PT1097167E

PT1097167E - Factor de crescimento neurotrofico

Info

Publication number: PT1097167E
Application number: PT99938261T
Authority: PT
Inventors: Hugo Alfonso Geerts; Stefan Leo Jozef Masure; Theo Frans Meert; Miroslav Cik; Luc August Laurentius Ver Donck
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2007-02-28
Also published as: CN1342165A; SK142001A3; EP1640381A3; JP4624476B2; HK1092477A1; SI1640381T1; HUP0102821A3; JP2002520042A; KR100712223B1; EP1097167B1; US7544788B2; ES2479067T3; JP4469500B2; BRPI9912819B1; CZ200128A3; CY1115496T1; EP1097167B2; WO2000004050A2; ID27024A; CA2333910C

Description

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DESCRIÇÃO "FACTOR DE CRESCIMENTO NEUROTRÓFICO" A presente invenção diz respeito a um factor neurotrófico e, em particular, à clonagem e expressão de um novo membro da familia GDNF de factores neurotróficos, designado aqui "enovina" (EVN).

Introdução

Os factores neurotróficos estão envolvidos na diferenciação, desenvolvimento e manutenção neuronais. Estas proteínas podem prevenir a degeneração e promover a sobrevivência de diferentes tipos de células neuronais; assim, são agentes terapêuticos potenciais para doenças neurodegenerativas. 0 factor neurotrófico derivado da linha de células gliais (GDNF) foi o primeiro membro de uma subfamilia em crescimento de factores neurotróficos estruturalmente distintos das neurotrofinas. 0 GDNF é um membro da superfamília de factores de crescimento do factor de transformação de crescimento β (TGF-β), caracterizada por um padrão especifico de sete resíduos cisteína altamente conservados na sequência de aminoácidos (Kingsley, 1994) . 0 GDNF foi originalmente purificado utilizando um ensaio baseado na sua capacidade para manter a sobrevivência e função de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral embrionário in vitro (Lin et al., 1993). Outros tipos de células neuronais do sistema nervoso central (SNC) ou periférico (SNP) também respondem aos efeitos de sobrevivência do GDNF (Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995) . 0 GDNF é produzido por células numa pró-forma 2 inactiva, que é clivada especificamente num sítio de reconhecimento de furina RXXR para produzir GDNF activo (maduro) (Lin et al.r 1993). A administração exógena de GDNF tem efeitos neuroprotectores potentes em modelos animais de doença de Parkinson, uma perturbação neurodegenerativa comum caracterizada pela perda de até 70% de células dopaminérgicas da substantia nigra do cérebro (Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).

Recentemente foram descobertos factores neurotróficos adicionais da família GDNF. A neurturina (NTN) foi purificada de meio condicionado de células de ovário de hamster chinês (CHO) utilizando um ensaio baseado na sua capacidade para promover a sobrevivência de neurónios simpáticos em cultura (Kotzbauer et al., 1996). A proteína NTN madura é 57% semelhante ao GDNF maduro. A persefina (PSP) foi descoberta por clonagem utilizando PCR com "primers" degenerados com DNA genómico como modelo. A PSP madura, tal como o GDNF maduro, promove a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral e de neurónios motores em cultura (Milbrandt et al., 1998). A semelhança da proteína PSP madura com GDNF e NTN maduros é = 50%. A artemina (ARTN) foi descoberta por pesquisas em bases de dados de DNA e é um factor de sobrevivência de neurónios sensoriais e simpáticos em cultura (Baloh et al., 1988, Neuron (.12); 1291-1302). Outro factor neurotrófico da família GDNF é revelado como Neublastina na publicação PCT WO00/01815. O GDNF, NTN, PSP e ARTN requerem um complexo de receptor heterodimérico para efectuar a transdução do sinal intracelular a jusante. O GDNF liga-se à subunidade alfa 1 do receptor da família GDNF (GFRa-1; Comité de Nomenclatura do GFRa, 1997), uma proteína membranar 3 ancorada a glicosilfosfatidilinositol (glicosil-Ptdlns) (Jing et al., 1996, Treanor et ai., 1996, Sanicola et al.r 1997). Subsequentemente, o complexo GDNF/GFRa-1 liga-se e activa o proto-oncogene cRET, uma tirosina quinase ligada a membranas (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), resultando na fosforilação de resíduos tirosina presentes no cRET e activação subsequente de vias de transdução do sinal a jusante (Worby et al., 1996). Foram caracterizados vários outros membros da família GFRa de receptores de ligação de ligandos (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). 0 GFRa-2 e GFRa-3 (Jing et al., 1997,

Masure et al., 1998, Woby et al., 1998, Naveilham et al., 1998, Baloh et al., 1998a) foram identificados por alguns grupos diferentes. 0 GFRa-1 e GFRa-2 são amplamente expressos em quase todos os tecidos, e a expressão pode ser regulada pelo desenvolvimento (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997). 0 GFRa-3 não é expresso no sistema nervoso central em desenvolvimento ou adulto, mas é altamente expresso em vários gânglios sensoriais e simpáticos em desenvolvimento e adultos do sistema nervoso periférico (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Um quarto membro da família, GFRa-4, foi clonado de cDNA de galinha (Thompson et al., 1998) . 0 GFRa-1 é o receptor preferido do GDNF, ao passo que o GFRa-2 se liga preferencialmente à NTN (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997) . 0 GFRa-4 de galinha forma um complexo de receptor funcional para a PSP em combinação com o cRET (Enokido et al., 1998) . Foi mostrado que células que expressam o GFRa-3 e cRET não respondem ao GDNF, NTN nem à 4 PSP (Worby et al., 1998, Baloh et al., 1998a).

Recentemente, foi mostrado que a ART sinaliza através do cRET utilizando o GFRa-3 como receptor de ligação de ligandos preferido (Baloh et al., 1998b) . A conversa cruzada entre os factores neurotróficos e os receptores GFRa é possível in vitro, pois o GDNF pode ligar-se ao GFRa-2 ou GFRa-3 na presença de cRET (Sanicola et al., 1997, Trupp et al., 1998) e a NTN pode ligar-se ao GFRa-1 com baixa afinidade (Klein et al., 1997). Em resumo, o GDNF, NTN, PSP e ART fazem parte de um sistema de sinalização neurotrófico pelo qual diferentes subunidades de ligação de ligandos (GFRa-1 até 4) podem interagir com a mesma subunidade da Tirosina quinase (cRET). A relevância fisiológica destas descobertas in vitro foi recentemente demonstrada em estudos de eliminação de genes (revisto por Rosenthal, 1999), que mostram claramente que o GDNF interage com o GFRa-1 in vivo, ao passo que a NTN é o ligando preferido para o GFRa-2.

Os presentes inventores identificaram, clonaram, expressaram, localizaram cromossomicamente e caracterizaram a Enovina (EVN), o quarto membro da família GDNF. 0 conhecimento da proteína EVN madura foi estendido com a descoberta de diferentes variantes de processamento de mRNA funcionais e não funcionais. Além disso, apresentamos dados de expressão, dados de ligação da EVN ao GFRa-3 e efeitos in vitro da EVN sobre excrescências de neurites e protecção contra neurotoxicidade induzida pelo taxol em culturas de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciadas por acção da estaurosporina. 5

Resumo da Invenção

Na presente candidatura é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica um novo factor de crescimento neurotrófico humano, "enovina", um vector de expressão compreendendo essa molécula de ácido nucleico, uma célula hospedeiro transformada com esse vector, um factor de crescimento neurotrófico codificado por essa molécula de ácido nucleico, enovina isolada e composições farmacêuticas contendo o ácido nucleico ou a proteína enovina.

Descrição pormenorizada da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica um factor de crescimento neurotrófico humano, designado aqui enovina, que tem a sequência de aminoácidos ilustrada na Figura 21 (ID SEQ N° 4) , ou que codifica um equivalente funcional, derivado ou bioprecursor desse factor de crescimento, em particular a variante de processamento longa (Fig. 23 - ID SEQ N° 9), a curta (Fig. 24 - ID SEQ N° 10) e outras ilustradas na Fig. 21 (ID SEQ N°s 11, 12, 13, 14 ou 15) .

Preferivelmente, essa molécula de ácido nucleico é DNA e, ainda mais preferivelmente, uma molécula de cDNA.

Preferivelmente, o ácido nucleico de acordo com a invenção compreende a sequência desde a posição 81 até à 419 da sequência ilustrada na Figura 1 (ID SEQ N° 2) e, mais preferivelmente, desde a posição 81 até à 422 e, ainda mais preferivelmente, a sequência completa ilustrada na Figura 1.

Crê-se que a molécula de ácido nucleico desde a posição 81 até à 419 codifica a sequência da proteína enovina 6 madura, subsequentemente ao processamento da pró-forma da proteína no sítio de processamento RXXR presente na pré-forma estável dessa proteína enovina.

Restrição da hibridização, tal como é aqui utilizado, refere-se a condições nas quais os ácidos polinucleicos são estáveis. A estabilidade dos híbridos reflecte-se na temperatura de fusão (Tf) dos híbridos. A Tf pode ser aproximada pela fórmula: 81,5°C - 16,6 (loglO [Na+] + 0,41 (%G&C) - 600/1 em que 1 é o comprimento dos híbridos em nucleótidos. A Tf decresce aproximadamente em 1-1,5°C por cada decréscimo de 1% da homologia de sequências.

Vantajosamente, a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser utilizada para expressar o factor de crescimento neurotrófico humano de acordo com a invenção numa célula hospedeiro ou afins, utilizando um vector de expressão apropriado.

Um vector de expressão de acordo com a invenção inclui vectores capazes de expressar DNA operativamente ligado a sequências reguladoras, como regiões promotoras, que são capazes de proceder à expressão desses fragmentos de DNA.

Elementos reguladores necessários para a expressão incluem sequências promotoras para ligarem RNA polimerase e sequências de iniciação da transcrição para a ligação de ribossomas. Por exemplo, um vector de expressão bacteriano pode incluir um promotor, como o promotor lac, e para a iniciação da transcrição a sequência de Shine-Dalgarno e o codão de início AUG. De modo semelhante, um vector de expressão eucariótico pode incluir um promotor heterólogo ou homólogo para a RNA polimerase II, um sinal de poliadenilação a jusante, o codão de início AUG e um codão 7 de terminação para a separação do ribossoma. Esses vectores podem ser obtidos comercialmente ou podem ser reunidos a partir das sequências descritas por métodos bem conhecidos na área.

Assim, um vector de expressão refere-se a uma construção de DNA ou RNA recombinante, como um plasmideo, um fago, virus recombinante ou outro vector que, por introdução numa célula hospedeiro apropriada, resulte na expressão dos fragmentos de DNA ou RNA. Vectores de expressão apropriados são bem conhecidos dos experimentados na área e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aqueles que permanecem epissomais, ou aqueles que se integram no genoma da célula hospedeiro.

Moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser inseridas nos vectores descritos numa orientação anti-sentido, de modo a proporcionar a produção de RNA anti-sentido. RNA anti-sentido ou outros ácidos nucleicos anti-sentido podem ser produzidos por meios sintéticos.

Outro aspecto da invenção compreende a célula hospedeiro transformada, transfectada ou infectada com o vector de expressão de acordo com a invenção, cuja célula compreende, preferivelmente, uma célula eucariótica e, mais preferivelmente, uma célula de mamifero. A incorporação de DNA clonado num vector de expressão adequado, para a transformação subsequente dessa célula e selecção subsequente das células transformadas, é bem conhecida dos experimentados na área, tal como ensinado em Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning, A Laboratory manual" Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Também é descrita uma molécula de ácido nucleico que tem pelo menos 15 nucleótidos da molécula de ácido nucleico 8 de acordo com a invenção e, preferivelmente, desde 15 até 50 nucleótidos.

Estas sequências podem ser vantajosamente utilizadas como sondas ou "primers", para iniciar a replicação ou afins. Essas moléculas de ácidos nucleicos podem ser produzidas de acordo com técnicas bem conhecidas na área, tal como por meios recombinantes ou sintéticos. Também podem ser utilizadas em estojos ou dispositivos de diagnóstico ou afins, para detectar a presença de um ácido nucleico de acordo com a invenção. Em geral, estes testes compreendem contactar a sonda com uma amostra em condições de hibridização e detectar a presença de qualquer formação de hélices duplas entre a sonda e qualquer ácido nucleico presente na amostra.

Estas sondas podem ser ancoradas a um suporte sólido. Preferivelmente, estão presentes numa série, de modo que múltiplas sondas podem hibridizar simultaneamente para uma única amostra biológica. As sondas podem ser colocadas de modo preciso na série ou ser sintetizadas in situ na série (ver Lockhart et ai., Nature Biotechnology, volume 14, Dezembro de 1996 "Expression monitoring by hybridisation into high density oligonucleotide arrays"). Uma única série pode conter mais de 100, 500 ou mesmo 1 000 sondas diferentes em localizações discretas.

Também podem produzir-se moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção utilizando meios recombinantes ou sintéticos, tais como, por exemplo, utilizando mecanismos de clonagem de PCR, que geralmente envolvem preparar um par de "primers", que podem ter, aproximadamente, 10 até 50 nucleótidos até uma região do gene que se deseja clonar, contactar os "primers" com mRNA, cDNA ou DNA genómico de uma célula humana, efectuar uma reacção em cadeia de polimerase em condições que permitem amplificar a região 9 desejada, isolar a região ou fragmento amplificado e recuperar o DNA amplificado. Em geral, essas técnicas, tal como são definidas aqui são bem conhecidas na área, como descrito em Sambrook et al. ("Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 1989).

Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou os oligonucleótidos descritos podem ter uma etiqueta reveladora. Etiquetas adequadas incluem isótopos radioactivos, como 32P ou 35S, etiquetas enzimáticas ou outras etiquetas proteicas, como biotina, ou marcadores fluorescentes. Essas etiquetas podem ser adicionadas aos ácidos nucleicos ou oligonucleótidos e podem ser detectadas utilizando técnicas conhecidas per se.

Vantajosamente, podem identificar-se variantes alélicas humanas ou polimorfismos da molécula de DNA de acordo com a invenção, por exemplo, por sondagem de bibliotecas de cDNA ou genómicas de uma gama de indivíduos, por exemplo, de populações diferentes. Suplementarmente, podem utilizar-se ácidos nucleicos e sondas descritos aqui para sequenciar DNA genómico de pacientes utilizando técnicas bem conhecidas na área, como o método de terminação de cadeias Didesoxi de Sanger, que, vantajosamente, pode avaliar qualquer predisposição de um paciente para certas perturbações associadas a um factor de crescimento de acordo com a invenção. É suplementarmente descrita uma célula, tecido ou organismo não humano transgénico compreendendo um transgene capaz de expressar o factor neurotrófico humano enovina de acordo com a invenção. 0 termo "transgene capaz de expressão", tal como é utilizado aqui, significa qualquer sequência de ácido nucleico adequada que conduz à expressão de um factor neurotrófico com a mesma função e/ou actividade de um 10 factor neurotrófico de acordo com a invenção. O transgene pode incluir, por exemplo, ácido nucleico genómico isolado de células humanas ou ácido nucleico sintético incluindo cDNA, integrado no cromossoma ou num estado extra-cromossómico.

Preferivelmente, o transgene compreende um vector de acordo com a invenção, cujo vector inclui uma molécula de ácido nucleico que codifica esse factor neurotrófico, ou um fragmento funcional dessa molécula de ácido nucleico. Deve entender-se que um "fragmento funcional" desse ácido nucleico significa um fragmento do gene ou cDNA que codifica esse factor neurotrófico ou respectivo equivalente funcional, cujo fragmento é capaz de ser expresso para produzir um factor de crescimento neurotrófico funcional de acordo com a invenção. Assim e por exemplo, fragmentos do factor de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção que correspondem aos resíduos de aminoácidos específicos que interagem com o receptor correspondente também fazem parte da presente invenção, cujos fragmentos podem funcionar como agonistas que activam o receptor correspondente do factor de crescimento de acordo com a invenção, de modo a induzir em células os seus efeitos de promoção do crescimento e manutenção da sobrevivência. Este aspecto da invenção também inclui isoformas processadas de modo diferencial e inicios da transcrição dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção.

De acordo com a presente invenção, um ácido nucleico definido inclui não só o ácido nucleico idêntico mas também quaisquer variações muito pequenas de bases, incluindo, em particular, substituições em bases que resultam num codão sinónimo (um codão diferente que especifica o mesmo residuo de aminoácido), devido ao código degenerado em substituições conservativas de aminoácidos. O termo 11 "molécula de ácido nucleico" também inclui a sequência complementar a qualquer sequência de filamentação simples determinada relativamente a variações de bases.

De acordo com outro aspecto, a invenção fornece um factor de crescimento neurotrófico humano isolado codificado por uma molécula de ácido nucleico como definida aqui. Preferivelmente, o factor de crescimento compreende uma sequência de aminoácidos desde a posição 27 até à 139 da sequência de aminoácidos da Figura 1.

Deve entender-se que um "equivalente funcional", como definido aqui, significa um factor de crescimento que exibe todas as propriedades de crescimento e funcionalidade associadas ao factor de crescimento enovina. Pretende-se que um "derivado" da enovina, como definido aqui, inclua um polipéptido no qual certos aminoácidos foral alterados ou deletados ou substituídos por outros aminoácidos e cujo polipéptido retém a actividade biológica da enovina e/ou cujo polipéptido pode reagir com anticorpos dirigidos, utilizando enovina de acordo com a invenção como antigene provocador.

Estão abrangidas no âmbito da presente invenção formas híbridas e modificadas da enovina, incluindo proteínas de fusão e fragmentos. As formas híbridas e modificadas incluem, por exemplo, os casos em que certos aminoácidos foram sujeitos a alguma modificação ou substituição, tal como, por exemplo, por mutação pontual, mas cujas modificações ainda resultam numa proteína que retém a actividade biológica da enovina, de acordo com a invenção. Sequências de ácidos nucleicos específicas podem ser alteradas pelos experimentados na área para produzir um factor de crescimento que exibe propriedades iguais ou substancialmente iguais à enovina. 12

Como é bem conhecido na área, muitas proteínas são produzidas in vivo com uma sequência de (pré) sinal no terminal N da proteína. Suplementarmente, essas proteínas podem compreender outra pró-sequência que representa um precursor estável da proteína madura. Em geral, essas pré e pró-sequências não são necessárias para a actividade biológica. A molécula da enovina de acordo com a invenção inclui não só a sequência completa ilustrada na Figura 21, mas desde a posição 27 até à 139 que se segue ao sítio de processamento proteolítico RXXR presente em factores de crescimento deste tipo e que se crê representar a sequência madura da enovina.

Uma proteína, polipéptido ou sequência de aminoácidos definida de acordo com a invenção inclui não só a sequência de aminoácidos idêntica, mas respectivos isómeros para além de variações muito pequenas de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos natural, incluindo substituições conservativas de aminoácidos (uma substituição por um aminoácido cujas cadeias laterais estão relacionadas). Também estão incluídas sequências de aminoácidos que diferem da sequência natural de aminoácidos mas que resultam num polipéptido que é imunologicamente idêntico ou semelhante ao polipéptido codificado pela sequência de ocorrência natural.

Proteínas ou polipéptidos de acordo com a invenção incluem suplementarmente variantes dessas sequências, incluindo variantes alélicas de ocorrência natural que são substancialmente homólogas a essas proteínas ou polipéptidos. Neste contexto, homologia substancial é considerada como uma sequência que tem pelo menos 7 0% e preferivelmente 80%, 90% ou 95% de homologia de aminoácidos com as proteínas ou polipéptidos codificados pelas moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção. 13

Factores de crescimento neurotróficos expressos pelas células-hospedeiro de acordo com a invenção também estão abrangidos na presente invenção.

Devido à semelhança de sequências entre o factor de crescimento descrito aqui e factores de crescimento previamente identificados da família GDNF, crê-se que a enovina também é capaz de promover a sobrevivência e crescimento celulares e de tratar perturbações resultantes de deficiências no funcionamento ou expressão desse factor neurotrófico.

Vantajosamente, observou-se que o factor de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção confere um efeito neurotrófico ou neuroprotector em células ou populações de células neuronais, particularmente aquelas células ou populações de células neuronais que foram induzidas a sofrer apoptose. Em conformidade, o ácido nucleico ou o próprio factor de crescimento enovina de acordo com a invenção pode ser adicionalmente utilizado como medicamento.

Adicionalmente, sendo descrito em mais pormenor no exemplo abaixo, verificou-se que a enovina acelera a recuperação de deficiências sensoriais induzidas, o que identifica a enovina como candidato para tratar ou atenuar síndromas dolorosas com um componente neurogénico periférico ou central e doenças reumáticas/inflamatórias, bem como perturbações da condutância, por administração a um paciente necessitado numa concentração suficiente para reduzir ou prevenir os sintomas destas perturbações.

Um método alternativo para tratar as perturbações dos nervos descritas acima compreende implantar num sujeito células que expressam um factor de crescimento neurotrófico humano de acordo com a invenção, como a célula transgénica descrita aqui. 14

As moléculas de ácidos nucleicos e factor de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção também podem ser incluídos numa composição farmacêutica juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aqueles farmaceuticamente aceitável.

Vantajosamente, podem preparar-se anticorpos para o factor neurotrófico da presente invenção por técnicas conhecidas na área. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos policlonais inoculando num animal hospedeiro, como um ratinho, o factor de crescimento ou respectivo epítopo e recuperando soro imunológico. Podem preparar-se anticorpos monoclonais de acordo com técnicas conhecidas, como descrito por Kohler R. e Milstein C., Nature (1975) 256, 495-497.

Vantajosamente, podem utilizar-se anticorpos de acordo com a invenção num método para detectar a presença de um factor de crescimento de acordo com a invenção, cujo método compreende fazer reagir o anticorpo com uma amostra e identificar qualquer proteína ligada a esse anticorpo. Também é fornecido um estojo para implementar esse método, que compreende um anticorpo de acordo com a invenção e meios para o anticorpo reagir com essa amostra. A presente invenção também fornece um estojo ou dispositivo para detectar a presença de um factor de crescimento neurotrófico de acordo com a invenção numa amostra, compreendendo um anticorpo como descrito acima e meios para esse anticorpo reagir com essa amostra.

Podem identificar-se proteínas que interagem com o factor neurotrófico da invenção, tal como, por exemplo, o seu receptor celular correspondente, investigando interacções proteína-proteína utilizando o sistema vectorial de dois híbridos, que é bem conhecido dos biólogos moleculares (Fields & Song, Nature 340 : 245, 15 1989) . Esta técnica baseia-se na reconstituição funcional in vivo de um factor de transcrição que activa um gene repórter. Mais particularmente, a técnica compreende fornecer a uma célula hospedeiro apropriada uma construção de DNA compreendendo um gene repórter sob o controlo de um promotor regulado por um factor de transcrição com um domínio de ligação e um domínio de activação de DNA, expressar na célula hospedeiro uma primeira sequência de DNA híbrida que codifica uma primeira fusão de um fragmento ou da totalidade de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção e o referido domínio de ligação ou referido domínio de activação de DNA do factor de transcrição, expressar no hospedeiro pelo menos uma segunda sequência de DNA híbrida, como uma biblioteca ou afins, que codifica proteínas de ligação putativas a serem investigadas juntamente com o domínio de ligação ou activação de DNA do factor de transcrição que não está incorporado na primeira fusão, detectar qualquer ligação das proteínas a serem investigadas a uma proteína de acordo com a invenção detectando a presença de qualquer produto do gene repórter na célula hospedeiro, opcionalmente isolar segundas sequências de DNA híbridas que codificam a proteína de ligação.

Um exemplo dessa técnica utiliza a proteína GAL4 em levedura. A GAL4 é um activador da transcrição do metabolismo da galactose em levedura e tem um domínio separado para ligação a activadores a montante dos genes do metabolismo da galactose, bem como um domínio de ligação de proteínas. Podem construir-se vectores de nucleótidos, um dos quais compreende os resíduos de nucleótidos que codificam o domínio de ligação de DNA da GAL4. Estes resíduos do domínio de ligação podem ser fundidos a uma sequência que codifica uma proteína conhecida, tais como, 16 por exemplo, os ácidos nucleicos de acordo com a invenção. 0 outro vector compreende os resíduos que codificam o domínio de ligação de proteínas da GAL4. Estes resíduos são fundidos a resíduos que codificam uma proteína de teste, preferivelmente da via de transdução do sinal do vertebrado em questão. Qualquer interacção entre o factor neurotrófico codificado pelo ácido nucleico de acordo com a invenção e a proteína a ser testada conduz à activação da transcrição de uma molécula repórter numa célula de levedura deficiente quanto à transcrição de GAL4 onde os vectores foram transformados. Preferivelmente, uma molécula repórter, como β-galactosidase, é activada por restabelecimento da transcrição dos genes do metabolismo da galactose de levedura.

Os presentes inventores identificaram o receptor da enovina, que é o GFRa3. Assim, podem preparar-se ensaios para identificar compostos agonistas ou antagonistas da enovina. Este ensaio também pode ser utilizado em associação com outros factores de crescimento neurotróficos e seus receptores correspondentes. Os compostos identificados podem ser utilizados para tratar ou prevenir perturbações tais como doença de Parkinson, doença de Alzheimer, perturbações neuronais associadas a sequências poliglutamina expandidas, tais como doença de Huntington, neuropatia periférica, lesão cerebral aguda, tumores do sistema nervoso, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, traumatismo dos nervos periféricos ou lesão por exposição a neurotoxinas, neoplasia endócrina múltipla e doença de Hirschsprung familiar, doenças associadas a Priões, doença de Creutzfeld - Jacob, acidente vascular cerebral, síndromas dolorosas com um componente neurogénico substancialmente periférico ou central e doenças reumáticas /inflamatórias, bem como perturbações da condutância, 17 administrando a um indivíduo uma quantidade desse agonista ou antagonista numa concentração suficiente para prevenir ou tratar essas perturbações neurais. Esses compostos também podem ser incluídos em composições farmacêuticas juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aqueles farmaceuticamente aceitável.

Agonistas ou antagonistas de um factor de crescimento (tal como, por exemplo, enovina) podem ser identificados numa especificação contactando uma célula, tecido ou organismo não humano que expressa um receptor apropriado e cRET com um composto candidato na presença do factor de crescimento e comparando os niveis de activação de RET nessa célula, tecido ou organismo não humano com um controlo que não esteve em contacto com esse composto candidato.

Uma especificação alternativa da invenção compreende um método para identificar agonistas ou antagonistas de um factor de crescimento neurotrófico, cujo método compreende contactar uma célula, tecido ou organismo não humano que expressa um receptor apropriado desse factor de crescimento e cRET com um composto candidato na presença desse factor de crescimento, medir o nivel de activação de uma quinase de sinalização na via de transdução do sinal da qual esse receptor apropriado é um componente, após a adição de um anticorpo especifico para essa quinase de sinal conjugado com uma molécula repórter, em comparação com uma célula, tecido ou organismo não humano que não esteve em contacto com esse composto.

Como se verá em mais pormenor a partir dos exemplos abaixo, a enovina foi bem sucedida na redução das deficiências sensoriais induzidas pelo taxol. Assim, a enovina pode desempenhar um possível papel em síndromas dolorosas com um componente neurogénico substancialmente 18 periférico e central e doenças reumáticas, bem como perturbações da condutância, e pode desempenhar um papel modulador em processos sensoriais após aplicação transdérmica, tópica, local, central (como epidural, intratecal, ICV, intra-plexo, intraneuronal), per oral, rectal e sistémica. Em consequência, do mesmo modo descrito aqui para outros estados mediados pela enovina, estes estados podem ser atenuados ou mesmo prevenidos administrando uma molécula anti-sentido, um ácido nucleico, proteína enovina, composição farmacêutica ou um composto identificado como agonista ou antagonista, consoante o apropriado, de acordo com a invenção, em concentrações suficientes para atenuar ou prevenir os sintomas dessa(s) perturbação(perturbações).

As composições terapêuticas ou farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer via adequada conhecida na área, incluindo, por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, transdérmica, intratecal ou intracerebral, ou administração a células em protocolos de tratamento ex vivo. A administração pode ser rápida, tal como por injecção, ou durante um período de tempo, tal como por infusão lenta ou administração de uma formulação de libertação lenta. Para o tratamento de tecidos no sistema nervoso central, a administração pode ser feita por injecção ou infusão no fluido cerebrospinal (CSF) . A enovina também pode ser ligada ou conjugada com agentes que conferem propriedades farmacêuticas ou farmacodinâmicas desejáveis. Por exemplo, pode ser acoplada a qualquer substância que se saiba, na área, promover a penetração ou transporte através da barreira sangue-cérebro, como um anticorpo para o receptor da transferrina, e administrada por injecção intravenosa. 19 A enovina, as moléculas anti-sentido ou mesmo os compostos identificados como agonistas ou antagonistas da enovina (em que os últimos não fazem parte da invenção) podem ser utilizados na forma de uma composição farmacêutica, que pode ser preparada de acordo com procedimentos bem conhecidos na área. Composições preferidas incluem um veiculo ou diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como, por exemplo, uma solução salina fisiológica. Também podem utilizar-se outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo outros sais não tóxicos, água esterilizada ou afins. Também pode estar presente um tampão adequado que permita que as composições sejam liofilizadas e armazenadas em condições esterilizadas, antes da reconstituição pela adição de água esterilizada para administração subsequente. Pode proceder-se à incorporação da enovina numa matriz sólida ou semi-sólida biologicamente compatível, que pode ser implantada em tecidos que necessitam de tratamento. 0 transportador também pode conter outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para modificar outras condições, como pH, osmolaridade, viscosidade, esterilidade, lipofilicidade, solubilidade ou afins. Também podem incluir-se excipientes farmaceuticamente aceitáveis que permitam a libertação prolongada ou retardada após a administração. A proteína enovina ou as moléculas de ácidos nucleicos ou compostos de acordo com a invenção podem ser administrados oralmente. Nesta especificação, podem ser encapsulados e combinados com transportadores adequados em formas galénicas sólidas, que são bem conhecidas dos experimentados na área.

Como é bem conhecido dos experimentados na área, pode calcular-se o regime específico de dosagem de acordo com a 20 área superficial do corpo do paciente ou o volume do espaço corporal a ser ocupado, dependente da via de administração particular a ser utilizada. No entanto, a quantidade da composição a ser administrada na realidade será determinada por um médico com base nas circunstâncias pertinentes à perturbação a ser tratada, como a gravidade dos sintomas, a composição a ser administrada, a idade, peso e resposta do paciente individual e a via de administração escolhida. A presente invenção pode ser mais claramente entendida pelos exemplos seguintes, que são puramente exemplificativos, e com referência às figuras adjuntas, nas quais:

Figura 1: é a sequência de cDNA parcial de um factor neurotrófico de acordo com a invenção designado enovina. A sequência de consenso foi obtida por amplificação por PCR, com os "primers" PNHsp3 e PNHapl, em diferentes cDNAs e em DNA genómico, seguido de clonagem, análise de sequências e comparação das sequências obtidas. A sequência de aminoácidos prevista, no código de uma letra, está mostrada acima da sequência de DNA. O número dos resíduos de nucleótidos está mostrado à direita da sequência de DNA, ao passo que o número dos resíduos de aminoácidos está mostrado à direita da sequência proteica traduzida. O sítio de clivagem RXXR putativo para o pró-domínio está indicado a cheio e sublinhado. O início putativo da proteína madura está indicado por uma seta. Os sete resíduos cisterna conservados característicos de todos os membros da família TGF-β estão indicados a cheio. Um sítio de N-glicosilação potencial está duplamente sublinhado. 21

Figura 2: é o alinhamento das sequências proteicas maduras previstas do GDNF, NTN, PSP e EVN humanos. As sequências foram alinhadas utilizando o programa de alinhamento ClustalW. Os residuos de aminoácidos conservados entre as três proteínas estão incluídos nas áreas a preto. Os residuos conservados entre duas ou três das sequências estão sombreados a cinzento. Os 7 residuos cisterna conservados, caracteristicos dos membros da familia TGF-β, estão indicados por asteriscos acima da sequência. Os residuos de aminoácidos estão numerados à direita. Os tracejados indicam hiatos introduzidos na sequência para optimizar o alinhamento.

Figura 3: é a sequência de cDNA parcial da enovina. A sequência de consenso foi obtida por amplificação por PCR (PCR primária com os "primers" PNHspl e PNHapl e

PCR encaixada com os "primers " PNHsp2 e PNHap2) em diferentes cDNAs, seguido de clonagem, análise de sequências e comparação das sequências obtidas. A sequência de aminoácidos traduzida, no código de uma letra, dos nucleótidos 30 até 284 (fase de leitura A) está mostrada acima da sequência e numerada para a direita (AI até A85) . Esta fase de leitura contém um codão de inicio da tradução ATG putativo. A sequência de aminoácidos traduzida, no código de uma letra, dos nucleótidos 334 até 810 (fase de leitura B) está mostrada acima da sequência e numerada para a direita (BI até B159) . Esta fase de leitura contém a região de homologia com o GDNF, NTN e PSP. O número dos residuos de nucleótidos está mostrado à direita da sequência de DNA. O sitio de clivagem RXXR putativo para o pró-domínio está indicado a cheio e sublinhado. O início 22 putativo da proteína madura está indicado por uma seta. Os sete residuos cisteina conservados, caracteristicos de todos os membros da familia TGF-β, estão indicados a cheio. Um sitio de N-glicosilação potencial está duplamente sublinhado.

Figura 4: é uma ilustração da localização cromossómica da Enovina humana. (A) Diagrama dos resultados do mapeamento de FISH para a Enovina. Cada ponto representa os sinais duplos de FISH detectados no cromossoma 1 humano, região p31.3-p32. (B) Exemplo do mapeamento de FISH da Enovina. 0 painel da esquerda mostra os sinais de FISH no cromossoma 1. O painel da direita mostra a mesma figura mitótica corada com 4',6— diamidino-2-fenilindolo, para identificar o cromossoma 1.

Figura 5: é uma ilustração da expressão da Enovina em diferentes tecidos humanos. (A), (B) , (C) Análise de coloração "Northern" da expressão em tecidos da Enovina. Avaliou-se a expressão de mRNA da Enovina em diferentes tecidos humanos utilizando uma sonda correspondente a parte da região codificadora da Enovina (incluindo a região que codifica para a proteina Enovina madura) para analisar colorações de RNA rico em poli(A) humano. (A) Coloração "Northern " de Múltiplos Tecidos (MTN); (B) coloração MTN II) coloração II de MTN fetal. 0 painel (D) mostra uma autorradiografia da coloração principal de RNA humano sondada com o mesmo fragmento de cDNA da Enovina. 0 painel (E) mostra a localização de amostras de mRNA de tecidos humanos na coloração principal de RNA de (D). 23

Figura 6: é uma ilustração gráfica da sobrevivência total de células SH-SY5Y após 72 horas de tratamento com taxol 10-6 M e o efeito de doses crescentes de enovina sobre a sua sobrevivência, normalizado para a condição do solvente. As células SH-SY5Y são diferenciadas durante 5 dias com estaurosporina 25 nM antes da aplicação do taxol. Os dados provêm de duas experiências independentes em sextuplicado. Mostram-se a média e o desvio padrão.

Figura 7: é uma representação gráfica do efeito de concentrações crescentes de enovina durante 48 horas

sobre as excrescências de neurites de células SH-SY5Y diferenciadas com estaurosporina, normalizado para a condição do solvente. As células SH-SY5Y são diferenciadas durante 5 dias com estaurosporina 25 nM antes do inicio da experiência de 48 horas. Como controlo positivo mostra-se o efeito de diferenciação da estaurosporina 25 nM. Calcula-se o comprimento de neurites em pelo menos 5000 células. Os dados provêm de experiências realizadas em duplicado. Mostram-se a média e o desvio padrão.

Figuras 8 até 18: são representações gráficas do efeito da enovina sobre a proliferação de vários tipos de células.

Figura 19: é uma representação gráfica dos efeitos da enovina sobre deficiências sensoriais induzidas por taxol utilizando o teste de picada com agulha. Apresentam-se as pontuações cumulativas médias (± 1 MEP) ao longo do tempo de ratos tratados com 2 doses diferentes de enovina (23 ou 130 μρ/ιηΐ; n = 10 24 ratos/grupo) ou veículo / solução salina (n = 20 ratos) após a administração de taxol. A enovina ou solução salina / veículo foram injectados, num volume de 75 μΐ, na área sub-plantar da pata traseira direita.

Figura 20: é uma representação gráfica dos efeitos da enovina sobre deficiências sensoriais induzidas por taxol utilizando o teste de picada com agulha. Apresentam-se as pontuações cumulativas médias (± 1 MEP) ao longo do tempo de ratos tratados com 2 doses diferentes de enovina (23 ou 130 n = 10 ratos/grupo) ou veículo / solução salina (n = 20 ratos) antes da administração de taxol. A enovina ou solução salina / veículo foram injectados, num volume de 75 μΐ, na área sub-plantar da pata traseira direita.

Figura 21: é uma sequência de DNA da enovina. A sequência de consenso foi obtida por amplificação com PCR, utilizando os "primers" PNHsp5 e PNHapl, em cDNA do córtex frontal humano e em DNA genómico humano, seguido de clonagem, análise de sequências e comparação das sequências resultantes. A sequência de aminoácidos prevista está apresentada acima da sequência de DNA para a única variante de processamento que origina uma proteína Enovina funcional após a tradução. O número dos resíduos de nucleótidos está mostrado à esquerda da sequência de DNA, ao passo que o número dos resíduos de aminoácidos está mostrado à direita da sequência proteica traduzida. Os sítios de processamento 5' e 3', detectados por comparação de fragmentos de cDNA sequenciados com a sequência genómica, estão indicados por linhas verticais dobradas para a esquerda ou para a 25 direita, respectivamente, e estão numerados consecutivamente. 0 sitio de clivagem de furina RXXR putativo para o pró-domínio está indicado a cheio e sublinhado. O início putativo da proteína madura está indicado por uma seta. Os sete resíduos cisteína conservados, característicos de todos os membros da família TGF-β, estão indicados a cheio. Um sítio de glicosilação N-ligado potencial está duplamente sublinhado. Os sítios de processamento 5' e 3' estão numerados dentro de uma circunferência.

Figura 22: é uma ilustração da expressão de diferentes variantes de processamento da Enovina em tecidos humanos. (A) diagrama esquemático de variantes de processamento da Enovina identificadas por experiências de RT-PCR, com "primers" específicos para a Enovina, em RNA derivado de diferentes tecidos humanos, seguido de clonagem e análise de sequências dos produtos de PCR. A linha de cima mostra uma escala (em pares de bases). A segunda linha representa a sequência genómica da Enovina. Estão indicadas as posições dos codões de início e terminação da tradução, do início da sequência codificadora da Enovina madura e dos sítios de processamento 5' e 3' (ver Figura 21). A parte direita da figura mostra os produtos de PCR obtidos por RT-PCR em RNA do ovário e do córtex frontal, juntamente com um marcador de tamanho escalonado ("ladder") de DNA de 100 pares de bases. A posição das diferentes variantes de mRNA está indicada juntamente com a sua dimensão (desde o codão de início até ao de terminação) . As proteínas traduzidas estão mostradas no lado esquerdo. Os rectângulos delimitam regiões representadas no cDNA. As linhas tracejadas representam DNA genómico removido no 26 processamento. A região sombreada representa a sequência codificadora da Enovina madura. A linha ponteada marca o inicio da sequência codificadora da Enovina madura. Os dois transcritos capazes de originar proteina Enovina funcional estão indicados por um asterisco no lado esquerdo. (B) Distribuição em tecidos das principais variantes de processamento. A fotografia mostra os fragmentos de PCR obtidos por RT-PCR, com "primers" específicos para a Enovina, em diferentes cDNAs humanos. As 4 variantes de processamento principais (A até D) estão indicadas por setas no lado esquerdo. As dimensões estão indicadas no lado direito, com base no marcador de tamanho escalonado de DNA de 100 pares de bases, utilizado como referência de tamanhos no gel.

Figura 23: Sequência proteica prevista da variante de processamento longa da Enovina, obtida por remoção no processamento dos dois intrões da sequência de DNA da Figura 21. Os sitios de processamento 5Ί e 3'-l são utilizados para remover o primeiro intrão, e os sitios de processamento 5'-2 e 3'-3 são utilizados para remover o segundo intrão. Isto resulta numa sequência de cDNA com uma fase de leitura aberta que codifica para a proteina com 228 residuos de aminoácidos mostrada acima.

Figura 24: Sequência proteica prevista de uma variante de processamento alternativa (curta) da Enovina, obtida por remoção no processamento dos dois intrões da sequência de DNA da Figura 21. Os sitios de processamento 5'-l e 3'-2 são utilizados para remover o primeiro intrão, e os sitios de processamento 5'-2 e 27 3'-3 são utilizados para remover o segundo intrão. Isto resulta numa sequência de cDNA com uma fase de leitura aberta que codifica para a proteína com 220 resíduos de aminoácidos mostrada acima. A esta sequência proteica faltam 8 resíduos de aminoácidos, em comparação com a sequência da Figura 23.

Figura 25: é uma representação gráfica dos resultados obtidos em experiências concebidas para comparar os níveis de expressão da enovina em tecido normal e doente. A expressão da enovina e de GAPDH está representada em tecido do cérebro, relativamente a esclerose múltipla e doença de Alzheimer.

Figura 26: é uma representação gráfica dos resultados obtidos para detectar níveis de expressão de enovina e GAPDH em doença de Parkinson e cancro.

Depósitos O plasmídeo EVNmat/pRSETB incluindo a sequência de DNA que codifica a enovina foi depositado, em 6 de Maio de 1999, com o N° de Acesso LMBP3931, no Belgian Coordinated Collections of Micro-Biologie (BCCM) no Laboratorium voor Moleculaire - Plasmidencollectie (LMBP) B9000, Ghent, Bélgica, de acordo com as condições do Tratado de Budapeste de 28 de Abril de 1997.

Materiais e métodos Materiais A Taq polimerase nativa, ampicilina, IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido), X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D- 28 galactopiranósido) e todas as enzimas de restrição utilizadas provieram da Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemanha). Adquiriu-se mistura de dNTP 10 mM à Life Technologies (Gaithersburg, MD, E.U.A.). O estojo de clonagem TOPO-TA foi adquirido à Invitrogen BV (Leek, Paises Baixos). O estojo de purificação mini- ou midi-DNA plasmidico Qiagen, o estojo Spin Miniprep Qiaprep e o estojo de extracção em gel Qiaquick foram adquiridos à Qiagen GmbH (Dusseldorf, Alemanha). Bibliotecas de cDNA, estojos de cDNA Marathon™ Ready, painéis I e II de cDNA de múltiplos tecidos humanos (MTC™) , colorações "Northern" de múltiplos tecidos e o estojo de PCR de cDNA Advantage-GC foram adquiridos à Clontech Laboratories (Paio Alto, CA, E.U.A.). Todas as reacções de PCR foram realizadas num dispositivo de aplicação de ciclos GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA, E.U.A.). O meio LB (Luria-Bertani) consiste em 10 g/1 de triptona, 5 g/1 de extracto de levedura e 10 g/1 de NaCl. As placas 2x YT/ampicilina consistem em 16 g/1 de triptona, 10 g/1 de extracto de levedura, 5 g/1 de NaCl, 15 g/1 de agar e 100 mg/1 de ampicilina.

Pesquisas de homologia em bases de dados e comparação de sequências.

Utilizando o factor neurotrófico derivado da linha completa de células gliais humanas (GDNF; n° de acesso Q99748), neurturina (NTN; n° de acesso P39905) e persefina (PSP; n° de acesso AF040962), sequências proteicas derivadas de cDNA como sequências de pesquisa, efectuou-se uma busca por BLAST (Ferramenta Básica de Busca de Alinhamentos Locais ("Basic Local Alignment Search Tool") ; Altschul et al., 1990) na actualização diária das bases de 29 dados de marcadores de sequências expressas (EST) e genómicas humanas EMBL/GenBank.

Efectuaram-se pesquisas adicionais por BLAST utilizando a sequência genómica com o n° de acesso AC005038, tendo-se detectado vários ESTs presentes na base de dados GenBank e exibindo homologia para esta sequência genómica.

Calculou-se a percentagem de identidade e percentagem de semelhança entre membros da familia GDNF por comparação em pares das sequências, utilizando o programa BESTFIT (pacote de "software" de análise de sequências do Genetics Computer Group, versão 8.0, Universidade de Wisconsin, Madison, WI, E.U.A.). Os alinhamentos de sequências de DNA ou proteicas foram feitos com o programa de alinhamento ClustalW (EMBL, Heidelberg, Alemanha).

Sintese de oligonucleótidos para PCR e sequenciação de DNA.

Todos os "primers" oligonucleotidicos foram encomendados à Eurogentec (Seraing, Bélgica). Os "primers" de sequenciação específicos para inserções (15- e 16-meros) e os "primers" a serem utilizados em reacções de PCR foram concebidos manualmente. O DNA foi preparado em colunas de permuta aniónica de ponta 20 ou 100 Qiagen ou de rotação ("spin") Qiaquick (Qiagen GmbH, Dusseldorf, Alemanha) e foi recuperado das colunas em 30 μΐ de tampão TE (Tris.HCl 10 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,0).

As reacções de sequenciação foram realizadas em ambos os filamentos utilizando o estojo de sequenciação BigDye Terminator Cycle da ABI Prism e foram conduzidas num sequenciador Applied Biosystems 377XL (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, E.U.A.). Utilizou-se o "software" Sequencher™ para a reunião de sequências e edição manual (GeneCodes, AnnArbor, MI, E.U.A.). 30

Clonagem de um novo homólogo do GDNF.

Utilizou-se uma região de DNA, abrangendo os nucleótidos 67411 até 68343, do n° de acesso da EMBL AC005038, cuja sequência proteica traduzida era homóloga à NTN e PSP maduras, para conceber "primers" oligonucleotidicos para por PCR. Os diferentes "primers" utilizados estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: "Primers" utilizados para a amplificação por PCR de fragmentos de ACO05038 Nome do "primer" Sequência do "primer" PNHspl 5' - CGGTGCACTCAGGTGATTCCTCC - 3' PNHsp2 5' - GGCAGCAAACCCATTATACTGGAACC - 3' PNHsp3 5'- CGCTGGTGCAGTGGAAGAGCC - 3' PNHsp4 5' - CTGCACCCCCATCTGCTCTTCC - 3' PNHapl 5' - GCAGGAAGAGCCACCGGTAAGG - 3' PNHap2 5' - CCAGTCTGCAAAGCCCTGGAGC - 3'

Utilizaram-se os "primers" PNHsp3 e PNHapl para amplificar um fragmento de 502 pares de bases em cDNA derivado de diferentes tecidos humanos (cDNA Marathon-Ready® de cérebro fetal, feto completo, próstata ou pulmão (Clontech Laboratories), cDNA do córtex frontal, hipocampo e cerebelo) e em DNA genómico humano. Com base na sequência genómica da base de dados EMBL/GenBank (n° de acesso AC005038), foi previsto que o fragmento a ser amplificado teria um teor de G+C de 76%. Assim, fizeram-se amplificações utilizando o estojo de PCR de cDNA Advantage-GC (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, E.U.A.) optimizado para a amplificação de sequências de DNA ricas em GC. As reacções de PCR foram efectuadas num volume total de 50 μΐ contendo tampão de reacção de PCR de cDNA lx GC, 31 dNTP 0,2 mM, GC-MELT™ 1 M, 200 nM dos "primers" PNHsp3 e PNHapl, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 1 até 5 μΐ de cDNA ou 0,5 μρ de DNA genómico. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 5 minutos e procedeu-se à aplicação de ciclos durante 45 s a 95°C, 1 minuto a 58°C e 40 s a 72°C durante 35 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Por fim, as amostras foram tratadas com 2,5 U de Taq DNA polimerase nativa, para adicionar uma protuberância A. Analisaram-se os produtos de PCR num gel de agarose 1% (p/v) em tampão lx TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,3). Os fragmentos de PCR com a dimensão esperada (495 pares de bases) foram excisados do gel e purificados com o estojo de extracção em gel Qiaquick. Os fragmentos de PCR foram sequenciados, para confirmar a sua identidade, e foram clonados no vector plasmidico pCR2.1-TOPO, utilizando o estojo de clonagem TOPO TA de acordo com as instruções do fabricante. Aproximadamente 20 ng de fragmento purificado foram combinados com 1 μΐ de vector pCR2.1-TOPO num volume total de 5 μΐ. As reacções foram incubadas à temperatura ambiente (20°C) durante 5 minutos. O volume de 2 μΐ da reacção foi transformado em células competentes TOPIOF' (Invitrogen BV) , utilizando transformação por choque térmico, e foi plaqueado em placas 2x YT/ampicilina suplementadas com IPTG 10 mM e X-gal 2% (p/v) para rastreio de azul-branco. Após crescimento durante a noite, as colónias brancas foram recolhidas das placas e cresceram em 5 ml de meio LB suplementado com 100 mg/1 de ampicilina, e preparou-se DNA plasmidico utilizando o estojo Qiaprep Spin Miniprep. Confirmou-se a presença de uma inserção com o tamanho esperado por digestão de restrição com AcoRI. Sequenciou-se a inserção plasmidica de vários clones positivos e 32 compararam-se as sequências obtidas utilizando o programa de alinhamento ClustalW.

Para obter sequências codificadoras adicionais para o novo homólogo do GDNF, um fragmento com uma dimensão esperada de 931 pares de bases, baseado na sequência da EMBL/GenBank (n° de acesso AC005038), foi amplificado por PCR utilizando os "primers" PNHspl e PNHapl. As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 μΐ contendo tampão de reacção de PCR de cDNA lx GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELT™ 1 M, 20 0 nM dos "primers" PNHspl e PNHapl, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 1 até 5 μΐ de cDNA do cerebelo, córtex frontal ou hipocampo ou 0,5 μg de DNA genómico. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 5 minutos e procedeu-se à aplicação de ciclos durante 45 s a 95°C, 1 minuto a 58°C e 1 minuto e 30 s a 72°C durante 35 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Os produtos de PCR foram analisados num gel de agarose 1% (p/v) em tampão lx TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,3). Efectuou-se uma amplificação de segunda ronda com "primers" encaixados (PNHsp2 e PNHap2). Utilizou-se 1 μΐ da reacção de amplificação de primeira ronda num volume total de 50 μΐ contendo tampão de reacção de PCR de cDNA lx GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELT™ 1 M, 200 nM dos "primers" PNHsp2 e PNHap2 e 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 5 minutos e procedeu-se à aplicação de ciclos durante 45 s a 95°C, 1 minuto a 58°C e 1 minuto e 30 s a 72°C durante 35 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. As amostras foram analisadas num gel de agarose 1% (p/v) em tampão lx

TAE. Os fragmentos de PCR com a dimensão esperada (87 0 pares de bases) foram excisados do gel e purificados com o estojo de extracção em gel Qiaquick. Os fragmentos de PCR 33 foram sequenciados, para confirmar a sua identidade, foram tratados com 2,5 U de Taq polimerase e clonados no vector plasmidico pCR2.1-T0P0, utilizando o estojo de clonagem TOPO TA de acordo com as instruções do fabricante. Aproximadamente 20 ng de fragmento purificado foram combinados com 1 μΐ de vector pCR2.1-TOPO num volume total de 5 μΐ. As reacções foram incubadas à temperatura ambiente (20°C) durante 5 minutos. O volume de 2 μΐ das reacções foi transformado em células competentes TOPIOF', utilizando transformação por choque térmico, e foi plaqueado em placas 2x YT/ampicilina suplementadas com IPTG 10 mM e X-gal 2% (p/v) para rastreio de azul-branco. Após crescimento durante a noite, as colónias brancas foram recolhidas das placas e cresceram em 5 ml de meio LB suplementado com 100 mg/1 de ampicilina, e preparou-se DNA plasmidico utilizando o estojo Qiaprep Spin Miniprep. Confirmou-se a presença de uma inserção com o tamanho esperado por digestão de restrição com EcoRI. Sequenciou-se a inserção plasmidica de vários clones positivos e compararam-se as sequências utilizando o programa de alinhamento ClustalW.

Análise da expressão do gene da enovina por análise de RT-PCR.

Utilizaram-se os "primers" oligonucleotidicos PNHsp3 e PNHapl (ver tabela 1) para a amplificação por PCR especifica de um fragmento de 502 pares de bases da enovina. As amplificações por PCR foram efectuadas em painéis de cDNA de múltiplos tecidos humanos (MTC™) normalizados para os niveis de expressão de mRNA de seis genes domésticos diferentes. As reacções de PCR com "primers" específicos para a enovina foram realizadas num 34 volume total de 50 μΐ contendo 5 μΐ de cDNA, tampão de reacção de PCR de cDNA lx GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELT TM 1 M, 400 nM dos "primers" PNHsp3 e PNHapl e 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen. As amostras foram aquecidas para 95°C durante 30 s e aplicaram-se ciclos durante 30 s a 95°C e 30 s a 68°C durante 35 ciclos. As amostras foram analisadas num gel de agarose 1,2% (p/v) em tampão lx TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,3), tendo-se obtido imagens dos géis corados com brometo de etidio utilizando um Sistema de video Eagle Eye II (Stratagene, La Jolla, CA, E.U.A.).

Uma pesquisa de semelhanças na actualização diária da base de dados EMBL/GenBank com as sequências proteicas da neurturina e persefina humanas deu origem a uma sequência de DNA genómico que codifica para uma nova proteína putativa semelhante aos factores neurotróficos GDNF, NTN e PSP, que foi denominada enovina (EVN). Uma pesquisa adicional de homologias na base de dados utilizando a sequência de DNA genómico que rodeia a região que codifica para a enovina deu origem a vários clones de marcadores de sequências expressas (EST) derivados de diferentes tecidos humanos (epitélio da próstata [n° de acesso AA533512 (ID1322952)], carcinoma do pulmão [n° de acesso AA931637] e tumor da paratiróide [n° de acesso AA844072]). Estes clones contêm sequências de DNA fora da região de homologia com o GDNF, PSP ou NTN, mas confirmaram que o mRNA da enovina é expresso em tecidos normais e tumorais. A amplificação inicial por PCR utilizando "primers" (PNHsp3 e PNHapl) baseados na sequência genómica deu origem a um fragmento = 500 pares de bases de cDNA de feto, cérebro fetal, próstata, córtex frontal, hipocampo e cerebelo e de DNA genómico, mas não de cDNA do pulmão. A clonagem e análise de sequências destes fragmentos deu 35 origem a uma sequência de DNA de 474 pares de bases, que foi traduzida numa sequência proteica prevista de 139 resíduos de aminoácidos, incluindo sete resíduos cisteína conservados característicos de todos os membros da família de proteínas do factor de transformação de crescimento β (TGF-β) (Kingsley, 1994) (Figura 1) . A sequência também continha um motivo RXXR para a clivagem do pró-domínio (RAAR, posições de aminoácidos 23 até 26) (Barr, 1991). Um sítio de clivagem semelhante está presente nas sequências proteicas do GDNF, NTN e PSP, numa posição comparável da sequência do pró-domínio. Presumindo que a clivagem do pró-domínio da enovina ocorre neste sítio in vivo, a sequência proteica da EVN madura tem 113 resíduos de aminoácidos (resíduos 27 até 139 na figura 1), tem uma massa molecular calculada de 11965 Da e um ponto isoeléctrico de 11,8. Na sequência madura está presente um sítio de N-glicosilação potencial (NST na posição de aminoácidos 121-123). Além disso, também estavam presentes na enovina várias regiões conservadas entre as formas maduras dos factores neurotróficos conhecidos GDNF, NTN e PSP (Figura 2). A Tabela 2 resume os resultados da comparação das sequências proteicas maduras dos membros da família GDNF pelo programa BESTFIT. Mostram-se a percentagem de identidade e a percentagem de semelhança. As sequências maduras do GDNF, NTN, PSP e EVN utilizadas nesta comparação começaram no primeiro resíduo de aminoácido após o sítio de clivagem RXXR. 36

Tabela 2: Comparação em pares dos membros da família GDNF humanos maduros utilizando o programa BESTFIT.

Comparação % identidade % semelhança EVN versus GDNF 38,8 47,2 EVN versus NTN 51 56, 1 EVN versus PSP 53,3 57,8 GDNF versus NTN 44,8 57,3 GDNF versus PSP 44,3 50 NTN versus PSP 50 54,4

Destas comparações é claro que a proteína enovina madura está relacionada mais de perto com a persefina e com a neurturina do que com o GDNF. A amplificação, clonagem e análise de sequências de um fragmento maior da sequência de DNA da enovina de cDNA do córtex frontal, utilizando "primers" baseados na sequência genómica de EMBL/GenBank (n° de acesso AC005038), deu origem a uma sequência de 819 pares de bases (Figura 3) . Esta sequência contém um codão de início ATG putativo nas posições de nucleótidos 30-32 e dá origem a uma fase de leitura aberta (fase de leitura A na figura 3) que se prolonga até um codão de terminação nas posições de nucleótidos 285-287. A sequência proteica traduzida desta região não exibe semelhança com nenhuma proteína conhecida presente nas bases de dados. A tradução da sequência de cDNA na segunda fase de leitura (fase de leitura B na figura 3) dá origem a uma sequência proteica prevista com 159 resíduos de aminoácidos. Esta sequência contém o sítio de clivagem RXXR (posições B43 até B46; posições de nucleótidos 460-471) e a sequência correspondente à sequência da enovina madura (posições B47 até B159; posições de nucleótidos 472-810). A fase de leitura aberta que inclui o sítio de clivagem RXXR e a sequência 37 codificadora da enovina madura prolonga-se desde a posição de nucleótidos 334 (precedida por um codão de terminação na estrutura) até um codão de terminação na posição 811-813, mas não contém um codão ATG para um residuo metionina de inicio. Por analogia com a persefina (Milbrandt et al., 1998), pomos a hipótese de um intrão não processado estar presente na maioria dos transcritos de mRNA do gene EVN. 0 GDNF e a NTN também têm um intrão nas suas regiões codificadoras do pró-dominio respectivas (Matsushita et al., 1997, Heuckeroth et al., 1997).

Para avaliar a existência de diferentes transcritos de mRNA para a Enovina, efectuaram-se experiências de RT-PCR utilizando "primers" situados na extremidade 5' da sequência codificadora da Enovina imediatamente a 5' de um possível codão de início ATG a montante ("primer" PNHsp5 [5'-GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3'] e "primer" encaixado PNHspô [5' -GGT GGG GGA ACA GCT CAA CAA TGG-3'] e na extremidade 3' ("primer" PNHapl e "primer" encaixado PNHap2 [ver Tabela 1]). As experiências foram realizadas em painéis de cDNA de múltiplos tecidos humanos (painéis MTC I e II da Clontech), numa biblioteca de cDNA de coração fetal (Clontech) e em cDNA derivado de cerebelo, hipocampo ou córtex frontal humanos (Masure et al., 1998). As reacções de PCR primárias foram conduzidas com os "primers" PNHsp5 e PNHapl em condições ricas em GC (estojo de PCR Advantage GC, Clontech) durante 30 ciclos (95°C - 30 s, 60°C - 30 s, 72°C - 1 minuto) como descrito. As reacções de PCR encaixadas foram efectuadas em 1 μΐ do produto da PCR primária, utilizando os "primers" PNHspô e PNHap2 nas mesmas condições durante 30 ciclos. Analisaram-se os produtos de PCR resultantes num gel de agarose 1,5%, cuja dimensão variou desde ± 350 pares de bases até ± 800 pares de bases. Purificaram-se várias bandas do gel e 38 sequenciaram-se directamente os fragmentos de PCR. Alguns produtos de PCR purificados também foram clonados no vector pCR2.1-T0P0 (estojo de clonagem TOPO-TA, Invitrogen) e depois foram sequenciados. A análise de sequências confirmou a existência de diferentes moléculas de mRNA contendo a sequência da Enovina. Compararam-se as sequências dos fragmentos obtidos com a sequência genómica da Enovina. Isto permitiu-nos identificar na sequência genómica vários sítios possíveis de processamento 5' e 3' (Figura 21) . Todos estes sítios de processamento corresponderam às sequências de consenso de sítios de processamento dadores e aceitadores (Senapathy, P., Shapiro, M.B. & Harris, N.L. (1990) "Splice junctions, branch point sites, and exons: sequence statistics, Identification, and applications to genome project" Methods Enzymol. 183, 252-278). As diferentes variantes de processamento da Enovina identificadas e a sua presença em diferentes tecidos humanos estão resumidas na Figura 22. Apenas dois dos 5 transcritos sequenciados dão origem à proteína Enovina funcional por tradução a partir do codão de início ATG. Estes dois transcritos codificam para proteínas de 228 ou 220 aminoácidos, respectivamente, com péptidos de sinal previstos de 47 e 39 resíduos de aminoácidos. As sequências proteicas previstas destas duas variantes estão apresentadas na Figura 23 (variante longa) e Figura 24 (variante curta). A variante longa pode ser deduzida da sequência de DNA da Figura 21 removendo no processamento o primeiro intrão nas localizações 5'—1 e 3'-1 e o segundo intrão em 5'-2 e 3'-3. Por tradução da fase de leitura aberta obtém-se a sequência proteica prevista da Figura 23. A variante mais pequena pode ser deduzida da sequência de DNA da Figura 21 removendo no processamento o primeiro intrão nas localizações 5' — 1 e 3'-2 e o segundo 39 intrão em 5'-2 e 3'-3. Por tradução da fase de leitura aberta obtém-se a sequência proteica prevista da Figura 24. 0 transcrito mais longo parece ser o mais abundante na maior parte dos tecidos, como avaliado pela intensidade das bandas na Figura 22B. Os transcritos mais pequenos resultam em deslocamentos do quadro de leitura, que originam uma proteina traduzida sem a sequência de aminoácidos da Enovina madura homóloga ao GDNF, NTN e PSP. Aos dois transcritos mais pequenos falta mesmo parte da sequência codificadora madura, incluindo dois dos sete residuos cisteina altamente conservados. A Figura 22B mostra a distribuição das principais variantes de processamento em diferentes tecidos humanos. 0 mRNA funcional da Enovina é expresso em quase todos os tecidos testados, incluindo cérebro, coração, rim, figado, pulmão, pâncreas, músculo-esquelético, cólon, intestino delgado, leucócitos do sangue periférico, baço, timo, próstata, testiculos, ovário, placenta e coração fetal. Em alguns tecidos humanos (por exemplo, cerebelo, hipocampo) só foi possivel amplificar por PCR transcritos não funcionais. Tanto quanto sabemos, a ocorrência de transcritos de mRNA não funcionais nessa extensão não tinha sido descrita antes. 0 significado biológico desta descoberta ainda terá de ser estudado. Apesar da expressão da NTN e PSP em tecidos diferentes não ter sido completamente caracterizada, os seus niveis de expressão parecem ser muito mais baixos e a expressão parece estar mais restringida a certos tecidos (Kotzbauer et al., 1996, Milbrandt et al., 1998). 40

Expressão recombinante de Enovina em E. coli. Construção de vim plasmideo de expressão da Enovina.

Um fragmento de PCR com 414 pares de bases foi amplificado a partir de DNA genómico humano com os "primers" PNHsp4 e PNHap2 (Tabela 1) e foi clonado no vector pCR2.1-TOPO utilizando clonagem TA (Invitrogen). Confirmou-se a sequência da inserção por análise de sequências. Utilizou-se um clone contendo uma inserção com a sequência de consenso da Enovina (clone 36) para a construção subsequente de um plasmideo de expressão. Conceberam-se dois "primers" contendo sitios de restrição apropriados nas suas extremidades 5'. O "primer" directo PNHexp-spl (5 1 ~GCG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A-3') continha um sitio de restrição de BamHI (sublinhado) e o "primer" reverso PNHexp-apl (5'-GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G-3') continha um sitio de restrição de Xhol (também sublinhado). Utilizando estes "primers", amplificou-se a partir do clone 36 o fragmento de 343 pares de bases que codifica para a Enovina madura (posições 81 até 422 na Figura 1) . A reacção de PCR foi realizada num volume total de 50 μΐ contendo tampão de reacção de PCR de cDNA lx GC, dNTP 0,2 mM, GC-MELT™ 1 M, 200 nM dos "primers" PNHexp-spl e PNHexp-apl, 1 μΐ de mistura de Taq polimerase Advantage Klen e 10 ng de DNA plasmidico do clone 36. As amostras foram aquecidas para 94°C durante 5 minutos e procedeu-se à aplicação de ciclos durante 45 s a 94°C, 1 minuto a 58°C e 30 s a 72°C durante 25 ciclos, com um passo final de 7 minutos a 72°C. Os 50 μΐ de produto resultantes foram purificados utilizando o estojo de purificação de PCR Qiaquick (Qiagen) e o DNA eluiu em 30 μΐ. Em seguida, 25 μΐ deste produto purificado foram digeridos numa reacção de 30 41

μΐ com 10 U de BamHI e 10 U de Xhol em lx tampão B (Boehringer Mannheim) durante 1 hora a 37°C. Após electroforese num gel de agarose 1% (p/v) em lx tampão TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA (sal de sódio) 1 mM, pH 8,3), a banda esperada de 353 pares de bases foi excisada do gel e foi purificada utilizando o estojo de extracção em gel Qiaquick. O fragmento resultante foi ligado no vector pRSET B (Invitrogen) linearizado com BamHI e Xhol. Confirmou-se a inserção da construção plasmidica resultante (hEVNmat/ pRSETB) por análise de sequências completas. A construção resultante codifica para uma proteína de 146 aminoácidos, com uma massa molecular prevista de 15704 Da, incluindo uma cauda 6x His NH2-terminal fundida na estrutura à sequência codificadora da Enovina madura. Assim, a sequência de aminoácidos NH2-terminal da proteína resultante é MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDK-DPAGGPGS (sequência da

Enovina madura a cheio, cauda 6x His sublinhada).

Expressão de Enovina em células de E. coli BL21(DE3)

A produção recombinante da proteína Enovina foi realizada essencialmente como descrito para a Neurturina por Creedon et al. (1997), com modificações. Para a produção da proteína Enovina recombinante, o plasmídeo hEVNmat/pRSETB foi transformado na estirpe de E. coli BL21(DE3) (Novagen) e cresceu em meio 2xYT/ampicilina (16 g/1 de triptona, 10 g/1 de extracto de levedura, 5 g/1 de NaCl e 100 mg/1 de ampicilina) a 30°C (225 rpm) ou 37°C (300 rpm) para uma OD600 aproximadamente de 0,5, antes da adição de IPTG para uma concentração final de 0,2 mM, com a finalidade de induzir a expressão. Os grânulos celulares foram recolhidos por centrifugação após um período de indução de 3 horas, foram lavados com solução salina 42 tamponada com fosfato, centrifugados e armazenados no estado congelado. Para a purificação e redobramento, os grânulos celulares foram novamente suspensos em tampão de sonicação (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, inibidores de proteases (pastilhas de "cocktail" de inibidores de proteases Complete™ (Boehringer Mannheim) , 1 pastilha por 50 ml de tampão) e 1 mg de lisozima por 500 mg de grânulos celulares). As células foram desagregadas por sonicação e os corpos de inclusão foram recolhidos por centrifugação. Os corpos de inclusão foram dissolvidos e incubados em tampão A (ureia 8 M, Tris-HCl 20 mM pH 7,6, NaCl 200 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM) durante 30 minutos a 37°C antes da adição a resina Ni-NTA (níquel-ácido nitrilotriacético, Qiagen). Após 40 minutos de agitação a 37°C, as amostras foram lavadas uma vez com tampão A e foram introduzidas numa coluna de Ni-NTA de 5 ml. A coluna foi lavada sucessivamente com 10 volumes da coluna de tampão A, 10 volumes da coluna de tampão A a pH 7,2 e 10 volumes da coluna de tampão A a pH 7,2 + imidazolo 10 mM. A Enovina foi eluída da coluna em 4 volumes da coluna de tampão A a pH 7,2 + imidazolo 200 mM.

Procedeu-se ao redobramento da Enovina por diálise durante a noite em passos a 4°C em tampão de renaturação (fosfato de sódio 0,1 M, NaCl 0,15 M, cisteína 3 μΜ, Tween-20 0,02%, glicerol 10%, Tris-HCl 0,01 M, pH 8,3) contendo quantidades decrescentes de ureia em cada passo (ureia 6 M para 4 M para 3 M para 2 M para 1 M para 0,5 M para 0 M). A proteína purificada foi transferida em alíquotas, armazenada a -20°C e suplementarmente utilizada em ensaios funcionais. 43

Localização cromossómica do gene da Enovina.

Amplificou-se um fragmento de 3,3 kb do gene da Enovina a partir de cDNA de cerebelo utilizando os "primers" EVN (7) -spl (5 ' -TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC-3') e PNHapl (5'-GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G-3') concebidos na sequência com o número de acesso da EMBL AC005038. A reacção de PCR foi realizada num volume total de 50 μΐ contendo tampão de reacção de PCR lx Expand Long Template (Boehringer Mannheim) , dNTP 0,5 mM, GC-MELT 1 M (Clontech Laboratories), 400 nM dos "primers" EVN(7)-spl e PNHapl e 1 μΐ de cDNA do cerebelo. Após 2 minutos iniciais a 94°C, adicionaram-se 0,75 μΐ de polimerase Expand Long Template (Boehringer Mannheim) e aplicaram-se ciclos durante 10 s a 94°C, 30 s a 58°C e 3 minutos a 68°C durante 10 ciclos. Em seguida, aplicaram-se 20 ciclos adicionais aumentando o tempo de extensão a 68°C em 20 s cada ciclo. Também se incluiram 7 minutos finais a 68°C. O fragmento de 3,3 kb resultante foi purificado após electroforese num gel 0,8% agarose/TAE e foi clonado no vector pCR2.1-TOPO utilizando clonagem TA (Invitrogen). A análise de sequências completas da inserção de 3,3 kb de um clone confirmou que a sequência de cDNA obtida correspondeu à sequência genómica da base de dados EMBL (número de acesso AC005038). Não foram removidos no processamento nenhuns intrões do cDNA obtido de cDNA do cerebelo.

Efectuaram-se estudos de mapeamento cromossómico utilizando análise de hibridização in situ fluorescente (FISH) essencialmente como descrito (Heng et al., 1992, Heng & Tsui, 1993). Cultivaram-se linfócitos humanos a 37°C durante 68-72 horas antes do tratamento com 0,18 mg/ml de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), para sincronizar os ciclos 44 celulares na população de células. As células sincronizadas foram lavadas e novamente cultivadas a 37°C durante 6 horas. Recolheram-se as células e prepararam-se lamelas utilizando procedimentos comuns, incluindo tratamento hipotónico, fixação e secagem ao ar. A sonda de 3,3 kb para a Enovina foi biotinilada e utilizada para a detecção por FISH. As lamelas cozeram a 55°C durante 1 hora, foram tratadas com RNase e desnaturadas em formamida 70% em 2x NaCl/Cit (em que 20x NaCl/Cit consiste em NaCl 3 M, citrato dissódico 0,3 M, pH 7,0) durante 2 minutos a 70°C, seguido de desidratação com etanol. A sonda foi desnaturada antes de ser introduzida nas lamelas cromossómicas desnaturadas. Após hibridização durante a noite, lavaram-se as lamelas, registaram-se separadamente os sinais de FISH e o padrão de formação de bandas com 4',6-diamidino-2-fenilindolo em filme fotográfico e correlacionaram-se os dados do mapeamento por FISH com as bandas cromossómicas por sobreposição dos sinais de FISH com cromossomas com bandas de 4',6-diamidino-2-fenilindolo (Heng & Tsui, 1993). Nas condições utilizadas, a eficiência da hibridização para esta sonda foi, aproximadamente, 72% (em 100 figuras mitóticas verificadas, 72 delas exibiram sinais num par dos cromossomas) . Uma vez que se utilizou a formação de bandas com 4',6-diamidino-2-fenilindolo para identificar o cromossoma especifico, obteve-se correlação entre o sinal da sonda e o braço curto do cromossoma 1. A posição pormenorizada foi suplementarmente determinada com base no resumo de 10 fotografias (Figura 4A) . A detecção por FISH não identificou nenhum locus adicional nas condições utilizadas; em consequência, concluímos que a Enovina está localizada no cromossoma 1 humano, região p31.3-p32. Apresenta-se na Figura 4B um exemplo dos resultados do mapeamento. 45

Dos dados de mapas genéticos do National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih. gov/genemap) pode deduzir-se que o clone genómico contendo a sequência da Enovina (número de acesso EMBL AC005038) está localizado no cromossoma 1 entre os marcadores D1S2843 e D1S417. Isto corresponde ao cromossoma 1, região p31.1 até p32.3, confirmando os dados obtidos pela análise de FISH.

Distribuição em tecidos da Enovina, determinada por análise de coloração "Northern" e coloração em pontos ("dot blot").

Colorações "Northern" contendo 2 μρ de RNA rico em poli(A) derivado de diferentes tecidos humanos (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA, E.U.A.; coloração MTN™, coloração II MTN™ e coloração II MTN™ fetal) foram hibridizadas, de acordo com as instruções do fabricante, com um fragmento de Enovina de 897 pares de bases etiquetado, por iniciação ("priming") aleatorra, com α- P-dCTP (estojo HighPrime, Boehringer Mannheim). Este fragmento foi obtido por amplificação por PCR, com os "primers" PNHspl e PNHapl, em cDNA do córtex frontal e clonagem subsequente no vector pCR2.1-T0P0. 0 fragmento contém 897 pares de bases da sequência da Enovina até ao codão de terminação e inclui a sequência codificadora completa para a proteina Enovina madura.

Detectou-se mRNA da Enovina na forma do transcrito principal com aproximadamente 4,5 kb (Fig. 5A-C). 0 mRNA da Enovina foi expresso numa gama de tecidos, maioritariamente no coração, músculo-esquelético, pâncreas e próstata. Alguns transcritos mais pequenos estão presentes, por exemplo, na placenta (4 kb, 2,4 kb e 1,6 kb) e próstata (4 kb e 1,6 kb). Em tecido fetal, um transcrito maioritário de 46 2,4 kb está presente no fígado e, em menor extensão, no pulmão. Também estão presentes outros transcritos em rim, fígado, pulmão e cérebro fetais.

Adicionalmente, uma coloração principal de RNA (Clontech Laboratories), contendo RNA rico em poli(A) de diferentes tecidos humanos e fases do desenvolvimento, também foi hibridizada com a sonda de Enovina de 897 pares de bases. As amostras de RNA rico em poli(A) utilizadas para esta coloração foram normalizadas pelo fabricante para os níveis de expressão de mRNA de oito genes domésticos diferentes. 0 mRNA da Enovina foi expresso de forma ubíqua, mas os níveis de mRNA mais elevados foram claros na próstata, glândula pituitária, traqueia, placenta, pulmão fetal, pâncreas e rim fetais (Figura 5D+E).

Construção de vectores de fusões GFRa-IgG-Fc

Regiões de cDNA do GFRa-1, GFRa-2 e GFRa-3 (que codificam para os aminoácidos 27 até 427, 20 até 431 e 28 até 371, respectivamente), excluindo as sequências que codificam para o péptido de sinal e para a região hidrófoba do terminal COOH envolvidas em ancoragem de GPI, foram clonadas na estrutura no vector de expressão Signal plg plus (R&D Systems Europe Ltd) . As proteínas resultantes expressas a partir destas construções contêm um péptido de sinal CD33 NH2-terminal de 17 aminoácidos, a região da proteína GFRa e um domínio de fusão IgGl humana-Fc COOH-terminal de 243 aminoácidos. Transfectaram-se células CHO com construções de fusão de GFRa e seleccionaram-se células transfectadas de forma estável utilizando 500 μρ de G418. Seleccionaram-se clones permanentes utilizando anticorpo anti Fc. Para a purificação de proteínas de fusão 47 GFRa, as células cresceram em meio sem soro e recolheu-se o meio de 3 em 3 dias. 0 meio foi centrifugado e aplicado numa coluna de proteína A (Proteína A Sefarose, Pharmacia Biotech). A proteína ligada eluiu com citrato de Na 0,1 M, PH 3,0, e foi recolhida em tampão Tris 1 M, pH 8,4. Estimou-se a concentração de proteína por absorvância a 280 nm, utilizando um coeficiente de extinção de 1,5. Estas proteínas de fusão GFRa-1 até 3 Fc solúveis e purificadas foram utilizadas em estudos de ligação subsequentes.

Análise de ressonância de plasmões de superfície

Efectuaram-se experiências de ressonância de plasmões de superfície (SPR) a 25°C utilizando um instrumento BIAcore 3000. As análises foram conduzidas com enovina e NGF como ligandos imobilizados. A matriz carboxilada de um "chip" sensor F1 foi primeiramente activada com uma mistura 1:1 de N-etil-N-(dimetilaminopropil)carbodiimida 400 mM e N-hidroxissuccinimida 100 mM durante 10 minutos. Em seguida, aplicaram-se enovina recombinante e NGF na superfície activada em tampão acetato 10 mM, pH 4,5, a uma taxa de fluxo de 5 μΐ/minuto. Os grupos reactivos não ocupados foram inactivados com cloridrato de etanolamina 1 M. Para as experiências de ligação, GFRal-3-Fc solúveis foram super-fundidos, a concentrações de 10-100 nM em solução salina tamponada com HEPES (NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, P-20 0,05%, HEPES 10 mM, pH 7,4), a uma taxa de fluxo de 10 μΐ/minuto. A associação foi monitorizada durante 3 minutos e a dissociação durante 1 minuto, seguido de regeneração com NaOH 5 mM. A dissociação foi iniciada por super-fusão com solução salina tamponada com HEPES. Utilizou-se um "software" de avaliação da BIAcore, 3.0, 48 para calcular a velocidade de associação (ka) , velocidade de dissociação (kd) e as constantes de dissociação de equilíbrio (KD, calculada como kd/ka) .

Resultados

Utilizou-se SPR para medir a ligação de GFRal-3 solúveis a enovina imobilizada. Só foi possível detectar ligação específica à enovina com o GFRa3 solúvel. O GFRal e GFRa2 não se ligaram à enovina imobilizada. A ligação observada do GFRa3 foi específica, não tendo ocorrido ligação ao NGF. Na experiência de controlo separada, detectou-se ligação específica de TrkA-Fc (receptor do NGF) ao NGF imobilizado, sem ligação à enovina imobilizada. A partir das curvas de ligação obtidas utilizando três concentrações diferentes de GFRa derivaram-se as seguintes constantes apresentadas na Tabela 3. Estes resultados demonstram que o GFRa3 se liga especificamente à enovina.

Tabela 3

Ka(l/Ms) Kd(l/s) Kd(M) GFRoí3 1,65 105 5,08 10'4 1 O \—1 \—1 00

Uma vez que o GDNF, NTN e PSP promovem a manutenção e sobrevivência de diferentes tipos de células neuronais, antecipa-se que a enovina exercerá efeitos biológicos semelhantes em células nervosas e, possivelmente, também noutros tipos de células. Em consequência, considera-se que a proteína enovina poderá ser útil no tratamento de 49 perturbações neurais em geral, incluindo doença de Parkinson, doença de Alzheimer, neuropatia periférica, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington, lesão cerebral aguda, tumores do sistema nervoso, esclerose múltipla, traumatismo dos nervos periféricos ou lesão de exposição a neurotoxinas. A enovina também pode ser útil em vários aspectos da neuroprotecção. Considerando o seu efeito na sobrevivência de diferentes populações de células neuronais e nas extensões de neurites observadas no nosso modelo de células SHSY5Y, propomos que este composto pode ter aplicações neuroprotectoras e neuro-regenerativas.

Isto baseia-se nas observações seguintes. 0 taxol induz apoptose neuronal em células de feocromocitoma de rato PC12 diferenciadas por NGF (Nuydens et ai., submetido). Em consequência, a citotoxicidade induzida pelo taxol tem caracteristicas de apoptose neuronal, como monitorizado por fragmentação de DNA, etiquetagem com Anexina V e protecção de bcl-2. Em consequência e como extensão, pode deduzir-se que o taxol induz apoptose em células SH-SY5Y diferenciadas. Mostra-se agora que a enovina é capaz de reduzir esta morte celular e, em consequência, pode inverter a apoptose neuronal em geral.

Assim, o composto pode ser útil nos seguintes estados neurodegenerativos onde foi observada a ocorrência de apoptose: acidente vascular cerebral (Hakim 1998), doença de Parkinson (Marsden et al. 1998), doença de Alzheimer (Nagy et al. 1998), doença de Huntington (Wellington et al. 1997), Neurotrauma (Smirnova et al. 1998), Neuropatias periféricas (Srinivisan et al. 1998).

Como exemplo da última indicação clinica, mostrámos que, na realidade, este factor neurotrófico protege células 50 de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciadas contra toxicidade celular induzida pelo taxol.

Metodologia de Medições de viabilidade

Determinou-se a viabilidade celular adicionando a cada cavidade 100 μΐ de uma solução 1 mg/ml de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT, Sigma) em DMEM (37°C) suplementado com metossulfato de fenazina 0,02 mM (PMS, Sigma). Em seguida, as placas foram incubadas a 37°C durante 2,5 horas. Leram-se as densidades ópticas (Molecular Devices) a 450 nm, utilizando 650 nm como referência. O ensaio de XTT baseia-se na conversão do sal de tetrazólio XTT num produto de formazano com coloração vermelha. Esta reacção é realizada por enzimas mitocondriais.

Metodologia da diferenciação neuronal 1. Diferenciação em células SHSY5Y de neuroblastoma humano Células SHSY5Y são diferenciadas durante 5 dias com estaurosporina 25 nM. Mede-se o efeito da Enovina 72 horas depois do inicio da experiência (referência: Jalava et al. "Protein Kinase inhibitor staurosporine induces a mature neuronal phenotype in SH-SY5Y human neuroblastoma cells through an a,b,z PKC independent pathway" Journ. Cell Physiol. 155, 301-312 (1993)). 2. Medição da extensão de neurites

As alterações morfológicas de neurónios foram automaticamente quantificadas do modo seguinte. Em resumo, 51 nas alturas apropriadas, adicionou-se glutaraldeido directamente ao meio e deixou-se repousar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Este passo assegurou que a morfologia das células nessa altura reflectiu a situação real. Observaram-se as células pelo modo de luz transmitida num microscópio Axiovert (Zeiss Oberkochen, Alemanha) equipado com uma fase de varrimento Marzhauser conduzida por um super-computador Indy (Silicon Graphics, Mountain View, E.U.A.). Capturaram-se imagens utilizando uma câmara de video MX5 (HCS) . Avaliaram-se cerca de 3000 células em 64 imagens alinhadas, formando uma matriz quadrada de imagens 8x8. O alinhamento exacto das imagens assegurou a monitorização das neurites de um campo de imagem para o seguinte. Procedeu-se à detecção automática das extensões de neurites, etiquetadas com anticorpo tau policlonal, utilizando um detector imparcial de estruturas curvilineas (Steger 1998). O "software" de análise calculou automaticamente a área total dos corpos celulares, número de corpos celulares e comprimento total das neurites.

Para investigar o efeito da enovina em diferentes tipos de células realizaram-se dois ensaios, um ensaio de síntese de DNA e um ensaio de quimiotaxia.

Ensaio de síntese de DNA

Mantiveram-se células, incluindo fibroblastos da derme humana (39SK), células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), células do músculo liso humano (HSMC), condrócitos humanos e osteoblastos de rato, em DMEM contendo FBS 10% (39-SK, HSMC, osteoblastos de rato) ou meio definido (condrócitos e HUVEC) a 37°C com 5% de CO2 e 95% de ar. Para o ensaio de síntese de DNA, as células foram cultivadas numa placa de cultura de tecidos de 96 52 cavidades, numa densidade de 5 000 células/cavidade, em DMEM contendo FBS 10% e foram incubadas durante 24 horas. Em seguida, o meio de cultura foi substituído por DMEM contendo várias concentrações de Enovina e BSA 0,1% (para 39-SK, osteoblastos, HSMC, condrócitos) ou DMEM contendo várias concentrações de Enovina e FBS 0,5% (para HUVEC) e as células foram incubadas durante 24 horas. Subsequentemente, o meio de cultura foi substituído por 100 μΐ de DMEM contendo FBS 5% e 0,1 μΟί de [3H]-timidina. Após 2 horas de etiquetagem com pulsos, as células foram fixadas com metanol/ácido acético (3:1, volume/volume) durante 1 hora à temperatura ambiente. As células fixadas foram lavadas duas vezes com metanol a 80%. As células foram solubilizadas em tripsina 0,05% (100 μΐ/cavidade) durante 30 minutos e depois em SDS 0,5% (100 μΐ/cavidade) durante 30 minutos adicionais. Combinaram-se alíquotas de lisatos celulares (180 μΐ) com 2 ml de "cocktail" de cintilação e mediu-se a radioactividade dos lisatos celulares utilizando um contador de cintilações líquidas (Wallac 1409) .

Ensaio de Quimiotaxia

Mantiveram-se células como descrito em "DNA Synthesis Assay". Analisou-se a actividade quimiotáctica da Enovina utilizando uma Câmara de Boyden modificada de 12 cavidades (McQuillan, D.J., Handley, C.J., Campbell, M.A., Bolis, S., Milway, V.E., Herington, A.C. (1986) "Stimulation of Proteoglycan biosynthesis by serum and insulin-like growth factor-I in cultured bovine articular cartilage" Biochem. J. 240: 423-430) . As células foram submetidas a tripsinação utilizando tripsina 0,05% e EDTA 0,5 mM e foram novamente suspensas em DMEM. Às cavidades inferiores de uma câmara de 53

Boyden adicionaram-se alíquotas de 150 μΐ de meio contendo várias concentrações de Enovina. Sobre as cavidades inferiores colocou-se uma membrana de policarbonato (8 μιη) revestida com 0,1 mg/ml de colagénio tipo I, seguido de montagem das cavidades superiores. Às cavidades superiores adicionaram-se aliquotas de 100 μΐ de células (70 000 células/ml). Após um período de 6 horas de incubação desmontou-se o aparato. Removeram-se as células que permaneceram sobre a membrana. A membrana foi fixada com formaldeído 10% durante 15 minutos, seguido de coloração com hemotoxilina com potência de Gill. As células foram contadas ao microscópio (ampliação de 250 X) e utilizou-se a média de contagens de células de cinco áreas de cada cavidade. Cada experiência foi repetida pelo menos quatro vezes. Os resultados foram expressos em vezes relativamente ao controlo (DMEM contendo BSA 0,1%).

Como ilustrado pelos resultados das Figuras 8 até 18, a enovina não exerce nenhum efeito sobre a proliferação em cada um dos tipos de células utilizados, ou sobre a migração de células HUVEC (Figura 14), como descrito acima. Ocorreu um efeito da enovina em células de neuroblastoma SH-SY-5Y. Isto demonstrou o efeito selectivo da enovina em células neuronais.

Foi mostrado que o GDNF e a NTN sinalizam via um complexo de sinalização composto por uma subunidade de ligação de ligandos, GFRa-1 ou GFRa-2, e uma subunidade de sinalização, a proteína tirosina quinase cRET. Espera-se que a Enovina exerça os seus efeitos biológicos via um complexo de sinalização semelhante, composto por um parceiro de ligação GFRa (GFRa-1, GFRa-2, o receptor órfão recentemente caracterizado GFRa-3 ou outros membros ainda não caracterizados da família GFRa) em combinação com cRET 54 ou outro parceiro de sinalização. De facto, os nossos dados de ligação mostram que a enovina se pode ligar especificamente ao GFRa-3.

Em humanos, mutações na linha germinativa no GDNF ou cRET podem conduzir a vários fenótipos de doença, incluindo neoplasia endócrina múltipla e doença de Hirschsprung Familiar (HSCR) (Romeo et al., 1994, Edery et al., 1994, Angrist et al., 1996). Ambas as doenças estão associadas a dismotilidade intestinal, em que a doença de Hirschsprung é a causa mais comum de obstrução congénita do intestino em lactentes. É interessante notar que ratinhos "knockout" para GDNF e cRET exibem patologias notavelmente semelhantes com agénese renal e aganglionose intestinal (Sanchez et al., 1996; Moore et al., 1996; Pichei et al., 1996). A Enovina pode estar envolvida em perturbações semelhantes dos intestinos ou dos rins, ou então, uma vez que é expressa de forma ubíqua, pode ser importante no desenvolvimento de outros órgãos periféricos do corpo. A interacção de ligandos com os seus receptores dá-se geralmente pela interacção de ligações específicas de resíduos particulares em ambas as proteínas. Fragmentos de uma proteína podem servir como agonistas que activam o receptor para induzir os seus efeitos de promoção do crescimento e de manutenção da sobrevivência em células. Em consequência, partes da enovina ou péptidos sintéticos baseados na sequência proteica da enovina podem ser úteis como agonistas ou antagonistas para regular o seu receptor GFRa3. Utilizando síntese de péptidos ou técnicas recombinantes, podem produzir-se factores de crescimento híbridos compostos por partes de GDNF, NTN ou PSP ou qualquer outro factor neurotrófico ou de crescimento com partes da enovina, originando um novo factor de crescimento sintético com novas propriedades. 55

Conduziram-se dois ensaios-piloto para testar se a enovina é capaz de alterar as deficiências sensoriais induzidas pelo taxol em ratos após injecções sub-plantares em ratos. Numa primeira experiência, testou-se se um único tratamento com enovina poderia inverter as deficiências sensoriais induzidas pelo taxol, ao passo que num segundo ensaio se testou se a enovina poderia prevenir o desenvolvimento das deficiências induzidas pelo taxol.

Reversão ao longo do tempo de disfunção sensorlal induzida pelo taxol

Procedimento

Utilizaram-se ratos Sprague-Dawley machos pesando 300 -340 gramas. Os animais foram alojados individualmente com alimentos e água ad libitum. Antes do inicio da experiência, os animais foram colocados em gaiolas padrão de observação e, após um periodo de habituação de 15 minutos, avaliou-se o reflexo a uma picada com agulha. Com esta finalidade, a superfície plantar da pata direita do animal foi estimulada com uma agulha, tendo-se pontuado a reactividade a esta picada com agulha como presente (pontuação = 1) ou ausente (pontuação = 0) . Numa sessão, o procedimento foi repetido três vezes, com um intervalo de tempo de 1 minuto entre 2 apresentações consecutivas do estímulo: assim, o teste de picada com agulha consistiu em três medições da reactividade a uma picada com agulha. Só se incluíram na experiência ratos com reacções normais nas 3 picadas com agulha.

Nos 3 dias consecutivos de manhã, os animais receberam diariamente uma injecção sub-plantar de 50 μΐ de taxol (3 mg/ml de paclitaxel dissolvidos em Chremofor e álcool 56 desidratado mais água) na pata traseira direita. Durante a manhã seguinte, avaliou-se novamente o reflexo à picada com agulha, tendo-se seleccionado os animais que não exibiram reactividade às 3 apresentações do estimulo. Estes animais foram aleatoriamente divididos em subgrupos (n = 10/grupo), tendo recebido uma injecção sub-plantar na pata traseira direita de 75 μΐ de veículo, solução salina ou 23 ou 130 μg/ml de enovina. Uma vez que não se observaram diferenças entre os resultados dos animais tratados com veiculo e solução salina, reuniram-se ambos os grupos (grupo de controlo) . Nos dias 1, 4, 5 e 7 após o último tratamento, efectuou-se o teste de picada com agulha de manhã (entre as 8 e as 9 horas) e de tarde (entre as 15 horas e 30 minutos e as 16 horas e 30 minutos). No dia 8, efectuou-se de manhã um último teste de picada com agulha. Para cada animal mediu-se ao longo do tempo a pontuação cumulativa da reactividade à picada com agulha. Uma vez que se realizaram, no total, 9 testes de picada com agulha (em que cada um consistiu em 3 apresentações de picada com agulha) após o último tratamento com fármaco, a pontuação máxima que pode ser atingida durante o período de tempo total da experiência é 27.

Resultados

Injecções sub-plantares repetidas de taxol durante 3 dias consecutivos dão origem a uma reacção inflamatória aguda, com ausência de resposta a uma estimulação de picada com agulha na maior parte dos animais. Uma injecção sub-plantar de solução salina ou veículo não afectou a deficiência induzida pelo taxol. Na primeira medição, apenas 4 de 20 controlos exibiram pelo menos 1 reacção às três picadas com agulha, e a pontuação média (± MEP) da 57 picada com agulha dos controlos na primeira medição foi 0,25 (± 0,12); este resultado contrasta com o inicio da experiência, em que a pontuação média foi 3,0 (± 0,0) porque todos os animais responderam à picada com agulha. Mesmo após 8 dias de medição, a reactividade dos controlos ainda estava enfraquecida, com 11 de 20 ratos respondendo pelo menos uma vez e com uma pontuação média de picada com agulha de 0,75 (± 0,18). Neste grupo de controlo, nenhum dos ratos exibiu uma reactividade normal à totalidade dos 3 estímulos. Apresenta-se na Figura 19 a pontuação cumulativa de picada com agulha dos controlos ao longo do tempo. Uma vez que os animais foram testados 9 vezes durante um periodo de 8 dias, a pontuação máxima que pode ser atingida com 3 picadas com agulha em cada teste é 27. Como observado no gráfico, uma injecção sub-plantar de solução salina ou veiculo não conseguiu inverter a deficiência induzida pelo taxol ao longo do periodo de tempo testado. A pontuação cumulativa total média dos controlos no final da experiência foi 5,10 (± 0,87), o que equivale a 18,9% da pontuação máxima que podia ser atingida.

Uma única injecção sub-plantar de 75 μΐ de enovina 23 μg/ml traduziu-se, após a primeira medição, em 4 de 10 ratos respondendo pelo menos uma vez, com uma pontuação média de picada com agulha de 0,70 (± 0,33) . No dia 8, todos os 10 animais responderam pelo menos uma vez à picada com agulha e 5 de 10 ratos exibiram uma reactividade normal. A pontuação média de picada com agulha deste grupo no dia 8 foi 2,20 (± 0,29). Em comparação com os controlos, a pontuação cumulativa média no final dos 8 dias de medições aumentou significativamente (teste U de Mann -Whitney, duas caudas, p < 0,01), atingindo uma pontuação média de picada com agulha de 14,50 (± 1,96) (Figura 19). Este valor corresponde a 53,7% da pontuação máxima. 58

Com uma injecção sub-plantar de 130 μρ/ιηΐ de enovina também se obteve uma eficácia acrescida relativamente aos controlos. Na primeira medição após a administração de 130 μρ/ιηΐ de enovina, 6 de 10 ratos responderam pelo menos uma vez, com uma pontuação média de picada com agulha de 1,10 (± 0,35). No dia 8, todos os 10 animais responderam a pelo menos uma picada com agulha, com uma pontuação média de 2,60 (± 0,22). Em 8 de 10 ratos observou-se uma reactividade normal às 3 picadas com agulha. Neste grupo, a pontuação cumulativa média do total de picadas com agulha no final da experiência foi 17,20 (± 1,94). Este valor corresponde a 63,7% da pontuação possivel total, constituindo uma melhoria significativa em comparação com o grupo de controlo (p < 0,01).

Prevenção ao longo do tempo de disfunção sensorial induzida pelo taxol.

Procedimento

Utilizaram-se ratos Sprague-Dawley machos pesando 300 -340 gramas. Os animais foram alojados individualmente com alimentos e água ad libitum. Antes do inicio da experiência, os animais foram colocados em gaiolas padrão de observação e, após um período de habituação de 15 minutos, avaliou-se o reflexo a uma picada com agulha. Com esta finalidade, a superfície plantar da pata direita do animal foi estimulada com uma agulha, tendo-se pontuado a reactividade a esta picada com agulha como presente (pontuação = 1) ou ausente (pontuação = 0). Numa sessão, o procedimento foi repetido três vezes, com um intervalo de tempo de 1 minuto entre 2 apresentações consecutivas do estímulo; assim, o teste de picada com agulha consistiu em 59 três medições da reactividade a uma picada com agulha. Só se incluíram na experiência ratos com reacções normais nas 3 picadas com agulha (pontuação de picada com agulha = 3). Após esta medição de controlo, os animais foram aleatoriamente divididos em subgrupos (n = 10/grupo), tendo recebido uma injecção sub-plantar na pata traseira direita de 75 μΐ de veículo, solução salina ou 23 ou 130 μρ/ιηΐ de enovina. Uma vez que não se observaram diferenças entre os resultados dos animais tratados com veículo e solução salina, reuniram-se ambos os grupos (grupo de controlo). Durante os 3 dias consecutivos, os animais receberam diariamente uma injecção sub-plantar de 50 μΐ de taxol (3 mg/ml de paclitaxel dissolvidos em Chremofor e álcool desidratado mais água) na pata traseira direita. Nos dias 1, 4, 5 e 7 após a administração de taxol, efectuou-se o teste de picada com agulha de manhã (entre as 8 e as 9 horas) e de tarde (entre as 15 horas e 30 minutos e as 16 horas e 30 minutos) . No dia 8 efectuou-se durante a manhã um último teste de picada com agulha. Para cada animal mediu-se ao longo do tempo a pontuação cumulativa da reactividade à picada com agulha. Uma vez que se realizaram, no total, 9 testes de picada com agulha (em que cada um consistiu em 3 apresentações de picada com agulha) após o tratamento com taxol, a pontuação máxima que pode ser atingida durante o período de tempo total da experiência é 27.

Resultados

Uma injecção sub-plantar de solução salina ou veículo antes da administração de taxol não preveniu a deficiência induzida pelo taxol no teste de picada com agulha. No primeiro teste após a administração de taxol, 8 em 20 ratos 60 responderam pelo menos uma vez à picada com agulha, com uma pontuação média de picada com agulha de 0,60 (± 0,18). No dia 8, a deficiência induzida pelo taxol ainda estava presente, em que apenas 8 de 20 animais responderam, exibindo uma pontuação média de 0,8 (± 0,25). Dois animais exibiram um reflexo normalizado à picada com agulha. Ao longo do tempo, a pontuação cumulativa de picada com agulha também foi reduzida, resultando num valor médio de 6,55 (± 1,08), o que corresponde a 24,3% da pontuação máxima (Figura 20). O pré-tratamento com 23 μg/ml de enovina reduziu as deficiências induzidas pelo taxol na picada com agulha. No dia 1, 8 em 10 animais responderam pelo menos uma vez, e a pontuação média de picada com agulha foi 1,70 (± 0,40). No dia 8, todos os animais responderam, com uma pontuação média de 2,50 (± 0,27) . Aqui, 7 animais exibiram uma reactividade normal em todas as exposições à picada com agulha. No que se refere à resposta cumulativa ao longo do tempo (Figura 20), a pontuação total média melhorou significativamente (p < 0,01), relativamente ao nivel de controlo, para 18,40 (± 1,73); este valor corresponde a 68,1% do valor máximo.

Obtiveram-se resultados comparáveis após um pré-tratamento com 130 μρ/ιηΐ de enovina. Aqui, 6 em 10 animais responderam durante o primeiro teste, com uma pontuação média de picada com agulha de 1,70 (+ 0,31) . No dia 8, todos os animais reagiram pelo menos uma vez a uma estimulação de picada com agulha, com uma pontuação média de 2,40 (+ 0,22), e as 3 reacções foram normais em metade dos animais. No que se refere à pontuação cumulativa, a pontuação média obtida no dia 8 foi 17,70 (± 1,92), representando 65,5% da pontuação total. 61

As presentes séries de experiências indicam que uma única injecção sub-plantar de enovina consegue reduzir as deficiências sensoriais induzidas pelo taxol, medido por um teste de picada com agulha. Observa-se actividade quando o fármaco é aplicado antes e após o taxol. A enovina é um candidato possivel para síndromas dolorosas maioritariamente com um componente neurogénico periférico e central e doenças reumáticas/inflamatórias, bem como perturbações da condutância, e pode desempenhar um papel modulador em processos sensoriais após aplicação transdérmica, tópica, local, central (como epidural, intratecal e afins) e sistémica. Suplementarmente, vale a pena utilizar a enovina como ferramenta de diagnóstico, para rastrear alterações fisiopatológicas nas áreas mencionadas acima.

Comparação da expressão de mRNA da Enovina em tecidos normais versus doentes A expressão de mRNA da Enovina foi analisada quantitativamente utilizando o Sistema de Detecção de Sequências ABI Prism 7700 (TaqMan; Perkin Elmer) com tecnologia registada desenvolvida e conduzida na Pharmagen Laboratories Ltd., Royston, Reino Unido. O sistema utiliza uma sonda fluorogénica para gerar sinais fluorescentes específicos de sequências durante a PCR. A sonda consiste num oligonucleótido ao qual estão ligados corantes fluorescentes repórter e supressor ("quencher") , está posicionada entre os "primers" de PCR directo e reverso. No estado intacto, a intensidade da fluorescência do repórter é suprimida pelo supressor. Se a sonda fizer parte de um complexo de replicação, o repórter fluorescente é clivado do supressor por actividade de exonucleases 5' para 3' 62 inerente à Taq polimerase. O aumento do sinal do repórter fluorescente numa reacção é uma medida directa da acumulação de produto de PCR. 0 número de cópias inicial de uma sequência alvo de mRNA (Cn) é estabelecido determinando o número de ciclos de PCR f raccionários (Ct) onde um produto de PCR é primeiramente detectado - o ponto em que o sinal de fluorescência ultrapassa um nivel de base limite. A quantificação da quantidade de mRNA alvo em cada amostra é feita por comparação dos valores Ct experimentais com uma curva padrão.

Preparação de RNA e controlo de qualidade

Isolou-se RNA total de tecido completo e sub- dissectado, utilizando reagente Tri-Zol (Life Technologies, Gaithersburg, MD, E.U.A.) de acordo com o protocolo dos fornecedores. Os procedimentos de controlo de qualidade para todas as amostras de RNA incluíram uma avaliação da integridade (RNA ribossómico 18S e 28S intacto) e determinação da presença de transcritos muito abundantes (actina) e pouco abundantes (receptor da transferrina).

Concepção de "primers"/sondas

Conceberam-se um par de "primers" e uma sonda TaqMan para amplificar uma sequência específica da Enovina. "Primer" 1: 5' ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3' "Primer" 3: 5' TGCTGCCGACCCACG 3'

Sonda 5: 5' CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3' 63

Adicionalmente, conceberam-se um par de "primers" e uma sonda TaqMan que abrangem um intrão e amplificam uma porção do gene GAPDH humano. "Primer" 2: 5' CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3' "Primer" 4: 5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3'

Sonda 6: 5' TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT 3' A sonda 5 é etiquetada com FAM fluorescente, ao passo que a sonda 6 é etiquetada com VIC fluorescente.

Tratamento com DNase de RNA total

Para cada tecido testado, 2,2 μρ de RNA total foram digeridos com 2 unidades de DNase sem RNase (Gibco BRL) , durante 15 minutos à temperatura ambiente, num volume de 20 μΐ de lx tampão DNase (Gibco BRL) . A reacção foi terminada por adição de 2 μΐ de solução de EDTA 25 mM. Em seguida, as amostras foram incubadas a 65°C durante 10 minutos, para inactivar a enzima.

Sintese do primeiro filamento de cDNA

Para cada tecido testado, utilizaram-se 100 ng de RNA total como modelo para a sintese do primeiro filamento de cDNA. O RNA, num volume de 4 ml e na presença dos "primers" 1 e 2 50 nM, lx Tampão II de PCR (Perkin Elmer) e MgCl2 5 mM, foi aquecido para 72°C durante 5 minutos e foi arrefecido lentamente para 55°C. Após a adição de todos os 64 outros reagentes, a reacção de 6 ml foi incubada a 48°C durante 30 minutos, seguido de um passo de inactivação enzimática de 90°C durante 5 minutos. As condições reaccionais finais foram as seguintes: lx tampão II de PCR, MgCl2 5 mM, dATP, dTTP, dGTP, dCTP 1 mM, 12,5 unidades de transcriptase reversa MuLV (Gibco BRL).

Amplificação por PCR de produtos do primeiro filamento de cDNA O cDNA derivado de 100 ng de RNA total para cada amostra foi sujeito a amplificação por PCR numa única reacção, para identificar transcritos alvo e de GAPDH. As concentrações finais de "primers"/sondas para o alvo foram "primer" 1 300 nM, "primer" 3 300 nM e sonda 5 200 nM, as concentrações para GAPDH foram "primer" 2 20 nM, "primer" 4 20 nM e sonda 6 100 nM. As concentrações finais dos outros reagentes da reacção foram glicerol 4,5%, 1 x tampão A TaqMan (Perkin Elmer), MgCl2 6,25 mM, dATP, dUTP, dGTP, dCTP 430 M, 2,5 unidades de AmpliTaq Gold. A amplificação por PCR foi realizada no sistema de detecção de sequências ABI 7700, a um passo de activação enzimática inicial de 94°C durante 12 minutos seguiram-se 45 ciclos de 94°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 minuto (tempo minimo de aumento).

Doenças e tecidos testados

Comparou-se a expressão de mRNA da Enovina em tecidos derivados de pacientes doentes e de indivíduos de controlo normais (Figuras 25 e 26) . A tabela abaixo mostra as doenças e tecidos correspondentes que foram investigados. 65

Para cada estado, analisaram-se três amostras doentes e três de controlo.

Patologia Tecido 1 Tecido 2 Tecido 3 Doença de Alzheimer córtex temporal hipocampo córtex occipital Esclerose múltipla espinal-medula matéria branca periventricular cerebelo Doença de Parkinson substantia nigra putâmen cerebelo Cancro Adenocarcinoma do cólon adenocarcinoma ductal da mama carcinoma de células escamosas do pulmão

Análise estatística

Para cada grupo de 3 tecidos, calcularam-se a média e desvio padrão dos valores Ct (que estão normalmente distribuídos), que depois foram convertidos em valores Cn de acordo com a fórmula Cn = 10((Ct ~~ 40'007) / _3' 623). Efectuou-se análise da variância (ANOVA) nos valores Ct, também para comparar os niveis médios de expressão de mRNA da Enovina em tecidos normais versus doentes.

As Figuras 25 e 26 mostram os números médios de cópias de mRNA da Enovina (± DP; n=3) em tecidos doentes versus de controlo. A análise estatística revelou um aumento significativo do nivel de expressão da Enovina na matéria branca periventricular de pacientes com esclerose múltipla (p = 0,013). O controlo de GAPDH interno não exibiu diferenças significativas (p = 0,79). Apesar do nivel de expressão da Enovina na matéria branca periventricular ser bastante baixo em tecido normal (270 cópias por 100 ng de RNA total em média versus 200000 cópias de GAPDH), o nivel 66 é três vezes mais elevado (825) em pacientes com esclerose múltipla.

Apenas outro tecido doente exibiu uma diferença significativa versus o controlo normal: em adenocarcinoma ductal da mama, o nivel de expressão de mRNA da Enovina é 6 vezes mais elevado (6000 versus 1000; p = 0,007), mas o valor de controlo de GAPDH também está significativamente aumentado (165000 versus 44000; p = 0,03), provavelmente representando um aumento geral dos niveis de mRNA.

Em conclusão, verificámos que os niveis de mRNA da Enovina são regulados positivamente na matéria branca periventricular de pacientes com esclerose múltipla.

Utilização de ELISA à base de células com anticorpos fosfo-especificos para o rastreio de miméticos da enovina no complexo de receptores GFRa3/cRET. O método também pode ser utilizado para identificar agonistas ou antagonistas de outros receptores de neurotrofinas, como GFRal, GFRa2, GFRa4, TrkA, TrkB e TrkC.

Ensaio

Utilizando este ensaio podemos identificar compostos agonistas ou antagonistas de factores de crescimento neurotroficos medindo a activação de quinases de sinalização chave activadas na via neurotrófica ou medindo a activação de receptor cRET quinase. Mede-se a activação detectando a quantidade de quinase fosforilada ou de receptor quinase utilizando anticorpos fosfo-especificos. Iremos utilizar células NIH 3T3 que expressam, 67 transitoriamente ou permanentemente, TrkA, TrkB, TrkC, GFRal/cRET, GFRa2/cRET, GFRa3/cRET ou GFRa4/cRET.

Detecta-se a activação de p42/p44 ΜΆΡ quinase, PKB quinase, c-jun, CREB, JNK/SAPK quinase e outras quinases utilizando anticorpos fosfo-especificos comercialmente disponíveis. Adicionalmente, pode detectar-se a activação de cRET utilizando anticorpo para cRET fosfo-específico. 0 protocolo utilizado foi o seguinte:

Plaquear células NIH 3T3 em 96 cavidades em soro de vitelo 10%, as células têm de estar 80% confluentes antes da estimulação.

No dia seguinte, substituir o meio por meio sem soro e privar as células de nutrientes durante 18-24 horas. Após a privação de nutrientes, estimular as células com compostos e factores neurotróficos como controlo positivo (10 ng/ml para factores neurotróficos).

Fixar as células com formaldeído 4% em PBS a 4°C durante 20 minutos.

Lavar as células 3x com 2 00 μΐ de PBS/Triton 0,1% durante 5 minutos.

Arrefecer rapidamente as células com 100 μΐ de H2O2 0,6% em PBS/Triton 0,1% durante 20 minutos.

Lavar as células 3x com 200 μΐ de PBS/Triton 0,1% durante 5 minutos.

Bloquear as células com 100 μΐ de soro fetal de vitelo 10% em PBS/Triton 0,1% durante 60 minutos.

Incubar as células com anticorpo fosfo-específico em 50 μΐ de BSA 5%//PBS/Triton 0,1% durante a noite a 4°C. A diluição do anticorpo deve ser determinada experimentalmente; gama sugerida 1:100 - 1:250. 68

Lavar as células 3x com 200 μΐ de PBS/Triton 0,1% durante 5 minutos.

Incubar com anticorpo secundário ligado a HRP, diluição 1:100 em 50 μΐ de BSA 5%/PBS/Triton 0,1%, durante 1 hora à temperatura ambiente.

Lavar as células 3x com 200 μΐ de PBS/Triton 0,1% durante 5 minutos.

Dissolver 1 pastilha de OPD (Sigma) em 25 ml de tampão (3, 65 g de ácido citrico-H20 e 5, 9 g de Na2HP04-2H20 em 0,51 H20, pH 5,6) e adicionar 12,5 μΐ de H202. Adicionar 50 μΐ a cada cavidade e incubar durante 15 minutos num agitador (200 rpm) coberto com folha de alumínio. Terminar a reacção com 25 μΐ de H2S04.

Medir OD490-65o no leitor de ELISA.

Cultura neuronal dopaminérgica mesencefálica Cultura neuronal

Preparam-se culturas neuronais do mesencéfalo ventral de rato fetal por dispersão enzimática e mecânica. O tecido foi recolhido, lavado em solução salina tamponada com fosfato sem Ca2+ - nem Mg2+ - gelada contendo glucose 0,6% (PBSG) e foi incubado durante 30 minutos com PBSG contendo tripsina 0,1% a 37°C. A suspensão de células foi plaqueada, numa densidade de 2,5 105 células/cm2, em placas de cultura de tecidos NUNC de 96 cavidades. Antecipadamente, as placas de cultura foram revestidas com poli-L-ornitina e CDM contendo soro fetal de vitelo 10%. As culturas foram mantidas em meio quimicamente definido (CDM), composto por uma mistura 1:1 de meio Eagles Modificado de Dulbecco e Nutriente F12 suplementado com glucose (0,6%), glutamina (2 69 mM) , bicarbonato de sódio (3 mM) , HEPES (5 mM) , insulina (25 μg/ml), transferrina humana (100 μg/ml), putrescina (60 μg/ml), selenito de sódio (30 nM) , estreptomicina (100 μg/ml) e penicilina (100 IU/ml).

Tratamento com factores neurotróficos

Dissolveram-se neurotrofinas em albumina de soro bovino 0,5% como lote. Adicionaram-se neurotrofinas 3 horas após o plaqueamento inicial e após 5 dias em cultura. Às cavidades de controlo adicionou-se a mesma quantidade de albumina de soro bovino 0,5%.

Captação de dopamina com afinidade elevada

Mediu-se a captação de dopamina passados 10 dias. Para a captação, as células foram lavadas duas vezes com PBS pré-aquecido suplementado com glucose (5 mM) , ácido ascórbico (100 mM) e pargilina (100 mM) e foram pré-incubadas durante 10 minutos com a mesma solução. A solução de pré-incubação foi substituída pela mesma solução contendo [ H]DA 50 nM, e continuou-se a incubação durante 15 minutos a 37°C. Terminou-se a captação com 3 lavagens rápidas com PBS gelado. A [3H]dopamina acumulada foi libertada por incubação com etanol acidificado durante 30 minutos à temperatura ambiente. Determinou-se a radioactividade após adição de 4 ml de líquido de cintilação (ultima gold MV da Packard) utilizando um contador de cintilações Packard. Determinou-se a captação inespecífica adicionando cocaína 20 μΜ. 70 70 Tabela 4. Efeito da enovina na captação de [3H] dopamina Tratamento Percentagem do controlo da n captação de [3H] dopamina controlo 100 5 enovina 300 ng/ml 111 4 enovina 1000 ng/ml 127 5 enovina 2000 ng/ml 152 5 enovina 4000 ng/ml 161 1 enovina 10000 ng/ml 165 2

As células cresceram durante 10 dias na presença ou ausência de enovina. Os controlos não tratados foram considerados como 100%. Os resultados são obtidos em 1-5 experiências independentes.

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Lista de abreviaturas BLAST ferramenta básica de busca de alinhamentos locais bp pares de bases cDNA DNA complementar SNC sistema nervoso central EST marcadores de seguências expressas

EVN enovina 80 GDNF factor neurotrófico derivado da linha gliais de GFRa receptor α da família GDNF GPI glicosilfosfatidilinositol MTC cDNA de múltiplos tecidos NTN neurturina PCR reacção em cadeia de polimerase SNP sistema nervoso periférico PSP persefina RT-PCR PCR de transcrição reversa TGF-β factor de transformação do crescimento P FISH hibridização in situ fluorescente MTN "Northern" de múltiplos tecidos NGF factor de crescimento dos nervos SPR ressonância de plasmões de superfície células 81

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Janssen Pharmaceutica N. V. et al <120> Factor de Crescimento Neurotrófico

Lisboa,

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica um factor de crescimento neurotrófico humano designado enovina e que tem a sequência de aminoácidos ilustrada na ID SEQ N° 4, ou que codifica uma variante de processamento compreendendo as sequências de aminoácidos ilustradas na ID SEQ N° 9 ou ID SEQ N° 10.

2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 1, que é uma molécula de DNA.

3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, que é uma molécula de cDNA.

4. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 3 que tem a sequência de ácido nucleico desde a posição 81 até à 419 da sequência ilustrada na ID SEQ N° 2.

5. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 4 que tem uma sequência de ácido nucleico correspondente à sequência de qualquer uma das variantes de processamento designada ID SEQ N° 11, 12, 13, 14 ou 15.

6. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 4 que tem a sequência de ácido nucleico ilustrada na ID SEQ N° 2. 2

7. Factor de crescimento neurotrófico humano isolado codificado por uma molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das Reivindicações 1 até 6.

8. Factor de crescimento neurotrófico humano isolado compreendendo a sequência de aminoácidos desde a posição 27 até à 139 da sequência de aminoácidos ilustrada na ID SEQ N° 4, ou compreendendo as sequências de aminoácidos ilustradas na ID SEQ N° 9 ou ID SEQ N° 10.

9. Factor de crescimento de acordo com a Reivindicação 8 compreendendo a sequência de aminoácidos ilustrada na ID SEQ N° 4.

10. Factor de crescimento de acordo com a Reivindicação 8 consistindo nas sequências de aminoácidos ilustradas na ID SEQ N° 9 ou ID SEQ N° 10.

11. Factor de crescimento neurotrófico humano isolado compreendendo um polipéptido que tem as sequências de aminoácidos ilustradas na ID SEQ N° 4, ID SEQ N° 9 ou ID SEQ N° 10.

12. Plasmideo EVNmat/pRSETB depositado no LMBP com o N° de Acesso LMBP 3931.

13. Vector de expressão compreendendo uma molécula de DNA de acordo com qualquer uma das Reivindicações 2 até 6.

14. Vector de expressão de acordo com a Reivindicação 13 compreendendo outra sequência de ácido nucleico que codifica uma molécula repórter. 3

15. Célula hospedeiro transformada ou transfectada com o vector de acordo com qualquer uma das Reivindicações 14.

16. Célula hospedeiro de acordo com a Reivindicação 15, cuja célula é uma célula eucariótica ou bacteriana.

17. Utilização de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência com pelo menos 70% de homologia de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos da ID SEQ N° 4 no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir síndromas dolorosas com um componente neurogénico substancialmente periférico ou central e doenças reumáticas/inflamatórias, bem como perturbações da condutância.

18. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 6 para utilização como medicamento.

19. Utilização de uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 6 no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir síndromas dolorosas com um componente neurogénico substancialmente periférico ou central e doenças reumáticas/inflamatórias, bem como perturbações da condutância.

20. Utilização de um factor de crescimento neurotrófico que tem pelo menos 70% de homologia de aminoácidos relativamente à sequência de aminoácidos da ID SEQ N° 4 no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir síndromas dolorosas com um componente neurogénico 4 substancialmente periférico ou central e doenças reumáticas/inflamatórias, bem como perturbações da condutância.

21. Factor de crescimento neurotrófico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 até 11 para utilização como medicamento.

22. Utilização de um factor de crescimento neurotrófico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 até 11 no fabrico de um medicamento para tratar ou prevenir síndromas dolorosas com um componente neurogénico substancialmente periférico ou central e doenças reumáticas/inflamatórias, bem como perturbações da condutância.

23. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 6 juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aquela farmaceuticamente aceitável.

24. Composição farmacêutica compreendendo um factor de crescimento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 até 11 juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aquele farmaceuticamente aceitável.

25. Anticorpo capaz de se ligar a um factor de crescimento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 até 11 ou a um epitopo deste. 5

26. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a Reivindicação 25 juntamente com um transportador, diluente ou excipiente para aquele farmaceuticamente aceitável.

27. Método para detectar a presença de um factor de crescimento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 até 11 numa amostra, cujo método compreende fazer reagir um anticorpo de acordo com a Reivindicação 25 com a referida amostra e detectar qualquer ligação desse anticorpo com esse factor de crescimento.

28. Método de acordo com a Reivindicação 27, cujo anticorpo está conjugado a uma molécula repórter.

29. Estojo ou dispositivo para detectar a presença de um factor de crescimento neurotrófico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 até 11 numa amostra, compreendendo um anticorpo de acordo com a Reivindicação 25 e meios para esse anticorpo reagir com essa amostra.

30. Método para identificar um agonista ou antagonista de um factor de crescimento neurotrófico humano de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 até 11, cujo método compreende contactar uma célula, tecido ou organismo que expressa um receptor desse factor de crescimento com um composto candidato, na presença desse factor de crescimento, e comparar os niveis de activação de RET nessa célula, tecido ou organismo com um controlo que não esteve em contacto com esse composto candidato. 6

31. Método para identificar agonistas ou antagonistas de um factor de crescimento neurotrófico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 até 11, cujo método compreende contactar uma célula, tecido ou organismo que expressa um receptor apropriado desse factor de crescimento e cRET com um composto candidato, na presença desse factor de crescimento, medir o nivel de activação de uma quinase de sinalização na via de transdução do sinal da qual esse receptor apropriado é um componente, após a adição de um anticorpo especifico para essa quinase de sinal conjugado a uma molécula repórter, em comparação com uma célula, tecido ou organismo que não esteve em contacto com esse composto.

32. Método de acordo com a Reivindicação 30 ou 31, cujo factor de crescimento neurotrófico é enovina que tem a sequência de aminoácidos da ID SEQ N° 3.

33. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 30 até 32, cuja célula, tecido ou organismo consiste em células NIH 3T3.

34. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 30 até 33, cujo receptor é qualquer um entre GFRal, GFRa2, GFRa3 ou GFRa4.

35. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 30 até 34, cujo anticorpo é especifico para qualquer um entre p42/p44 MAP quinase, PKB quinase, c-jun, CREB, JNK/SAPIC quinase. Lisboa