CZ303868B6 - Lidský neurotrofický rustový faktor a jeho aplikace - Google Patents

Lidský neurotrofický rustový faktor a jeho aplikace Download PDF

Info

Publication number
CZ303868B6
CZ303868B6 CZ20010028A CZ200128A CZ303868B6 CZ 303868 B6 CZ303868 B6 CZ 303868B6 CZ 20010028 A CZ20010028 A CZ 20010028A CZ 200128 A CZ200128 A CZ 200128A CZ 303868 B6 CZ303868 B6 CZ 303868B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
growth factor
nucleic acid
amino acid
sequence
arg
Prior art date
Application number
CZ20010028A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ200128A3 (cs
Inventor
Alfons Gabriel Geerts@Hugo
Leo Jozef Masure@Stefan
Frans Meert@Theo
Cik@Miroslav
Donck@Luc Ver
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27269394&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ303868(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB9815283.8A external-priority patent/GB9815283D0/en
Application filed by Janssen Pharmaceutica N. V. filed Critical Janssen Pharmaceutica N. V.
Publication of CZ200128A3 publication Critical patent/CZ200128A3/cs
Publication of CZ303868B6 publication Critical patent/CZ303868B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

Resení se týká klonování a exprese nového clena rodiny GDNF neurotrofických faktoru, oznacovaného jako "enovin" (EVN), který má sekvenci uvedenou na Obr. 21. Zralý rustový faktor obsahuje aminokyselinovou sekvenci od pozice 27 do pozice 139 SEQ ID NO: 4. Resení se dále týká zpusobu jeho detekce, zpusobu identifikace jeho agonisty nebo antagonisty, nukleové kyseliny kódující tento rustový faktor, príslusného plazmidu, expresního vektoru, hostitelské bunky, pouzití výse uvedené nukleové kyseliny nebo rustového faktoru, protilátky schopné se vázat k tomuto rustovému faktoru, farmaceutické kompozice obsahující tento rustový faktor nebo tuto protilátku a kitu pro detekci tohoto rustového faktoru.

Description

Vynález se týká lidského neurotrofického růstového faktoru, způsobu jeho detekce, způsobu identifikace jeho agonisty nebo antagonisty, nukleové kyseliny kódující tento růstový faktor, příslušného plazmidu, expresního vektoru, hostitelské buňky, použití výše uvedené nukleové kyseliny nebo růstového faktoru, protilátky schopné se vázat k tomuto růstovému faktoru, farmaceutické kompozice obsahující tento růstový faktor nebo tuto protilátku a kitu pro detekci tohoto růstového faktoru. Vynález se zejména týká klonování a exprese nového členu z rodiny GDNF neurotrofických faktorů, označovaného zde jako „enovin“ (EVN).
Dosavadní stav techniky
Neurotrofické faktory hrají roli v neuronální diferenciaci, vývoji a zásobování. Tyto proteiny mohou zabránit diferenciaci a podporovat přežívání růstových typů nervových buněk a jsou tedy potenciálními terapeutickými látkami pro neurodegenerativní onemocnění. Neurotrofický faktor odvozený z gliální buněčné linie (GDNF) byl prvním členem rostoucí podrodiny neurotrofických faktorů strukturálně odlišných od neutrofinů. GDNF patří do superrodiny transformujících faktorů β (TGF-β) charakterizuovaných specifickou strukturou sedmi vysoce konzervovaných cysteinových reziduí v aminokyselinové sekvenci (Kingsley, 1994). GDNF byl původně purifikován za použití testu založeného na jeho schopnosti udržet přežívání a funkci embryonálních dopa25 minergních neoronů předního mozku za podmínek in vitro (Lin et al., 1993). Další typy nervových buněk v centrálním (CNS) nebo periferním nervovém systému (PNS) také zodpovídají za přežívání zprostředkované GDNF (Henderson et al., 1994, Buj-Bell et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995). GDNF je produkován buňkami v neaktivní proformě, která je specificky štěpena v RXXR furinovém rozpoznávacím místě za vzniku aktivního (zralého)
GDNF (Lin et al., 1993). Exogenní podání GDNF má silné neuroprotektivní účinky na zvířecích modelech Parkinsonovy nemoci, běžného neurodegenerativního onemocnění charakterizovaného ztrátou až 70 % dopaminergních buněk v substantia nigra mozku (Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Gash et al., 1996; Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).
V nedávné době byly objeveny další neurotrofické faktory z rodiny GDNF. Neurturin (NTN) byl purifikován z upraveného média z buněk ovaria čínského křečka (CHO) za použití testu založeného na schopnosti neurturinu podporovat přežívání sympatických neuronů v kultuře (Kutzbauer et al., 1996). Zralý NTN je z 57 % podobný zralému GDNF. Persefin (PSP) byl objeven klonováním za použití PCR z degenerovanými primery s genomickou DNA jako templátem. Zralý
PSP, podobně jako zralý GDNF, podporuje přežívání dopaminergních neuronů ventrálního středního mozku a motorických neuronů v kultuře (Mildtbrandt et al., 1998). Podobnost zralého PSP proteinu se zralým GDNF a NTN je asi 50 %. Artemin (ARTN) byl objeven vyhledáváním v databázi DNA a je faktorem přežívání senzorických a sympatických neuronů v kultuře (Balon etal., 1998b).
GDNF, NTN, PSP a ARTN vyžadují heterodimerický receptorový komplex, aby mohla být provedena dopředná transdukce intracelulámího signálu. GDNF se váže na podjednotku alfa 1 receptorů z rodiny GDNF (GFRa-1, GFRa Nomenclature Committee, 1997), což je glykosylfosfatidyl-inositol (glykosyl-Ptdlns) ukotvený membránový protein (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al., 1997). Komplex GDNF/GFRa-1 se následně váže na a aktivuje cRET protoonkogen, membránově vázanou tyrosin kinázu (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), což má za následek fosforylaci tyrosinových reziduí v cRET a následnou aktivaci drah dopředně signálové transdukce (Worby et al., 1996). Bylo charakterizováno několik dalších členů GFRa rodiny ligand vázajících receptorů (Baloh et. al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997,
Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). Několika skupinami byly identifikovány GFRa-2
-1 CZ 303868 B6 a GFRa-3 (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Woby et 1., 1998, Naveilhám et al., 1998 Baloh et al., 1998a). GFRa-1 a GFRot-2 jsou hojně exprimovány v téměř všěch tkáních a jejich exprese může být vývojově regulována (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).
GFRa-3 není exprimován ve vyvíjejícím se nebo dospělém centrálním nervovém systému, aleje vysoce exprimován v několika vyvíjejících se a dospělých senzorických a sympatických ganglií periferního nervového systému (Widelfalk et al., 1998, Navielhan et al., 1998. Baloh et al., 1998a). Čtvrtý člen rodiny GFRa-4 byl klonován z kuřecí cDNA (Thompson et al., 1998). GFRa-1 je přednostním receptorem pro GDNF, zatímco GFRa-2 přednostně váže NTN (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). Kuřecí GFRa-4 vytváří funkční receptorový komplex pro PSP v kombinaci s cRET (Enokido et al., 1998). U buněk exprimujících GFRa-3 i cRET bylo prokázáno, že neodpovídají ani na GDNF, NTN ani na PSP (Worby et al, 1998, Baloh et al., 1998a). V nedávné době bylo prokázáno, že ART působí jako přes cRET za použití GFRa-3 jako přednostního ligandu vázajícího receptor (Baloh et al., 1998b; WO 00/18799). Interakce mezi neurotrofickými faktory GFRa receptory je možná za podmínek in vitro, protože GDNF může vázat GFRa-2 nebo GFRa-3 v přítomnosti cRET (Sanicola et al., 1997. Trupp et al., 1998), a NTN se může vázat na GFRa-1 s nízkou afinitou (Klein et al., 1997). Souhrnně řečeno jsou GDNF, NTN, PSP a ART částí neurotrofického signálního systému, ve kterém mohou různé podjednotky vázající ligand (GFRa-1 až -4) interagovat se stejnou podjednotkou tyrodin kinázy (cRET). Fyziologická relevance těchto in vitro nálezů byla nedávno prokázána ve studiích s knockoutovanými geny (přehled od Rosenthala, 1999), který jasně prokázal, že GDNF interaguje s GFRa-1 za podmínek in vivo, zatímco NTN je přednostní ligand pro GFRa-2.
Původci vynálezu identifikovali, klonovali, exprimovali, chromozomálně lokalizovali a charakterizovali enovin (EVN), čtvrtý prvek rodiny GDNF. Znalosti o zralém proteinu EVN byly rozšířeny objevem různých funkčních a nefunkčních mRNA sestřihových variant. Navíc předkládáme data o expresi, vazebná data EVN k GFRa-3 a in vitro účinky EVN na vyrůstání neuritů a na ochranu před taxolem indukovanou neurotoxicitou v taurosporinem diferenciovaných SH-SY5X lidských neuroblastomových buněčných kulturách.
Podstata vynálezu
V předkládané přihlášce je mj. poskytnuta molekula nukleové kyseliny kódující lidský neurotrofický růstový faktor, „enovin“, expresní vektor zahrnující molekulu, nukleové kyseliny, hostitelská buňka transformovaná řečeným vektorem, neurotrofický růstový faktor kódovaný řečenou molekulou nukleové kyseliny, izolovaný enovin a farmaceutické kompozice obsahující nukleovou kyselinu nebo izolovaný enovinový protein.
Podle prvního aspektu předkládaného vynálezu je předmětem vynálezu izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující lidský neurotrofický růstový faktor označený názvem enovin a mající aminokyselinovou sekvenci ilustrovanou v SEQ ID No. 4 (viz obr. 1). Řečená molekula nukleové kyseliny je přednostně DNA a výhodněji molekula cDNA.
O molekule nukleové kyseliny od pozice 81 do pozice 419 se předpokládá, že kóduje sekvenci zralého enovinového proteinu po zpracování proformy proteinu v RXXR místě přítomném u stabilní proformy řečeného enovinového proteinu.
S jakoukoli sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu může za příslušných (stringentních) podmínek, které jsou známy osobám znalých oboru, hybridizovat komplementární (antisense) molekula.
-2CZ 303868 B6
Přísnost podmínek hybridizace, jak je používáno zde, se týká podmínek, za kterých jsou polynukleové kyseliny stabilní. Stabilita hybridů se odráží v teplotě tání (Tm) hybridů. Tm může být odhadnuta ze vzorce:
81,5 °C - 16,6 (loglO [Na+] + 0,41 (%G+C) - 600/1 kde 1 je délka hybridů v nukleotidech. Tm se snižuje přibližně o 1-1,5 °C s každým 1% snížením sekvenční homologie.
Molekula nukleové kyseliny může být s výhodou použita k expresi lidského neurotrofického růstového faktoru podle vynálezu v hostitelské buňce, nebo podobně za použití vhodného expresního vektoru.
Expresní vektor podle vynálezu zahrnuje vektory schopné exprese DNA operativně navázané na regulační sekvence, jako jsou promotory oblasti, které jsou schopné zajistit expresi takových DNA fragmentů.
Regulační elementy vyžadované pro expresi zahrnují promotorové sekvence k vazbě RNA polymerázy a transkripční iniciační sekvence pro vazbu ribozómů. Bakteriální expresní vektor může například zahrnovat promotor, jako je například lac promotor a pro iniciaci transkripce Shine-Dalgamovu sekvenci a startovací kodón AUG. Podobně může eukaryotický expresní vektor zahrnovat heterologní nebo homologní promotor pro RNA polymerázu II, dopředný polyadenylační signál, startovací kodón AUG a terminační kodón pro oddělení ribozómů. Tyto vektory mohou být komerčně získány nebo uspořádány ze sekvencí popsaných metodami dobře známými v oboru.
Z tohoto důvodu se expresní vektor týká konstruktu rekombinantní DNA nebo RNA, jako je například plazmid, fág, rekombinantní virus nebo další vektor, který po začlenění do vhodné hostitelské buňky vede k expresi fragmentů DNA nebo RNA. Vhodné expresní vektory jsou dobře známé osobám znalým oboru a zahrnují vektory, které jsou schopné replikace v eukaryotických a/nebo prokaryotických buňkách, vektorů které zůstávají epizomální, nebo vektorů, které se integrují do genomu hostitelské buňky.
Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být vloženy do vektorů popsaných v antikomplementámí orientaci, aby byla zajištěna tvorba antikomplementámí RNA. Antikomplementámí RNA nebo antikomplementámí nukleové kyseliny mohou být produkovány syntetickým způsobem.
Další aspekt vynálezu zahrnuje hostitelskou buňku transformovanou, transfektovanou, nebo infikovanou expresním vektorem podle vynálezu, kterážto buňka přednostně zahrnuje eukaryotickou buňku a přednostně savčí buňku.
Začlenění klonované DNA do vhodného expresního vektoru pro následnou transformaci řečené buňky a následný výběr transformovaných buněk jsou dobře známy osobám znalým oboru, jak je uvedeno například v publikaci Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Další aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje molekulu nukleové kyseliny mající alespoň 15 nukleotidů z molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu a přednostně od 15 do 50 nukleotidů.
Tyto sekvence mohou být s výhodou použity pro próby nebo primery k iniciaci replikace, nebo podobně. Takové molekuly nukleové kyseliny mohou být produkovány podle technik dobře známých v oboru, jako například rekombinantním nebo syntetickým způsobem. Mohou být také použity v diagnostických soupravách nebo zařízeních k detekci přítomnosti nukleové kyseliny
-3CZ 303868 B6 podle vynálezu. Tyto testy obecně zahrnují kontakt próby se vzorkem za hybridizačních podmínek, a dále detekci přítomnosti jakékoli tvorby duplexu mezi próbou a jakoukoli nukleovou kyselinou ve vzorku.
Podle předkládaného vynálezu mohou být tyto próby ukotveny na pevnou podporu. Přednostně mohou být přítomny v takovém uspořádání, že mnohočetné próby mohou simultánně hybridizovat s jednotlivými biologickými vzorky. Próby mohou být umístěny do uspořádání, nebo zde mohou být in šitu syntetizovány. (Viz Lockhart et al., Nátuře Biotechnology, sv. 14, prosinec 1996. „Expression monitoring by hybridization into high density oligonucleotide arrays“. Jednotlivé uspořádání může obsahovat více než 100, 500 nebo dokonce 1000 různých prób v oddělených lokalizacích.
Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být také produkovány za použití rekombinantních nebo syntetických způsobů, jako například za použití PCR klonovacích mechanismů, které obecně zahrnují vytvoření párů primerů, které mohou mít přibližně 10 až 50 nukleotidů z oblasti genu, která má být klonována, vytvoření kontaktu mezi primery a mRNA, cDNA nebo genomickou DNA z lidské buňky, provedení polymerázové řetězové reakce za podmínek, které vedou k amplifikaci požadované oblasti, izolaci amplifikované oblasti nebo fragmentu a získání amplifikované DNA. Tyto techniky, jak jsou zde definovány, jsou obecně dobře známé v oboru, jak je popsáno například v publikaci Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 1989).
Nukleové kyseliny nebo oligonukleotidy podle vynálezu mohou nést značku. Vhodné značky zahrnují radioizotopy, jako jsou například 32P nebo 32S, enzymové značky nebo jiné proteinové značky, jako je například biotin nebo fluorescenční markéry. Tyto značky mohou být přidány k nukleovým kyselinám nebo oligonukleotidům vynálezu a mohou být detekovány za použití známých technik per se.
Lidské alelické varianty nebo polymorfismy molekuly DNA podle vynálezu mohou být s výhodou identifikovány například pomocí prób cDNA nebo genomických knihoven od mnoha jedinců, například z různých populací. Dále mohou být nukleové kyseliny a próby podle vynálezu použity k sekvenování genomické DNA od pacientů za použití technik dobře známých v oboru, jako je například Sangerova Dideoxy řetězová terminační metoda, která může s výhodou ověřit u pacienta predispozici k určitým onemocněním spojených s růstovým faktorem podle vynálezu.
Předkládaný vynález dále poskytuje transgenní buňku, tkáň nebo organismus obsahující transgen schopný exprese lidského neurotrofického faktoru enovin podle vynálezu.
Termín „transgen schopný exprese“, jak je zde používán, znamená jakoukoli vhodnou sekvenci nukleové kyseliny, která vede k expresi neutrofíckého faktoru podle vynálezu. Transgen může zahrnovat například genomickou nukleovou kyselinu izolovanou z lidských buněk, nebo syntetickou nukleovou kyselinu obsahující cDNA, integrovanou do chromozómu nebo v extrachromozomálním stavu.
Transgen zahrnuje přednostně vektor podle vynálezu, kterýžto vektor zahrnuje molekulu nukleové kyseliny kódující řečený neurotrofický faktor nebo funkční fragment řečené molekuly nukleové kyseliny. „Funkční fragment“ řečené nukleové kyseliny by měl znamenat fragment nebo gen nebo cDNA kódující řečený neurotrofický faktor nebo jeho funkční ekvivalent, kterýžto fragment je schopný exprese za vzniku funkčního neurotrofického faktóru podle vynálezu. Z tohoto důvodu například fragmenty neurotrofického růstového faktoru podle vynálezu, které korespondují se specifickými aminokyselinovými rezidui a interagují s korespondujícím receptorem, vytvářejí také část předkládaného vynálezu a tyto fragmenty mohóu také sloužit jako agonisté aktivující korespondující receptor růstového faktoru podle vynálezu tak, aby došlo k vyvolání účinků podporujících růst a udržujících přežívání buněk. Tento aspekt vynálezu také
-4CZ 303868 B6 zahrnuje diferenciálně sestříhané izoformy a transkripční začátky nukleových kyselin podle vynálezu.
Ve shodě s předkládaným vynálezem zahrnuje definovaná nukleová kyselina nejen pouze identickou nukleovou kyselinu, ale také jakékoli varianty minoritních bází, obzvláště substituce bází, které vedou k synonymnímu kodónu (odlišný kodón specifikující stejné aminokyselinové reziduum) v důsledku degenerace kódu v konzervativních aminokyselinových substitucích. Termín „molekula nukleové kyseliny“ také zahrnuje komplementární sekvenci jakékoli jednovláknové sekvence týkající se variace bází.
Podle dalšího aspektu poskytuje vynález izolovaný neurotrofický růstový faktor kódovaný molekulou nukleové kyseliny, jak je zde definována. Růstový faktor přednostně zahrnuje aminokyselinovou sekvenci od pozice 27 do pozice 139 aminokyselinové sekvence z Obrázku 1, nebo jeho funkční ekvivalent, derivát nebo bioprekurzor.
„Funkční ekvivalent“, jak je zde definován, by měl zahrnovat růstový faktor, který vykazuje všechny růstové a funkční vlastnosti spojené s růstovým faktorem enovit. „Derivát“ enovinu, jak je zde definován, zahrnuje polypeptid, u kterého byly určité aminokyseliny porušeny, vynechány nebo nahrazeny jinými aminokyselinami, a kterýžto polypeptid si uchovává biologickou aktivitu enovinu, a/nebo kterýžto polypeptid může reagovat s protilátkami vytvořenými proti enovinu podle vynálezu jako stimulujícímu antigenu.
Popsány jsou také hybridní a modifikované formy enovinu zahrnující fúzní proteiny a fragmenty. Hybridní a modifikované formy zahrnují například určité aminokyseliny, které byly zmobilizo25 vány nebo nahrazeny, jako například bodovou mutací, kteréžto modifikace vedou stále k udržení biologické aktivity enovinu podle vynálezu. Specifické sekvence nukleové kyseliny mohou být narušeny osobami znalými oboru za vzniku růstového faktoru vykazujícího stejné nebo významně podobné vlastnosti enovinu.
Jak je dobře známo v oboru, je mnoho proteinů produkováno in vivo s (pre) signální sekvencí na N-konci proteinu. Dále takové protein y mohou obsahovat další pro sekvence, které představují stabilní prekurzor zralého proteinu. Takové pre a pro sekvence nejsou obecně nezbytné pro biologickou aktivitu. Molekula enovinu podle vynálezu zahrnuje nejen pouze sekvenci o plné délce ilustrovanou na Obrázku 21, ale také sekvence od pozice 27 do pozice 139, která následuje za RXXR proteolytickým zpracovávacím místem přítomným u růstových faktorů tohoto typu, a o kterých se věří, že reprezentují zralou sekvenci enovinu.
Definovaný protein, polypeptid nebo aminokyselinová sekvence podle vynálezu zahrnuje nejen pouze identickou aminokyselinovou sekvenci, ale také její izomery navíc k variacím minoritních aminokyselin přirozené aminokyselinové sekvence včetně náhrad konzervativních aminokyselin (náhrada aminokyseliny, která se vztahuje kjejímu postrannímu řetězci). Také jsou zahrnuty aminokyselinové sekvence, které se liší od přirozených aminokyselin, ale vedou ke vzniku polypeptidu, který je imunologicky identický nebo podobný polypeptidu kódovanému přirozeně se vyskytující sekvencí.
Proteiny nebo polypeptidy použité podle vynálezu dále zahrnují varianty takových sekvencí, včetně přirozeně se vyskytujících alelických variant, které jsou významně homologní k řečeným proteinům nebo polypeptidům. V tomto kontextu je významnou homologií míněna sekvence, která má alespoň 70 % a přednostně 80 %, 90 % nebo 95 % aminokyselinové homologie s pro50 teiny nebo polypeptidy kódovanými molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.
Neurotrofické růstové faktory exprimované hostitelskými buňkami podle vynálezu jsou také zahrnuty do předkládaného vynálezu.
-5CZ 303868 B6
Kvůli sekvenční podobnosti mezi růstovým faktorem zde popsaným a dříve identifikovanými růstovými faktory z rodiny GDNF se předpokládá, že enovin by mohl být schopen podporovat přežívání a růst buněk a být použitelný při léčbě nemocí vznikajících v důsledku defektů funkce nebo exprese řečeného neurotrofického faktoru.
U neurotrofického růstového faktoru podle vynálezu bylo s výhodou pozorováno, že má neurotrofický a neuroprotektivní účinek na nervové buňky nebo buněčné populace, obzvláště ty nervové buňky nebo buněčné populace, které byly indukovány k apoptóze. Z tohoto důvodu mohou být nukleová kyselina nebo růstový faktor enovin jako takový navíc použity v léčbě neurodegenerativních onemocnění, jako jsou například mozková mrtvice, Huntingtonova choroba, periferní neuropatie, akutní poškození mozku, nádory nervového systému, roztroušená skleróza, amyotrofická laterální skleróza, poškození periferních nervů, poškození v důsledku expozice neurotroxinům, mnohočetné endokrinní neoplázie, familiární Hirschprungova choroba, onemocnění spojená s priony, Creutzfeld-Jacobova nemoc, prostřednictvím podání množství řečené nukleové kyseliny nebo enovinu v dostatečné koncentraci jedinci potřebujícímu tuto léčbu tak, aby došlo ke snížení nebo zabránění příznaků nervových poruch popsaných výše.
Navíc, a co je popsáno detailněji v příkladu uvedeném níže, bylo u enovinu prokázáno, že urychluje reparaci indukovaných senzorických deficitů, což identifikuje enovin jako kandidátní lék pro léčbu nebo zmírnění bolestivých syndromů s periferní nebo centrální neurogenní složkou prostřednictvím podáním dostatečné koncentrace pacientovi potřebujícímu tuto léčbu tak, aby došlo ke snížení nebo zabránění příznaků těchto onemocnění.
Alternativní způsob léčby nervových poruch popsaných výše zahrnuje implantaci buněk jedinci, buněk, které exprimují lidský neurotrofický růstový faktor podle vynálezu, jako je například transgenní buňka zde pospaná.
Molekuly nukleové kyseliny a neurotrofický růstový faktor podle vynálezu mohou být také začleněny do farmaceutického preparátu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředící nebo excipientní látkou.
Protilátky proti neurotrofickému faktoru, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být s výhodou připraveny pomocí technik, které jsou známé v oboru. Pólyklonální protilátky mohou být například připraveny inokulací hostitelskému zvířeti, jako je například myš, růstového faktoru nebo jeho epitopu, a získáním imunního séra. Monoklonální protilátky mohou být připraveny podle známých technik, jak je například popsáno Kohlerem R. a Milsteinem C., Nátuře (1975)256, 495-497:
Protilátky podle vynálezu mohou být s výhodou použity ve způsobu detekce přítomnosti růstového faktoru podle vynálezu, kteiýžto způsob zahrnuje reakci protilátky se vzorkem a identifikaci proteinu navázaného k řečné protilátce. Poskytnuta je také souprava (kit) pro provedení řečeného způsobu, která zahrnuje protilátku podle vynálezu a prostředek pro reakci protilátky s řečeným vzorkem.
V předkládaném vynálezu je také poskytnuta souprava (kit) nebo zařízení pro detekci přítomnosti neurotrofického růstového faktoru podle vynálezu ve vzorku, obsahující pro ilátku jak je popsáno výše a prostředek pro reakci protilátky s řečeným vzorkem.
nálezu, jako je napřímáním interakcí prohře znám molekulárzaložena na funkční en. Konkrétněji tato ^sáhujícím reportéroícím DNA vazebnou
Proteiny, které interagují s neurotrofíckým faktorem, který je předmětem vy klad jeho korespondující buněčný receptor, mohou být identifikovány zkou teinprotein za použití dvou-hybridového vektorového systému, který je do ním bilogům (Fields a Song, Nátuře, 340, 245, 1989). Tato technika je rekonstituci in vivo transkripčního faktoru, který aktivuje reportére vý g technika zahrnuje zajištění příslušné hostitelské buňky DNA konstruktem oí vý gen za kontroly promotoru regulovaného transkripčním faktorem maj
-6CZ 303868 B6 doménu a aktivační doménu, exprimující v hostitelské buňce první hybridovou DNA sekvenci kódující první fúzi fragmentu nebo všechny sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu, a buďto řečenou DNA vazebnou doménu, nebo řečenou aktivační doménu transkripčního faktoru, exprimující v hostitelské buňce alespoň jednu druhou hybridní DNA sekvenci, jako je například knihovna a podobně, kódující domnělé vazebné proteiny, které mají být zkoumány spolu s DNA vazebnou a aktivační doménou transkripčního faktoru, které nejsou začleněny do první fúze, detekující vazbu zkoumaných proteinů s proteinem podle vynálezu detekcí přítomnosti produktu reportérového genu v hostitelské buňce, a volitelně izolaci druhé hybridní DNA sekvence kódující vazebný protein.
Příklad takové techniky využívá GAL4 protein u kvasinek. GAL 4 je transkripční aktivátor metabolismu galaktózy u kvasinek a má separátní doménu pro vazbu aktivátorů nad geny metabolizujícími galaktózu, stejně tak jako má doménu vázající protein. Mohou být zkonstruovány nukleotidové vektory, z nichž jeden obsahuje nukleotidová rezidua kódující DNA vazebnou doménu GAL4. Tato rezidua vazebné domény mohou být zfázována se známou sekvencí kódující protein, jako jsou například nukleové kyseliny podle vynálezu. Další vektor obsahuje rezidua kódující protein vazebnou doménu GAL4. Tato rezidua jsou zfázována s rezidui kódujícími testovaný protein, přednostně ze signální transdukční dráhy zkoumaného obratlovce. Jakákoli interakce mezi neurotrofickým faktorem kódovaným nukleovou kyselinou podle vynálezu a testovaným proteinem vede k transkripční aktivaci reportérové molekuly v GAL4 transkripčně deficientní kvasinkové buňce, do které byly vektory transformovány. Přednostně je reportérová molekula, jako je například β-galaktosidáza, aktivovaná po obnovení transkripce kvasinkových genů metabolizujících galaktózu.
Receptor pro enovin byl identifikován předkládajícími vynálezci jako GFRa3. Mohou být také připraveny testy k identifikaci agonistických a antagonistických sloučenin enovinu. Tento test může být také použit ve spojení s dalšími neurotrofickými růstovými faktory a jejich odpovídajícími receptory. Identifikované sloučeniny mohou být použity k léčbě nebo prevenci onemocnění jako jsou například Parkinsonova nemoc, Alzheimerova nemoc, neuronální poruchy spojené s rozšířenými polyglutaminovými sekvencemi, jako je například Huntingtonova nemoc, periferní neuropatie, akutní poškození mozku, nádory nervového systému, roztroušená skleróza, amyotrofická laterální skleróza, poškození periferních nervů, poškození v důsledku expozice neurotoxinům, mnohočetné endokrinní nádory, familiární Hirschprungova nemoc, nemoci spojené s priony, Creutzfeld-Jacobova nemoc, mozková mrtvice, bolestivé syndromy s významnou periferní nebo centrální neurogenní komponentou, revmatická/zánětlivá onemocnění, stejně tak jako poruchy vodivosti, a to prostřednictvím podání jedinci množství řečeného agonisty nebo antagonisty v koncentraci dostatečné k prevenci nebo léčbě řečených nervových poruch. Tyto sloučeniny mohou být také obsaženy ve farmaceutických preparátech spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředicí nebo excipientní látkou.
Agonisté nebo antagonisté růstového faktoru (jako je například enovin) mohou být identifikovány v jedné formě pomocí kontaktu buněčné tkáně nebo organismu exprimujících příslušný receptor a cRET s kandidátní sloučeninou v přítomnosti růstového faktoru, a srovnáním hladiny aktivace RET v řečené buňce, tkáni nebo organismu s kontrolou, která nebyla v kontaktu s řečenou kondidátní sloučeninou.
Alternativní forma vynálezu zahrnuje způsob identifikace agonistů nebo antagonistů neurotrofického růstového faktoru, kdy řečený způsob zahrnuje kontakt buněčné tkáně nebo organismu exprimujících příslušný receptor řečeného růstového faktoru a cRET s kandidátní sloučeninou v přítomnosti růstového faktoru, měření hladiny aktivace signální kinázy v signální transdukční dráze, v které řečený příslušný receptor je složkou, která následuje po přidání protilátky specifické pro řečenou signální kinázu konjugovanou s reportérovou molekulou ve srovnání s buněčnou tkání nebo organismem, které nebyly v kontaktu s řečenou kandidátní sloučeninu.
-7CZ 303868 B6
Jak bude patrné z příkladů uvedených níže, je enovin úspěšný ve snižování senzorických deficitů vyvolaných taxolem. Enovin může proto hrát možnou roli v bolestivých syndromech s významnou periferní a centrální neurogenní složkou a může hrát modulační úlohu v senzorických procesech po transdermálním topickém, lokálním centrálním (jako je například epidurální), intrathékální, ICV, intraplexové, intraneuronální), perorálním, rektálním a systémovém podání. Proto stejným způsobem, jak je zde popsáno pro další stavy zprostředkované enovinem, mohou být tyto stavy zmírněny, nebojím může být zabráněno prostřednictvím podání buďto antikomplementámí molekuly, nukleové kyseliny, enovinového proteinu, farmaceutického preparátu, nebo sloučeniny identifikované jako agonista nebo antagonista jako vhodných látek podle vynálezu v koncentracích dostatečných ke snížení nebo zabránění příznaků řečeného(ých) onemocnění.
Terapeutické nebo farmaceutické preparáty, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být podány jakýmkoli vhodným způsobem známým v oboru zahrnujícím například intravenózní, podkožní, intramuskulámí, transdermální intrathekální nebo intracerebrální podání buňkám v léčebných protokolech ex vivo. Podání může být buďto rychlé, jako například u pomalé infúze nebo při podání preparátu s pomalým uvolňováním. Pro léčbu tkání v centrálním nervovém systému může být podání formou injekce nebo infúze do cerebrospinální tekutiny.
Enovin může být také navázán nebo konjugován s látkami, které poskytují žádoucí farmaceutické nebo farmakodynamické vlastnosti. Může být například navázán na jakpukoli látku známou v oboru, která podporuje průnik a transport přes hemotoencefalickou bariéru, jako je například protilátka proti transferinovému receptorů a podání intravenózních injekcí.
Enovin, antikomplementámí molekuly, nebo sloučeniny skutečně identifikované jako agonisté nebo antagonisté enovinu, mohou být použity ve formě farmaceutického preparátu, který může být připraven podle postupů dobře známých v oboru. Přednostní preparáty zahrnují farmaceuticky přijatelné vehikulum, nebo ředící či excipientní látkou, jako je například fyziologický roztok. Mohou být použity další farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnující další netoxické soli, sterilní vodu a podobně. Může být přítomný vhodný pufr, který umožňuje lyofilizaci preparátu a uskladnění za sterilních podmínek před rekonstituci přidáním sterilní vody pro následné podání. Může být provedena inkorporace enovinu na pevnou nebo polo-pevnou biologicky kompatibilní matrici, která může být implantována do tkání vyžadujících léčbu.
Nosič může také obsahovat další farmaceuticky přijatelné excipientní látky k modifikaci dalších podmínek jako je například pH, osmolarita, viskozita, sterilita, lipofilita, rozpustnost, a podobně. Mohou být zahrnuty také excipientní látky, které umožňují trvalé nebo opožděné uvolňování po podání preparátu.
Enovinový protein nebo molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být podány paralelně. V této formě mohou být enkapsulovány a kombinovány s vhodnými nosiči v pevných dávkových formách, které jsou dobře známy osobám znalým oboru.
Jak bude dobře známo osobám, které jsou znalé oboru, může být podle plochy tělesného povrchu, nebo objemu tělesného prostoru, který bude použit, vypočten specifický dávkovači režim v závislosti na konkrétním použitém způsobu podání. Množství preparátu skutečné podaného však bude určeno lékařem na podkladě okolností týkajících se léčeného onemocnění, jako je například intenzita příznaků, preparát, který má být podán, věk, váha a odpověď jednotlivého pacienta a zvolený způsob podáni.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1: je částečná cDNA sekvence neurotrofického faktoru podle vynál enovin. Konsensuální sekvence byla získána PCR amplifikací s primery různých cDNA a genomické DNA s následným klonováním a sekvenční a ezu označeného jako pHNsp3 a PNHapl nalýzou a srovnáním
-8CZ 303868 B6 získaných sekvencí. Předpověděný jednopísmenový kód aminokyselinové sekvence je uveden nad DNA sekvencí. Počet nukleotidových reziduí je uveden napravo od DNA sekvence, zatímco počet aminokyselinových reziduí je napravo od přepsané proteinové sekvence. Domnělé RXXR štěpící místo pro doménu je uveden šipkou. Sedm konzervovaných charakteristických cysteino5 vých reziduí pro všechny členy TGF-β rodiny je uvedeno tučně. Potenciální N-glykosylační místo je dvojitě podtrženo.
Obr. 2: je uspořádáním předpověděných sekvencí zralého proteinu lidského GDNF, NTN, PSP a EVN. Sekvence byly uspořádány za použití programu GlustalW. Aminokyselinová rezidua ío konzervovaná mezi všemi třemi proteiny jsou uvedena v černých oblastech rezidua konzervovaná mezi dvěmi nebo třemi sekvencemi jsou šedě stínována. Sedm konzervovaných charakteristických cysteinových reziduí pro všechny členy TGF-β rodiny je uvedeno hvězdičkami nad sekvencí. Pomlčky ukazují na mezeiy začleněné do sekvence k optimalizaci uspořádání.
Obrázek 3: je částečná cDNA sekvence enovinu. Konsensuální sekvence byla získána PCR amplifikací (primární PCR s primery PNHspl a PNHapl a nested PCR s primery PNHsp2 a PNHap2) různých cDNA s následným klonováním a sekvenční analýzou a srovnáním získaným sekvencí. Přepsaný jednopísmenový kód aminokyselinové sekvence nukleotidů 30 až 284 (čtecí rámec A) je uveden nad sekvencí a je číslován směrem doprava (Al až A85). Tento čtecí rámec obsahuje domnělý ATG translační startovací kodón. Přepsaný jednopísmenový kód aminokyselinové sekvence nukleotidů 334 až 810 (čtecí rámec B) je uveden nad sekvencí a je číslován směrem doprava (B1 až B159). Tento čtecí rámec obsahuje oblast homologie s GDNF, NTN a PSP. Počet nukleotidových reziduí je uveden napravo od DNA sekvence. Domnělé RXXR štěpící místo pro prodoménu je uvedeno tučně a podtržené. Domnělý start zralého proteinu je uveden tučně a podtržené. Domnělý start zralého proteinu je uveden šipku. Sedm konzervovaných charakteristických cysteinových reziduí pro všechny členy TGF-β rodiny je uvedeno tučně. Potenciální N-glykosylační místo je dvojitě podtrženo.
Obrázek 4; je vyobrazením chromozomální lokalizace lidského Enovinu. (A) schéma výsledku
FISH mapování pro Enovin. Každá tečka představuje dvojité FISH signály detekované na lidském chromozómu 1, oblast p31,3-p32. (B) Příklad FISH mapování Enovinu. Levý panel ukazuje FISH signály na chromozómu 1. Pravý panel ukazuje stejný mitotický obrázek barvený 4‘,6‘diamidino-2-fenylindol za účelem identifikace chromozómu 1,
Obrázek 5: je vyobrazením exprese Enovinu v různých lidských tkáních. (A), (B), (C) Analýza Northern blot tkáňové exprese Enovinu. Exprese mRNA Enovinu v různých lidských tkáních byla posuzována za použití próby odpovídající části kódující oblasti Enovinu (zahrnující oblast kódující zralý Enovinový protein), aby mohly být analyzovány bloty lidské poly(A) bohaté RNA. (A) Mnohočetný tkáňový Northern (MTN), blot, (Β) MTN blot II, (C) fetální MTN blot II. panel (D) ukazuje autoradiografii lidského RNA master blotu s použitím stejného Enovin cDNA fragmentu jako próby. Panel (E) ukazuje lokalizaci mRNA vzorků lidské tkáně na RNA master blotu z (D),
Obrázek 6: je grafickou ilustrací celkového přežívání SH-SY5Y buněk po 72 hodinách léčby
10-6M taxolem a účinek zvyšujících se dávek enovinu na toto přežívání, normalizovaného na podmínky rozpouštědla. SH-SY5Y buňky jsou diferencovány po dobu 5 dnů pomocí 25nM staurosporinu před aplikací taxolu. Data jsou z dvou nezávislých experimentů v sextapletu. Jsou uvedeny průměry a směrodatné odchylky.
Obrázek 7: je grafickým znázorněním účinku zvyšujících se koncentrací enovinu po dobu 48 hodin růstu neuritu SH-SY5Y buněk diferencovaných staurosporinem s normalizací na podmínkách rozpouštědla. SH-SY5Y buňky jsou diferencovány po dobu 5 dnů pomocí 25nM staurosporinu před zahájením 48 hodinového experimentu. Jako pozitivní kontrola je uveden diferenciační účinek 25nM staurosporinu. Délka neurinu je vypočtena z alespoň 5000 buněk. Data jsou poskytnuta z experimentů provedených v dubletu. Jsou uvedeny průměry a směrodatné odchylky.
-9CZ 303868 B6
Obrázek 8 až 18: jsou grafickým vyobrazením účinku enovinu na proliferaci různých typů buněk.
Obrázek 19: je grafickým vyobrazením účinku enovinu na senzorické deficity vyvolané taxolem za použití testu bodnutí špendlíkem. Uveden je průměr (± 1 SEM) kumulativních skóre za čas u krys léčených buďto 2 různými dávkami enovinu (23 nebo 130 pg/ml, n= 10 krys/skupinu, nebo vehikula/fyziologický roztok (n = 20 krys) po podání taxolu. Enovin nebo fyziologický roztok/vehikulum byly injikovány v objemu 75 μΐ do subplantámí oblasti pravé zadní tlapky.
Obrázek 20: je grafickým vyobrazením účinku enovinu na senzorické deficity vyvolané taxolem za použití testu bodnutí špendlíkem. Uveden je průměr (±1 SEM) kumulativních skóre za čas u krys léčených buďto 2 různými dávkami enovinu (23 nebo 130pl/ml, n= 10 krys/skupinu, nebo vehikula/fyziologický roztok (n = 20 krys) před podáním taxolu. Enovin nebo fyziologický roztok/vehikulum byly injikovány v objemu 75 μΐ do subplantámí oblasti pravé zadní tlapky.
Obrázek 21: je DNA sekvence enovinu. Konsensuální sekvence byla získána amplifíkací pomocí PCR za použití primerů PNHsp5 a PNHapl na cDNA lidského frontálního kortexu a lidské genomické DNA s následným kolonováním, sekvenční analýzou a srovnání výsledných sekvencí. Předpověděná aminokyselinová sekvence je uvedena nad DNA sekvencí pro pouze sestříhovou variantu, která vede po translaci ke vzniku funkčního Enovinového proteinu. Počet nukleotidových reziduí je uveden nalevo od DNA sekvence, zatímco počet aminokyselinových reziduí je uveden napravo od přepsané proteinové sekvence. 5‘ a 3‘ sestřihová místa detekována srovnáním sekvenovaných cDNA fragmentů s genomickou sekvencí uvedených vertikálních čar probíhajících odleva doprava a jsou postupně očíslovány. Domnělé RXXR furin štěpící místo pro prodoménu je uvedeno tučně a podtržené. Domnělý start zralého proteinu je uveden šipkou. Sedm konzervovaných charakteristických cysteinových reziduí pro všechny členy TGF-β rodiny je uvedeno tučně. Potenciální N-glykosylační místo je dvojitě podtrženo. 5‘ a 3‘ sestřihová místa jsou očíslována a v kroužku.
Obrázek 22: je vyobrazením exprese různých sestřihových variant Enovinu v lidských tkáních (A) schématický diagram sestřihových variant Enovinu identifikovaných pomocí RT-PCR experimentů se specifickými primery pro Enovin na RNA odvozenou z různých lidských tkání s následným klonováním, sekvenční analýzou PCR produktů. Horní čára ukazuje měřítko (v bp). Druhá čára představuje genomické sekvence Enovinu. Jsou uvedeny pozice translačního startovacího a terminačního kodónu startu kódující sekvence zralého Enovinu a 5‘ a 3‘ sestřihových míst (viz Obrázek 21). Pravá část obrázku ukazuje PCR produkty získané pomocí RT-PCR na RNA vaječníku a frontálního kortexu spolu se 100 bp DNA žebříkem. Pozice různých mRNA variant je uvedena spolu s jejich velikostí (od startovacího k ukončovacímu kodónu). Přepsané proteiny jsou uvedeny na levé straně. Obdélníky ukazují oblasti reprezentované v cDNA. Přerušované čáry představují sestříhanou genomickou DNA. Vystínované oblasti představují sekvenci kódující zralý Enovin. Tečkovaná čára označuje start sekvence kódující zralý Enovin. Dva transkripty schopné vzniku funkčního Enovinového proteinu jsou značeny hvězdičkou na levé straně. (B) Tkáňové rozložení hlavních sestřihových variant. Fotografie ukazuje PCR fragmenty získané pomocí RT-PCR se specifickými primery pro enovin na různých lidských cDNA. Čtyři hlavní sestřihová varianty (A až D) jsou označeny šipkami na levé straně. Velikosti jsou uvedeny na pravé straně na základě 100 bp DNA žebříku použitém jako standard velikostí na gelu.
Obrázek 23: Předpověděná proteinová sekvence dlouhé sestřihové sekvei sestřihem dvou intronů ze sekvence DNA z Obrázku 21. Sestřihová místa ‘ žita k odstranění prvního intronu a sestřihová místa 5‘-2 a 3‘-3 jsou použit ho intronu. To vede k sekvenci cDNA mající otevřený čtecí rámec kódující kyselinovými rezidui uvedený výše íce enovinu, získaná ‘-1 a 3‘-1 jsou poua k odstranění druhéprotein s 228 amino-10CZ 303868 B6
Obrázek 24: Předpověděná proteinová sekvence alternativní (krátké) sestřihové sekvence enovinu, získaná sestřihem dvou intronů ze sekvence DNA z Obrázku 22. Sestřihová místa 5‘-1 a 3‘-2 jsou použita k odstranění prvního intronu a sestřihová místa 5‘-2 a 3‘-3 jsou použita k odstranění druhého intronu. To vede k sekvenci cDNA mající otevřený čtecí rámek kódující protein s 220 aminokyselinovými rezidui uvedený výše. Tato proteinová sekvence postrádá 8 aminokyselinových reziduí ve srovnání se sekvencí z Obrázku 23.
Obrázek 25: je grafickým zobrazením výsledků získaných z experimentů určených ke srovnání hladin exprese enovinu v normální nemocné tkáni. Exprese enovinu a GAPDH je reprezentována v mozkové tkáni, s ohledem na roztroušenou sklerózu a Alzheimerovu chorobu.
Obrázek 26: je grafickým zobrazením výsledků získaných k detekci hladin exprese enovinu a GAPDH u Parkinsonovi nemoci a nádorů.
Následující příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Depozice
Plazmid EVNmat/pRSETB zahrnující DNA sekvenci kódující enovin byl deponován 6. května 1999 pod přístupovým číslem LMBP3931 v Belgických koordinovaných sbírkách mikrobiologie (BCCM) v Laboratorium voor Moleculaire - Plasmidencollectie (LMBP) B9000, Gent, Belgie, ve shodě s ustanovením Budapešťské smlouvy z 28. dubna 1997.
Materiál a metody
Materiál
Nativní Taq polymeráza, ampicilin, IPTG (izopropyl-p-D-thiogalaktozid), X-gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-|3-D-galaktopyranozÍd) a všechny použité restrikční enzymy byly zakoupeny od společnosti Boehringer Manheim (Manheim, Německo). 10 mM směs dNTP byla zakoupena od společnosti Life Technologie (Gaithersburg, MD, USA). TOPO-TA klonovací kit byl zakoupen od společnosti Invitrogen BV (Leek, Nizozemí). Qiagen plazmid mini- nebo midi-DNA purifikační kit, Qiaprep Spin Minipep kit a Qiaquick gel extrakční kit byly zakoupeny od společnosti Qiagen GmbH (Dusseldorf, Německo). cDNA knihovny, Marathon™ Ready cDNA kity, panely I a II lidské mnohočetné tkáňové cDNA (MTC™), mnohočetné tkáňové northem bloty a Advantage-GC cDNA PCR kit byly získány od společnosti Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA). Všechny PCR reakce byly provedeny v cykléru GeneAmp PCR systém 9600 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA). LB (Luria-Bertani) médium se skládá z 10 g/1 tryptonu, 5 g/1 kvasničného extraktu a 10 g/1 NaCl. 2x YT/ampicilinové plotny se skládají z 16 g/1 tryptonu, 10 g/1 kvasničného extraktu, 5 g/1 NaCl, 15 g/1 agaru a 100 mg/1 ampicilinu. Hledání homologie v databázi a srovnání sekvencí
Za použití kompletních z cDNA odvozených proteinových sekvencí neurotrofického faktoru odvozeného z buněčné linie lidských gliálních buněk (GDNF, přístupové číslo Q99748), neurturinu (TNT, přístupové číslo P39905) a persefinu (PSP, přístupové číslo AF040962), jakožto hledaných sekvencí, bylo provedeno BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. 1990), vyhledávání v denně doplněných databázích EMBL/GenBank human expressed sequence tag (EST) a v genomických databázích.
- 11 CZ 303868 B6
Další BLAST vyhledávání bylo provedeno za použití genomické sekvence s přístupovým číslem AC005038 a několika EST přítomných v databázi GenBank, a byla detekována homologie k této genomické sekvenci.
Procento shodnosti a procento podobnosti mezi členy GDNF rodiny byla vypočítána pomocí párového srovnání sekvencí za použití programu BESTFIT (Genetics Computer Group Softwarový balíček pro sekvenční analýzu, verze 8,0, Univerzita Winsconsin, Madison, WI, USA).
Srovnání DNA nebo proteinových sekvencí bylo provedeno pomocí srovnávacího programu ClustalW (Embl, Heidelberg, Německo).
Syntéza oligonukleotidů pro PCR a DNA sekvenci
Všechny oligonukleotidové primery byly objednány od společnosti Eurogentec (Seraing, Belgie). Pro inzerci specifické sekvenční primery (15- a 16-timery) a primery pro použití v PCR reakcích byly navrženy manuálně. DNA byla připravena na Qiangen GmbH-tip-20 nebo- 100 anexové koloně nebo na Qiaquick stáčecí koloně (Qiagen GmbH, Dusseldorf, Německo) a získaná z kolon v 30 μΐ TE-pufru (lOmM Tris.HCl, lmM EDTA (sodná sůl), pH 8,0).
Sekvenační reakce byly provedeny na obou vláknech za použití sekvenačního kitu ABI prism BigDye Terminátor Cycle na sekvenátoru Applied Biosystems 377X1 (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA). Software Sequencher™ byl použit k uspořádání sekvence a k manuální editaci (GeneCodes, AnnArbor, MI, USA).
Klonování nového GDNF homologa
DNA oblast překrývající nukleotidy 67411 až 68343 pod EMBL přístupovým číslem AC005038, z níž předepsaná proteinová sekvence byla homologní se zralým NTN a PSP byla použita k navržení oligonukleotidových primerů pro PCR amplifíkaci. Použité odlišné primery jsou uvedeny v Tabulce 1.
Tabulka 1: Primery použité PCR amplifíkaci fragmentů AC005038
Název primeru Sekvence primeru
PNHspl 5'-CGTTGCACTCAGGTGATTCCTCC-3'
PNHsp2 5'-ggcagcaaacccattatactggaacc-3'
PNHsp3 5'-CGCTGGTGCAGTGGAAGAGCC-3'
PNHsp4 5'-CTGCACCCCCATCTGCTCTTCC-3'
PNHapl 5'-GCAGGAAGAGCCACCGGTAAGG-3'
PNHap2 5'-CCAGTCTGCAAAGCCCTGGAGC-3'
Primery PNHsp3 a PNHapl byly použity k amplifíkaci fragmentu o 502 bp na cDNA odvozené z různých lidských tkání (cDNA z fetálního mozku, celého plodu, marathon-Ready™ cDNA z prostaty nebo z plic (Clontech Laboratories), cDNA z frontální kůry, hippkampu a mozečku), a na lidské genomické DNA. Na základě genomické sekvence z databáze EMBL/GenBank (přístupové číslo AC005038) bylo předpovězeno, že fragment určený k amplifíkaci má G+C obsah 76 %. Proto byly amplifikace provedeny za použití Advantage-GC cDNA PCR amplifíkaci GC bohatý DNA sekvencí. PCR reakce byly provedeny v celkovém objemu 50 μΐ, obsahujícím 1 x GC cDNA PCR reakční pufr, 0,2mM dNTP, 1M GC-MELT™, 200nM primery PNHsp3 a PNHapl, 1 μΐ směsi Advantage KlenTaq polymerázy a 1 a 5 μ} cDNA nebo 0,5 μg genomické DNA. Vzorky byly zahřívány na 95 °C po dobu 5 minut a cyklizace byla prováděna
- 12CZ 303868 Β6 s při teplotě 95 °C, 1 minutu při teplotě 58 °C a 40 s při teplotě 72 °C pro 35 cyklů s finálním krokem 7 minut při teplotě 72 °C. Vzorky byly nakonec podrobeny reakci s 2,5 U nativní Taq DNA polymerázy, aby se vytvořil přečnívající konec. PCR produkty byly analyzovány na 1% (w/v) agarózovém gelu v lx TAE pufru (40mM Tris acetát, lmM EDTA (sodná sůl), pH 8,3). PCR fragmenty očekávané velikosti (495 bp) byly vyříznuty z gelu a purifikovány pomocí Qiaquick gel extrakčního kitu. PCR fragmenty byly sekvenovány, aby se potvrdila jejich identita, a dále klonovány do plazmidového vektoru pCR2.1-TOPO za použití TOPO TA klonovacího kitu podle instrukcí výrobce. Přibližně 20 ng purifikovaného fragmentu bylo z kombinováno s 1 μΐ pCR2.1-TOPO vektoru v celkovém objemu 5 μΐ. Reakce byly inkubovány při pokojové teplotě (20 °C) po dobu 5 minut. 2 μΐ reakční směsi byly transformovány do TOP1OF‘ kompetentních buněk (Invitrogen BV) za použití transformace tepelným šokem a umístěny na 2x YT/ampicilinové plotny suplementované lOmM IPTG a 2% (w/v X-gal pro modrobílé zobrazení. Bílé kolonie po růstu přes noc byly vyjmuty z ploten, byly ponechány růst v 5 ml LB média suplementovaného 100 mg/1 ampicilinu a plazmidovou DNA připravenou za použití Qiaprep Spin Miniprep kitu. Přítomnost inzertu o očekávané velikosti byla potvrzena restrikčním natrávením pomocí EcoRI. Plazmidový inzert několika pozitivních klonů byl sekvenován a získané sekvence byly pozorovány za použití srovnávacího programu ClustalW.
Aby bylo možné získat další kódující sekvenci nového homologa GDNF, byl amplifikován pomocí PCR fragment s očekávanou velikostí 931 bp na podkladě sekvence z EMBL/GenBank (přístupové číslo AC005038) za použití primerů PNHspl a PNEIapl. PCR reakce byly provedeny v celkovém objemu 50 μΐ, obsahujícím lx GC cDNA PR reakční pufr, 0,2mM dNTP, 1M GC-MELT™, 200nM primery PNEIspl a PNHapl, 1 μΐ směsi Advantage KlenTaq polymerázy a 1 až 5 μΐ cDNA z mozečku, frontální kůry nebo hipokampu, nebo 0,5 pg genomické DNA. Vzorky byly zahřívány na 95 °C po dobu 5 minut a cyklizace byla prováděna 45 s při teplotě 95 °C, 1 minutu při teplotě 58 °C a 1 minuta 30 s při teplotě 72 °C pro 35 cyklů s finálním krokem 7 minut při teplotě 72 °C. PCR produkty byly analyzovány na 1% (w/v) agarózovém gelu v lx TAE pufru (40mM Tris acetát, lmM EDTA (sodná sůl), pH 8,3). Druhé kolo amplifikace bylo provedeno pomocí vložených primerů (PNHsp2 a PNHap2). 1 μΐ reakční směsi z prvního kola amplifikace bylo použito v celkovém objemu 50 μΐ, obsahujícím lx GC cDNA PR reakční pufr, 0,2mM dNTP, 1M GC-MELT™, 200nM primeiy pNHsp2 a PNHap2 a 1 μΐ směsi Advantage KlenTaq polymerázy. Vzorky byly zahřívány při teplotě 95 °C po dobu 5 minut a cyklizace byla prováděna 45 s při teplotě 95 °C, 1 minutu při teplotě 58 °C a 1 minutu a 30 s při teplotě 72 °C pro 35 cyklů s finálním krokem 7 minut při teplotě 72 °C. Vzorky byly analyzovány na 1% (w/v) agarózovém gelu a lx TAE pufru. PCR fragmenty očekávané velikosti (870 bp) byly vyříznuty z gelu a purifikovány pomocí Quaquick gel extrakčního kitu. PCR fragmenty byly sekvenovány pomocí Qiaquick gel extrakčního kitu. PCR fragmenty byly sekvenovány, aby se potvrdila jejich identita, a podrobeny reakci s 2,5 U Taq polymerázy a klonovány do plazmidového vektoru pCR2.1-TOPO za použití TOPO TA klonovacího kitu podle instrukcí výrobce. Přibližně 20 ng purifikovaného fragmentu bylo zkombinováno s 1 μΐ pCR2.1-TOPO vektoru v celkovém objemu 5 μΐ. Reakce byly inkubovány při pokojové teplotě (20 °C) po dobu 5 minut. 2 μΐ reakční směsi byly transformovány do TOPÍ OF' kompetentních buněk (Invitrogen BV) za použití transformace tepelným šokem a umístěny na 2x YT/ampicilinové plotny suplementované lOmM IPTG a 2% (w/v) X-gal pro modrobílé zobrazení. Bílé kolonie po růstu přes noc byly vyjmuty z ploten, byly ponechány růst v 5 ml LB média suplementovaného 100 mg/1 ampicilinu a plazmidovou DNA připravenou za použití Qiaprep Spin Miniprep kitu. Přítomnost inzertu o očekávané velikosti byla potvrzena restrikčním natrávením pomocí ExoRI. Plazmidový inzert několika pozitivních klonů byl sekvenován a získané sekvence byly porovnány za použití srovnávacího programu ClustalW.
Analýza exprese gelu pro enovin pomocí analýzy RT-PCR
Oligonukleotidové primery PNHsp3 a PNEIapl (viz tabulka 1) byly použity k specifické PCR amplifikaci fragmentu enovinu o 502 bp. PCR amplifikace byly provedeny na panelech lidské cDNA z mnoha tkání (MTC™) normalizované na koncentrace exprese mRNA šesti odlišných
- 13CZ 303868 B6 provozních (housekeeping) genů. PCR reakce s primery specifickými k enovinu gely provedeny v celkovém objemu 50 μΐ, obsahujícím 1 x GC cDNA PCR reakční pufr, 0,2 mM dNTP, 1M GC-MELT™, 400nM primery PNHsp3 a PNHapl a 1 μΐ směsi Ádvantage KlenTaq polymerázy. Vzorky byly zahřívány na 95 °Č po dobu 30 s při teplotě 68 °C. Vzorky byly analyzovány na 1,2% (w/v) agarózovém gelu v lx TAE pufru (40mM Tris acetát, lmM EDTA (sodná sůl) pH 8,3) a zobrazení ethidium bromidem obarvených gelů bylo získáno za použití Eagle Eye II Video systému (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
Vyhledávání podobnosti v denně doplňované databázi EMBL/GenBank proteinových sekvencí lidského neurturinu a persefinu vedlo k získání sekvence genomické DNA kódující domnělý nový protein podobný n eurotrofickým faktorům GDNF, NTN a PSP, která byla nazvána enovin (EVN). Další vyhledávání homologie v databázi za použití sekvence genomické DNA obklopující oblast kódující enovin vedlo k získání několika lonů s exprimovaným sekvenčním koncem (EST) odvozených z různých lidských tkání (epitel prostaty, přístupové číslo AA533512 (ID1322952), karcinom plic, přístupové číslo AA931637 a nádor příštipnýčh tělísek, přístupové číslo AA844072). Tyto klony obsahují DNA sekvenci mimo oblast homologie s GDNF, PSP nebo NTN, ale potvrdily, že mRNA enovinu je exprimována v normálních a nádorových tkáních.
Původní PCR amplifikace za použití primerů (PNHsp3ě a PNHapl) na podkladě genomické sekvence vedla k získání fragmentu o velikosti zhruba 500 bp z cDNA plodu, fetálního mozku, prostaty, frontální kůry, hipokampu, mozečku a genomické DNA, ale ne z plicní cDNA. Klonování a sekvenování těchto fragmentů vedlo ke vzniku DNA sekvence o 474 bp, která se přepsala do předpověděné proteinové sekvence o 139 aminokyselinových reziduích zahrnujících sedm konzervovaných cysteinových reziduí charakteristických pro všechny členy rodiny proteinů transformujícího růstového faktoru β (TGF-β) (Kingsley, 1994) (Obrázek 1). Sekvence také obsahovala RXXR motiv po štěpení prodomény (RAAR, aminokyselinová pozice 23 až 26), (Barr, 1991). Podobné štěpící místo je přítomno také v sekvencích GDNF, NTN a PSP ve srovnatelné pozici v sekvenci prodomény. Za předpokladu, že ke štěpení prodomény enovinu dochází na tomto místo za podmínek in vivo, obsahuje zralá proteinová sekvence ENV 113 aminokyselinových reziduí (rezidua 27 až 139 na Obrázku 1 a má vypopítanou molekulovou váhu 11965 Da a izoelektrický bod 11,8. Ve zralé sekvenci existuje jedno potenciální glykosylační místo (NST v aminokyselinové pozici 121-123). Navíc bylo u enovinu přítomno několik oblastí konzerovaných mezi zralými formami známých neurotrofických faktorů GDNF, NTN a PSP (Obrázek 2). Tabulka 2 sumarizuje výsledky srovnání zralých proteinových sekvencí členů rodiny GDNF pomocí programu BESTFIT. Jsou uvedena procenta identity a podobnosti. Zralé sekvence GDNF, NTN, PSP a EVN použité v tomto srovnání začínaly na prvním aminokyselinovém reziduu po RXXR štěpícím místě.
Tabulka 2: párové srovnání zralých členů rodiny lidského GDNF za použití programu BESTFIT.
srovnání % identity % podobnosti
EVN vs GDNF 38,8 47,2
EVN vs NTN 51 56, 1
EVN vs PSP 53, 3 57,8
GDNF VS NTN 44, 8 57,3
GDNF vs PSP 44,3 50
NTN vs PSP 50 54,4
Z těchto srovnání je zřejmé, že zralý enovinový protein má bližší příbuznost s persefinem a neurturinem než s GDNF.
- 14CZ 303868 Β6
Amplifikace, klonování a sekvenční analýza většího fragmentu DNA sekvence enovinu z cDNA frontální kůry za použití primerů na podkladě genomické EMBl/GenBank sekvence (přístupové číslo AC005038) vedlo ke vzniku sekvence o 819 bp (Obrázek 3). Tato sekvence obsahuje domnělý ATG startovací kodón v nukleotidových pozicích 30-32 a vedla ke vzniku otevřeného čtecího rámce (čtecí rámec A na obrázku 3), který přesahuje až k terminačnímu kodónu v nukleotidových pozicích 285-287. Přepsaná proteinová sekvence této oblasti nevykazuje podobnost s žádným známým proteinem v databázích. Translace cDNA sekvence v druhém čtecím rámci (čtecí rámec B na aminokyselinových reziduích. Tato sekvence obsahuje RXXR štěpící místo (pozice B43 až B46, nukleotidová pozice 460-471) a sekvenci odpovídající sekvenci zralého enovinu (pozice B47 až B159, nukleotidová pozice 472-810). Otevřený čtecí rámec včetně RXXR štěpícího místa a sekvence kódující zralý enovin přesahuje z nukleotidová pozice 334 (která přechází terminační kodón v čtecím rámci) do zastavujícího kodónu v pozici 811-813, ale neobsahuje ATG kodón pro startující methioninové reziduum. Analogicky k persefinu (Mildbrandt et al., 1998) hypotetizujeme, že ve většině mRNA transkriptů z genu EN je přítomen nesestříhaný intron. GDNF a NTN mají také intron v jejich odpovídajících oblastech kódujících prodoménu (Matsushita et al., 1997, Heuckeroth et al., 1997).
V vyhodnocení různých mRNA transkriptů pro Enovin byly provedeny RT-PCR experimenty za použití primerů umístěných na 5‘ konci sekvence kódující Enovin v 5‘ směru od ATG startovacího kodónu (primer PNHsp5 (5‘-GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3‘) a vložený primer PNHsp6 (5‘—GGT GGG GGA ACA GCT CAA TGG—3‘) a na 3‘ konci (primer PNHapl a vložený primer PNHap2 (viz Tabulka 1).
Experimenty byly provedeny na cDNA panelech mnohočetné lidské tkáně (Clontech MTC panely I a II), na cDNA knihovně fetálního srdce (Clontech) a na cDNA odvozené z lidského mozečku, hipokampu a frontální kůry (Masure et al., 1998). Primární PCR reakce byly provedeny s příměry PNHsp5 a PNHapl za podmínek nadbytku GC (Advantage CG-PCR kit, Clontech) ve 30 cyklech (95 °C - 30 s, 60 °C - 30 s, 72 °C - 1 minuta), jak bylo popsáno. Vložené PCR reakce byly provedeny na 1 μΐ primárního PCR produktu za použití primerů PNHsp6 a PNHap2 za stejných podmínek ve 30 cyklech. Výsledné PCR produkty byly analyzovány na 1,5% agarózovém gelu a jejich velikost byla v rozmezí od ±350 bp do ±800 bp. Některé proužky byly puntíkovány z gelu a PCR fragmenty byly sekvenovány přímo. Některé purifikované PCR produkty byly také klonovány ve vektoru pCR2.1-TOPO (TOPO-TA cloning kit, Invitrogen) a poté sekvenovány. Sekvenční analýza potvrdila existenci různých mRNA molekul obsahujících sekvenci Enovinu. Získané sekvence fragmentu byly porovnány se sekvencí genomického Enovinu. To nám umožnilo identifikovat několik možných 5‘ a 3‘ sestřihových míst v genomické sekvenci (obrázek 21). Všechny tato sestřihová místa odpovídali konsensuálním sekvencím pro donorová a akceptorová sestřihová místa (Seanpathy, P., Shapiro, M.B., Harris, N.L. (1990) Splice Junctions, branch point sites, and exons: sequence statistics, identifícation, and applications to genome project. Methods Enzymol. 193, 252-278). Identifikované různé sestřihová varianty Enovinu a jejich přítomnost v různých lidských tkáních jsou sumarizovány na Obrázku 22. Pouze 2 z 5 sekvenovaných transkriptů vedly ke vzniku funkčního Enovinového proteinu po translaci z ATG startovacího kodónu. Tyto dva transkripty kódují proteiny o 228 nebo 220 aminokyselinách s předpověděnými signálními peptidy s 47 a 39 aminokyselinovými rezidui. Předpověděné proteinové sekvence těchto dvou variant jsou uvedeny na Obrázku 23 (dlouhá varianta) a na Obrázku 24 (krátká varianta). Dlouhá varianta může být odečtena ze sekvence DNA z Obrázku 21 sestřihem prvního intronu v místech 5‘—1 a3‘-l a druhého intronu v místech 5‘-2 a 3‘-3. Po translaci otevřeného čtecího rámce je získána předpověděná proteinová sekvence z Obrázku 23. Kratší varianta může být odečtena z DNA sekvence z Obrázku 21 sestřihem prvního intronu v místech 5‘-1 a 3‘-2 druhého intronu v místech 5‘-2 a 3‘-3. Po translaci otevřeného čtecího rámce je získána předpověděná proteinová sekvence z Obrázku 24.
- 15CZ 303868 Β6
Nejdelší transkript se zdá být nejhojněji zastoupen ve většině tkání, jak je vidět z intenzity proužků na Obrázku 22B. Kratší transkripty vedou k posunům rámce za vzniku přepsaného proteinu postrádajícího aminokyselinovou sekvenci zralého Enovinu homologní s GDNF, NTN a PSP. Dva nejmenší transkripty dokonce postrádají část zralé kódující sekvence včetně dvou ze sedmi konzervovaných cysteinových reziduí. Na Obrázku 22B je zobrazeno rozložení hlavních sestřihových variant v různých lidských tkáních. Funkční mRNA Enovinu je exprimována v téměř všech testovaných tkáních, včetně mozku, srdce, ledvin, jater, plic, pankreatu, kosterních svalů, tlustého střeva, tenkého střeva, leukocytů periferní krve, sleziny, thymu, prostaty, varlete, vaječníku, placenty a fetálního srdce. V některých lidských tkáních (např mozeček, hipokampus), mohou být pomocí PCR amplifikovány pouze nefunkční transkripty. Pokud je nám známo, výskyt nefunkčních mRNA transkriptů nebyl v takové míře doposud popsána. Biologický význam tohoto nálezu zůstává otázkou k dalšímu studiu. Ačkoli exprese NTN a PSP v různých tkáních nebyla plně charakterizována, úroveň jejich exprese se zdá být mnohem nižší a exprese je mnohem omezenější na určité tkáně (Kotzbauer et al., 1996, Milbrandt et al., 1998).
Rekombinantní exprese Enovinu v E. coli. Konstrukce plazmidu exprimujícího Enovinu
414 bp PCR fragment byl amplifikován z lidské genomické DNA pomocí primerů PNHsp4 a PNHap2 (Tabulka 1) a klonován ve vektoru pCR2.1-TOPO za použití TA-klonování (Invitrogen). Sekvence inzertu byla potvrzena sekvenční analýzou. Jeden klon obsahující inzert s konsensuální sekvencí Enovinu (klon 36) byl použit pro následnou konstrukci exprimujícího plazmidu. Dva primery byly navrženy, aby obsahovaly příslušná konstrukční místa na jejich 5‘ konci. Přední primer PNHexp-spl (5‘-GcG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A —3‘) obsahoval BamHI restrikční místo (podtrženo) a reverzní primer PNHexp-apl (5 ‘-GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G -3‘) obsahoval Xhol restrikční místo (také podtrženo). Za použití těchto primerů byl 343 bp fragment kódující zralý Enovin (pozice 81 až 422 na Obrázku 1) amplifikován z klonu 36. PCR reakce byla provedena v celkovém objemů 50 μΐ, obsahujícím 1 x GC cDNA PCR reakční pufr, 0,2mM dNTP, 1M GC-MELT™, 200nM primery PNHexp-spl a PNHexp-apl, 1 μΐ směsi Advantage KlenTaq polymerázy 10 ng plazmidóvé DNA z klonu 36. Vzorky byly zahřívány na 94 °C po dobu 5 minut a cyklizace byla prováděna 45 s při teplotě 94 °C, 1 minutu při teplotě 58 °C a 30 s při teplotě 72 °C pro 25 cyklů s finálním krokem 7 minut při teplotě 72 °C. Výsledných 50 μΐ produktu bylo purifíkováno pomocí Qiaquick PCR purifíkačního kitu (Quiagen) a DNA byla eluována ve 30 μΐ. 25 μΐ tohoto purifikovaného produktu bylo poté naštěpeno v 30 μΐ reakční směsi slOU BamHI a 10 U Xhol vlx pufruB (Boehringer Manheim) po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Po elektroforéze na 1% (w/v) agarózovém gelu v lx TAE pufru (40mM Tris acetát, lmM EDTA (sodná sůl), pH 8,3), byl očekávaný 353 bp proužek vyříznut z gelu a purifikován za použití Qiaquick extrakčního kitů. Výsledný fragment byl ligován ve vektoru pRSET B (Invitrogen) linearizovaném pomocí BámHI a Xhol. Inzert výsledného plazmidového konstruktu (hEVNmat/pRSETB) byl potvrzen kompletní sekvenční analýzou. Výsledný konstrukt kóduje protein o 164 aminokyselinách s předpověděnou molekulární váhou 15704 Da včetně NH2-konce 6x His-tag fúzovaném v rámci ke kódující sekvenci zralého Enovinu. NH2- konec aminokyselinové sekvence výsledného proteinu je tedy MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS (sekvence zralého Enovinu je vyznačena tučně, 6x His-tag je vyznačen podtržené).
Exprese Enovinu v BL21 (DE3) E. coli
Rekombinantní produkce Enovinového proteinu byla provedena stejně, jak je popsáno pro Neurturin Creedonem et al. (1997) s modifikacemi. Pro produkci rekombinantního Enovinového proteinu byl transformován plazmid hEVNmat/pRSETB v kmeni E. coli BL21 (DE3) Novagen a ponechán růst ve 2xYT/ampicilinovém médiu (16 g/1 tryptonu, 10g/l kvasničného extraktu, 5g/lNaCl a 100mg/l ampicilinu) při teplotě 30 °C (225 otáček za minutu) nebo 37 °C (300 otáček za minutu) do hodnoty optické denzity přibližně 0,5 před přidáním IPTG koncentrace 0,2mM k indukci exprese. Buněčné pelety byly posbírány centrifugací po 3 hodinové indukční periodě, promyty fosfátovým pufrem, centrifugovány a uskladněny zamrazením. Pro purifikaci
- 16CZ 303868 B6 a rozvolnění byly buněčné pelety resuspendovány v sonikačním pufru (20mM Tris-Hcl, pH 8,0, 300mM NaCl, lmM 2-merkaptoethanol, inhibitory proteáz (koktejlové tablety inhibitorů proteáz Complete™ (Boehringer Manheim, 1 tableta na 50 ml pufru) a 1 mg lysozymu na 500 mg buněčné pelety). Buňky byly rozrušeny sonikací a inkluzní tělíska byla posbírána centrifugách Inkluzní tělíska byla rozpuštěna a inkubována v pufru A (8M urea, 20mM Tris-Hcl pH 7,6, 200mM NaCl, lmM 2-merkaptoethanol) po dobu 30 minut při teplotě 37 °C před přidáním Ni-NTA pryskyřice (nikl nitriolotrioctová kyselina, Qiagen). Po 40 minutách protřepávání při 37 °C, byly vzorky jednou promyty pufrem A a naneseny na 5 ml Ni-NTA kolonu. Kolona byla promyta 10 objemy kolony pufru A, 10 objemy kolony pufru A při pH 7,2 a 10 objemy kolony pufru A při pH 7,2 + lOmM imidazol. Enovin byl eluován z kolony ve 4 objemech kolony pufru A při pH 7,2 + 200mM imidazol.
Rozvolnění Enovinu bylo provedeno dialýzou přes noc po jednotlivých krocích při teplotě 4 °C v renaturačním pufru (0,lM fosfát sodný, 0,15M NaCl, 3 μΜ cystein, 0,02% Tween-20, 10% glycerol, 0,01M tris-HCl, pH 8,3) obsahující snižující se množství urey v každém kroku (6M až 4M až 3M až 2M až 1M až 0,5M až 0M urea). Purifikovaný protein byl rozdělen na alikvóty, uložen při -20 °C a dále použit pro funkční testy.
Chromozomální lokalizace genu pro Enovin
3,3 kb fragment genu pro Enovin byl amplifíkován z mozečkové cDNA za použití primerů EVN(7)-spl (5‘-TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC - 3‘) a PNHapl (5‘- GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G - 3‘) navržených podle sekvence z EMBL pod přístupovým číslem AC005038. PCR reakce byla připravena v celkovém objemu 50 μΐ obsahujícím lx Expand Long Template PCR reakční pufr (Boehringer Manheim), 0,5mM dNTP, 1M GC-MELT ((Clontech Laboratories), 400mM primery EVN (7)—spi a PNHapl a 1 μΐ mozečkové cDNA. Po úvodních 2 minutách při teplotě 94 °C bylo přidáno 0,75 μΐ Expand Long Template polymerázy (Boehringer Manheim) 58 % a 3 minuty při teplotě 68 °C pro 10 cyklů. Poté bylo provedeno dalších 20 cyklů zvyšujíce prodlužování času při teplotě 68 °C o 20 sekund každým cyklem. Zahrnuto bylo také finálních 7 minut při teplotě 68 °C. Výsledný 3,3 kb fragment byl purifikován po elektroforéze a 0,8% agarózovém/TAE a klonován ve vektoru pCR2.1-TOPO za použití TA klonování (Invitrogen). Kompletní sekvenční analýzy 3,3 kb inzertu jednoho klonu potvrdila, že získaná cDNA sekvence koresponduje s genomickou sekvencí v EMBL databázi (přístupové číslo AC005038). Žádný intron nebyl vystřižen z CDNA získané z mozečkové cDNA.
Studie chromozomálního mapování byly provedeny za použití analýzy fluorescenční in šitu hybridizace (FISH) tak, jak je popsáno (Heng et al., 1992, Heng tsui, 1993). Lidské lymfocyty byly kultivovány při teplotě 37 °C po dobu 68 až 72 hodin před reakcí s 0,18 mg/ml 5-bromo2‘—deoxyuridinu (BrdU), aby se synchronizovaly buněčné cykly v buněčné populaci. Synchronizované buňky byly promyty a rekultivovány při teplotě 37 °C po dobu 6 hodin. Buňky byly posbírány a byly z nich připraveny preparáty za použití standardních postupů zahrnujících přípravu v hypotonickém roztoku, fixaci a vysušení. 3,3 kb próba pro Enovin byla biotinylována a použita pro FISh detekci. Preparáty byly zahřívány při teplotě 55 °C po dobu 1 hodiny, podrobeny reakci s RNázou a denaturovány v 70% formamidu v 2x NaCl/Cit (20x NaCl/Cit, což je 3m NaCl, 0,3M dvojsodný citrát, pH 7,0) po dobu 2 minut při teplotě 70 °C s následnou dehydratací ethanolem. Próba byla denaturována před nanesením na denaturovaná chromozomální sklíčka. Po hybridizaci probíhající přes noc byla sklíčka promyta a byly separátně zaznamenány na fotografický film FISH signály a 4‘,6-diamidino-2-fenylindol barvící se proužky a přiřazení údajů FISH mapování s chromozomálními proužky bylo dosaženo superimpozicí FISH signálů s 4‘,6-diamidino-2-fenylindol barvící se chromozómy (Heng a Tsui, 1993). Za použitých podmínek byla účinnost hybridizace přibližně 72% pro tuto próbu (mezi 100 kontrolovanými mitotickými figurami vykázalo 72 z nich signály na jednom páru chromozómu). Protože 4',6diamidino-2-fenylindol identifikace proužků byla použita k identifikaci specifického chromozómu, bylo získáno přiřazení mezi signálem z próby a krátkým raménkem chromozómu 1. Pozice byla dále určena na podkladě přehledu z 10 fotografií (Obrázek 4A). Za použitých podmínek
- 17CZ 303868 B6 nebyl detekován pomocí FISH analýzy žádný další lokus, proto jsme uzavřeli, že Enovinje lokalizován na chromozómu 1, oblast p31,3—p32. Příklad výsledku mapování je uveden na Obrázku 4B.
Z údajů genové mapy v Národním centru pro biotechnologii (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov./genemap), může být odvozeno, že genomický klon obsahující sekvenci Enovinu (EMBL přístupové číslo AC005038) je lokalizován na chromozómu 1 mezi markéry D1S2843 aDlS417. To odpovídá chromozómu 1, oblast p31,1 až p32.3 potvrzujíce údaje získané FISH analýzou. Tkáňové rozložení Enovinu určené pomocí Northern Blotu a dot blotu.
Northern bloty obsahující 2 pg poly(A)-bohaté RNA odvozené z různých lidských tkání (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA, MTN™ blot II) byly hybridizovány podle instrukcí výrobce s a-32P-dCTP náhodně označených (HighPrime kit, Boehringer Manheim) 897 bp Enovinový fragment. Tento fragment byl získán PCR amplifikací s primery PNHspl a PNHapl na cDNA frontální kůry a následným klonováním ve vektoru pCR2,l-TOPO. Fragment obsahuje 897 bp sekvence Enovinu do terminačního kodónu a zahrnuje kompletní kódující sekvenci zralého Enovinového proteinu.
mRNA Enovinu byla detekována jako hlavní transkript přibližně 4,5 kb (Obr. 5A-C). Enovinová mRNA byla exprimována v celé řadě tkání, nejvíce v srdci, kosterním svalu, pankreatu a prostatě. Některé transkripty o menší velikosti jsou přítomny například v placentě (4kb, 2,4 kb a 1,6 kb) a v prostatě (4 kb a 1,6 kb). Ve fetální tkáni je nápadný 2,4 kb transkript přítomný v játrech a do menší míry ve fetální ledvině, v játrech, v plicích a v mozku.
Navíc byl také hybridizován RNA master blot (Clontech Laboratories) obsahující poly(A) bohatou RNA z různých lidských tkání a v různých vývojových stádiích, a to s 897 bp Enovinovou próbou. Poly(A) bohaté RNA vzorky použité pro tvorbu tohoto blotu byly výrobcem normalizovány na mRNA expresní hladiny osmi různých provozních genů.
MRNA Enovinu byla exprimována všude, ale nejvyšší mRNA hladiny byly patrné v prostatě, v hypofýze, v průdušnici, v placentě, ve fetálních plicích, v pankreatu a v ledvině (Obrázek 5D+E).
Konstrukce GFRa-IgG-Fc fúzních vektorů cDNA oblasti GFRa-1, GFRa-2 a GFRa-3 (kódující aminokyseliny 27—427, 20 až 431 a 28 až 371) mimo sekvencí kódujících signální peptid a COOH-terminální hydrofóbní oblast hrající roli vGPI ukotvení byly klonovány v rámci v expresním vektoru Signál plg plus (R+D Systems Europe Ltd). Výsledné proteiny exprimované z těchto konstruktů obsahují NH2 terminální CD33 signální peptid o 17 aminokyselinách, oblast GFRa proteinu a COOH-temiinální fúzní doménu lidského IgGi-Fc proteinu o 243 aminokyselinách. CHO buňky byly transfekovány GFRa fúzním konstruktem a stabilně transfekované buňky byly vybrány za použití 500 pg G418. Permanentní klony byly vybrány za použití anti Fc protilátky. K purifikaci GFRa fúzních proteinů byly buňky podrobeny růstu v médiu bez séra a médium bylo sbíráno další 3 dny. Médium bylo centrifugováno a aplikováno na kolonu s proteinem A (Protein A Sepharose, Pharmacia Biotech). Navázaný protein byl eluován pomocí 0,lM Na citrátu, pH 3,0 a sbírán do 1M Tris pufru, pH 8,4.
xtinkčního koeficienpoužity pro následné
Koncentrace bílkoviny byla odhadnuta z absorbance při 280 nm za použití e tu 1,5. Tyto purifikované rozpustné GFRa-1 až -3 Fc fúzní proteiny byly vazebné studie.
- 18CZ 303868 B6
Povrchová plazmon rezonanční analýza
Experimenty s povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) byly provedeny při teplotě 25 °C za použití zařízení BIAcore 3000. Analýzy byly provedeny s enovinem a NGF jako imobilizova5 nými ligandy. Karboxylovaná matrice F1 senzorového čepu byla nejprve aktivována směsí 1:1 400mM A-ethyl-A-(dimethylaminopropyl)-karbodiimidu a lOOmM A-hydroxy-sukcinimidu po dobu 10 minut. Poté byly rekombinantní enovin a NGF aplikovány na aktivovaný povrch v lOmM acetátovém pufru, pH 4,5 při průtoku 5 μΐ/min. Neokupované reaktivní skupiny byly inaktivovány 1M ethanolaminhydrochloridem. Pro vazebné experimenty byly rozpustné GFRal10 3-FC superfúzovány v koncentracích 10 až lOOnM v HEPES pufru (150mM NaCl, 3,5mM EDTA, 0,05% P-20, lOmM HEPES, pH 7,4) při průtoku 10 μΐ/min. Asociace byla monitorována po dobu 3 minut a disociace po dobu 1 minuty, s následnou regenerací pomocí 5mM NaOH. Disociace byla zahájena superfuzí HEPES pufrem. K výpočtu asociačního stupně (ka), disociačního stupně (kd) a rovnovážných disociačních konstant (KD, vypočteno jako Kd/Ka) byl použit
BIAcore vyhodnocovací software, 3,0.
Výsledky
SPR byla použita k měření vazby rozpustných GFRa 1-3 k imobilizovanému enovinu. Specifická vazba byla detekována pouze u rozpustného GFRa3. GFRal a GFRa2 se na imobilizovaný enovin nevázaly. Pozorovaná vazba GFRa3 byla specifická, protože nedošlo k vazbě kNGF. V separátním kontrolním experimentu byla detekována specifická vazba TrkA-Fc (NGF receptor) k imobilizovanému NGF, bez vazby na imobilizovaný enovin.
Z vazebných křivek získaných za použití tří odlišných koncentrací GFRa byly odvozeny následující konstanty uvedené v Tabulce 3. Tyto výsledky demonstrují, že GFRa3 se váže specificky na enovin.
Tabulka 3
Ka(l/Ms) K^l/s) Kd(M)
GFRa 3 1,65 105 5,08 10'4 3,1 10'5
Protože GDNF, NTN a PSP podporují udržení a přežívání různých typů neuronálních buněk, je předpokládáno, že enovin má podobné biologické účinky na nervové buňky a možná také na další buněčné typy. Proto je předpokládáno, že enovinový protein může být užitečný obecně v léčbě nervových onemocnění, včetně Parkinsonovy choroby, Alzheimerovy nemoci, periferní neuropatie, amyotrofícké laterální sklerózy, Huntingtonovy nemoci, akutního poškození mozku, nádorů nervového systému, roztroušené sklerózy, poškození periferních nervů nebo poškození v důsledku expozice neurotoxinům.
Enovin by mohl být také užitečný v různých aspektech neuroprotekce. Uvážíme-li jeho účinek na přežívání různých populací neuronálních buněk a na pozorovanou extenzi neuritů na našem modelu SHSY5Y buněk, navrhujeme, že tato sloučenina by měla mít neuroprotektivní a neurodegenerativní aplikace.
Toto je založeno na následujícím pozorování. Taxol indukuje neuronální apoptózu u NGF-diferencovaných PC 12 krysích ferochromocytomových buněk (Nuydens et al, odesláno k publikaci). Proto taxol indukovaná cytotoxicita má rysy neuronální apoptózy, jak je monitorováno pomocí DNA fragmentace, značením Annexinu V a bcl-2 protekcí. Proto může být poté odvozeno, že taxol indukuje apoptózu u diferencovaných SH-SY5Y buněk. Pro Enovin je nyní prokázáno, že je schopný snížit buněčné odumírání a proto může obecně zvrátit neuronální apoptózu.
- 19CZ 303868 B6
Přestože to není předmětem vynálezu, může proto být tato sloučenina užitečná v následujících neurodegenerativních stavech, v kterých byla apoptóza pozorována. Jedná se iktus (Hakim 1998), Parkinsonovu nemoc (Marsden et al 1998), Alzheimerovu nemoc (Nagy et al 1998), Huntingtonovu chorobu (Wellington et al 1997), neurotrauma (Smimova et al 1998), periferní neuropatie (Srinivisan et al 1998).
Jako příklad pro poslední klinickou indikaci jsme prokázali, že tento neurotrofícký faktor skutečně chrání diferencované SH-SY5Y lidské neuroblastomové buňky proti buněčné toxicitě vyvolané taxolem.
Metodika pro měření životnosti
Buněčná životnost byla určena přidáním 100 μΐ roztoku o koncentraci 1 mg/ml 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl-2H-tetrazolium-5-karboxanilid (XTT, Sigma) v DMEM (37 °C) suplementovaných 0,02mM fenazin methosulfátem (PMS, Sigma) do každé jamky. Destičky byly poté inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 2,5 hodin. Optické denzity byly odečteny (Molecular devices) při vlnové délce 450 nm, za použití 650 nm jako referenční vlnové délky. XTT stanovení je založeno na konverzi tetrazoliové soli XTT na červeně zbarvený formazanový produkt. Tato reakce je provedena mitochondriálními enzymy.
Metodika pro neuronální diferenciaci
1. Diferenciace v lidských neuroblastomových buňkách SHSY5Y SHSY5Y buňky jsou diferencovány po dobu 5 dnů s 25nM staurosporinem. Efekt enovinu je měřen 72 hodin po zahájení experimentu (reference: Jalava et al. Protein Kináze inhibitor staurosporine induces a mature neuronal phenotype in SH-SY5Y human neuroblastoma cells through an a,b,z PKC independent pathway. Joum Cell Physiol 155, 301-312, 1993.
2. Měření rozsahu neuritu
Morfologické změny neuronů byly automaticky kvantifikovány následujícím způsobem. Stručně řečeno, v příslušných časech byl do média přímo přidán glutaraldehyd a ponechán po dobu 30 minut při pokojové teplotě. To zajistilo, že morfologie buněk v tomto časovém bodě odrážela skutečnou situaci. Buňky byly pozorovány prostřednictvím přeneseného světla v mikroskopu Axiovert (Zeiss Oberkochen, Německo), vybaveným Martzhauserovým skenovacím nosičem ovládaným zařízením Indy (Silicon Graphics, Mountain, View, USA). Obrázky byly zachyceny za použití videokamery MX5 (HCS). V 64 vyrovnaných obrázcích vytvářejících 8x8 čtvereční matrici bylo hodnoceno okolo 3000 buněk. Přesné vyrovnání obrázků zajistilo, že neurity mohly být sledovány z jednoho obrázkového pole do dalšího. Automatická detekce rozsahu neuritu značená polyklonální tau protilátkou byla provedena za použití detektoru křivočarých struktur (Steger 1998). Analytický software automaticky vypočítal celkový buněčný povrch a celkovou délku neuritu.
Ke zkoumání efektu enovinu na různé buněčné typy byly provedeny dva testy, test syntézy DNA a test chemotaxe.
Test syntézy DNA
Buňky zahrnující lidské dermální fibroblasty (39SK), endoteliální buňky z lidské umbilikální vény (HUVEC), lidské buňky hladkého svalstva (HSMC), lidské chondrocyy a krysí osteoblasty byly udržovány v DMEM obsahujícím 10% FBS (39-SK, HSMC, krysí osteoblasty), nebo v definovaném médiu (chondrocyty a HUVEC) při teplotě 37 °C s 5 % CO2 a 95 % vzduchu. Pro test syntézy DNA byly buňky umístěny do 96-jamkové destičky pro tkáňové kultury v denzitě
5000 buněk na jamku v DMEM obsahujícím 10% FBS a inkubované po dobu 24 hodin.
-20CZ 303868 Β6
Kultivační médium bylo poté nahrazeno DMEM obsahujícím různé koncentrace Enovinu a 0,1% BSA (pro 39-SK, osteoblasty, HSMC, chondrocyty), nebo DMEM obsahující různé koncentrace Enovinu a 0,5% FBS (pro HUVEC) a buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin. Následně bylo kultivační médium nahrazeno 100 μΐ DMEM obsahujícím 5% FBS a 0,1 pCi (3H)-thymidinu. Po 2 hodinách pulzního značení byly buňky fixovány methanolem/kyselinu octovou (3:1, vol/vol) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Fixované buňky byly dvakrát promyty 80% methanolem. Buňky byly solubilizovány v 0,05% trypsinu (100 μΐ/jamku) po dobu 30 minut a poté v 0,5% SDS (100 μΐ/jamku) po dalších 30 minut. Alikvóty buněčných lyzátů (180 μΐ) byly zkombinovány s 2 ml scintilačního koktejlu a radioaktivita buněčných lyzátů byla měřena za použití tekutého scintilačního počítače (Wallac 1409).
Test na chemotaxi
Buňky byly udržovány tak, jak je popsáno v „Testu syntézy DNA“. Chemotaktická aktivita Enovinu byla analyzována za použití 12-jamkové modifikované Boydenovy komory (McQuillan, D. J., Handley, C. i., Campbell, M. A., Bolis, S., Milway, V. E., Herington, A. C. (1986). Stimulation of proteoglycan biosynthesis by sérum and insulin-like growth factor-In in cultured bovine articular cartilage. Biochem. J. 240, 423—430). Buňky byly natráveny trypsinem za použití 0,05% trypsinu a 0,5mM EDTA a resuspendovány v DMEM. Do spodních jamek Boydenovy komory byly přidány alikvóty 150 μΐ média obsahující různé koncentrace Enovinu. Polykarbonátová membrána (8 pm) potažená 0,1 mg/ml kolagenu typ I byla umístěna na vrchol spodních buněk následným sestavením horních buněk. Do horních buněk byly přidány alikvóty 100 μΐ buněk (70000 buněk/ml). Po 6 hodinové inkubaci bylo zařízení rozloženo. Buňky zůstávající na horní části membrány byly odstraněny. Membrána byla fixována 10% formaldehydem po dobu 15 minut, s následným barvením Gillovým hematoxylinem. Buňky byly počítány pod mikroskopem (250x zvětšení) a byl použit průměr buněk z pěti ploch z každé buňky. Každý experiment byl opakován alespoň pětkrát. Výsledky byly vyjádřeny jako násobek kontroly (DMEM obsahující 0,1% BSA).
Jak je ilustrováno výsledky na Obrázku 8 až 18, nemá enovin žádný efekt na proliferaci použitých buněčných typů, nebo na migraci buněk HUVEC (Obrázek 14), jak je popsáno výše. Enovin neměl žádný efekt na SH-SY-5Y neuroblastomové buňky. To ukázalo selektivní účinek enovinu na nervové buňky.
Pro GDNF i NTN bylo prokázáno, že účinkují jako signál prostřednictvím signálního komplexu složeného z podjednotky vázající ligand, buďto z GFRa-1 nebo GFRa-2 a signalizační podjednotky, cRET protein tyrosin kinázy. O Enovinu je předpokládáno, že vykonává své biologické účinky prostřednictvím signálního komplexu tvořeného GFRa vázajícím partnerem (buďto GFRa-1, GFRa-2, v nedávné době charakterizovaným sirotčím receptorem GFRa-3, nebo doposud necharakterizovanými členy rodiny GFRa v kombinaci s cRET nebo jiným signálním partnerem. Naše vazebné údaje skutečně ukazují, že enovin se může vázat specificky na GFRa-3.
U člověka mohou vést germinální mutace GDNF nebo cRET k několika fenotypům onemocnění včetně mnohočetné endokrinní neoplázie a familiární Hirschprungovy emoci (Romeo et al., 1994, Edery et al., 1994, Angrist et al., 1996). Obě onemocnění jsou sdružena se střevní dysmotilitou, přičemž Hirschprungova nemoc je nejběžnější příčinou kongenitální obstrukce střeva u dětí. Zajímavé je, že GDNF a cRET knockoutované myši vykazují významně podobné patologie s renální agenezí a střevní agangliózou (Sanchez et al., 1996, Moore et al., 1996, Pichel et al., 1996). Enovin by mohl hrát roli v podobných onemocněních střeva nebo ledvin, nebo protože je exprimován všudypřítomně, by mohl být důležitý v rozvoji dalších periferních orgánů v těle.
Interakce ligandů s jejich receptory je obecně dosaženo interakcí specifických vazeb mezi konkrétními rezidui na obou proteinech. Fragmenty proteinu mohou sloužit jako agonisté aktivující receptor k vyvolání účinků podporujících růst a udržujících přežívání buněk. Části enovinu
-21 CZ 303868 B6 nebo syntetické peptidy založené na proteinové sekvenci enovinu mohou být proto užitečné jako agonisté nebo antagonisté regulující svůj receptor GFRa-3. Za použití peptidové syntézy nebo rekombinantních technik mohou být vytvořeny hybridní růstové faktory tvořené částmi GDNF, NTN nebo PSP, nebo jakýmkoli jiným neurotrofickým nebo růstovým faktorem s částmi enovinu, což vede ke vzniku nového syntetického růstového faktoru s novými vlastnostmi.
K otestování, zdali je enovin schopný změnit senzorické deficity indukované taxolem u kiys po subplantárních injekcích krysám. V prvním experimentu bylo testováno, zdali léčba enovinem může zvrátit senzorické deficity indukované taxolem, zatímco druhá klinická studie testovala, zdali enovin může zabránit rozvoji deficitům indukovaným taxolem.
Zvrat senzorické dysfunkce indukované taxolem po určitém čase
Postup
Byly použity krysí samci kmene Sprague-Dawley vážící 300 až 340 gramů. Zvířata byla ustájena jednotlivě s přístupem k vodě a k potravě ad libitum. Před zahájením experimentu byla zvířata umístěna do standardních pozorovacích klecí a po habituační době 15 minut byl vyhodnocen reflex bodnutí špendlíkem. Aby mohl být tento test proveden, byl planetární povrch pravé tlapky zvířete stimulován jehlou a reaktivita tohoto bodnutí špendlíkem byla hodnocena jako, že je buďto přítomná (skóre 1) nebo nepřítomná (skóre 0). Postup byl v jednom sezení opakován třikrát s časovým intervalem 1 minuty mezi dvěma následujícími podněty, takže test bodnutí špendlíkem se skládal ze 3 měření reaktivity vůči bodnutí špendlíkem. Pouze krysy mající normální reakce na 3 bodnutí špendlíkem byly zahrnuty do experimentu.
Tři následující dny bylo zvířatům ráno aplikováno subplantámí injekcí 50 μΐ taxolu (3 mg/ml paclitaxelu rozpuštěného v cremophoru a dehydratovaném alkoholu s vodou) do pravé zadní tlapky. Během dalšího rána byl znovu vyhodnocen reflex po bodnutí špendlíkem a byla vybrána zvířata nevykazující žádnou reaktivitu ke 3 podnětům. Tato zvířata byla náhodně rozdělena do podskupin (n = 10/skupinu), kterým bylo aplikováno subplantámí injekcí do pravé zadní tlapky 76 μΐ buďto vehikula, fyziologického roztoku, nebo 23 či 130 pg/ml enovinu. Protože nebyly pozorovány rozdíly mezi výsledky zvířat léčených vehikulem a fyziologickým roztokem, byly obě skupiny spojeny (kontrolní skupina). Ve dnech 1, 4, 5 a 7 po poslední léčbě byl proveden test bodnutí špendlíkem ráno (mezi 8 a 9 hodinou ranní) a večer (mezi 3,30 a 4,30 odpoledne). Osmý den ráno byl proveden poslední test bodnutí špendlíkem. Pro každé zvíře bylo měřeno kumulativní skóre reaktivity na bodnutí špendlíkem. Protože po poslední léčbě bylo provedeno celkem 9 testů bodnutí špendlíkem (ve třech sezeních), je maximální skóre, které může být dosaženo po dobu celého experimentu 27.
Výsledky edou u většiny zvířat dlíkem. Subplantámí ý taxolem. V prvním špendlíkem a průměr 12). To kontrastuje se la zvířata odpověděla u kontrolních zvířat . skórem na bodnutí s normální reaktivitu íí skupiny za určitou dobu 8 dnů, je maxi:u 27. Jak je vidět na :hopná zvrátit deficit kontrolních zvířat na
Opakované subplantámí injekce taxolu po dobu tří po sobě jdoucích dnů v k akutní zánětlivé reakci s chyběním odpovědi na stimulaci bodnutí špen injekce fyziologického roztoku nebo vehikula neovlivnila deficit indukován měření vykázaly pouze 4 z 20 kontrol alespoň jednu reakci na tři bodnutí (±SEM) skóre bodnutí špendlíkem u kontrol v prvním měření byl 0,25 (± 0. začátkem experimentu, kde průměrné skóre bylo 3,0 (± 0,0), protože všechi na bodnutí špendlíkem. Dokonce i po 8 dnech měření byla reaktivita porušena, kdy u 11 z 20 krys odpovědělo alespoň jednou s průměmýrr špendlíkem 0,75 (± 0,18). V této kontrolní skupině nevykázala žádná zkiy na všechny 3 podněty. Kumulativní skóre na bodnutí špendlíkem kontrol] dobu je uvedeno na Obrázku 19. Protože zvířata byla testována 9 krát po mální skóre, které může být dosaženo 3 bodnutí špendlíkem v každém teši grafu, subplantámí injekce fyziologického roztoku nebo vehikula nebyla Si vyvolaný taxolem po testovanou dobu. Průměrné celkové kumulativní skóre
-22CZ 303868 B6 konci experimentu bylo 5,10 (± 0,87), což je 18,9% maximálního skóre, které může být dosaženo.
Jedna subplantámí injekce 76 μΐ roztoku enovinu o koncentraci 23 pg/ml vedla po prvním měření u 4 krys z 10 k alespoň jedné odpovědi, s průměrným skóre bodnutí špendlíkem 0,70 (± 0,33). V osmém dnu odpovědělo všech 10 krys alespoň jedenkrát na bodnutí špendlíkem a normální reaktivita byla přítomna u 5 z 10 krys. Průměrné skóre bodnutí špendlíkem v této skupině bylo osmý den 2,20 (±0,29). Ve srovnání s kontrolními zvířaty bylo průměrné kumulativní skóre na konci 8. dne měření významně vyšší (dvoustranný Mann-Whitney U-test, p menší než 0,01), s průměrným skóre na bodnutí špendlíkem 14,50 (± 1,96) (Obrázek 19). To je 53,7% z maximálního skóre.
Také po subplantámí injekci 130 pg/ml enovinu došlo k vyšší účinnosti oproti kontrolní skupině. Po první léčbě enovinem v koncentraci 130 pg/ml odpovědělo 6 krys z 10 alespoň jedenkrát s průměrným skóre bodnutí špendlíkem 1,10 (± 0,35). V osmém dnu všech 10 zvířat odpověděla alespoň na jedno bodnutí špendlíkem s průměrným skóre 2,60 (± 0,22). Normální reaktivita na 3 bodnutí špendlíkem byla přítomna u 8 z 10 krys. Průměrné kumulativní celkové skóre na bodnutí špendlíkem bylo v této skupině na konci experimentu 17,20 (± 1,94). To je 63,7% z celkového možného skóre a významně vyšší skóre ve srovnání s kontrolní skupinou (p menší než 0,01).
Prevence senzorické dysfunkce indukované taxolem po určitém čase
Postup
Byly použity krysí samci kmene Sprague-Dawley vážící 300 až 340 gramů. Zvířata byla ustájena jednotlivě s přístupem k vodě a k potravě ad libitum. Před zahájením experimentu byla zvířata umístěna do standardních pozorovacích klecí a po habituační době 15 minut byl vyhodnocen reflex bodnutí špendlíkem. Aby mohl být tento test proveden, byl plantámí povrch pravé tlapky zvířete stimulován jehlou a reaktivita tohoto bodnutí špendlíkem byla hodnocena jako, že je buďto přítomná (skóre 1) nebo nepřítomná (skóre 0). Postup byl v jednom sezení opakován třikrát s časovým intervalem 1 minuty mezi dvěma následujícími podněty, takže test bodnutí špendlíkem se skládal ze 3 měření reaktivity vůči bodnutí špendlíkem. Pouze krysy mající normální reakce na 3 bodnutí špendlíkem byly zahrnuty do experimentu (skóre bodnutí špendlíkem = 3). Po tomto kontrolním měření byla zvířata náhodně rozdělena do podskupin (n = 10/skupinu) a bylo jim aplikováno subplantámí injekcí do pravé zadní tlapky 75 μΐ buď vehikula, fyziologického roztoku, nebo 23 či 130 μΐ/ml enovinu. Protože nebyly pozorovány rozdíly mezi výsledky zvířat léčených vehikulem a fyziologickým roztokem, byly obě skupiny spojeny (kontrolní skupina). Během tří následujících dnů bylo zvířatům ráno aplikováno subplantámí injekcí 50 μΐ taxolu (3 mg/ml paclitaxelu rozpuštěného v cremophoru a dehydratovaném alkoholu s vodou) do pravé zadní tlapky. Ve dnech 1, 4, 5 a 7 po léčbě taxolem byl proveden test bodnutí špendlíkem ráno (mezi 8 a 9 hodinou ranní) a večer (mezi 3,30 a 4,30 odpoledne). Osmý den ráno byl proveden poslední test bodnutí špendlíkem. Pro každé zvíře vylo měřeno komulativní skóre reaktivity na bodnutí špendlíkem. Protože po poslední léčbě bylo provedeno celkem 9 testů bodnutí špendlíkem (ve třech sezeních), je maximální skóre, které může být dosaženo po dobu celého experimentu 27.
Výsledky
Subplantámí injekce fyziologického roztoku nebo vehikula nezabránily deficitu indukovanému taxolem podle testu bodnutí špendlíkem. V prvním testování po léčbě taxolem odpovědělo 8 z 10 krys alespoň jedenkrát na bodnutí špendlíkem s průměrným skóre bodnutí špendlíkem 0,60 (± 0,25). U dvou zvířat byl přítomný normalizovaný reflex po bodnutí špendlíkem. Po čase bylo sníženo také kumulativní skóre bodnutí špendlíkem s průměrnou hodnotou 6,55 (± 1,08), což je 24,3% z maximálního skóre (Obrázek 20). Předléčení 23 μί/ml enovinu snížilo deficity vyvolané taxolem najedno bodnutí špendlíkem. První den 8 z 10 zvířat odpovědělo alespoň
-23CZ 303868 B6 jedenkrát a průměrné skóre bodnutí špendlíkem bylo 1,70 (± 0,40). V osmém dnu všechna zvířata odpověděla s průměrným skórem 2,50 (± 0,27). U 7 zvířat byla prokázána normální reaktivita na všechna bodnutí špendlíkem. S ohledem na kumulativní odpověď za čas (Obrázek 20) bylo průměrné celkové skóre významně zlepšeno (p menší než 0,01) oproti kontrolní hodnotě 18,40 (± 1,73), což je 68,1% maximální hodnoty.
Srovnatelné výsledky byly získány po předléčení 130 μΐ/ml enovinu. V této studii 8 z 10 zvířat odpovědělo během prvního testování s průměrným skóre bodnutí špendlíkem 1,70 (± 0,31). V osmém dnu všechna zvířata reagovala alespoň jedenkrát na stimulaci bodnutím špendlíkem s průměrným skórem 2,40 (± 0,22) a všechny 3 reakce byly normální u poloviny zvířat. S ohledem na kumulativní skóre získané průměrné skóre získané v osmém dnu 17,70 (± 1,92) představovalo 65,5 % celkového skóre.
Tato série experimentů ukazuje, že jedna subplantámí injekce enovinu je schopná snížit senzorické deficity vyvolané taxolem, jak je měřeno pomocí testu bodnutí špendlíkem. Aktivita je patrná, je-li lék aplikován před a po taxolu.
Enovin je možným kandidátem pro bolestivé syndromy s převažující periferní a centrální neurogenní komponentou, a může hrát modulační roli v senzorických procesech po transdermální, topické, lokální, centrální (jako je například epidurální, intrathekální, a podobně), a systémové aplikaci.
Dále je enovin užitečný jako diagnostický prostředek pro vyhledávání patofyziologických změn v oblastech zmíněných výše.
Srovnání exprese mRNA Enovinu v normální versus nemocné tkáni
Exprese mRNA Enovinu byla kvantitativně analyzována za použití systému ABI Prism 770 Sequence Detection Systém (TaqMan, perkin Elmer) s příslušnou technologií vyvinutou a prováděnou v laboratořích Pharmagene Laboratories Ltd., Royston, Spojené království. Systém používá fluorogenní próbu ke generaci pro sekvenci specifických fluorescenčních signálů během PCR. Próba je oligonukleotid s připojeným fluorescenčním reportérem a zhášečem barevné reakce, která je umístěna mezi předním a reverzním primerem. Je-li intaktní je intenzita reportérové fluorescence potlačena zhášečem. Pokud tvoří próba část replikačního komplexu,je fluorescenční reportér odštěpen od zhášeče pomocí 5‘ do 3‘ exonukleázové aktivity obsaženo v Taq polymeráze. Zvýšení fluorescenčního reportérového signálu v Taq polymeráze. Zvýšení fluorescenčního reportérového signálu v reakci je přímým důsledkem akumulace PCR produktu. Počet výchozích kopií mRNA cílové sekvence (Cn) je stanoven určením PCR cyklu (Ct), v kterém je PCR produkt poprvé detekován — bod, při kterém fluorescenční signál přesahuje prahovou hodnotu. Kvantifikace množství cílové mRNA v každém vzorku je stanovena pomocí srovnání experimentálních Ct hodnot se standardní křivkou.
Příprava RNA a kontroly kvality
-Zol (Life Technologu kvality pro všechmální RNA) a určení ch transkriptů (transCelková RNA byla izolována z celé a rozdělené tkáně za použití činidla Tri gies, Gaithersburg, MD, USA) podle protokolu dodavatele. Postupy a konto ny vzorky RNA zahrnovaly posouzení integrity (intaktní 18S a 28S ribozo přítomnosti transkriptů ve vysokém nadbytku (aktin) a méně se vyskytující ferinový receptor).
Navržení primeru/próby
Pár primerů a TaqMan próba byly navrženy k amplifikací specifické sekveni ;e z Enovinu
-24CZ 303868 B6
Primer 1: 5' ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3'
Primer 3: 5' TGCTGCCGACCCACG 3'
Próba 5: 5'CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3'
Navíc byly navrženy pár primerů a próba TaqMan, které přesahují intron a amplifikují část lidského genu APDH
Primer 2:
5' CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3'
Primer 4:
5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3'
Próba 6:
5' TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT 3'
Próba 5 je označena pomocí fluor FAM, zatímco próba 6 je označena pomocí fluor VIC.
Štěpení celkové RNA DNázou
V každé testované tkáni bylo natráveno 2,2 pg celkové RNA pomocí 2 jednotek DNázy bez RNázy (Gibco BRL) po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve 20 μΐ objemu lx pufru s DNázou. Reakce byla zastavena přidáním 2 μΐ 25mM roztoku s EDTA. Vzorky byly poté inkubovány při teplotě 65 °C po dobu 10 minut za účelem inaktivace enzymu.
Syntéza prvního vlákna cDNA
Pro každou testovanou tkáň bylo použito 100 ng celkové RNA jako templát pro syntézu prvního vlákna cDNA. RNA v objemu 4 ml a v přítomnosti 50nM primerů 1 a 2, 1 x PCR pufru II (Perkin Elmer) a 5mM MgCl2 byla zahřívána na 72 °C po dobu 5 minut a pomalu ochlazena na teplotu 55 °C. Po přidání všech dalších činidel bylo 6 ml reakční směsi inkubováno při teplotě 48 °C po dobu 30 minut s následným krokem inaktivace enzymu při teplotě 90 °C po dobu 5 minut. Finální reakční podmínky byly následující: 1 x PCR pufru II, 5mM MgCl2, lmM dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 12,5 jednotek MuLV reverzní transkriptázy (Gibco BRL).
PCR amplifikace prvního vlákna cDNA cDNA odvozená od 100 ng celkové RNA každého vzorku byla podrobena PCR amplifíkací v jedné reakci za účelem identifikace cílového i GAPDH transkriptu. Finální koncentrace primeru/próby pro cílový transkript byly 300nM primer, 300 nM primer 3 a 200nM próba 5, pro GAPDH transkript to bylo 20nM primer 2, 20nM primer 4 a lOOnM próba 6. Finální koncentrace dalších činidel v reakci byla 4,5% glycerolu, lx TaqMan pufr A (Perkin Elmer), 6,25mM MgCl2, 430M DATP, dLTP, dGTP, dCTP, 2,5 jednotek AmpliTaq Gold. PCR amplifikace byla provedena v sekvenčním detekčním systému ABI 7700, úvodní krok aktivace enzymu při teplotě 94 °C po dobu 12 minut byl následován 45 cykly při teplotě 94 °C po dobu 15 sekund, 60 °C po dobu 1 minuty (minimální čas).
Testované nemoci a tkáně
Exprese mRNA Enovinu byla porovnána v tkáních odvozených od nemocných pacientů a normálních kontrolních jedinců (Obrázky 25 a 26). Níže uvedená tabulka ukazuje nemoci a odpovídající tkáně, které byly zkoumány. Pro každé onemocnění byly analyzovány 3 vzorky od nemocných pacientů a 3 kontrolní vzorky.
-25 CZ 303868 B6
Patologie Tkáň 1 Tkáň2 Tkáň 3
Alzheimerova nemoc Temporální kůra Hipokampus O) ccipitální kůra
Roztroušená skleróza Mícha Periventrikulámí bílá hmota Mozeček
Parkinsonova nemoc Substantia nigra Putamen Mozeček
Nádorové onemocněni Adenokarcinom tlustého střeva Duktální adenokarcinom prsu Dlaždicobuněčný karcinom plic
Statistická analýza
Pro každou skupinu 3 tkáni byl vypočítán průměr a směrodatná odchylka Ct hodnot (které jsou normálně rozloženy) a byly poté přeměněny na Cn hodnoty podle vzorce Cn = 1 Q((Ct-40,007V-3·623. Analýza variace (ANOVA) byla také provedena pro Ct hodnoty za účelem srovnání průměrných hodnot exprese mRNA enovinu u normálních versus nemocných tkání.
Obrázky 25 a 26 ukazují průměrné počty kopií mRNA Enovinu (± SD, n = 3) u nemocných versus kontrolních tkání. Statistická analýza ukázala signifikantní zvýšení exprese Enovinu v periventrikulámí bílé hmotě pacientů s roztroušenou sklerózou (p = 0,013). Vnitřní GAPDH kontrola nevykázala signifikantní rozdíl (p = 0,013). Vnitřní GADPH kontrola nevykázala signifikanční rozdíl (p = 0,79). Ačkoli exprese Enovinu v periventrikulámí bílé hmotě je dosti nízká v normální tkáni (270 kopií na lOOng celkové RNA versus 200000 kopií GAPDH), je u pacientů s roztroušenou skerózou exprese třikrát vyšší (825).
Pouze jedna další nemocná tkáň vykázala signifikantní rozdíl od normálních kontrol: u duktálního adenokarcinomu prsu je exprese mRNA Enovinu 6 krát vyšší (6000 versus 1000, p = 0,007), ale GAPDH kontrolní hodnota je také významně zvýšena (165000 versus 44000, p = 0,03), což pravděpodobně reprezentuje celkové zvýšení koncentrace mRNA.
Závěrem lze říci, že jsme nalezli zvýšenou expresi mRNA Enovinu v periventrikulámí bílé hmotě pacientů s roztroušenou sklerózou.
Použití ELISA testu založeném na fosfospecifické protilátce pro vyhledávání enovinového kinetika na receptorovém komplexu GFRoc3/cRET.
Způsob může být také použit pro identifikaci agonisty nebo antagonisty jiných neurotrofinových receptorů, jako jsou GFRal, GFRa2, GFRa4, TrKa, TrKB a TrKC.
Test
Za použití tohoto testu můžeme identifikovat agonistické nebo antagonistické sloučeniny neurotrofických růstových faktorů měřením aktivace klíčových signálních kináz aktivovaných v neurotrofické dráze, nebo měřením aktivace cRET receptorové kinázy. Aktivace je měřena detekcí množství fosforylované kinázy nebo receptorové kinázy za použití fosfo-specifických protilátek. Použijeme NUH 3T3 buňky exprimující přechodně nebo trvale TrkA, TrkB, TrkC, GFRal/cRET, GFRa2/cRET, GFRa3/cRET nebo GFRa4/cRET. Aktivace p42/p44 MAP kinázy, PKB kinázy, cjun, CREB, JNK/SAPK kinázy a dalších kináz je detekována za použití komerčně dostupných fosfo-specifických protilátek. Navíc, aktivace CRET může být odstraněna za použití fosfospecifické cRET protilátky.
-26CZ 303868 B6
Protokol byl použit následujícím způsobem:
- Umístění NIH 3T3 buňky do 96 jamek v 10% telecím séru, buňky musí z 80% splávat přes stimulací
- Další den nahraďte médium médiem bez séra a ponechejte buňky bez živin po dobu 18 a 24 hodin.
- Po této době stimulace buňky sloučeninami a neurotrofickými faktory, které slouží jako pozitivní kontrola (10 ng/ml pro neurotrofické faktory).
- Fixujte buňky 4% formaldehydem v PBS při teplotě 4 °C po dobu 20 minut.
- Promývejte buňky 3x 200 μΐ PBS/0,1% Triton po dobu 5 minut.
- Potlačte růst buněk 100 μΐ 0,6% H2O2 v PBS/0,1% Triton po dobu 20 minut.
- Promývejte buňky 3x 200 μΐ PBS/0,1% Triton po dobu 5 minut.
- Blokujte buňky 100 μΐ 10% fetálního telecího séra v PBS/0,1% Triton po dobu 60 minut.
- Inkubujte buňky s fosfo-specifickou protilátkou v 50 μΐ 5% BSA/PBS/0,1% Triton přes noc při teplotě 4 °C. Řešení protilátek by mělo být určeno experimentálně, navrhované rozmezí je 1:100-1:250.
- Promývejte buňky 3x 200 μΐ PBS/0,1% Triton po dobu 5 minut.
- Inkubujte se sekundární protilátkou vázanou k HRP, ředění 1:100 v 50 μΐ 5% BSA/PBS/0,1 % Triton po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.
- Promývejte buňky 3x 200 μΐ PBS/0,1% Triton po dobu 5 minut.
- Rozpusťte 1 tabletu OPD (Sigma) v 25 ml pufru (3,65 g kyseliny citrónové-H2O a 5,9 g
Na2HPO4-2H2O v 0,5 1 H2O, pH 5,6) a přidejte 12,5 μΐ H2O2. Přidejte 50 μΐ do každé jamky a inkubujte po dobu 15 minut na třepačce (200 otáček za minutu), přikryté alobalem.
- Zastavte reakci 25 μΐ H2SO4.
Změřte OD490-65o na ELISA readeru.
Mezencefalická neuronální dopaminergní neuronální kultura
Neuronální kultura
Neuronální kultury byly připraveny z ventrálního nemencefalon fetální krysy pomocí enzymatické a mechanické disperze. Tkáň byla sbírána, promyta v ledovémfosfátovém pufru bez Ca2+ a Mg2+ obsahujícím 0,6% glukózu (PBSG) a inkubována po dobu 30 minut s PBSG obsahujícím 0,6% glukózu (PBSG) a inkubována po dobu 30 minut s PBSG obsahujícím 0,1% trypsin při teplotě 37 °C. Buněčná suspenze byla umístěna v hustotě 2,5 105 buněk/cm2 do 96 jamkových destiček pro tkáňové kultury NUNC. Kultivační destičky byly předem potaženy polyL-omitinem a CDM obsahujícím 10% fetální telecí sérum. Kultury byly udržovány v chemicky definovaném médiu (CDM) tvořeném směsí 1:1 Dulbecovým modifikovaným Eagles médiem (CDM) tvořeném směsí 1:1 Dulbecovým modifikovaným Eagle médiem a F12 Nutrient suplementovaným glukózou (0,6%), glutaminem (2mM), bikarbonátem sodným (3mM), HEPES (5mM), inzulínem (25 pg/ml), lidským transferinem (100 pg/ml), putrescinem (60 pg/ml). Selenitem sodným (30nM) streptomycinem (100 pg/ml) a penicilinem (100 IU/ml).
Léčba neurotrofickými faktory
Neurotrofiny byly rozpuštěny v 0,5 % bovinním sérem albuminu jako zásobní roztok. Neurotrofiny byly přidány 3 hodiny po úvodním umístění po 5 dnech v kultuře. Stejné množství 0,5% bovinního sérového albuminu bylo přidáno do kontrolních jamek.
-27CZ 303868 B6
Vysoceafinitní vychytávání dopaminu
Vychytávání dopaminu bylo měřeno po 10 dnech. Pro vychytávání byly buňky dvakrát promyty předem zahřátým PBS suplementovým glukózou (15mM), askorbovou kyselinou (lOOmM) apargylinem (100 mM), a preinkubovány 10 minut se stejným roztokem. Preinkubační roztok byl nahrazen stejným roztokem obsahujícím 50nM (3H)Da a inkubace pokračovala po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Vychytávání bylo zastaveno 3 rychlými promytími ledovým PBS. Akumulovaný (3H)dopamin byl uvolněn inkubací s okyseleným ethanolem po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Radioaktivita byla určena po přidání 4 ml scintilační tekutiny (Packard ultima gold MV) za použití scintilačního počítače packard. Nespecifické vychytávání bylo určeno přidáním 20 μΜ kokainu.
Tabulka 4. Účinek enovinu na vychytávání (3H) dopaminu
Léčba Procento kontrol vychytávání {3H)dopaminu n
Kontrola 100 5
Enovin 300 ng/ml 111 4
Enovin 1000 ng/ml 127 5
Enovin 2000 ng/ml 152 5
Enovin 4000 ng/ml 161 1
Enovin 10000 ng/ml 165 2
Buňky byly ponechány růst po dobu 10 dnů v přítomnosti nebo v nepřítomnosti enovinu. Neléčené kontroly byly brány jako 100%. Výsledky jsou získány z 1 a 5 nezávislých experimentů.
Reference
Altshul, S.F., Gish, W., Miller, W. Myers, E.W. Lipman, D.J. (1990), Gasic local alingment search tool. J. Mol. Biol. 215, 413-410.
Angrist, M. Bolk, S., Halushka, M., Lapchak. P.A., Chakravarti, A. (1996). Germline mutations in glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNGF) and RET in Hirschprung disease patient. nátuře Genetics 14, 341-344.
Baloh, R.H., Tansey, M.G., Golden, J.P., Creedon, D.J., Heuckeroth, R.O., Keck, CIL., Zimonjic,
D. B., Popescu, N.C., Johnon, E.M., Milbrandt, J. (1997) TmR2, a novel receptor that mediates neurturin and GDNF signaling through Ret. Neuron 18, 793-802.
Baloh, R.H., Gorodinsky, A., Golden, J.P., Tansey, MG., Keck, C.L., Popescu, N.C., Johnson,
E. M., Milbrandt, J. (1988) GFRct3 is an opthan member of the GDNF/neurturin/persephin receptor family. proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, 5801-5806.
Barr, P.J. (1991), Mamalian subtilisins: the long-sought dibasic procčssing endoproteases. Cel. 66, 1-3.
Beck, K.D., Valverde, J., Alexi, T., Poulsen, K., Moffat, B., Vandlen, RA., Rosenthal, A., Hefti,
F. (1995) Mesencephalic dopaminergi neurons protected by GDNF form axotomy-induced degeneration in the adult brain. Nátuře 373, 339-341.
-28CZ 303868 B6
Bilang-Bleuel, A., Reveh, F., Colin, P., Locquet, I., Ropbert J.J., Mallet, J., Horellou, P. (1997) Intrastriatal injection of an adenoviral vector expressin glial-cell-line-derived neurotrophic factor prevents dopaminergic neuron degeneration and behavioral impairment in a rat model of Parkinson disease. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 8818-8823.
Buj-Bello, A:, Buchman. V.L., Horton, A., Rosenthal, A., Davies A.M. (1995) GDNF is an age-specific survival factor for sensory and autonomie neurons. Neuron 15, 821-828.
Buj-Bello, A., Adu, J., Pinon, L.G.P., Horton, AI, Thompson, J., Rosenthal, A., Chinchetru, M., Buchman, V.L., Davies, A.M. (1997) Neurturin responsiveness requires a GPI-linked receptor and the Ret receptor tyrosine kináze. Nátuře 387, 721-724.
Choi-Lundberg, D.L., Lin,. Q., Chang, Y.N., Chiang, Y.L., Hay, C.M., Mahajeri, H., Davidson.
B. L., Bohn, M.C. (1997). Dopaminergic neurons protected form degeneration by GDNF gene therapy. Science. 275, 838-841.
Creedon, D.J., Tansey, M.G., Baloh, R.H., Osbome, P.A., Lampě, P.A., Fahmer, TJ., Heuckeroth, R.O., Milbrandt, J., Johnson, E.M. (1997) Neurturin shares receptors and signál transduction pathways with glial cell line-derived neurotrophic factor in sympathetic neurons. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 7018-7023.
Durbec, P., Marcos-Gutierrez, C.V., Kilkenny, C., Grigoriou, M., Wartowaara, K., Suvanto, P., Smith, D., Ponder, B., Constantini F., Saarma, M., Sariola, H., Pachnis, V. (1996) GDNF signalling through the RET receptor tyrosine kináze. Nátuře 381, 789-793.
Edery, P., Lyonnet, S., Mulligan, L.M., Pelet, A., Dow., E., Ábel, L., Holder S., Nihoul-fekete,
C. , Ponder, B.A., Munnich, A. (1994) Mutations of the RET proto-Oncogene in Hirschprung’s disease. Nátuře 367, 378-380.
Gash, D.M., Zhang, Z., Ovadia, A., Cass, W.A., Yi, A., Simmerman, L., Russell, D., Martin, D., Lapchak, P.A., Collins, F., Hoffer, B.J., Gerhard, G.A. (1996) Functional recovery in parkinsonian monkey treated with GDNF. Nátuře 380, 252-255.
GFRa Nomenclature Committee (1997) Nomenclature of GPI-linked receptors for the GDNF ligand family. Neuron 19, 485.
Hakim A „Inschemic penumbra: the therapeutic window.“ Neurology. 1998 Sep, 51 (3 Suppl 3): S44-6.
Hendenson, C.E., Phillips, H.S., Pollock, R.A., Davies, A.M., Lemeulle, C., Armamini, M., Simmons, L., Moffet, B., Vandlen, R.A., Koliatsos, V.E., Rosenthal, A. (1994) GDNF: a potent survival factok for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266, 1062-1064.
Heng, H.H.Q., Squire, J., Tsui, L.C. (1992) High resolution mapping off mamalian genes by in šitu hybridization to free chromatin. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 9509-9513.
Heng, H.H.Q., tsui, L.C. (1993) Modes of DAPI banding and simultaneous in šitu hbridization. Chromasoma 102, 325-332.
Heuckeroth, R.O., Koztzbauer, P., Copeland, n.G., Gilbett, D.J. Jenkins, N.A., Zimonjic, D.B., popescu, N.C., Johnson, E.M., Milbrandt, J. (1997) Neurturin, a novel neurotrophic factor is localized to mouše chromosome 17 and human chromosome 19pl3.3. Genomics 44, 137-140.
-29CZ 303868 B6
Jing, S., Wen, D., Yu, Y., Holst, P.L, Luo, Y., Fang, M., Tamir, R., Antoniq, L., Hu, Z., Cupples, R., Louis, J.C., Hu, S., Altrock, B.W., Fox, G.M. (1996) GNDF-induced activation ofthe ret protein tyrosine kináze is mediated by GDNF-α, a novel receptor for GDNF. Cell 85, 1113 1124.
Jing, S., Yu, Y., Fang M., Hu, Z., Holst. P.L., Boone, T., Delaney, J., Schultz, H., Zhou, R., Fox,
G.M. (1997) GRFa-2 and GFRa-3 are two new receptors for ligands of the GDNF family. J. Biol. Chem. 272,33111-33117.
Kingsley, D.M. (1994) The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes and Development 8, 133-146.
Dklein, R.D., Sherman, D., Ho. W.H., Stone, D., Bennet, G.L., Moffat, B., Vandlen, R., Simmons, L., Gu, Q., Hongo, J.A., Devaux, B., Poulsen, K., Armanini, M., Nozaki, C., Asai, N., Goddard, A., Phillips, H., Henderson, C.E. Takahashi, M., Rosenthal, A. (1997) A GPI-linked protein that interects with Ret to form a candidate neurturin receptor. Nátuře 387, 717-721.
Kotzbauer, P.T., Lampě, P.A., Hauckeroth, R.O., Golden, J.P., Creedon, D.J., Jonhson, E.M., Milbmdt, J. (1996), Neurturin, a relative of glial-cell-line-derive neurotrophic factor. Nátuře 384, 467-470.
Lin, L.F.H., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S., Collins, F. (1993) GDNF: a glia cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260, 1130-1132.
Mandel, R.J., Spratt, S.K. Snyder, R.O., Leff, S.E. (1997) Midbrain injection of recombinant adeno-associated virus encoding rat glial cell line-derived neurotrophic factor protects nigral neurons in a progressive 6-hydroxydopamine-induced degeneration model of Parkinson’s disease in rats. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 14083-14088.
Marsden et al. „The causes of Parkinson’s disease are bing unraveled and rational neuroprotective therapy is close to reality“ Ann neurol. 1988, Sep. 44 (3 Suppl. 1): S189—96
Masure, S., Cik, M., Pangalos, M.N., Bonaventure, P., Verhaasselt, P., Lesage, A.S, Leysen, J.E., Gordon R.D. (1998) Molecular cloning, expression and tissue distribution of glial—cell— linederived neurotrophic factor family receptor a-3 (GFR a-3). Eur. J. Biochem. 251, 622-630.
Matsushita, N., Fujita, Y., Tanaka, M., Nagatsu, T., Kiuchu, K. (1997) Cloning and structural organization of the gene encoding the mouše glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF. Gene 203, 149-157.
Mildbrandt, J., de Sauvage, F.J., Fahmer, TJ., Baloh, R.H., Leitner, M.L., Tansey, M.G., Lampě, P.A., Heckeroth, R.O., Kotzbauer, P.T., Simburger, K.S., Golden, J.P., Davies, J.A., Vejsada, R., Kato, A.C., Hyneš, M., Sherman, D., Nishimura, M., Wang, L.C., Vandlen, R., Moffat, B., Klein, R.D., Poulsen, K., Gray, C„ Garces, A., Henderson, C.E., Phillips, H.S., Johnson, E.M. Jr. (1998) Persephin, a novel neurotrophic factor related to GDNF and neurturin. Neuron 20, 245-253.
Moore, M.W., Klein, R.D., Farinas, I., Saer, H., Armanini, M., Phillips; H., Reichardt, L.F., Ryan, A.M., Carver-Moore, K., Rosenthal, A. (1996) Renal and neronal abnormalities in mice lacking GDNF. Nátuře 382, 76-79.
Mont, H.T., Dean, D.O., Alberch, J., Dreyfs, C.F., Black, I.B. (1995) Glial cell line-derived neurotrophic factor promotes the survival and morphologic differentiation of Purkinje cells. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 9092-9096.
-30CZ 303868 B6
Nagy Zet al., „The cell division cycle and the pathophysiology of Alzheimer’s disease.“ Neuroscience. 1998 Dec, 87 (4): 731-9.
Naveilhan, P., Baudet, C., Mikaels, A., Shen, L., Westphal, H., Emfors, P. (1998) Expression and regulation of GFRa-3, a glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor. Proč. Nati. Aced. Sci. USA 95, 1295-1300.
Nuydens, R., Dispersyn, G., Van den Kienboom G., De Jonh M., Connors R., Ramaekers F., Borgers M., Geerts H., „Bcl-2 protects neuronal cells against taxol-induced apoptosis by indusing multi nucleation“, zasláno k publikaci.
Oppenheim, R.W., Houenou, L.J., Johnson, J.E., Lin L.F., Li, L., Lo, A.C., Newsom, A.L., Prevette, D.M., Wang, S. (1995) Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by GDNF. Nátuře 373, 344-346.
Pichel, J.G., Shen, L., Sheng, H.Z., Granholm, A.C., Drogo, J., Grinberg, A., Lee, E.J., Huang, S.P., Saarma, M., Hoffer, B.J., Sariola, H., Westphal, H. (1996) Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nátuře 382, 73-76.
Romeo, G., Ronchetto, P., Luo, Y., Barone, V., Seri, M., Cecherini, I., Pasini, B., Bocciardi, R., Lerone, M., Kaariainen, H, et al., (1994), Point mutations affecting the tyrosine kináze domain of the RET protooncogene in Hirschprung’s disease. Nátuře 367, 377-378.
Sanchez, M.P., Silos-Santiago, L, Frisen, J., He, B., Lira, S.A., Barbacid, M., (1996) Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice laking GDNF. Nátuře 382, 70-73.
Sanicola, M., Hession, C., Worley, D., Carmillo, P., Ehrenfels, C., Walus, L., Robinson, S., Jaworski, G., Wei, H., Tizard, R., Whitty, A., Pepinsky, R.B., Cate, R.L. (1997) Glial cell line-derived neurotrophic factor-dependent ret activation can be mediated by two different cell-surface accessory proteins. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 6238-6243.
Smimova et al. „Thrombin is an extracellular signál that activates intracellular death protease pathways inducing apoptosis in model motor neurons“. J. Neurobiol. 1998 Jul, 36(1): 64-80.
Srinivisan et al „Sérum from patients with type 2 diabetes with neuropathy induces complementindependent, calcium-dependent apoptosis in cultured neuronal cells.“ J. Clin. Invest. 1998, Oct 1, 102(7): 1454-62.
Steger. „An unbiased detector of curvilinear structures“ IEEE Transactions on pattem analysis and machine intelligence, 20, 2, 113-125 (1998).
Suvanto, P., Wartovaara, K., Lindahl, M., Arumáe, U., Mosnyakov, M., Horelli-Kuitunen, N., Airaksinen, M.S., Palotie, A., Sariola, Hl, Saarma, M. (1997) Cloning, mRNA distribution and chromosomal localisation of the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor receptor β, a homologue to GDNFRa. Human Mol. Genet. 6, 1267-1273.
Tomac, A., Lindquist, E., Lin, L.F., Ogren, S.O., Young, D., Hoffer, B.J., Olson, L. (1995) Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic systém by GDNF in vivo. Nátuře 373, 335-339.
Treanor, J.J.S., Goodman, L., de Savage, F., Stone, D.M., Poulsen, K.T., Beck, C.D., Gray, C., Armanini, M.P., Pollock, R.A., Hefti, F., Phillips, H.S., Goddard, A., Moore, M.W., Buj-bello, A., Davies, A.M.„ Asai, N., Takahashi, M., Vandlen, R., Henderson, C.E., Rosenthal, A. (1996) Characterization of a multicomponent receptor for GDNF. Nátuře 382, 80-83.
-31 CZ 303868 B6 iu, M., Kilkenny, C., Ibanez, C.F. (1996) 381, 785-788.
Trupp, M., Arenas, E., Fainzilber, M., Nilsson, A.S., Sieber, B.A., Grigorio SalazarGrueso E., Pachnis, V., Arumáe, U., Sariola, H., Saarma, M. Functional receptor for GDNF encoded by the c-ret photo-oncogene. Nátuře
Wellington et al., „Toward understanding the molecular pathology of Huntington’s disease. „Brain Pathol. 1997 Jul, 7(3): 979-1002.
Widenfalk, J., Nosrat, C„ Tomac, A., Westphal, H., Hoffer, B., Olson, L. (1997). Neurtutin and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor-β (GDNFR-α), novel proteins related to GDNF a GDNFR-α with specific cellular pattems of expression suggesting roles in the developing and adult nervous systém and in peripheral organs. J.Neurosci. 17, 8506-8519.
Widelfalk, J„ Tomac, A., Lindquist, E., Hoffer, B., Olson, L., (1998) GFR-a3, a protein related to GFR-al, is expressed in developing peripheral neurons and ensheating cells. Eur. J. Neurosci. 10,1508-1517.
Worby, C.A., Vega, Q.C., Zhao, Y., Chao, H.H.J., Seasholtz, A.F., Dixon, J.E. (1996) Glial cell line derived neurotrophic factor signals through the RET receptor and activates mitogenactivated protein kináze. J. Biol. Chem. 271, 23619-23622.
Worby, C.A., Vega, Q.C., Zhao, Y„ Chao, H.H.J., Seasholtz, A.F., Thompson, R.C., Dixon, J.E. (1998) Identification and characterization of GFR-a3, a novel co-receptor belonging to the glial cell line-derived neorotrophic receptor family. J. Biol. Chem. 273, 3502-3508.
Yan, Q., Matheson, C„ Lopez, O.T. (1995) In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons. Nátuře 373, 341-344.
Seznam sekvencí <110> Janssen Pharmaceutica N.V. et al.
< 120> Neurotrophic Growth Factor <130> 50936/002 <140> PCT/EP99/05031 <141> 199-07-14 <150> 9815283.8 <151> 1998-07-14 <150> 09/248, 772 <151> 1999-02-12 <150> 09/327m 667 <151> 1999-06-08 <160> 15 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 339 <212>DNA <213> Homo sapiens
-32CZ 303868 B6 <400> 1 gctgggggcc cgggcagccg cgctcgggca cagctggtgc cggtgcgcgc gctcggcctg cgcttctgca gcggctcctg ccgccgcgcg ctactgggcg ccggggccct gcgaccgccc tgccgaccca cgcgctacga agcggtctcc gtggaccgcc tctccgccac cgcctgcggc <210>2 <211> 474 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgccgccgca gccttctcgg cccgcgcccc gcgggggccg cgcggcgcgg gctgggggcc ggggctgccg cctgcgctcg cagctggtgc ccgacgagct ggtgcgtttc cgcttctgca acgacctcag cctggccagc ctactgggcg ggcccgtcag ccagccctgc tgccgaccca tcaacagcac ctggagaacc gtggaccgcc gagggctcgc tccagggctt tgcagactgg gcgggggcgc ggggctgccg cctgcgctcg 60 ggccaccgct ccgacgagct ggtgcgtttc 120 cgctctccac acgacctcag cctggccagc 180 ccgggctccc ggcccgtcag ccagccctgc 240 ttcatggacg tcaacagcac ctggagaacc 300 tgcctgggc 339 cgccgcctgc acccccatct gctcttcccc 60 cgggcagccg cgctcgggca gcgggggcgc 120 cggtgcgcgc gctcggcctg ggccaccgct 180 gcggctcctg ccgccgcgcg cgctctccac 240 ccggggccct gcgaccgccc ccgggctccc 300 cgcgctacga agcggtctcc ttcatggacg 360 tctccgccac cgcctgcggc tgcctgggct 420 acccttaccg gtggctcttc ctgc 474 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens
-33 CZ 303868 B6 <400>3
Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 15 10 15
Arg Leu Arg ser Gin Leu val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30
Arg Ser Asp Glu Leu val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser cys Arg 35 40 45
Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80
Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala val ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95
Thr Trp Arg Thr val Asp Arg Leu ser Ala Thr Ala Cys Gly cys Leu 100 105 110 <210> 4 5 <211>139 <212> PRT <213> Homo sapiens
-34iMSKfe#· -i <400>4
Pro 1 Pro Gin pro Ser 5 Arg pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser
10 15
Ala Leu pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser
20 25 30
Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly cys Arg Leu Arg ser Gin Leu
35 40 45
Val Pro val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser ASp Glu Leu Val
50 55 60
Arg Phe Arg phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser pro His
65 70 75 80
Asp Leu ser Leu Ala ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro pro
85 90 95
Pro Gly Ser Arg pro val Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr
100 105 110
Glu Ala val Ser Phe Met Asp val Asn Ser Thr Trp Arg Thr val Asp
115 120 125
Arg Leu ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
130 135
<210> 5 <211> 819
<212>DNA
<213> Homo sapiens
-35CZ 303868 B6 <400> 5 gagtttcccc tccacacagc taggagccca ccctccttga ggtccttcct ccccaagccc cacttggtct ctccgcgcag cctgccctgt gcagcgtcgc agaggcctcc ctgggctccg ccccgcctgt cctggcgtcc cccgccggcc cggggcgggg ctggcccggg acaccgcgcg gcccgctggt gcagtggaag agcccggcgg ccgccgcctg cacccccatc tgctcttccc ccgggcagcc gcgctcgggc agcgggggcg ccggtgcgcg cgctcggcct gggccaccgc agcggctcct gccgccgcgc gcgctctcca gccggggccc tgcgaccgcc cccgggctcc acgcgctacg aagcggtctc cttcatggac ctctccgcca ccgcctgcgg ctgcctgggc <210> 6 5 <211>85 <212> PRT <213> Homo sapiens tgcccggcct gatctcagcc cgaggacagc 60 acctgggtgc cctctttctc cctgaggctc 120 ggcccaccct ggccgctctg gctctgctga 180 cgccccgcag ccctgccccc cgcgaaggcc 240 acctgccggg taggtgagag ggcgaggggg 300 tgactgggtc tcattccagg gggacgcacg 360 ccgccgccgc agccttctcg gcccgcgccc 420 cgcgggggcc gcgcggcgcg ggctgggggc 480 cggggctgcc gcctgcgctc gcagctggtg 540 tccgacgagc tggtgcgttt ccgcttctgc 600 cacgacctca gcctggccag cctactgggc 660 cggcccgtca gccagccctg ctgccgaccc 720 gtcaacagca cctggagaac cgtggaccgc 780 tgagggctc 819
-36CZ 303868 B6 <400> 6
Met 1 pro Gly Leu Ile ser Ala Arg Gly Gin Pro Leu Leu Glu val 15 Leu
5 10
Pro pro Gin Ala HÍS Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala pro Leu
20 25 30
Gly Leu Ser Ala Gin Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala
35 40 45
Leu Leu Ser Ser val Ala Glu Ala ser Leu Gly ser Ala pro Arg Ser
50 55 60
Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser pro Ala Gly
65 70 75 80
HÍS Leu Pro Gly Arg
85
<210>7 <211> 159
<212> PRT
<213> Homo sapiens
-37CZ 303868 B6 <400>7
Leu Gly 1 Leu Ile Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp cys Sfer Gly 15 Arg
5 10
Ala Arg Arg pro Pro Pro Gin Pro Ser Arg Pro Ala pro Pro pro pro
20 25 30
Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly
35 40 45
Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu
50 55 60
Arg ser Gin Leu val Pro val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg ser
65 70 75 80
ASP Glu Leu val Arg Phe Arg Phe Cys ser Gly ser cys Arg Arg Ala
85 90 95
Arg Ser Pro His ASp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala
100 105 110
Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys Cys Arg
115 120 125
Pro Thr Arg Tyr Glu Ala val Ser Phe Met Asp val Asn ser Thr Trp
130 135 140
Arg Thr val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala cys Gly Cys Leu ! Gly
145 150 155
<210> 8
<211> 1188 <212>DNA
<213> Homo sapiens
-38CZ 303868 B6 <400>8
ctgatgggcg ctcctggtgt tgatagagat ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60
gtcccactgc ccctggccta ggcggcaggt gagtggttct cccagtgact cctacctggt 120
actgaggaaa ggcggcttga ctggtgaggg agagcagggc ttggcttggg cagcggttag 180
gtgtgggagg gaaaatggtc agggagggac caggtgaatg ggaggaggag cgggacttct 240
ctgaatggtc ggtgcactca ggtgattcct cccctgggct cccagaggca gcaaacccat 300
tatactggaa cctaggccct tcctgagttt cccctccaca cagctaggag cccatgcccg 360
gcctgatctc agcccgagga cagcccctcc ttgaggtcct tcctccccaa gcccacctgg 420
gtgccctctt tctccctgag gctccacttg gtctctccgc gcagcctgcc ctgtggccca 480
ccctggccgc tctggctctg ctgagcagcg tcgcagaggc ctccctgggc tccgcgcccc 540
gcagccctgc cccccgcgaa ggccccccgc ctgtcctggc gtcccccgcc ggccacctgc 600
cgggtaggtg agagggcgag ggggcggggc ggggctggcc cgggacaccg cgcgtgactg 660
ggtctcattc cagggggacg cacggcccgc tggtgcagtg gaagagcccg gcggccgccg 720
ccgcagcctt ctcggcccgc gcccccgccg cctgcacccc catctgctct tccccgcggg 780
ggccgcgcgg cgcgggctgg gggcccgggc agccgcgctc gggcagcggg ggcgcggggc 840
tgccgcctgc gctcgcagct ggtgccggtg cgcgcgctcg gcctgggcca ccgctccgac 900
gagctggtgc gtttccgctt ctgcagcggc tcctgccgcc gcgcgcgctc tccacacgac 960
ctcagcctgg ccagcctact gggcgccggg gccctgcgac cgcccccggg ctcccggccc 1020
gtcagccagc cctgctgccg acccacgcgc tacgaagcgg tctccttcat ggacgtcaac 1080
agcacctgga gaaccgtgga ccgcctctcc gccaccgcct gcggctgcct gggctgaggg 1140
ctcgctccag ggctttgcag actggaccct taccggtggc tcttcctg 1188
<210> 9 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>9
Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp 15 10 15
Pro Arg Arg Gin Ala Pro Leu Gly Leu Ser Ala Gin Pro Ala Leu Trp 20 25 30
-39CZ 303868 B6
Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu ser ser Val Ala Glu Ala Ser 35 40 45
Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro 50 55 60
Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg
70 75 80
Trp cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg Pro Pro Pro Gin Pro Ser Arg Pro
90 95
Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg 100 105 110
Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala 115 120 125
Arg Gly Cys Arg Leu Arg ser Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly 130 135 140
Leu Gly His Arg ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Cys Arg Arg Ala Arg ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala ser Leu
165 170 175
Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val ser 180 185 190
Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala val Ser Phe Met Asp 195 200 205
-40HMMM val Asn ser Thr Trp Arg Thr val Asp Arg Leu ser Ala Thr Ala Cys 210 215 220
Gly Cys Leu Gly 225 <210> 10 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His cys Pro Trp 15 10 15
Pro Arg Arg Gin Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu 20 25 30
Leu ser Ser val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro 35 40 45
Ala Pro Arg Glu Gly Pro pro Pro val Leu Ala ser Pro Ala Gly His 50 55 60
Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg 65 70 75 80
Pro pro Pro Gin Pro Ser Arg pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro 85 90 95
Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly 100 105 110
-41 CZ 303868 B6
Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gin 115 120 125
Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg ser Asp Glu Leu 130 135 140
Val Arg Phe Arg Phe cys Ser Gly Ser cys Arg Arg Ala Arg ser Pro
145 150 155 160
His Asp Leu Ser Leu Ala ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
165 170 175
Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro cys cys Arg Pro Thr Arg 180 185 190
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp val Asn ser Thr Trp Arg Thr val 195 200 205
Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly cys Leu Gly 210 215 220 <210> 11 <211> 766 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctgatgggcg gtcccactgc gtggcccacc cgcgccccgc ccacctgccg gcagccttct ctcctggtgt ccctggccta ctggccgctc agccctgccc gggggacgca cggcccgcgc tgatagagat ggcggcaggc tggctctgct cccgcgaagg cggcccgctg ccccgccgcc ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60 tccacttggt ctctccgcgc agcctgccct 120 gagcagcgtc gcagaggcct ccctgggctc 180 ccccccgcct gtcctggcgt cccccgccgg 240 gtgcagtgga agagcccggcíggccgccgcc 300 tgcaccccca tctgctcttc cccgcggggg 360
-42CZ 303868 B6 ccgcgcggcg cgggctgggg ccgcctgcgc tcgcagctgg gctggtgcgt ttccgcttct cagcctggcc agcctactgg cagccagccc tgctgccgac cacctggaga accgtggacc cgctccaggg ctttgcagac <210> 12 <211> 742 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctgatgggcg ctcctggtgt gtcccactgc ccctggccta tctgctgagc agcgtcgcag cgaaggcccc ccgcctgtcc ccgctggtgc agtggaagag gccgcctgca cccccatctg gggcagccgc gctcgggcag ggtgcgcgcg ctcggcctgg cggctcctgc cgccgcgcgc cggggccctg cgaccgcccc gcgctacgaa gcggtctcct ctccgccacc gcctgcggct cccttaccgg tggctcttcc gcccgggcag tgccggtgcg gcagcggctc gcgccggggc ccacgcgcta gcctctccgc tggaccctta ccgcgctcgg gcagcggggg cgcggggctg 420 cgcgctcggc ctgggccacc gctccgacga 480 ctgccgccgc gcgcgctctc cacacgacct 540 cctgcgaccg cccccgggct cccggcccgt 600 cgaagcggtc tccttcatgg acgtcaacag 660 caccgcctgc ggctgcctgg gctgagggct 720 ccggtggctc ttcctg 766 tgatagagat ggaacttgga ggcggcagcc tgccctgtgg aggcctccct gggctccgcg tggcgtcccc cgccggccac cccggcggcc gccgccgcag ctcttccccg cgggggccgc cgggggcgcg gggctgccgc gccaccgctc cgacgagctg gctctccaca cgacctcagc cgggctcccg gcccgtcagc tcatggacgt caacagcacc gcctgggctg agggctcgct tg cttggaggcc tctccacgct 60 cccaccctgg ccgctctggc 120 ccccgcagcc ctgccccccg 180 ctgccggggg gacgcacggc 240 ccttctcggc ccgcgccccc 300 gcggcgcggg ctgggggccc 360 ctgcgctcgc agctggtgcc 420 gtgcgtttcc gcttctgcag 480 ctggccagcc tactgggcgc 540 cagccctgct gccgacccac 600 tggagaaccg tggaccgcct 660 ccagggcttt gcagactgga 720
742 <210> 13 ío <211>603 <212> DNA <213> Homo sapiens
43CZ 303868 B6 <400> 13 ctgatgggcg gtcccactgc gcccggcggc gctcttcccc gcgggggcgc ggccaccgct cgctctccac ccgggctccc ttcatggacg tgcctgggct ctg etcctggtgt ccctggccta cgccgccgca gcgggggccg ggggctgccg ccgacgagct acgacctcag ggcccgtcag tcaacagcac gagggctcgc tgatagagat ggcggcaggg gccttctcgg cgcggcgcgg cctgcgctcg ggtgcgtttc cctggccagc ccagccctgc ctggagaacc tccagggctt ggaacttgga ggacgcacgg cccgcgcccc gctgggggcc cagctggtgc cgcttctgca ctactgggcg tgccgaccca gtggaccgcc tgcagactgg cttggaggcc tctccacgct 60 cccgctggtg cagtggaaga 120 cgccgcctgc acccccatct 180 cgggcagccg cgctcgggca 240 cggtgcgcgc gctcggcctg 300 gcggctcctg ccgccgcgcg 360 ccggggccct gcgaccgccc 420 cgcgctacga agcggtctcc 480 tctccgccac cgcctgcggc 540 acccttaccg gtggctcttc 600
603 <210> 14 <211> 489 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ctgatgggcg etcctggtgt tgatagagat gtcccactgc ccctggccta ggcggcagcc tctgctgagc agcgtcgcag aggcctccct cgaaggcccc ccgcctgtcc tggcgtcccc cgcgcgcgct ctccacacga cctcagcctg ccgcccccgg gctcccggcc cgtcagccag gtctccttca tggacgtcaa cagcacctgg tgcggctgcc tgggctgagg gctcgctcca ctcttcctg ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60 tgccctgtgg cccaccctgg ccgctctggc 120 gggctccgcg ccccgcagcc ctgccccccg 180 cgccggccac ctgccggcgg ctcctgccgc 240 gccagcctac tgggcgccgg ggccctgcga 300 ccctgctgcc gacccacgcg ctacgaagcg 360 agaaccgtgg accgcctctc cgccaccgcc 420 gggctttgca gactggaccc ttaccggtgg 480
489 io <210> 15 <211> 350 <212>DNA <213> Homo sapiens
-44CZ 303868 B6 <400> 15 ctgatgggcg ctcctggtgt tgatagagat ggaacttgga cttggaggcc tctccacgct 60 gtcccactgc ccctggccta ggcggcagcg gctcctgccg ccgcgcgcgc tctccacacg 120 acctcagcct ggccagccta ctgggcgccg gggccctgcg accgcccccg ggctcccggc 180 ccgtcagcca gccctgctgc cgacccacgc gctacgaagc ggtctccttc atggacgtca 240 acagcacctg gagaaccgtg gaccgcctct ccgccaccgc ctgcggctgc ctgggctgag 300 ggctcgctcc agggctttgc agactggacc cttaccggtg gctcttcctg 350

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující lidský neurotrofický růstový faktor označený názvem enovin a mající aminokyselinovou sekvenci ilustrovanou v SEQ I No. 4.
  2. 2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kterou je molekula DNA.
  3. 3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo 2, kterou je molekula cDNA.
  4. 4. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 zahrnující sekvenci nukleové kyseliny odpovídající sekvenci kterékoliv varianty sestřihu označené jako SEQ ID No. 11, 12 nebo 13.
  5. 5. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 mající sekvenci nukleové kyseliny ilustrovanou v SEQ ID No. 2.
  6. 6. Izolovaný lidský neurotrofický růstový faktor kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a 5.
  7. 7. Izolovaný lidský neurotrofický růstový faktor obsahující aminokyselinovou sekvenci od pozice 27 do pozice 139 aminokyselinové sekvence ilustrované v SEQ ID No. 4.
  8. 8. Izolovaný lidský neurotrofický růstový faktor podle nároku 7 obsahující aminokyselinovou sekvenci ilustrovanou v SEQ ID No. 4.
  9. 9. Izolovaný lidský neurotrofický růstový faktor obsahující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci ilustrovanou v SEQ ID No. 4.
  10. 10. Expresní vektor obsahující molekulu DNA podle kteréhokoliv z nároků 2 až 5.
  11. 11. Expresní vektor podle nároku 10 obsahující další sekvenci nukleové kyseliny kódující reportérovou molekulu.
  12. 12. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná vektorem podle nároku 11.
  13. 13. Hostitelská buňka podle nároku 12, kterou je eukaryontní nebo bakteriální buňka.
    -45CZ 303868 B6
  14. 14. Použití molekuly nukleové kyseliny kódující sekvenci vykazující alespoň 70% aminokyselinovou homologii s aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 4 na výrobu léčiva na léčení nebo prevenci syndromů bolesti s podstatnou periferní nebo centrální neurogenní složkou.
  15. 15. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro použití jako léčivo.
  16. 16. Použití molekuly nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 na výrobu léčiva na léčení nebo prevenci syndromů bolesti s podstatnou periferní nebo centrální neurogenní složkou.
  17. 17. Použití neurotrofického růstového faktoru vykazujícího alespoň 70% aminokyselinovou homologii s aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 4 na výrobu léčiva na léčení nebo prevenci syndromů bolesti s podstatnou periferní nebo centrální neurogenní složkou.
  18. 18. Neurotrofický růstový faktor podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9 pro použití jako léčivo.
  19. 19. Použití neurotrofického růstového faktoru podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9 na výrobu léčiva na léčení nebo prevenci syndromů bolesti s podstatnou periferní nebo centrální neurogenní složkou.
  20. 20. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.
  21. 21. Farmaceutická kompozice, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje růstový faktor podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipi entem.
  22. 22. Protilátka schopná se vázat k růstovému faktoru podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9 nebo jeho epitopu.
  23. 23. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 22 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.
  24. 24. Způsob detekce přítomnosti růstového faktoru podle kteréhokoliv z náíoků 7 až 9 ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje reakci protilátky podle nároku 22 se vzorkem a detekci vazby mezi protilátkou a růstovým faktorem.
  25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že protilátka je konjugována k reportérové molekule.
  26. 26. Kit nebo zařízení na detekci přítomnosti neurotrofického růstového faktoru podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9 ve vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 22 a prostředek na reakci této protilátky se vzorkem.
  27. 27. Způsob identifikace agonisty nebo antagonisty lidského neurotrofického růstového faktoru podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že žahmuje kontaktování buněčné tkáně nebo organismu exprimujícího receptor růstového faktoru 3 kandidátskou sloučeninou za přítomnosti růstového faktoru a porovnání úrovně aktivace RET v buňce, tkáni nebo organismu s kontrolou, která nebyla kontaktována s kandidátskou sloučeninou.
    růstového faktoru Zahrnuje kontaktování cRET s kandidátskou e signální kinásy na Specifické pro signální
  28. 28. Způsob identifikace agonisty nebo antagonisty lidského neurotrofického podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že buněčné tkáně nebo organismu exprimujícího receptor růstového faktoru a sloučeninou za přítomnosti růstového faktoru a měření úrovně aktivac signální transdukční dráze, jejíž složkou receptor je, po přidání protilátky
    -46CZ 303868 B6 kinázu konjugovanou k reportérové molekule, ve srovnání s buněčnou tkání nebo organismem, který s touto sloučeninou nebyl kontaktován.
  29. 29. Způsob podle nároku 27 nebo 28, vyznačující se tím, že neurotrofickým růstovým faktorem je enovin mající aminokyselinovou sekvenci SE ID No. 3.
  30. 30. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 27 až 29, vyznačující se tím, že buněčnou tkání nebo organismem jsou buňky NIH 3T3.
  31. 31. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 27 až 30, v y z n a č u j í c í se tím, žereceptorem je receptor zvolený z GFRal, GFRa2, GFRa3 nebo GFRa4.
  32. 32. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 28 až 31, vyznačující se tím, že protilátka je specifická pro p42/p44 MAP kinázu, PKB kinázu, c-jun, CREB nebo JNK/SAPIC kinázu.
CZ20010028A 1998-07-14 1999-07-14 Lidský neurotrofický rustový faktor a jeho aplikace CZ303868B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9815283.8A GB9815283D0 (en) 1998-07-14 1998-07-14 Neurotrophic growth factor
US24877299A 1999-02-12 1999-02-12
US32766899A 1999-06-08 1999-06-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200128A3 CZ200128A3 (cs) 2001-08-15
CZ303868B6 true CZ303868B6 (cs) 2013-06-05

Family

ID=27269394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20010028A CZ303868B6 (cs) 1998-07-14 1999-07-14 Lidský neurotrofický rustový faktor a jeho aplikace

Country Status (28)

Country Link
US (1) US7544788B2 (cs)
EP (2) EP1640381B1 (cs)
JP (2) JP4469500B2 (cs)
KR (2) KR100712223B1 (cs)
CN (1) CN1243770C (cs)
AT (1) ATE343594T1 (cs)
AU (1) AU768472B2 (cs)
BG (1) BG65518B1 (cs)
BR (2) BR9912819A (cs)
CA (1) CA2333910C (cs)
CY (2) CY1105949T1 (cs)
CZ (1) CZ303868B6 (cs)
DE (1) DE69933771T2 (cs)
DK (2) DK1097167T3 (cs)
ES (2) ES2275349T3 (cs)
HK (2) HK1045528B (cs)
HR (1) HRP20010036B1 (cs)
HU (1) HU226073B1 (cs)
ID (1) ID27024A (cs)
IL (1) IL140877A0 (cs)
NO (1) NO331809B1 (cs)
NZ (1) NZ509723A (cs)
PL (1) PL209952B1 (cs)
PT (2) PT1097167E (cs)
SI (1) SI1640381T1 (cs)
SK (1) SK287361B6 (cs)
TR (1) TR200100074T2 (cs)
WO (1) WO2000004050A2 (cs)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
IL140259A0 (en) * 1998-07-06 2002-02-10 Nsgene As Neurotrophic factors
DE69933771T2 (de) * 1998-07-14 2007-09-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophischer wachstumsfaktor
US7067473B1 (en) 1998-07-14 2006-06-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor
US6284540B1 (en) 1998-09-29 2001-09-04 Washington University Artemin, a novel neurotrophic factor
WO2000034475A2 (en) * 1998-12-09 2000-06-15 Amgen Inc. Grnf4, a gdnf-related neurotrophic factor
EP1873244A3 (en) * 1999-06-02 2008-04-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
IL156559A0 (en) * 2000-12-22 2004-01-04 Genentech Inc New use of artemin, a member of the gdnf ligand family
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) * 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
CN1525866B (zh) * 2001-03-28 2013-05-29 比奥根艾迪克Ma公司 神经胚活素多肽的治疗作用
US20040077543A1 (en) * 2001-03-28 2004-04-22 Sah Dinah W. Y. Treatment using neublastin polypeptides
CA2486000A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Use of compounds that are effective as selective opiate receptor modulators
JP4571776B2 (ja) * 2002-11-05 2010-10-27 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 潤滑油組成物
EP1897552B1 (en) 2003-04-18 2009-06-17 Biogen Idec MA Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
DK1636260T3 (da) 2003-06-10 2009-06-22 Biogen Idec Inc Forbedret udskillelse af Neublastin
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
KR101241551B1 (ko) * 2004-08-19 2013-03-11 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 전환 성장 인자 베타 패밀리 단백질의 리폴딩
KR20110126732A (ko) * 2004-08-19 2011-11-23 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 뉴블라스틴 변형체
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
WO2007103182A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Biogen Idec Ma Inc. Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins
MX2009008413A (es) 2007-02-06 2009-11-02 Tai June Yoo Tratamiento y prevencion de enfermedades neurodegenerativas usando terapia genica.
TWI445544B (zh) * 2007-05-01 2014-07-21 Biogen Idec Inc 增進血管形成之組合物及方法
JP2010534195A (ja) * 2007-06-27 2010-11-04 オークランド ユニサーヴィスィズ リミテッド アルテミン及び関連するリガンドについてのポリペプチド及びポリヌクレオチド、並びにその使用方法
WO2009020964A2 (en) * 2007-08-08 2009-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-neublastin antibodies and uses thereof
JO3462B1 (ar) * 2012-08-22 2020-07-05 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية تجاه gfr?3 وطرق لاستخدامها
US11225689B2 (en) * 2016-08-17 2022-01-18 The Broad Institute, Inc. Method for determination and identification of cell signatures and cell markers

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000001815A2 (en) * 1998-07-06 2000-01-13 Nsgene A/S Neurotrophic factors
EP1097167A2 (en) * 1998-07-14 2001-05-09 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194596A (en) 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5739307A (en) 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
US5972338A (en) 1997-09-19 1999-10-26 Genentech, Inc. Tie ligands homologues
US20020055467A1 (en) * 1998-07-06 2002-05-09 Johansen Teit E. Novel neurotrophic factors
US7067473B1 (en) 1998-07-14 2006-06-27 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor
US6284540B1 (en) 1998-09-29 2001-09-04 Washington University Artemin, a novel neurotrophic factor
WO2000034475A2 (en) † 1998-12-09 2000-06-15 Amgen Inc. Grnf4, a gdnf-related neurotrophic factor
JP2002051906A (ja) * 2000-08-11 2002-02-19 Nippon Platec Co Ltd Ｉｈ調理器による加熱を可能にしたアルミ箔材料及びこのアルミ箔材料を用いて成形したアルミ箔材料製食品用容器
US7276580B2 (en) * 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
US11162698B2 (en) † 2017-04-14 2021-11-02 Johnson Controls Tyco IP Holdings LLP Thermostat with exhaust fan control for air quality and humidity control

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000001815A2 (en) * 1998-07-06 2000-01-13 Nsgene A/S Neurotrophic factors
EP1097167A2 (en) * 1998-07-14 2001-05-09 Janssen Pharmaceutica N.V. Neurotrophic growth factor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Baloh a kol. (1998) Neuron 21, 1291-1302, viz Obr. 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1342165A (zh) 2002-03-27
SK142001A3 (en) 2002-02-05
EP1640381A3 (en) 2007-01-31
JP4624476B2 (ja) 2011-02-02
HK1092477A1 (en) 2007-02-09
SI1640381T1 (sl) 2014-07-31
HUP0102821A3 (en) 2003-09-29
JP2002520042A (ja) 2002-07-09
KR100712223B1 (ko) 2007-04-27
EP1097167B1 (en) 2006-10-25
US7544788B2 (en) 2009-06-09
ES2479067T3 (es) 2014-07-23
JP4469500B2 (ja) 2010-05-26
BRPI9912819B1 (pt) 2018-09-18
CZ200128A3 (cs) 2001-08-15
CY1115496T1 (el) 2017-01-04
EP1097167B2 (en) 2018-12-12
WO2000004050A2 (en) 2000-01-27
ID27024A (id) 2001-02-22
CA2333910C (en) 2016-11-15
AU5283299A (en) 2000-02-07
PL348431A1 (en) 2002-05-20
BR9912819A (pt) 2001-05-02
PL209952B1 (pl) 2011-11-30
AU768472B2 (en) 2003-12-11
NO20010212L (no) 2001-03-14
KR100773776B1 (ko) 2007-11-12
NO331809B1 (no) 2012-04-10
IL140877A0 (en) 2002-02-10
KR20060061408A (ko) 2006-06-07
DE69933771D1 (de) 2006-12-07
CA2333910A1 (en) 2000-01-27
SK287361B6 (sk) 2010-08-09
HRP20010036B1 (en) 2010-06-30
BRPI9912819B8 (pt) 2021-05-25
BG65518B1 (bg) 2008-10-31
EP1640381B1 (en) 2014-05-14
DE69933771T2 (de) 2007-09-13
HK1045528B (zh) 2006-10-27
HUP0102821A2 (hu) 2001-11-28
EP1097167A2 (en) 2001-05-09
EP1640381A2 (en) 2006-03-29
TR200100074T2 (tr) 2001-11-21
CY1105949T1 (el) 2011-04-06
PT1640381E (pt) 2014-07-17
WO2000004050A3 (en) 2000-11-09
US20050233359A1 (en) 2005-10-20
JP2010158241A (ja) 2010-07-22
NO20010212D0 (no) 2001-01-12
ATE343594T1 (de) 2006-11-15
ES2275349T3 (es) 2007-06-01
HK1045528A1 (en) 2002-11-29
DK1097167T3 (da) 2007-03-12
CN1243770C (zh) 2006-03-01
NZ509723A (en) 2004-01-30
BG105107A (en) 2001-10-31
HU226073B1 (en) 2008-04-28
PT1097167E (pt) 2007-02-28
KR20010083108A (ko) 2001-08-31
DK1640381T3 (da) 2014-07-14
HRP20010036A2 (en) 2001-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ303868B6 (cs) Lidský neurotrofický rustový faktor a jeho aplikace
US8222378B2 (en) Neurotrophic growth factor, enovin
JP2002514055A (ja) ガラニンｇａｌｒ３受容体をコードするｄｎａおよびその使用
JP2003159083A (ja) 新規な神経栄養因子
PT1196560E (pt) Receptor de factores neurotróficos gfr-alfa-4
RU2238947C2 (ru) Нейротрофический фактор роста человека (эновин), кодирующая его выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор (варианты), фармацевтическая композиция (варианты), антитело, способ обнаружения фактора роста, набор, способ идентификации агониста или антагониста (варианты)
JPH10337189A (ja) 新規化合物
EP1171593A2 (en) Transmembrane (7tm) receptor r35
JPH1156375A (ja) エプスタイン・バーウイルスにより誘導されるｇタンパク質共役受容体の新規なスプライシング変異体
Class et al. Patent application title: ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING A NEUROTROPHIC GROWTH FACTOR Inventors: Stefano Leo Jozef Masure (Brasschaat, BE) Assignees: JANSSEN PHARMACEUTICA NV
CN1803837B (zh) 神经营养生长因子
MXPA01000579A (en) Neurotrophic growth factor

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20190714