SU1735307A1

SU1735307A1 - Конъюгат аденилил(2 @ -5 @ ) аденилил-(2 @ -5 @ ) аденозина с бычьим сывороточным альбумином, используемый дл получени антител, специфичных к 2 @ , 5 @ - олигоаденилатам

Info

Publication number: SU1735307A1
Application number: SU904845719A
Authority: SU
Inventors: Тамара Ивановна Кулак; Евгений Иванович Квасюк; Игорь Александрович Михайлопуло; Светлана Михайловна Шуляковская; Андрей Георгиевич Прядко; Татьяна Владимировна Карпова
Original assignee: Институт биоорганической химии АН БССР
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1990-07-02
Publication date: 1992-05-23

Abstract

Изобретение относитс к биохимии, конкретно к конъюгату аденилил(21-51)аде- нилил (21-51) аденозина с бычьим сывороточным альбумином. Цель изобретени - повышение стабильности. Конъюгат получают взаимодействием адёнилил (21-51) аденилил (21-51)-21, 31-0-(2-карбоксиэ- тил/этилиденаденозина с бычьим сывороточным альбумином в присутствии М-этил-М1-диэтиламинопропилкарбодиими - да в среде водной уксусной кислоты или на- трийацетатного буфера. Полученный конъю- гат стабилен в водных растворах и может быть использован дл получени антител, специфичных к 2 ,5 -олигоаденилатам. Ё VJ GJ ел со о VI

Description

Изобретение относитс к биохимии, конкретно к конъюгату формулы I:

шW

но

л

Y7l

Ade

н-SX

W

БСА.-5ыч1ш сыбороточный альбумин ,

который может быть использован дл получени антител, специфичных к 2 ,5-олиго- аденилатам.

2|,5|-Олигоаденилаты - природные низкомолекул рные биорегул торы, которые вл ютс медиаторами противовирусного действи интерферона (1). Эти соединени присутствуют в различных органах и ткан х и обладают широким спектром биологической активности (2). Концентраци 2,5 -оли- гоаденилатов в клетках зависит от гормонального статуса организма и уровн циклических нуклеотидов. Это свидетельствует о возможности использовани 2, олигоаденилатов в качестве лекарственных препаратов, а также дл создани на их основе средств микроанализа дл диагностики различных заболеваний (вирусные, аллергические, аутоиммунные и т.д.).

Широкое распространение дл определени природных соединений в биологических объектах получили методы, основанные на использовании антител, специфичных к этим соединени м. 2,5 -Олиго- аденилаты сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому дл получени иммунного ответа у животных они могут быть использованы дл иммунизации в виде конъюгатов с белками. Так как в общем пуле 2,5 -олигоаденилатов в клетке основна дол приходитс на тример, то естественно, что конъюгаты должны быть получены на его основе.

Известен конъюгат аденилил(2-5)аде- нилил(2-5)аденозина с БСА формулы:

пАйе

T7I

НО 0-Р-О 0-1/0

Ade

W

НО 0-Р-О

i-vQ|ue

®-W чшв котором св зь тримера с белком осуществл етс путем периодатного окислени , 2,з -цис-диольного фрагмента 2 -терми- нального аденозина с последующими конденсацией образующегос диальдегида с аминогруппами белка и восстановлением Шиффовых оснований (3). Такой способ получени в данном случае приводит практически к разрушению одного звена в молекуле

антигена, что не может не сказатьс на специфичности вырабатываемых животным антител.

Более близким по сути к предлагаемому вл етс конъюгат формулы:

Ho-yONMe

W §

НО Q-P-Qi-jAf

@Н1н-с-снг-снгс-о о-8-снгснгс-кн-©

Полученный путем конденсации 0-сукципильного производного аденилил-(2 -5)аде- нозина с БСА (4). Существенным недостатком такого конъюгата вл етс наличие в молекуле лабильной сложноэфир- ной св зи между молекулой димера и

остатком нтарной кислоты. Как было показано дл конъюгатов 2 -0-сукцината адено- зин-3 .б -циклофосфата с белком, гидролиз сложноэфирной св зи и разрушение конъюгата происходит в водных растворах даже

при-20°С(5).

Целью изобретени вл етс новый конъюгат аденилил(2-5)аденил ил(2|-5у-2|,З1- 0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина и БСА, более стабильный в сравнении с описанными в литературе.

Поставленна цель достигаетс конъюгатом 1, который получают взаимодействием аденилил(2-5)аденилил (21- 5|)-2|,3|-0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина

(6) с БСА в присутствии N-этил-М -диэтила- минопропилкарбодиимида в среде уксусной кислоты или натрийацетатного буфера с последующим выделением и очисткой конъюгата известными способами.

Сущность изобретени иллюстрируетс следующими примерами конкретного выполнени .

Пример 1.

К раствору 10 мг БСА в 1 мл воды

добавл ют 10мг(0,007ммоль)аденилил(2- 51) аденилил (21-51) -21,31-0-(2- карбоксиэтил) этилиденаденозина три (триэтиламмоние- вой) соли и 7 мг (0,036 ммоль} IM-этил-М -диэ- тиламинопропилкарбодиимида гидрохлорида . К полученному раствору добавл ют по капл м 1 М раствор уксусной кислоты до рН 4,5 и выдерживают смесь в течение 20 ч при комнатной температуре. Раствор диализу- ют при 0-5°С против воды (3x500 мл) и хро- матографируют на колонке с сефадексом G-10 (200 см3). Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют. Получают 10 мг конъюгата, УФ-спектр а воде: Лмакс 260 нм.

Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенна спек- трофотометрически, составл ет 5 моль три- мера на 1 моль белка.

П ри м б р 2.

К раствору 30 мг БСА в 3 мл 0,1 М натрий- ацетатного буфера с рН 4,7 добавл ют 44 мг (0,033 ммоль) аденилил(2|-5)аденилил(2|-5|)- 2 -з -0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина три(триэтиламмониевой соли) и 30 мг (0,11 ммоль) Ы-этил-Г -диэтиламинопропилкар- бодиимида гидрохлорида, Реакционную смесь выдерживают в течение 20 ч при комнатной температуре, диализуют при 0-5°С против 0,01 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,35, содержащего 0,15 М NaCI (4 х 500 мл) и хроматографируют на колонке с сефадексом G-10 (300 см3), Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют, Получают 32 мг конъюгата, УФ-спектр в Н20: Амакс 260 нм. Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенна спектро- фотометрически, составл ет 8 мольтримера на 1 моль белка.

Конъюгат получают с высоким выходом (практически количественный) и хорошей степенью посадки антигена (5-8 моль три- мера на 1 моль белка), что обусловлено стабильностью соединени как в процессе синтеза так и в процессе выделени , протекающих в водных растворах. Синтезированный конъюгат используют дл получени антител, специфичных к 2,5 -олигоаденила- там, что подтверждаетс следующим примером .

Пример 3.

П ть кроликов (случайной породы, массой 2,3-2,5 кг) иммунизируют введением 0,5 мл эмульсии 0,25 мг конъюгата 1 в полном адъюванте Фрейнда подкожно в 4-5 точек на спине 7 раз с интервалом в 14 дн. Спуст 1,5 мес. после последней инъекции провод т 5 поддерживающих инъекций с интервалом в 14 дн. и через 10 дн. провод т забор

крови. Антисыворотку выдел ют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, разбавл ют 1:100 0,05 М ацетат-цит- ратным буфером рН 6,2-6,3 и хран т малыми аликвотами при -20°С.

Высокоспецифична антисыворотка к аде- нилил (2-5)аденилил(2-5)аденозину была получена от двух животных через 3 мес. Характеристика антисыворотки. Путем последовательных разведений

установлено, что 50%-ное св зывание радиоактивно меченного лиганда достигаетс при разведении 1:6000. Константа ассоциации , определенна путем построени графика Скэтчарда(7), составл ет 1,18 х 109

Кроссреактивность антисыворотки к адено- зину, аденозин-б -монофосфату, аденозин- б -трифосфату 0,01%и

аденилил(3-5|)аденилил(3|-5|)аденозину составл ет 0,02%.

Конъюгат, не содержащий в своей структуре лабильных сложноэфирных св зей , получают и выдел ют с количественным выходом. Достигаема степень посадки гап- тена на белок обеспечивает необходимую

иммуногенность дл получени антител, специфичных к 2|,5|-олигоаденилатам. Кол- нъюгат стабилен в водных растворах и может быть использован дл иммунизации без дополнительной очистки после длительного

хранени .

Claims

Формула изобретени Конъюгат аденилил(2-51)аденилил- (2-5)аденозина с бычьим сывороточным альбумином формулы:

)1Нг

,

%

НО 0-Р-О

1 ПМе

ф

НО 0-Р-О

о

50

где

О О НзС СгНц-С-КН-®

55

используемый дл получени антител, специфичных к 2,5 олигоаденилатам.