JPS63126900A - 化学修飾蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は化学修飾蛋白質に関する。

従来の技術 百日咳毒素は、百日咳というヒト特有の疾患の原因微生
物であるボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌ　１ａ）Ｉｉ１
閑が産生ずるこの属菌独自の毒素である。

該毒素は、種々の生物活性を示すことか知られており、
例えばヒスタミン増感因子（ＨＳ　Ｆ　）、白血球（リ
ンパ球）増多因子（Ｌｌ）Ｆ）、血球凝集素（ＨＡ）、
マウス感染防御抗原（ＭＰＡ）、インシュリン分泌増強
活性蛋白質（Ｉ　Ａ　Ｐ　’Ｉなどとして知られて１六
　−ｊｌ−仁プのＩト躬パ受シｌ平白イｋｔ；を１自１
ト空１．−　トり上記活性の本体も明らかになりつつあ
り、ＬＰＦはｆＡＰと同一物質と認められているＪＰｉ
ｔｔｍａｎ。

闇１．レビュー・才ブ・インフエクシアス・ディシーズ
（Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）、上、４０１
−４１２（１９７９）ｌ。

上記インシュリン分泌増強活性蛋白質（以下■ＡＰと略
記することがある）は、哺乳動物のインシュリン分泌を
促進し、且つ血糖値を正常に長期間に渡り維持調整する
という薬理作用を有し、糖尿病の治療および予防薬とし
て有用であると考えられ、検討された結果、その製造法
、物理化学的性状についても既に知られている［Ｙａｊ
ｉｍａ、　Ｍ、。

ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、８３，２９５−３０３（１９７８
）］。

しかし反面、白血球増多作用、ヒスタミン増感作用、赤
血球凝集などの副作用をもち、さらに微生物起源の蛋白
であるので、異種蛋白質として免疫原性を有している。

したがってインシュリン分泌増強活性のみをＨし、副作
用の軽微ならしくはない性質を持つ物質の創製が望まれ
ている。

上記目的のため、ＩＡＰの化学修飾についてら試みられ
ている［Ｎｏｇｉｍｏｒｉ、　Ｋ、ら、ビオヒミンエ・
バイオフィジシエーアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｔｏ
ｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ）、８０１．２２０−２３１（１９８４）；同
誌。

８０１．２３２−２４３（１９８４）コが、副作用の低
減化、特に抗原性や免疫原性の低下については期待でき
ない。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、副作用を減弱化し、インシュリン分泌増強活
性を有するＩ　Ａ　Ｐ誘導体を創製することにある。

問題点を解決するための手段 本発明は、ボルデテラ属菌が産生ずるインシュリン分泌
増強活性蛋白質の一級アミノ基にポリエチレングリコー
ルを結合してなる化学修飾蛋白質を提供するものである
。

上記ボルデテラ属菌が産生ずるＩ　Ａ　Ｉ）は、インシ
ュリン分泌活性を有する蛋白質であれば精製品。

半端製品のいずれでもよく、例えば、１ｉη記Ｉ　Ａ　
Ｉ）の製造に関する文献に記載されたものや下記参考例
により製造されｒこものが挙げられる。

蛋白質の一級アミノ基については、リジンのε−アミノ
基や蛋白質のアミノ末端の一級アミノ基が挙げられる。

上記結合したポリエチレングリコールの残基は式−〇（
Ｃ１，Ｃ）１．０：ｉＲ［式中、Ｒは水酸基の保護基を
、Ｑは約７〜７００の整数を示す］で表わすことかでき
る。

本発明の化学修飾蛋白質は、上記−級アミノ基が上記ポ
リエチレングリコールとスペーサーを介して結合するの
か好ましい。

該スペーサーは、上記−級アミン基とボリエヂレンとの
結合を仲介するものであればいずれでも（トリアジン）
　、　＋ｉ　）　（Ｃｌｌｔｉ　［式中、ｍは１〜３の
整数を示す］で表わされる基（アルキレン）。

ｉｉｉ　）　　−叶ＣＨへ「［式中、ｎはＩ〜３の整数
を示す］で表わされる基（イミデート）などが挙げられ
る。

上記スペーサーに関し、トリアジンの場合はポリエチレ
ングリコールを１または２有していてもよく、とりわけ
ポリエチレングリコールを２分子有するものが好ましい
。アルキレンにおけるｍおよびイミデートにおけるｎは
、とりわけ２が好ましい。

本発明の化学修飾蛋白質は、ＩＡＰ分子に、ポリエチレ
ングリコールまたはポリエチレングリコールを有するス
ペーサーが約ｌないし３０分子、とりわけ約１〜ｌＯ分
子結合することが好ましい。

またＩＡＰ分子中の一級アミン基の約３〜８０％が、と
りわけ約３〜４０％が上記ポリエチレングリコールまた
はポリエチレングリコールをＨするスペーサーと結合す
ることが好ましい。

上記ポリエチレングリコールに関し、Ｒで表わされる水
酸基の保護基として低級（例えば炭素数１〜３）アルキ
ルや低級（例えば炭素数１〜３）アルカノイルが挙げら
れ、曲δ′としてメチル、エヂル、プロピル、ｉ−プロ
ピルなどが、後者としてホルミル、アセチル、プロピオ
ニルなどが例示される。

とりわけ水酸基の保護基としてはメチルが好ましい。σ
としては、とりわけ約８０〜３００であることが好まし
く、ポリエチレングリコールの平均分子量として約３５
０〜３００００、とりわけ約１９００〜１５０００のも
のが好ましい。

本発明の化学修飾蛋白質は、ボルデテラ属が産生ずるイ
ンシュリン分泌増強活性蛋白質（ＩＡＰ）とポリエチレ
ングリコールを有する化合物（活性化ＰＥＧ）とを反応
させることにより製造することができる。

次に、本発明の化学修飾蛋白質の製造法について述べる
。

スペーサーがトリアジンである本発明の化学修飾蛋白質
は、ＩＡＰと式 およびＱはｉｉｉ記と同意義を、Ｘはハロゲンを、ｐは
１または２の整数を示す］で表わされる化合物とを反応
させることにより製造することができる。

なお、Ｘは塩素であることが好ましい。

該反応は、例えばリン酸、ホウ酸等のバッファーの水溶
液中ｐＨ約８ないしｌＯ１温度約θ℃ないし室温で約１
ないし２４時間行なう。ＩＡＰに対し、化合物（Ｉ）を
１〜５００倍モル量、好ましくは５〜２００倍モル量用
いる。

スペーサーがアルキレンである本発明の化学修飾蛋白質
は、ＩＡＰを式 ０１１Ｃ（’Ｃ１１ｆｆｉ：ｉ；０（ＣＩＩ、ＣＩＩ０
）−Ｒ（ＩＩ）　［式中、Ｒ，ｍおよびＱは前記と同意
義を示す］で表わされる化合物とを還元剤の存在下反応
させることにより製造することができる。

該反応はリン酸、ホウ酸等のバッファーの水溶液中ｐ）
（約６．０〜９．０、温度約００Ｃ〜５０℃で約１０〜
８０時間行う。なお還元剤としては、水素化ホウ素ナト
リウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどホウ素系還
元剤が有利に用いられる。

またＩＡＰに対し、化合物（ＩＩ）を１−１０００倍モ
ル量、好ましくは５〜２００倍モル量用い、還元剤を１
〜１００倍モル量用いる。

スペーサーがイミデートである本発明の化学修飾蛋白質
は、ｔＡＰと式 Ｒ’　−Ｃ，−（ＣＨｔＶＯ（Ｃ１（ｔｃＩ（ｔ■ｐＲ
（Ｉ［Ｉ）　　［式中、Ｒ１ｉｌ ｎおよびＱは前記と同意義を、Ｒ′は低級アルコキシを
示す］で表わされる化合物とを反応させることにより製
造することができる。なおＲ′としては炭素数１〜３の
アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ）が
好ましい。また上記化合物（１）は塩酸、硫酸、酢酸等
との塩として用いることもできる。

該反応はリン酸、ホウ酸等のバッファーの水溶液中ｐＨ
約７．０〜９．０の弱アルカリ性、温度０℃〜４０℃で
約３〜３０時間行う。

なお、アミノ基の修飾率は、上記の活性化ＰＥＧの使用
量の範囲により、その使用量に応じ自由に変動させるこ
とができ、その好ましい使用ｍは、ＩＡＰＩモルに対し
てスペーサーがトリアジンである場合は約５〜１０００
モル、とりわけ好ましくは約５０〜５００モルであり、
スペーサーがイミデートまたはアルキレンである場合は
約１０〜２０００モル、とりわけ好ましくは約５０〜１
０００モルである。

所望により、反応液は、透析、塩析、限外ろ過。

イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、高速液体ク
ロマトグラフィー、電気泳動など通常の蛋白質の精製法
で精製し、目的とする化学修飾蛋白質を得ることができ
る。特に限外ろ過やゲルろ過は、未反応のＰＥＧの除去
に有効である。また、アミノ基の修飾の程度は、例えば
酸分解のあと、アミノ酸分析を行なって算出することが
できる。

原料物質である化合物（１）および（ＩＩ）はいずれも
公知物質であり、その製造法および物理化学的性状はそ
れぞれ例えばケミストリー・レターズ（Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、　７７３　（１９８０）お
よびＥＰＣ公開第１５４３１６号公報に記載されている
。

また化合物（ＩＩＩ）は、公知物質である式ＮＣ（ＣＨ
，１Ｏ−（Ｃ）ｌ、ＣＨ，０）−Ｒ（ＩＶ）　　Ｅ式中
、Ｒ，ｎおよびＱは前記と同意義を示すコで表わされる
化合物を、常法に従い低級アルカノール（メタノール。

エタノール、プロパツールなど）および酸（塩化水素、
塩酸、硫酸、酢酸など）の存在下加水分解することによ
り製造できる。

本発明の化学修飾蛋白質は、強いインシュリン分泌増強
活性を有し、さらに無修飾ＩＡＰが有する副作用である
、白血球増多作用、ヒスタミン増感作用、赤血球凝集作
用が著しく減弱されている。

さらに公知の無修飾ＩＡＰやその関連物質では達成され
得ない、抗原性や免疫原性についても著しく低下されて
いる。また低毒性である。

従って本発明の化学修飾蛋白質は、哺乳動物（ラット、
マウス、イヌ、ネコ、ヒトなど）の糖尿病の予防および
治療薬として極めて有用である。

例えば、糖尿病治療薬として本発明の化学修飾蛋白質を
用いる場合、成人１人１日当り蛋白質量として注射剤と
してならＬ　Ｏｎｇ／　ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇであり
、経口剤としてならｌ　ｍｇ／　ｋｇ　〜５００ｍｇ／
　ｋｇである。

ｍ皿 本発明の化学修飾蛋白質の作用は下記の実験例によって
も示される。

実験例１ インシュリン分泌増強活性 無修飾ＩＡＰおよび実施例１〜４で得たＰｌεＧ−ＩＡ
Ｐを生理食塩水に溶解し、そのｌｄ（蛋白質として４μ
ｇ）をＳＤラット（雄性各群５匹）の尾静脈内に投与し
、３日後に糖負荷による血糖値と血中インシュリンの変
動を調べた。なお実験開始前　２４時間絶食させた。ラ
ット尾静脈より０１ｌｄの血液を採取後、直ちに２０％
グルコース溶液を体重１００ｇあたりｌ　ｒＪを腹腔内
に投与し、１５．３０および６０分後に０．１旙のＩＩ
ＩＬ液を採取した。血糖値はグルコースオキシダーゼ法
、インシュリンは二抗体法により測定した。表１〜３に
示す結果のとおり、ＩＡＰおよびＰＥＧ−ＩＡＰの役！
−）により、いずれら血糖値の低下および血中インツユ
リンの増加が見られ、ＰＥＧで修飾したらのもインシュ
リン分泌増強活性を有している。

（以下余白） 実験例２　白血球増多作用（△ＬＰＦ’活性）Ａ／Ｊマ
ウス（雄性）に静脈注射で無修飾ＩＡＰおよび実施例２
で得たＰＥＧ−ＩＡＰ各０．４μｇ（蛋白質として）を
投与し、５日後に白血球数を測定し、対照群の白血球数
との差をもって、増加する白血球数を求めた。

ΔＬＰＦ活性＝活性物投与群の白血球数）−（対照群の
白血球数） 表４に示す結果のとおりＰＥＧ−Ｉ　ＡＰでは白血球増
多活性が消失もしくは減弱している。

表４　白血球増多活性 無修飾ＩＡＰ　　　　　　　　　　７２ＰＥＧ−ＩＡＰ
　　　　１０　　　　　　１１ＰＥＧ−ＩＡＰ　　　　
５０　　　　　　　０ＰＥＧ−ＩＡＰ　　　２００　　
　　　　　０実験例３　ヒスタミン増感作用 Ａ／Ｊマウス（雄性各群１０匹）に静脈注射で無修飾Ｉ
ＡＰおよび実施例２で得たＰＥＧ−Ｉ　ＡＰ各２μｇを
投与し、４日後にヒスタミン２　、５　ｍｇを腹腔内に
投与し、１時間以内に死亡したマウスの数をヒスタミン
増感作用として表わした。結果を表５に示す。ＰＥＧ−
Ｉ　ＡＰではヒスタミン増感作用が消失している。

無修飾ＩＡＰ　　　　　　　　　　１０ＰＥＧ−ＩＡＰ
　　　　１０　　　　　　　０ＰＥＧ−ＩＡＩ”　　　
　５０　　　　　　　０ＰＥＧ−ＩＡＰ　　　２００　
　　　　　　０実験例４　赤血球凝集作用 無修飾ＩＡＰおよび実施例２で得たＰＥＧ−ＩＡＰを０
．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むｌＯｎ＋Ｍリン酸バッフ
ァー、ｐＨ７で段階的に希釈し、０字型底マルチウェル
プレートに５０μρずつ分注し、同バッファーに＠濁し
た０、６％ガチ式つ赤血球（日本生物材料センター製）
を５０μσずつ加え混合した。室温で２時間放置した後
に赤血球凝集の有無を肉眼で判定した。表６に示す結果
のとおり、ＰＥＧ−ＩＡＰは赤血球凝集作用が減弱して
いる。

表６　赤血球凝集作用 蛋白濃度（μｇ／成） 無修飾ＩＡＰ　　　　　＋＋＋＋＋−１−−−ＰＥＧ−
ＩＡＰ　　　　５０　　＋＋　　＋　　−−−−−実験
例５　抗原性 抗原性は、酵素免疫測定法（サンドイツチ法）により測
定した。ＩＡＰに対する抗体はヤギを用いて免疫し、ア
フィニティ精製して得られた抗ＩＡＰ−ＩｇＧを用いた
。アルカリホスファターゼ標識抗ＩＡＰ−ＩｇＧはアル
カリフォスファターゼ（マイルス社製）をゲルタールア
ルデヒド法により、上記方法で得られた抗ＩＡＰ−１ｇ
Ｇに結合し調製した。以下に詳しく酵素免疫測定法の手
順について説明する。

５０ｍＭ炭酸バッフｙ−（ｐＨ９，７）に溶解した抗Ｉ
ＡＰ−ｔｇＧ（０，１μｇ／成）をデンマーク国。

ヌンク社製　９６穴マイクロプレートに１００μρずつ
分注し、４℃でｌ晩装置し、プレートに結合させｆこ。

抗ｒＡＰ−ＩｇＧを結合させたプレートを０．１４Ｍ塩
化ナトリウム、３ｍＭ塩化カリウムおよび０．０５％ト
ウイーン２０を含む１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＩ−
Ｉ　７　、４で洗浄した後、同バッファーで希釈した無
修飾ＩＡＰまたは実施例１〜４で得たＰＥＧ−ＩＡＰ（
０〜２００μｇ／ｄ）を１００μＱ加え、室温で２時間
放置した。プレートを同バッファーで洗浄した後、同バ
ッファーに溶解したアルカリホスファターゼ標識抗ｒＡ
Ｐ−ＩｇＧ（約０．２５μｇ／滅）をｉｏｏμｇ加え、
室温で２時間放置し、同バッファーで洗浄した後、アル
カリホスファターゼ活性を測定した。アルカリホスファ
ターゼ活性は、０．０１％塩化マグネシウム・６水塩を
含む１Ｍジェタノールアミンバッファー、ｐＨ９，８に
溶解したｐ−ニトロフェニルリン酸（１ｍｇ／滅）２０
０μＱを加え、室温で１時間反応させた後の波長４０５
ｎｍの吸光度の増加をコロナ社製ＭＴＰ−１２型マイク
ロプレート光度計を用いて測定した。結果を表７に示す
。抗原性は無修飾ＩＡＰを１００％として無修飾ＩＡＰ
に対する吸光度の比を％て表わした。

表７　抗原性 実験例６　免疫原性 ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ）　１４　。

３８１（１９７７）に記載の方法にしたがって行つた。

無修飾ＩＡＰまたは実施例２で得たＰＥＧ−［ＡＰ（蛋
白として２μｇ）をフロイント完全補助ａ（ＦＣＡ）で
乳濁化したのちＡ／Ｊマウス（６群８匹）の腹腔内へ投
与し、その後さらに１４日目。

２８日目に追加投与を行った。１４日目から７日目毎に
マウス眼窩静脈から採血し、その血清について、ラット
を用いて、受身皮膚アナフィラキシ−（ＰＣＡ）反応に
よる抗体産生の評価を行った。

予め希釈しておいた血清０．１ｄを皮肉注射しておき、
その４時間後に無修飾ＩＡＩ）１００μｇとエバンスブ
ルー２０ｍｇの混液２ｄを静脈注射し、色素の血管透過
性をもって判定した。結果を表８に示す。表中の数値は
ＰＣＡ反応が陽性であった。

血清の最大希釈倍数で表示した。無修飾Ｉ　ＡＰ。

ＰＥＧ−ＩＡＰ　　１０およびＰＥＧ−ＩＡＩ）５０は
無修飾ＩＡＰに対する抗体が産生されｆ二がＰＥＧ−［
ＡＰ　　２００では無修飾ＩＡＰに対する抗体産生は認
められなかった。

表８　免疫原性 ＰＣＡ−タイター判定日 モル比　　１４　２１　２８　３５ 無修飾ＩＡＰ　　　　　　　　−”　　−−１６ＰＥＧ
−ＩＡＰ　　　　１０　　　−　−　　４　３２ＰＥＧ
−ＩＡＰ　　　　５０　　　−　　−　−　１６ＰＥＧ
−ＩＡＰ　　　　２００ ｌ：＜４ 実験例７　糖尿病モデルラットにおける耐糖能改善 １．５日齢の雌Ｗｉｓｔａｒ　　Ｋｙｏｔｏラットの皮
下にストレプトシトシン１２０　ｔｎｇ／ｋｇを注射し
た後に、８週齢まで飼育することにより糖尿病モデルラ
ットを作製した。無修飾ＴＡＰまたは実施例２で得たＰ
ＥＧ−Ｉ　Ａｐを２μｇ静脈投与し、６日後に耐糖能を
測定しｆこ。また投与５日後および１１日後に体重と白
血球数を測定した。耐糖能の測定は以下のように行った
。実験開始前２４時間絶食させたラット尾静脈より０．
ｌ扉採血後直ちに、グルコースを経口投与（２ｇ／　ｋ
ｇ）　Ｉ、、１５．３０’。

６０，１２０分後に０．１ｄの血液を採取した。採取し
た血液の血漿グルコース屯をグルコースオキシダーゼ法
により測定した。第１図に血漿グルコース値、第２図に
体重、第３図に白血球数を示す。

第１図に示したとおり糖尿病ラットでは正常ラットに比
へ、かなりの耐糖能悪化が見られる。しかし無修飾ＩＡ
ＰまたはＰＥＧ−ＩＡＰ投与群では、はぼ正常ラットに
近いまでに耐糖能が改善されている。また無修飾ＩＡＰ
投与群では体重の減少が見られ、さらに白血球数が対照
群の３倍にまで増加している。一方、ＰＥＧ−Ｉ　ＡＰ
投与群では体重および白血球数ともに対照群とほとんど
差は見られない。

以上により、ＩＡＰをＰＥＧで修飾することにより、無
修飾ＩＡＰと同等の耐糖能改簿作用をｆ丁しｆ二まま、
体重減少および白血球増加の副作用を消失させることか
明らかである。

実施例 以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。

参考例Ｉ　　ＩＡＰの製造 ＥＰＣ公開第４７８０２号公報実施例１の記載の方法に
従い製造した１００°Ｃ，３分間加熱により得られた内
毒素が少なくニワトリ血球凝集価（ＨＡ価）の高い両分
を、ｐＩ−■８．０に平衡化したハイドロオキシアパタ
イトカラムを通しＦ　ＨＡを除いた。この素通り画分を
塩酸でｐｒ−ｔｅ、ｏに調整し、１）Ｉ−１６，０に平
衡化した新しいハイドロオキシアパタイトカラムに通し
た。吸着さイｔた粗ＩＡＰは０．５Ｍ塩化ナトリウムの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＩ４７　、０　）で溶出し、
ついで抗Ｆ’ＨＡ結合セファロースカラムを通し、最後
に蔗糖密度勾配遠心により精製した。かくして得られた
ＩＡＰを実施例において用いた。

参考例２２．４−ビス（０−ポリエチレングリコール　
メチルエーテル）−６−クロロ −８−トリアジンの合成 ポリエチレングリコール　メチルエーテル（平均分子量
５０００）４０ｇ、ベンゼン２００成、無水炭酸ナトリ
ウム２０ｇおよびモレキュラーシーブ３Ａ（和光補薬工
業（昧）社製）１０ｇからなる混合液に塩化シアヌル７
３０ｍｇを加え、８０℃で２０時間攪拌しながら反応さ
せた。反応後石油エーテル４００滅を加え、２．４−ビ
ス（０−ポリエチレングリコール　メチルエーテル）−
６−クロロ−８−トリアジンを沈澱せしめ、その沈澱物
をベンゼンに溶解し、未反応の塩化シアヌルを除去する
ため、この操作を３回くり返した後、その沈澱物をデシ
ケータ−中で減圧下で乾燥させ、２．４−ビス（０−ポ
リエチレングリコール　メチルエーテル）−６−クロロ
−８−トリアジン３６ｇを得た。

Ｍａｒｉｃｌｅの方法［アナリティカルケミストリー（
Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、）、　３５．６８３（１９６３
）］により測定した該ＰＥＧ−Ｉ　ＡＰの塩素含量は０
．３２％であり、理論値の０，３５％とほぼ一致してい
た。

平均分子量３５０．７５０．１９００のポリエチレング
リコール　メチルエーテルをそれぞれ同様の方法で処理
し、対応する２、４−ヒス（Ｏ−ポリエチレングリコー
ル　メチルエーテル）−６−りコロ−Ｓ−トリアジンを
得た。

各収量１０．０ｇ、１３．２ｇおよび３３．６ｇ得られ
たＰＥＧ−ＩＡＰの塩素含量はそれぞれ７．５％、４．
２％および１．５％であり、理論値７゜６％、４．１％
および１．７％とほぼ一致していた。

平均分子量３５０および７５０のものは常温では飴状で
あった。

参考例３　ポリエチレングリコールモノメチルエーテル
アルデヒドの合成 （１）ポリエチレングリコール　メチルエーテル（５ｇ
、平均分子量５０００）を塩化メチレン（１００成）に
溶かし、クロルクロム酸ピリジニウム（３３０ｍｇ）を
加え、室温で１２時間かきまぜた。反応液を２倍量の塩
化メチレンでうすめて、フロリジル（セルバ社製、西ド
イツ国）のカラム（６ｘｌＯｃｍ）に注ぎ込み、カラム
を塩化メチレン、ついでクロロホルムで洗ったのち、メ
タノール−クロロホルム（１’：　９　）で溶出した。

２．４−ジニトロフェニルヒドラジンテストで陽性の両
分を集めて、溶媒を減圧留去し、結晶性のワックスとし
て目的化合物を得た。収量１．５ｇ（３０％）、薄層ク
ロマトグラフィー：’ｕ−０，０８ｃクロロホルム：メ
タノール：酢酸＝　９　：　ｌ　：０．５．シリカゲル
）、１３Ｃ−ＮＭＲで９６．２ＰＰＭに水和した型（−
ＣＨ（ＯＨ）ｔ）でアルデヒド基の吸収を認めた。

参考例４　ポリエチレングリコールイミドエステル体の
合成 平均分子ｆｆ１５０００のポリエチレングリコールメチ
ルエーテルから合成したポリエチレングリコール　メチ
ルエーテル　モノ−β−シアノエチルエーテル２ｇを無
水メタノール１５ｄに溶解し一２０℃以下で乾燥塩化水
素を飽和するまで吹込んだのち密栓して冷凍庫中で３日
間放置した。これに無水エーテルを加え再び冷凍庫中で
静置した。

４時間後、上部エーテル層をデカンテーションし再び無
水エーテルを加えてよく混ぜ冷凍庫中で放置するとめ１
時間で固形物が生じた。エーテルをすて無水エーテルを
加えて固形物を良く洗い、冷凍庫中で放置し、固形物の
沈澱を待ってエーテル層をすてた。この操作を引続き２
回行ない固形物を良く洗った。得られた固形物を五酸化
リンおよび固形ＮａＯＨデシケータ−中で１時間吸引乾
燥して平均分子ｆｉ５０００のポリエチレングリコール
イミドエステルを得た。収ｉ１．５ｇ、ＮＭＲ（ｄ６−
ＤＭＳＯ中、９０ＭＨｚ）では ＣＨｔ　−ＣＨｔ　　Ｃ＝　Ｎ　Ｈに帰属されるトリＣ
Ｈ３ ブレットをδ２．３の位置に観察し、また、ＩＲでは一
〇Ｈに帰属される吸収が消失した。

実施例Ｉ　　ＰＥＧ−ＩＡＰの調製 ＩＡＰ２．５ｍｇに対し、２００倍モル比になるように
、参考例２で得た、平均分子量３５０，７５０．１９０
０および５０００の２．４−ビス（０−ポリエチレング
リコール　メチルエーテル）−６−クロロ−８〜トリア
ジンをそれぞれ加え、０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ
９，０，２５成中で４℃、２時間反応させたのち、０．
２Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７を２５蔵加え反応を停止
させ、限外ろ過（アミコン社（米国）製、＠ＰＭ−３０
）で未反応のＰＥＧを除去し、濃縮ｉ！２．０Ｍｌをセ
ファクリルＳ−２００（２アルマシア製、スウェーデン
）のカラム（１，８ｘ　７７ｃｍ）を用いたゲルろ過に
より精製し、ＰＥＧ−Ｉ　ＡＰを得た。なお蛋白量はＬ
’ｏ　ｗ　ｒ　ｙの方法により測定した。アミノ基の修
飾率はフルオレサミン法［アーカイフス・オブ・バイオ
ケミストリー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒｃｈ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）、　１５５　、
２１３−２２０　（１９７３）］により測定した遊離ア
ミノ基量から算出した。結果を表９に示す。

ＰＥＧ−ＩＡＰ　　　　　３５０　　　　　　　２２．
５ＰＥＧ−ＩＡＰ　　　　　７５０　　　　　　　３０
．５ＰＥＧ−ＩＡＰ　　　　　１９００　　　　　　　
　１５．８実施例２　　ＰＥＧ−ＩＡＩ）の調製 ＩＡＰ１ｍｇに対し、１０．５０および２００倍モル比
になるように参考例２て得られた平均分子１５０００の
２．４−ビス（Ｏ−ポリエチレングリコール　メチルエ
ーテル）−６−クロロ−８−トリアジンを加え、０．１
Ｍホウ酸バッファー。

りＨ９，４，Ｏｄ中で４℃、２時間反応させたのち、０
．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７、０を４　、　Ｏｒｒ
ｒｌ加え反応を停止させ、限外ろ過（アミコン社（米国
）製、膜ＰＭ−３０）で未反応のＰＥＧを除去し、濃縮
液２．０成をセファクリルＳ−２００（ファルマシア製
、スウェーデン）のカラム（１，８Ｘ７７ｃｍ）のゲル
ろ過により精製し、ＰＥＧ−Ｉ　ＡＰを得た。

なお蛋白量はＬｏｗｒｙの方法により測定した。アミノ
基の修飾率はフルオレサミン法により測定した遊離アミ
ノ基量から算出した。結果を表１Ｏに示す。

表１０　　ＰＥＧ−ＩＡＰのアミノ基修飾率ＰＥＧ−Ｉ
ＡＰ　　　　　１０　　　　　３．０ＰＥＧ−ＩＡＰ　
　　　　５０　　　　　１９．７実施例３　　ＰＥＧ−
ＩＡＰの調製 ＩＡＰ２ｍｇに対し、１０００倍モル比になるように参
考例３で得られたポリエチレングリコールメチルエーテ
ルアルデヒドを加え、０．２Ｍ尿素を含む０．１Ｍリン
酸バッファー、Ｉ）Ｈ７，０，２旙中で室温、３０分反
応させたのち、メタノールに溶解したピリジンボラン（
５５ｍｇ／Ｊ）を５０μＱ加え室温、２時間反応させた
。ＩＭグリンンを２顧加え反応を停止させ、限外ろ過（
アミコン社（米国）製、膜１’Ｍ−３０）で未反応のＰ
ＥＧを除去し、濃縮液２．０滅をセファクリルＳ−２０
０（ファルマシア製、スウェーデン）のカラム（１，８
ｘ　７７ｃｍ）のゲルろ過により精製し、ＰＥＧ−Ｉ　
ＡＰを得た。

フルオレサミン法によるアミノ基修飾率は、３７゜０％
であった。

実施例４　　ＰＥＧ−ＩＡＰの調製 ＩＡＰ２ｍｇに対し、２０００倍モル比になるように、
参考例４で得られｆこポリエチレングリコールイミドエ
ステルを加え、２Ｍ尿素を含む０．１Ｍリン酸バッファ
ー、ｐＨ７，０，２蔵中で４８Ｃ，２時間反応させた後
、Ｉ　Ｍ酢酸アンモニウム、Ｉ）８６．０を４０成加え
反応を停止させ、限外ろ過（アミコン社（米国）製、膜
ＰＭ−３０）で未反応のＰＥＧを除去し、濃縮液２．０
戒をセファクリルＳ−２００（ファルマノア製、スウェ
ーデン）のカラム（１，８ｘ７７ｃｍ）のゲルろ過によ
り精製し、ＰＥＧ−ＩＡＰを得た。フルオレサミン法に
よるアミノ基修飾率は、１６．４％であった。

発明の効果 本発明の化学修飾蛋白質は、強いインシュリン分泌増強
活性を有し、無修飾ＩＡＰが有する各種副作用を低減し
ているので、糖尿病の予防および治療薬として有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図は、実験例７に示したそれ
ぞれ糖尿病ラットの耐糖能（血漿グルコース値）２体重
変化および白血球数を示す。なお第１図において一〇−
は対照群を、−×−は正常ラットを、−・−はＩＡＰを
、−△−はＰＥＧ−ＩＡＰを示す。第２図において一〇
−は対照群を、−×−は正常ラットを、−・−はＩＡＰ
を、−△−はＰＥＧ−ＩＡＰを示す。 第１図 Ｏ初　　　６０　　　　′：？０１２０時間　（分） 第２図 ０　　　　　　　　ぢ　　　　　　　　　　１１日 手続補正書（自発） 昭和６２年６月２６日 １、事件の表示 昭和６２年特許願第９７９９０号 ２、発明の名称 化学修飾蛋白質 ３、補正をする晋 事件との関係　　特許出願人 住所　　大阪市東区道修町２丁目２７番地名称　（２９
３）武田薬品工業株式会社代表者　梅　本　純　正 ４、代理人 住所　大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８５号５、補
正の対象 ６、補正の内容 明細書第２５頁第１５行目および第２６頁第３行目のｒ
ＰＥＧ−［ＡＰＪを「化合物」に訂正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ボルデテラ属菌が産生するインシュリン分泌増強活性蛋
   白質の一級アミノ基にポリエチレングリコールを結合し
   てなる化学修飾蛋白質。