３４１，１９９５；Ｔｈｏｎａｓら，Ｎａｔｕｒｅ、３７３：３３５−３３９， １９９５；Ｈｏｆｆｅｒら．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ，１８２：１０７− １１１，１９９４）。ＧＤＮＦはまた生体内と試験管内の両方で脳幹や脊髄のコ リン作動性運動神経に対して神経栄養作用を有している（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：３４４−３４６，１９９５；Ｚｕｍら．，Ｎｅｕｒ ｏｒｅｐｏｒｔ，６；１１３−１１８，１９９４；Ｙａｎら．，Ｎａｔｕｒｅ， ３７３：３４１−３４４，１９９５；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１０６２−１０６４，１９９４）。ＧＤＮＦが中脳の ドーパミン作動性神経や体制運動神経以外の広い範囲に神経栄養作用を持つこと を示す証拠が得られつつある（ＹａｎとＭａｔｈｅｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ）３７ ３：３４１−３４４，１９９５；Ｍｉｌｌｅｒら．，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ．Ａｂｓｔｒ．，２０：１３０，１９９４）。ＧＤＮＦｍＲＮＡは筋肉や末梢神 経系のシュワン細胞や中枢神経系のタイプＩのアストロ細胞に発見されている（ Ｓｃｈａａｒら．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２４：３６８−３７１，１９９ ３）。 ハンチントン病（ＨＤ）は、不随意の手足の運動、痴呆、情緒障害、発症後１ ５から２０年での死という特徴を有する遺伝性の神経退行性の疾患である。本疾 患は常染色体性の優性遺伝病で、男女１００，０００人当たり５人の等しい割合 で発症する。発症した親を持つ子供は５０％の確率で本疾患が遺伝する。本疾患 は一般には４０−５０代で発病し、多くの患者は結婚し子供を持っている。 病気の最初の徴候は目立たないものである：放心、過敏症ならびに落ち着きを 失い、ぎこちなくなり突然抑鬱状態になる。本疾患の最も顕著な特徴である制御 できない舞踏病様の運動は 患者が起きあがれない状態あるいは車椅子に拘束される状態になるまで漸次増加 する。患者の口調は最初は早口で不明瞭となり、次に意味不明となり、最後に話 さなくなる。認識機能もまた障害され、突然分別の機能が消失する。治療方法は 無い。本疾患がひとたび発症すると情け容赦なく進行し、患者は年ごとに能力を 失い、最後には完全に機能を消失して死を迎える。ＨＤの病因の主要部位は線状 体であり、ここでは神経単位の９０％までが消失する。線状体内においては特定 の神経単位集団が選択的に脱落する。神経化学マーカーであるガンマアミノ酪酸 （ＧＡＢＡ）、サブスタンスＰ、ディノルフィン、エンケファリンを含む、線状 体内の中程度の大きさの脊髄神経単位がより影響を受けやすい。逆に、神経ペプ チドであるソマトスタチンや神経ペプチドＹを含む中程度の大きさの脊髄神経単 位やコリンエステラーゼ（ＣｈＡＴ）活性を含む大きな脊髄神経単位は残る傾向 にある（ただしＣｈＡＴ活性は完全に消失する）。ドーパミン作動性ならびにセ ロトニン作動性球心性投影系統も影響が小さい（Ｂｅａｌら．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉ．，１１：１６４９−１６５９、１９９１）。 障害された認識機能と結果としての痴呆は皮質神経単位の消 失あるいは基底神経節認識部位、すなわち背側部正面と側方眼窩正面回路の正常 活動の破綻のいずれかが原因と考えられている。舞踏病の特徴は、視床下核の活 動の減少も同時におこるものの、線状体の神経消失がその原因であると信じられ ている。通常、３種類の生化学的には異なるが、機能的には相互に関係してる以 下の系の間でバランスが取られている：（１）黒質線状体のドーパミン作動系； （２）線状内コリン作動系；ならびに（３）線状体から淡蒼球に伸びるＧＡＢＡ 作動系。ドーパミン、アセチルコリン、あるいはＧＡＢＡ系のいずれかのバラン スが崩れることで不随意運動が引き起こされる。アセチルコリンを作る上に必要 なコリンアセチル転移酵素と、ＧＡＢＡの合成に必要な酵素であるグルタミン酸 炭素酵素がＨＤ患者の線状体中では顕著に減少している。これらの酵素の欠損と 、Ｌ−ＤＯＰＡ投与後に舞踏病様の運動が悪化するという臨床観察に一致してい る。 グルタミン酸の誘導による神経細胞死がハンチントン病に関与していると信じ られている。グルタミン酸は脳の重要な興奮性伝達物質である。あらゆる中枢神 経を強く興奮させ、神経末端部に高濃度で存在している（１０^-3Ｍ）。グルタミ ン酸受 容体は４つのタイプに分けられている（代表的なアゴニスト名を冠して称される ）：カイニン酸受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体、 ａ−アミノ−３−ヒロドキシ−５−メチル−４−イソキザオルプロピオン酸（Ａ ＭＤＡ）受容体、とメタボロトロフィック受容体。多くの正常のシナプス伝達事 象にグルタミン酸の放出が関与している。 グルタミン酸は神経毒性も有し、高濃度で細胞死を誘導する（Ｃｈｏｉ，Ｄ． Ｗ，Ｎｅｕｒｏｎ、１：６２３−６３４，１９８８）。細胞死の機序は主に、Ｎ −メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型のグルタミン酸受容体に持続的に グルタミン酸が作用することでおき、その結果過剰のＣａ²⁺の流入が起きる。過 剰のＣａ²⁺によりＣａ²⁺依存型プロテアーゼが活性化されて、さらにポスフォリ パーゼＡ₂が活性化した結果アラキドン酸放出が起き、炎症を引き起こす物質を 産生させ、またその後の破壊的事象の引き金となるフリーラジカルが作られる。 これらのグルタミン酸により引き起こされる有害な変化はグルタミン酸刺激毒性 と呼ばれ、発作やひどい痙攣といった急性の脳傷害の後におきる細胞死が原因と 信じられている。刺激毒性は脳虚血やアルツハイマー病、ＨＤにも関与している 可 能性も示唆されている（Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７： １４９６−１４９９，１９８５；Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｗ，Ｎｅｕｒｏｎ，１：６２３ −６３４，１９８８）。 グルタミン酸受容体アゴニストをラット線状体に注入するとＨＤに似た神経細 胞消失パターンを作り出すことができる。実際に注入した部位内の神経は大部分 が死ぬものの、周囲部分に漸次移行域が観察されこの部分では細胞の選択死が見 られる。カイニン酸（ＫＡ）−誘導傷害に関する初期の研究により、ＨＤとの強 い類似性が示された。ＫＡは海藻のＤｉｇｉｎｅａｓｉｍｐｌｅｘから分離され たものであり、ほ乳類の脳には無い。ＫＡを線状体内に注入すると神経消失と神 経膠腫病が現れ、それに伴って線状体固有の神経マーカーが減少するがドーパミ ン作動性の球心作用は保存されている。しかし、これらのＫＡによる傷害は、ソ マトスタチンレベルの有意な減少とソマトスタイン神経単位の消失も引き起こす ことからＨＤのモデルとしは不完全である。キノリン酸（ＱＡ）の様なＮＭＤＡ 受容体アゴニストによる傷害は、比較的ソマトスタチンやニューロペプチドＹレ ベルは維持される一方でＧＡＢＡやサブスタンスＰのレベルは有意に低下するこ とからＨＤのモデルとしてより良い ものを提供する。長期間（６ヶ月から１年）のＱＡ傷害の追跡調査の結果は、ソ マトスタチンとニューロペプチドＹならびにセレトニンとＨＩＡＡの増加（ＫＡ 傷害の長期追跡調査では認められない）が認められるが、これは実際のＨＤ患者 の所見に類似している。したがって、慢性のＱＡ傷害はＨＤの神経化学上の特徴 に極めて近いものである（Ｂｅａｌら．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１１：１６ ４９−１６５９、１９９１）他の研究者もＱＡに誘導された線状体の傷害がＨＤ の組織病理に類似していることを確認している（Ｒｏｂｅｒｓら．，のＥｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．，１２４：２７４−２８２，１９９３）。 本発明の一般観点は１９９３年の４月１日に公開されたＷＯ９３／０６１１６ （Ｌｉｎら．，Ｓｙｎｔｅ−Ｓｙｎｅｒｇｅｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｊ ｏｉｎｔ Ｖｅｎｔｕｒｅ）であり、それにはＧＤＮＦがパーキンソン病に伴う 傷害を含む神経傷害の治療に有用であることが報告されている。別の観点はＳｃ ｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒら．，のＧＤＮＦｍＲＮＡがピロカルピン誘導の癲 癇後に検出可能になり上流制御されているというＭｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ，２６：３２５−３３０、１９９４の報告：Ｓｃｈａａｒら．，Ｅｘｐ ． Ｎｅｕｒｏｌ．，１２４：３６８−３７１、ならびにＳｃｈａａｒら．，Ｅｘｐ ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１３０：３８７−３９３，１９９４の基底前脳部アストロ細 胞が培養条件下に分子レベルのＧＤＮＦｍＲＮＡを発現するか、ＧＤＮＦは基底 前脳部のＣｈＡＴ活性を変化させないという報告、ならびに係属中の１９９５年 ９月２８日公開の米国出願連続番号０８／５３５，６８２（Ｙａｎら）のＧＤＮ Ｆが基底前脳部コリン作動性神経の傷害あるいは退化の治療に有用であるという 報告；係属中の１９９５年１１月２９日出願の米国出願連続番号０８／５６４． ４５８（Ｙａｎら）は、ＧＤＮＦが網膜神経節細胞傷害の治療に有用であるとい う報告、そして係属中の１９９５年１１月２９日出願の米国出願連続番号０８／ ５６４，８３３（Ｌｏｕｉｓ）によるＧＤＮＦが光受容器傷害の治療に有用であ るという報告である。 特に関心のある点はＨｕｍｐｅｌら．，のカイニン酸により痙攣を誘導すると 海馬中のＧＤＮＦｍＲＮＡレベルが増加するというＮｅｕｒｏｓｃｉ．，５９： ７９１−７９５，１９９４の報告や、ＧＤＮＦがカイニン酸（非哺乳動物興奮性 アミノ酸）（現在係属中の１９９４年１１月１５日出願の”ＧＤＮＦを神 経保護材剤として利用する方法”という名称の米国出願連続番号０８／３４０， ８２１（Ｍａｒｔｉｎ）と１９９５年５月２２日出願の米国出願連続番号０７／ ４４６，３８３も参照のこと）の投与により誘導された脳の海馬、視床部ならび に扁桃体域での痙攣運動と痙攣に伴う神経細胞の消失を阻害するというＭａｒｔ ｉｎらのＢｒａｉｎ．Ｒｅｓ．，６８３：１７２−１７８，１９９５の報告であ る。さらに別の観点はＰｅｒｅｚ−ＮａｖａｒｒｏらのＮＧＦと塩基性繊維芽細 胞増殖因子（ｂＦＧＦ）がキノリン酸が介在する線状体のＣｈＡＴ活性の減少を 防止し、ＮＧＦとｂＦＧＦがキノリン酸傷害からコリン作動性の線状体神経を保 護するという報告である。これまでにＧＤＮＦはキノリン酸に曝され傷害を受け た線状体神経の生存あるいは再生を促進し、あるいはＮＭＤＡ受容体アゴニスト が介在した細胞死を伴うハンチントン病の様な神経退行性疾患に作用することが 示唆あるいは示されてきた。 これまでもハンチントン病の治療に有効な方法と治療処方に対する要望があっ た。その様な方法ならびに治療処方は理想的に退行性疾患の進行を完全に停止さ せ、さらに傷害を受けた神経の再生を重度の副作用なく促進するだろう。 発明の要約 本発明は、ＮＭＤＡ受容体アゴニスト介在型の細胞死に関連する神経変性疾患 を、治療効果量のグリアル系の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産物を投与するこ とにより治療する方法を提供する。そのような神経変性の疾患の例にはハンチン トン病（ＨＤ）がある。この様なＧＤＮＦ蛋白産物には配列番号１記載のアミノ 酸配列、その変種、ならびに誘導体が含まれる。本発明は、組換体ヒトＧＤＮＦ を頭内投与することで、ハンチントン病の生体内モデルへのキノリン酸（ＱＡ） 投与により誘導される特徴的な皮質と線状体細胞の死が軽減されたという発見に 基づく。特異的ＮＭＤＡ受容体アゴニストであるＱＡを介した傷害に対するＧＤ ＮＦ活性はＮＭＤＡ受容体介在の毒作用も改善する。 本発明によれば、ＧＤＮＦ蛋白産物は非経口的に（好ましくは静脈あるいは大 脳脳室内に(intracerebroventricularly)）約１０μｇ／ｋｇ／日から１００ｍ ｇ／ｋｇ／日の範囲の用量、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日から２５ｍｇ／ｋｇ ／日の範囲の用量、そして最も好ましくはおよそ５から２０ｍｇ／ｋｇ／日の範 囲の用量で投与する。さらにＧＤＮＦ蛋白産物はハンチ ントン病に対し有効な第二の治療薬の有効量と共に投与することもできる。 本発明はまた、ハンチントン病に伴う神経細胞死を軽減させることも含めたハ ンチントン病治療の為の医薬品製造におけるＧＤＮＦ蛋白産物の使用も提供する 。 さらに多くある本発明の別の観点ならびに優位点については以下好適な実施態 様をもって記載する本発明の詳細な記述により当業者に明らかになるだろう。 簡単な図表の説明 図１は脳の断面図で、生存しているニューロン細胞を数えるためにとったサン プル域ならびにおおよその線状体の位置、キノリン酸により誘導された傷害部位 、そしてそこからの移行域が分かる。 図２Ａおよび２Ｂは、それぞれキノリン酸（ＱＡ）、ＱＡ＋ビヒクル、あるい はＱＡ＋組換体ヒトＧＤＮＦ（たとえば図４記載のアミノ酸配列を有するｒｈＧ ＤＮＦ）投与後の左と右それぞれの前方ならびに頭頂部の皮質部の生存ニューロ ン細胞数を示す。 図３はＱＡ、ＱＡとビヒクル、あるいはＱＡとｒｈＧＤＮＦ を投与した後に右と左の線状体内に見られた生存ニューロン細胞数を示す。 図４はＧＤＮＦ蛋白産物のアミノ酸配列例を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、グリアル細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産物を治療有 効量投与することでハンチントン病に伴う神経細胞死を軽減する方法を提供する 。本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列、その変種、ならびにその誘導体を 有するＧＤＮＦを含む生物学的に活性なＧＤＮＦ蛋白産物を用いて実行できる。 本発明は、当該分野にてハンチントン病の生体モデルと認知されているキノリ ン酸（ＱＡ）投与による特徴的な皮質と線状体の神経細胞の死が、組換体ヒトＧ ＤＮＦの頭内投与により軽減されたという発見に基づく。キノリン酸投与はハン チントン病の多くの組織病理学的特徴を表すことから該疾患の進行と潜在的治療 法の研究に最も一般的に使用されるモデルである。 キノリン酸の神経興奮性作用は、その惹起された放出パターンがＮＭＤＡのそ れに類似しており、また競合的ＮＭＤＡアンタゴニストがキノリン酸誘導型の興 奮を減少させることから、 ＮＭＤＡ型受容体によって介在されると考えられている（ＭａｒｔｉｎとＬｏｄ ｇｅ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，７５：１７５−１８０，１９８７）。し かして、ＧＤＮＦはＮＭＤＡ受容体アゴニストにより介在される神経傷害あるい は神経変性を改善することが期待される。ＮＭＤＡアゴニストは、側頭葉てんか ん、肝性脳症、脳虚血症、低血糖症、ならびにＡＩＤＳ痴呆を含む多くの脳障害 に潜在的に関与している（ＳｃｈｗａｒｃｚとＤｕ，”哺乳動物の脳におけるキ ノリン酸とキヌレン酸”、キヌレニンとセロトニン経路、Ｓｃｈｗａｒｃｚら． ，編．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９１）。 グルタミン酸シナプスに影響する異なるシナプス前およびシナプス後の異常が ＮＭＤＡ受容体介在性の神経毒性を生成すると予想される。シナプス前異常とし ては過剰な神経活性、過剰のグルタミン酸の放出あるいはグルタミン酸の（神経 末端あるいはグリアへの）取り込みの減少が考えられる。シナプス後の異常とし てはＮＭＤＡ受容体数の異常な増加、ＮＭＤＡ受容体チャンネル複合体の変化（ 例えば平均チャンネル開口時間の延長）、平均静止ポテンシャルの減少（例えば 、Ｍｇ²⁺ブロックの減少を招く）あるいはＣａ²⁺介在型傷害の受け易さの増 大（例えばＣａ²⁺緩衝能力の減少による）が考えられる。上記の全てのことがＮ ＭＤＡ受容体介在型の傷害の基礎となる。さらに、ＮＭＤＡ受容体介在型の有害 作用もまた変調因子の異常、シナプスのＺｎ²⁺の減少、シナプスのグリシン（Ｇ ｌｙ）の過剰あるいは変化したＮＭＤＡアゴニスト（例えばキノリナート）の量 の異常により引き起こされる可能性がある。ＮＭＤＡ受容体活性型チャンネルが 、フェンサイクリジン（ＰＣＰ）部位に対する内因性リガンドにより部分的に正 常にブロックされる場合には、このリガンドのレベルの減少が別の形のＮＭＤＡ 受容体介在型の有毒作用の源となる可能性がある。 本発明によれば、ＧＤＮＦ蛋白産物は非経口的に（静脈あるいは大脳脳室内投 与を含む）約１０μｇ／ｋｇ／日から１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量、好ま しくは約１ｍｇ／ｋｇ／日から２５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量、そして最も好 ましくはおよそ５から２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量で投与する。さらに本発 明は注射以外の方法によりデリバリーされ、非経口投与形態と生物有効性のうえ で等価な効果をもたらすにのに十分な量のＧＤＮＦ蛋白産物を含む様処方された 医薬組成物も意図する。さらに本発明はＧＤＮＦ蛋白産物を、キノリン酸が誘導 する線状体ＣｈＡＴ活性の減少を阻止すると報告されているＮＧＦやｂＦＧＦの 様なハンチントン病に対する第二の治療薬の治療有効量と共に投与することも意 図する。 本発明は、ハンチントン病に関連する神経細胞死の軽減も包含するハンチント ン病の治療薬の調製へのＧＤＮＦ蛋白産物の使用も提供する。 本明細書で使用する“ＧＤＮＦ蛋白産物”という言葉には、生物学的に活性な 精製した天然、合成あるいは組換体ＧＤＮＦとその断片、ＧＤＮＦ変種（挿入、 置換、ならびに欠損変種）ならびに化学的に修飾された誘導体が含まれる。さら に配列番号１記載のアミノ酸配列を有するヒトＧＤＮＦに実質的に相同な生物学 的に活性なＧＤＮＦ蛋白も含まれる。ＧＤＮＦ蛋白産物は生物学的に活性な形で はホモダイマーあるいはヘテロダイマーの形で存在しうる。 本明細書における“生物学的に活性”という言葉は、ＧＤＮＦ蛋白産物が以下 の実施例に記載する神経栄養上の特性を示すことを意味するが、少なくともキノ リン酸誘導型の皮質と線状体内の神経細胞死や、ハンチントン病に伴うＮＭＤＡ 受容体アゴニスト介在型の細胞死を軽減し、配列番号１記載のアミノ酸 配列を有するＧＤＮＦ蛋白産物について示された性質を有していれば、その性質 は必ずしも全て同じである必要はなく、且つ、同じ程度である必要はない。必要 とする特定の神経栄養特性の選定は、どのＧＤＮＦ蛋白産物を投与するかによっ て行う。本記載内容を利用すれば、対象とするポリペプチドが本明細書記載のＧ ＤＮＦ蛋白産物と実質的に同等の生物学的活性を有するものであるかを決めるこ とは当業者にとって容易である。 本明細書に使用する“実質的に相同”という言葉は配列番号１記載のアミノ酸 配列を有するＧＤＮＦとある程度の相同性を有することを意味しており、好まし くは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最 も好ましくは９５％以上の相同性を有する。例えば、ラットとヒトの該蛋白の相 同性はおよそ９３％であり、全ての哺乳動物のＧＤＮＦは同程度の相同性を持つ と考えられる。本明細書記載の相同性のパーセンテージは、比較する配列中で、 アミノ酸配列が同一である２つの配列の内の、短い方の配列中に認められるアミ ノ酸残基のパーセンテージとして計算したもので、この時、１００アミノ酸の長 さ当り平均３から４のギャップを挿入して配列を調節しても良い（本明細書中に 参考資料として採用 している、Ｄａｙｈｏｆｆによる報告参照：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｖ．５，ｐ．１２４，Ｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉ ｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７２））。すなわち、配列相同性 の程度は、比較する分子のアミノ酸残基を配列番号１記載の様なＧＤＮＦポリペ プチドのアミノ酸残基と比較し、２つの配列間の残基の一致が最大になるように （比較配列において、保存的残基置換を適当に行い、必要に応じてギャップを導 入して、末端部（truncations）及び内部の欠損あるいは挿入は無視する）最適 に並べて決定する。一度並べてパーセンテージを比較するポリペプチドの全残基 数で一致した残基数を除して決定するが、比較ポリペプチドが参照のポリペプチ ドの末端を越えた部分を有している場合には、これを無視する。保存的置換の例 としては以下の一群間での置換がある：グリシン、アラニン；バリン、イソロイ シン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン； セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；ならびにフェニルアラニン、チロシ ン。さらに実質的相同性には配列番号１のＧＤＮＦに対する抗体との交叉反応に より分離され得るＧＤＮＦ蛋白産物、あるいはその遺伝子が配列番号１のＧＤＮ Ｆをコードする遺伝子あるいはその断片とハイブリダイゼーションすることで分 離できるものも含む。 本発明のＧＤＮＦ蛋白産物は当業者に公知な方法により分離あるいは生成でき る。本発明の利用可能なＧＤＮＦ蛋白産物を製造する方法の例は１９９４年、５ 月２３日出願の米国特許出願番号０８／１８２，１８３とその親特許出願；１９ ９２年９月１７日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０７８８８で、ＷＯ ９３／０６１１６（Ｌｉｎら．，Ｓｙｎｔｅｘ−Ｓｙｎｅｒｇｅｎ Ｎｅｒｕｏ ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｉｎｔ Ｖｅｎｔｕｒｅ）で開示；欧州特許出願番号９２ ９２１０２２．７、ＥＰ６１０２５４で公開；ならびに共有、係属中の１９９５ 年９月２８日出願の切断ＧＤＮＦ蛋白産物あるいはＧＤＮＦ欠損変種を含む米国 出願番号０８／５３５，６８１に記載されており、これら開示情報は全て本明細 書に参考資料として採用されている。 全長のＧＤＮＦポリペプチドあるいは断片は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ［１９８９］）及び／又はＡｕｓｕｂｅｌら．，編集（Ｃｕ ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ［１９９４］）中に記載の公知の組み替えＤＮＡ技術を利用して 調製できる。ＧＤＮＦ蛋白あるいはその切断片（truncated version）をコード する遺伝子あるいはｃＤＮＡは、たとえばゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡ ライブラリーのスクリーニング、あるいはＰＣＲ増幅法により得ることができる だろう。あるいは、ＧＤＮＦポリペプチドもしくは断片をコードする遺伝子は、 Ｅｎｇｅｌｓら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７ ３４［１９８９］）に記載された当業者公知の方法を用いた化学合成法で調製で きるだろう。これらの方法には、特に核酸合成法としてのホスホトリエステル、 ホスホルアミジト（phosphoramidite）、ならびにＨ−ホスホネート法が含まれ る。これら化学合成に好適な方法は、標準的なホスホルアミジト化学を利用した ポリマー支持型合成法である。典型的にＧＤＮＦポリペプチドをコードするＤＮ Ａ は数百ヌクレオチドの長さを有している。およそ１００ヌクレオチドを越える長 さの核酸はこれらの方法を用いて幾つかの断片として合成される。それからこれ らの断片を結合して全長のＧＤＮＦポリペプチドを作成する。 天然のＧＤＮＦをコードしている核酸及び／又はそのアミノ酸の変種の調製が 望ましいこともある。核酸変種（野生型あるいは天然に存在するＧＤＮＦと１個 以上のヌクレオチドが異なるもの）は位置指定突然変異誘発法あるいはＰＣＲ増 幅法を用いて調製でき、この場合にはプライマーに所望の点突然変位を持たせる （突然変異誘発技術についてはＳａｍｂｒｏｏｋら．，上記ならびにＡｕｓｕｂ ｅｌら．，上記を参照）。上記のＥｎｇｅｌｓら．，の化学合成法はまた、この 様な変種の合成にも利用できるだろう。当業者に公知の他の方法も同様に使用で きる。好適な核酸変種はＧＤＮＦ産生に使用する宿主細胞中の選択されたコドン を補償する核酸の置換を含むものである。その他の好適な変種は、野生型に比べ て保存的アミノ酸変更をコードするものであり（例えば、天然のアミノ酸側鎖の 電荷あるいは極性が実質的には変化しないように他のアミノ酸へ置換されたもの ）、及び／又はＧＤＮＦ上に新たにグリコシル化及び／ 又はリン酸化部位ができるように設計されたもの、あるいはＧＤＮＦ上の既存の グリコシル化または／あるいはリン酸化部位を除去するよう設計されたものであ る。 天然に存在するＧＤＮＦ蛋白産物は哺乳動物の神経細胞調製物より分離でき、 あるいはＧＤＮＦを分泌あるいは発現する哺乳動物細胞系より分離することがで きる。例えば、ＷＯ９３／０６１１６はＢ４９神経膠芽腫細胞の無血清増殖培地 からのＧＤＮＦの分離を記載している。ＧＤＮＦ蛋白産物はまた当業者に公知な 方法により化学的に合成することもできる。比較的大量の蛋白を高純度に得るこ とができることから組換体技術がＧＤＮＦ蛋白産物の製造方法として好適である 。組換体ＧＤＮＦ蛋白産物には蛋白のグリコシル化型と非グリコシル化型、また は細菌、哺乳動物、あるいは昆虫細胞系で発現した蛋白が含まれる。 一般に組換体技術には、ＧＤＮＦをコードする遺伝子を分離し、適当なベクタ ー及び細胞型に該遺伝子をクローニングし、必要に応じて所望の変種をコードす る様に遺伝子を修飾し、該遺伝子を発現させてＧＤＮＦ蛋白産物を生産する工程 が含まれる。あるいは、所望ＧＤＮＦ蛋白産物をコードする核酸配列を 化学的に合成することもできる。またＧＤＮＦ蛋白産物は、遺伝子コードの退縮 や対立遺伝子変異によりコドンが異なった核酸配列を利用して発現することも意 図される。ＷＯ９３／０６１１６はラツトＧＤＮＦ遺伝子のｃＤＮＡクローンの 単離及び配列決定、並びに、ヒトＧＤＮＦ遺伝子のゲノムＤＮＡクローンの単離 、配列決定及び発現を記載している。ＷＯ９３／０６１１６は更に、ベクター、 宿主細胞、ＧＤＮＦ蛋白産物の発現のための培養増殖条件についても記している 。ＧＤＮＦ蛋白産物の大腸菌での発現に適した別のベクターは、本明細書中に参 考資料として採用した１９９１年４月２４日公開の欧州特許出願番号０４２３９ ８０（“幹細胞因子”）に開示されている。成熟型のヒトＧＤＮＦをコードする 遺伝子のＤＮＡ配列ならびにＧＤＮＦのアミノ酸配列はＷＯ９３／０６１１６の 図１９（配列番号：５）に示されている。図１９にはＧＤＮＦのプレプロ体の全 配列は示されていないが、ヒトプレプロＧＤＮＦの最初の５０アミノ酸がＷＯ９ ３／０６１１６の図２２に示されている（配列番号：８）。 天然のＧＤＮＦは生物学的に活性な形ではジスルフィド結合したダイマーであ る。細菌系で発現した後に分離した物質は本 質的には生物学的には非活性で、モノマーとして存在している。生物学的に活性 なジスルフィド結合ダイマーを生成するためには再生が必要である。細菌の系で 発現したＧＤＮＦの再生と成熟についてはＷＯ９３／０６１１６に記載されてい る。例えば、再生は、ＧＤＮＦ含有抽出物に、まず最初にジチオトレイトールを 加え、次いでグルタチオン２ナトリウム塩さらに再生バッファーを加えることで 実施できる。ＧＤＮＦ活性の初測定のための試験管内アッセーの標準法について 、本明細書に参考資料として採用されているＷＯ９３／０６１１６と１９９５年 ９月２８日に申請された共有、係属中の米国出願番号０８／５３５，６８１に記 載されている。これらのアッセーには以前に記載されたアッセーに基づくドーパ ミン取り込みアッセーも含まれている（Ｆｒｉｅｄｍａｎら．，Ｎｅｕｒｏ．Ｓ ｃｉ．Ｌｅｔｔ．７９：６５−７２、１９８７，この開示は本明細書に参考資料 として取り込まれる）。ドーパミン取り込み測定により、高親和性ドーパミン再 取り込みトランスポーター部位の数と活性が測定され、ドーパミン作動性神経の 機能差を知ることができる。 Ａ．ＧＤＮＦ変種 本書で使用する“ＧＤＮＦ変種”という言葉には、天然型のＧＤＮＦのアミノ 酸配列の残基から、アミノ酸が欠損したペプチド（“欠損型変種”）、上記残基 にアミノ酸を挿入したペプチド（“付加型変種”）あるいは上記残基に対してア ミノ酸を置換したペプチド（“置換型変種”）が含まれる。この様な変種は適当 なヌクレオチドの変更をポリペプチドをコードするＤＮＡに導入するか、あるい は試験管内にて所望のポリペプチドを化学的に合成することで調製できる。これ らの欠損、挿入および置換を種々組み合わせて、ＧＤＮＦ生物学的活性を有する 最終型分子である成熟ヒト型ＧＤＮＦのアミノ酸配列を作成できることが当業者 によって認識される。 １つ以上の特定のアミノ酸残基を交換、挿入あるいは欠損する突然変異誘発技 術は当業者に公知である（例えば、本明細書に参考資料として採用している米国 特許番号４,５１８,５８４）。置換型変種の構築には基本的に２種類の変異があ る：突然変異部位の位置と突然変異の種類である。ＧＤＮＦ置換型変種の設計で は突然変異の部位とその種類は修飾しようとするＧＤＮＦ特性によって選択する 。変異部位は個々にあるいは連続して修 飾することができ、たとえば（１）最初の置換を保存的アミノ酸で行い、ついで 得られた結果を見てよりラジカルなアミノ酸で置換する、（２）標的のアミノ酸 残基を欠損させる、（３）現場の部位の隣にアミノ酸残基を挿入することで行え る。保存的な変更は１から２０のアミノで行うのが好ましい。所望のＧＤＮＦ蛋 白産物のアミノ酸配列が決まったら、該蛋白の発現に使用するに好適な核酸配列 は自動的に決まる。Ｎ−末端とＣ−末端の欠損変種はまた蛋白分解酵素を使用し て生成できる。 ＧＤＮＦ欠損変種については、通常欠損域はおよそ１から３０残基であり、通 常はおよそ１から１０残基であり、さらに典型的な例ではおよそ１から５の連続 する残基である。Ｎ−末端、Ｃ−末端ならびに内部配列の欠損も意図される。欠 損は他のＴＧＦ−βファミリーメンバーと相同性の低い領域に導入され、ＧＤＮ Ｆの活性を修飾する。本質的に他のＴＧＦ−βファミリー配列に相同な領域の欠 損は、ＧＤＮＦの生物学的活性を著しく修飾すると予想される。連続して欠損す る場合の残基の数は、影響を受けるドメインにおけるＧＤＮＦ蛋白産物の、例え ばシステイン架橋結合の様な三次元構造が保存される様に選別される。限定され ない欠損変種の例には、本明細書に参考資 料として採用している共有、同時係属中の米国出願番号０８／５３５，６８１に 記載されている様に、ＧＤＮＦの１から４０のＮ−末端アミノ酸を欠く切断（tr uncated）ＧＤＮＦ蛋白産物、あるいはＧＮＤＦのＣ−末端残基を欠く変種、あ るいはその組み合わせが含まれている。 ＧＤＮＦの付加型変種については、付加するアミノ酸配列は、１残基の長さか ら１００残基数以上のポリペプチドまでの長さの範囲のものをＮ−末端及び／又 はＣ−末端に融合するもの、そして１個以上のアミノ酸残基を内部に付加するも のが含まれる。内部への付加の場合の残基数は一般には１から１０であり、より 典型的な場合には１から５残基であり、さらに通常は１から３アミノ酸残基数で ある。Ｎ−末端への付加変種の例には［Ｍｅｔ^-1］ＧＤＮＦと呼ばれるＮ−末端 にメチオニル残基を付加したＧＤＮＦ（細菌組換体細胞培養でＧＤＮＦを直接発 現させる時の人工加工）やＧＤＮＦのＮ−末端に異種のＮ−末端シグナル配列を 融合して組換体宿主細胞から成熟型のＧＤＮＦを分泌させるようにしたものも含 まれる。この様なシグナル配列は通常は使用する宿主細胞種から、すなわち相同 的なものとして得ることができる。付加体には他の神経栄養因子の配 列から得たアミノ酸配列も含ませることができる。本発明の使用に好適なＧＤＮ Ｆ蛋白産物は組換体ヒト［Ｍｅｔ^-1］ＧＤＮＦである。 ＧＤＮＦ置換変種は、ＧＤＮＦのアミノ酸配列のアミノ酸残基を少なくとも１ 個取り除き、そして異なる残基をその位置に挿入したものである。この様な置換 変種には生物種集団中に天然に生じる核酸変位でアミノ酸の変化を起こすものも 、起こさないものもあり得る対立遺伝子変種（allelic variants）が含まれる。 置換型変種の例（配列番号５０を参照）は共有、同時係属中の、本明細書に参考 資料として採用した米国出願連続番号０８／５３５、６８１に開示されている。 ＧＤＮＦアミノ酸配列の特異的突然変異にはグリコシル化位置の修飾も含まれ る（例えば、セリン、トレオニン、あるはアスパラギン）。グリコシル化の欠除 又は部分的なグリコシル化の欠除は、アスパラギン結合性グリコシル化認識部位 のアミノ酸の置換もしくは欠損、あるいはＯ−結合炭化水素の付加により修飾さ れた分子のいずれかの位置を置換もしくは欠損させることで生じる。アスパラギ ン結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞性グリコシル化酵素により特異的に 認識される３ペプ チド配列を含む。これらの３ペプチド配列にはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒあるいは Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒがあり、式中のＸａａはＰｒｏ以外のいずれかのアミノ 酸である。グリコシル化認識部位の最初あるいは３番目のアミノ酸位置の一方又 は両方についてアミノ酸置換あるいは欠損（及び／又は２番目の位置のアミノ酸 の欠損）がある場合の変種では、修飾された３ペプチド配列においてグリコシル 化を生じない。したがって、適当にヌクレオチド配列を変更し発現することで、 その部位がグリコシル化されていない変種産物を製造することができる。あるい は、ＤＮＦアミノ酸配列を修飾してグリコシル化部位を付加することもできる。 突然変異を起こすＧＤＮＦアミノ酸残基あるいは領域を特定する方法の一つは “アラニンスキャニング突然変異誘発法”と呼ばれる、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍと Ｗｅｌｌにより報告された方法である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１ ０８５，１９８９）。本法では、標的とするアミノ酸残基あるいは残基群を同定 し（例えばＡｒｇ，Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，ならびにＧｌｕの様な荷電した残 基）、中性あるいは陰性に荷電したアミノ酸（最も好適な例はアラニンあるいは ポリアラニン）で 置換し、アミノ酸と細胞内外の周囲の水性環境との相互作用を変化させる。それ から、これらの置換により機能的に感受性であることが判明した領域について、 先の置換部位において残基の付加あるいは変更を行いさらに細かな決定を行う。 こうしてアミノ酸配列変異を導入する標的の部位を決め、アラニンスキャニング あるいはランダム突然変異誘発をＤＮＡ配列の対応する標的コドン又は領域で実 施し、発現されたＧＤＮＦ変種について、所望の活性が得られるかどうか、また その活性度がどのくらいかスクリーニングする。 置換型突然変異誘発の最も興味深い部位には、様々な種由来のＧＤＮＦ蛋白に あるアミノ酸が、側鎖の大きさや荷電、及び／又は疎水性に関して本質的に異な る部位が含まれる。別の候補部位としては様々な種より得られたＧＤＮＦ様蛋白 で同一な残基である。この様な位置は一般にその蛋白の生物学的活性に重要であ る。まず、これらの部位を比較的保存的な手法で置換する。この保存的置換につ いて、好ましい置換の見出しと共に表１に示す。この置換により生物学的活性が 変化した場合には、より実質的な変更を（例示の置換）行い、及び／又は別の付 加あるいは欠損を行い、その産物について活性を調べる。 アミノ酸配列への保存的修飾（ならびにエンコーディング核酸配列に対する対 応する修飾）により機能的ならびに化学的に天然のＧＤＮＦに近い性質を有する ＧＤＮＦ蛋白産物が生み出 されることが期待される。逆に、ＧＤＮＦ蛋白産物の機能的及び／又は化学的性 質の実質的な修飾は、（ａ）シ−ト構造あるいは螺旋構造のような置換域のポリ ペプチドバックボ−ン構造や、（ｂ）標的部位の分子の電荷と疎水性、あるいは （ｃ）側鎖の大きさ、の維持に対する影響が著しく異なる置換を選び行われる。 天然の残基は共通する側鎖の特性に基づき以下のグル−プに分類される： １）疎水群：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ； ２）中性親水群：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ； ３）酸性群：Ａｓｐ，Ｇｌｕ； ４）塩基性群：Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｈｌｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ； ５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；ならびに ６）芳香群：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ． 非保存的置換にはこれらの群の一つのメンバーを他のものに交換することが含 まれる。この様な置換した残基は別のＴＧＦ−β蛋白質に相同なＧＤＮＦ蛋白の 領域あるいは該分子の非相同領域に挿入できる。 Ｂ．ＧＤＮＦ誘導体 ＧＤＮＦ又はＧＤＮＦ変種の化学的に修飾した誘導体は本明細書に開示した方 法の一つによりを調製できる。誘導体化に最適な化学成分には水溶性ポリマーが 含まれる。水溶性ポリマーは結合した蛋白質が水性環境内でも沈殿しないことか ら望ましい。好ましくはポリマーは治療用製品あるいは組成物の調製に対して医 薬的に受容可能なものである。当業者はポリマー／蛋白質結合体が治療に使用で きるかどうかという観点からポリマーを選別することは可能であり、治療に使用 できる場合、望ましい用量、循環時間、蛋白分解に対する耐性、その他の必要な 点を考慮して選別することもできる。誘導体化の効果は誘導体を所望の形態で（ 例えば、浸透圧ポンプ、あるいはより好ましくは注射や注入、もしくは経口、経 肺、あるいはその他の投与経路用に更に製剤した形態で）投与して確認し、その 効果を決定することができる。 好適な水溶性ポリマーにはポリエチレングリコール、エチレングリコール／プ ロピレングリコールのコポリマー、カルボキシルメチルセルロース、デキストラ ン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラ ン、ポリ− １，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ 酸（ホモポリマーあるいはランダムコポリマー）およびデキストランもしくはポ リ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコー ルホモポリマー、プロリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイド共重合体、 ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコー ルやこれらの混合物であるが、もとよりこれに限定されるものでは無い。ポリエ チレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であることから製造に有 利である。 ポリマーはいずれの分子量でも、また分枝状態でも非分枝状態でもかまわない 。ポリエチレングリコールにおいては、取り扱いならびに製造における容易性と いう観点から好ましい分子量はおよそ２ｋＤａからおよそ１００ｋＤａの間であ る（“およそ”という言葉はポリエチレングリコールの調製においては、記載の 分子量より大きな分子もあり、また小さな分子もあることを意味する）。その他 の分子量のものも、所望の治療様式によっては利用可能である（例えば、所望の 放出持続期間；もし有していれば、生物学的活性に対する作用；取り扱い易さ； 抗 原性の程度又は欠損、及び、ポリエチレングリコールの持つ治療用蛋白あるいは 変種に対する既知の作用がある）。 結合するポリマー分子の数は多様であるが、当業者は機能に及ぼすその影響を 確認することができる。一つはモノ誘導体化であり得、あるいは同一あるいは異 なる化学的部分を有するジ−、トリ−、テトラ、もしくはそれらを組みあわせた 誘導体化（例えば、異なる分子量のポリエチレングリコールの様なポリマー）を 提供することができる。蛋白分子に対する（あるいはペプチド分子に対する）ポ リマー分子の比率は、その反応混合液中での濃度が多様であることから様々であ る。一般的には、最適比率（反応効率に関して、過剰の未反応蛋白あるいはポリ マーが存在しないという点で最適）は誘導化の所望程度（例えばモノ−、ジ−、 トリ−、等）、選択したポリマーの分子量、ポリマーが分枝しているかいないか 、反応条件といった条件より決定される。 ポリエチレングリコール分子（もしくは他の化学的成分）は蛋白の機能性もし くは抗原性領域への影響を考慮しながら結合させなければならない。当業者が利 用可能な結合方法は多数ある。例えば、開示内容を本書に参考資料として採用し ている欧 州特許０４０１３８４（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへのカップリング）、またはＭａｌ ｉｋら．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０−：１０２８−１０３５，１９９２ （塩化トレシル(tresylchloride)を用いたＧＭ−ＣＳＦのペジル化(pegylatlon) を報告している）を参照。例えば、ポリエチレングリコールは遊離アミノ基もし くはカルボキシル基の様な反応性基を介してアミノ酸残基に共有結合的に結合で きる。反応性基は活性化されたポリエチレングリコール分子が結合できるもので ある。遊離アミノ基を持つアミノ酸残基にはリジン残基とＮ−末端アミノ酸残基 が含まれるだろう。遊離カルボキシル基を持つものにはアスパラギン酸残基、グ ルタミン酸残基、およびＣ−末端アミノ酸残基が含まれる。スルフィジル(sulfh ydrl)基もポリエチレングリコール分子と結合するための反応性基として利用す ることができる。治療の目的では、Ｎ−末端あるいリジン基における結合の様な アミノ基の結合が望ましい。受容体結合に重要な残基への結合は、受容体との結 合が必要な場合には避けなければならない。 特にＮ−末端を化学的に修飾した蛋白を望むこともできる。 ポリエチレングリコールを本書に示す様に用いる時には、様々 なポリエチレングリコール分子から使用する種類（分子量、分枝等）、混合液中 の蛋白（あるいはペプチド）分子とポリエチレングリコール分子の比率、実施す るペジル化の種類、選択されたＮ−末端がペジル化された蛋白の獲得方法を選択 することができる。Ｎ−末端がペジル化された調製物を得る方法（すなわち、他 のモノペジル化分子から必要に応じて本分子を分離する）は、ペジル化された蛋 白分子集団からＮ−末端がペジル化された分子を精製することで行われる。選択 的なＮ−末端の化学修飾は、特定蛋白の中の誘導体化に利用可能な異なる第一級 アミノ基（リジン対Ｎ−末端）の異なる反応性を活用する還元的アルキル化によ り実施できる。適当な反応条件下では、カルボキシル基を含むポリマーによる実 質的に選択的は蛋白のＮ−末端の誘導体化が達成できる。例えば、リジン残基の ｅ−アミノ基と蛋白のＮ−末端残基のａ−アミノ基の間のｐＫａ差が利用できる 様なｐＨ条件で反応を行うことで蛋白のＮ−末端を選択的ペジル化できる。この 様な選択的誘導体化により、水溶性ポリマーの蛋白質への結合を制御できる：ポ リマーによる結合は蛋白のＮ−末端に優先的に起き、リジン側鎖アミノ基の様な その他の反応性基には重大な修飾は起こさない。還元的アルキ ル化を用いる場合、水溶性ポリマーは上記記載の型であるが、蛋白への結合には 単反応性アルデヒドを利用すべきである。単反応性アルデヒドを含むポリエチレ ングリコールプロピオンアルデヒドが利用できるだろう。 本発明は、原核生物の発現するＧＤＥＦあるいはその変種であって、少なくと も１分子のポリエチレングリコールに結合している誘導体の使用、ならびに、ア シルあるいはアルキル結合を介して１つ以上のポリエチレングリコール分子に結 合しているＧＤＮＦとその変種の使用も意図する。 ペジル化は当業者に周知のいずれかのペジル化反応を用いて実施できる。例と しては：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３（２）：４−１ ０，１９９２；開示内容を本書に参考資料として採用しているＥＰ０１５４３１ ６；ＥＰ０４０１３８４；ならびにペジル化に関して本書に引用するその他の刊 公物を参照のこと。ペジル化は、反応性ポリエチレングリコール分子（あるいは 反応性水溶性ポリマー類似体）を用いるアシル化反応あるいはアルキル化反応を 介して行う。 アシル化によるペジル化には通常ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性エ ステル誘導体とＧＤＮＦ蛋白あるいはその 変種との反応が含まれる。ＧＤＮＦ蛋白質あるいはその変種のペジル化には、既 知あるいは今後発見される反応性ＰＥＧ分子のいずれも使用できる。好ましい活 性化ＰＥＧエステルはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化し たＰＥＧである。本書で使用する”アシル化”とは治療用蛋白とＰＥＧの様な水 溶性ポリマー間のアミド、カルバメート、ウレタン等の結合を含むが、もとより これに限定されない。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：１３３−１ ４０、１９９４を参照。反応条件は既知のペジル化法のいずれか、あるいは今後 開発されるペジル化法のいずれかから選択できるが、温度、溶媒、ｐＨについて は修飾するＧＤＮＦあるいはその変種が不活性化されるような条件は避けなけれ ばならない。 アシル化によるペジル化では普通にはポリペジル化されたＧＤＮＦ蛋白質もし くは変種ができる。好ましい連結結合はアミドである。また好ましくは、得られ た産物は実質的（例えば、＞９５％）にはモノ、ジ−、あるいはトリペジル化産 物だけである。しかし、反応条件によって量は異なるがよりペジル化されたもの もできる。必要であれば、より精製度の高いペジル化した種類を混合体、特に未 反応のものから、透析、塩析、限外 濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーや電気泳動 等を含む、標準的な精製技術を用いて分離することもできる。 アルキル化によるペジルには通常還元剤存在下にＰＥＧの末端アルデヒド誘導 体とＧＤＮＦ蛋白あるいはその変種との反応が含まれる。アルキル化によるペジ ル化もまたポリペジル化したＧＤＮＦ蛋白あるいは変種を産生する。さらに反応 条件を調整することでＧＤＮＦ蛋白あるいは変種のＮ−末端のａ−アミノ基だけ を実質的にペジル化することもできる（すなわちモノペジル化蛋白）。モノペジ ル化あるいはポリペジル化のいずれの場合でも、ＰＥＧ基はＣＨ２−ＮＨ−基を 介して蛋白に結合することが好ましい。特に−ＣＨ２−基を介した結合を本書で は“アルキル”結合と言う。 還元的アルキル化を介した誘導体化により、誘導体化に利用できる様々なタイ プの第一級アミノ基（リジン対Ｎ−末端）の持つ様々な反応性を利用して、モノ ペジル化産物を生成できる。反応はリジン基のｅ−アミノ基と蛋白質のＮ−末端 残基のａ−アミノ基の間のｐＫａ差を利用できるｐＨで実施する。この選択的誘 導体化により、アルデヒドの様な反応性基を含む水溶性 ポリマーの蛋白への結合を制御することができる：ポリマーとの結合は蛋白のＮ −末端で主に起き、その他のリジン側鎖アミノ基の様な反応性基には重大な修飾 は生じない。重要な観点は、本発明にはモノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白質（あるい は変種）結合分子の実施的に均一な調製物の使用が意図される点である（ポリマ ー分子が実施的には（例えば＞９５％）一カ所に結合しているＧＤＥＦ蛋白ある いその変種を意味する）。より詳細には、ポリエチレングリコールを使用する場 合には、本発明はまた抗原性結合基と思われるものを欠き、ＧＤＮＦ蛋白あるい は変種と直接結合したポリエチレングリコール分子を有するペジル化したＧＤＮ Ｆ蛋白質あるいは変種の使用も包含している。 すなわち、本発明によるＧＤＮＦ蛋白産物にはペジル化ＧＤＮＦ蛋白あるいは 変種が含まれており、ＰＥＧ基はアシル基あるいはアルキル基を介して結合する 。上記の如く、これらの産物はモノペジル化あるいはポリペジル化（例えば、２ −６、好ましくは２−５のＰＥＧ基を含む）されていて良い。ＰＥＧ基は一般に は蛋白質にアミノ酸のａ−あるいはｅ−アミノ基の位置で結合しているが、適当 な条件下においてＰＥＧ基に結合できるに十分な反応性を有している蛋白結合ア ミノ基であれば、 いずれのアミノ基にもＰＥＧは結合できる。 アシル化ならびにアルキル化による方法で用いたポリマー分子は上記の水溶性 ポリマーの中から選択できる。選択したポリマーは、アシル化の為の活性化エス テルやアルキル化の為のアルデヒドの様な単一の反応性基を持たせ、好ましくは 重合の程度を本方法に示す様に制御できる様に修飾すべきである。典型的な反応 性ＰＥＧアルデヒドは水に安定であるポリエチレングリコールプロピオンアルデ ヒドか、そのモノＣ１−Ｃ１０アルキルもしくはアリールオキシ誘導体である（ 米国特許５，２５２，７１４を参照）。ポリマーは分枝型でも未分枝型でもよい 。アシル化反応の場合には、単反応性エステル基を持ったポリマー選択しなけれ ばならない。本発明の還元的アルキル化の場合には、単一活性アルデヒド基を持 ったポリマーでなければならない。一般には水溶性ポリマーは天然のグリコシル 残基から選択されることはない。それは哺乳動物組換体発現系を利用してより簡 単に作ることができるからである。該ポリマーの分子量はいずれのものでもよく 、また分枝していても分枝していなくともよい。 本例に使用できる代表的な水溶性ポリマーはポリエチレング リコールである。本例で使用する如く、ポリエチレングリコールはモノ−（Ｃ１ −Ｃ１０）アルコキシ−あるいはアリールオキシポリエチレングリコールの様な 他の蛋白質の誘導体化に使用されるあらゆる型のＰＥＧも包含している。 一般的には、生物学的に活性な物質を活性化ポリマー分子と反応させるのに使 用される任意の適当な条件下で化学的誘導体化を行うことができる。ペジル化Ｇ ＤＮＦ蛋白産物の調製方法は一般的には（ａ）ＧＤＮＦ蛋白産物をポリエチレン グリコール（例えばＰＥＧの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体）と、蛋 白が１つ以上のＰＥＧ基に結合する条件下で反応させる工程、（ｂ）反応産物を 回収する工程から成っている。通常、アシル化反応の至適反応条件はケースバイ ケースで既知のパラメータと望む結果を基に決められる。例えば、ＰＥＧ：蛋白 比が大きくなると、ポリペジル化産物の量が多くなる。 還元的アルキル化を利用した実質的に均一なモノ−ポリマー／ＧＤＮＦ蛋白産 物の集団の作成は一般的には以下の：（ａ）ＧＤＮＦ蛋白あるいはその変種を反 応性のＰＥＧ分子と還元的アルキル化条件下に、該ＧＤＮＦ蛋白あるいは変種の アミノ末端にあるａ−アミノ基を選択的に修飾するのに好適なｐＨで反 応させる工程；と（ｂ）反応産物を回収する工程からなる。 実質的に均一なモノ−ポリマー／ＧＤＮＦ蛋白産物の集団の場合、還元的アル キル化反応条件では水溶性ポリマー分子はＧＤＮＦ蛋白あるいは変種に選択的に 結合する。この様な反応条件では通常リジンアミノ基とＮ−末端のａ−アミノ基 のｐＫａの間に差が生じる（ｐＫａとはアミノ基の５０％がプロトン化し、残り の５０％はプロトン化していないｐＨである）。ｐＨもまた使用するポリマーと 蛋白の割合に影響を与える。一般的にはｐＨが低い程、蛋白に対するポリマーの 割合が大きくなることが求められる（すなわちＮ−末端のａ−アミノ基の反応性 が低い程、至適条件に必要なポリマー量が多くなる）。ｐＨが高い場合には大き なポリマー／蛋白比は必要なくなる（すなわち、より強い反応性基が利用できる ので、より少ないポリマー分子しか必要なくなる）。本発明の目的に適したｐＨ は、一般には３−９の間であり、好ましくは３−６である。 その他の重要な点はポリマーの分子量である。一般には、ポリマーの分子量が 大きいほど蛋白に結合するポリマーの数は少なくなる。同様にポリマーの分枝も これらのパラメータを最適化する場合考慮に入れなくてはならない。一般的には 、分子量 が大きいほど（あるいはより多くの枝をもっているほど）、ポリマー：蛋白の比 は大きくなる。一般には、本発明におけるペジル化反応では、好ましい平均分子 量はおよそ２ｋＤａからおよそ１００ｋＤａである。好ましい平均分子量はおよ そ５ｋＤａからおよそ５０ｋＤａであり、特に好ましくはおよそ１２ｋＤａから およそ２５ｋＤａである。ＧＤＮＦ蛋白あるいは変種に対する水溶性ポリマーの 比は通常は１：１から１００：１であり、好ましくは（ポリペジル化については ）１：１から２０：１と（モノペジル化については）１：１から５：１である。 上記の条件下で還元的にアルキル化すると、アミノ末端にａ−アミノ基を持つ ＧＤＮＦ蛋白あるいは変種にポリマーを選択的に結合させることができ、実質的 に均一なモノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（あるいは変種）結合体の調製物を得るこ とができる。本明細書における“モノポリマー／ＧＤＮＦ蛋白（あるいは変種） 結合体”という言葉は、ＧＤＮＦ蛋白あるいはＧＤＮＦ変種蛋白分子に単一のポ リマー分子が結合したものから成る成分を意味する。モノポリマー／ＧＤＮＦ蛋 白（あるいは変種）結合体は典型例ではポリマーはＮ末端に局在するがリ ジンアミノ側鎖基には存在しない。該調製物は一般的には９０％以上がモノポリ マー／ＧＤＮＦ蛋白（又は変種）結合体であり、通常は９５％以上がモノポリマ ー／ＧＤＮＦ蛋白（又は変種）結合体であり、観察される残りの分子は未反応の ものである（すなわちポリマー分子を持たない蛋白）。ＧＤＮＦ蛋白産物は２種 類のＧＤＮＦモノマーが非ペプチド性の重合スペーサーを用いて結合して２量体 分子の分子間結合を形成するペジル化分子の調製方法も本発明の範囲である。例 えば、２つのＧＤＮＦ分子は、非天然又は天然のシステイン残基、例えば各々天 然のＣｙｓ¹⁰¹アミノ酸残基において、開示内容を本書に参考資料として採用し たＷＯ９２／１６２２１（Ｔｈｏｍｐｓｏｎらの国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２ ／０２１２２）記載のＰＥＧ成分を用いて結合できる。 本発明の還元的アルキル化では、還元剤は水溶液において安定していなければ ならず、還元的アルキル化の初期の工程で形成されるシッフ塩基だけを還元し得 るものが好ましい。好適な還元剤はホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナ トリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピリジンボランか ら選択できる。特に好ましい還元剤はシアノホウ水素化 ナトリウムである。その他の、溶媒や反応時間、温度等の反応パラメータと産物 の精製方法は、水溶性ポリマーを用いた蛋白質の誘導体化と関連した刊行物に基 づいて状況に応じて決めることができる（本書引用資料を参照）。 Ｃ．ＧＤＮＦ蛋白産物の医薬組成物 ＧＤＮＦ蛋白産物医薬組成物は、典型的には治療効果的あるいは予防効果的に 十分な量のＧＤＮＦ蛋白産物を、投与方法に適合する様に選ばれた１つ以上の医 薬的および生理学的に受容可能な製剤材料との混合物として含有する。好適な製 剤材料には、もとよりこれに限定されるものではないが、抗酸化剤、保存剤、着 色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、充てん剤、増量剤、緩衝剤、デ リバリービヒクル、希釈液、賦形剤及び／又は医薬用アジュバントがある。例え ば、好適なビヒクルとしては注射する場合では水、生理食塩水溶液、人工ＣＳＦ があり、その他の非経口投与用組成物に共通の成分を補給することもできる。中 性緩衝食塩水又は血清アルブミンと混合した食塩水はビヒクルの更なる例である 。本明細書で使用する「医薬的に受容可能な担体」又は「生理学的に受容可能な 担体」という用語は、医薬組成物としてのＧＤＮＦ蛋白産物のデリバリーを行う 又は 増強するのに適した製剤材料を意味する。 ビヒクル中の一次溶媒は水性あるいは非水性いずれでもよい。さらに、ビヒク ルには、製剤のｐＨや浸透圧、粘度、透明度、色彩、無菌性、安定性、溶解速度 、あるいはにおいを改良したり維持したりするために、他の医薬として受容でき る賦形剤を含むことができる。同様にビヒクルには別種の医薬として受容可能な 賦形剤を、ＧＤＮＦ蛋白産物の放出速度を改良あるいは維持するために、あるい はＧＤＮＦ蛋白産物の血液−脳関門を通過して吸収又は浸透するのを促進するた めに、含ませることもできる。 治療用組成物を製剤した後には、無菌のバイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エ マルション、固体、あるいは脱水もしくは凍結乾燥した粉末として保存すること ができる。このような製剤はまたそのまま使用できる形態、又は凍結乾燥状態の 様な投与前に再調製する必要のある形態で保存できる。 当業者は医薬として最適な製剤を投与経路や所望の用量から決めることができ る。例えば開示内容を本書中に参考資料として採用しているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（ １９９０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１８０４２）の １４３５−１７１２ページを参照せよ。この様な組成物は本発明の蛋白とその誘 導体の物理的状態、安定性、生体内放出速度、ならびに生体内排泄速度に影響し てくるだろう。 その他に、（１）徐放性製剤、（２）吸入噴霧、あるいは（３）経口活性製剤 等も有効な投与形態として考慮される。ＧＤＮＦ蛋白産物医薬組成物は非経口投 与として処方することができる。この様な非経口投与される治療用組成物は通常 は、医薬的に受容可能なビヒクル中にＧＤＮＦ蛋白産物を含む発熱原不含有の非 経口的に受容可能な水溶液の形をとる。好ましいビヒクルの１つは生理食塩水で ある。ＧＤＮＦ蛋白産物医薬組成物はまたポリ乳酸やポリグリコール酸等の重合 体化合物の粒状調製物を包含し、あるいはリポソームに入れることができる。ヒ アルロン酸も利用でき、これは循環期間の持続促進に効果を示す。 非経口注射に特に好適なビヒクルは滅菌蒸留水で、この中にＧＤＮＦ蛋白産物 を無菌の等張液として処方し、適切に保存する。その他の調剤にはＧＤＮＦ蛋白 産物を注射可能なミクロスフェアあるいはリポソームの様なものと製剤し、デポ 剤注射 としてデリバリーされる蛋白をゆっくり放出させたり持続的に放出させることも できる。その他の好適なＧＤＮＦ蛋白産物の投与方法としては、ＧＤＮＦ蛋白産 物を含むインプラント可能な薬剤デリバリー装置がある。 本発明の調剤には、例えば非経口的に受容可能な保存剤、緊張剤、共溶媒、湿 潤剤、複合剤、緩衝剤、抗菌剤、酸化防止剤、ならびに表面活性剤やその他当業 者公知のものを含むことができる。例えば、好適な緊張増強剤としてはアルカリ 金属ハロゲン化物（塩化ナトリウムあるいは塩化カリウムが好ましい）、マンニ トール、ソルビトール等がある。好適な保存剤としては塩化ベンザルコニウム、 チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ク ロロヘキシジン、ソルビン酸等があるが、これに限定されるものではない。過酸 化水素もまた保存剤として利用できる。好適な共溶媒の例としては、グリセリン 、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールがある。好適な複合剤(compl exing agents)の例にはカフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキス トリンあるいはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンがある。好適な表 面活性剤あるいは湿潤剤にはソルビタンエステル、ポリソル ベート８０の様なポリソルベート類、トルメタミン、レシチン、コレステロール 、チロキサパル等がある。緩衝剤はホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩 あるいはＴｒｉｓ−ＨＣｌの様な通常の緩衝剤が利用できる。 製剤成分は投与部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝剤を用いて該 組成物を生理的ｐＨあるいは若干低めのｐＨ、通常はおよそ５からおよそ８の間 にｐＨを維持する。 医薬組成物は吸入剤としても処方できる。例えばＧＤＮＦ蛋白産物を吸入用の 乾燥粉末に処方できる。ＧＤＮＦ蛋白産物吸入溶液はエーロゾルデリバリー用の 溶液状プロペラント中に処方することもできる。その他製剤形態で溶液を噴霧す ることもできる。 ＧＤＮＦ蛋白産物を含む特定の製剤を経口的に投与することもできる。この方 法で投与されるＧＤＮＦ蛋白産物は、錠剤やカプセルの様な固形投与形態の構成 に通常使用される担体を用いて、又は用いずに処方される。例えばカプセルは製 剤中の活性成分が胃腸管で放出される様に設計され、生物有効性を最大化し全身 へ移行前の分解を最小にする。その他の賦形剤として、ＧＤＮＦ蛋白産物の吸収 を促進させるものを含有することが できる。希釈液、香味剤、低融点蝋、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、結 合剤も利用できる。 その他の調製法は、効果的な量のＧＤＮＦ蛋白産物を錠剤製造に適する無毒の 賦形剤と共に混合したものがある。錠剤を滅菌水あるいは他の適当なビヒクルで 溶解し、溶液を単位用量の形に調製する。好適な賦形剤としては、炭酸カルシウ ムや炭酸ナトリウム、あるいは重炭酸ナトリウム、乳糖、もしくはリン酸カルシ ウムの様な不活性希釈液；あるいはデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴム の様な結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸あるいはタル クの様な潤滑剤があるが、もとよりこれに限定されるものではない。 Ｄ．ＧＤＮＦ蛋白産物の投与 ＧＤＮＦ蛋白産物は皮下、筋肉内、静脈内、経肺的、経皮的、髄腔内あるいは 脳内経路により投与できる。さらに血液脳関門を通過しない蛋白成長因子を直接 脳内に投与するか、あるいは該関門を通過させる他のエレメントとともに投与す ることができる。例えばＧＤＮＦ蛋白産物を脳室内投与あるいは脳内あるいは脊 髄クモ膜下に投与できる。ＧＤＮＦ蛋白産物はまた脳内の脳実質内に直接投与す ることもできる。ＧＤＮＦ蛋白産物は 血液脳関門を通過できる形に化学的に修飾されたり包剤化されるか、該関門のＧ ＤＮＦ蛋白産物の通過を促進する１種類以上の成分と共に脳外投与することもで きる。例えば、ＮＧＦとモノクローナル抗トランスフェリン受容体抗体を結合し たものは、トランスフェリン受容体への結合を介して脳に運搬されることが示さ れている。 ＧＤＮＦ蛋白産物の所望の用量を得るためには、ＧＤＮＦ蛋白産物を毎日ある いはそれより低い頻度で注射するか、ＧＤＮＦ蛋白産物を連続的あるいは定期的 に一定あるいはプログラム可能な埋め込み型フローポンプを利用して注入するこ ともできる。生体分解性ポリマーマトリックスで包埋した神経栄養因子を含む徐 放性インプラントを利用してＧＤＮＦ蛋白産物をデリバリーすることもできる。 投与の頻度は製剤としてのＧＤＮＦ蛋白産物の薬力学パラメータや投与経路によ り決まる。 投与方法とは無関係に、特定用量は体重、体表面積、あるいは器官の大きさか ら計算できる。上記の各製剤を用いた治療に適当な用量を決定するには、さらに 細かい計算が必要であるが、当業者は過度の実験をすることなく日常的に決定し ており、特に本書中に開示した用量情報とアッセー方法を参考にすれば容 易である。適当な用量は、適当な用量−反応データを利用した確立した用量決定 方法を利用して確めることができる。 上記記載の状態の治療法での最終用量計画は担当医により、薬物の作用を変え てしまう様々な因子、例えば患者の年齢、状態、体重、性別や食事、感染の重症 度、投与時間やその他の臨床因子を考慮しながら決定される。研究の進行により 、様々な疾患や症状に対する治療にとって適当な用量に関するさらなる情報が得 られるだろう。 ＧＤＮＦの連続投与あるいは持続的デリバリーは特定の治療には有用である。 連続投与は注入ポンプの様な機械的方法により可能となるが、その他の連続ある いは連続に近い状態の投与も実施できる。例えば、化学的に誘導体化あるいはカ プセル化して該蛋白を持続的に放出される形にして、血流中に決定した投与計画 より予想さえる量が持続して存在する様にできる。すなわち、ＧＤＮＦ蛋白産物 は誘導体化された蛋白を含むか、あるいは連続的投与に効果的な形に製剤する。 ＧＤＮＦ蛋白産物の持続放出形態は望まれる効果的な１日用量あるいは１週間用 量が提供される様に処方される。 ＧＤＮＦ蛋白産物の細胞治療、例えばＧＤＮＦ蛋白産物を産 生する細胞を脳内に移植する様な治療も包含される。この様な実施態様には、生 物学的に活性なＧＤＮＦ蛋白産物を合成し分泌できる細胞を患者に移植すること も含まれる。この様なＧＤＮＦ蛋白産物産生細胞はＧＤＮＦ蛋白産物の天然の生 産細胞（Ｂ４９神経膠芽腫細胞の類似細胞）か、所望のＧＤＮＦ蛋白産物をコー ドする遺伝子で形質転換されてＧＤＮＦ蛋白産物の産生能が増強された組換体細 胞である。この様な形質転換は遺伝子デリバリーならびに発現と分泌の促進に適 したベクターを用いて実施できる。異種のＧＤＮＦ蛋白産物が投与された患者で の免疫反応を最小限にするためには、ＧＤＮＦ蛋白産物を産生するヒト由来の天 然の細胞でヒト型ＧＤＮＦ蛋白産物を産生するものが好ましい。同様に、ヒト型 ＧＤＮＦ蛋白産物をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されたＧＤ ＮＦ蛋白産物産生組換体細胞が好ましい。移植細胞はカプセル化することで周囲 組織への浸潤を避けることができるだろう。ヒトあるいはヒト以外の動物細胞は 、生体適合性を有し且つＧＤＮＦ蛋白産物は放出できるが、患者の免疫系や周囲 の組織からの有害因子による細胞の破壊を防止できる半透過性の重合閉鎖物ある いは膜に包んで患者に移植することができる。あるいは患者 自身の細胞をＧＤＮＦ蛋白産物を産生する様に生体外で形質転換し、上記の様な カプセル化しないで直接患者体内に移植することもできる。 生体内でのＧＤＮＦ蛋白産物遺伝子治療もまた本発明の範囲であり、ＧＤＮＦ 蛋白産物をコードする遺伝子を、標的細胞に核酸構築物又は適当なデリバリーベ クターを局所注射して導入する。（Ｈｅｆｔｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２ ５：１４１８−１４３５，１９９４）。例えばＧＤＮＦ蛋白産物をコードする核 酸配列はアデノ随伴ウイルスベクターに含ませて標的細胞にデリバリーすること ができる。他のウイルスベクターには、レテロウイルス、アデノウイルス、単純 ヘルペスウイルス、パピローアウイルスベクターがあるが、もとよりこれに限定 されない。生体内ならびに生体外での物理的な転送も、リポソーム介在転送や直 接注射する方法（裸のＤＮＡ）、受容体を介した転送（リガンドＤＮＡ複合体） 、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法あるいは微粒子爆撃法（遺 伝子銃）により実施できる。 生きている細胞を膜でカプセル化する方法は当業者に周知であり、こうしたカ プセル化細胞の調製や患者への移植も過度の 実験なしに実施することができる。本書に参考資料として採用している米国特許 番号４，８９２，５３８号，５，０１１，４７２号ならびに５，１０６，６２７ 号を参照のこと。生きている細胞をカプセル化する系については、本書に参考資 料として採用したＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４２５に記 載されている。また本書に参考資料として採用したＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣ Ｔ出願ＷＯ９１／１０４７０、Ｗｉｎｎら．，のＥｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．， １１３：３２２−３２９、１９９１、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎ ｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５、１９９１；Ｔｒｅｓｃｏら．，ＡＳＡ ＩＯ、３８：１７−２３、１９９２も参照のこと。リポソーム担体、生体分解性 粒子あるいはビーズやデポ注射剤といった様々な他の持続性あるいは制御された デリバリー方法による製剤技術についても当業者には公知である。 ＧＤＮＦ蛋白産物を、相同的組換体により、あるいは、既にＧＤＮＦをコード するＤＮＡを含んでいる細胞に導入した制御エレメントを用いた組換体作成法に より生成することもできるだろう。例えば相同的組換体技術を利用することで、 通常は転写活性がサイレントあるいは低発現状態にあるＧＤＮＦ遺伝子 を持つ細胞を修飾して、ＧＤＮＦを発現する細胞にすることができる。相同的組 換体技術は元々は標的遺伝子を転写活性を有する遺伝子内に誘導するか、あるい は突然変異を補正するために開発された（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ．Ｐｒｏｇ ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．とＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１（１ ９８９））。基本的技術は哺乳動物遺伝子の特定領域に特定の突然変異を導入す る方法として（Ｔｈｏｍａｓら．，Ｃｅｌｌ．４４：４１９−４２８，１９８６ ；ＴｈｏｍａｓとＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ．５１：５０３−５１２，１９８ ７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５ ：８５８３−８５８７，１９８８）、あるいは欠陥遺伝子内の特定突然変異を補 正する技術として（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら．，Ｎａｔｕｒｅ．３３０：５７６ −５７８．１９８７）開発された。相同的組み替え技術の例は本書で参考資料と して採用している米国５，２７２，０７１（ＥＰ９１９０３０５１，ＥＰ公開番 号５０５５００；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２，国際公開番号ＷＯ９１／０９ ９５５）に記載されている。 相同的組み替えにより、ゲノムに挿入するＤＮＡ配列を標的 ＤＮＡに結合させることで、目的の特定遺伝子領域に直接向けることができる。 標的ＤＮＡはゲノムＤＮＡのある領域に相補的（相同）であるＤＮＡである。ゲ ノムの特定領域に相補的な標的ＤＮＡの小片をＤＮＡ複製時期の間に親鎖に接触 させる。細胞内に入れられたＤＮＡはＤＮＡの一般的な性質として相同領域を共 通に持つ内因性のＤＮＡ片とハイブリダイズし、その結果組み替えが起きる。こ の相補鎖が突然変異あるいは異なるＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドと結合 すると、これは組み替えの結果として新しく合成された鎖にも取り込まれる。校 正機能の結果、新しいＤＮＡの配列が鋳型として機能する可能性もある。こうし て転移されたＤＮＡはゲノムに取り込まれる。 特定の遺伝子の配列がＧＤＮＦの核酸配列やプレープロ配列あるいは発現制御 配列の様に既知の場合、選択した遺伝子領域に相補的なＤＮＡ片は合成すること ができ、あるいは、例えば、天然ＤＮＡを問題の領域に結合する特定な認識部位 で適当に制限して得ることができる。このＤＮＡ片を標的配列として細胞内に挿 入すると、ゲノム内の相同域とハイブリダズする。ＤＮＡ複製時にハイブリダイ ズが起きると、このＤＮＡ片とそれに結合した任意の付加的配列はＯｋａｚａｋ ｉ断片として働 き、新しく合成されたＤＮＡの嬢鎖中に取り込まれる。 結合が起きた標的ＤＮＡ片はＧＤＮＦ蛋白の発現に影響するＤＮＡ領域である 。例えばプロモーター／エンハンサーエレメント、やサプレッサー、もしくは外 因性転写変調エレメントが、目的の宿主細胞のゲノム中に、所望のＧＤＮＦ蛋白 産物をコードするＤＮＡの転写に作用するのに十分近い距離と方向に挿入される 。制御エレメント(control element)はＧＤＮＦをコードしていないが、その代 わりに宿主細胞ゲノム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。したがってＧＤＮ Ｆ蛋白の発現はＧＤＮＦ遺伝子そのものをコードするＤＮＡのトランスフェクシ ョンでは達成できず、むしろ標的ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子に相補的な配列を 含む）にＧＤＮＦ蛋白の転写についての認識可能シグナルを有する内因性遺伝子 配列を提供するＤＮＡ調節断片を結合させたものを利用することで達成できる。 本明細書に記載したＧＤＮＦ蛋白産物製剤は動物及びヒトへの適用が可能であ るが、“患者”という言葉は限定的に使用してはならない。動物への応用の場合 には、用量域は上記に同じである。 本発明の他の観点ならびに優位点については以下の実施例を 考慮することで理解されるだろう。実施例１ではＧＤＮＦ蛋白産物をキノリン酸 を線状体内に注射した結果神経細胞が消失した例に作用させた。 実施例 実施例１ 線状体ならびに皮質の選択的神経細胞消失例に対するＧＤＮＦ蛋白産物の作用 本実験では、体重２００−２２５ｇの成熟雄ラットＦ３４４を２．５％イソフ ラン＋Ｏ₂で麻酔し、ｋｏｐｆ固定フレーム内に配置して麻酔を持続した。これ らの動物に一方の側部からの脳室内注射（ＩＣＶ）によりｒｈＧＤＮＦ（用量１ ００μｇ／４μｌ）あるいはビヒクル（４μｌのリン酸緩衝生理食塩水）を５分 間かけて右側部脳室に２６ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いて投与した。 Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器はさらに除去前にその場所に５分間置いた。注射は前頂 部を基軸に位置決めした：硬膜下３．５ｍｍの深さでＡＰ−０．８、ＭＬ−１． ５に行った。１時間後にキノリン酸（用量１２０ｎｍｏｌ／４μｌ）を２６ゲー ジＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いて５分間かけて線状体内に投与した。Ｈａｍｉ ｌｔｏｎ注射器は除去する 前にさらに５分間その場所に置いた。注射は頭頂部を基軸に位置決めした：硬膜 下４．５ｍｍの深さでＡＰ−０．３，ＭＬ−３．０に行った。動物は傷クリップ で皮膚を縫合して回復させた。 キノリン酸投与後１４日目にラットはナトリウムペントバルビトン（５５ｍｇ ／ｋｇ腹腔内投与）で麻酔し、リン酸で緩衝作用を持たせたフオルマリン溶液を 経心臓的に灌流する。脳を取り出し、同じ固定液に２４時間浸して固定する。そ れから脳を脱水し、パラフィンに包埋して５μｍ厚で冠状切片を作成してＮｉｓ ｓｌ染色した。生存細胞数は両側で、線状体（ハッチド領域）、頭頂皮質（ＰＣ ）ならびに前頭部皮質（ＦＣ）について測定した。これらの領域のおおよその位 置を図１の脳断面図に示す。図１中の（Ｌ）と記した領域は障害部位であり、図 １中に（Ｔ）と記した領域は移行域である。サンプリングはＭｅｔｈｏｄｓ ｉ ｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，７：２８−３８，１９９１、Ｌｅｓｉｓｏｎｓ ａｎ ｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｃｏｎｎ編中のＲｏｂｅｒｔｓの”Ｅｘ ｃｉｔｏｔｏｘｉｎ−Ｌｅｓｉｏｎｅｄ Ｒａｔ Ｓｔｒａｔｕｍ”に従って実 施した。 キノリン酸の線状体への注射により線状体と皮質の神経細胞が選択的に消失し た。前頭ならびに頭頂皮質の生存神経細胞数を図２Ａと２Ｂに示す。組織学的実 験では、ＩＣＶ ｒｈＧＤＮＦにより有意に（ｐ＜０．０１、スチューデントの ｔ−試験）皮質（頭頂ならびに前頭の両方）におけるキノリン酸の線状体注入に より誘導される神経細胞の消失が、担体だけを処置した動物に比べて減少した（ 図２Ａと２Ｂを参照）。線状体中の生存神経細胞数を図３に示す。 キノリン酸は大きく線状体の細胞消失を引き起こすが、消失細胞数はｒｈＧＤ ＮＦのＩＣＶ投与により軽減した。 これらの結果は、ｒｈＧＤＮＦがキノリン酸により誘導された皮質と線状体中 の神経細胞の消失を軽減することを示している。ｒｈＧＤＮＦのこの作用は、Ｇ ＤＮＦ蛋白産物の治療的利用をＮＭＤＡ受容体アゴニスト介在型細胞死を伴うハ ンチントン病の様な神経変性疾患の治療への適用まで広げる。 当業者が上記の本発明の好適な実施態様を考慮することで、本発明の実施につ いて様々な改良ならび変更を行うことが期待される。従って、本発明の範囲は付 記した請求項にのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産物の有効量を、Ｎ−メ チル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アゴニスト介在神経細胞死に罹患 した患者に投与することから成る、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ ）受容体アゴニスト介在神経細胞死を減少させる方法。 ２．該神経細胞死がハンチントン病に関連するものである請求項１記載の方法。 ３．ＧＤＮＦ蛋白産物が配列番号１記載のアミノ酸配列あるいはその変種もしく はその誘導体である請求項１記載の方法。 ４．ＧＤＮＦ蛋白産物が配列番号１記載のアミノ酸配列を有する請求項３記載の 方法。 ５．ＧＤＮＦ蛋白産物が［Ｍｅｔ^-1］ＧＤＮＦである請求項３記載の方法。 ６．誘導体が水溶性ポリマーを含む請求項３記載の方法。 ７．水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである請求項６記載の方法。 ８．ＧＤＮＦ蛋白産物をおよそ１０μｇ／ｋｇ／日から１００ ｍｇ／ｋｇ／日の間の用量で投与する請求項１記載の方法。 ９．ＧＤＮＦ蛋白産物をおよそ１ｍｇ／ｋｇ／日から２５ｍｇ／ｋｇ／日の間の 用量で投与する請求項１記載の方法。 １０．Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アゴニスト介在神経 細胞死の治療用の医薬組成物を製造するための、グリア細胞系由来神経栄養因子 （ＧＤＮＦ）蛋白産物の使用。 １１．該神経細胞死がハンチントン病に関連するものである請求項１０記載の使 用。 １２．ＧＤＮＦ蛋白産物が配列番号１記載のアミノ酸配列あるいはその変種もし くはその誘導体である請求項１０記載の使用。 １３．ＧＤＮＦ蛋白産物が配列番号１記載のアミノ酸配列を有する請求項１２記 載の使用。 １４．ＧＤＮＦ蛋白産物が［Ｍｅｔ^-1］ＧＤＮＦである請求項１２記載の使用。 １５．誘導体が水溶性ポリマーを含む請求項１２記載の使用。 １６．水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである請求項１５記載の使用。 １７．ＧＤＮＦ蛋白産物をおよそ１０μｇ／ｋｇ／日から １００ｍｇ／ｋｇ／日の間の用量で投与する請求項１０記載の使用。 １８．ＧＤＮＦ蛋白産物をおよそ１ｍｇ／ｋｇ／日から２５ｍｇ／ｋｇ／日の間 の用量で投与する請求項１０記載の使用。 １９．ハンチントン病に関連する神経細胞死の治療用の医薬組成物を製造するた めの、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）蛋白産物の使用。 ２０．ＧＤＮＦ蛋白産物が［Ｍｅｔ^-1］ＧＤＮＦである請求項１９記載の使用。 ２１．ＧＤＮＦ蛋白産物が、ＧＤＮＦ蛋白産物を産生し且つ分泌するように修飾 された細胞を用いる細胞治療あるいは遺伝子治療により投与される請求項１０又 は１９に記載の使用。 ２２．生体外で修飾された細胞を用いる請求項２１記載の使用。 ２３．生体内で修飾された細胞を用いる請求項２１記載の使用。