JP4469500B2 - 神経栄養成長因子 - Google Patents
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Description
(技術分野)
本発明は、神経栄養因子、ならびに特に本明細書において「エノビン(enovin)」(EVN)と命名された、神経栄養因子のGDNFファミリーの新規メンバーのクローニングおよび発現に関する。
【0002】
序論
神経栄養因子は、ニューロンの分化、発達および維持に関与している。これらのタンパク質は、種々のタイプのニューロン細胞の退化を防ぎ、そして生存を促進することができ、かくして神経変性疾患のための潜在的な治療剤である。グリア細胞系由来の神経栄養因子(GDNF)は、ニューロトロフィン(neurotrophin)とは構造的に異なる神経栄養因子の増えつつあるサブファミリーの最初のメンバーであった。GDNFは、成長因子のトランスフォーミング成長因子β(TGF−β)サブファミリーのメンバーであって、アミノ酸配列内に7個の高度に保存されたシステイン残基の特異的パターンを特徴とする(Kingsley,1994)。GDNFは、本来は、イン・ビトロでの胚性腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存および機能を維持するその能力に基づくアッセイを用いて精製された(Lin et al.,1993)。また、中枢(CNS)もしくは末梢神経系(PNS)における他のニューロン細胞タイプは、GDNFの生存効果に応答する(Henderson et al.,1994,Buj−Bello et al.,1995,Mount et al.,1995,Oppenheim et al.,1995)。GDNFは、不活性なプロフォームにおいて細胞によって生産され、これが、RXXRフリン(furin)認識部位において特異的に切断されて活性(成熟)GDNFを生成する(Lin et al.,1993)。GDNFの外因性投与は、パーキンソン病、脳の黒質におけるドーパミン作動性細胞の70%までの損失を特徴とする普通の神経変性障害、の動物モデルにおいて強力な神経保護効果を有する(Beck et al.,1995,Tomac et al.,1995,Gash et al.,1996,Choi−Lundberg et al.,1997,Bilang−Bleuel et al.,1997)。
【0003】
近年、GDNFファミリーのさらなる神経栄養因子が発見された。ニュールツリン(neurturin)(NTN)は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から、培養における交感ニューロンのその生存促進能に基づくアッセイを用いて順化培地より精製された(Kotzbauer et al.,1996)。成熟NTNタンパク質は、成熟GDNFに57%類似している。ペルセフィン(persephin)(PSP)は、鋳型としてゲノムDNAを用いて退化プライマーPCRを使用するクローニングによって発見された。成熟PSPは、成熟GDNF同様、培養において腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンおよび運動ニューロンの生存を促進する(Milbrandt et al.,1998)。成熟GDNFおよびNTNと成熟PSPタンパク質の類似性は、ほぼ50%である。アルテミン(artemin)(ARTN)は、DNAデータベース検索によって発見され、そして培養における感覚および交感ニューロンの生存因子である(Baloh et al.,1998b)。
【0004】
GDNF、NTN、PSPおよびARTNは、下流の細胞内シグナル伝達を実施するためにヘテロ二量体の受容体複合体を必要とする。GDNFは、GDNFファミリー受容体α−1(GFRα−1;GFRα命名委員会、1997)サブユニット、グリコシル−ホスファチジル−イノシトール(グリコシル−PtdIns)に固定された膜タンパク質に結合する(Jing et al.,1996,Treanor et al.,1996,Sanicola et al.,1997)。続いて、GDNF/GFRα−1複合体は、cRETプロトオンコジーン、膜結合チロシンキナーゼに結合し、活性化して(Durbec et al.,1996,Trupp et al.,1996)、cRETにおけるチロシン残基のリン酸化と、続く下流のシグナル伝達経路の活性化をもたらす(Worby et al.,1996)。リガンド結合性受容体のGFRαファミリーの若干の他のメンバーが特徴付けられた(Baloh et al.,1997,Sanicola et al.,1997,Klein et al.,1997,Buj−Bello et al.,1997,Suvanto et al.,1997)。GFRα−2およびGFRα−3(Jing et al.,1997,Masure et al.,1998,Woby et al.,1998,Naveilham et al.,1998,Bello et al.,1998a)は、多くの異なるグループによって同定された。GFRα−1およびGFRα−2は、ほとんど全ての組織において広く発現し、そして発現は、発生的に制御されているようである(Sanicola et al.,1997,Widenfalk et al.,1997)。
【0005】
GFRα−3は、発生中もしくは成熟した中枢神経系では発現されないが、若干の発生中および成熟した末梢神経系の感覚および交感神経節では高度に発現される(Widenfalk et al.,1998,Naveilham et al.,1998,Baloh et al.,1998a)。第4のファミリーメンバー、GFRα−4は、ニワトリcDNAからクローン化された(Thompson et al.,1998)。GFRα−1は、GDNFに対する好適な受容体であり、一方GFRα−2は、NTNを優先的に結合する(Jing et al.,1996,Treanor et al.,1996,Klein et al.,1997)。ニワトリGFRα−4は、cRETと一緒になってPSPに対する機能的受容体複合体を形成する(Enokido et al.,1998)。両GFRα−3およびcRETを発現する細胞は、GDNF、NTNもしくはPSPのいずれにも応答しないことが分かった(Worby et al.,1998,Baloh et al.,1998a)。近年、ARTが、好適なリガンド結合性受容体としてGFRα−3を用いてcRETを通してシグナルを送ることが分かった(Baloh et al.,1998b)。GDNFが、cRETの存在下でGFRα−2もしくはGFRα−3に結合でき(Sanicola et al.,1997,Trupp et al.,1998)、そしてNTNが、低い親和力でGFRα−1に結合できる(Klein et al.,1997)ので、神経栄養因子とGFRα受容体間のクロストークが、イン・ビトロにおいて可能である。総括すれば、GDNF、NTN、PSPおよびARTは、神経栄養シグナリング系の一部であり、これによって種々のリガンド結合性サブユニット(GFRα−1〜4)が、同じチロシンキナーゼサブユニット(cRET)と相互作用することができる。これらのイン・ビトロの知見の生理学的関連性は、近年、遺伝子ノックアウト研究において示され(Rosenthalによる総論、1999)、これは、GDNFが、イン・ビボにおいてGFRα−1と相互作用するのに対して、NTNは、GFRα−2に対する好適なリガンドであることを明らかに示している。
【0006】
本発明者らは、エノビン(EVN)、GDNFファミリーの第4のメンバーを同定し、クローン化し、発現し、染色体上の位置を定め、そして特徴付けした。成熟EVNタンパク質の知識は、種々の機能性および非機能性mRNAスプライシング変異体の発見とともに拡大された。さらにまた、本発明者らは、EVNの発現データ、GFRα−3への結合データ、ならびにスタウロスポリン(staurosporine)で分化されたSH−SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞培養における、軸索成長およびタキソール誘導神経毒性に対する保護へのEVNのイン・ビトロ効果を提供する。
【0007】
発明の概要
本出願において、新規なヒト神経栄養成長因子、「エノビン」をコードしている核酸分子、該核酸分子を含有する発現ベクター、該ベクターにより形質転換される宿主細胞、該核酸分子によってコードされている神経栄養成長因子、単離されたエノビン、エノビンの作動剤もしくは拮抗剤として働く化合物、および核酸またはエノビンタンパク質またはそれらの作動剤もしくは拮抗剤を含有する製薬組成物が提供される。
【0008】
発明の詳細な記述
本発明の第1の態様によれば、図21に示されるアミノ酸配列をもつ、本明細書においてエノビンと命名されたヒト神経栄養成長因子をコードしているか、あるいは該成長因子の機能的等価物、誘導体または生体前駆体をコードしている核酸分子が提供される。好ましくは、該核酸分子は、DNA、そしてなおより好ましくは、cDNA分子である。
【0009】
好ましくは、本発明による核酸は、図1に示される配列の位置81〜419、そしてより好ましくは位置81〜422の配列、そしてなおより好ましくは、図1に示される完全配列を含有する。
【0010】
位置81〜419の核酸分子は、該エノビンタンパク質の安定なプロフォーム中に存在するRXXRプロセッシング部位において、タンパク質のプロフォームのプロセッシングに続いて生じる成熟エノビンタンパク質の配列をコードしていると考えられる。
【0011】
また、当業者には周知である高いストリンジェント条件下で、本発明による核酸配列のいずれかにハイブリダイズすることが可能なアンチセンス分子が、本発明によって提供される。
【0012】
ここに使用されるようなハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリ核酸が安定である条件を指す。ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度(Tm)において反映される。Tmは、式:
81.5℃−16.6(log10[Na+]+0.41(%G&C)
−600/l
[式中、lは、ヌクレオチド内でのハイブリッドの長さである]
によって近似させられる。Tmは、配列相同性における1%減少毎に、ほぼ1〜1.5℃低下する。
【0013】
有利には、本発明による核酸分子は、適当な発現ベクターを用いて宿主細胞もしくは類似するものにおいて、本発明によるヒト神経栄養成長因子を発現するために使用されてもよい。
【0014】
本発明による発現ベクターは、DNAフラグメントの発現に影響を与えることができる調節配列、例えばプロモーター領域に操作可能に結合されたそのようなDNAを発現することが可能なベクターを含む。
【0015】
発現のために要求される調節要素は、RNAポリメラーゼを結合するプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を含む。例えば、細菌発現ベクターは、lacプロモーターのようなプロモーター、および転写開始のためのシャイン・ダルガルノ配列および開始コドンAUGを含んでもよい。同様に、真核生物発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIのための異種もしくは同類のプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG、およびリボソームの脱離のための終止コドンを含んでもよい。そのようなベクターは、商業的に得られても、または当該技術分野において周知の方法によって、既述の配列から構築できる。
【0016】
かくして、発現ベクターは、組み換えDNAもしくはRNA構築物、例えばプラスミド、ファージ、組み換えウイルス、または適当な宿主細胞中への導入によってDNAもしくはRNAフラグメントの発現をもたらす他のベクターを指す。適当な発現ベクターは当業者には周知であり、そして真核細胞および/または原核細胞において複製可能であるもの、およびエピソームのまま残るもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものを含む。
【0017】
本発明による核酸にハイブリダイズすることが可能なアンチセンス分子は、プローブもしくは薬物として、または製薬組成物において使用されてもよい。
【0018】
本発明による核酸分子は、アンチセンスRNAの作成用に提供するために、アンチセンス方向において既述のベクター中に挿入されてもよい。アンチセンスRNAもしくは他のアンチセンス核酸は、合成手段によって作成されてもよい。
【0019】
本発明のさらなる態様は、本発明による発現ベクターにより形質転換、トランスフェクションもしくは感染された宿主細胞を含み、この細胞は、好ましくは、真核細胞、そしてより好ましくは哺乳類細胞を含む。
【0020】
該細胞の続いての形質転換、そして形質転換された細胞の続いての選択のために、適当な発現ベクター中へのクローン化されたDNAの組み入れは、Sambrook et al(1989)Molecular Cloning,A Laboratory manual,Cold Spring Harbour Laboratory Pressにおいて提供されるように、当業者には周知である。
【0021】
本発明のさらなる態様は、本発明による核酸分子のヌクレオチド少なくとも15、好ましくはヌクレオチド15〜50をもつ核酸分子を含む。
【0022】
これらの配列は、有利には、プローブまたは複製を開始するべきプライマーまたは類似のものとして使用されてもよい。そのような核酸分子は、当該技術分野において周知の技術により、例えば組み換えもしくは合成手段によって作成されてもよい。また、それらは、本発明による核酸の存在を検出するための診断キットもしくは用具もしくは類似のものにおいて使用されてもよい。これらの試験は、一般に、プローブをハイブリダイズする条件下でサンプルと接触させ、そしてプローブとサンプル中のいずれかの核酸間でのいずれか二重らせん形成の存在を検出することを含む。
【0023】
本発明によれば、これらのプローブは、固形支持体に固定されてもよい。好ましくは、それらは、多数のプローブが、単一の生物サンプルに同時にハイブリダイズできるようにアレイ上に存在している。プローブは、アレイ上に点在させるか、またはアレイ上でインサイチューで合成することができる。(Lockhart et al.,Nature Biotechnology,vol.14,December 1996「高密度オリゴヌクレオチド・アレイ中へのハイブリダイゼーションによる発現モニタリング」、参照)。単一のアレイは、別々の配置において100,500または1,000個以上もの異なるプローブを含有できる。
【0024】
また、本発明による核酸分子は、例えば、PCRクローニング機序を用いるような組み換えもしくは合成手段を使用して作成されてもよく、この機序は、一般に、クローン化されることが望まれる遺伝子の領域に対して約10〜50ヌクレオチドであってもよい1対のプライマーを作成し、そのプライマーをヒト細胞からのmRNA、cDNAもしくはゲノムDNAと接触させ、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を遂行し、増幅された領域もしくはフラグメントを単離し、そして増幅されたDNAを回収することを伴う。一般に、ここで定義されるような技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et alにより既述されている(Molecular Cloning:a Laboratory manual,1989)。本発明による核酸もしくはオリゴヌクレオチドは、指示標識を担持してもよい。適当な標識は、放射性同位元素、例えば32Pもしくは35S、酵素標識もしくは他のタンパク質標識、例えばビオチンもしくは蛍光マーカーを含む。そのような標識は、本発明の核酸もしくはオリゴヌクレオチドに付加されてもよく、そしてそれ自体既知の技術を用いて検出されてもよい。
【0025】
有利には、ヒト対立遺伝子変異体もしくは本発明によるDNA分子の多型性は、例えば、例えば種々の集団からの個体の範囲から、cDNAもしくはゲノムライブラリーをプローブすることによって同定されてもよい。さらにまた、本発明による核酸およびプローブは、当該技術分野において周知の技術、例えばサンガージデオキシチェーンターミネーション法を用いて、患者からのゲノムDNAを配列決定するために使用されてもよく、この方法は、有利には、本発明による成長因子に関連するある障害に対する患者の何らかの素質を確認できる。
【0026】
さらに、本発明によるヒト神経栄養因子エノビンを発現することが可能な導入遺伝子を含有しているトランスジェニック細胞、組織もしくは生物体が、本発明によって提供される。
【0027】
本明細書において使用されるところの用語「発現の可能な導入遺伝子」は、本発明による神経栄養因子の同じ機能および/または活性をもつ神経栄養因子の発現に導くすべての適当な核酸配列を意味する。導入遺伝子は、例えば、染色体中もしくは染色体外の状態で組み込まれた、ヒト細胞から単離されたゲノム核酸またはcDNAを含む合成核酸を含んでもよい。
【0028】
好ましくは、導入遺伝子は、ベクターが該神経栄養因子をコードしている核酸分子、または該核酸分子の機能的フラグメントを含む、本発明によるベクターを含有する。該核酸の「機能的フラグメント」は、該神経栄養因子またはその機能的等価物をコードしている遺伝子もしくはcDNAのフラグメントを意味するととらえるべきであり、このフラグメントは、発現されて本発明による機能的神経栄養成長因子を生産することが可能である。かくして、例えば、対応する受容体と相互作用する特異的アミノ酸残基に対応する本発明による神経栄養成長因子のフラグメントは、また、本発明の一部を形成し、そしてこれらのフラグメントは、本発明による成長因子の対応する受容体を活性化する作動体として機能するために役立って、細胞へのその成長促進および生存維持効果を誘起できる。また、本発明のこの態様は、本発明による核酸の差別的にスプライシングされたイソ型および転写開始物(starts)を含む。
【0029】
本発明によれば、定義された核酸は、同一の核酸のみならず、また、特に同類アミノ酸置換における退化コードによる同義コドン(同じアミノ酸残基を指定する異なるコドン)をもたらす塩基における置換を含む何らかの小さい塩基変異を含む。用語「核酸分子」は、また、関連する塩基変異を与えるいかなる一本鎖配列にも相補的な配列を含む。
【0030】
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書において定義されるような核酸分子によってコードされている、単離されたヒト神経栄養成長因子を提供する。好ましくは、成長因子は、図1のアミノ酸配列のアミノ酸配列位置27〜139またはそれらの機能的等価物、誘導体もしくは生体前駆体を含有する。
【0031】
本明細書において定義されるような「機能的等価物」は、成長因子エノビンに関連する成長性および機能性のすべてを表す成長因子を意味するととらえられるべきである。本明細書において定義されるようなエノビンの「誘導体」は、ポリペプチドにおけるある種のアミノ酸が変更もしくは欠失されるか、または他のアミノ酸によって置換され、そしてポリペプチドがエノビンの生物活性を保持し、そして/またはポリペプチドが、チャレンジ抗原として本発明によるエノビンを使用して生じた抗体と反応できる、ポリペプチドを含むことを意図している。
【0032】
融合タンパク質およびフラグメントを含む、エノビンのハイブリッドおよび改変型は、本発明の範囲内に包含される。ハイブリッドおよび改変型は、本発明によれば、例えば、ある種のアミノ酸が、例えば、改変が、なおもエノビンの生物活性を保持しているタンパク質をもたらす点突然変異によるような、若干の改変もしくは置換にかけられた場合を含む。特定の核酸配列は、エノビンに同じか実質的に同じ性質を表す成長因子を生産するように、当業者によって改変することができる。
【0033】
当該技術分野において周知のように、多くのタンパク質は、タンパク質のN末端における(プレ)シグナル配列をもってイン・ビボで生産される。さらにまた、そのようなタンパク質は、成熟タンパク質への安定な前駆体を表すさらなるプロ配列を含有してもよい。そのようなプレおよびプロ配列は、生物活性のためには一般に必要ではない。本発明によるエノビン分子は、図21に示される完全な長さの配列のみならず、また、位置27〜139も含み、これは、このタイプの成長因子に存在するRXXRタンパク質分解プロセッシング部位に続き、そしてエノビンの成熟配列を表すと考えられる。
【0034】
本発明により定義されたタンパク質、ポリペプチドもしくはアミノ酸配列は、同一アミノ酸配列のみならず、また、同類アミノ酸置換(その側鎖に関連するアミノ酸による置換)を含む天然のアミノ酸配列とは異なる小さいアミノ酸変異に加えてそれらの異性体も含む。また、天然のアミノ酸から変化しているが、天然に存在する配列によってコードされるポリペプチドと免疫学的に同一または類似であるポリペプチドをもたらすアミノ酸配列も含まれる。
【0035】
本発明によるタンパク質もしくはポリペプチドは、該タンパク質もしくはポリペプチドと実質的に相同である天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、そのような配列の変異体をさらに含む。本文脈において、実質的な相同性は、本発明による核酸分子によってコードされるタンパク質もしくはポリペプチドと、少なくとも70%、好ましくは80%、90%もしくは95%のアミノ酸相同性をもつ配列と見なされる。
【0036】
本発明による宿主細胞によって発現される神経栄養成長因子は、また、本発明内に包含される。
【0037】
さらに、本発明は、アンチセンス技術の使用によって、本発明による神経栄養成長因子をイン・ビボで抑制することに対向される。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAを通して遺伝子発現を調節するために使用でき、この両方法は、DNAもしくはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟タンパク質をコードしているDNA配列の一部が、長さ10〜50塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するのに使用できる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計される(三重らせん−Lee et al.,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Cooney et al.,Science,241:456(1988);Dervan et al.,Science,251:1360(1991);それによる転写の阻止およびエノビンの生産、参照)。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、イン・ビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてエノビンへのmRNA分子の翻訳を遮断する。
【0038】
従来同定されたGDNFファミリーの成長因子と本明細書に既述される成長因子間の配列類似性のために、エノビンは、また、細胞の生存および成長を促進し、そして該神経栄養因子の機能および発現における欠陥からもたらされる障害を治療することができると考えられる。
【0039】
したがって、本発明による核酸分子もしくは神経栄養因子は、有利には、該障害の症候を軽減させるのに十分な濃度における本発明による核酸分子もしくは成長因子量を、患者に投与することによって該患者における神経障害を治療または予防するために使用されてもよい。かくして、本発明の核酸分子は、ニューロン細胞の維持および生存を促進するため、そしてパーキンソン病、アルツハイマー病、末梢神経病、筋委縮性側索硬化症、末梢および中枢神経傷害もしくは損傷および神経毒曝露を含む神経細胞障害もしくは神経変性症状を治療するために使用されてもよい。
【0040】
本発明による神経栄養成長因子は、有利には、ニューロン細胞もしくは細胞集団、特に、アポトーシスを受けるべく誘導されたそれらのニューロン細胞もしくは細胞集団に、神経栄養もしくは神経保護効果を与えることが観察された。したがって、本発明による核酸もしくはエノビン成長因子それ自体は、本明細書に記述される神経障害の症候を軽減または予防するのに十分な濃度における該核酸分子もしくはエノビン量を、それらを必要とする患者に投与することによって、神経変性障害、例えば卒中、ハンチントン病、末梢神経病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷、神経毒曝露、多発性内分泌新形成、家族性ヒルシュスプルング病、プリオン関連疾患、クロイツフェルド・ヤコブ病を治療することに、さらに使用されてもよい。
【0041】
その上、そして下記実施例においてより詳細に記述されるが、エノビンは、誘発された感覚欠乏の回復を速めることが分かっていて、このことは、これらの障害の症候を軽減または予防するのに十分な濃度においてそれを必要とする患者に投与することによって、末梢もしくは中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ/炎症疾患ならびにコンダクタンス障害を治療または緩和するための候補薬として、エノビンを同定する。
【0042】
上記神経障害を治療するその外の方法は、本発明によるヒト神経栄養成長因子を発現する患者細胞、例えば本明細書に記述されるトランスジェニック細胞中に移植することを含む。
【0043】
また、本発明による核酸分子および神経栄養成長因子は、製薬組成物中に、そのための製薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤もしくは添加物と一緒に含有されてもよい。
【0044】
本発明の神経栄養因子に対する抗体は、有利には、当該技術分野において既知である技術によって作成されてもよい。例えば、ポリクローナル抗体は、成長因子もしくはそのエピトープを宿主動物、例えばマウスに接種し、そして免疫血清を回収することのよって作成されてもよい。モノクローナル抗体は、Kohler R.and Milstein C.,Nature(1975)256,495−497によって記述されるような既知技術にしたがって作成されてもよい。
【0045】
本発明による抗体は、有利には、本発明による成長因子の存在を検出する方法において使用されてもよく、この方法は、抗体をサンプルと反応させ、そして該抗体に結合されるいずれかのタンパク質を同定することを含む。また、本発明による抗体を含む該方法を遂行するキット、および該サンプルと抗体を反応させる手段が提供される。
【0046】
また、上記の抗体および該抗体と該サンプルを反応させるための手段を含む、サンプルにおいて本発明による神経栄養成長因子の存在を検出するためのキットもしくは器具が、本発明によって提供される。
【0047】
本発明の神経栄養因子と相互作用するタンパク質、例えばそれは対応する細胞受容体であるが、それは、分子生物学者には周知である二ハイブリッドベクター系を用いてタンパク質−タンパク質相互作用を研究することによって同定されてもよい(Fields & Song,Nature 340:245 1989)。この技術は、リポーター遺伝子を活性化する転写因子のイン・ビボでの機能的再構築に基づいている。より特別には、その技術は、DNA結合ドメインと活性化ドメインをもつ転写因子によって制御されるプロモーターの調節下にリポーター遺伝子を含有するDNA構築物を提供し、本発明による核酸配列のフラグメントもしくは全部の第1の融合物をコードしている第1のハイブリッドDNA配列および転写因子の該DNA結合ドメインか該活性化ドメインのいずれかを宿主細胞において発現し、第1の融合物に組み入れられていない転写因子のDNA結合ドメインもしくは活性化ドメインと一緒に、研究されるべき推定上の結合タンパク質をコードしている少なくとも1つの第2のハイブリッドDNA配列、例えばライブラリーまたは類するものを宿主において発現すること;宿主細胞におけるいずれかリポーター遺伝子産物の存在を検出することによって、本発明によるタンパク質と研究されるべきタンパク質のいずれかの結合を検出すること;場合によっては結合タンパク質をコードしている第2のハイブリッドDNA配列を単離すること;を含む。
【0048】
そのような技術の例は、酵母におけるGAL4タンパク質を利用する。GAL4は、酵母におけるガラクトース代謝の転写アクチベーターであり、そしてガラクトース代謝遺伝子ならびにタンパク質結合ドメインの上流にアクチベーターに結合するための別のドメインをもつ。ヌクレオチドベクターが構築されてもよく、これらの1つは、GAL4のDNA結合ドメインをコードしているヌクレオチド残基を含有する。これらの結合ドメイン残基は、既知のタンパク質をコードする配列、例えば本発明による核酸に融合されてもよい。他のベクターは、GAL4のタンパク質結合ドメインをコードしている残基を含有する。これらの残基は、試験タンパク質、好ましくは問題の脊椎動物のシグナル伝達経路からの試験タンパク質をコードしている残基に結合される。本発明による核酸によってコードされる神経栄養因子と試験されるべきタンパク質との間の相互作用は、ベクターが形質転換されたGAL4転写欠失酵母細胞におけるリポーター分子の転写活性化をもたらす。好ましくは、β−ガラクトシダーゼのようなリポーター分子は、酵母ガラクトース代謝遺伝子の転写の回復により活性化される。
【0049】
エノビンについての受容体は、GFRα3として本発明者らによって同定された。したがって、アッセイは、エノビンの作動もしくは拮抗化合物を同定するために作成されてもよい。また、このアッセイは、他の神経栄養成長因子とそれらの対応する受容体を組み合わせて使用されてもよい。同定された化合物は、パーキンソン病、アルツハイマー病のような障害、拡張したポリグルタミン配列に関連するニューロン障害、例えばハンチントン病、末梢神経病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷、神経毒曝露、多発性内分泌新形成および家族性ヒルシュスプルング病、プリオン関連疾患、クロイツフェルド・ヤコブ病、卒中、事実上末梢もしくは中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ/炎症疾患ならびにコンダクタンス障害を治療または予防するために、該神経障害を予防または治療するのに十分な濃度における該作動剤もしくは拮抗剤量を個体に投与することによって、使用されてもよい。また、そのような化合物は、製薬組成物中に、そのための製薬的に許容しうるキャリヤー、希釈剤もしくは添加物と一緒に含有されてもよい。
【0050】
成長因子(例えばエノビンのような)の作動剤もしくは拮抗剤は、1つの実施態様では、適当な受容体およびcRETを発現する細胞、組織もしくは生物体を、成長因子の存在下で候補化合物と接触させ、そして該細胞、組織もしくは生物体におけるRET活性化レベルを、該候補化合物と接触されなかった対照と比較することによって同定されてもよい。
【0051】
本発明の別の実施態様は、神経栄養成長因子の作動剤もしくは拮抗剤を同定する方法を含み、該方法は、該成長因子の適当な受容体およびcRETを発現する細胞組織もしくは生物体を、該成長因子の存在下で候補化合物と接触させ、該適当な受容体が成分であるシグナル伝達経路におけるシグナリングキナーゼの活性化のレベルを、リポーター分子に共役される該シグナルキナーゼに特異的な抗体の添加に続いて、該化合物と接触されなかった細胞、組織もしくは生物体と比較されて測定することを含む。
【0052】
本発明のさらなる態様は、増強された蠕動腸運動に仲介される胃腸障害もしくは症状を治療するための薬物の製造における、本発明による拮抗剤として同定された化合物の使用を含む。
【0053】
本発明のアッセイにおいて同定された化合物は、有利には、胃腸運動を増進するために使用されてもよく、したがって妨げられ、または傷害された胃腸通過に関連する症状を治療することに有用であろう。
【0054】
したがって、そのような化合物は、妨げられ、または傷害された胃排出に関連する症状を患っているか、あるいはより一般的に、妨げられ、または傷害された胃腸通過に関連する症状を患っている、ヒトを含む温血動物を治療することに有用であろう。その結果、治療方法は、例えば胃食道逆流、消化不良、軽症胃アトニー、術後腸閉塞症および腸偽閉鎖症のような症状から患者を救護するために提供される。
【0055】
消化不良は、消化機能の障害であり、これは、1次的な胃腸機能障害、特に筋緊張力の増加に関連する胃腸機能障害の症候として、または他の障害、例えば虫垂炎、胆嚢障害もしくは栄養失調症による併発症として起きる。消化不良症候は、例えば、食欲欠乏、満腹感、初期飽満、悪心、嘔吐および鼓腸である。
【0056】
軽症胃アトニーは、胃における異常によるか、または糖尿病、進行性全身性硬化症、食欲不良および萎縮性筋硬直症のような疾病の合併症としてもたらされる。
【0057】
術後腸閉塞症は、術後の筋緊張力の分裂による腸における閉塞もしくは運動性障害である。
【0058】
腸偽閉塞症は、便秘、疝痛性痛みおよび嘔吐を特徴とする症状であるが、物理的閉塞の証拠はない。
【0059】
かくして、本発明の化合物は、症状の実原因を取り除くためにも、また症状の徴候を緩和するためにも使用することができる。
【0060】
その上、結腸における運動活性の促進物質であるある種の化合物は、障害された運動性、例えば小腸および大腸自体か、または遅延した胃の排出と組み合わされての減退した蠕動に関連した症候を患っている患者における腸通過を正常化するか改善するために有用であろう。
【0061】
本発明の化合物の結腸運動への利用に関して、腸系の運動障害、例えば便秘、偽閉塞症、腸アトニー、術後腸アトニー、感応性腸症候群(IBS)および薬物誘発の通過遅延を患っているヒトを含む、温血動物を治療する方法が提供される。
【0062】
また、本発明のアッセイにより拮抗剤として同定された化合物は、腸における増強した蠕動運動からもたらされる胃腸症状、例えば下痢(分泌性下痢、細菌誘発性下痢、胆汁性下痢、旅行者の下痢および心理的下痢)、クローン病、痙攣性結腸、感応性腸症候群(IBS)、下痢優勢の感応性腸胃腸過敏症の治療もしくは予防において有効な用途をもつであろう。
【0063】
本発明の化合物の利用に関して、本発明は、また、胃腸症状、例えば感応性腸症候群(IBS)、特にIBSの下痢症状を患っているヒトを含む、温血動物を治療する方法を提供することが続く。その結果、治療方法は、感応性腸症候群(IBS)、下痢優勢の感応性腸症候群、腸過敏症のような症状を患っている患者を救護するため、そして胃腸過敏症に関連する疼痛の軽減のために提供される。
【0064】
また、本化合物は、他の胃腸障害、例えば上部消化管運動に関連した障害において、ならびに嘔吐および細胞毒性薬物や放射能に誘発される嘔吐を治療する鎮吐薬として、有力な用途をもつであろう。
【0065】
炎症性腸疾患は、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病および類するものを含む。
【0066】
また、本発明のさらなる態様は、障害の症候を緩和もしくは軽減するのに十分な濃度において、本発明によるアンチセンス分子もしくはその拮抗剤量を患者に投与することによる、本発明によるエノビンの発現によって仲介される該障害の治療方法を含む。
【0067】
また、エノビンの不活性化もしくは発現を抑制することによって仲介される障害は、有利には、障害の症候を軽減もしくは予防するのに十分な濃度において、エノビンの作動剤として同定された化合物の量を個体に投与することによって治療されてもよい。
【0068】
さらなる態様では、本発明は、ヒト神経栄養成長因子エノビンに関連する疾病の治療のための製薬製剤を作成する方法を提供し、該方法は、本発明によるエノビンの作動剤もしくは拮抗剤として同定される候補化合物を選択し、該化合物のバルク量を製造し、そして製造された化合物を製薬的に許容しうるキャリヤーにおいて製剤化することを含む。
【0069】
以下の実施例からより詳細に見られるように、エノビンは、タキソール誘導感覚欠乏を軽減することに有効であった。したがって、エノビンは、事実上末梢および中枢神経に由来する成分による疼痛症候群、リウマチ病ならびにコンダクタンス障害において可能性のある役割を演じるであろうし、そして経皮、局所、局部中心点(local central)(例えば硬膜外、夾膜内(intrathecal)、ICV、集網内、ニューロン内)、経口、肛門および全身適用後の感覚行程において変調的役割を演じることができる。したがって,エノビンによって仲介される他の症状に関しても本明細書に記述されるような同じ方式において、これらの症状は、該障害の症候を緩和もしくは予防するために十分な濃度において、本発明により適当であるような、アンチセンス分子、核酸、エノビンタンパク質、製薬組成物、または作動剤もしくは拮抗剤として同定された化合物のいずれかを投与することによって緩和もしくは予防さえできるであろう。
【0070】
本発明の治療もしくは製薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、夾膜内もしくは脳内を含む当該技術分野において既知のすべての適当な経路によって、またはエクス・ビボ治療処方における細胞への投与によって投与することができる。投与は、注射によるように急速にでも、または遅い注入もしくは徐放製剤の投与による長時間にわたってもよい。中枢神経系における組織を治療するためには、投与は、脳脊髄液(CSF)中への注射もしくは注入によってもよい。
【0071】
また、エノビンは、所望の製薬的もしくは薬力学性質を提供する薬剤と結合されても共役されてもよい。例えば、当該技術分野における既知のいずれかの物質と結合されて、トランスフェリン受容体に対する抗体のように、血液−脳バリヤーを横切る浸透もしくは輸送を促進することができ、そして静脈内注射によって投与できる。
【0072】
本発明によるエノビン、アンチセンス分子または実際にエノビンの作動剤もしくは拮抗剤として同定された化合物は、製薬組成物の形態において使用されてもよく、これは、当該技術分野において周知の操作にしたがって製造できる。好適な組成物は、製薬的に許容しうる媒質もしくは希釈剤もしくは添加物、例えば生理食塩水を含有する。また、他の製薬的に許容しうるキャリヤーは、無毒な塩類、滅菌水もしくは類するものが使用されてもよい。また、適当なバッファーは、凍結乾燥させ、そして保存された組成物を、後の投与のために滅菌水の添加によって再調製するまで無菌状態で存在してもよい。固形もしくは半固形の生物学的に適合しうるマトリックス中へのエノビンの組み入れが実施されてもよく、これは、治療を要する組織中に移植できる。
【0073】
また、キャリヤーは、pH、張性、粘度、滅菌性、凍結乾燥性、溶解度もしくはそれに類するような他の条件を修飾するために、他の製薬的に許容しうる添加物を含有してもよい。また、投与後、持続もしくは遅延放出させる製薬的に許容しうる添加物が含有されてもよい。
【0074】
本発明によるエノビンタンパク質もしくは核酸分子もしくは化合物は、経口的に投与されてもよい。この実施態様では、それらは、当業者には周知である固形製剤中に適当なキャリヤーとともに封入および合体されてもよい。
【0075】
当業者には周知であるように、一定の用量処方が、使用されるべき特定の投与経路に応じて、患者の体表面積もしくは占められる体空間の容積にしたがって計算されてもよい。しかしながら、実際に投与される組成物の量は、治療されるべき障害に付随する環境、例えば症候の重篤度、投与される組成物、個々の患者の年齢、体重および応答、および選択された投与経路に基づいて、医療実務者によって決定されるであろう。
【0076】
本発明は、純粋に例示である次の実施例によって、そしてここに添付する図面の引用によって、より明白に理解されるであろう:
図1:エノビンと命名された本発明による神経栄養因子の部分cDNA配列である。共通配列は、種々のcDNAおよびゲノムDNAにおいてプライマーPNHsp3およびPNHaplを用いるPCR増幅、それに続くクローニングおよび得られた配列の配列解析と比較によって得られた。予期される1文字コードアミノ酸配列は、DNA配列の上に示される。ヌクレオチド残基数は、DNA配列の右に示され、一方アミノ酸残基数は、翻訳されたタンパク質配列の右に示される。プロドメインに対する推定RXXR切断部位は、太い下線で指示される。成熟タンパク質の推定の始まりは、矢印によって指示される。TGF−βファミリーの全メンバーの7個の保存システイン残基特性は、太く指示される。潜在性N−グリコシル化部位は、二重の下線である、
図2:ヒトGDNF,NTN,PSPおよびEVNの予測される成熟タンパク質配列である。配列は、ClustalWアラインメントプログラムを用いて整列された。すべて3種のタンパク質間に保存されるアミノ酸残基は、黒い範囲に含まれる。2〜3種の配列間に保存される残基は、灰色で塗られている。TGF−βファミリーのメンバーの7個の保存システイン残基特性は、配列の上に星印によって指示される。アミノ酸残基は、右に数が示される。ダッシュは、整列を最適化するために配列中に導入されたギャップを示す、
図3:エノビンの部分cDNA配列である。共通配列は、種々のcDNAにおけるPCR増幅(プライマーPNHsp1およびPNHaplを用いるプライマーPCR、およびプライマーPNHsp2およびPNHap2を用いるネストPCR)、それに続くクローニングおよび得られた配列の配列解析と比較によって得られた。ヌクレオチド30〜284(読み枠A)の翻訳された1文字コードアミノ酸配列は、配列の上に示され、そして右に数が示される(A1〜A85)。この読み枠は、推定のATG翻訳開始コドンを含有する。ヌクレオチド334〜810(読み枠B)の翻訳された1文字コードアミノ酸配列は、配列の上に示され、そして右に数が示される(B1〜B159)。この読み枠は、GDNF,NTNおよびPSPとの相同領域を含有する。ヌクレオチド残基数は、DNA配列の右に示される。プロドメインに対する推定RXXR切断部位は、太い下線で指示される。成熟タンパク質の推定の始まりは、矢印によって指示される。TGF−βファミリーの全メンバーの7個の保存システイン残基特性は、太く指示される。潜在性N−グリコシル化部位は、二重の下線である、
図4:ヒト・エノビンの染色体局在の図示である。(A)エノビンについてのFISHマッピング結果の図。各ドットは、ヒト染色体1、領域p31.3−p32において検出される二重FISHシグナルを表す。(B)エノビンのFISHマッピングの例。左図は、染色体1におけるFISHシグナルを示す。右図は、染色体1を同定するための4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドールにより染色された同じ有糸分裂図を示す、
図5:種々のヒト組織におけるエノビンの発現の図示である。(A),(B),(C)エノビンの組織発現のノザンブロット解析。種々のヒト組織におけるエノビンmRNAの発現が、ヒト・ポリ(A)リッチRNAのブロットを解析するために、エノビンのコーディング領域の一部(成熟エノビンタンパク質をコードしている領域を含む)に対応するプローブを用いて検査された。(A)多組織ノザン(MTN)ブロット;(B)MTNブロットII)胎児性MTNブロットII。パネル(D)は、同じエノビンcDNAフラグメントによりプローブされたヒトRNAマスターブロットのオートラジオグラフィーを示す。パネル(E)は、(D)からのRNAマスターブロットにおけるヒト組織mRNAサンプルの位置、
図6:10−6Mタキソールによる72時間治療後のSH−SY5Y細胞の全生存のグラフによる図示および溶媒の条件に対して標準化された、この生存に及ぼすエノビンの増加用量の効果である。SH−SY5Y細胞は、タキソールの適用前に25nMスタウロスポリンにより5日間分化された。データは、sixtuplateにおける2つの独立した実験からのものである。平均値および標準偏差が示される、
図7:溶媒の条件に対して標準化された、スタウロスポリンで分化されたSH−SY5Y細胞の軸索成長に及ぼす48時間にわたるエノビンの増加濃度の効果のグラフ表示である。SH−SY5Y細胞は、48時間の実験を始める前に25nMスタウロスポリンにより25日間分化される。ポジティブ対照として、25nMスタウロスポリンの分化効果が示される。軸索の長さは少なくとも5000細胞において算出される。データは、2並列において実施された実施から提供される。平均値および標準偏差が示される、
図8〜18:種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【0077】
図19:針突き(pin prick)試験を用いるタキソール誘発の感覚欠乏に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。タキソール後にエノビンの2つの異なる用量(23もしくは130μg/ml;n=10ラット/群)か、または媒質/食塩水(n=20ラット)かいずれかにより処置されたラットの経時的な平均(±1SEM)累積スコアが与えられる。エノビンもしくは食塩水/媒質は、右後足の足底下(subplantar)域中に容量75μlにおいて注射された。
【0078】
図20:針突き試験を用いるタキソール誘発の感覚欠乏に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。タキソール後にエノビンの2つの異なる用量(23もしくは130μg/ml;n=10ラット/群)か、または媒質/食塩水(n=20ラット)かいずれかにより処置されたラットの経時的な平均(±1SEM)累積スコアが与えられる。エノビンもしくは食塩水/媒質は、右後足の足底下域中に容量75μlにおいて注射された。
【0079】
図21:エノビンのDNA配列である。共通配列は、ヒト前頭皮質cDNAおよびヒト・ゲノムDNAにおいてプライマーPNHsp5およびPNHaplを用いるPCRによる増幅、それに続くクローニング、得られた配列の配列解析と比較によって得られた。予期されるアミノ酸配列は、翻訳後に機能的エノビンタンパク質を生じる唯一スプライシング変異体についてDNA配列の上に示される。ヌクレオチド残基数は、DNA配列の左に示され、一方アミノ酸残基数は、翻訳されたタンパク質配列の右に示される。配列決定されたcDNAフラグメントのゲノム配列との比較によって検出される5’および3’スプライシング部位が、それぞれ左もしくは右に曲がった縦線によって指示され、そして連続的に数字を付けられる。プロドメインに対する推定RXXRフリン切断部位は、太い下線で指示される。成熟タンパク質の推定の始まりは、矢印によって指示される。TGF−βファミリーの全メンバーの7個の保存システイン残基特性は、太く指示される。潜在性N−結合グリコシル化部位は、二重の下線である。5’および3’スプライシング部位が、数字を付けられ、そして円で囲まれている。
【0080】
図22:ヒト組織における種々のエノビンスプライシング変異体の発現の示である。(A)種々のヒト組織由来のRNAにおいてエノビン特異的プライマーを用いるRT−PCR、それに続くクローニング、およびPCR生成物の配列解析によって同定されたエノビンスプライシング変異体の概要図。上部の線はスケール(bp)を示す。第2の線はエノビンゲノム配列を表す。翻訳開始および終止コドンの位置、配列をコードしている成熟エノビンの開始の位置および5’および3’スプライシング部位(図21参照)の位置が指示される。図の右部分は、100bpDNAラダーとともに卵巣および前頭皮質RNAにおけるRT−PCRによって得られたPCR生成物を示す。種々のmRNA変異体の位置は、それらのサイズ(開始から終止コドンまで)とともに指示される。翻訳されたタンパク質は、左手側に示される。ボックスはcDNAにおいて表される領域を描く。破線はスプライシングアウトされたゲノムDNAを表す。斜線領域は、成熟エノビン・コーディング配列を表す。点線は成熟エノビン・コーディング配列の始めを印す。機能的エノビンタンパク質を得ることが可能な2つの転写物が、左手側における星印によって指示される。(B)主スプライシング変異体の組織分布。写真は、種々のヒトcDNAにおいてエノビン特異的プライマーを用いるRT−PCRによって得られたPCRフラグメントを示す。4個の主スプライシング変異体(A〜D)が、左手側における矢印によって指示される。サイズは、ゲルにおいてサイズ参照として使用された100bpDNAラダーに基づいて右手側に指示される。
【0081】
図23:図21のDNA配列から2つのイントロンをスプライシングアウトすることによって得られる、エノビンの長いスプライシング変異体の予測されるタンパク質配列。スプライシング部位5’−1および3’−1は、第1のイントロンを除去するために使用され、そしてスプライシング部位5’−2および3’−3は、第2のイントロンを除去するために使用される。これは、先に示された228アミノ酸残基タンパク質をコードしている読み枠をもつcDNA配列をもたらす。
【0082】
図24:図21のDNA配列から2つのイントロンをスプライシングアウトすることによって得られる、エノビンの別の(短い)スプライシング変異体の予測されるタンパク質配列。スプライシング部位5’−1および3’−2は、第1のイントロンを除去するために使用され、そしてスプライシング部位5’−2および3’−3は、第2のイントロンを除去するために使用される。これは、先に示された220アミノ酸残基タンパク質をコードしている読み枠をもつcDNA配列をもららす。このタンパク質配列は、図23の配列と比較して8アミノ酸残基を失っている。
【0083】
図25:普通の疾病組織においてエノビンの発現レベルを比較するために計画された実験から得られた結果のグラフ表示である。エノビンおよびGAPDH発現は、多発性硬化症およびアルツハイマー病に関して、脳組織において表される。
【0084】
図26:パーキンソン病およびがんにおいてエノビンおよびGAPDHの発現レベルを検出するために得られた結果のグラフ表示である。
【0085】
寄託
エノビンをコードしているDNA配列を含有しているプラスミドEVNmat/pRSETBは、1997年4月28日のブダペスト条約の約定に従って、Laboratorium voor Moleculaire−Plasmidencollectie(LMBP)B9000,Ghent,Belgiumにおけるザ・ベルジアン・コオーディネーテッド・コレクションズ・オブ・ミクロ−ビオロジー(the Belgian Cordinated Collections of Micro−Biologie)(BCCM)に、受託番号LMBP3931の下、1999年5月6日に寄託された。
【0086】
材料および方法
材料
ネイティブTaqポリメラーゼ、アンピシリン、IPTG(イソプロピル−β−チオガラクトシド)、X−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド)および使用される全制限酵素は、Boehringer Mannheim(Mannheim,Germany)製であった。10mMdNTP混合物は、Life Technologies(Gaithersburg,MD,USA)から購入した。TOPO−TAクローニングキットは、Invitrogen BV(Leek,The Netherlands)から購入した。Qiagen プラスミド・ミニ−もしくはミディ−DNA精製キット、Qiaprep Spin MiniprepキットおよびQiaquickゲル抽出キットは、Qiagen GmbH(Dusseldorf,Germany)から購入した。cDNAライブラリー、MarathonTm Ready cDNAキット、ヒト多組織cDNA(MTCTM)パネルIおよびII多組織ノザンブロット、およびAdvantage−GC cDNA PCRキットは、Clontech Laboratories(Palo Alto,CA,USA)から得られた。全PCR反応は、GeneAmp PCRシステム9600サイクラー(perkin Elmer,Foster City,CA,USA)において行われた。LB(Luria−Bertani)培地は、トリプトン10g/l、酵母エキス5g/lおよびNaCl 10g/lからなる。2xYT/アンピシリンプレートは、トリプトン16g/l、酵母エキス10g/l、NaCl 5g/l、寒天15g/lおよびアンピシリン100mg/lからなる。
【0087】
データベース相同性検索および配列比較
完全なヒト・グリア細胞系誘導の神経栄養因子(GDNF;受託番号Q99748)、クウィリー(query)配列としてのニュールツリン(neurturin)(NTN;受託番号P39905)およびペルセフィン(persephin)(PSP;受託番号AF040962)cDNA誘導のタンパク質配列を使用して、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul et al.,1990)検索が、EMBL/GenBankヒト発現配列tag(EST)およびゲノムデータベースの毎日最新のものにおいて遂行された。
【0088】
追加のBLAST検索は、受託番号AC005038をもつゲノム配列およびGenBankデータベースに存在する数種のESTを用いて遂行され、そしてこのゲノム配列に対して見られる相同性が検出された。
【0089】
GDNFファミリーのメンバー間の同一性パーセントおよび類似性パーセントは、BESTFITプログラム(Genetics Computer Group配列解析ソフトウエアーパッケージ、バージョン8.0,University of Wisconsin,Madison,WI,USA)を用いて配列の対毎の比較で算出された。DNAもしくはタンパク質配列の整列は、ClustalWアラインメントプログラム(EMBL,Heidelberg,Germany)により実施された。
【0090】
PCRのためのオリゴヌクレオチド合成およびDNA配列決定
すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Eurogentec(Seraing,Belgium)から整えられた。インサート特異的配列決定プライマー(15−および16量体)およびPCR反応に使用するためのプライマーは、手作業で計画された。DNAは、Qiagen−tip−20もしくは−100陰イオン交換またはQiaquickスピンカラム(Qiagen GmbH,Dusseldorf,Germany)において調製され、そしてカラムからTEバッファー(10mMTris.HCl,1mMEDTA(ナトリウム塩),pH8.0)30μl中に回収された。
【0091】
配列決定反応は、ABIプリズムBigDye Terminator Cycle配列決定キットを用いて両鎖において実施され、そしてApplied Biosystems377XLシーケンサー(Perkin Elmer,ABI Division,Foster City,CA,USA)において行われた。SequencherTMソフトウェアーは、配列組み立ておよび手編集のために使用された(GeneCodes,AnnArbor,MI,USA)。
【0092】
新規なGDNF同族体のクローニング
翻訳タンパク質配列が成熟NTNおよびPSPに相同であった、EMBL受託番号AC005038のヌクレオチド67411〜68343にわたるDNA領域が、PCR増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用された。使用された種々のプライマーが表1に示される。
【0093】
【表1】
【0094】
プライマーPNHsp3およびPNHap1は,種々のヒト組織(胎児脳、全胎児、前立腺もしくは肺Marathon−ReadyTMcDNA(Clontech Laboratories)、前頭皮質、海馬および小脳cDNA)から得られたcDNAに基づき、およびヒトゲノムDNAに基づく502bpのフラグメントを増幅するために使用された。EMBL/GenBankデータベースからのゲノム配列(acc.no.AC005038)に基づいて、増幅されるべきフラグメントは、G+C含量76%をもつと予測された。したがって、増幅は、GCリッチDNA配列の増幅のために標準化されたAdvantage−GC cDNA PCRキット(Clontech Laboratories,Palo Alto,CA,USA)を用いて実施された。PCR反応は、1xGC cDNA PCR反応バッファー、0.2mMdNTP、1MGC−MELTTM,プライマーPNHsp3およびPNHap1 200nM、Advantage KlenTaqポリメラーゼ混合物1μlおよびcDNA1〜5μlまたはゲノムDNA0.5μgを含有する全容量50μlにおいて遂行された。サンプルは5分間95℃に加熱され、そしてサイクリングは、35サイクルの間95℃で45秒、58℃で1分そして72℃で40秒間実施されたが、最終段階は72℃で7分であった。サンプルは、最後に、A−オーバーハングを付加するために、ネイティブTaqDNAポリメラーゼ2.5Uによって処理された。PCR生成物は、1xTAEバッファー(40mMTris−酢酸、1mMEDTA(ナトリウム塩),pH8.3)における1%(w/v)アガロースゲルにおいて解析された。期待されたサイズ(495bp)のPCRフラグメントが、ゲルから切り取られ、そしてQiaquickゲル抽出キットにより精製された。PCRフラグメントは、それらの同一性を確認するために配列決定され、そして製造者の指示にしたがって、TOPO−TAクローニングキットを用いてプラスミドベクターpCR2.1−TOPO中にクローン化された。精製フラグメント約20ngが、全容量5μl中にpCR2.1−TOPOベクター1μlと合わされた。反応物は、室温(20℃)で5分間インキュベートされた。反応物2μlは、ヒートショック・トランスフォーメーションを用いてTOP1OF’受容細胞(Invitrogen BV)中にトランスフォームされ、そしてブルー・ホワイトスクリーニングのために10mMIPTGおよび2%(w/v)X−galを補足された2xYT/アンピシリンプレート上に平板塗布された。一夜増殖後ホワイトコロニーが、プレートから採取され、アンピシリン100mg/lを補足されたLB培地5ml中で増殖され、そしてプラスミドDNAがQiaprep Spin Miniprepキットを用いて調製された。期待されるサイズのインサートの存在は、EcoRIによる制限消化によって確認された。若干のポジティブクローンのプラスミドインサートが配列決定され、そして得られた配列がClustalWアラインメントプログラムを用いて比較された。
【0095】
新規GDNF同族体についての付加的なコーディング配列を得るために、EMBL/GenBank配列(acc.no.AC005038)に基づいて、931bpの期待されるサイズをもつフラグメントが、プライマーPNHsp1およびPNHap1を用いてPCRによって増幅された。PCR反応は、1xGC cDNA PCR反応バッファー、0.2mMdNTP、1MGC−MELTTM,プライマーPNHsp3およびPNHap1 200nM、Advantage KlenTaqポリメラーゼ混合物1μl、および小脳、前脳皮質もしくは海馬からのcDNA5μlまたはゲノムDNA0.5μgを含有する全容量50μlにおいて遂行された。サンプルは5分間95℃に加熱され、そしてサイクリングは、35サイクルの間95℃で45秒、58℃で1分そして72℃で1分30秒間実施されたが、最終段階は72℃で7分であった。PCR生成物は、1xTAEバッファー(40mMTris−酢酸、1mMEDTA(ナトリウム塩),pH8.3)における1%(w/v)アガロースゲルにおいて解析された。
【0096】
第2回の増幅は、ネストプライマー(PNHsp2およびPNHap2)を用いて行われた。第1回の増幅反応の1μlが、1xGC cDNA PCR反応バッファー、0.2mMdNTP、1MGC−MELTTM,プライマーPNHsp2およびPNHap2 200nMおよびAdvantage KlenTaqポリメラーゼ混合物を含有する全容量50μlにおいて使用された。サンプルは5分間95℃に加熱され、そしてサイクリングは、35サイクルの間95℃で45秒、58℃で1分そして72℃で1分30秒間実施されたが、最終段階は72℃で7分であった。サンプルは、1xTAEバッファーにおける1%(w/v)アガロースゲルにおいて解析された。期待されたサイズ(870bp)のPCRフラグメントが、ゲルから切り取られ、そしてQiaquickゲル抽出キットにより精製された。PCRフラグメントは、それらの同一性を確認するために配列決定され、そして製造者の指示にしたがって、TOPO TAクローニングキットを用いてプラスミドベクターpCR2.1−TOPO中にクローン化された。精製フラグメント約20ngが、全容量5μl中にpCR2.1−TOPOベクター1μlと合わされた。反応物は、室温(20℃)で5分間インキュベートされた。反応物2μlは、ヒートショック・トランスフォーメーションを用いてTOP1OF’受容細胞中にトランスフォームされ、そしてブルー・ホワイトスクリーニングのために10mMIPTGおよび2%(w/v)X−galを補足された2xYT/アンピシリンプレート上に平板塗布された。一夜増殖後ホワイトコロニーが、プレートから採取され、アンピシリン100mg/lを補足されたLB培地5ml中で増殖され、そしてプラスミドDNAがQiaprep Spin Miniprepキットを用いて調製された。期待されるサイズのインサートの存在は、EcoRIによる制限消化によって確認された。若干のポジティブクローンのプラスミドインサートが配列決定され、そして配列がClustalWアラインメントプログラムを用いて比較された。
【0097】
RT−PCR解析によるエノビン遺伝子発現の解析
オリゴヌクレオチドプライマーPNHsp3およびPNHap1(表1参照)が,エノビンからの502bpフラグメントの特異的PCR増幅のために使用された。6種の異なる保管遺伝子のmRNA発現レベルに標準化されたヒト多組織cDNA(MTCTM)パネルにおいて遂行された。エノビン特異的プライマーによるPCR反応は、cDNA5μl、1xGC cDNA PCR反応バッファー、0.2mMdNTP、1MGC−MELTTM,プライマーPNHsp3およびPNHap1 400nM、およびAdvantage KlenTaqポリメラーゼ混合物1μlを含有する全容量50μlにおいて遂行された。サンプルは30秒間95℃に加熱され、そしてサイクリングは、35サイクルの間95℃で30秒および68℃で30秒間であった。サンプルは、1xTAEバッファー(40mMTris−酢酸、1mMEDTA(ナトリウム塩),pH8.3)における1.2%(w/v)アガロースゲルにおいて解析され、そして臭化エチジウム染色されたゲルの像が、Eagle Eye II Videoシステム(Stratagene,La Jolla,CA,USA)を用いて得られた。
【0098】
ヒト・ニュールツリンおよびペルセフィンタンパク質配列を用いる、EMBL/GenBankデータベースの毎日最新の類似性検索が、エノビン(EVN)と呼ばれた、神経栄養因子GDNF、NTNおよびPSPに類似の推定新規タンパク質をコードしているゲノムDNA配列を得た。エノビンをコードしている領域を取り囲むゲノムDNA配列を用いる、さらなるデータベース相同性検索は、種々の組織(前立腺上皮[受託番号AA533512(ID1322952)]、肺がん腫[受託番号AA931637]および上皮小体腫瘍[受託番号AA844072])から得られる数種の発現される配列tag(EST)クローンをもたらした。これらのクローンは、GDNF、PSPもしくはNTNと相同性をもつ領域の外側のDNA配列を含有しているが、エノビンmRNAが正常および腫瘍組織において発現されることを確認した。
【0099】
ゲノム配列に基づくプライマー(PNHsp3およびPNHap1)を用いる最初のPCR増幅は、胎児、胎児脳、前立腺、前頭皮質、海馬、小脳cDNAから、そしてゲノムDNAからほぼ500bpのフラグメントを生成したが、肺cDNAからは生成しなかった。これらのフラグメントのクローニングおよび配列解析は、474bpのDNA配列をもたらし、これは、タンパク質のトランスフォーミング成長因子β(TGF−β)ファミリー(Kingsley,1994)の全メンバーの7個の保存システイン残基特性を含む139アミノ酸残基の予測されたタンパク質残基に翻訳された(図1)。また、配列は、プロドメインの切断のためのRXXRモチーフ(RAAR、アミノ酸位置23〜26)(Barr,1991)を含有した。類似の切断部位は、プロドメイン配列における比較しうる位置において、GDNF、NTNおよびPSPタンパク質配列中にも存在している。エノビンのプロドメインの切断が、イン・ビボでこの部位において起きると仮定すると、成熟EVNタンパク質配列は、113アミノ酸残基(図1において残基27〜139)を含有し、そして計算される分子質量11965Daおよび等電点11.8をもつ。成熟配列には1個の潜在的N−グリコシル化部位が存在する(アミノ酸位置121−123におけるNST)。さらに、既知の神経栄養因子GDNF、NTNおよびPSPの成熟型間に保存されるいくつかの領域が、また、エノビンにおいても存在している(図2)。表2は、BESTFITプログラムによる、GDNFファミリーメンバーの成熟タンパク質配列の比較結果を総括している。同一性パーセントおよび類似性パーセントが示される。この比較において使用されたGDNF、NTN、PSPおよびEVN成熟配列は、RXXR切断部位に続く最初のアミノ酸残基において始まる。
【0100】
【表2】
【0101】
これらの比較から、成熟エノビンタンパク質が、GDNFよりもペルセフィンおよびニュールツリンに、より密接に関連していることが明らかである。
【0102】
ゲノムEMBL/GenBank配列(acc.no.AC005038)に基づくプライマーを用いる、前頭皮質cDNAからのエノビンDNA配列の、より大きいフラグメントの増幅、クローニングおよび配列解析が、819bpの配列をもたらした。この配列は、ヌクレオチド位置30−32おける推定ATG開始コドンを含有し、そしてヌクレオチド位置285−287における終止コドンまで広がる読み枠(図3における読み枠A)をもたらす。この領域の翻訳タンパク質配列は、データベースにおけるいずれの既知タンパク質とも類似性も示さない。第2の読み枠(図3における読み枠B)におけるcDNA配列の翻訳は、159アミノ酸残基の推定タンパク質配列をもたらす。この配列は、RXXR切断部位(位置B43〜B46;ヌクレオチド位置460−471)、および成熟エノビン配列(位置B47〜B159;ヌクレオチド位置472−810)に対応する配列を含有する。RXXR切断部位および成熟エノビンコーディング配列を含む読み枠は、ヌクレオチド位置334(フレーム内終止コドンによって先行される)から位置811−813における終止コドンまで広がっている。ペルセフィン(Milbrandt et al.,1998)との類似性では、本発明者らは、スプライシングされないイントロンが、EVN遺伝子からの主要mRNA転写物中に存在すると仮定している。GDNFおよびNTNもまた、それぞれのプロドメインコーディング領域中にイントロンをもっている(Matsusita et al.,1997,Heuckeroth et al.,1997)。
【0103】
エノビンの種々のmRNA転写物の存在を評価するために、RT−PCR実験が、エノビン・コーディング配列の5’末端、可能性のある上流ATG開始コドンのまさに5’に位置するプライマー(プライマーPNHsp5[5’−GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G−3’]およびネストプライマーPNHsp6[5’−GGT GGG GGA ACA GCT CAA CAA TGG−3’]、ならびに3’末端に位置するプライマー(プライマーPNHap1およびネストプライマーPNHap2[表1参照]を用いて遂行された。実験は、ヒト多組織cDNAパネル(Clontech MTCパネルIおよびII),胎児心臓cDNAライブラリー(Clontech)およびヒト小脳、海馬もしくは前頭皮質から得られたcDNA(Masure et al.,1998)において遂行された。1次PCR反応は、GCリッチ条件下でプライマーPNHsp5およびPNHap1を用いて(Advantage−GC PCRキット(Clontech)、既述のように30サイクル(95℃−30秒、60℃−30秒、72℃−1分)の間遂行された。ネストPCR反応は、同じ条件下でプライマーPNHsp6およびPNHap2を用いて30サイクルの間遂行された。得られるPCR生成物は、1.5%アガロースゲルにおいて解析され、そしてサイズは±350bp〜±800bpにわたった。いくつかのバンドがゲルから精製され、そしてPCRフラグメントが直接配列決定された。また、若干の精製PCR生成物が、また、ベクターpCR2.1−TOPO(TOPO−TAクローニングキット、Invitrogen)中にクローン化され、次いで配列決定された。
【0104】
配列解析は、エノビン配列を含有する種々のmRNA分子の存在を確認した。得られたフラグメント配列は、ゲノムエノビン配列と比較された。これにより、ゲノム配列におけるいくつかの可能な5’および3’スプライシング部位を同定することができた(図21)。すべてのこれらのスプライシング部位は、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位に対する共通配列に対応した(Senapathy,p.,Shapiro,M.B.&Harris,N.L.(1990))splice junctions,branch point sites,and exons:sequence statistics,identification,and applications to genome project.Methods Enzymol.183,252−278)。同定された種々のエノビンスプライシング変異体およびそれらの種々のヒト組織における存在が図22に総括される。5種の配列決定された転写物のわずか2種が、ATG開始コドンからの翻訳により機能的なエノビンタンパク質を生成する。これらの2種の転写物は、それぞれ47および39アミノ酸残基の予想シグナルペプチドをもつアミノ酸228もしくは220個のタンパク質をコードしている。これら2種の変異体の予想されるタンパク質配列は、図23(長い変異体)および図24(短い変異体)に示される。長い変異体は、場所5’−1および3’−1における第1のイントロンを、そして5’−2および3’−3における第2のイントロンをスプライシングアウトすることによって図21のDNA配列から得られると推定できる。読み枠の翻訳によって、図23の予測されたタンパク質配列が得られる。より短い変異体は、場所5’−1および3’−2における第1のイントロンを、そして5’−2および3’−3における第2のイントロンをスプライシングアウトすることによって図21のDNA配列から得られると推定できる。読み枠の翻訳によって、図24の予測されたタンパク質配列が得られる。
【0105】
最も長い転写物は、図22Bにおけるバンドの強さによって判定されるようにほとんどの組織において最も豊富にそんざいすると思われる。より短い転写物は、GDNF,NTNおよびPSPと相同な成熟エノビンアミノ酸配列を失っている翻訳タンパク質を生成するフレームシフトをもたらす。2種の最小の転写物は、7個の高度に保存されたシステイン残基の2個を含む、成熟コーディング配列の一部を失ってさえいる。図22Bは、種々のヒト組織における主なスプライシング変異体の分布を示す。機能的なエノビンmRNAは、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、結腸、小腸、抹消血液白血球、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、胎盤および胎児心臓を含む、試験されたほとんど全ての組織において発現される。若干のヒト組織(例えば小脳、海馬)では、非機能的な転写物のみが、PCRによって増幅することができた。本発明者らの知識にとって、そのような程度までの非機能的なmRNA転写物の出現は、以前には既述されていなかった。この発見の生物学的意義は、研究されるべく残されている。種々の組織におけるNTNおよびPSPの発現は完全には特徴付けられていないけれども、それらの発現レベルは、非常に低く、そしてある種の組織に、より限定された発現であると思われる(Kotzbauer et al.,1996,Milbrandt et al.,1998)。
【0106】
E.コリ(E.coli)におけるエノビンの組み換え発現
エノビン発現プラスミドの構築
414bpPCRフラグメントが、プライマーPNHsp4およびPNHap2(表1)を用いてヒトゲノムDNAから増幅され、TA−クローニング(Invitrogen)を用いてベクターpCR2.1−TOPO中にクローン化された。インサートの配列は、配列解析によって確認された。エノビン共通配列をもつインサートを含有する1つのクローン(クローン36)が、続く発現プラスミドの構築のために使用された。2種のプラスミドが、それらの5’末端において適当な制限部位を含有するように設計された。正プライマーPNHexp−sp1(5’−GCG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A−3’)は、BamHI制限部位(下線)を含有し、そして逆プライマーPNHexp−ap1(5’−GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G−3’)は、XhoI制限部位(また下線)を含有した。これらのプライマーを使用して、成熟エノビンをコードしている343bpフラグメント(図1における位置81〜422)が、クローン36から増幅された。PCR反応は、1xGC cDNA PCR反応バッファー、0.2mMdNTP、1MGC−MELTTM,プライマーPNHexp−sp1およびPNHexp−ap1 200nM、Advantage KlenTaqポリメラーゼ混合物1μl、およびクローン36からのプラスミドDNA10ngを含有する全容量50μlにおいて遂行された。サンプルは5分間94℃に加熱され、そしてサイクリングは、25サイクルの間94℃で45秒、58℃で1分そして72℃で30秒間実施されたが、最終段階は72℃で7分であった。得られる50μl生成物は、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製され、そしてDNAは30μlに溶出された。この精製生成物25μlが、次に、1xバッファーB(Boehringer Mannheim)中BamHI 10UおよびXhoI 10Uを含む反応液30μlにおいて37℃で1時間消化された。1xTAEバッファー(40mMTris−酢酸、1mMEDTA(ナトリウム塩),pH8.3)における1%(w/v)アガロースゲルにおける電気泳動の後、期待される353bpバンドが、ゲルから切除され、そしてQiaquickゲル抽出キットを用いて精製された。得られるフラグメントは、BamHIとXhoIにより線状にされたベクターpRSET B(Invitrogen)中に連結された。得られるプラスミド構築物のインサート(hEVNmat/pRSETB)は、完全配列解析によって確認された。得られる構築物は、成熟エノビンコーディング配列にフレーム内融合されたNH2末端6xHis−tagを含む推定分子質量15704Daをもつ146アミノ酸タンパク質をコードしている。かくして、得られるタンパク質のNH2末端アミノ酸配列は、
【表3】
【0107】
BL21(DE3)E.コリ細胞におけるエノビンの発現
エノビンタンパク質の組み換え生産は、本質的に、Creedon et al.(1997)によるニュールツリンに関する記述のように改変して遂行された。組み換えエノビンタンパク質の生産のために、プラスミドhEVNmat/pRSETBが、E.コリ菌株BL21(DE3)(Novagen)中にトランスフォームされ、そして2xYT/アンピシリン培地(トリプトン16g/l、酵母エキス10g/l、NaCl 5g/lおよびアンピシリン100mg/l)において、発現を誘導するために最終濃度0.2mMまでIPTGを添加する前に、OD600約0.5まで30℃(225rpm)または37℃(300rpm)において増殖された。3時間の誘導時間に続いて、細胞ペレットが遠心によって回収され、リン酸バッファー食塩水で洗浄され、遠心され、そして凍結保存された。精製および再生(refolding)では、細胞ペレットは、音波処理バッファー(20mMTris−HCl,pH8.0,300mMNaCl,1mM2−メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤(CompleteTMプロテアーゼ阻害剤反応混液タブレット(Boehringer Mannheim,50mlバッファー当たり1タブレット)および細胞ペレット500mg当たりリゾチーム1mg)中に再懸濁された。細胞が音波処理によって破壊され、そして封入体が遠心によって回収された。封入体は、バッファーA(8M尿素、20mMTris−HCl,pH7.6,200mMNaCl,1mM2−メルカプトエタノール)に溶解され、そして37℃で30分間インキュベートされ、その後Ni−NTA樹脂(ニッケルニトリロ三酢酸、Qiagen)に添加された。37℃で40分振盪後、サンプルがバッファーAで1回洗浄され、そして5mlNi−NTAカラム上に負荷された。カラムは、連続して10カラム容量のバッファーA、10カラム容量のpH7.2のバッファーAおよび10カラム容量のpH7.2+10mMイミダゾールのバッファーAで洗浄された。エノビンは、カラムから、4カラム容量のpH7.2+200mMイミダゾールのバッファーAにおいて溶出された。
【0108】
エノビン再生は、各段階において減量する尿素(6M−4M−3M−2M−1M−0.5M−0M尿素)を含有する再生バッファー(0.1Mリン酸ナトリウム、0.15MNaCl、3μMシステイン、0.02%Tween−20、10%グリセロール、0.01MTris−HCl、pH8.3)中、4℃において段階的な一夜透析によって遂行された。精製タンパク質は一定量づつ分けられ、−20℃で保存され、そしてさらに機能アッセイに使用された。
【0109】
エノビン遺伝子の染色体局在
エノビン遺伝子の3.3kbフラグメントが、EMBL受託番号AC005038の配列において設計されたプライマーEVN(7)−sp1(5’−TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC−3’)およびPNHap1(5’−GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G−3’)を用いて小脳cDNAから増殖された。PCR反応は、1xExpand Long Template PCR反応バッファー(Boehringer Mannheim)、0.5mMdNTP、1MGC−MELT(Clontech Laboratories),プライマーEVN(7)−sp1およびPNHap1 400nMおよび小脳cDNA1μlを含有する全容量50μlにおいて遂行された。最初94℃で2分間後、Expand Long Template ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)が添加され、そしてサイクリングは、10サイクルの間94℃で10秒、58℃で30秒そして68℃で3分間実施された。次いで、さらなるサイクルは、各サイクル20秒づつ68℃で伸長時間を増加しつつ遂行された。最終68℃で7分が、また含まれた。得られる3.3kbフラグメントは、0.8%アガロース/TAEゲルにおける電気泳動後精製され、そしてTA−クローニング(Invitrogen)を用いてベクターpCR2.1−TOPO中にクローン化された。1つのクローンの3.3kbインサートの完全配列解析は、得られたcDNA配列が、EMBLデータベース中のゲノム配列(受託番号AC005038)に対応することを確認した。小脳cDNAから得られたcDNAにおいて、イントロンはスプライシングアウトされなかった。
【0110】
染色体マッピング研究は、本質的に既述の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を用いて実施された(Heng et al.,1992,Heng & Tsui,1993)。ヒト・リンパ球が、37℃で68〜72時間培養された後、細胞集団における細胞周期を同調させるために5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)0.18mg/mlにより処理した。同調された細胞は洗浄され、そして37℃で6時間再培養された。細胞が収穫され、そして低張処理、固定および風乾を含む標準操作を用いて、スライドが調製された。エノビンについての3.3kbプローブがビオチン化され、そしてFISH検出に使用された。スライドは、55℃で1時間乾かされ、RNaseで処理され、そして2xNaCl/Cit(20xNaCl/Citは3MNaCl、0.3Mクエン酸二ナトリウム、pH7.0である)中70%ホルムアルデヒド中で70℃2分間変性され、続いて、エタノールで脱水された。プローブは、変性染色体スライドに装填する前に変性された。一夜ハイブリダイゼーションの後、スライドが洗浄され、そしてFISHシグナルおよび4’,6’−ジアミジノ−2−フェニルインドール・バンディングパターンが、写真フィルム上に別々に記録され、そして染色体バンドによるFISHマッピングデータの割り当てが、FISHシグナルを4’,6’−ジアミジノ−2−フェニルインドールで縞模様にされた染色体と重ね合わせることによって達成された(Heng & Tsui,1993)。使用された条件下で、ハイブリダイゼーション効率は、このプローブでは約72%であった(100個のチェックされた有糸分裂図中で、それらの72個が、1対の染色体においてシグナルを示した)。4’,6’−ジアミジノ−2−フェニルインドール・バンディングが、特定の染色体を同定するために使用されたので、プローブからのシグナルと染色体1の短い腕との間の割り当てが得られた。さらに、詳細な位置は10枚の写真からの総括に基づいて決定された(図4A)。使用された条件下のFISH検出によって選ばれるさらなる座はなく、したがって、本発明者らは、エノビンがヒト染色体1、領域p31.3−p32に位置すると結論する。マッピング結果の例は図4Bに提示される。
【0111】
National Center for Biotechnology Information(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap)における遺伝子マップデータから、エノビン配列(EMBL受託番号AC005038)を含有するゲノムクローンは、染色体1において、マーカーD1S2843とD1S417間に位置すると推定できる。これは、染色体1、領域p31.3−p32.3に対応し、FISH解析によって得られたデータを確定する。
【0112】
ノザンブロットおよびドットブロット解析によって決定されるエノビンの組織分布
種々のヒト組織から得られたポリ(A)−リッチRNAを含有するノザンブロット(Clontech Laboratories,Palo Alto,CA,USA;MTNTMブロット、MTNTMブロットIIおよび胎児MTNTMブロットII)が、製造者の指示にしたがって、(α−32P−dCTPランダムプライミング標識(HighPrimeキット、Boehringer Mannheim)された897bpエノビンフラグメントとハイブリダイズされた。このフラグメントは、前頭皮質cDNAにおいてプライマーPNHsp1およびPNHap1を用いるPCR増幅、続くベクターpCR2.1−TOPO中へのクローニングによって得られた。フラグメントは、終止コドンまでのエノビン配列897bpを含有し、そして成熟エノビンタンパク質の完全コーディング配列を含む。
【0113】
エノビンmRNAは、約4.5kbの主転写物として検出された(図5A−C)。エノビンmRNAは、組織の範囲内、もっとも著しくは心臓、骨格筋、膵臓および前立腺において発現される。若干の比較的小サイズの転写物は、例えば胎盤(4kb,2.4kbおよび1.6kb)および前立腺(4kbおよび1.6kb)に存在している。胎児組織では、顕著な2.4kb転写物は、肝臓に、そしてより少ない程度で肺に存在している。また、他の転写物は、胎児腎臓、肝臓、肺および脳に存在している。
【0114】
さらにまた、種々のヒト組織および発生段階からのポリ(A)リッチRNAを含有するRNAマスターブロット(Clontech Laboratories)が、897bpエノビンプローブとハイブリダイズされた。このブロットを作成するために使用されたポリ(A)リッチRNAサンプルは、製造者による8種の異なる保管遺伝子のmRNA発現レベルに標準化された。エノビンmRNAは、偏在的に発現されるが、もっとも高いレベルは、前立腺、下垂体、気管、胎盤、胎児肺、膵臓および腎臓において明白であった(図5D+E)。
【0115】
GFRα−IgG−Fc融合ベクターの構築
シグナルペプチドおよびGPI固定に関与するCOOH−末端疎水性領域をコードしている配列を除いてGFRα−1、GFRα−2およびGFRα−3(アミノ酸27〜427、20〜431および28〜371をそれぞれコードしている)のcDNA領域が、発現ベクターSignal pIg plus(R&D Systems Europe Ltd)中にインフレームにクローン化された。これらの構築物から発現される得られるタンパク質は、17アミノ酸NH2−末端CD33シグナルペプチド、GFRαタンパク質領域および243アミノ酸COOH−末端ヒトIgG1−Fc融合ドメインを含有する。CHO細胞は、GFRα融合構築物によりトランスフェクションされ、そして安定にトランスフェクションされた細胞が、G418 500μgを用いて選択された。永久クローンは、抗Fc抗体を用いて選択された。GFRα融合タンパク質の精製では、細胞が血清不含培地で増殖され、そして培地が3日後毎に回収された。培地は遠心され、そしてプロテインAカラム(Protein A Sepharose,Pharmacia Biotech)に適用された。結合タンパク質は、0.1Mクエン酸Na、pH3.0で溶出され、そして1MTrisバッファー、pH8.4中に回収された。タンパク質濃度は、吸光係数1.5を用いて280nmにおける吸光度によって評価された。これらの精製された可溶性GFRα−1〜−3Fc融合タンパク質は、続いての結合研究のために使用された。
【0116】
表面プラズモン共鳴解析
表面プラスモン共鳴(SPR)実験は、BIAcore3000装置を用いて25℃において行われた。解析は、固定化リガンドとしてのエノビンおよびNGFにより遂行された。FIセンサーチップのカルボキシル化マトリックスが、最初に、400mMN−エチル−N−(ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミドおよび100mMN−ヒドロキシ−スクシンイミドの1:1混合液により10分間活性化された。次いで、組み換えエノビンおよびNGFが、10mM酢酸バッファー,pH4.5において流速5μl/minで活性化された表面上に適用された。占有されなかった反応基は、1Mエタノールアミン塩酸塩で不活性化された。結合実験では、可溶性GFRα1−3−Fcが、HEPESバッファー食塩水(150mMNaCl,3.5mMEDTA,0.05%P−20、10mMHEPES,pH7.4)中濃度10〜100nMにおいて、流速10μl/minで流下された。会合が3分間モニターされ、そして1分間解離され、続いて、5mMNaOHにより再生された。解離は、HEPESバッファー食塩水を流下することによって開始された。BIAcore評価ソフトウエアー,3.0が、会合速度(Ka)、解離速度(Kd)および平衡解離定数(kp,Kd/Kaとして算出される)を計算するために使用された。
【0117】
結果
SPRが、固定化エノビンへの可溶性GFRα1−3の結合を測定するために使用された。エノビンの特異的結合は、可溶性GFRα3によってのみ検出できた。GFRα1およびGFRα2は、固定化エノビンには結合しなかった。観察されたGFRα3の結合は特異的であり、したがってNGFへの結合は存在しなかった。別の対照実験では、固定化NGFへのTrkA−Fc(NGF受容体)の特異的結合は、固定化エノビンへの結合なしに検出された。
【0118】
GFRαの異なる3濃度を用いて得られた結合曲線から、次の表3に示される定数が引き出された。これらの結果は、GFRα3が特異的にエノビンに結合することを例証している。
【0119】
【表4】
【0120】
GDNF,NTNおよびPSPの全ては、種々のタイプのニューロン細胞の維持および生存を促進するので、エノビンが、神経細胞および多分他の細胞タイプにも類似の生物学的効果を有することが期待される。したがって、エノビンタンパク質が、一般に、パーキンソン病、アルツハイマー病、末梢神経病、筋委縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病、急性脳損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、末梢神経傷害もしくは損傷および神経毒曝露を含む、神経障害の治療において有用であろうということが想起される。
【0121】
また、エノビンは、種々の面の神経保護において有用であろう。種々のニューロン細胞集団の生存および本発明者らのSHSY5Y細胞モデルで観察された軸索伸長に及ぼすその効果を考慮すると、本発明者らは、この化合物が、神経保護および神経再生適用をもつであろうと提案する。
【0122】
このことは、次の観察に基づいている。タキソールは、NGFで分化されるPC12ラット褐色細胞腫においてニューロンアポトーシスを誘発する(Nuydens et al.,提出)。したがって、タキソール誘発細胞障害は、DNAフラグメント化、Annexin V標識およびbcl−2保護によってモニターされるようなニューロンアポトーシスの特徴を有する。したがって、延長として、タキソールが分化SH−SY5Y細胞におけるアポトーシスを誘発することが推定できる。エノビンは、この細胞死を減少できることが、ここに示され、したがって一般にニューロンアポトーシスを逆流させるであろう。
【0123】
したがって、本化合物は、アポトーシスが観察される次の神経変性症状、卒中(Hakim 1998)、パーキンソン病(Marsden et al 1998)、アルツハイマー病(Nagy et al 1998)、ハンチントン病(Wellington et al.1997)、神経傷害(Smirnova et al.1998)、末梢神経病(Strinivisan et al.1998)において役立つであろう。
【0124】
最後の臨床適応の例のように、本発明者らは、この神経栄養因子は、実際に、タキソール誘発細胞障害に対して、分化されたSH−SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞を保護することを示した。
【0125】
生存率測定の方法
細胞生存率は、0.02mMフェナジンメトサルフェート(PMS,Sigma)を補足したDMEM(37℃)中、2,3−ビス[2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル]−2H−テトラゾリウム−5−カルボキシアニリド(XTT,Sigma)1mg/ml溶液の100μlを、各ウェルに添加することによって決定された。次いで、プレートは、37℃で2.5時間インキュベートされた。光学密度は、標準として650nmを用いて、450nmにおいて読まれた(Molecular devices)。XTTアッセイは、テトラゾリウム塩XTTの赤色ホルマザン生成物への転化に基づいている。この反応は、ミトコンドリア酵素によって遂行される。
【0126】
ニューロン分化の方法
1.ヒト神経芽細胞腫SHSY5Y細胞における分化
SHSY5Y細胞が、25nMスタウロスポリンにより5日間分化される。エノビンの効果は、実験開始後72時間目に測定される。(引用文献 Jalava et al.”プロテインキナーゼ阻害剤スタウロスポリンは、a,b,z PKC独立経路を通してSH−SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞において成熟ニューロン表現型を誘発する”Journ cell Physiol 155,301−312(1993))。
【0127】
2.軸索伸長の測定。
【0128】
ニューロンの形態学的変化が、次にように自動的に定量された。簡単に言えば、適当な時間において、グルタルアルデヒドが、培地に直接添加され、そして室温で30分間放置された。これは、その時点における細胞の形態が、実際の状況を反映することを確認した。細胞は、Indyワークステーション(Silicon Graphics,Mountain View,USA)によって作動されるMarzhauserスキャニングステージを備えたAxiovert顕微鏡(Zeiss Oberkochen,Germany)において、透過光方式により観察された。影像は、MX5ビデオカメラ(HCS)を用いて撮影された。約3000細胞が、像の8x8四角格子を形成している64の整列された像において評価された。像の正確な整列は、軸索が、1つの像視野から次まで続くことを確認した。ポリクローナルtau抗体によって標識された軸索伸長の自動検出は、曲線構造の無偏向検出器(Steger 1998)を用いて遂行された。解析ソフトウエアーは、全細胞体面積、細胞体数および全軸索長を自動的に算出した。
【0129】
種々の細胞タイプへのエノビンの影響を検討するために、2つのアッセイ、DNA合成アッセイと走化性アッセイが行われた。
【0130】
DNA合成アッセイ
ヒト皮膚繊維芽細胞(39SK)、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト平滑筋細胞(HSMC)、ヒト軟骨細胞およびラット骨芽細胞を含む細胞が、10%FBSを含有するDMEM(39−SK、HSMC、ラット骨芽細胞)または合成培地(骨芽細胞およびHUVEC)において5%CO2および95%空気を含む37℃において維持された。DNA合成アッセイでは、細胞が、96穴組織培養プレートにおいて、10%FBSを含有するDMEM中に5000細胞/ウェルの密度で接種され、そして24時間培養された。次いで、培地は、種々の濃度のエノビンおよび0.1%BSAを含有するDMEM(39−SK、骨芽細胞、HSMC、軟骨細胞のため)または種々の濃度のエノビンおよび0.5%FBSを含有するDMEM(HUVECのため)により置換され、そして細胞は24時間培養された。続いて、培地は、5%FBSおよび0.1μCiの[3H]−チミジンを含有するDMEM100μlで置換された。2時間のパルスラベルに続いて、細胞は、室温で1時間メタノール/酢酸(3:1,vol/vol)により固定された。固定細胞は80%メタノールで2回洗浄された。細胞は0.05%トリプシン(100μl/ウェル)において30分間、そして0.5%SDS(100μl/ウェル)においてさらに30分間可溶化された。細胞溶解物の一定量(180μl)がシンチレーション混液2mlと合わせられ、そして細胞溶解物の放射能が液体シンチレーションカウンター(Wallac 1409)を用いて測定された。
【0131】
走化性アッセイ
細胞は「DNA合成アッセイ」において記述されたように維持された。エノビンの走化活性は、12穴改変Boydenチャンバー(McQuillan,D.J.,Handley,C.J.,Campbell,M.A.,Bolis,S.,Milway,V.E.,Herington,A.C.,(1986),「培養ウシ関節間軟骨における血清およびインシュリン様成長因子−Iによるプロテオグリカン生合成の促進」,Biochem.J.240:423−430)を用いて分析された。細胞は、0.05%トリプシンおよび0.5mMEDTAを用いてトリプシン処理され、そしてDMEM中に再懸濁された。Boydenチャンバーの下部ウェルに、種々の濃度のエノビンを含有する培地の一定分量150μlが添加された。タイプIコラーゲン0.1mg/mlでコーティングされたポリカーボネートメンブラン(8μm)が、下部ウェルの上に置かれ、続いて上部ウェルを組み立てた。上部ウェルには、細胞(70,000細胞/ml)の一定量100μlが添加された。6時間の培養時間後、装置が解体された。メンブランの上に残っている細胞が除去された。メンブランは、10%ホルムアルデヒドにより15分間固定され、続いてGillのストレングス ヘモトキシリン(strength hemotoxylin)によって染色された。細胞が顕微鏡下(250x倍率)でカウントされ、そして各ウェルの5区域からの平均細胞数が使用された。各実験は少なくとも4回繰り返された。結果は対照(0.1%BSA含有DMEM)の倍数として表された。
【0132】
図8〜18における結果によって具体的に説明されるように、エノビンは、使用された各細胞タイプの増殖、または前述のようにHUVEC細胞の遊走(図14)には効果をもたなかった。SH−SY−5Y神経芽細胞腫細胞にはエノビンの効果があった。このことは、ニューロン細胞に及ぼすエノビンの選択的効果を例証した。
【0133】
両GDNFおよびNTNは、リガンド結合サブユニット、GFRα−1かGFRα−2のいずれか、およびシグナリングサブユニット、cRETタンパク質チロシンキナーゼからなるシグナリング複合体を経てシグナルを送ることが分かった。エノビンは、cRETもしくはその他のシグナリングパートナーと組み合わされたGFR結合パートナー(GFRα−1、GFRα−2、近年特定されたオーファン受容体GFRα−3または他のまだ特定されてないGFRαファミリーのメンバーのいずれか)からなる類似のシグナリング複合体を経てその生物学的効果を発揮することが期待される。事実、本発明者らのデータは、エノビンがGFRα−3に特異的に結合できることを示している。
【0134】
ヒトでは、GDNFもしくはcRETにおける生殖系突然変異が、多発性内分泌新形成および家族性ヒルシュスプルング病(HSCR)を含むいくつかの疾病表現型を起こすことができる(Romeo et al.,Edery et al.,1994,Angrist et al.,1996)。両疾病は、乳児における先天性腸閉塞のもっとも共通する原因であるヒルシュスプルング病とともに、消化管運動性欠乏と関連される。興味あることに、GDNFおよびcRETノックアウトマウスは、腎発育不全および腸無神経節症(aganglionosis)と類似の病理を顕著に現す(Sanchez et al.,1996;Moore et al.,1996;Pichel et al.,1996)。エノビンは、消化管もしくは腎臓の類似の障害に関与することができるか、あるいはそれは、偏在的に発現されるので、身体における他の末梢器官の発達に重要であるかもしれない。
【0135】
それらの受容体とリガンドとの相互作用は、一般に、両タンパク質における特定の残基からの特異的結合の相互作用によって達成される。タンパク質のフラグメントは、その受容体を活性化する作動剤として働いて細胞においてその成長促進および生存維持効果を惹起することができる。したがって、エノビンタンパク質配列に基づくエノビンの一部もしくは合成ペプチドは、その受容体GFRα3を調節するべき作動剤もしくは拮抗剤として有用である。ペプチド合成もしくは組み換え技術を用いて、GDNF、NTNもしくはPSPの一部、またはエノビンの一部をもついずれか他の神経栄養もしくは成長因子を含んでなるハイブリッド成長因子が製造されて、新しい性質をもつ新規な合成成長因子を得ることができる。
【0136】
2つの試行が、ラットにおいて足底下に注射後、エノビンが、ラットにおけるタキソール誘導感覚欠乏を変化できるか否かを試験するために行われた。第1の実験では、エノビンによる単回処置が、タキソール誘導感覚欠乏を逆転できるか否かが試験され、一方第2の試行では、エノビンが、タキソール誘導感覚欠乏の発生を防ぐことができるか否か試験された。
【0137】
タキソール誘導感覚機能障害の経時的回復
操作
オスのSprague−Dawleyラット、体重300〜340グラムが使用された。動物は、食餌および任意の水により個々に飼われた。実験開始前に、動物は標準の観察ケージに入れられ、そして15分の順応後、針突き反射が評価された。そうするためには、動物の右足の足底面が針により刺激され、そしてこの針突きに対する反応性が存在(スコア=1)もしくは不在(スコア=0)のいずれかで記録された。1試行内に、操作は、2度の連続刺激提示間に1分の間隔を置いて3回繰り返された;そのような針突き試験は、針突きに対する反応性の3測定値からなった。3回の針突きにおいて正常な反応を有するラットのみが、実験に含まれた。
【0138】
連続3日間の午前に、動物はタキソール(クレモホルおよび無水アルコールプラス水中に溶解されたパクリタキセル3mg/ml)50μlの足底下注射を、右後ろ足に毎日受けた。翌午前中に、針突き反射が再評価され、そして3回の刺激提示に対していかなる反応性も示さない動物が、ランダムにサブグループ(n=10/グループ)に分けられて、媒質、食塩水またはエノビン23もしくは130μg/mlのいずれか75μlの右後ろ足における足底下注射を受けた。媒質および食塩水処置された動物の結果の間に差異は観察されなかったので、両グループは一緒にされた(対照グループ)。最後の処置後1、4、5および7日目に、針突き試験が、午前(8〜9am)および午後(3.30〜4.30pm)両方に行われた。8日目には、最終針突き試験が午前中に行われた。各動物では、針突きに対する反応性の累積スコアが経時的に測定された。全部で9回の針突き試験(各々、3回の針突き提示からなる)が最後の薬物処置後に遂行されたので、実験の全期間にわたって到達される最高スコアは27である。
【0139】
結果
連続3日間のタキソールの反復足底下注射は、大部分の動物において針突き刺激に対する応答を欠如させる急性炎症反応をもたらした。食塩水もしくは媒質の足底下注射は、タキソール誘導感覚欠乏に影響を与えなかった。最初の測定では、20の対照のうち4対照のみが、3回の針突きに対して少なくとも1回の反応を示し、最初の測定における対照の平均(±SEM)針突きスコアは0.25(±0.12)であった;これは、全動物が針突きに応答したので平均スコアが3.0(±0.0)であった実験の開始時とは対照的である。測定の8日後でさえも、なお、対照における反応性は、20ラット中11ラットが少なくとも1回反応し、そして平均針突きスコア0.75(±0.18)もつように弱められた。この対照グループ内では、どのラットも全3回の刺激に対して正常な反応性を示さなかった。経時的な対照の累積針突きスコアが図19に示される。動物は、8日間にわたって9回試験されたので、各試験において3回の針突きにより到達される最高スコアは27である。グラフに見られるように、食塩水もしくは媒質の足底下注射は、タキソール誘導感覚欠乏を試験された期間にわたって回復できなかった。実験の最後における対照の平均全累積スコアは5.10(±0.87)であって;到達される最高スコアの18.9%であった。
【0140】
23μg/mlエノビン75μlの単回足底下注射は、最初の測定後少なくとも1回応答する10ラット中4ラットをもたらし、平均針突きスコアは0.70(±0.33)であった。8日目には、全10動物が、針突きに対して少なくとも1回応答し、そして正常な反応性は10ラット中5ラットに存在した。8日目におけるこのグループの平均針突きスコアは2.20(±0.29)であった。対処に比較すると、測定8日目の最後の平均累積スコアは、有意に増加され(Mann−Whitney U−test,two−tailed,p<0.01)、平均針突きスコア14.50(±1.96)に達した(図19)。これは、最高スコアの53.7%であった。
【0141】
また、130μg/mlエノビンの足底下注射によっては、対照に対して改善された効力があった。130μg/mlエノビン後の最初の測定では、10ラット中6ラットが少なくとも1回応答し、平均針突きスコアは1.10(±0.35)であった。8日目には、全10動物が、少なくとも1回針突きに対して応答し、平均針突きスコアは2.60(±0.22)であった。3回の針突きに対する正常な反応性は10ラット中8ラットに存在した。この実験の最後の平均累積総針突きスコアは、17.20(±1.94)であった。これは、総可能スコアの63.7%であり、そして対照グループに比べて有意に改善された(p<0.01)。
【0142】
タキソール誘導感覚機能障害の経時的予防
操作
オスのSprague−Dawleyラット、体重300〜340グラムが使用された。動物は、食餌および任意の水により個々に飼われた。実験開始前に、動物は標準の観察ケージに入れられ、そして15分の順応後、針突き反射が評価された。そうするためには、動物の右足の足底面が針により刺激され、そしてこの針突きに対する反応性が存在(スコア=1)もしくは不在(スコア=0)のいずれかで記録された。1試行内に、操作は、2度の連続刺激提示間に1分の間隔を置いて3回繰り返された;そのような針突き試験は、針突きに対する反応性の3測定値からなった。3回の針突きにおいて正常な反応を有するラットのみが、実験に含まれた(針突きスコア=3)。この対照測定の後、動物はランダムにサブグループ(n=10/グループ)に分けられて、媒質、食塩水またはエノビン23もしくは130μg/mlのいずれか75μlの右後ろ足における足底下注射を受けた。媒質および食塩水処置された動物の結果の間に差異は観察されなかったので、両グループは一緒にされた(対照グループ)。連続3日間、動物はタキソール(クレモホルおよび脱水アルコールプラス水中に溶解されたパクリタキセル3mg/ml)50μlの足底下注射を右後ろ足に毎日受けた。タキソール後1、4、5および7日目に、針突き試験が、午前(8〜9am)および午後(3.30〜4.30pm)両方に行われた。8日目には、最終針突き試験が午前中に行われた。各動物では、針突きに対する反応性の累積スコアが経時的に測定された。全部で9回の針突き試験(各々、3回の針突き提示からなる)がタキソール処置後に遂行されたので、実験の全期間にわたって到達される最高累積スコアは27である。
【0143】
結果
タキソール前の食塩水もしくは媒質の足底下注射は、針突き試験においてタキソール誘導感覚欠乏を防ぐことができなかった。タキソール後の最初の試験では、20ラットの内8ラットが、針突きに対して少なくとも1回応答し、平均針突きスコアは0.60(±0.18)であった。8日目には、タキソール誘導感覚欠乏は、なお存在し、20動物中8匹のみが応答し、そして平均スコア0.8(±0.25)もっていた。2動物では、標準化針突き反射が存在した。また、経時的に、累積針突きスコアは減少し、平均値6.55(±1.08)をもたらし、これは最高スコアの24.3%であった(図20)。
【0144】
23μg/mlエノビンによる前処置は、針突きにおいてタキソール誘導感覚欠乏を軽減した。1日目には、10動物中8匹が少なくとも1回応答し、そして平均針突きスコアは1.70(±0.40)であった。8日目には、全動物が応答し、平均スコアは2.50(±0.27)であった。ここでは、7動物が、すべての針突き曝露において正常な反応性を現した。経時的な累積応答に関して(図20)、平均総スコアは、対照レベルを超えて18.40(±1.73)まで有意に改善された(p<0.01);これは最高値の68.1%である。
【0145】
比較しうる結果は、130μg/mlエノビンによる前処置後に得られた。ここでは、10動物中6匹が、最初の試験の間に応答し、平均針突きスコアは1.70(+0.31)であった。8日目には、全10動物が、少なくとも1回、針突き刺激に対して反応していて、平均スコアは2.40(+0.22)であり、そして全3回の反応は、動物の半数において正常であった。累積スコアに関しては、8日目に得られた平均スコアは、17.70(±1.92)であり、総スコアの65.5%を表している。
【0146】
本一連の実験は、エノビンの単回足底下注射が、針突き試験によって測定されるようなタキソール誘導感覚欠乏を軽減することができることを示している。活性は、薬物が両タキソール前後に適用された場合に見られる。
【0147】
エノビンは、主として末梢および中枢の神経に由来する成分による疼痛症候群、リューマチ/炎症疾患ならびにコンダクタンス障害のための可能性のある候補薬であり、そして経皮、局所、局部、中枢(例えば硬膜外、夾膜内など)および全身適用後の感覚行程における調整的役割を演じることができる。
【0148】
さらに、先に述べられた分野における生理病理学的変化をスクリーニングするための診断道具としてエノビンを使用することは価値あることである。
【0149】
正常対病変組織におけるエノビンmRNA発現の比較
エノビンmRNAの発現は、Pharmagene Laboratories Ltd,Royston,United Kingdomにおいて開発され、実施されている専有技術を用いて、ABI Prism7700 Sequence Detection System(TaqMan;Perkin Elmer)を使用して定量的に分析された。システムは、PCRの間に配列特異的蛍光シグナルを生成する蛍光発生プローブを使用する。プローブは、結合された蛍光リポーターおよび消光染料をもつオリゴヌクレオチドであり、それは、正および逆PCRプライマーの間に位置している。インタクトである間は、リポーター蛍光の強度は、消光剤によって抑制される。プローブが複製複合体の一部を形成すると、蛍光リポーターが、Taqポリメラーゼにおける固有の5’〜3’エキソヌクレアーゼ活性によって消光剤から切断される。反応中の蛍光リポーターシグナルの増強が、PCR生成物の集積の直接測定値である。mRNA標的配列の出発コピー数(Cn)は、分画PCRサイクル数(Ct)を決定することによって確立され、このCtにおいて、PCR生成物が最初に検出され−この点において、蛍光シグナルが閾基線を越える。各サンプルにおける標的mRNA量の定量は、実験的Ct値と標準曲線との比較を通して確立される。
【0150】
RNA調製および品質管理
総RNAが、全組織および小分断組織から、発売者のプロトコールにしたがって、Triz−zol試薬(Life Technologies,Gaithersburg,MD,USA)を用いて単離された。全RNAサンプルについての品質管理操作は、完全性(インタクト18Sおよび28SリボソームRNA)の検査および高含有量(アクチン)と低含有量(トランスフェリン受容体)転写物の存在の決定を含む。
【0151】
プライマー/プローブ設計
1対のプライマーおよびTaqManプローブが設計されて、エノビンからの特異配列が増幅された。
【0152】
【表5】
【0153】
さらに、イントロンにまたがり、そしてヒトGAPDH遺伝子の一部分を増幅する1対のプライマーおよびTaqManプローブが設計された。
【0154】
【表6】
【0155】
プローブ5はフルオルFAMで標識され、一方、プローブ6はフルオルVICで標識された。
【0156】
総RNAのDNアーゼ処理
試験された各組織では、総RNA2.2μgが、1xDNアーゼバッファー(Gibco BRL)20μl量中、室温で15分間、RNアーゼ不含DNアーゼ2単位により消化された。反応は、25mMEDTA溶液2μlの添加によって停止された。次いで、サンプルは、65℃で10分間インキュベートされて酵素が失活された。
【0157】
第1鎖cDNA合成
試験された各組織では、総RNA100ngが、第1鎖cDNA合成のための鋳型として使用された。4mlの容量で、50nMプライマー1および2、1xPCRバッファーII(Perkin Elmer)および5mMMgCl2の存在下のRNAが、72℃で5分間加熱され、そして55℃まで徐々に冷却された。すべての他の試薬の添加後、6ml反応液は、48℃で30分間インキュベートされ、続いて90℃5分間の酵素失活段階が行われた。最終反応条件は、次のとおりである:1xPCRバッファーII、5mMMgCl2、1mMdATP、dTTP、dGTP、dCTP、12.5単位MuLVリバーストランスクリプターゼ(Gibco BRL)。
【0158】
第1鎖cDNA生成物のPCR増幅
各サンプルについて100ngの総RNA由来のcDNAが、両標的およびGAPDH転写物を同定するために、1回反応におけるPCR増幅にかけられた。標的についての最終プライマー/プローブ濃度は、300nMプライマー1、300nMプライマー3および200nMプローブ5であり、GAPDHについてのそれは、20nMプライマー2、20nMプライマー4および100nMプローブ6であった。反応における他の試薬の最終濃度は、4.5%グリセロール、1xTaqManバッファーA(Perkin Elmer)、6.25mMMgCl2、430MdATP、dUTP、dGTP、dCTP、2.5単位AmpliTaq Goldであった。PCR増幅は、ABI 7700配列検出システムにおいて、最初の酵素活性化段階94℃12分間で実施され、続いて、94℃15秒、60℃1分(最小ランプ(ramp)時間)のサイクルが続いた。
【0159】
試験される疾病および組織
エノビンmRNA発現が、病気の患者および正常な対照個体から由来する組織において比較された(図25および26)。下記の表は、検討された疾病および対応する組織を示す。各条件について、3種の疾病組織および3種の対照サンプルが分析された。
【0160】
【表7】
【0161】
統計学的解析
3組織の各グループでは、平均および標準偏差が、Ct値(正規分布される)において計算され、次いで式Cn=10((Ct-40.007)/-3.623)に対応するCn値に変換された。また、変動分析(ANOVA)がCt値において行われて、正常組織対疾病組織における平均エノビンmRNA発現レベルを比較した。
【0162】
図25および26は、疾病組織対対照組織における平均エノビンmRNAコピー数(±SD;n=3)を示す。統計学的解析は、多発性硬化症をもつ患者の脳室周囲白質におけるエノビン発現レベルにおいて有意な増加を示した(p=0.013)。内部GAPDH対照は有意な差異を示さなかった(p=0.79)。脳室周囲白質におけるエノビン発現レベルは、正常組織では全く低い(GAPDH200000コピーに対して平均総RNA100ng当たり270コピー)けれども、そのレベルは、多発性硬化症をもつ患者では3倍高い(825)。
【0163】
他の疾病組織のわずか1種が、正常な対照に対して有意な差異を示した:乳導管(breast ductal)腺ガンにおいては、エノビンmRNA発現レベルは6倍高い(6000対1000;p=0.007)が、また、GAPDH対照値は、有意に増加され(165000対44000;p=0.03)、これは多分、mRNAレベルにおける一般的増加を表している。
【0164】
結論として、本発明者らは、エノビンmRNAレベルが多発性硬化症をもつ患者の脳室周囲白質において上方制御されることを見い出した。
【0165】
GFRα3/cRET受容体複合体におけるエノビン擬似体のスクリーニングのためのホスホ特異抗体細胞に基づくELISAの使用。
【0166】
また、方法は、他のニューロトロフィン受容体、例えばGFRα1、GFRα2、GFRα4、TrkA、TrkBおよびTrkCの作動剤もしくは拮抗剤の同定のためにも使用できる。
【0167】
アッセイ
このアッセイを使用して、本発明者らは、神経栄養経路において活性化されるキーシグナリング・キナーゼの活性化を測定するか、またはcRET受容体キナーゼの活性化を測定することによって、神経栄養成長因子の作動もしくは拮抗化合物を同定することができる。活性化は、ホスホ特異抗体を用いて、リン酸化されるキナーゼもしくは受容体キナーゼ量を検出することによって測定される。本発明者らは、TrkA、TrkB、TrkC、GFRα1/cRET、GFRα2/cRET、GFRα3/cRETもしくはGFRα4/cRETを一時的または継続的に発現するNIH 3T3細胞を使用できる。
【0168】
p42/p44MAPキナーゼ、PKBキナーゼ、c−jun、CREB、JNK/SAPKキナーゼおよび他のキナーゼの活性化は、市販のホスホ特異抗体を用いて検出される。さらに、cRET活性化は、ホスホ特異cRET抗体を用いて欠失できる。
【0169】
使用されたプロトコールは次のとおりであった:
−96穴において10%ウシ血清中でNIH3T3細胞を接種し、細胞は刺激前に80%集密にされる。
【0170】
−翌日、培地を血清不含培地と置き換え、そして細胞を18〜24時間飢餓させる。
【0171】
−飢餓後、細胞を化合物およびポジティブ対照としての神経栄養因子(神経栄養因子について10ng/ml)により刺激する。
【0172】
−PBS中4%ホルムアルデヒドにより4℃で20分間細胞を固定する。
【0173】
−PBS/0.1%Triton200μlにより5分間3回細胞を洗浄する。
【0174】
−PBS/0.1%Triton中0.6%H2O2100μlにより20分間細胞を停止させる。
【0175】
−PBS/0.1%Triton200μlにより5分間3回細胞を洗浄する。
【0176】
−PBS/0.1%Triton中10%胎児ウシ血清100μlにより60分間細胞をブロックする。
【0177】
−5%BSA//PBS/0.1%Triton50μl中ホスホ特異的抗体により一夜4℃において細胞をインキュベートする。
抗体希釈は、実験的に決定されるべきであり、範囲1:100〜1:250が示唆される。
【0178】
−PBS/0.1%Triton200μlにより5分間3回細胞を洗浄する。
【0179】
−5%BSA/PBS/0.1%Triton50μl中希釈1:100で、室温で1時間、結合される第2の抗体HRPとインキュベートする。
【0180】
−PBS/0.1%Triton200μlにより5分間3回細胞を洗浄する。
【0181】
−バッファー(H2O0.5l中クエン酸H2O3.36gおよびNa2HPO4−2H2O)25ml中OPD(Sigma)1錠を溶解し、そしてH2O212.5μlを添加する各ウェルに50μl添加し、そしてアルミニウムフォイルで覆って、シェーカー(200ppm)上で15分間インキュベートする。
【0182】
−H2SO425μlにより反応を停止する。
【0183】
−ELISAリーダーにおいてOD490-650を測定する。
【0184】
中脳ドーパミン作動性ニューロン培養
ニューロン培養
ニューロン培養は、酵素的および機械的分散によって胎児ラットの腹側中脳から調製された。組織が収集され、0.6%グルコースを含有する氷冷Ca2+およびMg2+不含リン酸バッファー食塩水(PBSG)中で洗浄し、そして0.1%トリプシンを含有するPBSGとともに37℃で30分間インキュベートされた。細胞懸濁液が、96穴NUNC組織培養プレートに密度2.5 105細胞/cm2で入れられた。予め、培養プレートは、ポリ−L−オルニチンおよび10%胎児ウシ血清を含有するCDMによりコーティングされた。培養物は、Dulbecco’s Modified Eagle培地、およびグルコース(0.6%)、グルタミン(2mM)、重炭酸ナトリウム(3mM)、HEPES(5mM)、インスリン(25μg/ml)、ヒト・トランスフェリン(100μg/ml)、プトレッシン(putrescine)(60μg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(30nM)、ストレプトマイシン(100μg/ml)およびペニシリン(100IU/ml)を補足されたF12 Nutrientの1:1混合物からなる化学合成培地(CDM)中で維持された。
【0185】
神経栄養因子による処置
ニューロトロフィンは、保存物として0.5%ウシ血清アルブミンに溶解された。ニューロトロフィンは、最初のプレーティング後3時間および培養5日後に添加された。同量の0.5%ウシ血清アルブミンが、対照ウェルに添加された。
【0186】
高親和力ドーパミン取り込み
ドーパミン取り込みは、10日後に測定された。取り込みでは、細胞が、グルコース(5mM)アスコルビン酸(100mM)およびパルギリン(100mM)を補足された前加温されたPBSにより2回洗浄され、そして同じ溶液とともに10分間プレインキュベートされた。プレインキュベーション溶液は、50nM[3H]DAを含有する同じ溶液で置換され、そしてインキュベーションは37℃で15分間継続された。取り込みは、氷冷PBSによる3回の急速洗浄によって停止された。蓄積された[3H]ドーパミンは、室温で30分間、酸性化エタノールとともにインキュベートすることによって遊離された。放射能は、シンチレーション液(Packard ultima gold MV)4mlの添加後、Packardシンチレーションカウンターを使用して決定された。非特異的取り込みは、20μMコカインを添加することによって決定された。
【0187】
【表8】
【0188】
細胞は、エノビンの存在または不在下で10日間増殖された。未処置対照は、100%として設定された。結果は1〜5の独立した実験において得られた。
【0189】
【表9】
【0190】
【表10】
【0191】
【表11】
【0192】
【表12】
【0193】
【表13】
【0194】
【表14】
【0195】
【表15】
【0196】
【表16】
【0197】
【表17】
【0198】
【表18】
【0199】
略語のリスト
BLAST Basic local alignment search
tool
bp 塩基対
cDNA 相補的DNA
CNS 中枢神経系
EST 発現配列Tag
EVN エノビン
GDNF グリア細胞系由来の神経栄養因子
GFRα GDNFファミリー受容体α
GPI グリコシルホスファチジルイノシトール
MTC 多組織cDNA
NTN ニュールツリン
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PNS 末梢神経系
PSP ペルセフィン
RT−PCR 逆転写PCR
TGF−β トランスフォーミング成長因子
FISH 蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
MTN 多組織ノザン
NGF 神経成長因子
SPR 表面プラスモン共鳴
【図面の簡単な説明】
【図1】 エノビンと命名された本発明による神経栄養因子の部分cDNA配列である。
【図2】 ヒトGDNF,NTN,PSPおよびEVNの予測される成熟タンパク質配列である。
【図3】 エノビンの部分cDNA配列である。
【図4】 ヒト・エノビンの染色体局在の図示である。
【図5】 種々のヒト組織におけるエノビンの発現の図示である。
【図6】 10−6Mタキソールによる72時間治療後のSH−SY5Y細胞の全生存のグラフによる図示および溶媒の条件に対して標準化された、この生存に及ぼすエノビンの増加用量の効果である。
【図7】 溶媒の条件に対して標準化された、スタウロスポリンで分化されたSH−SY5Y細胞の軸索成長に及ぼす48時間にわたるエノビンの増加濃度の効果のグラフ表示である。
【図8】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図9】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図10】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図11】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図12】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図13】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図14】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図15】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図16】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図17】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図18】 種々の細胞タイプの増殖に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図19】 針突き(pin prick)試験を用いるタキソール誘発の感覚欠乏に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図20】 針突き試験を用いるタキソール誘発の感覚欠乏に及ぼすエノビンの効果のグラフ表示である。
【図21】 エノビンのDNA配列である。
【図22】 ヒト組織における種々のエノビンスプライシング変異体の発現の示である。
【図23】 図21のDNA配列から2つのイントロンをスプライシングアウトすることによって得られる、エノビンの長いスプライシング変異体の予測されるタンパク質配列。
【図24】 図21のDNA配列から2つのイントロンをスプライシングアウトすることによって得られる、エノビンの別の(短い)スプライシング変異体の予測されるタンパク質配列。
【図25】 普通の疾病組織においてエノビンの発現レベルを比較するために計画された実験から得られた結果のグラフ表示である。
【図26】 パーキンソン病およびがんにおいてエノビンおよびGAPDHの発現レベルを検出するために得られた結果のグラフ表示である。
Claims (17)
- エノビンと命名され、かつ、配列番号3もしくは4に示されるアミノ酸配列をもつヒト神経栄養成長因子をコードしている単離された核酸分子。
- DNA分子である、請求項1記載の核酸分子。
- cDNA分子である、請求項1または2記載の核酸分子。
- 配列番号2に示される配列の位置81から419までの核酸配列をもつ、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸分子。
- 配列番号2に示される核酸配列をもつ、請求項4記載の核酸分子。
- 請求項1〜5のいずれかに記載された核酸分子によってコードされている単離されたヒト神経栄養成長因子。
- 配列番号4に示されるアミノ酸配列の位置27から139までのアミノ酸配列を含む単離されたヒト神経栄養成長因子。
- 配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む、請求項7記載のヒト神経栄養成長因子。
- 請求項2または3記載のDNA分子を含む発現ベクター。
- リポーター分子をコードしているさらなる核酸配列を含む請求項9記載の発現ベクター。
- 請求項9または10記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
- 細胞が真核細胞もしくは細菌細胞である、請求項11記載の宿主細胞。
- 請求項6〜8のいずれかに記載のヒト神経栄養因子エノビンを発現することが可能な導入遺伝子を含有する、トランスジェニック細胞、組織もしくは非ヒト生物体。
- 導入遺伝子が、請求項9または10記載のベクターを含有する、請求項17記載のトランスジェニック細胞、組織もしくは非ヒト生物体。
- 請求項11〜14のいずれかに記載の細胞によって発現される、神経栄養成長因子。
- 請求項13または14記載のトランスジェニック細胞、組織もしくは非ヒト生物体によって発現される、神経栄養成長因子。
- LMBP受託番号LMBP3931の下に寄託されたプラスミドEVNmat/pRSETB。
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