CZ200128A3

CZ200128A3 - Neurotrofický růstový faktor

Info

Publication number: CZ200128A3
Application number: CZ200128A
Authority: CZ
Inventors: Hugo Alfons Gabriel Geerts; Stefan Leo Jozef Masure; Theo Frans Meert; Miroslav Cik; Donck Luc Ver
Original assignee: Janssen Pharmaceutica N. V.
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2001-08-15
Also published as: CA2333910C; JP4624476B2; BG65518B1; AU768472B2; EP1097167A2; EP1640381A2; HK1045528A1; HUP0102821A2; TR200100074T2; DE69933771T2; DE69933771D1; EP1097167B2; NO331809B1; WO2000004050A2; HK1045528B; PT1097167E; KR20060061408A; NZ509723A; BR9912819A; CN1342165A

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká neurotrofického faktoru a zejména klonováni a exprese nového členu z rodiny GDNF neurotrofických faktorů, označovaného zde jako 'enovin (EVN) .

Dosavadní stav techniky

Neurotrofické faktory hrají roli v neuronální diferenciaci, vývoji a zásobování. Tyto proteiny mohou zabránit diferenciaci a podporovat přežívání různých typů nervových buněk a jsou tedy potenciálními terapeutickými látkami pro neurodegenerativní onemocnění. Neurotrofický faktor odvozený z gliální buněčné linie (GDNF) byl prvním členem rostoucí podrodiny neurotrofických faktorů strukturálně odlišných od neurotrofinů. GDNF patří do superrodiny transformujících faktorů β strukturou sedmi vysoce v aminokyselinové sekvenci (TGF-β) charakterizovaných specifickou konzervovaných cysteinových reziduí (Kingsley, 1994). GDNF byl původně purifikován za použití testu založeném na jeho schopnosti udržet přežívání a funkci embryonálníh dopaminergních neuronů předního mozku za podmínek in vitro (Lin et al., 1993). Další typy nervových buněk v centrálním (CNS) nebo periferním nervovém systému (PNS) také zodpovídají za přežívání zprostředkované GDNF (Henderson et al., 1994, Buj-Bell et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al. ,

1995). GDNF je produkován buňkami v neaktivní proformě, která je specificky štěpena v RXXR furinovém rozpoznávacím místě za vzniku aktivního (zralého) GDNF (Lin et al., 1993). Exogenní podání GDNF má silné neuroprotektivní účinky na zvířecích modelech Parkinsonovy nemoci, běžného neurodegenerativního onemocnění charakterizovaného ztrátou až 70% dopaminergních buněk v substantia nigra mozku (Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).

V nedávné době byly objeveny další neurotrofické faktory z rodiny GDNF. Neurturin (NTN) byl purifikován z upraveného média z buněk ovaria čínského křečka (CHO) za použití testu založeném na schopnosti neurturinu podporovat přežívání sympatických neuronů v kultuře (Kutzbauer et al·., 1996). Zralý NTN je z 57% podobný zralému GDNF. Persefin (PSP) byl objeven klonováním za použití PCR degenerovaného primeru s genomickou DNA jako templátem. Zralý PSP, • · · · podobně jako zralý GDNF, podporuje přežíváni dopaminergnich neuronů ventrálniho předního a motorických neuronů v kultuře (Mildtbrandt et al., 1998). Podobnost zralého PSP proteinu se zralým GDNF a NTN je asi 50%. Artemin (ARTN) byl objeven vyhledáváním v databázi DNA a je faktorem přežívání senzorických a sympatických neuronů v kultuře (Baloh et al., 1998b).

GDNF, NTN, PSP a ARTN vyžadují heterodimerický receptorový komplex, aby mohla být provedena dopředná transdukce intracelulárního signálu. GDNF se váže na podjednotku alfa 1 receptorú z rodiny GDNF (GFRa-1, GFRa Nomenclature Committee, 1997), což je glykosylfosfatidyl-inositol (glykosyl-Ptdlns) ukotvený membránový protein (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al. , 1997). Komplex GDNF/GFRa-1 se následně váže na a aktivuje cRET protoonkogen, membránově váznou tyrosin kinázu (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), což má za následek fosforylaci tyrosinových reziduí v cRET a následnou aktivaci drah dopředně signálové transdukce (Worby et al., 1996). Bylo charakterizováno několik dalších členů GFRa rodiny ligand vázajících receptorú (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al. ,

1997, Suvanto et al., 1997). Několika skupinami byly identifikovány GFRa-2 a GFRa-3 (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Woby et 1.,

1998, Naveilham et al., 1998 Baloh et al., 1998a). GFRa-1 a GFRa-2 jsou hojně exprimovány v téměř všech tkáních a jejich exprese může být vývojově regulována (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).

GFRa-3 není exprimován ve vyvíjejícím se nebo dospělém centrálním nervovém systému, ale je vysoce exprimován v několika vyvíjejících se a dospělých senzorických a sympatických ganglií periferního nervového systému (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al. , 1998.

Baloh et al., 1998a). Čtvrtý člen rodiny GFRa-4 byl klonován z kuřecí cDNA (Thompson et al., 1998). GFRa-1 je přednostním receptorem pro GDNF, zatímco GFRa-2 přednostně váže NTN (Jing et al., 1996, Treanor et al. , 1996, Klein et al·., 1997). Kuřecí GFRa-4 vytváří funkční receptorový komplex pro PSP v kombinaci s cRET (Enokido et al., 1998). U buněk exprimujících GFRa-3 i cRET bylo prokázáno, že neodpovídají ani na GDNF, NTN ani na PSP (Worby et « · « « • · • * · · ··· ··· ···· *·· ····· · · · ···*·«· · ··· · ·

- · · ·«·**«

J «·· * »· * · * · · · al. , 1998, Baloh et al., 1998a). V nedávné době bylo prokázáno, že

ART působí jako signál přes cRET za použiti GFRa-3 jako přednostní ligand vázající receptor (Baloh et al., 1998b). Interakce mezi neurotrofickými faktory GFRa receptory je možná za podmínek in vitro, protože GDNF může vázat GFRa-2 nebo GFRa-3 v přítomnosti cRET (Sanicola et al. , 1997. Trupp et al., 1998), a NTN se může vázat na

GFRa-1 s nízkou afinitou (Klein et al., 1997). Souhrnně řečeno jsou GDNF, NTN, PSP a ART částí neurotrofického signálního systému, v kterém mohou různé podjednotky vázající ligand (GFRa-1 až -4) interagovat se stejnou podjednotkou tyrosin kinázy (cRET). Fyziologická relevance těchto in vitro nálezů byla nedávno prokázána ve studiích s knockoutovanými geny (přehled od Rosenthala, 1999), který jasně prokázal, že GDNF interaguje s GFRa-1 za podmínek in vivo, zatímco NTN je přednostní ligand pro GFRa-2.

Současní vynálezci identifikovali, klonovali, exprimovali, chromozomálně lokalizovali a charakterizovali Enovin (EVN), čtvrtý prvek rodiny GDNF. Znalosti o zralém proteinu EVN byly rozšířeny objevem různých funkčních a nefunkčních mRNA sestřihových variant. Navíc předkládáme data o expresi, vazebná data EVN k GFRa-3 a in vitro účinky EVN na vyrůstání neuritů a na ochranu před taxolem indukovanou neurotoxicitou v taurosporinem diferenciovaných SH-SY5Y lidských neuroblastomových buněčných kulturách.

Popis vynálezu

V předkládané přihlášce je poskytnuta molekula nukleové kyseliny kódující nový lidský neurotrofický růstový faktor, enovin, expresní vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny, hostitelskou buňku transformovanou řečeným vektorem, neurotrofický růstový faktor kódovaný řečenou molekulou nukleové kyseliny, izolovaným enovinem, sloučeninami, které účinkují jako agonisté nebo antagonisté enovinu a farmaceutické preparáty obsahující nukleovou kyselinu nebo enovinový protein, nebo jeho agonisty či antagonisty.

Detailní popis vynálezu

Podle prvního aspektu předkládaného vynálezu je poskytnuta molekula nukleové kyseliny kódující lidský neurotrofický růstový faktor, označovaný zde jako enovin a mající aminokyselinovou sekvenci ilustrovanou na obrázku 21, nebo kódující funkční ekvivalent, derivát nebo bioprekurzor řečeného růstového faktoru. Řečená molekula nukleové kyseliny je přednostně DNA a dokonce přednostněji molekula cDNA.

Nukleová kyselina podle vynálezu obsahuje přednostně sekvenci od pozice 81 do pozice 419 ze sekvence ilustrované na Obrázku 1, přednostněji od pozice 81 do pozice 422 a dokonce ještě přednostněji úplnou sekvenci ilustrovanou na Obrázku 1.

molekule nukleové kyseliny od pozice 81 do pozice 419 se domnívá, že kóduje sekvenci zralého enovinového proteinu po zpracování proformy proteinu v RXXR místě přítomném u stabilní proformy řečeného enovinového proteinu.

Vynálezem je také poskytnuta komplementární (antisense) molekula schopná hybridizace s jakoukoli vynálezu za přísných podmínek, oboru.

sekvencí nukleové kyseliny podle které budou známy osobám znalým

Přísnost podmínek hybridizace, jak je používáno zde, se týká podmínek, za kterých jsou polynukleové kyseliny stabilní. Stabilita hybridů se odráží v teplotě tání (Tm) hybridů. Tm může být odhadnuta ze vzorce:

81,5^r’C - 16,6 (loglO[Na⁺] + 0,41 (%G+C) - 600/1 kde 1 je délka hybridů v nukleotidech. Tm se snižuje přibližně o 1l,5^riC s každým 1% snížením sekvenční homologie.

Molekula nukleové kyseliny může být s výhodou použita k expresi lidského neurotrofického růstového faktoru podle vynálezu v hostitelské buňce, nebo podobně za použiti vhodného expresního faktoru.

Expresní vektor podle vynálezu zahrnuje vektory schopné exprese DNA operativně navázané na regulační sekvence, jako jsou promotorové oblasti, které jsou schopné zajistit expresi takových DNA fragmentů.

Regulační elementy vyžadované pro expresi zahrnují promotorové sekvence k vazbě RNA polymerázy a transkripční iniciační sekvence • · · · • · · ···· · · · ······ · ··* · · • · · · · · ' • · ····* ·· ·· pro vazbu ribozómů. Bakteriální expresní vektor může například zahrnovat promotor, jako je například lac promotor a pro iniciaci transkripce Shine-Dalgarnovu sekvenci a startovací kodón AG. Podobně může eukaryotický expresní vektor zahrnovat heterologní nebo homologní promotor pro RNA polymerázu II, dopředný polyadenylační signál, startovací kodón AUG a terminační kodón pro oddělení ribozómů. Tyto vektory mohou být komerčně získány nebo uspořádány ze sekvencí popsaných metodami dobře známými v oboru.

Z tohoto důvodu se expresní vektor týká konstruktu rekombinantní DNA nebo RNA, jako je například plazmid, fág, rekombinantní virus nebo další vektor, který po začlenění do vhodné hostitelské buňky vede k expresi fragmentů DNA nebo RNA. Vhodné expresní vektory jsou dobře známé osobám znalým oboru a zahrnují vektory, které jsou schopné replikace v eukaryotických a/nebo prokaryotických buňkách, vektorů

které zůstávají epizomální, genomu hostitelské buňky.	nebo	vektorů, které se	integruj i	do
Antikomplementární molekula	schopná	hybridizace	s nukleovou
kyselinou podle vynálezu může	být	použita	jako próba,	nebo jako	lék
ve farmaceutickém preparátu.

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být vloženy do vektorů popsaných v antikomplementární orietaci, aby byla zajištěna tvorba antikomplementární RNA. Antikomplemntární RNA nebo antikomplementární nukleové kyseliny mohou být produkovány syntetickým způsobem.

Další aspekt vynálezu zahrnuje hostitelskou buňku transformovanou, transfektovanou, nebo infikovanou expresním vektorem podle vynálezu, kterážto buňka přednostně zahrnuje eukryotickou buňku a přednostněji savčí buňku.

Začlenění klonované DNA do vhodného expresního vektoru pro následnou transformaci řečené buňky a následný výběr transformovaných buněk jsou dobře známy osobám znalým oboru, jak je uvedeno například v publikaci Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

• · · ·

Další aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje molekulu nukleové kyseliny mající alespoň 15 nukleotidů z mlekuly nukleové kyseliny podle vynálezu a přednostně od 15 do 50 nukleotidů.

Tyto sekvence mohou být s výhodou použity jako próby nebo primery k iniciaci replikace, nebo podobně. Takové molekuly nukleové kyseliny mohou být produkovány podle technik dobře známých v oboru, jako například rekombinantním nebo syntetickým způsobem. Mohou být také použity v diagnostických soupravách nebo zařízeních k detekci přítomnosti nukleové kyseliny podle vynálezu. Tyto testy obecně zahrnují kontakt próby se vzorkem za hybridizačních podmínek, a dále detekci přítomnosti jakékoli duplicitní tvorby mezi próbou a jakoukoli nukleovou kyselinou ve vzorku.

Podle předkládaného vynálezu mohou být tyto próby ukotveny na pevnou podporu. Přednostně mohou mnohočetné próby mohou biologickými vzorky. Próby zde mohou být Biotechnology, hybridization uspořádáni může obsahovat různých prób v oddělených lokalizacích.

in šitu

14, into high uspořádání, že hybridizovat s jednotlivými umístěny do uspořádání, nebo (Viz Lockhart et al., Nátuře

1996. Expression monitoring by arrays. Jednotlivé nebo dokonce 1000 být přítomny v takovém simultánně mohou být syntetizovány.

prosinec density oligonucleotide více než 100, 500

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být také produkovány za použití rekombinantních nebo syntetických způsobů, jako například za použití PCR klonovacích mechanismů, které obecně zahrnují vytvoření páru primerů, které mohou mít přibližně 10 až 50 nukleotidů z oblasti genu, která má být klonována, vytvoření kontaktu mezi primery a mRNA, cDNA nebo genomickou DNA z lidské buňky, provedení polymerázové řetězové reakce za podmínek, které vedou k amplifikaci požadované oblasti, izolaci amplifikované oblasti nebo fragmentu a získýání amplifikované DNA. Tyto techniky, jak jsou zde definovány, jsou obecně dobře známé v oboru, jak je popsáno například v publikaci Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 1989).

Nukleové kyseliny nebo oligonukleotidy podle vynálezu mohou nést značku. Vhodné značky zahrnují radioizotopy, jako jsou například ³²P nebo ³⁵S, enzymové značky nebo jiné proteinové značky, jako je * · · • · · · · · například biotin nebo fluorescenční markéry.

Tyto značky mohou být přidány k nukleovým kyselinám nebo oligonukleotidům vynálezu a mohou být detekovány za použití známých technik per se.

Lidské alelické varianty nebo polymorfismy' molekuly DNA podle vynálezu mohou být s výhodou identifikovány například pomocí prób cDNA nebo genomických knihoven od mnoha jedinců, například z různých populací. Dále mohou být nukleové kyseliny a próby podle vynálezu použity k sekvenování genomické DNA od pacientů za použití technik dobře známých v oboru, jako je například Sangerova Dideoxy řetězová terminační metoda, která může s výhodou ověřit u pacienta predispozici k určitým onemocněním spojených s růstovým faktorem podle vynálezu.

Předkládaný vynález dále poskytuje transgenní buňku, tkáň nebo organismus obsahující transgen schopný exprese lidského neurotrofického faktoru enovin podle vynálezu.

Termín transgen schopný exprese, jak je zde používán, znamená jakoukoli vhodnou sekvenci nukleové kyseliny, která vede k expresi neurotrofického faktoru podle vynálezu. Transgen může zahrnovat například genomickou nukleovou kyselinu izolovanou z lidských buněk, nebo syntetickou nukleovou kyselinu obsahující cDNA, integrovanou do chromozómu nebo v extrachromozómálním stavu.

Transgen zahrnuje přednostně vektor podle vynálezu, kterýžto vektor zahrnuje molekulu nukleové kyseliny kódující řečený neurotrofický faktor nebo funkční fragment řečené molekuly nukleové kyseliny.

Funkční fragment řečené nukleové kyseliny by měl znamenat fragment nebo gen nebo cDNA kódující řečený neurotrofický faktor nebo jeho funkční ekvivalent, kterýžto fragment je schopný exprese za vzniku funkčního například vynálezu, rezidui a neurotrofického faktoru podle vynálezu, fragmenty meurotrofického růstového které korespondují se specifickými interaguj i

Z tohoto důvodu podle aminokyselinovými s korespondujícím receptorem, vytvářejí také faktoru část předkládaného vynálezu a tyto fragmenty mohou také sloužit jako agonisté aktivující korespondující receptor růstového faktoru podle vynálezu tak, aby došlo k vyvolání účinků podporujících růst a udržujících přežívání buněk. Tento aspekt vynálezu také zahrnuje • · · diferenciálně sestřihané izoformy a transkripčni začátky nukleových kyselin podle vynálezu.

Ve shodě s předkládaným vynálezem zahrnuje definovaná nukleová kyselina nejen pouze identickou nukleovou kyselinu, ale také jakékoli varianty minoritních bází, obzvláště substituce bází, které vedou k synonymnímu kodónu (odlišný kodón specifikující stejné aminokyselinové reziduum) v důsledku degenerace kódu v konzervativních aminokyselinových substitucích. Termín molekula nukleové kyseliny také zahrnuje komplementární sekvenci jakékoli jednovláknové sekvence týkající se variace bází.

Podle dalšího aspketu poskytuje vynález izolovaný neurotrofický růstový faktor kódovaný molekulou nukleové kyseliny, jak je zde definována. Růstový faktor sekvenci od pozice 27 do z Obrázku 1, nebo jeho přednostně zahrnuje aminokyselinovou pozice 139 aminokyselinové sekvence funkční ekvivalent, derivát nebo bioprekurzor.

Funkční ekvivalent, jak je zde definován, by měl zahrnovat růstový faktor, který vykazuje všechny růstové a funkční vlastnosti spojené s růstovým faktorem enovin. Derivát” enovinu, jak je zde definován, zahrnuje polypeptid, u kterého byly určité aminokyseliny porušeny, vynechány nebo nahrazeny jinými aminokyselinami, a kterýžto polypeptid si uchovává biologickou aktivitu enovinu, a/nebo kterýžto polypeptid může reagovat s protilátkami vytvořenými proti enovinu podle vynálezu jako stimulujícího antigenu.

V rozsahu předkládaného vynálezu jsou také obsaženy hybridní a modifikované formy enovinu zahrnující fúzní proteiny a fragmenty. Hybridní a modifikované formy zahrnují například určité aminokyseliny, které byly zmodifikovány nebo nahrazeny, jako například bodovou mutací, kteréžto modifikace vedou stále k udrženi biologické aktivity enovinu podle vynálezu. Specifické sekvence nukleové kyseliny mohou být narušeny osobami znalými oboru za vzniku růstového faktoru vykazujícího stejné nebo významně podobné vlastnosti enovinu.

Jak je dobře známo v oboru, je mnoho (pre)signální sekvencí N-terminu proteinu.

produktů in

Dále takové vivo s proteiny • · · _e * · · · ; — ··· ·· mohou obsahovat další pro sekvence, které představuji stabilní prekurzor zralého proteinu. Takové pre a pro sekvence nejsou obecně nezbytné pro biologickou aktivitu. Molekula enovinu podle vynálezu zahrnuje nejen pouze sekvenci o plné délce ilustrovanou na Obrázku 21, ale také sekvenci od pozice 27 do pozice 139, která následuje za RXXR proteolytickým zpracovávacim místem přítomným u růstových faktorů tohoto typu, a o kterých se věří, že reprezentují zralou sekvenci enovinu.

Definovaný protein, polypeptid nebo aminokyselinová sekvence podle vynálezu zahrnuje nejen pouze identickou aminokyselinovou sekvenci, ale také její izomery navíc k variacím minoritních aminokyselin přirozené aminokyselinové sekvence včetně náhrad konzervativních aminokyselin (náhrada aminokyseliny, která se vztahuje k jejímu postrannímu řetězci). Také jsou zahrnuty aminokyselinové sekvence, které se liší od přirozených aminokyselin, ale vedou ke vzniku polypeptidu, který je imunologicky identický nebo podobný polypeptidu kódovanému přirozeně se vyskytující sekvenci.

Proteiny nebo polypeptidy podle vynálezu dále zahrnují varianty takových sekvencí, včetně přirozeně se vyskytujících alelických variant, které jsou významně homologní k řečeným proteinům nebo polypeptidům. V tomto kontextu je významnou homologií míněna sekvence, která má alespoň 70% a přednostně 80%, 90% nebo 95% aminokyselinové homologie s proteiny nebo polypeptidy kódovanými molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.

Neurotrofické růstové faktory exprimované hostitelskými buňkami podle vynálezu jsou také zahrnuty do předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález je dále namířen k inhibici neurotrofického růstového faktoru podle vynálezu in vivo za použití antikomplementární technologie. Antikomplementární technologie může být použita ke kontrole genové exprese prostřednictvím tvorby trojšroubovice nebo antikomplementární DNA nebo RNA, kdy oba způsoby jsou založeny na vazbě polynukleotidu k DNA nebo RNA. Například část sekvence kódující zralý protein, který je předmětem předkládaného vynálezu, je použita k navrženi oligonukleotidů antikomplementární RNA o délce od 10 do 50 párů bází. DNA oligonukleotid je navržen, aby byl komplementární k oblasti genu mající úlohu v transkripci • 4 · a

		•	* · ' * * · * Z « · * · · · ·· ’
			...««· · · ♦ · · · • ♦ · ♦ ♦ *
		10 .	, Z 4. 4.4 .· ···
(trojitá	šroubovice viz Lee et	al.	Nucl. Acids. Res., 6,	3073
(1979),	Cooney et al., Science,	241,	456 (1988), a Dervan et	al. ,
Science	251, 1360 (1991), čímž	dochází k prevenci transkrip	ce a

tvorbě enovinu. Oligonukleotid antikomplementární RNA hybridizuje s mRNA in vivo a blokuje translaci mRNA molekuly na enovin.

Kvůli sekvenční podobnosti mezi růstovým faktorem zde popsaným a dříve identifikovanými růstovými faktory z rodiny GDNF se věří, že enovin by mohl být schopen podporovat přežívání buněk jejich růst v léčbě nemoci vznikajících v důsledku defektů funkce nebo exprese řečeného neurotrofického faktoru.

Molekuly nukleové kyseliny nebo neurotrofický faktor podle vynálezu může být s výhodou použit k léčbě nebo k prevenci onemocnění jedince prostřednictvím podání tomuto jedinci molekuly nukleové kyseliny nebo růstového faktoru podle v dostatečné koncentraci, aby došlo ke snížení výskytu řečeného onemocnění. Proto molekuly nukleové kyseliny, nervových množství vynálezu příznaků které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být použity k podpoře udržení a přežívání nervových buněk a k léčbě nervových onemocnění nebo neurodegenerativních stavů zahrnujících Parkinsonovu nemoc, Alzheimerovu nemoc, periferní neuropatie, amyotrofickou laterálni sklerózu, poškození periferních a centrálních nervů a expozici neurotoxinům.

U neurotrofického růstového faktoru podle vynálezu bylo s výhodou pozorováno, že má neurotrofický a neuroprotektivní účinek na nervové buňky nebo buněčné populace, obzvláště ty nervové buňky nebo buněčné populace, které byly indukovány k apoptóze. Z tohoto důvodu může být nukleová kyselina nebo růstový faktor enovin jako takový navíc použity v léčbě neurodegenerativních onemocněni, jako jsou například mozková mrtvice, Huntingtonova choroba, periferní neuropatie, akutní poškození mozku, nádory nervového systému, roztroušená skleróza, amyotrofická laterálni skleróza, poškozeni periferních nervů, poškození v důsledku expozice neurtoxinům, mnohočetné endokrinní neoplázie, familiární Hirschprungova choroba, onemocněni spojená s priony, Creutzfeld-Jacobova nemoc, prostřednictvím podání množství řečené nukleové kyseliny nebo enovinu v dostatečné koncentraci jedinci potřebujícímu tuto léčbu tak, aby došlo ke snížení nebo zabránění příznaků nervových poruch popsaných výše.

• · · ·

Navíc, a co je popsáno detailněji v příkladu uvedeném níže, bylo u enovinu prokázáno, že urychluje reparaci indukovaných senzorických deficitů, což identifikuje enovin jako kandidátní lék pro léčbu nebo zmírnění bolestivých syndromů s periferní nebo centrální neurogenní složkou, revmatických/zánětlivých onemocnění, stejně tak jako poruch vodivosti, prostřednictvím podání dostatečné koncentrace pacientovi potřebujícímu tuto léčbu tak, aby došlo ke snížení nebo zabránění příznaků těchto onemocnění.

Alternativní způsob léčby nervových poruch popsaných výše zahrnuje implantaci buněk jedinci, buněk, které exprimují lidský neurotrofický růstový faktor podle vynálezu, jako je například transgenní buňka zde popsaná.

Molekuly nukleové kyseliny a neurotrofický růstový faktor podle vynálezu mohou být také začleněny do farmaceutického preparátu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředící nebo excipientni látkou.

Protilátky proti neurotrofickému faktoru, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být s výhodou připraveny pomocí technik, které jsou známé v oboru. Polyklonální protilátky mohou být například připraveny inokulací hostitelskému zvířeti, jako je například myš, růstového faktoru nebo jeho epitopu, a získáním imunního séra. Monoklonální protilátky mohou být připraveny podle známých technik, jak je například popsáno Kohlerem R. a Milsteinem C., Nátuře (1975) 256, 495-497.

Protilátky podle vynálezu mohou být s výhodou použity ve způsobu detekce přítomnosti růstového faktoru podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje reakci protilátky se vzorkem a identifikaci proteinu navázaného k řečené protilátce. Poskytnuta je také souprava pro provedení řečeného způsobu, která zahrnuje protilátku podle vynálezu a prostředek pro reakci protilátky s řečeným vzorkem.

V předkládaném vynálezu je také poskytnuta souprava nebo zařízení pro detekci přítomnosti neurotrofického růstového faktoru podle vynálezu ve vzorku, obsahující protilátku, jak je popsána výše a prostředek pro reakci protilátky s řečeným vzorkem.

Proteiny, které interagují s neurotrofickým faktorem, který je předmětem vynálezu, jako je například jeho korespondující buněčný receptor, mohou být identifikovány zkoumáním interakcí proteinprotein za použití dvou-hybridového vektorového systému, který je dobře znám molekulárním biologům (Fields a Song, Nátuře 340, 245,

1989) . Tato technika je založena na funkční rekonstituci in vivo transkripčního faktoru, tato technika zahrnuje zajištění příslušné konstruktem obsahujícím reportérový gen regulovaného transkripčním faktorem majícím aktivační doménu, exprimující v hostitelské DNA sekvenci kódující první fúzi nukleové kyseliny podle vynálezu, doménu, nebo řečenou aktivační který aktivuje reportérový gen. Konkrétněji hostitelské buňky DNA za kontroly promotoru DNA vazebnou doménu a fragmentu a buďto buňce první hybridovou nebo všechny řečenou DNA sekvence vazebnou doménu transkripčního faktoru, exprimující v hostitelské buňce alespoň jednu druhou hybridní DNA sekvenci, jako je například knihovna a podobně, kódující domnělé vazebné proteiny, které mají být zkoumány spolu s DNA vazebnou a aktivační doménou transkripčního faktoru, které nejsou začleněny do první fúze, detekující vazbu zkoumaných proteinů s proteinem podle vynálezu detekci přítomnosti produktu reportérového genu v hostitelské buňce, a volitelně izolaci druhé hybridní DNA sekvence kódující vazebný protein.

Příklad takové techniky využívá GAL4 protein u kvasinek. GAL4 je transkripční aktivátor metabolismu galaktózy u kvasinek a má separátní doménu pro vazbu aktivátorů nad geny metabolizujícími galaktózu, stejně tak jako má doménu vázající protein. Mohou být zkonstruovány nukleotidová vektory, z nichž jeden obsahuje nukleotidová rezidua kódující DNA vazebnou doménu GAL4. Tato rezidua vazebné domény mohou být zfázována do známé sekvence kódující protein, jako jsou například nukleové kyseliny podle vynálezu. Další vektor obsahuje rezidua kódující protein vazebnou doménu GAL4. Tato rezidua jsou zfázována s rezidui kódujícími testovaný protein, přednostně ze signální transdukční dráhy zkoumaného obratlovce. Jakákoli interakce mezi neurotrofickým faktorem kódovaným nukleovou kyselinou podle vynálezu a testovaným proteinem vede k transkripční aktivaci reportérové molekuly v GAL4 transkripčně deficientní kvasinkové buňce, do které byly vektory transformovány. Přednostně je reportérové molekula, jako je například β-galaktosidáza, • · « · aktivována po obnovení transkripce kvasinkových genů metabolizujících galaktózu.

Receptor pro enovin byl identifikován předkládajícími vynálezci jako a antagonistických sloučenin enovinu. Tento test může

GFRa3. Mohou být také připraveny testy k identifikaci agonistických být také použit ve spojení s dalšími jejich odpovídajícími receptory. použity k léčbě nebo prevenci neurotrofickými

Identifikované onemocnění jako růstovými sloučeniny j sou faktory a mohou být například

Parkinsonova nemoc, Alzheimerova nemoc, neuronálni s rozšířenými polyglutaminovými sekvencemi, jako poruchy spojené je například

Huntingtonova nemoc, periferní neuropatie, akutní poškození mozku, nádory laterální v důsledku nervového systému, roztroušená poškození expozice neurotoxinům, skleróza, periferních mnohočetné skleróza, amyotrofická nervů, poškození endokrinní nádory, familiární

Hirschprungova nemoc, nemoci spojené s priony,

Creutzfeld-Jacobova nemoc, mozková mrtvice, bolestivé syndromy s významnou periferní nebo centrální neurogenní komponentou, revmatická/zánětlivá onemocnění, stejně tak jako poruchy vodivosti, a to prostřednictvím podání jedinci množství řečeného agonisty nebo antagonisty v koncentraci dostatečné k prevenci nebo léčbě řečených nervových poruch. Tyto sloučeniny mohou být také obsaženy ve farmaceutických preparátech spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředící nebo excipientní látkou.

Agonisté nebo antagonisté růstového faktoru (jako je například enovin) mohou být identifikovány v jedné formě pomocí kontaktu buněčné tkáně nebo organismu exprimujících příslušný receptor a cRET s kandidátní sloučeninou v přítomnosti růstového faktoru, a srovnáním hladin aktivace RET v řečené buňce, tkáni nebo organismu s kontrolou, která nebyla v kontaktu s řečenou kandidátní sloučeninou.

Alternativní forma vynálezu zahrnuje způsob identifikace agonistů nebo antagonistů neurotrofického růstového faktoru, kdy řečený způsob zahrnuje kontakt buněčné tkáně nebo organismu exprimujících příslušný receptor řečeného růstového faktoru a cRET s kandidátní sloučeninou v přítomnosti růstového faktoru, měření hladiny aktivace signální kinázy v signální transdukční dráze, v které řečený příslušný receptor je složkou, která následuje po přidání protilátky

specifické pro řečenou signální kinázu konjugovanou s reportérovou molekulou ve srovnání buněčnou tkání nebo organismem, které nebyly v kontaktu s řečenou kandidátní sloučeninou.

Další aspekt vynálezu zahrnuje použití sloučeniny identifikované jako antagonista podle vynálezu ve gastrointestinálních poruch nebo stavů střevní peristaitikou.

výrobě léku pro léčbu zprostředkovaných zvýšenou

Sloučeniny identifikované v testech, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být s výhodou použity ke zvýšení gastrointestinální motility a mohou být tedy užitečné v léčbě stavů na podkladě porušené gastrointestinální pasáže.

Tyto sloučeniny mohou být proto užitečné v léčbě teplokrevných živočichů včetně člověka trpících stavy na podkladě porušeného vyprazdňování žaludku, nebo obecněji trpících stavy na podkladě porušené gastrointestinální pasáže. Následně je poskytnut způsob léčby pacientů trpících stavy, jako jsou například gastrointestinální reflux, dyspepsie, gastroparéza, pooperační ileus a střevní pseudoobstrukce.

Dyspepsie je porucha funkce trávení, která se objevuje jako příznak primární gastrointestinální dysfunkce, obzvláště gastrointestinální dysfunkce na podkladě zvýšeného svalového tonu jako komplikace způsobené jinými onemocněními, jako jsou například apendicitis, poruchy žlučníku, nebo malnutrice. Dyspeptické příznaky zahrnují například ztrátu chuti, pocit plnosti, časný pocit nasycení, nauseu, zvraceni a nadýmání.

Gastroparéza může vzniknout jako komplikace onemocnění, jako jsou například diabetes, progresivní systémová skleróza, anorexia nervosa a myotonická dystrofie.

Pooperační ileus je obstrukcí nebo kinetickou poruchou střeva vznikající v důsledku poruchy svalového tonu po chirurgickém zákroku.

Střevní pseudoobstrukce je stav charakterizovaný zácpou, kolikovitou bolestí a zvracením, ale bez důkazu fyzikální obstrukce.

• · · *

Sloučeniny, které jsou předmětem předkládaného vynálezu tak mohou být použity buďto k odstraněni skutečné příčiny onemocněni, nebo ke zmírnění příznaků těchto onemocnění.

Navíc některé sloučeniny, které jsou stimulátory kinetické aktivity tlustého střeva, mohou být užitečné k normalizaci nebo ke zlepšení střevní pasáže u jedinců trpících příznaky na podkladě porušené motility, například se jedná o sníženou peristaltiku tenkého a tlustého střeva jako takovou, nebo v kombinaci s opožděným vyprazdňováním žaludku.

S ohledem na použití sloučenin, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, na kinetiku tlustého střeva, je poskytnut způsob léčby teplokrevných živočichů, včetně člověka, trpících poruchami motility střevního systému, jako jsou například zácpa, pseudoobstrukce, střevní atonie, pooperační střevní atonie, syndrom dráždivého tračníku a poruchy pasáže vyvolané léky.

Sloučeniny identifikované jako antagonisté podle testů, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou mít také potenciální využití v léčbě nebo profylaxi gastrointestinálních poruch vznikajících v důsledku zvýšené peristaltiky ve střevech, jako jsou například průjem (včetně sekrečního průjmu, bakteriálního průjmu, průjmu vyvolaného žlučovými kyselinami, průjmu cestovatelů a psychogenního průjmu), Crohnova nemoc, spastický tračník, syndrom dráždivého tračníku, dráždivý tračník s gastrointestinální hypersenzitivitou s průjmy.

S ohledem na použití sloučenin, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, poskytuje předkládaný vynález také způsob léčby teplokrevných živočichů, včetně člověka, trpících gastrointestinálními poruchami, jako je například syndrom dráždivého tračníku, obzvláště s ohledem na průjmy provázející tento syndrom. Následně je poskytnut způsob léčby pacientů trpících stavy, jako jsou například syndrom dráždivého tračníku, syndrom dráždivého tračníku provázeného především průjmy, střevní hypersenzitivita a snížení bolestí spojených s gastrointestinální hypersenzitivitou.

Předkládané sloučeniny mohou mít také potenciální využití u dalších gastrointestinálních onemocnění, jako jsou například nemoci sdružené s motilitou proximálního střeva, a jako antiemetika pro léčbu zvracení, včetně zvracení vyvolaného cytotoxickými léky a ozářením.

Zánětlivé nemoci střeva zahrnují například ulcerózní kolitidu, Crohnovu nemoc, a podobně.

Další aspekt zprostředkovaných podání pacientovi antagonisty enovinu zmírnění nebo snížení vynálezu i expresí množství také zahrnuje způsob enovinu podle vynálezu antikomplementární podle vynálezu v koncentraci příznaků řečeného onemocnění.

léčby nemocí prostřednictvím molekuly nebo dostatečné ke

Onemocnění zprostředkovaná inaktivací nebo inhibicí exprese enovinu mohou také být s výhodou léčeny prostřednictvím podání pacientovi množství sloučeniny identifikované jako agonista enovinu v koncentraci dostatečné ke snížení nebo zabránění příznaků onemocnění.

V dalším aspektu poskytuje vynález způsob přípravy farmaceutického preparátu pro léčbu onemocnění sdružených s lidským neurotrofickým faktorem enovinem, kde řečený způsob zahrnuje výběr kandidátní sloučeniny identifikované jako agonista nebo antagonista enovinu podle vynálezu, výrobu velkého množství řečené sloučeniny a formulaci vyrobené sloučeniny na farmaceuticky přijatelný nosič.

Jak bude patrné z příkladů uvedených níže, je enovin úspěšný ve snižování senzorických deficitů vyvolaných taxolem. Enovin může proto hrát možnou roli v bolestivých syndromech s významnou periferní a centrální složkou, v revmatických onemocněních, stejně tak jako u poruch vodivosti, a může hrát modulační úlohu v senzorických procesech po transdermálním, topickém, lokálním centrálním (jako je například epidurální, intrathékální, ICV, intraplexové, intraneuronální), perorální, rektální a systémové podání. Proto stejným způsobem, jak je zde popsáno pro další stavy zprostředkované enovinem, mohou být tyto stavy zmírněny, nebo jim může být zabráněno prostřednictvím podání buďto antikomplementární molekuly, nukleové kyseliny, enovinového proteinu, farmaceutického preparátu, nebo sloučeniny identifikované jako agonista nebo • ·«···« · ♦ · • * · - « · » · • · · *>··· · · · ······ · ♦ · ♦ · · • · · · · · · • ·· ··· ·« »·« antagonista jako vhodných látek podle vynálezu v koncentracích dostatečných ke zmírněni nebo zabránění příznaků řečeného(ých) onemocnění.

Terapeutické nebo farmaceutické preparáty, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být podány jakýmkoli vhodným způsobem známým v oboru zahrnujícím například intravenózní, podkožní, intramuskulární, transdermální intrathékální nebo intracerebrální podání buňkám v léčebných protokolech ex vivo. Podání může být buďto rychlé, jako například injekcí, nebo může trvat určitou dobu, jako je tomu například u pomalé infúze nebo při podání preparátu s pomalým uvolňováním. Pro léčbu tkání v centrálním nervovém systému může být podání formou injekce nebo infúze do cerebrospinální tekutiny.

Enovin může být také navázán nebo konjugován s látkami, které poskytují žádoucí farmaceutické nebo farmakodynamické vlastnosti. Může být například navázán na jakoukoli látku známou v oboru, která podporuje průnik a transport přes hematoencefalickou bariéru, jako je například protilátka proti transferinovému receptoru a podání intravenózních injekcí.

Enovin, antikomplementární molekuly, nebo sloučeniny skutečně identifikované jako agonisté nebo antagonisté enovinu, mohou být použity ve formě farmaceutického preparátu, který může být připraven podle postupů dobře známých v oboru. Přednostní preparáty zahrnují farmaceuticky přijatelné vehikulum, nebo ředící či excipientní látku, jako je například fyziologický roztok. Mohou být použity další farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnující další netoxické soli, sterilní vodu a podobně. Může být přítomný vhodný pufr, který umožňuje lyofilizaci preparátu a uskladnění za sterilních podmínek před rekonstitucí přidáním sterilní vody pro následné podání. Může být provedena inkorporace enovinu na pevnou nebo polo-pevnou biologicky kompatibilní matrici, která může být implantována do tkání vyžadujících léčbu.

Nosič může také obsahovat další farmaceuticky přijatelné excipientní látky k modifikaci dalších podmínek jako je například pH, osmolarita, viskozita, sterilita, lipofilita, rozpustnost, a • · « « • ·

podobně. Mohou být zahrnuty také excipientní látky, které umožňuji trvalé nebo opožděné uvolňování po podáni preparátu.

Enovinový protein nebo molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být podány perorálně. V této formě mohou být enkapsulovány a kombinovány s vhodnými nosiči v pevných dávkových formách, které jsou dobře známy osobám znalým oboru.

Jak bude dobře známo osobám, které jsou znalé oboru, může být podle plochy tělesného povrchu, nebo objemu tělesného prostoru, který bude použit, vypočten specifický dávkovači režim v závislosti na konkrétním použitém způsobu podání. Množství preparátu skutečně podaného však bude určeno lékařem na podkladě okolnosti týkajících se léčeného onemocnění, jako je například intenzita příznaků, preparát, který má být podán, věk, váha a odpověď jednotlivého pacienta a zvolený způsob podání.

Příklady provedeni vynálezu

Předkládaný vynález může být jasněji pochopen následujícími příklady, které slouží čistě jako příklady, a dále odkazy k doprovodným obrázkům, kde:

Obrázek 1: je částečná cDNA sekvence neurotrofického faktoru podle vynálezu označeného jako enovin. Koncensuální sekvence byla získána PCR amplifikací s primery PNHsp3 a PNHapl různých cDNA a genomické DNA s následným klonováním a sekvenční analýzou a srovnáním získaným sekvencí. Předpověděný jednopísměnový kód aminokyselinové sekvence je uveden nad DNA sekvencí. Počet nukleotidových reziduí je uveden napravo od DNA sekvence, zatímco počet aminokyselinových reziduí je napravo od přepsané proteinové sekvence. Domnělé RXXR štěpící místo pro prodoménu je uvedeno tučně a podtržené. Domnělý start zralého proteinu je uveden šipkou. Sedm konzervovaných charakteristických cysteinových reziduí pro všechny členy TGF-β rodiny je uvedeno tučně. Potenciální N-glykosylační místo je dvojitě podtrženo.

Obrázek 2: je uspořádáním předpověděných sekvencí zralého proteinu lidského GDNF, NTN, PSP a EVN. Sekvence byly uspořádány za použití programu ClustalW. Aminokyselinová rezidua konzervovaná mezi všemi třemi proteiny jsou uvedena v černých oblastech. Rezidua ♦ · · · konzervovaná mezi dvěmi nebo třemi sekvencemi jsou šedě stínována.

Sedm konzervovaných charakteristických cysteinových rezidui pro všechny členy TGF-β rodiny Pomlčky ukazuji na mezery uspořádání.

je uvedeno hvězdičkami nad sekvencí, začleněné do sekvence k optimalizaci

Obrázek 3: je částečná cDNA sekvence enovinu. Koncensuální sekvence byla získána PCR amplifikaci (primární PCR s primery PNHspl a PNHapl a nested PCR s primery PNHsp2 a PNHap2) různých cDNA s následným klonováním a sekvenční analýzou a srovnáním získaným sekvencí. Přepsaný jednopísměnový kód aminokyselinové sekvence nukleotidů 30 až 284 (čtecí rámec A) je uveden nad sekvencí a je číslován směrem doprava (Al až A85). Tento čtecí rámec obsahuje domnělý ATG translační startovací kodón. Přepsaný jednopismenový kód aminokyselinové sekvence nukleotidů 334 až 810 (čtecí rámec B) je uveden nad sekvencí a je číslován směrem doprava (Bl až B159). Tento čtecí rámec obsahuje oblast homologie s GDNF, NTN a PSP. Počet nukleotidových reziduí je uveden napravo od DNA sekvence. Domnělé RXXR štěpící místo pro prodoménu je uvedeno tučně a podtržené. Domnělý start zralého proteinu je uveden šipkou. Sedm konzervovaných charakteristických cysteinových reziduí pro všechny členy TGF-β rodiny je uvedeno tučně. Potenciální N-glykosylační místo je dvojitě podtrženo.

Obrázek 4: je vyobrazením chromozomální lokalizace lidského Enovinu. (A) Schéma výsledku FISH mapování pro Enovin. Každá tečka představuje dvojité FISH signály detekované na lidském chromozómu 1, oblast p31,3-p32. (B) Příklad FISH mapování Enovinu. Levý panel ukazuje FISH signály na chromozómu 1. Pravý panel ukazuje stejný mitotický obrázek barvený 4',6-diamidino-2-fenylindol za účelem identifikace chromozómu 1,

Obrázek 5: je vyobrazením exprese Enovinu v různých lidských tkáních. (A) , (B), (C) Analýza Northern blot tkáňové exprese

Enovinu. Exprese mRNA Enovinu v různých lidských tkáních byla posuzována za použití próby odpovídající části kódující oblasti Enovinu (zahrnující oblast kódující zralý Enovinový protein), aby mohly být analyzovány bloty lidské poly(A) bohaté RNA. (A) Mnohočetný tkáňový Northern (MTN) blot, (B) MTN blot II, (C) fetální MTN blot II. Panel (D) ukazuje autoradiografii lidského RNA master • · · · blotu s použitím stejného Enovin cDNA fragmentu jako próby. Panel (E) ukazuje lokalizaci mRNA vzorků lidské tkáně na RNA master blotu

Obrázek 6: je grafickou ilustrací celkového přežívání SH-SY5Y buněk po 72 hodinách léčby 10-6M taxolem a účinek zvyšujících se dávek enovinu na toto přežívání, normalizovaného na podmínky rozpouštědla. SH-SY5Y buňky jsou diferencovány po dobu 5 dnů pomocí 25 nM staurosporinu před aplikaci taxolu. Data jsou z dvou nezávislých experimentů v sextapletu. Jsou uvedeny průměry a směrodatné odchylky.

Obrázek 7: je grafickým znázorněním účinku zvyšujících se koncentrací enovinu po dobu 48 hodin růstu neuritu SH-SY5Y buněk diferencovaných staurosporinem s normalizací na podmínky rozpouštědla. SH-SY5Y buňky jsou diferencovány po dobu 5 dnů pomocí 25 nM staurosporinu před zahájením 48 hodinového experimentu. Jako pozitivní kontrola je uveden diferenciační účinek 25 nM staurosporinu. Délka neuritu je vypočtena z alespoň 5000 buněk. Data jsou poskytnuta z experimentů provedených v dubletu. Jsou uvedeny průměry a směrodatné odchylky.

Obrázky 8 až 18: jsou grafickým vyobrazením účinku enovinu na proliferaci různých typů buněk.

Obrázek 19: je grafickým vyobrazením účinku enovinu na senzorické deficity vyvolané taxolem za použití testu bodnutí špendlíkem. Uveden je průměr (± 1 SEM) kumulativních skóre za čas u krys léčených buďto 2 různými dávkami enovinu (23 nebo 130 ug/ml, n = 10 krys/skupinu, nebo vehikula/fyziologický roztok (n = 20 krys) po podání taxolu. Enovin nebo fyziologický roztok/vehikulum byly injikovány v objemu 75 ul do subplantární oblasti pravé zadní tlapky.

Obrázek 20: je grafickým vyobrazením účinku enovinu na senzorické deficity vyvolané taxolem za použití testu bodnutí špendlíkem.

Uveden je průměr (±1 SEM) kumulativních skóre za čas u krys léčených buďto 2 různými dávkami enovinu (23 nebo 130 ug/ml, n = 10 krys/skupinu, nebo vehikula/fyziologický roztok (n = 20 krys) před podáním taxolu. Enovin nebo fyziologický roztok/vehikulum byly • 9 9·« · injikovány v objemu 75 ul do subplantárni oblasti pravé zadní tlapky.

Obrázek 21: je DNA sekvence enovinu. Koncensuálni sekvence byla získána amplifikací pomocí PCR za použití primeru PNHsp5 a PNHapl na cDNA lidského frontálního kortexu a lidské genomické DNA s následným klonováním, sekvenční analýzou a srovnáním výsledných sekvencí. Předpověděná aminokyselinová sekvence je uvedena nad DNA sekvencí pro pouze sestřihovou variantu, která vede po translaci ke vzniku funkčního Enovinvého proteinu. Počet nukleotidových reziduí je uveden nalevo od DNA sekvence, zatímco počet aminokyselinových reziduí je uveden napravo od přepsané proteinové sekvence. 5' a 3' sestřihová místa detekovaná srovnáním sekvenovaných cDNA fragmentů s genomickou sekvencí uvedených vertikálních čár probíhajících odleva doprava a jsou postupně očíslovány. Domnělé RXXR furin štěpící místo pro prodoménu je uvedeno tučně a podtržené. Domnělý start zralého proteinu je uveden šipkou. Sedm konzervovaných charakteristických cysteinových reziduí pro všechny členy TGF-β rodiny je uvedeno tučně. Potenciální N-glykosylační místo je dvojitě podtrženo. 5' a 3' sestřihová místa jsou očíslována a v kroužku.

Obrázek 22: je vyobrazením exprese různých sestřihových variant Enovinu v lidských tkání. (A) schématický diagram sestřihových variant Enovinu identifikovaných pomocí RT-PCR experimentů se specifickými primery pro Enovin na RNA odvozenou z různých lidských tkání s následným klonováním, sekvenční analýzou PCR produktů. Horní čára ukazuje měřítko (v bp). Druhá čára představuje genomické sekvence Enovinu. Jsou uvedeny pozice translačního startovacího a terminačního kodónu startu kódující sekvence zralého Enovinu a 5' a 3' sestřihových míst (viz Obrázek 21) . Pravá část obrázku ukazuje PCR produkty získané pomocí RT-PCR na RNA vaječníku a frontálního kortexu spolu se 100 bp DNA žebříkem. Pozice různých mRNA variant je uvedena spolu s jejich velikostí (od startovacího k ukončovacímu kodónu). Přepsané proteiny jsou uvedeny na levé straně. Obdélníky ukazují oblasti reprezentované v cDNA. Přerušované čáry představují sestříhanou genomickou DNA. Vystínované oblasti představují sekvenci kódující zralý Enovin. Tečkovaná čára označuje start sekvence kódující zralý Enovin. Dva transkripty schopné vzniku funkčního Enovinového proteinu jsou označeny hvězdičkou na levé straně. (B) Tkáňové rozložení hlavních sestřihových variant. Fotografie ukazuje • · ·*···· *· • · ♦ » · · · ··· · ···· · · • ··»··» · ··· » ··· · ·♦ ··· ·· ·»·

PCR fragmenty získané pomocí RT-PCR se specifickými primery pro Enovin na různých lidských cDNA. Čtyři hlavní sestřihové varianty (A až D) jsou označeny šipkami na levé straně. Velikosti jsou uvedeny na pravé straně na základě 100 bp DNA žebříku použitém jako standard velikostí na gelu.

Obrázek 23: Předpověděná proteinová sekvence dlouhé sestřihové sekvence Enovinu, získaná sestřihem dvou intronů ze sekvence DNA z Obrázku 21. Sestřihová místa 5'1 a 3'-l jsou použita k odstranění prvního intronu a sestřihová místa 5'-2 a 3'-3 jsou použita k odstranění druhého intronu. To vede k sekvenci cDNA mající otevřený čtecí rámec kódující protein o 228 aminokyselinovými rezidui uvedený výše

Obrázek 24: Předpověděná proteinová sekvence alternativní (krátké) sestřihové sekvence Enovinu, získaná sestřihem dvou intronů ze sekvence DNA z Obrázku 21. Sestřihová místa 5'1 a 3'-2 jsou použita k odstranění prvního intronu a sestřihová místa 5'-2 a 3'-3 jsou použita k odstranění druhého intronu. To vede k sekvenci cDNA mající otevřený čtecí rámec kódující protein o 220 aminokyselinovými rezidui uvedený výše. Tato proteinová sekvence postrádá 8 aminokyselinových reziduí ve srovnání se sekvencí z Obrázku 23.

Obrázek 25: je grafickým zobrazením výsledků získaných z experimentů určených ke srovnání hladin exprese enovinu v normální nemocné tkáni. Exprese enovinu a GAPDH je reprezentována v mozkové tkáni, s ohledem na roztroušenou sklerózu a Alzheimerovu chorobu.

Obrázek 26: je grafickým zobrazením výsledků získaných k detekci hladin exprese enovinu a GAPDH u Parkinsonovi nemoci a nádorů.

Depozice

Plazmid EVNmat/pRSETB zahrnující DNA sekvenci kódující enovin byl deponován 6. května 1999 pod přístupovým číslem LMBP3931 v Belgických koordinovaných sbírkách mikrobiologie (BCCM) v Laboratorium voor Moleculaire - Plasmidencollectie (LMBP) B9000, Gent, Belgie, ve shodě s ustanovením Budapešťské smlouvy z 28. dubna 1997 .

Materiál a metody

Materiál

Nativní Taq polymeráza, ampicilin, IPTG (izopropyl-β-ϋthiogalaktozid) , X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-Dgalaktopyranozid) a všechny použité restrikční enzymy byly zkoupeny od společnosti Boehringer Manheim (Manheim/ Německo). 10 mM směs dNTP byla zakoupena od společnosti Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) . TOPO-TA klonovací kit byl zakoupen od společnosti Invitrogen BV (Leek, Nizozemí). Qiagen plazmid mini- nebo midi-DNA purifikační kit, Qiaprep Spin Minipep kit a Qiaquick gel extrakční kit byly zakoupeny od společnosti Qiagen GmbH (Dusseldorf, Německo). cDNA knihovny, Marathon™ Ready cDNA kity, panely I a II lidské mnohočetné tkáňové cDNA (MTC™) , mnohočetné tkáňové northern bloty a Advantage-GC cDNA PCR kit byly získány od společnosti Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA). Všechny PCR reakce byly provedeny v cykléru GeneAmp PCR systém 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA) . LB (Luria-Bertani) médium se skládá z 10 g/l tryptonu, 5 g/l kvasničného extraktu a 10 g/l aCl. 2x YT/ampicilinové plotny se skládají z 16 g/l tryptonu, 10 g/l kvasničného extraktu, 5 g/l NaCl, 15 g/l agaru a 100 mg/1 ampicilinu.

Hledání homologie v databázi a srovnání sekvencí

Za použití kompletních z cDNA odvozených proteinových sekvencí neurotrofického faktoru odvozeného z buněčné linie lidských gliálních buněk (GDNF, přístupové číslo Q99748), neurturinu (NTN, přístupové číslo P39905) a persefinu (PSP, přístupové číslo AF040962), jakožto hledaných sekvencí, bylo provedeno BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. 1990) vyhledávání v denně doplňovaných databázích EMBL/GenBank human expressed sequence tag (EST) a v genomických databázích.

Další BLAST vyhledávání bylo provedeno za použití genomické sekvence s přístupovým číslem AC005038 a něklolika EST přítomných v databázi GenBank, a byla detekována homologie k této genomické sekvenci.

Procento shodnosti a procento podobnosti mezi členy GDNF rodiny byla vypočítána pomocí párového srovnání sekvencí za použití programu BESTFIT (Genetics Computer Group softwarový balíček pro sekvenční analýzu, verze 8,0, Univerzita Winsconsin, Madison, WI, USA).

• · * · · · * - » » ♦ · 4 » «· ··*'-·♦* « · » 4 »i * · « · * ·í* • · ♦ 4 * * ··· · · «··

Srovnáni DNA nebo proteinových sekvencí bylo provedeno pomocí srovnávacího programu ClustalW (EMBL, Heidelberg, Německo).

Syntéza oligonukleotidů pro PCR a DNA sekvenaci

Všechny oligonukleotidové primery byly objednány od společnosti Eurogentec (Seraing, Belgie). Pro inzerci specifické sekvenční primery (15- a 16-timery) a primery pro použití v PCR reakcích byly navrženy manuálně. DNA byla připravena na Qiangen GmbH-tip-20 nebo 100 anexové koloně nebo na Qiaquick stáčecí koloně (Qiagen GmbH, Dusseldorf, Německo) a získána z kolon v 30 ul TE-pufru (10 mM Tris.Hcl, 1 mM EDTA (sodná sůl), pH 8,0).

Sekvenční reakce byly provedeny na obou vláknech za použití sekvenčního kitu ABI prism BigDye Terminátor Cycle na sekvenátoru Applied Biosystems 377XL (Perkin Elmer, ABI Division, Poster City, CA, USA) . Software Sequencher™ byl použit k uspořádání sekvence a k manuální editaci (GeneCodes, AnnArbor, MI, USA).

Klonování nového GDNF homologa

DNA oblast překrývající nukleotidy 67411 až 68343 pod EMBL přístupovým číslem AC005038, z níž přepsaná proteinová sekvence byla homologní se zralým NTN a PSP byla použita k navržení oligonukleotidových primeru pro PCR amplifikaci. Požité odlišné primery jsou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1: Primery použité pro PCR amplifikaci fragmentů AC005038

Název primeru	Sekvence primeru
PNHspl	5'-CGTTGCACTCAGGTGATTCCTCC-3 '
PNHsp2	5'-GGCAGCAAACCCATTATACTGGAACC-3 '
PNHsp3	5'-CGCTGGTGCAGTGGAAGAGCC-3 '
PNHsp4	5'-CTGCACCCCCATCTGCTCTTCC-3'
PNHapl	5'-GCAGGAAGAGCCACCGGTAAGG-3'
PNHap2	5'-CCAGTCTGCAAAGCCCTGGAGC-3'

Primery PNHsp3 a PNHapl byly použity k amplifikaci fragmentu o 502 bp na cDNA odvozené z různých lidských tkání (cDNA z fetálního mozku, celého plodu, Marathon-Ready™ cDNA z prostaty nebo z plic (Clontech Laboratories), cDNA z frontální kůry, hipokampu a mozečku), a na lidské genomické DNA. Na základě genomické sekvence z databáze EMBL/GenBank (přístupové číslo AC005038) bylo předpovězeno, že fragment určený k amplifikaci má G+C obsah 76%. Proto byly amplifikace provedeny za použití Advantage-GC cDNA PCR kitu (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) optimalizované pro amplifikaci GC bohatých DNA sekvencí. PCR reakce byly provedeny v celkovém objemu 50 ul, obsahujícím 1 x GC cDNA PCR reakční pufr, 0,2 mM dNTP, 1M GC-MELT™, 200 nM primerů PNHsp3 a PNHapl, 1 ul směsi

Advantage KlenTaq polymerázy a 1 až 5 ul cDNA nebo 0,5 ug genomické DNA. Vzorky byly zahřívány na 95°C po dobu 5 minut a cyklizace byla prováděna 45 s při teplotě 95°C, 1 minutu při teplotě 58^r'C a 40 s při teplotě 72°C pro 35 cyklů s finálním krokem 7 minut při teplotě 72°C. Vzorky byly nakonec podrobeny reakci s 2,5 U nativní Taq DNA polymerázy, aby se vytvořil přečnívající konec. PCR produkty byly analyzovány na 1% (w/v) agarózovém gelu v lx TAE pufru (40 mM Tris acetát, 1 mM EDTA (sodná sůl), pH 8,3). PCR fragmenty očekávané velikosti (495 bp) byly vyříznuty z gelu a purifikovány pomocí Qiaquick gel extrakčního kitu. PCR fragmenty byly sekvenovány, aby se potvrdila jejich identita, a dále klonovány do plazmidového vektoru pCR2.1-TOPO za použití TOPO TA klonovacího kitu podle instrukcí výrobce. Přibližně 20 ng purifikovaného fragmentu bylo zkombinováno s 1 ul pCR2.1-TOPO vektoru v celkovém objemu 5 ul. Reakce byly inkubovány při pokojové teplotě (20^flC) po dobu 5 minut. 2 ul reakční směsi byly transformovány do TOP1OF' kompetentních buněk (Invitrogen BV) za použití transformace tepelným šokem a umístěny na 2x YT/ampicilinové plotny suplementované 10 mM IPTG a 2% (w/v) X-gal pro modrobílé zobrazení. Bílé kolonie po růstu přes noc byly vyjmuty z ploten, byly ponechány růst v 5 ml LB média suplementovaného 100 mg/1 ampicilinu a plazmidovou DNA připravenou za použití Qiaprep Spin Miniprep kitu. Přítomnost inzertu o očekávané velikosti byla potvrzena restrikčním natrávením pomocí EcoRI. Plazmidový inzert několika pozitivních klonů byl sekvenován a získané sekvence byly porovnány za použití srovnávacího programu ClustalW.

Aby bylo možné získat další kódující sekvenci nového homologa GDNF, byl amplifikován pomocí PCR fragment s očekávanou velikosti 931 bp na podkladě sekvence z EMBL/GenBank (přístupové číslo AC005038) za použití primerů PNHspl a PNHapl. PCR reakce byly provedeny v celkovém objemu 50 ul, obsahující lx GC cDNA PR reakční pufr, 0,2 mM dNTP, 1M GC-MELT™, 200 nM primerů PNHspl a PNHapl, 1 ul směsi Advantage KlenTaq polymerázy a 1 až 5 ul cDNA z mozečku, frontální kúry nebo hipokampu, nebo 0,5 ug genomické DNA. Vzorky byly zahřívány na 95°C po dobu 5 minut a cyklizace byla prováděna 45 s při teplotě 95°C, 1 minutu při teplotě 58°C a 1 minuta 30 s při teplotě

72°C pro 35 cyklů s finálním krokem 7 minut při teplotě 72°C. PCR produkty byly analyzovány na 1% (w/v) agarózovém gelu v lx TAE pufru (40 mM Tris acetát, 1 mM EDTA (sodná sůl), pH 8,3). Druhé kolo amplifikace bylo provedeno pomocí vložených primerů (PNHsp2 a PNHap2). 1 ul reakční směsi z prvního kola amplifikace bylo použito v celkovém objemu 50 ul, obsahujícím lx GC cDNA PR reakční pufr, 0,2 mM dNTP, 1M GC-MELT™, 200 nM primerů PNHsp2 a PNHap2 a 1 ul směsi Advantage KlenTaq polymerázy. Vzorky byly zahřívány při teplotě 95C po dobu 5 minut a cyklizace byla prováděna 45 s při teplotě 95°C, 1 minutu při teplotě 58°C a 1 minutu a 30 s při teplotě 72^(IC pro 35 cyklů s finálním krokem 7 minut při teplotě 72°C. Vzorky byly analyzovány na fragmenty očekávané purifikovány pomoci byly sekvenovány, reakci s 2,5 U Taq polymerázy a klonovány do plazmidového vektoru

1% (w/v) agarózovém gelu v lx TAE pufru. PCR velikosti (870 bp) byly vyříznuty Qiaquick gel extrakčního kitu. PCR aby se potvrdila jejich identita, a z gelu a fragmenty podrobeny pCR2.1-TOPO za použití TOPO TA klonovaciho kitu podle instrukcí výrobce. Přibližně 20 ng purifikovaného fragmentu bylo zkombinováno s 1 ul pCR2.1-TOPO vektoru v celkovém objemu 5 ul. Reakce byly inkubovány při pokojové teplotě (20°C) po dobu 5 minut. 2 ul reakční směsi byly transformovány do TOP1OF' kompetentních buněk (Invitrogen BV) za použití transformace tepelným šokem a umístěny na 2x YT/ampicilinové plotny suplementované 10 mM IPTG a 2% (w/v) X-gal pro modrobílé zobrazení. Bílé kolonie po růstu přes noc byly vyjmuty z ploten, byly ponechány růst v 5 ml LB média suplementovaného 100 mg/1 ampicilinu a plazmidovou DNA připravenou za použití Qiaprep Spin Miniprep kitu. Přítomnost inzertu o očekávané velikosti byla potvrzena restrikčním natrávením pomocí EcoRI. Plazmidový inzert několika pozitivních klonů byl sekvenován a získané sekvence byly porovnány za použití srovnávacího programu ClustalW.

Analýza exprese genu pro enovin pomocí analýzy RT-PCR

Oligonukleotidové primery PNHsp3 a PNHapl (viz tabulka 1) byly použity k specifické PCR amplifikaci fragmentu enovinu o 502 bp. PCR amplifikace byly provedeny na panelech lidské cDNA z mnoha tkání (MTC™) normalizované na koncentrace exprese mRNA šesti odlišných uklízečích genů. PCR reakce s primery specifickými k enovinu byly • ······ ·· · • · · ····· ·· · · · · ·«· · ······ · · · · · · • · · ·· · · • · · ··· · · · · · provedeny v celkovém objemu 50 ul, obsahujícím 1 x GC cDNA PCR reakční pufr, 0,2 mM dNTP, 1M GC-MELT™, 400 nM primerů PNHsp3 a PNHapl a 1 ul směsi Advantage KlenTaq polymerázy. Vzorky byly zahřívány na 95°C po dobu 30 s a cyklizace byla prováděna 30 s při teplotě 95^l,C a 30 s při teplotě 68°C. Vzorky byly analyzovány na 1,2% (w/v) agarózovém gelu v lx ΤΆΕ pufru (40 mM Tris acetát, 1 mM EDTA (sodná sůl), pH 8,3) a zobrazení etidium bromidem obarvených gelů bylo získáno za použití Eagle Eye II Video systému (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Vyhledávání podobnosti v denně doplňované databázi EMBL/GenBank proteinových sekvencí lidského neurturinu a persefinu vedlo k získání sekvence genomické DNA kódující domnělý nový protein podobný neurotrofickým faktorům GDNF, NTN a PSP, která byla nazvána enovin (EVN). Další vyhledávání homologie v databázi za použití sekvence genomické DNA obklopující oblast kódující enovin vedlo k získání několika klonů s exprimovaným sekvenčním koncem (EST) odvozených z různých lidských tkání (epitel prostaty, přístupové číslo AA533512 (ID1322952), karcinom plic, přístupové číslo AA931637 a nádor příštitných tělísek, přístupové číslo AA844072). Tyto klony obsahují DNA sekvenci mimo oblast homologie s GDNF, PSP nebo NTN, ale potvrdily, že mRNA enovinu je exprimována v normálních a nádorových tkáních.

Původní PCR amplifikace za použití primerů (PNHsp3 a PNHapl) na podkladě genomické sekvence vedla k získání fragmentu o velikosti zhruba 500 bp z cDNA plodu, fetálního mozku, prostaty, frontální kůry, hipokampu, mozečku a genomické DNA, ale ne z plicní cDNA. Klonování a sekvenování těchto fragmentů vedlo ke vzniku DNA sekvence o 474 bp, která se přepsala do předpověděné proteinové sekvence o 139 aminokyselinových reziduích zahrnujících sedm konzervovaných cysteinových reziduí charakteristických pro všechny členy rodiny proteinů transformujícího růstového faktoru β (TGF-β) (Kingsley, 1994) (Obrázek 1). Sekvence také obsahovala RXXR motiv po štěpení prodomény (RAAR, aminokyselinová pozice 23 až 26) (Barr, 1991). Podobné štěpící místo je přítomno také v sekvencích GDNF, NTN a PSP ve srovnatelné pozici v sekvenci prodomény. Za předpokladu, že ke štěpení prodomény enovinu dochází na tomto místě za podmínek in vivo, obsahuje zralá proteinová sekvence ENV 113 aminokyselinových reziduí (reziduum 27 až 139 na Obrázku 1 a má vypočítanou • · • · · ·

28· • · · · ·· ·· · · · · · ·9

999999 · ···9

9 9 9 99

9 99 9999 9 molekulovou váhu 11965 Da a izoelektrický bod 11,8. Ve zralé sekvenci existuje jedno potenciální glykosylačni místo (NST v aminokyselinové pozici 121-123). Navíc bylo u enovinu přítomno několik oblastí konzervovaných mezi zralými formami známých neurotrofických faktorů GDNF, NTN a PSP (Obrázek 2). Tabulka 2 sumarizuje výsledky srovnání zralých proteinových sekvenci členů rodiny GDNF pomocí programu BESTFIT. Jsou uvedena procenta identity a podobnosti. Zralé sekvence GDNF, NTN, PSP a EVN použité v tomto srovnání začínaly na prvním aminokyselinovém reziduu po RXXR štěpícím místě.

Tabulka 2: Párové srovnání zralých členů rodiny lidského GDNF za použití programu BESTFIT.

srovnání	% identity	% podobnosti
EVN vs GDNF	38, 8	47,2
EVN vs NTN	51	56, 1
EVN vs PSP	53, 3	57,8
GDNF vs NTN	44,8	57,3
GDNF vs PSP	44, 3	50
NTN vs PSP	50	54,4

Z těchto srovnání je zřejmé, že zralý enovinový protein má bližší příbuznost s persefinem a neurturinem než s GDNF.

Amplifikace, klonováni a sekvenční analýza většího fragmentu DNA sekvence enovinu z cDNA frontální kůry za použití primerů na podkladě genomické EMBL/GenBank sekvence (přístupové číslo AC005038) vedlo ke vzniku sekvence o 819 bp (Obrázek 3). Tato sekvence obsahuje domnělý ATG startovací kodón v nukleotidových pozicích 3032 a vedla ke vzniku otevřeného čtecího rámce (čtecí rámec A na obrázku 3), který přesahuje terminační kodón v nukleotidových pozicích 285-287. Přepsaná proteinová sekvence této oblasti nevykazuje podobnost s žádným známým proteinem v databázích. Translace cDNA sekvence v druhém čtecím rámci (čtecí rámec B na obrázku 3) vede ke vzniku předpokládané proteinové sekvence o 159 aminokyselinových reziduích. Tato sekvence obsahuje RXXR štěpící místo (pozice B43 až B46, nukleotidová pozice 460-471) a sekvenci odpovídající sekvenci zralého enovinu (pozice B47 až B159, nukleotidová pozice 472-810). Otevřený čteci rámec včetně RXXR štěpícího místa a sekvence kódující zralý enovin přesahuje z nukleotidové pozice 334 (které předchází terminační kodón v čtecím rámci) do zastavujícího kodónu v pozici 811-813, ale neobsahuje ATG kodón pro startující methioninové reziduum. Analogicky k persefinu (Milbrandt et al., 1998) hypotetizujeme, že ve většině mRNA transkriptů z genu EVN je přítomen nesestříhaný intron. GDNF a NTN mají také intron v jejich odpovídajících oblastech kódujících prodoménu (Matsushita et al., 1997, Heuckeroth et al., 1997).

K vyhodnocení různých mRNA transkriptů pro Enovin byly provedeny RTPCR experimenty za použití primeru umístěných na 5' konci sekvence kódující Enovin v 5' směru od ATG startovacího kodónu (primer PNHspó (5' -GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3') a vložený primer PNHsp6 (5'GGT GGG GGA ACA GCT CAA TGG-3') a na 3' konci (primer PNHapl a vložený primer PNHap2 (viz Tabulka 1).

Experimenty byly provedeny na cDNA panelech mnohočetné lidské tkáně (Clontech MTC panely I a II) z na cDNA knihovně fetálního srdce (Clontech) a na cDNA odvozené z lidského mozečku, hipokampu a frontální kůry (Masure et al. , 1998). Primární PCR reakce byly provedeny s primery PNHspó a PNHapl za podmínek nadbytku GC (Advantage GC-PCR kit, Clontech) ve 30 cyklech (95^f,C - 30 s, 60^f,C 30 s, 72°C - 1 minuta), jak bylo popsáno. Vložené PCR reakce byly provedeny na 1 ul primárního PCR produktu za použití primeru PNHspó a PNHap2 za stejných podmínek ve 30 cyklech. Výsledné PCR produkty byly analyzovány na 1,5% agarózovém gelu a jejich velikost byla v rozmezí od +350 bp do ±800 bp. Některé proužky byly purifikovány z gelu a PCR fragmenty byly sekvenovány přímo. Některé purifikované PCR produkty byly také klonovány ve vektoru pCR2.1-TOPO (TOPO-TA cloning kit, Invitrogen) a poté sekvenovány. Sekvenční analýza potvrdila existenci různých mRNA molekul obsahujících sekvenci Enovinu. Získané sekvence fragmentu byly porovnány se sekvencí genomického Enovinu. To nám umožnilo identifikovat několik možných 5'a 3' sestřihových míst v genomické sekvenci (Obrázek 21). Všechny tato sestřihová místa odpovídali koncensuálním sekvencím pro donorová a akceptorová sestřihová místa (Seanpathy, P., Shapiro, M.B., Harris, N.L. (1990) Splice junctions, branch point sites, and exons: sequence statistics, identification, and applications to genome project. Methods Enzymol. 183,252-278). Identifikované různé

sestřihové varianty Enovinu a jejich přítomnost v různých lidských tkáních jsou sumarizovány na Obrázku 22. Pouze 2 z 5 sekvenovaných transkriptů vedly ke vzniku funkčního Enovinového proteinu po translaci z ATG startovacího kodónu. Tyto dva transkripty kódují proteiny o 228 nebo 220 aminokyselinách s předpověděnými signálními peptidy o 47 a 39 aminokyselinovými rezidui. Předpověděné proteinové sekvence těchto dvou variant jsou uvedeny na Obrázku 23 (dlouhá varianta) a na Obrázku 24 (krátká varianta). Dlouhá varianta může být odečtena ze sekvence DNA z Obrázku 21 sestřihem prvního intronu v místech 5'-l a 3'-l a druhého intronu v místech 5'-2 a 3'-3. Po translaci otevřeného čtecího rámce je získána předpověděná proteinová sekvence z Obrázku 23. Kratší varianta může být odečtena z DNA sekvence z Obrázku 21 sestřihem prvního intronu v místech 5'-l a 3'-2 druhého intronu v místech 5'-2 a 3'-3. Po translaci otevřeného čtecího rámce je získána předpověděná proteinová sekvence z Obrázku 24.

Nejdelší transkript se zdá být nejhojněji zastoupen ve většině tkání, jak je vidět z intenzity proužků na Obrázku 22B. Kratší transkripty vedou k posunům rámce za vzniku přepsaného proteinu postrádajícího aminokyselinovou sekvenci zralého Enovinu homologní s GDNF, NTN a PSP. Dva nejmenší transkripty dokonce postrádají část zralé kódující sekvence včetně dvou ze sedmi konzervovaných cysteinových reziduí. Na Obrázku 22B je zobrazeno rozložení hlavních sestřihových variant v různých lidských tkáních. Funkční mRNA Enovinu je exprimována v téměř všech testovaných tkáních, včetně mozku, srdce, ledvin, jater, plic, pankreatu, kosterních svalů, tlustého střeva, tenkého střeva, leukocytů periferní krve, sleziny, thymu, prostaty, varlete, vaječníku, placenty a fetálniho srdce. V některých lidských tkáních (např. mozeček, hipokampus), mohou být pomocí PCR amplifikovány pouze nefunkční transkripty. Pokud je nám známo, výskyt nefukčních mRNA transkriptů nebyl v takové míře doposud popsána. Biologický význam tohoto nálezu zůstává otázkou k dalšímu studiu. Ačkoli exprese NTN a PSP v různých tkáních nebyla plně charakterizována, úroveň jejich exprese se zdá být mnohem nižší a exprese je mnohem omezenější na určité tkáně (Kotzbauer et al., 1996, Milbrandt et al., 1998).

• · · ·

Rekombinantní exprese Enovinu v E. coli. Konstrukce plazmidů exprimujícího Enovinu

414 bp PCR fragment byl amplifikován z lidské genomické DNA pomocí primerů PNHsp4 a PNHap2 (Tabulka 1) a klonován ve vektoru pCR2.1TOPO za použití TA-klonování (Invitrogen). Sekvence inzertu byla potvrzena sekvenční analýzou. Jeden klon obsahující inzert s koncensuální sekvencí Enovinu (klon 36) byl použit pro následnou konstrukci exprimujícího plazmidů. Dva primery byly navrženy, aby obsahovaly příslušná restrikční místa na jejich 5' konci. Přední primer PNHexp-spl (5'- GCG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A -3') obsahoval BamHI restrikční místo (podtrženo) a reverzní primer PNHexp-apl (5'- GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G -3') obsahoval Xhol restrikční místo (také podtrženo). Za použití těchto primerů byl 343 bp fragment kódující zralý Enovin (pozice 81 až 422 na Obrázku 1) amplifikován z klonu 36. PCR reakce byla provedena v celkovém objemu 50 ul, obsahující 1 x GC cDNA PCR reakčni pufr, 0,2 mM dNTP, 1M GC-MELT™, 200 nM primerů PNHexp-spl a PNHexp-apl, 1 ul směsi Advantage KlenTaq polymerázy a 10 ng plazmidové DNA z klonu 36. Vzorky byly zahřívány na 94^fJC po dobu 5 minut a cyklizace byla prováděna 45 s při teplotě 94°C, 1 minutu při teplotě 58^flC a 30 s při teplotě 72°C pro 25 cyklů s finálním krokem 7 minut při teplotě 72°C. Výsledných 50 ul produktu bylo purifikováno pomocí Qiaquick PCR purifikačního kitu (Quiagen) a DNA byla eluována ve 30 ul. 25 ul tohoto purifikovaného produktu bylo poté naštěpeno v 30 ul reakčni směsi s 10 U BamHI a 10 U Xhol v lx pufru B (Boehringer Manheim) po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C. Po elektrof oréze na 1% (w/v) agarózovém gelu v lx ΤΆΕ pufru (40 mM Tris acetát, 1 mM EDTA (sodná sůl), pH 8,3), byl očekávaný 353 bp proužek vyříznut z gelu a purifikován za použití Qiaquick extrakčniho kitu. Výsledný fragment byl ligován ve vektoru pRSET B (Invitrogen) linearizovaném pomocí BamHI a Xhol. Inzert výsledného plazmidového konstruktu (hEVNmat/pRSETB) byl potvrzen kompletní sekvenční analýzou. Výsledný konstrukt kóduje protein o 164 aminokyselinách s předpověděnou molekulární váhou 15704 Da včetně NH₂-konce 6x His-tag fúzovaném v rámci ke kódující sekvenci zralého Enovinu. NH₂- konec aminokyselinové sekvence výsledného proteinu je tedy MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS (sekvence zralého Enovinu je vyznačena tučně, 6x His-tag je vyznačen podtržené).

Exprese Enovinu v BL21(DE3) E.coli

Rekombinantní produkce Enovinového proteinu byla provedena stejně, jak je popsáno pro Neurturin Creedonem et al. (1997) s modifikacemi. Pro produkci rekombinantniho Enovinového proteinu byl transformován plazmid hEVNmat/pRSETB v kmeni E. coli BL21 (DE3) Novagen a ponechán růst ve 2xYT/ampicilinovém médiu (16 g/1 tryptonu, 10 g/1 kvasničného extraktu, 5 g/1 NaCI a 100 mg/1 ampicilinu) při teplotě 30C (225 otáček za minutu) nebo 37°C (300 otáček za minutu) do hodnoty optické denzity přibližně 0,5 před přidáním IPTG do finální koncentrace 0,2 mM k indukci exprese. Buněčné pelety byly posbírány centrifugací po 3 hodinové indukční periodě, promyty fosfátovým pufrem, centrifugovány a uskladněny zamrazením. Pro purifikaci a rozvolnění byly buněčné pelety resuspendovány v sonikačním pufru (20 mM Tris-Hcl, pH 8,0, 300 mM NaCL, 1 mM 2-merkaptoetanol, inhibitory proteáz (koktejlové tablety inhibitorů proteáz Complete^T:' (Boehringer Manheim, 1 tableta na 50 ml pufru) a 1 mg lysozymu na 500 mg buněčné pelety). Buňky byly rozrušeny sonikací a inkluzní tělíska byly posbírána centrifugací. Inkluzní tělíska byla rozpuštěna a inkubována v pufru A (8 M urea, 20 mM Tris-Hcl pH 7,6, 200 mM NaCI, 1 mM 2-merkaptoetanol) po dobu 30 minut při teplotě 37°C před přidáním Ni-NTA praskyřice (nikl nitriolotrioctová kyselina, Qiagen). Po 40 minutách protřepávání při 37°C, byly vzorky jednou promyty pufrem A a naneseny na 5 ml Ni-NTA kolonu. Kolona byla promyta 10 objemy kolony pufru A, 10 objemy kolony pufru A při pH

7.2 a 10 objemy kolony pufru A při pH 7,2 + 10 mM imidazolu. Enovin byl eluován z kolony ve 4 objemech kolony pufru A při pH 7,2 + 200 mM imidazolu.

Rozvolnění Enovinu bylo provedeno dialýzou přes noc po jednotlivých krocích při teplotě 4°C v renaturačním pufru (0,lM fosfát sodný, 0,15M NaCI, 3 uM cysteinu, 0,02% Tween-20, 10% glycerol, 0,01M TrisHcl, pH 8,3) obsahující snižující se množství urey v každém kroku (6M až 4M až 3M až 2M až 1M až 0,5M až 0M urea). Purifikovaný protein byl rozdělen na alikvóty, uložen při -20°C a dále použit pro funkční testy.

Chromozomální lokalizace genu pro Enovin

3.3 kb fragment genu pro Enovin byl amplifikován z mozečkové cDNA za použití primerů EVN(7)-spl (5'- TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC 33 • ······ ·· • · · · · · ·· · ···· · · ······ · · · · ·

3') a PNHapl (5'- GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G - 3') navržených podle sekvence z EMBL pod přístupovým číslem AC005038. PCR reakce byla připravena v celkovém objemu 50 ul obsahujícím lx Expand Long Template PCR reakční pufr (Boehringer Manheim), 0,5 mM dNTP, 1M GCMELT ((Clontech Laboratories), 400 nM primerů EVN (7)-spl a PNHapl a 1 ul mozečkové cDNA. Po úvodních 2 minutách při teplotě 94°C bylo přidáno 0,75 ul Expand Long Template polymerázy (Boehringer Manheim) a cyklizace byla prováděna 10 s při teplotě 94°C, 30 s při teplotě 58^cC a 3 minuty při teplotě 68°C pro 10 cyklů. Poté bylo provedeno dalších 20 cyklů zvyšujíce prodlužování času při teplotě 68°C o 20 sekund každým cyklem. Zahrnuto bylo také finálních 7 minut při teplotě 68^r,C. Výsledný 3,3 kb fragment byl purifikován po elektroforéze na 0,8% agarózovém/TAE gelu a klonovány ve vektoru pCR2.1-TOPO za použití TA klonování (Invitrogen). Kompletní sekvenční analýza 3,3 kb inzertu jednoho klonu potvrdila, že získaná cDNA sekvence koresponduje s genomickou sekvencí v EMBL databázi (přístupové číslo AC005038). Žádný intron nebyl vystřižen z cDNA získané z mozečkové cDNA.

Studie chromozomálního mapování byly provedeny za použití analýzy fluorescenční in šitu hybridizace (FISH) tak, jak je popsáno (Heng et al., 1992, Heng tsui, 1993). Lidské lymfocyty byly kultivovány při teplotě 37°C po dobu 68-72 hodin před reakcí s 0,18 mg/ml 5bromo-2'-deoxyuridinu (BrdU), aby se synchronizovaly buněčné cykly v buněčné populaci. Synchronizované buňky byly promyty a rekultivovány při teplotě 37°C po dobu 6 hodin. Buňky byly posbírány a byly z nich připraveny preparáty za použití standardních postupů zahrnujících přípravu v hypotonickém roztoku, fixaci a vysušení. 3,3 kb próba pro Enovin byla biotinylována a použita pro FISH detekci. Preparáty byly zahřívány při teplotě 55°C po dobu 1 hodiny, podrobeny reakci s RNázou a denaturovány v 70% formamidu v 2x NaCl/Cit (20x NaCl/Cit, což je 3M NaCI, 0, 3 M dvojsodný citrát, pH 7,0) po dobu 2 minut při teplotě 70° s následnou dehydratací etanolem. Próba byla denaturována před nanesením na denaturovaná chromozomální sklíčka. Po hybridizaci probíhající přes noc byla sklíčka promyta a byly separátně zaznamenány na fotografický film FISH signály a 4', 6diamidino-2-fenylindol barvící se proužky a přiřazení údajů FISH mapování s chromozomálními proužky bylo dosaženo superimpozicí FISH signálů s 4', 6-diamidino-2-fenylindol barvící se chromozómy (Heng a Tsui, 1993). Za použitých podmínek byla účinnost hybridizace • · · ·

přibližně 72% pro tuto próbu (mezi 100 kontrolovanými mitotickými figurami vykázalo 72 z nich signály na jednom páru chromozómu). Protože 4' , 6-diamidino-2-fenylindol identifikace proužků byla použita k identifikaci specifického chromozómu, bylo získáno přiřazení mezi signálem z próby a krátkým raménkem chromozómu 1. Pozice byla dále určena na podkladě přehledu z 10 fotografií (Obrázek 4Ά) . Za použitých podmínek nebyl detekován pomocí FISH analýzy žádný další lokus, proto jsme uzavřeli, že Enovin je lokalizován na chromozómu 1, oblast p31,3-p32. Příklad výsledku mapování je uveden na Obrázku 4B.

Z údajů genové mapy v Národním centru pro biotechnologii (NCBI, http://www.nebi.nim.nih.gov./genemap) , může být odvozeno, že genomický klon obsahující sekvenci Enovinu (EMBL přístupové číslo AC005038) je lokalizován na chromozómu 1 mezi markéry D1S2843 a D1S417. To odpovídá chromozómu 1, oblast p31,l až p32.3 potvrzujíce údaje získané FISH analýzou.

Tkáňové rozložení Enovinu určené pomocí Northern Blotu a dot blotu.

Northern bloty obsahující 2 ug póly(A)-bohaté RNA odvozené z různých lidských tkání (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA, MTN™ blot II) byly hybridizovány podle instrukcí výrobce s a-³²P-dCTP náhodně označených (HighPrime kit, Boehringer Manheim) 897 bp Enovinový fragment. Tento fragment byl získán PCR amplifikací s primery PNHspl a PNHapl na cDNA frontální kůry a následným klonováním ve vektoru pCR2,l-TOPO. Fragment obsahuje 897 bp sekvence Enovinu do terminačního kodónu a zahrnuje kompletní kódující sekvenci zralého Enovinového proteinu.

mRNA Enovinu byla detekována jako hlavní transkript přibližně 4,5 kb (Obr. 5A-C) . Enovinová mRNA byla exprimována v celé řadě tkání, nejvíce v srdci, kosterním svalu, pankreatu a prostatě. Některé transkripty o menší velikosti jsou přítomny například v placentě (4kb, 2,4 kb a 1,6 kb) a v prostatě (4 kb a 1,6 kb). Ve fetálni tkáni je nápadný 2,4 kb transkript přítomný v játrech a do menší míry ve fetálni ledvině, v játrech, v plicích a v mozku.

Navíc byl také hybridizován RNA master blot (Clontech Laboratories) obsahující poly(A) bohatou RNA z různých lidských tkání a v různých vývojových stádiích, a to s 897 bp Enovinovou próbou. Póly(A) bohaté • · « · • · · · • · · ··· ···· « · · · · · · · · « · ······· · ··· · · • · ·· · · · · _Λ _ ··· · ·· ··· ·· ··· 35

RNA vzorky použité pro tvorbu tohoto blotu byly výrobcem normalizovány na mRNA expresní hladiny osmi různých uklízečích genů.

MRNA Enovinu byla exprimována všude, ale nejvyšší mRNA hladiny byly patrné v prostatě, v hypofýze, v průdušnici, v placentě, ve fetálních plicích, v pankreatu a v ledvině (Obrázek 5D+E).

Konstrukce GFRa-IgG-Fc fúzních vektorů cDNA oblasti GFRa-1, GFRa-2 a GFRa-3 (kódující aminokyseliny 27-427, 20 až 431 a 28 až 371) mimo sekvencí kódujících signální peptid a COOH-terminální hydrofobní oblast hrající roli v GPI ukotvení byly klonovány v rámci v expresním vektoru Signál plg plus (R+D Systems Europe Ltd). Výsledné proteiny exprimované z těchto konstruktů obsahují NH₂ terminální CD33 signální peptid o 17 aminokyselinách, oblast GFRa proteinu a COOH-terminální fúzní doménu lidského IgGj-Fc proteinu o 243 aminokyselinách. CHO buňky byly transfektovány GFRa fúzním konstruktem a stabilně transfektované buňky byly vybrány za použití 500 ug G418. Permanentní klony byly vybrány za použití anti Fc protilátky. K purifikaci GFRa fúzních proteinů byly buňky podrobeny růstu v médiu bez séra a médium bylo sbíráno další 3 dny. Médium bylo centrifugováno a aplikováno na kolonu s proteinem A (Protein A Sepharose, Pharmacia Biotech). Navázaný protein byl eluován pomocí 0,1 M Na citrátu, pH 3,0 a sbírán do 1 M Tris pufru, pH 8,4. Koncentrace bílkoviny byla odhadnuta z absorbance při 280 nm za použití extinkčního koeficientu 1,5. Tyto purifikované rozpustné GFRa-1 až -3 Fc fúzní proteiny byly použity pro následné vazebné studie.

Povrchová plazmon rezonanční analýza

Experimenty s povrchovou plazmon rezonancí (SPR) byly provedeny při teplotě 25°C za použití zařízení BIAcore 3000. Analýzy byly provedeny s enovinem a NGF jako imobilizovanými ligandy. Karboxylovaná matrice F1 senzorového čipu byla nejprve aktivována směsí 1:1 400 mM A-etylA-(dimetylaminopropyl)-karbodiimidu a 100 rnM A-hydroxy-succinimidu po dobu 10 minut. Poté byly rekombinantní enovin a NGF aplikovány na aktivovaný povrch v 10 mM acetátovém pufru, pH 4,5 při průtoku 5 ul/min. Neokupované reaktivní skupiny byly inaktivovány 1M etanolaminhydrochloridem. Pro vazebné experimenty byly rozpustné GFRal-3-Fc superfúzovány v koncentracích 10-100 nM v HEPES pufru • · • · · · • · · ··· · * » · · · ··· · « · · · · · · ·····«· « · · · · · • · ·· ···· ··· · ····· · · ·»· (150 mM NaCl, 3,5 mM EDTA, 0,05% P-20, 10 mM HEPES, pH 7,4) při průtoku 10 ul/min. Asociace byla monitorována po dobu 3 minut a disociace po dobu 1 minuty, s následnou regenerací pomocí 5 mM NaOH. Disociace byla zahájena superfúzí HEPES pufrem. K výpočtu asociačního stupně (k_a) , disociačního stupně (k_d) a rovnovážných disociačních konstant (K_D, vypočteno jako K_d/K_a) byl použit BIAcore vyhodnocovací software, 3,0.

Výsledky

SPR byla použita k měřeni vazby rozpustných GFRal-3 k imobilizovanému enovinu. Specifická vazba byla detekována pouze u rozpustného GFRa3. GFRal a GFRa2 se na imobilizovaný enovin nevázaly. Pozorovaná vazba GFRa3 byla specifická, protože nedošlo k vazbě k NGF. V separátním kontrolním experimentu byla detekována specifická vazba TrkA-Fc (NGF receptor) k imobilizovanému NGF, bez vazby na imobilizovaný enovin.

Z vazebných křivek získaných za použití tří odlišných koncentrací GFRa byly odvozeny následující konstanty uvedené v Tabulce 3. Tyto výsledky demonstrují, že GFRct3 se váže specificky na enovin.

Tabulka 3

	K_a(l/Ms)	Kd(l/s)	k_d(M)
GFRa 3	1,65 10⁵	5,08 10⁴	3,1 10'⁵

Protože GDNF, NTN a PSP podporují udržení a přežívání různých typů neuronálních buněk, je předpokládáno, že enovin má podobné biologické účinky na nervové buňky a možná také na další buněčné typy· Proto je předpokládáno, že enovinový protein může být užitečný obecně v léčbě nervových onemocnění, včetně Parkinsonovy choroby, Alzeheimerovi nemoci, periferní neuropatie, amyotrofické laterální sklerózy, Huntingtonovy nemoci, akutního poškození mozku, nádorů nervového systémů, roztroušené sklerózy, poškození periferních nervů nebo poškození v důsledku expozice neurotoxinům.

Enovin by mohl být také užitečný v různých aspektech neuroprotekce.

Uvážíme-li jeho účinek na přežívání různých populací neuronálních buněk a na pozorovanou extenzi neuritů na našem modelu SHSY5Y buněk, • · ···t

37* • » · navrhujeme, že tato sloučenina by měla mít neuroprotektivní a neuroregenerativní aplikace.

Toto je založeno na následujícím pozorování. Taxol indukuje neuronální apoptózu u NGF-diferencovaných PC12 krysích feochromocytomových buněk (Nuydens et al, odesláno k publikaci). Proto taxol indukovaná cytotoxicita má rysy neuronální apoptózy, jak je monitorováno pomocí DNA fragmentace, značením Annexinu V a bcl-2 protekcí. Proto může být poté odvozeno, že taxol indukuje apoptózu u diferencovaných SH-SY5Y buněk. Pro Enovin je nyní prokázáno, že je schopný snížit buněčné odumírání a proto může obecně zvrátit neuronální apoptózu.

Sloučenina může být proto užitečná v následujících neurodegenerativních stavech, v kterých byla apoptóza pozorována. Jedná se o iktus (Hakim 1998), Parkinsonovu nemoc (Marsden et al 1998), Alzheimerovu nemoc (Nagy et al 1998), Huntingtonovu chorobu (Wellington et al 1997), neurotrauma (Smirnova et al 1998), periferní neuropatie (Srinivisan et al 1998).

Jako příklad pro poslední klinickou indikaci jsem prokázali, že tento neurotrofický faktor skutečně chrání diferencované SH-SY5Y lidské neuroblastomové buňky proti buněčné toxicitě vyvolané taxolem.

Metodika pro měření životnosti

Buněčná životnost byla určena přidáním 100 ul roztoku o koncentraci 1 mg/ml 2,3-bis (2-metoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5karboxanilid (XTT, Sigma) v DMEM (37°C) suplementovaných 0,02 mM fenazin metosulfátem (PMS, Sigma) do každé jamky. Destičky byly poté inkubovány při teplotě 37°C odečteny nm jako konverzi (Molecular devices) referenční vlnové tetrazoliové soli po dobu 2,5 hodin. Optické denzity byly při vlnové délce 450 nm, za délky. XTT stanovení je XTT na červeně . zbarvený provedena mitochondriálními enzymy.

použití 650 založeno na formazanový produkt.

Tato reakce je

Metodika pro neuronální diferenciaci

1. Diferenciace v lidských neuroblastomových buňkách SHSY5Y

SHSY5Y buňky jsou diferencovány po dobu 5 dnů s 25 nM staurosporinem. Efekt Enovinu je měřen 72 hodin po zahájení ·· « · ♦ experimentu (reference: Jalava et al. Protein Kinase inhibitor staurosporine induces a mature neuronal phenotype in SH-SY5Y human neuroblastoma cells through an a,b,z PKC independent pathway. Journ

Cell Physiol 155, 301-312, 1993.

2. Měření rozsahu neuritu

Morfologické změny neuronů byly automaticky kvantifikovány následujícím způsobem. Stručně řečeno, v příslušných časech byl do média přímo přidán glutaraldehyd a ponechán po dobu 30 minut při pokojové teplotě. To zajistilo, že morfologie buněk v tomto časovém bodě odrážela skutečnou situaci. Buňky byly pozorovány prostřednictvím přeneseného světla v mikroskopu Axiovert (Zeiss Oberkochen, Německo), vybaveným Martzhauserovým skenovacím nosičem ovládaným zařízením Indy (Silicon Graphics, Mountain View, USA). Obrázky byly zachyceny za použití videokamery MX5 (HCS). V 64 vyrovnaných obrázcích vytvářejících 8x8 čtvereční matrici bylo hodnoceno okolo 3000 buněk. Přesné vyrovnání obrázků zajistilo, že neurity mohly být sledovány z jednoho obrázkového pole do dalšího. Automatická detekce rozsahu neuritu značená polyklonální tau protilátkou byla provedena za použití detektoru křivočarých struktur (Steger 1998). Analytický software automaticky vypočítal celkový buněčný povrch a celkovou délku neuritu.

Ke zkoumání efektu enovinu na různé buněčné typy byly provedeny dva testy, test syntézy DNA a test chemotaxe.

lidské dermální fibroblasty (39SK), endoteliální umbilikální vény (HUVEC), lidské chondrocyty obsahujícím 10% definovaná média

FBS

Test syntézy DNA Buňky zahrnující buňky z lidské svalstva (HSMC), udržovány v DMEM osteoblasty), nebo teplotě 37°C s 5% CO₂ a 95% vzduchu. Pro test umístěny do 96-jamkové destičky pro tkáňové buněk na jamku v DMEM obsahujícím hodin. Kultivační médium bylo poté koncentrace Enovinu a

10% FBS a nahrazeno

0,1% BSA obsahující byly inkubovány (pro různé chondrocyty), nebo DMEM

FBS (pro HUVEC) a buňky bylo kultivační médium nahrazeno 100 ul

HSMC, a HUVEC)

DNA byly v denzitě 5000 byly krysí při buňky lidské buňky hladkého krysí osteoblasty (39-SK, (chondrocyty syntézy kultury inkubované po dobu 24 DMEM obsahujícím různé 39-SK, osteoblasty, HSMC, koncentrace Enovinu a 0,5% po dobu 24 hodin. Následně DMEM obsahujícím 5% FBS a • · · ·

0,1 uCi (³H)-thymidinu. Po 2 hodinách pulsinho značeni byly buňky fixovány metanolem/kyselinou octovou (3:1, vol/vol) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Fixované buňky byly dvakrát promyty 80% metanolem. Buňky byly solubilizovány v 0,05% trypsinu (100 ul/jamku) po dobu 30 minut a poté v 0,5% SDS (100 ul/jamku) po dalších 30 minut. Alikvóty buněčných lyzátů (180 ul) byly zkombinovány s 2 ml scintilačního koktejlu a radioaktivita buněčných lyzátů byla měřena za použití tekutého scintilačního počítače (Wallac 1409).

Test na chemotaxi

Buňky byly udržovány tak, jak je popsáno v Testu syntézy DNA. Chemotaktická aktivita Enovinu byla analyzována za použití 12jamkové modifikované Boydenovy komory (McQuillan, D.J., Handley, C.J., Campbell, M.A., Bolis, S., Milway, V.E., Herington, A.C. (1986). Stimulation of proteoglycan biosynthesis by sérum and insulin-like growth factor-I in cultured bovine articular cartilage. Biochem. J. 240, 423-430). Buňky byly natráveny trypsinem za použití 0,05% trypsinu a 0,5 mM EDTA a resuspendovány v DMEM. Do spodních jamek Boydenovy komory byly přidány alikvóty 150 ul média obsahující různé koncentrace Enovinu. Polykarbonátová membrána (8 um) potažená 0,1 mg/ml kolagenu typ I byla umístěna na vrchol spodních buněk následným sestavením horních buněk. Do horních buněk byly přidány alikvóty 100 ul buněk (70000 buněk/ml). Po 6 hodinové inkubaci bylo zařízení rozloženo. Buňky zůstávající na horní částí membrány byly odstraněny. Membrána byla fixována 10% formaldehydem po dobu 15 minut, s následným barvením Gillovým hematoxylinem. Buňky byly počítány pod mikroskopem (250x zvětšení) a byl použit průměr buněk z pěti ploch z každé buňky. Každý experiment byl opakován alespoň pětkrát. Výsledky byly vyjádřeny jako násobek kontroly (DMEM obsahující 0,1% BSA).

Jak je ilustrováno výsledky na Obrázku 8 až 18, nemá enovin žádný efekt na proliferaci použitých buněčných typů, nebo na migraci buněk HUVEC (Obrázek 14), jak je popsáno výše. Enovin neměl žádný efekt na SH-SY-5Y neuroblastomové buňky. To ukázalo selektivní účinek enovinu na nervové buňky.

Pro GDNF i NTN bylo prokázáno, že účinkují jako signál prostřednictvím signálního komplexu složeného z podjednotky vázající ligand, buďto z GFRa-1 nebo GFR a-2 a signalizační podjednotky, cRET • · · · • ·

protein tyrosin kinázy. O Enovinu je předpokládáno, že vykonává své biologické účinky prostřednictvím signálního komplexu tvořeného GFRa vázajícím partnerem (buďto GFRa-1, GFRa-2, v nedávné době charakterizovaným sirotčím receptorem GFRa-3, nebo doposud necharakterizovanými členy rodiny GFRa v kombinaci s cRET nebo jiným signálním partnerem. Naše vazebné údaje skutečně ukazují, že enovin se může vázat specificky na GFRa-3.

U člověka mohou vést germinální muztace GDNF nebo cRET k několika fenotypům onemocnění včetně mnohočetné endokrinní neoplázie a familiární Hirschprungovy nemoci (Romeo et al., 1994, Edery et al., 1994, Angrist et al., 1996). Obě onemocnění jsou sdružena se střevní dysmotilitou, přičemž Hirschprungova nemoc je nejběžnější příčinou kongenitální obstrukce střeva u dětí. Zajímavé je, že GDNF a cRET knockoutované myši vykazují významně podobné patologie s rénální agenezí a střevní agangliózou (Sanchez et al. , 1996, Moore et al. ,

1996, Pichel et al. , 1996). Enovin by mohl hrát roli v podobných onemocněních střeva nebo ledvin, nebo protože je exprimován všudypřítomně, by mohl být důležitý v rozvoji dalších periferních orgánů v těle.

Interakce ligandů s jejich receptory je obecně dosaženo interakcí specifických vazeb mezi konkrétními rezidui na obou proteinech. Fragmenty proteinu mohou sloužit jako agonisté aktivující receptor k vyvolání účinků podporujících růst a udržujících přežívání buněk. Části enovinu nebo syntetické peptidy založené na proteinové sekvenci enovinu mohou být proto užitečné jako agonisté nebo antagonisté regulující svůj receptor GFRa-3. Za použití peptidové syntézy nebo rekombinantních technik mohou být vytvořeny hybridní růstové faktory tvořené částmi GDNF, NTN nebo PSP, nebo jakýmkoli jiným neurotrofickým nebo růstovým faktorem s částmi enovinu, což vede ke vzniku nového syntetického růstového faktoru s novými vlastnostmi.

K otestování, zdali je enovin schopný změnit senzorické deficity indukované taxolem u krys po subplantárních injekcích krysám.

V prvním experimentu bylo testováno, zdali léčba enovinem může zvrátit senzorické deficity indukované taxolem, zatímco druhá • · · · klinická studie testovala, zdali enovin může zabránit rozvoji deficitům indukovaným taxolem.

Zvrat senzorické dysfunkce indukované taxolem po určitém čase

Postup

Byly použity krysí samci kmene Sprague-Dawley vážící 300 - 340 gramů. Zvířata byla ustájena jednotlivě s přístupem k vodě a k potravě ad libitum. Před zahájením experimentu byla zvířata umístěna do standardních pozorovacích klecí a po habituační době 15 minut byl vyhodnocen reflex bodnutí špendlíkem. Aby mohl být tento test proveden, byl plantární povrch pravé tlapky zvířete stimulován jehlou a reaktivita tohoto bodnutí špendlíkem byla hodnocena jako, že je buďto přítomná (skóre 1) nebo nepřítomná (skóre 0). Postup byl v jednom sezení opakován třikrát s časovým intervalem 1 minuty mezi dvěmi následujícími podněty, takže test bodnutí špendlíkem se skládal ze 3 měření reaktivity vůči bodnutí špendlíkem. Pouze krysy mající normální reakce na 3 bodnutí špendlíkem byly zahrnuty do experimentu.

Tři následující dny bylo zvířatům ráno aplikováno subplantární injekcí 50 ul taxolu (3 mg/ml paclitaxelu rozpuštěného v cremophoru a dehydratovaném alkoholu s vodou) do pravé zadní tlapky. Během dalšího rána byl znovu vyhodnocen reflex po bodnutí špendlíkem a byla vybrána zvířata nevykazující žádnou reaktivitu ke 3 podnětům. Tato zvířata byla náhodně rozdělena do podskupin (n = 10/skupinu), kterým bylo aplikováno subplantární injekcí do pravé zadní tlapky 75 ul buďto vehikula, fyziologického roztoku, nebo 23 či 130 ug/ml enovinu. Protože nebyly pozorovány rozdíly mezi výsledky zvířat léčených vehikulem a fyziologickým roztokem, byly obě skupiny spojeny (kontrolní skupina). Ve dnech 1, 4, 5 a 7 po poslední léčbě byl proveden test bodnutí špendlíkem ráno (mezi 8 a 9 hodinou ranní) a večer (mezi 3,30 a 4,30 odpoledne) . Osmý den ráno byl proveden poslední test bodnutí špendlíkem. Pro každé zvíře bylo měřeno kumulativní skóre reaktivity na bodnutí špendlíkem. Protože po poslední léčbě bylo provedeno celkem 9 testů bodnutí špendlíkem (ve třech sezeních), je maximální skóre, které může být dosaženo po dobu celého experimentu 27.

Výsledky

Opakované subplantární injekce taxolu po dobu tří po sobě jdoucích dnů vedou u většiny zvířat k akutní zánětlivé reakci s chyběním odpovědi na stimulaci bodnutí špendlíkem. Subplantární injekce fyziologického roztoku nebo vehikula neovlivnila deficit indukovaný taxolem. V prvním měření vykázaly pouze 4 z 20 kontrol alespoň jednu reakci na tři bodnutí špendlíkem a průměr (±SEM) skóre bodnutí špendlíkem u kontrol v prvním měření byl 0,25 (± 0,12). To kontrastuje se začátkem experimentu, kde průměrné skóre bylo 3,0 (± 0,0), protože všechna zvířata odpověděla na bodnutí špendlíkem. Dokonce i po 8 dnech měření byla reaktivita u kontrolních zvířat porušena, kdy u 11 z 20 krys odpovědělo alespoň jednou s průměrným skórem na bodnutí špendlíkem 0,75 (± 0,18). V této kontrolní skupině nevykázala žádná z krys normální reaktivitu na všechny 3 podněty. Kumulativní skóre na bodnutí špendlíkem kontrolní skupiny za určitou dobu je uvedeno na Obrázku 19. Protože zvířata byla testována 9 krát po dobu 8 dnů, je maximální skóre, které může být dosaženo 3 bodnutí špendlíkem v každém testu 27. Jak je vidět na grafu, subplantární injekce fyziologického roztoku nebo vehikula nebyla schopná zvrátit deficit vyvolaný taxolem po testovanou dobu. Průměrné celkové kumulativní skóre kontrolních zvířat na konci experimentu bylo 5,10 (± 0,87), což je 18,9% maximálního skóre, které může být dosaženo.

Jedna subplantární injekce 75 ul roztoku enovinu o koncentraci 23 ug/ml vedla po prvním měření u 4 krys z 10 k alespoň jedné odpovědi, s průměrným skóre bodnutí špendlíkem 0,70 (± 0,33). V osmém dnu odpovědělo všech 10 krys alespoň jedenkrát na bodnutí špendlíkem a normální reaktivita byla přítomna u 5 za 10 krys. Průměrné skóre bodnutí špendlíkem v této skupuině bylo osmý den 2,20 (±0,29) . Ve srovnání s kontrolními zvířaty bylo průměrné kumulativní skóre na konci 8. dne měření významně vyšší (dvoustranný Mann-Whitney U-test, p menší než 0,01), s průměrným skóre na bodnutí špendlíkem 14,50 (± 1,96) (Obrázek 19). To je 53,7% z maximálního skóre.

Také po subplantární injekci 130 ug/ml enovinu došlo k vyšší účinnosti oproti kontrolní skupině. Po první léčbě enovinu v koncentraci 130 ug/ml odpovědělo 6 krys z 10 alespoň jedenkrát s průměrným skóre bodnutí špendlíkem 1,10 (± 0,35). V osmém dnu všech 10 zvířat odpověděla alespoň na jedno bodnutí špendlíkem s průměrným skóre 2,60 (± 0,22). Normální reaktivita na 3 bodnutí špendlíkem byla přítomna u 8 z 10 krys. Průměrné kumulativní celkové skóre na bodnuti špendlíkem bylo v této skupině na konci experimentu

17,20 (+ 1,94) . To je 63,7% z celkového možného skóre a významně vyšší skóre ve srovnání s kontrolní skupinou (p menši než 0,01).

• · * ·

Prevence senzorické dysfunkce indukované taxolem po určitém čase

Postup

Byly použity krysí samci kmene Sprague-Dawley vážící 300 - 340 gramů. Zvířata byla ustájena jednotlivě s přístupem k vodě a k potravě ad libitum. Před zahájením experimentu byla zvířata umístěna do standardních pozorovacích klecí a po habituační době 15 minut byl vyhodnocen reflex bodnutí špendlíkem. Aby mohl být tento test proveden, byl plantární povrch pravé tlapky zvířete stimulován jehlou a reaktivita tohoto bodnutí špendlíkem byla hodnocena jako, že je buďto přítomná (skóre 1) nebo nepřítomná (skóre 0). Postup byl v jednom sezení opakován třikrát s časovým intervalem 1 minuty mezi dvěmi následujícími podněty, takže test bodnutí špendlíkem se skládal ze 3 měřeni reaktivity vůči bodnutí špendlíkem. Pouze krysy mající normální reakce na 3 bodnutí špendlíkem byly zahrnuty do experimentu (skóre bodnutí špendlíkem = 3) . Po tomto kontrolním měření byla zvířata náhodně rozdělena do podskupin (n = 10/skupinu) a bylo jim aplikováno subplantární injekcí do pravé zadní tlapky 75 ul buďto enovinu.

léčených spojeny zvířatům (kontrolní ráno aplikováno paclitaxelu s vodou) do taxolem rozpuštěného pravé zadní proveden test či 130 ug/ml mezi výsledky zvířat byly obě skupiny dnů bylo (3 mg /ml alkoholu hodinou byl ranní) a večer (mezi 3,30 a vehikula, fyziologického roztoku, nebo Protože nebyly pozorovány rozdíly vehikulem a fyziologickým roztokem, skupina). Během tří následujících subplantární injekcí 50 ul taxolu v cremophoru a dehydratovaném tlapky. Ve bodnuti dnech 1, 4, 5 špendlíkem ráno 4,30 odpoledne).

ráno bylo po léčbě (mezi 8

Osmý den byl proveden poslední test bodnutí špendlíkem. Pro každé zvíře měřeno kumulativní skóre reaktivity na bodnutí špendlíkem. Protože 9 testů bodnutí špendlíkem které může po poslední léčbě bylo (ve třech sezeních), je dobu celého experimentu provedeno celkem maximální skóre, být dosaženo po .

Výsledky

Subplantární nezabránily špendlíkem.

fyziologického indukovanému taxolem podle

V prvním testování po léčbě taxolem odpovědělo 8 z 10 injekce deficitu roztoku nebo vehikula testu bodnutí krys alespoň jedenkrát na bodnutí špendlíkem s průměrným skóre bodnutí špendlíkem 0,60 (±0,17). V osmém dnu byl deficit vyvolaný taxolem stále přítomen a pouze 8 z deseti zvířat odpovědělo a mělo průměrné skóre 0,8 (± 0,25). U dvou zvířat byl přítomný normalizovaný reflex po bodnutí špendlíkem. Po čase bylo sníženo také kumulativní skóre bodnutí špendlíkem s průměrnou hodnotou 6,55 (± 1,08), což je 24,3% z maximálního skóre (Obrázek 20). Předléčení 23 ug/ml enovinu snížilo deficity vyvolané taxolem na jedno bodnutí špendlíkem. První den 8 z 10 zvířat odpovědělo alespoň jedenkrát a průměrné skóre bodnutí špendlíkem bylo 1,70 (± 0,40). V osmém dnu všechna zvířata odpověděla s průměrným skórem 2,50 (±0,27). U 7 zvířat byla prokázána normální reaktivita na všechna bodnutí špendlíkem. S ohledem na kumulativní odpověď za čas (Obrázek 20) bylo průměrné celkové skóre významně zlepšeno (p menší než 0,01) oproti kontrolní hodnotě 18,40 (± 1,73), což je 68,1% maximální hodnoty.

Srovnatelné výsledky byly získány po předléčení 130 ug/ml enovinu. V této studii 8 z 10 zvířat odpovědělo během prvního testování s průměrným skóre bodnutí špendlíkem 1,70 (± 0,31). V osmém dnu všechna zvířata reagovala alespoň jedenkrát na stimulaci bodnutím špendlíkem s průměrným skórem 2,40 (±0,22) a všechny 3 reakce byly normální u poloviny zvířat. S ohledem na kumulativní skóre získané průměrné skóre získané v osmém dnu 17,70 (± 1,92) představovalo 65,5' celkového skóre.

Tato série experimentů ukazuje, že jedna subplantární injekce enovinu je schopná snížit senzorické deficity vyvolané taxolem, jak je měřeno pomocí testu bodnutí špendlíkem. Aktivita je patrná, je-li lék aplikován před a po taxolu.

Enovin je možným kandidátem pro bolestivé syndromy s převažující periferní a centrální neurogenní komponentou, pro revmatická/zánětlivá onemocnění, stejně tak jako pro poruchy vodivosti, a může hrát modulační roli v senzorických procesech po transdermální, topické, lokální, centrální (jako je například epidurální, intrathekální, a podobně), a systémové aplikaci.

Dále je enovin užitečný jako diagnostický prostředek pro vyhledávání patofyziologických změn v oblastech zmíněných výše.

• · · ·

Srovnáni exprese mRNA Enovinu v normální versus nemocné tkáni

Exprese mRNA Enovinu byla kvantitativně analyzována za použití systému ABI Prism 7700 Sequence Detection Systém (TaqMan, Perkin Elmer) s příslušnou technologií vyvinutou a prováděnou v laboratořích Pharmagene Laboratories Ltd., Royston, Spojené království. Systém používá fluorogenní próbu ke generaci pro sekvenci specifických fluorescenčních signálů během PCR. Próba je oligonukleotid s připojeným fluorescenčním reportérem a zhášečem barevné reakce, která je umístěna mezi předním a reverzním primerem. Je-li intaktní, je intenzita reportérové fluorescence potlačena zhášečem. Pokud tvoří próba část replikačního komplexu, je fluorescenční reportér odštěpen od zhášeče pomocí 5' do 3' exonukleázové aktivity obsažené v Taq polymeráze. Zvýšení fluorescenčního reportérového signálu v reakci je přímým důsledkem akumulace PCR produktu. Počet výchozích kopií mRNA cílové sekvence (Cn) je stanoven určením PCR cyklu (Ct), v kterém je PCR produkt poprvé detekován - bod, při kterém fluorescenční signál přesahuje prahovou hodnotu. Kvantifikace množství cílové mRNA v každém vzorku je stanovena pomocí srovnání experimentálních Ct hodnot se standardní křivkou.

Příprava RNA a kontrola kvality

Celková RNA byla izolována z celé a rozdělené tkáně činidla Tri-Zol (Life Technologies, Gaithersburg, MD, za použití

USA) podle protokolu dodavatele. Postupy na kontrolu kvality pro všechny vzorky RNA zahrnovaly posouzení integrity (intaktní 18S a 28S ribozomální RNA) a určení přítomnosti transkriptů ve vysokém nadbytku (aktin) a méně se vyskytujících transkriptů (transferinový receptor).

Navržení primeru/próby

Pár primerů a TaqMan próba byly navrženy k amplifikaci specifické sekvence z Enovinu

Primer 1: 5' ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3'

Primer 3: 5' TGCTGCCGACCCACG 3'

Próba 5: 5'CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3'

Navíc byly navrženy pár primerů a próba TaqMan, které přesahují intron a amplifikují část lidského genu GAPDH • · · · • ·

Primer 2:

5' CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3'

Primer 4 :

5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3'

Próba 6:

5' TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT 3'

Próba 5 je označena pomoci fluor FAM, zatímco próba 6 je označena pomocí fluor VIC.

Štěpení celkové RNA DNázou

V každé testované tkáni bylo natráveno 2,2 ug celkové RNA pomocí 2 jednotek DNázy bez RNázy (Gibco BRL) po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve 20 ul objemu lx pufru s DNázou. Reakce byla zastavena přidáním 2 ul 25 mM roztoku s EDTA. Vzorky byly poté inkubovány při teplotě 65°C po dobu 10 minut za účelem inaktivace enzymu.

Syntéza prvního vlákna cDNA

Pro každou testovanou tkáň bylo použito 100 ng celkové RNA jako templát pro syntézu prvního vlákna cDNA. RNA v objemu 4 ml a v přítomnosti 50 nM primerů 1 a 2, 1 x PCR pufru II (Perkin Elmer) a 5 mM MgCl₂ bylo zahříváno na 72°C po dobu 5 minut a pomalu ochlazeno na teplotu 55°C. Po přidání všech dalších činidel bylo 6 ml reakční směsi inkubováno při teplotě 48°C po dobu 30 minut s následným krokem inaktivace enzymu při teplotě 90°C po dobu 5 minut. Finální reakční podmínky byly následující: 1 x PCR pufr II, 5 mM MgCl₂, 1 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 12,5 jednotek MuLV reverzní trankriptázy (Gibco BRL) .

PCR amplifikace prvního vlákna cDNA cDNA odvozená ze 100 ng celkové RNA každého vzorku byla podrobena PCR amplifikaci v jedné reakci za účelem identifikace cílového i GAPDH transkripu. Finální koncentrace primeru/próby pro cílový transkript byly 300 nM primeru 1, 300 nM primeru 3 a 200 nM próby 5, pro GAPDH transkript to bylo 20 nM primeru 2, 20 nM primeru 4 a 100 nM próby 6. Finální koncentrace dalších činidel v reakci byla 4,5% glycerolu, lx TaqMan pufr A (Perkin Elmer), 6,25 MgCl₂, 430 M dATP, dUTP, dGTP, dCTP, 2,5 jednotek AmpliTaq Gold. PCR amplifikace byla provedena v sekvenčním detekčním systému ABI 7700, úvodní krok • · · ·

• · aktivace enzymu při teplotě 94°C po dobu 12 minut byl následován 45 cykly při teplotě 94°C po dobu 15 sekund, 60°C po dobu 1 minuty (minimální čas) .

Testované nemoci a tkáně

Exprese mRNA Enovinu byla porovnána v tkáních odvozených od nemocných pacientů a normálních kontrolních jedinců (Obrázky 25 a 26). Níže uvedená tabulka ukazuje nemoci a odpovídající tkáně, které byly zkoumány. Pro každé onemocněni byly analyzovány 3 vzorky od nemocných pacientů a 3 kontrolní vzorky.

Patologie	Tkáň 1	Tkáň2	Tkáň 3
Alzheimerova nemoc	Temporální kůra	Hipokampus	Okcipitální kůra
Roztroušená skleróza	Mícha	Periventrikulární bílá hmota	Mozeček
Parkinsonova nemoc	Substantia nigra	Putamen	Mozeček
Nádorové onemocněni	Adenokarcinom tlustého střeva	Duktální adenokarcinom prsu	Dlaždicobuněčný karcinom plic

Statistická analýza

Pro každou skupinu 3 tkání byl vypočítán průměr a směrodatrná odchylka Ct hodnot (které jsou normálně rozloženy) a byly poté přeměněny na Cn hodnoty podle vzorce Cn = 10 ^{1 (Ct}'-⁴⁰⁰'^{1 /_3}' ^{62 3} . Analýza variace (ANOVA) byla také provedena pro Ct hodnoty za účelem srovnání průměrných hodnot exprese mRNA Enovinu u normálních versus nemocných tkání.

Obrázky 25 a 26 ukazují průměrné počty kopií mRNA Enovinu (± SD, n = 3) u nemocných versus kontrolních tkání. Statistická analýza ukázala signifikantní zvýšení exprese Enovinu v periventrikulární bílé hmotě pacientů s roztroušenou sklerózou (p = 0,013). Vnitřní GAPDH kontrola nevykázala signifikantní rozdíl (p = 0,79). Ačkoli exprese Enovinu v periventrikulární bílé hmotě je dosti nízká v normální tkáni (270 kopií na 100 ng celkové RNA versus 200000 kopií GAPDH, je u pacientů s roztroušenou sklerózou exprese třikrát vyšší (825).

Pouze jedna další nemocná tkáň vykázala signifikantní rozdíl od normálních kontrol: u duktálního adenokarcinomu prsu je exprese mRNA

Enovinu 6 krát vyšší (6000 versus 1000, p= 0,007), ale GAPDH kontrolní hodnota je také významně zvýšena (165000 versus 44000, p = 0,03), což pravděpodobně reprezentuje celkové zvýšení koncentrace mRNA.

• · · · • ·

Závěrem lze říci, že jsme nalezli zvýšenou expresi mRNA Enovinu v periventrikulární bílé hmotě pacientů s roztroušenou sklerózou.

Použití ELISA testu založeném na fosfospecifické protilátce pro vyhledávání enovinového mimetika na receptorovém komplexu GFRa3/cRET.

Způsob může být také použit pro identifikaci agonisty nebo antagonisty jiných neurotroflnových receptorů, jako jsou GFRal, GFRa2, GFRa4, TrKA, TrKB a TrKC.

Test

Za použití tohoto testu můžeme identifikovat agonistické nebo antagonistické sloučeniny neurotrofických růstových faktorů měřením aktivace klíčových signálních kináz aktivovaných v neurotrofické dráze, nebo měřením aktivace cRET receptorové kinázy. Aktivace je měřena detekci množství fosforylované kinázy nebo receptorové kinázy za použití fosfo-specifických protilátek. Použijeme NUH 3T3 buňky exprimující přechodně nebo trvale TrkA, TrkB, TrkC, GFRal/cRET, GFRa2/cRET, GFRa3/cRET nebo GFRa4/cRET. Aktivace p42/p44 MAP kinázy, PKB kinázy, c-jun, CREB, JNK/SAPK kinázy a dalších kináz je detekována za použití komerčně dostupných fosfo-specifických protilátek. Navíc, aktivace cRET může být odstraněna za použití fosfo-specifické cRET protilátky.

Protokol byl použit následujícím způsobem:

Umístěte NIH 3T3 buňky do 96 jamek v 10% telecím séru, buňky musí z 80% splývat před stimulací

Další den nahraďte médium médiem bez séra a ponechejte buňky bez živin po dobu 18-24 hodin.

Po této době stimulujte buňky sloučeninami a neurotrofickými faktory, které slouží jako pozitivní kontrola (10 ng/ml pro neurotrofické faktory).

Fixujte buňky 4% formaldehydem v PBS při teplotě 4°C po dobu 20 minut.

Promývejte buňky	3x	200	ul	PBS/0,1%	Tritonu po	dobu	5	minut.
Potlačte růst buněk	100	ul	0,6% H₂O₂	v PBS/0,1%	Tritonu po dobu 20
minut.
Promývejte buňky	3x	200	ul	PBS/0,1%	Tritonu po	dobu	5	minut.

• ·

Blokujte buňky 100 ul 10% fétálniho telecího séra v PBS/0,1% Tritonu po dobu 60 minut.

Inkubujte buňky s fosfo-specifickou protilátkou v 50 ul 5% BSA/PBS/0,1% Tritonu přes noc při teplotě 4°C. Ředění protilátek by mělo být určeno experimentálně, navrhované rozmezí je 1:1001:250.

Promývejte buňky 3x 200 ul PBS/0,1% Tritonu po dobu 5 minut.

Inkubujte se sekundární protilátkou vázanou k HRP, ředění 1:100 v 50 ul 5% BSA/PBS/0,1% Triton po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.

Promývejte buňky 3x 200 ul PBS/0,1% Tritonu po dobu 5 minut.

Rozpusťte 1 tabletu OPD (Sigma) v 25 ml pufru (3,65 g kyseliny citrónové-H₂0 a 5,9 g Na₂HPO₄-2H₂O v 0,5 1 H₂O, pH 5,6) a přidejte 12,5 ul H₂O₂. Přidejte 50 ul do každé jamky a inkubujte po dobu 15 minut na třepačce (200 otáček za minutu) , přikryté alobalem.

Zastavte reakci 25 ul H₂SO₄.

Změřte OD._15f!_6₅o na ELISA readeru.

Mezencefalická neuronální dopaminergní neuronální kultura

Neuronální kultura

Neuronální kultury byly připraveny z ventrálního mezencefalon fetální krysy pomocí enzymatické a mechanické disperze. Tkáň byla sbírána, promyta v ledovém fosfátovém pufru bez Ca²⁺ a Mg²⁺obsahujícím 0,6% glukózu (PBSG) a inkubována po dobu 30 minut s PBSG obsahujícím 0,1% trypsin při teplotě 37^c,C. Buněčná suspenze byla umístěna v hustotě 2,5 10⁵ buněk/cm² do 96 jamkových destiček pro tkáňové kultury NUNC. Kultivační destičky byly předem potaženy polyL-ornitinem a CDM obsahujícím 10% fetální telecí sérum.

Kultury byly udržovány v chemicky definovaném médiu (CDM)

Dulbecovým modifikovaným Eagles médiem suplementovaným glukózou (0,6%), glutaminem tvořeném směsí 1:1 a F12 Nutrient (2mM), bikarbonátem sodným (3mM), HEPES (5mM), inzulínem (25 ug/ml), lidským transferinem (100 ug/ml), putrescinem (60 ug/ml). Selenitem sodným (30 nM), streptomycinem (100 ug/ml) a penicilinem (100 IU/ml).

Léčba neurotrofickými faktory

Neurotrofiny byly rozpuštěny v 0,5% bovinním sérovém albuminu jako zásobní roztok. Neurotrofiny byly přidány 3 hodiny po úvodním ·· »·»· umístěni a po 5 dnech v kultuře. Stejné množství 0,5% bovinního sérového albuminu bylo přidáno do kontrolních jamek.

Vysoceafinitni vychytáváni dopaminu

Vychytávání dopaminu bylo měřeno po 10 dnech. Pro vychytávání byly buňky dvakrát promyty předem zahřátým PBS (5 mM), askorbovou kyselinou (100 mM) a preinkubovány 10 minut se stejným roztokem, nahrazen stejným roztokem obsahujícím 50 po dobu rychlými inkubací pokračovala zastaveno 3 byl uvolněn pokojové scintilační minut při teplotě promytími ledovým PBS.

s okyseleným teplotě. Radioaktivita tekutiny (Packard etanolem

Po byla určena ultima gold suplementovaným glukózou pargylinem (100 mM) , a Preinkubační roztok byl nM (³H)DA a inkubace 37°C. Vychytávání bylo Akumulovaný (³H)dopamin dobu po

MV) minut při přidání 4 ml za použití scintilačního počítače Packard. Nespecifické vychytávání bylo určeno přidáním 20 uM kokainu.

Tabulka 4. Účinek enovinu na vychytávání (³H)dopaminu

Léčba	Procento kontrol vychytávání (³H) dopaminu	n
Kontrola	100	5
Enovin 300 ng/ml	111	4
Enovin 1000 ng/ml	127	5
Enovin 2000 ng/ml	152	5
Enovin 4000 ng/ml	161	1
Enovin 10000 ng/ml	165	2

Buňky byly ponechány růst po dobu 10 dnů v přítomnosti nebo v nepřítomnosti enovinu. Neléčené kontroly byly brány jako 100%. Výsledky jsou získány z 1-5 nezávislých experimentů.

Reference

Altshul, S.F., Gish,W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J.

(1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 413410.

Angrist, M., Bolk, S., Halushka, M., Lapchak, P.A., Chakravarti, A. (1996). Germline mutations in glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and RET in Hirschprung disease patient. Nátuře Genetics 14, 341-344.

Baloh, R.H., Tansey, M.G., Golden, J.P., Creedon, D.J., Heuckeroth, R.O., Keck, C.L., Zimonjic, D.B., Popescu, N.C., Johnon, E.M., Milbrandt, J. (1997) TrnR2, a novel receptor that mediates neurturin and GDNF signaling through Ret. Neuron 18, 793-802.

Baloh, R.H., Gorodinsky, A., Golden, J.P., Tansey, M.G., Keck, C.L., Popescu, N.C., Johnson, E.M., Milbrandt, J. (1998) GFRa.3 is an orphan member of the GDNF/neurturin/persephin receptor family. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, 5801-5806.

Barr, P.J. (1991) Mamalian subtilisins: the long-sought dibasic processing endoproteases. Cell. 66, 1-3.

Beck, K.D., Valverde, J., Alexi, T., Poulsen, K. , Moffat, B., Vandlen, RA. , Rosenthal, A., Hefti, F. (1995) Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brain. Nátuře 373, 339-341.

Bilang-Bleuel, A., Revah, F. , Colin, P., Locquet, I., Ropbert J.J., Mallet, J. , Horellou, P. (1997) Intrastriatal injection of an adenoviral vector expressing glial-cell-line-derived neurotrophic factor prevents dopaminergic neuron degeneration and behavioral impairment in a rat model of Parkinson disease. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 8818-8823.

Buj-Bello, A., Buchman, V.L., Horton, A., Rosenthal, A., Davies A.M. (1995) GDNF is an age-specific survival factor for sensory and autonomie neurons. Neuron 15, 821-828.

Buj-Bello, A., Adu, J. , Pinon, L.G.P., Horton, A., Thompson, J., Rosenthal, A., Chinchetru, M., Buchman, V.L., Davies, A.M. (1997)

Neurturin responsiveness requires a GPI-linked receptor and the Ret receptor tyrosine kinase. Nátuře 387, 721-724.

Choi-Lundberg, D.L., Lín, Q., Chang, Y.N., Chiang, Y.L., Hay, C.M., Mohajeri, H., Davidson, B.L., Bohn, M.C. (1997). Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy. Science. 275, 838-841.

Creedon, D.J., Tansey, M.G., Baloh, R.H., Osborne, P.A., Lampě, P.A., Fahrner, TJ. , Heuckeroth, R.O., Milbrandt, J., Johnson, E.M. (1997) Neurturin shares receptors and signál transduction pathways with glial cell line-derived neurotrophic factor in sympathetic neurons. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 7018-7023.

Durbec, P., Marcos-Gutierrez, C.V., Kilkenny, C., Grigoriou, M., Wartowaara, K. , Suvanto, P., Smith, D., Ponder , B., Constantini, F., Saarma, Μ. , Sariola, H., Pachnis, V. (1996) GDNF signalling through the RET receptor tyrosine kinase. Nátuře 381, 789-793.

Edery, P., Lyonnet, S., Mulligan, L.M., Pelet, A., Dow., E., Ábel, L., Holder S., Nihoul-Fekete, C., Ponder, B.A., Munnich, A. (1994) Mutations of the RET proto-oncogene in Hirschprung's disease. Nátuře 367, 378-380.

Gash, D.M., Zhang, Z., Ovadia, A., Cass., W.A., Yi, A., Simmerman, L., Russell, D., Martin, D., Lapchak, P.A., Collins, F., Hoffer, B.J., Gerhardt, G.A. (1996) Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF. Nátuře 380, 252-255.

GFRa Nomenclature Committee (1997) Nomenclature of GPI-linked receptors for the GDNF ligand family. Neuron 19, 485.

Hakim A Ischemic penumbra: the therapeutic window. Neurology. 1998 Sep, 51, (3 Suppl 3): S44-6.

Henderson, C.E. Phillips, H.S., Pollock, R.A., Davies, A.M., Lemeulle, C., Armamini, Μ. , Simmons, L., Moffet, B., Vandlen, R.A., Koliatsos, V.E., Rosenthal, A. (1994) GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266, 1062-1064.

• ·

Heng, H.H.Q., Squire, J., Tsui, L.C. (1992) High resolution mapping of mammalian genes by in šitu hybridization to free chromatin. Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 89, 9509-9513.

Heng, H.H.Q., tsui, L.C. (1993) Modes of DAPI banding and simultaneous in šitu hybridization. Chromosoma 102, 325-332.

Heuckeroth, R.O., Koztzbauer, P., Copeland, N.G., Gilbert, D.J., Jenkins, N.A., Zimonjic, D.B., popescu, N.C., Johnson, E.M., Milbrandt, J. (1997) Neurturin, a novel neurotrophic factor is localized to mouše chromosome 17 and human chromosome 19pl3.3. Genomics 44, 137-140.

Jing, S., Wen, D., Yu, Y. , Holst, P.L., Luo, Y., Fang, M., Tamir, R., Antonio, L., Hu, Z., Cupples, R., Louis, J.C., Hu, S., Altrock, B.W., Fox, G.M. (1996) GDNF-induced activation of the ret protein tyrosine kinase is mediated by GDNF-α, a novel receptor for GDNF. Cell 85, 1113-1124.

Jing, S., Yu, Y. , Fang, M., Hu, Z., Holst. P.L., Boone, T. , Delaney, J., Schultz, H., Zhou, R., Fox, G.M. (1997) GFRa-2 and GFRa-3 are two new receptors for ligands of the GDNF family. J. Biol. Chem. 272, 33111-33117.

Kingsley, D.M. (1994) The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes and Development 8, 133-146.

Klein, R.D., Sherman, D., Ho, W.H., Stone, D., Bennet, G.L., Moffat, B., Vandlen, R., Simmons, L., Gu, Q. , Hongo, J.A., Devaux, B., Poulsen, K., Armanini, M., Nozaki, C., Asai, N., Goddard, A., Phillips,H., Henderson, C.E., Takahashi, M., Rosenthal, A. (1997) A GPI-linked protein that interacts with Ret to form a candidate neurturin receptor. Nátuře 387, 717-721.

Kotzbauer, P.T.,

Lampě,

P.A.,

Heuckeroth,

R.O. ,

Golden, J.P.,

Creedon, D.J.,

Johnson,

E.M. ,

Milbrndt,

J. (1996) Neurturin, relative of glial-cell-line-derived neurotrophic factor. Nátuře 384, 467-470.

Lin, L.F.H., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S., Collins, F. (1993) GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260, 1130-1132.

• · • · · ·

Mandel, R.J., Spratt, S.K., Snyder, R.O., Leff, S.E. (1997) Midbrain injection of recombinant adeno-associated virus encoding rat glial cell line-derived neurotrophic factor protects nigral neurons in a progressive 6-hydroxydopamine-induced degeneration model of Parkinson's disease in rats. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1408314088.

Marsden et al. The causes of Parkinson's disease are being unraveled and rational neuroprotective therapy is close to reality Ann Neurol. 1998, Sep. 44 (3 Suppl. l):S189-96

Masure, S., Cik, M., Pangalos, M.N., Bonaventure, P., Verhaasselt, P., Lesage, A.S., Leysen, J.E., Gordon R.D. (1998) Molecular cloning, expression and tissue distribution of glial-cell-linederived neurotrophic factor family receptor a-3 (GFRa-3). Eur. J. Biochem. 251, 622-630.

Matsushita, N., Fujita, Y., Tanaka, M., Nagatsu, T., Kiuchu, K. (1997) Cloning and structural organization of the gene encoding the mouše glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF. Gene 203, 149-157.

Milbrandt, J., de Sauvage, F.J., Fahrner, TJ., Baloh, R.H., Leitner, M.L., Tansey, M.G., Lampě, P.A., Heuckeroth, R.O., Kotzbauer, P.T., Simburger, K.S., Golden, J.P., Davies, J.A., Vejsada, R. , Kato, A.C., Hyneš, M., Sherman, D., Nishimura, M., Wang, L.C., Vandlen, R., Moffat, B., Klein, R.D., Poulsen, K. , Gray, C., Garces, A., Henderson, C.E., Phillips, H.S., Johnson, E.M. Jr. (1998) Persephin, a novel neurotrophic factor related to GDNF and neurturin. Neuron 20, 245-253.

Moore, M.W., Klein, R.D., Farinas, I., Saer, H., Armanini, M., Phillips, H., Reichardt, L.F., Ryan, A.M., Carver-Moore, K., Rosenthal, A. (1996) Renal and neronal abnormalities in mice lacking GDNF. Nátuře 382, 76-79.

Mont, H.T., Dean, D.O., Alberch, J., Dreyfs, C.F., Black, I.B. (1995) Glial cell line-derived neurotrophic factor promotes the survival and morphologic differentiation of Purkinje cells. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 9092-9096.

• · • · * · • · • · · f

the

Shen, pathophysiology of

L.

Wes

H.

Nagy Z et al. The cell division cycle ; Alzheimer's disease. Neuroscience. 1998 D

Naveilhan, P., Baudet, C., Mikaels, A.,

Ernfors, P. (1998) Expression and regulation of GFRa-3, a glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, 1295-1300.

Nuydens, R., Dispersyn, G. , Van den Kienboom G., De Jong M., Connors R. , Ramaekers F., Borgers M. , Geerts H. Bcl-2 protects neuronal cells against taxol-induced apoptosis by inducing multi-nucleation, zasláno k publikaci.

Oppenheim, R.W., Houenou, L.J., Johnson, J.E., Lin, L.F., Li, L., Lo, A.C., Newsom, A.L., Prevette, D.M., Wang, S. (1995) Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by GDNF. Nátuře 373, 344-346.

Pichel, J.G., Shen, L., Sheng, H.Z., Granholm, A.C., Drago, J., Grinberg, A., Lee, E.J., Huang, S.P., Saarma, M. , Hoffer, B.J., Sariola, H., Westphal, H. (1996) Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nátuře 382, 73-76.

Romeo, G., Ronchetto, P., Luo, Y. , Barone, V., Seri, M., Cecherini, I., Pasini, B., Bocciardi, R., Lerone, M., Kaariainen, H, et al. (1994) Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RET protooncogene in Hirschprung's disease. Nátuře 367, 377-378.

Sanchez, M.P., Silos-Santiago, I., Frisen, J., He, B., Lira, S.A., Barbacid, M. (1996) Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice laking GDNF. Nátuře 382, 70-73.

Sanicola, M. , Hession, C. , Worley, D., Carmillo, P., Ehrenfels, C., Walus, L., Robinson, S., Jaworski, G., Wei, H., Tizard, R., Whitty, A., Pepinsky, R.B., Cate, R.L. (1997) Glial cell line-derived neurotrophic factor-dependent RET activation can be mediated by two different cell-surface accessory proteins. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 6238-6243.

Smirnova et al. Thrombin is an extracellular signál that activates intracellular death protease pathways inducing apoptosis in model motor neurons. J Neurobiol. 1998 Jul, 36(1):64-80.

• · ·

Srinivisan et al Sérum from patients with type 2 diabetes with neuropathy induces complement-independent, calcium-dependent apoptosis in cultured neuronal cells. J. Clin. Invest. 1998, Oct 1,

102(7):1454-62.

Steger. An unbiased detector of curvilinear structures IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence, 20, 2, 113-125 (1998).

Suvanto, P., Wartovaara, K. , Lindahl, M. , Arumáe, U., Mosnyakov, M., Horelli-Kuitunen, N., Airaksinen, M.S., Palotie, A., Sariola, H., Saarma, M. (1997) Cloning, mRNA distribution and chromosomal localisation of the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor receptor β, a homologue to GDNFRa. Human Mol. Genet. 6, 12671273.

Tomac, A., Lindquist, E., Lin, L.F., Ogren, S.O., Young, D., Hoffer, B.J., Olson, L. (1995) Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic systém by GDNF in vivo. Nátuře 373, 335-339.

Treanor, J.J.S., Goodman, L., de Savage, F., Stone, D.M., Poulsen,

K.T., Beck, C.D., Gray, C., Armanini, M.P., Pollock, R.A., Hefti, F., Phillips, H.S., Goddard, A., Moore, M.W., Buj-Bello, A., Davies, A.M., Asai, N., Takahashi, M., Vandlen, R. , Henderson, C.E., Rosenthal, A. (1996) Characterization of a multicomponent receptor for GDNF. Nátuře 382, 80-83.

Trupp, M., Arenas, E., Fainzilber, M., Nilsson, A.S., Sieber, B.A., Grigoriou, M., Kilkenny, C., SalazarGrueso E., Pachnis, V., Arumáe, U., Sariola, H., Saarma, M., Ibanez, C.F. (1996) Functional receptor for GDNF encoded by the c-ret proto-oncogene. Nátuře 381, 785-788.

Wellington et al. Toward understanding the molecular pathology of Huntigton's disease. Brain Pathol. 1997 Jul, 7(3): 979-1002.

Widenfalk, J., Nosrat, C., Tomac, A., Westphal, H., Hoffer, B., Olson, L. (1997). Neurtutin and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor-β (GDNFR-α), novel proteins related to GDNF a GDNFRa with specific cellular patterns of expression suggesting roles in the developing and adult nervous systém and in peripheral organs. J. Neurosci. 17, 8506-8519.

Widenfalk, J., Tomac, A., Lindquist, E., Hoffer, B., Olson, L., (1998) GFR-a3, a protein related to GFR-al, is expressed in developing peripheral neurons and ensheating cells. Eur. J.

Neurosci. 10, 1508,-1517.

Worby, C.A., Vega, Q.C., Zhao, Y. , Chao, H.H.J., Seasholtz, A.F., Dixon, J.E. (1996) Glial cell line derived neurotrophic factor signals through the RET receptor and activates mitogen-activated protein kinase. J. Biol. Chem. 271, 23619-23622.

Worby, C.A., Vega, Q.C., Zhao, Y., Chao, H.H.J., Seasholtz, A.F., Thompson, R.C., Dixon, J.E. (1998) Identitication and characterization of GFR-a3, a novel co-receptor belonging to the glial cell line-derived neurotrophic receptor family. J. Biol. Chem. 273, 3502-3508.

Yan, Q., Matheson, C., Lopez, O.T. (1995) In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons. Nátuře 373, 341-344.

• · • · · ·

Seznam zkratek

BLAST vyhledávací nástroj pro základní lokální srovnání (basic local alignment search tool) bp páry baží cDNA komplementární DNA

CNS centrální nervový systém

EST exprimovaná sekvence tag

EVN enovin

GDNF glial cell-line derived neurotrophic factor

GFRa receptor a z rodiny GDNF

GPI glykosyl fosfatidyl inositol

MTC cDNA z mnoha tkání

NTN neurturin

PCR polymerázová řetězová reakce

PNS periferní nervový systém

PSP persefin

RT-PCR PCR s reverzní transkripcí

TGF-β transformující růstový faktor β

FISH fluorescenční in šitu hybridizace

MTN northern z mnoha tkání

NGF nervový růstový faktor

SPR povrchová plazmonová rezonance • · • · · • · · · * · · • · • · · • · · · · · • · · · · · • · • · • · · · • · · · • · · · · · • · • * • · · ·

PATENTOVÉ

Claims

NÁROKY

Izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduj ící lidský neurotrofický růstový faktor pod názvem enovin a mající aminokyselinovou sekvenci zobrazenou na Obrázku 1, nebo kódující funkční ekvivalent, derivát nebo bioprekurzor řečeného růstového faktoru.

Molekula nukleové kyseliny podle patentového nároku 1, která je molekulou DNA.

Molekula nukleové kyseliny podle patentového nároku 1 nebo 2, která je molekulou cDNA.

Molekula nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 3 mající sekvenci nukleové kyseliny od pozice 81 do pozice 419 sekvence ilustrované na Obrázku 1.

Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 5 mající sekvenci nukleové kyseliny odpovídající sekvenci jakékoli sestřihové varianty určené pozicí od 5'-l do 3'-l nebo 3'-2, nebo od 5'-l nebo 5'-2 do 3'-2 nebo 3'-3 sekvence ilustrované na Obrázku 21.

Molekula nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 5 mající sekvenci nukleové kyseliny ilustrovanou na Obrázku 1 nebo 21, nebo sekvenci schopnou vazby k výše uvedené sekvenci za přísných podmínek.

Antikomplementární molekula schopná hybridizace s molekulou nukleové kyseliny definované v jakémkoli z patentových nároků 1 až 6 za přísných podmínek.

Izolovaný lidský neurotrofický růstový faktor kódovaný molekulou nukleové kyseliny, jak je definováno v jakémkoli z patentových nároků 1 až 6.

Růstový faktor podle patentového nároku 8 obsahující aminokyselinovou sekvenci od pozice 27 do pozice 139 aminokyselinové sekvence ilustrované na Obrázku 1, nebo funkční ekvivalent, derivát nebo bioprekurzor řečeného růstového faktoru.

Růstový faktor podle patentového nároku 8 nebo 9 obsahující aminokyselinovou sekvenci ilustrovanou na Obrázku 1, nebo funkční ekvivalent, derivát nebo bioprekurzor řečeného růstového faktoru.

Růstový faktor podle patentového nároku 8 obsahující aminokyselinovou sekvence ilustrované na Obrázku 23 nebo 24.

Expresní vektor obsahující molekulu DNA podle jakéhokoli z patentových nároků 2 az 6.

• · · · • · ·· · · · ·** * ..... ·· ···

Expresní vektor obsahující antikomplementární molekulu podle patentového nároku 7.

Expresní vektor podle patentového nároku 12 nebo 13 obsahující dále sekvenci nukleové kyseliny kódující reportérovou molekulu.

Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná vektorem podle jakéhokoli z patentových nároků 12 až 14.

Hostitelská buňka podle patentového nároku 15, kterážto buňka je eukaryotická nebo bakteriální buňka.

Transgenní buňka, tkáň nebo organismus obsahující transgen schopný exprese lidského neurotrofického faktoru enovinu podle jakéhokoli z patentových nároků 8 až 11.

Transgenní buňka, tkáň nebo organismus podle patentového nároku 17, kde řečený transgen zahrnuje vektor podle jakéhokoli z patentových nároků 12 až 14.

Neurotrofický růstový faktor nebo jeho funkční ekvivalent, derivát nebo bioprekurzor exprimovaný buňkou podle jakéhokoli z patentových nároků 15 až 18.

Neurotrofický růstový faktor nebo jeho funkční ekvivalent, derivát nebo bioprekurzor exprimovaný transgenní buňkou, tkání nebo organismem podle patentového nároku 17 nebo 18.

Použití molekuly nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 6 ve výrobě léku pro léčbu nebo prevenci jedinců s nervovými poruchami.

Použití podle patentového nároku 21, kde řečená nervová porucha je vybrána ze skupiny obsahující Parkinsonovu nemoc, Alzheimerovu nemoc, neuronální poruchy spojené s rozšířenými polyglutaminovými sekvencemi, jako je například Huntingtonova nemoc, periferní neuropatie, akutní poškození mozku, nádory nervového systému, roztroušená skleróza, amyotrofická laterální skleróza, poškození periferních nervů, poškození v důsledku expozice neurotoxinům, mnohočetné endokrinní nádory, familiární Hirschprungova nemoc, nemoci spojené s priony, Creutzfeld-Jacobova nemoc, mozková mrtvice, bolestivé syndromy s významnou periferní nebo centrální neurogenní komponentou, revmatická/zánětlivá onemocnění, stejně tak jako poruchy vodivosti.

Použití neurotrofického růstového faktoru podle jakéhokoli z patentových nároků 8 až 11 ve výrobě léku pro léčbu nebo prevenci nervových poruch.

Použití podle patentového nároku 22, kde řečená nervová porucha je vybrána ze skupiny obsahující Parkinsonovu nemoc, Alzheimerovu • · · · nemoc, neuronální poruchy spojené s rozšířenými polyglutaminovými sekvencemi, jako je například Huntingtonova nemoc, periferní neuropatie, akutní poškození mozku, nádory nervového systému, roztroušená skleróza, amyotrofická laterální skleróza, poškození periferních nervů, poškození v důsledku expozice neurotoxinům, mnohočetné endokrinní nádory, familiární Hirschprungova nemoc, nemoci spojené s priony, Creutzfeld-Jacobova nemoc, mozková mrtvice, bolestivé syndromy s významnou periferní nebo centrální neurogenní komponentou, revmatická/zánětlivá onemocnění, stejně tak jako poruchy vodivosti.

25. Farmaceutický preparát obsahující molekulu nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 6 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředící nebo excipientní látkou.

26. Farmaceutický preparát obsahující růstový faktor podle jakéhokoli z patentových nároků 8 až 11 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředící nebo excipientní látkou.

27. Použití antikomplementární molekuly podle patentového nároku 7 ve výrobě léku pro léčbu nebo prevenci nervových poruch zprostředkovaných zvýšenou expresí nebo zvýšenou aktivitou enovinu.

28. Použití podle patentového nároku 27, kde nervová porucha je vybrána ze skupiny obsahující Parkinsonovu nemoc, Alzheimerovu nemoc, neuronální poruchy spojené s rozšířenými polyglutaminovými sekvencemi, jako je například Huntingtonova nemoc, periferní neuropatie, akutní poškození mozku, nádory nervového systému, roztroušená skleróza, amyotrofická laterální skleróza, poškození periferních nervů, poškození v důsledku expozice neurotoxinům, mnohočetné endokrinní nádory, familiární Hirschprungova nemoc, nemoci spojené s priony, Creutzfeld-Jacobova nemoc, mozková mrtvice, bolestivé syndromy s významnou periferní nebo centrální neurogenní komponentou, revmatická/zánětlivá onemocnění, stejně tak jako poruchy vodivosti.

29. Protilátka schopná vazby k růstovému faktoru podle jakéhokoli z patentových nároků 8 až 11 nebo k jeho epitopu.

30. Způsob detekce přítomnosti růstového faktoru ve vzorku, kterýžto způsob zahrnuje reakci protilátky podle patentového nároku 29 s řečeným vzorkem, a detekci jakékoli vazby řečené protilátky s řečeným růstovým faktorem.

• «

Způsob podle patentového nároku 30, kde řečená protilátka je konjugována s reportérovou molekulou.

Souprava nebo zařízení růstového faktoru ve patentového nároku 29, a a řečeného vzorku.

pro detekci přítomnosti neurotrofického vzorku obsahujícím protilátku podle pro reakci’ řečené protilátky prostředek

Způsob identifikace neurotrofického růstového nebo kontakt agonisty faktoru, buněčné tkáně nebo organismu kde antagonisty řečený způsob exprimuj icich kandidátní sloučeninou lidského řečeného růstového faktoru s řečeného řečené růstového faktoru, buňce, tkáni, nebo a srovnání hladin zahrnuj e receptor.

v přítomnosti aktivace RET organismu s kontrolou, kontaktu s řečenou kandidátní sloučeninou.

která nebyla

Způsob identifikace agonisty nebo neurotrofického růstového faktoru, kde kontakt buněčné tkáně nebo organismu receptor řečeného růstového faktoru sloučeninou v přítomnosti řečeného hladiny aktivace signální kinázy v v které řečený příslušný receptor je protilátky specifické pro řečenou s reportérovou molekulou, ve organismem, které nebyly sloučeninou.

antagonisty řečený způsob exprimuj icich lidského zahrnuj e příslušný a cRET s kandidátní růstového faktoru, měření ignálni transdukční dráze, ložkou, která je po přidání ignálni kinázu v kontaktu buněčnou s řečenou konj ugována tkání, nebo kandidátní

Způsob podle patentového neurotrofický růstový faktor

Způsob podle jakéhokoli z řečená buněčná tkáň nebo organismus jsou HIH 3T3

Způsob podle nároku 33 je enovin. patentových nebo

34, kde řečený nároků až

35, kde jakéhokoli z patentových nároků buňky.

až

36, kde řečený receptor je jakýkoli z receptorú GFRal, GFRa2, GFRa3 nebo

GFRa4.

jakéhokoli z patentových nároků 34 k jakékoli p42/p44 c-jun, CREB, JNK/SAPIC kináze.

až 37, MAP kináze, kde

Způsob podle řečená protilátka je specifická

PKB kináze,

Sloučenina identifikovaná jako agonista nebo podle způsobů z jakéhokoli z patentových nároků Použití jakékoli sloučeniny identifikované jako až jako antagonista

38.

antagonista podle patentového nároku 39, molekuly nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 7, nebo neurotrofického růstového faktoru podle jakéhokoli z patentových nároků 8 až 11 • ♦ · · · · ve výrobě léku pro léčbu nebo prevenci poruch zprostředkovaných expresi nebo aktivitou lidského neurotrofického faktoru.

41. Použiti jakékoli sloučeniny identifikované jako agonista podle patentového nároku 39, molekuly nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 7, nebo' růstového faktoru podle jakéhokoli z patentových nároků 8 až 11 ve výrobě léku pro léčbu nebo prevenci poruch zprostředkovaných inaktivaci lidského neurotrofického faktoru.

42. Použiti jakékoli sloučeniny identifikované jako agonista podle patentového nároku 39, molekuly nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 7, nebo růstového faktoru podle jakéhokoli z patentových nároků 8 až 11 ve výrobě léku pro léčbu gastrointestinálních poruch zprostředkovaných porušenou gastrointestinálni pasáží.

43. Použití podle patentového nároku 42, kde řečená porucha nebo stav zahrnuje gastrointestinální reflux, dyspepsii, gastroparézu, pooperační ileus a střevní pseudoobstrukci, sníženou peristaltiku tenkého nebo tlustého střeva, a/nebo opožděné vyprazdňováni žaludku, zácpu, střevní atonii, pooperační střevní atonii, syndrom dráždivého tračníku, zpomalení pasáže vyvolané léky, zvracení a zvracení vyvolané cytotoxickými léky a ozářením.

44. Použití jakékoli sloučeniny identifikované jako antagonista podle patentového nároku 39, molekuly nukleové kyseliny podle jakéhokoli z patentových nároků 1 až 7, nebo růstového faktoru podle jakéhokoli z patentových nároků 8 až 11 ve výrobě léku pro léčbu gastrointestinálních poruch nebo stavů zprostředkovaných zvýšenou peristaltikou střeva.

45. Použití podle patentového nároku 44, kde řečené poruchy zahrnují průjem včetně sekrečního průjmu, bakteriální průjem, průjem vyvolaný žlučovými kyselinami, průjem cestovatelů a psychogenní průjem, Crohnovu nemoc, spastický tračník, syndrom dráždivého tračníku, hypersenzitivitu střeva a sníženi bolestí spojených s gastrointestinální hypersenzitivitou.

46. Farmaceutický preparát obsahující sloučeninu podle patentového nároku 39 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředící nebo excipientní látkou.

47. Způsob přípravy farmaceutického preparátu pro léčbu nemocí spojených s lidským neurotrofickým růstovým faktorem, kde řečený způsob zahrnuje výběr kandidátní sloučeniny identifikované jako agonista nebo jako antagonista podle způsobu z patentového nároku *·· -» nebo 34, výrobu velkého množství řečené sloučeniny a formulaci vyrobené sloučeniny s farmaceuticky přijatelným nosičem.

48. Způsob podle patentového nároku 47, kde řečeným růstovým faktorem je enovin.

49. Farmaceutický preparát obsahující protilátku’ podle patentového nároku 29 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředící nebo excipientní látkou.

50. Izolovaný lidský neurotrofický růstový faktor obsahující polypeptid, který má alespoň 85% sekvenční identitu s aminokyselinovými sekvencemi ilustrovanými na Obrázku 1, 21, 23 nebo 24.

51. Plazmid EVNmat/pRSETB uložený pod LMBP přístupovým číslem LMBP 3931.

52. Použití sloučeniny podle patentového nároku 39 ve výrobě léku pro léčbu jakékoli nemoci ze skupiny obsahující Parkinsonovu nemoc, Alzheimerovu nemoc, neuronální poruchy spojené s rozšířenými polyglutaminovými sekvencemi, jako je například Huntingtonova nemoc, periferní neuropatie, akutní poškození mozku, nádory nervového systému, roztroušená skleróza, amyotrofická laterální skleróza, poškození periferních nervů, poškození v důsledku expozice neurotoxinům, mnohočetné endokrinní nádory, familiární Hirschprungova nemoc, nemoci spojené s priony, Creutzfeld-Jacobova nemoc, mozková mrtvice, bolestivé syndromy s významnou periferní nebo centrální neurogenní komponentou, revmatická/zánětlivá onemocnění, stejně tak jako poruchy vodivosti.

4 · 4 * ·

Obr. 1

PPQPSRPAP?

P P A P P s cgccgccgcagcctcctcggcccgcgcccccgccgcctgcacccccaccc A L P R G G X X Λ R Γα G G P G S R gctcctccccgcgggggccgcgcggcgcgggccgggggcccgggcagccg

100

ARAAGARG CRLRSQLV cgctcgggcagcgggggcgcggggctgccgcctgcgctcgcagctggcgc

150

PVRALGLGHRS DELVRF cggtgcgcgcgctcggcccgggccaccgctccgacgagctggtgcgcccc

200

RFCSGSCRRARSPHDLS cgcttctgcagcggctcctgccgccgcgcgcgctctccacacgacctcag

25C

LASLLGAGALRPPPGS cctggccagcctactgggcgccggggccccgcgaccgcccccgggctccc

30C

RPVSQPCCR PTRYEAVS ggcccgtcagccagccctgctgccgacccaagcgctacgaagcggtcccc

116

350

F M D V N $ T WRTVDRLSAT ttcatggacgtcaacagcacctggagaaccgtggaccgcctctcegccac

133

400

A C G C L G * cgcctgcggctgcctgggcugagggctcgctccagggctttgcagactgg

139

450 acccttaccggtggczcctcctgc

474 • · • · · · z

Z cu tz z

Z

Z

Q

H w

>

Q

H w

>

Z w

Z ω

—

X r*

X

X

X

X • ·