NL1009601C2

NL1009601C2 - Verbinding welke de binding van een eiwit aan mestcellen kan remmen, toepassing van de verbinding voor de bereiding van een geneesmiddel, een farmaceutisch preparaat, een werkwijze voor het diagnostiseren van een ziekte en een selectiewerkwijze.

Info

Publication number: NL1009601C2
Application number: NL1009601A
Authority: NL
Inventors: Franciscus Antonius M Redegeld; Aletta Desiree Kraneveld; Franciscus Petrus Nijkamp
Original assignee: Univ Utrecht
Priority date: 1998-07-09
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2000-01-11
Also published as: AU4804799A; EP1093462A1; US20020045186A1; EP1093462B1; CA2332561A1; US7056511B2; DE69941431D1; US20050049183A1; WO2000002915A1; ES2333493T3; ATE443080T1; CA2332561C

Description

Verbinding welke de binding van een eiwit aan mestcellen kan remmen, toepassing van de verbinding voor de bereiding van een geneesmiddel, een farmaceutisch preparaat, een werkwijze voor het diagnostiseren van een ziekte en een selectiewerk-wijze

Op het gebied van de immunologie is door Askenase, P.W. et al (J. Exp. Med. 1£7, blz. 862-873 (1983)) een »T-celfactor" beschreven welke mestcellen sensibiliseert. Deze "T-celfactor" is een zeer onzuiver preparaat. Tot op heden 5 was niet bekend welk bestanddeel/welke bestanddelen verantwoordelijk was/waren voor de sensibilisatie.

Verrassenderwijze heeft aanvraagster gevonden dat de vrije lichte keten van immunoglobuline (Ig LC) deel uitmaakt van de "T-celfactor" en het voor sensibilisatie van mestcel-10 len verantwoordelijke agens is. Gevonden is dat Ig LC de mestcellen op antigeen-specifieke wijze sensibiliseert.

Derhalve heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een verbinding welke de binding van de vrije lichte keten van immunoglobuline aan mestcellen remt, waarbij de verbin-15 ding in aanwezigheid van een equimolaire hoeveelheid vrije lichte keten van immunoglobuline de binding daarvan met ten minste 5% verlaagt.

Een dergelijke verbinding is van groot belang voor gebruik als middel voor het onderdrukken van onaangename ge-20 volgen voor een patiënt die daar als gevolg van de sensibilisatie last van heeft. De verbindingen kunnen op eenvoudige wijze worden gevonden, bijvoorbeeld door incubatie van een te onderzoeken verbinding, fluorescent gelabeld Ig LC en mestcellen. Met behulp van een fluorescentie-microscoop of, voor 25 kwantitatieve meting, van een Fluorescence Activated Cell

Sorter (FACS) kan de remming worden vastgesteld. Deze remming kan optreden door competitie tussen de verbinding en Ig LC om binding aan de mestcel.

Volgens een interessante uitvoeringsvorm kan de ver-30 binding binden aan de vrije lichte keten van immunoglobuline, waarbij de verbinding in staat is tot competitie met een de vrije lichte keten bindend peptide met aminozuurvolgorde 1009601 2 (AHWSGHCCL) en de verbinding in aanwezigheid van een equimolaire hoeveelheid van het peptide de binding daarvan met ten minste 5% verlaagt.

In het vak is bekend dat uromoduline, een in de nie-5 ren aanwezig eiwit, kan binden aan de vrije lichte keten van een immunoglobuline. Bij onderzoek door Huang, Z.-Q. et al (ref.2) is gebleken dat een van uromoduline afgeleid peptide voor deze binding zorg lijkt te dragen.

Bij voorkeur verlaagt de verbinding de binding van 10 het peptide met ten minste 10, bij voorkeur ten minste 25, met meer voorkeur ten minste 50, met nog meer voorkeur ten minste 75 en met de meeste voorkeur met ten minste 90%.

Dergelijke verbindingen zijn, zeker als de binding met meer dan 50% wordt verlaagd, in principe zeer bruikbaar 15 als actief bestanddeel voor een farmaceutisch preparaat.

Binnen het kader van de onderhavige uitvinding kan ook het peptide met de formule (I) van het formuleblad worden gebruikt als actief bestanddeel. Verder kunnen ook op peptiden worden toegepast met ongebruikelijke en/of gemodificeerde 20 aminozuren. Volgens een interessante uitvoeringsvorm is de verbinding een peptidomimeticum.

Een geschikt peptidomimeticum is bijvoorbeeld een peptoïde zoals het peptoïde dat overeenkomt met het peptide met de formule (I), maar waarbij de zijketens zich op de 25 stikstofatomen van het peptideskelet bevinden. Een dergelijk peptoïde heeft in vergelijking met het oorspronkelijke peptide een langere halfwaardetijd in het bloed. De bereiding van peptoïden is in het vak goed beschreven. Het belangrijkste verschil met de synthese van peptiden betreft de afwijkende, 30 met aminozuren corresponderende uitgangsstoffen.

! De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor het nalopen van een serie verbindingen op het vermogen ervan om de vrije lichte keten van immunoglobuline te binden onder gebruikmaking van een gelabelde verbin-35 ding waarvan bekend is dat deze de vrije lichte keten van immunoglobuline kan binden, en een competitiereactie kan aangaan met het peptide met aminozuurvolgorde (AHWSGHCCL) van het formuleblad, waarbij het nalopen geschiedt onder gebruikmaking van een test welke een competitiereactie omvat tussen ' 1009601 3 een te testen verbinding en de gelabelde verbinding. De test is geschikt een homogene test, wat het mogelijk maakt snel verbindingen na te lopen en werkzame verbindingen te selecteren.

5 In de onderhavige aanvrage wordt onder een homogene test verstaan een test waarbij voor detectie het niet nodig is niet-gecomplexeerd gelabeld peptide (of peptidomimeticum) te scheiden van gecomplexeerd gelabeld peptide. In plaats van het gelabelde peptide met aminozuurvolgorde (AHWSGHCCL) kan 10 vanzelfsprekend ook een met dat peptide gevonden verbinding worden gebruikt.

Twee voorbeelden van heel geschikte homogene testen zijn gebaseerd op respectievelijk fluorescentie (de)polarisatie of interne energie-overdracht, aangezien daarmee optimaal 15 gebruik kan worden gemaakt van het verschil in grootte van complex en gelabeld peptide respectievelijk de geringe afstand tussen fluorofoor en chromofoor.

Ook heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het nalopen van een serie verbindingen op 20 het vermogen ervan om sensibilisatie van mestcellen te verminderen, waarbij het nalopen geschiedt door een te testen verbinding en een gelabelde vrije lichte keten van immunoglo-buline te incuberen met een mestcel en een verminderde binding van de gelabelde vrije lichte keten van immunoglobuline 25 te meten.

Steeds geldt dat het nalopen bij voorkeur geschiedt onder fysiologische omstandigheden, aangezien de verbinding ook onder die omstandigheden zijn werk zal moeten doen bij gebruik als geneesmiddel.

30 Het spreekt voor zich dat de verbinding farma ceutisch kunnen worden toegepast, in het bijzonder als het een farmaceutisch aanvaardbare verbinding is.

Derhalve heeft de onderhavige uitvinding ook betrekking op een toepassing van een verbinding (verkregen) volgens 35 de uitvinding voor de bereiding van een geneesmiddel voor een ziekte met als symptoom i) een concentratie van de vrije lichte keten van immunoglobuline in.serum van ten minste 8 mg/1, in het bijzonder ten minste 15 mg/1 en meer in het bijzonder 20 mg/1; en/of ii) een concentratie van de vrije lich- 1009601 4 te kappa-keten van immunoglobuline in liquor van ten minste 70 μg/l, in het bijzonder ten minste 100 μg/l en meer in het bijzonder 150 /ig/1; en of iii) een concentratie van de vrije lichte lambda-keten van immunoglobuline in liquor van ten 5 minste 300 Mg/l, in het bijzonder ten minste 400 μg/l en meer in het bijzonder 500 Mg/l.

Belangrijke voorbeelden van dergelijke ziekten zijn astma, allergie, daaronder begrepen contactallergie en beroepsallergie, chronische inflammatoire darmaandoeningen, vi-10 rale infectie en multiple sclerose. Aanvraagster houdt rekening met de mogelijkheid dat ook migraine tot de ziekten behoort .

Volgens een gunstige uitvoeringsvorm wordt een verbinding toegepast welke een peptide of peptidomimeticum is 15 met een massa van minder dan 10 kDal, bij voorkeur minder dan 2 Kdal.

In die gevallen waarin het peptide is afgeleid van een eiwit, en dus niet hoeft te worden gesynthetiseerd, is de massa van minder groot belang. Wel is het peptide bij voor-20 keur niet-immunogeen.

Derhalve heeft de onderhavige uitvinding tevens betrekking op een farmaceutisch preparaat dat een verbinding volgens de uitvinding bevat te zamen met een farmaceutisch aanvaardbare drager of vulstof.

25 Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het diagnostiseren van een ziekte bij een patiënt met een verhoogde concentratie van de vrije lichte keten van immunoglobuline in een lichaamsvloeistof, waarbij een voor de ziekte specifiek lichaamsvreemd antigeen in contact 30 wordt gebracht met de van de patiënt afkomstige lichaamsvloeistof, en vervolgens de aanwezigheid wordt vastgesteld ! van een complex tussen het lichaamsvreemde antigeen en de vrije lichte keten van immunoglobuline.

De lichaamsvloeistof is geschikt urine, serum of 35 plasma. Ook kan worden gedacht aan liquor, longwasvloeistof en sputum. Derhalve wordt in het kader van de onderhavige uitvinding onder lichaamsvloeistof tevens vloeistoffen verstaan bereid op basis van lichaamseigen materiaal. Het vaststellen van de aanwezigheid van een complex kan geschieden op 1009601 5 één van de vele in de stand van de techniek bekende werkwijzen, zoals bijvoorbeeld een sandwich-ELISA waarbij het complex wordt aangetoond met behulp van een tegen de vrije lichte keten gericht gelabeld antilichaam.

5 Een dergelijk gelabeld antilichaam is geschikt ge richt tegen een geconserveerd deel van de vrije lichte keten.

De onderhavige uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden onder verwijzing naar de bijgaande tekening, waarin: 10 Fig. 1 Een grafiek voorstelt van de relatieve fluor escentie als maat voor de hoeveelheid gebonden Ig LC tegen het aantal mestcellen.

Fig. 2A en B Western-blots na SDS-PAGE-elektrofore-se-gelen laten zien.

15 Bereiding 1: Bereiding van Ig LC-bindend peptide LCBP

Peptide Ac-AHWSGHCCL-NH2 werd bereid met een 430A Applied Biosystems Instruments (Foster City, Californië, U.S.A.) met behulp van vaste-fase FastMoc chemie. De bereiding werd uitgevoerd op een Tentagel-S-RAM hars als dragerma-20 teriaal. Ter bescherming van gevoelige zijketens werd gebruik gemaakt van His(Trt), Cys(Trt), Trp(boc), Ser(tBu). Het peptide werd van de hars losgemaakt en de beschermgroepen werden verwijderd door gebruik te maken van een mengsel van triflu-orazijnzuur, ethaandithiol en water (95:2,5:2,5 v/v). Het 25 ruwe peptide werd neergeslagen met ether en gezuiverd met behulp van preparatieve HPLC. De zuiverheid van LCBP werd met behulp van analytische HPLC en massaspectrometrie geverifieerd.

Bereiding 2: Isolatie van lymfocytfactor 30 BALB/c muizen (RIVM, Bilthoven, Nederland) werden huid-gesensibiliseerd met picrylchloride (PCL), dinitrofluor-benzeen of oxazolon zoals eerder beschreven (ref. 1). 4 Dagen na sensibilisatie werden miltcellen (10 x 10* cellen/ml) gedurende 35 24-48 uur in RPMI medium aangevuld met penicilline, strep- tomycine en gentamycine gekweekt. De kweekbovenvloeistof werd geoogst en antigeen-bindende eiwitten werden geïsoleerd onder gebruikmaking van hapteen-affiniteitschromatografie (van hapteen voorzien rundergammaglobuline of BSA geïmmobiliseerd aan 1009601 6

Affigel-10 (Bio Rad Labs., Veenendaal, Nederland) zoals beschreven door Ferguson, T.A. et al. (ref. 5). Na wassen van de kolom met PBS + 0,5 M NaCl, werden de eiwitten van de kolom geëlueerd met 5 ml 5 M guanidine oplossing. Vervolgens 5 werd uitgebreid gedialyseerd tegen PBS. Eiwitten van biologisch actieve monsters, zoals bepaald met een oorzwellings-test (zie later) werden gefractioneerd met behulp van 15 % Tricine SDS-PAGE, geblot op PVDF en.vervolgens onderworpen aan een Edman degradatie voor aminozuurvolgorde-analyse.

10 Om de aanwezigheid van kappa Ig LC aan te tonen wer den de hapteen-bindende eiwitten gefractioneerd met behulp van 12,5 % SDS-PAGE, geblot op PVDF en getest met met horseradish peroxidase gelabeld anti-Ig kappa LC (The Binding Site, Birmingham, V.K.) in een verdunning van 1:2000. Immuno-15 reactieve eiwitten werden zichtbaar gemaakt met ECL (Amersham Pharmacia Biotech Benelux, Roosendaal, Nederland) volgens de aanbevelingen van de fabrikant (fig. 2A). Hieruit blijkt dat in lymfocytfactoren die specifiek zijn voor picrinezuur, di-nitrofluorbenzeen respectievelijk oxazolon, de aanwezigheid 20 van Ig LC met een anti-kappa Ig LC specifiek antilichaam kan worden aangetoond.

Fig. 2B laat zien dat lymfocytfactor een grote verscheidenheid aan antigeen-bindende eiwitten omvat. De laantjes gelabeld A (geëlueerd met 0,2 M Na2C03) en B (door-25 loop van kolom) zijn twee fracties die worden verkregen door affiniteitschromatografie. Van deze fracties vertoonde alleen fractie A de in voorbeeld 3 aangetoonde biologische activiteit. Van het eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 27 Kdal (p27) is de N-eindstandige aminozuurvolgorde bepaald, 30 welke overeenstemde met de uit de literatuur bekende volgorde ! van IgLC.

Voorbeeld 1: Ig LC-binding aan mestcellen

Basofiele leukemiecellen RBL-2H3 (een gift van C. Fewtrell, Ithaca, NY, Verenigde Staten van Amerika) van de 3 5 rat werden geïncubeerd met 200 ng/105 cellen Ig LC dat met fluoresceïneisothiocyanaat was gelabeld. Incubatie geschiedde gedurende 30 minuten bij 4°C in aanwezigheid of afwezigheid van het bij bereiding 1 bereide peptide 250 μg/val LCBP (aan de lichte keten-bindend peptide). Vervolgens werd drie keer 1009601 7 met met fosfaat gebufferde zoutoplossing aangevuld met 1 vol./vol.% foetaal kalfsserum en 0,01 gew./vol.% natriumazide gewassen. Binding van met FITC-gelabeld Ig LC aan RBL-2H3 cellen werd geanalyseerd onder gebruikmaking van een FACScan 5 stromingscytometer.

Uit kromme 1 van fig. 1 blijkt dat de vrije lichte keten van Ig aan mestcellen bindt. Ten tweede blijkt uit kromme 2 en 3 van fig. 1 dat deze binding kan worden geremd door LCBP (0,25 mg/ml respectievelijk 0,50 mg/ml). Kromme 4 10 betreft de autofluorescentie van ongelabelde RBL-2H3 cellen. Voorbeeld 2: Effect van peptide LCBP op de luchtweg response 2.1 Sensibilisatie van muizen

Onder lichte verdoving met halothaan werden muizen passief gesensibiliseerd door injectie van trinitrofenyl 15 (TNP)-specifiek Ig LC (2 μg in 50 μΐ steriele zoutoplossing) in de retro-orbitale plexus. Controle muizen ontvingen alleen 50 μΐ steriele zoutoplossing. Alle muizen kregen onder lichte verdoving met halothaan 30 min. na injectie intranasaal 50 μΐ 0,6 % PSA-oplossing (picrylsulfonzuür opgelost in het fos-20 faatoplossing gebufferde zoutoplossing) toegediend.

2.2 Effect van Ig LC en LCBP

Bij een deel van elk van deze twee groepen muizen werd tegelijk 200 μg LCBP (het bij voorbeeld 1 bereide peptide) intranasaal toegediend.

25 Bronchoconstrictie werd gemeten zoals beschreven door Kraneveld A.D. et al. (ref.3) en Zuany-Amorim et al.

(ref. 6). In het kort, 5 minuten voor intranasale toediening van PSA werden de muizen in een plethysmografische kamer (Buxco Electronics Inc., Shanon, CT) geplaatst teneinde de 30 ademhaling te analyseren en normaalwaarden te verkrijgen. Na de intranasale toediening werden de dieren direct in de kamer teruggezet. De luchtwegweerstand werd gedurende een periode van 25 minuten gemeten. De luchtwegweerstand wordt uitgedrukt in een dimensieloze waarde berekend'met de formule voor de 35 Penh (ref. 4). Voor elke muis werden de maximale Penh-waarden gemeten gedurende een tijdsinterval van l minuut op de in tabel 1 weergegeven tijdstippen.

1009601 8 TABEL 1

tijd PBS/PBS/PSA PBS/Ig LC/PSA LCBP/PBS/PSA LCBP/Ig LC/PSA

(min.)__(Penh)__(Penh)__(Penh)__(Penh)_ 5 _0^__0,62*0,09__0,35*0,03__0,44*0,05__0,43*0,05_ 2.5 __0,60*0,20__1,98*0,16__0,60*0,12__0,87±0,20_ _5__0,62*0,20__2,29*0,51__0,65*0,23__1,12*0,20_ 7.5 __0,70*0,30__S,29*1,00__0,74*0,12__0,87*0,10_ 10__0,60*0,20__6,05*1,90__0,53*0,03__0,87*0,20_ 10 _15__0,70*0,05__3,76*0,70__0,49*0,06__0,85*0,01_ 20_ 0,73*0,20 1,88*0,30__0,49*0,03__0,52±0,05_ 1 Normaalwaarde voor de challenge

Uit dit experiment blijkt dat de door antigeen (PSA) geïndu-15 ceerde bronchoconstrictie (verhoging Penh) geheel kan worden geremd door intranasale toediening van LCBP ten tijde van de passieve sensibilisatie (i.v.) met Ig LC.

Voorbeeld 3:

Effect van passieve sensibilisatie met Ig LC op oor- 20 zwelling.

Muizen werden zoals beschreven bij voorbeeld 2.1 passief gesensibiliseerd door injectie met van een met picrylchloride gesensibiliseerde muis verkregen lymfocyt factor PCL-F of voor trinitrofenyl specifiek Ig LC. Controle 25 muizen ontvingen hetzij alleen PBS, hetzij TNP-specifiek Ig HC (zware keten van immuunglobuline). 30 Minuten na injectie werd picrylchloride (50 μΐ 0,8% picrylchloride (PCL) opgelost in olijfolie) op het oor gesmeerd. Na 2 uur werd de dikte van het oor gemeten._ 30 Behandeling__Oor dik te toename (x 10 ~5 m)_ PCL-F__3,94 ± 0,56_ TNP-specif iek Ig LC__3,77 ±_0,46_ PBS*__0,37 ± 0,40_ TNP-specifiek Ig HC* 0,01 ± 0,32 35----—”—"— -

Controle.

Uit dit experiment blijkt dat TNP-specifiek Ig LC hetzelfde effect heeft als lymfocytfactor. De zware keten vertoont dit j effect niet.

j { 1009601 9

REFERENTIES

1. Askenase, P.W. et al. J. Exp. Med. 157: blz. 862 (1983) .

5 2. Huang, Z.-Q. et al. J. Clin. Invest. J9: blz.

732 (1997).

3. Kraneveld A.D. et al. Immunol Let. £6, blz. 181 (1997).

4. Hamelmann, E., et al., Am. J. Respir. Crit. Care 10 Med. 156, 766-775, (1997).

5. Ferguson, T.A. et al., J. Immunol. 136. 2896- 2903, (1986) .

6. Zuany-Amorim, C. et al. Science 280. blz. 1265-1267 (1998) .

1009601

Claims

1. Verbinding welke de binding van de vrije lichte keten van immunoglobuline (Ig LC) aan mestcellen remt, waarbij de verbinding in aanwezigheid van een equimolaire hoeveelheid vrije lichte keten van immunoglobuline de binding 5 daarvan met ten minste 5% verlaagt.

2. Verbinding volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het kan binden aan de vrije lichte keten van immunoglobuline, waarbij de verbinding in staat is tot competitie met een de vrije lichte keten bindend peptide met aminozuurvolg- 10 orde (AHWSGHCCL) en de verbinding in aanwezigheid van een equimolaire hoeveelheid van het peptide met de binding daarvan met ten minste 5% verlaagt.

3. Verbinding volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de verbinding de binding met ten minste 10, bij 15 voorkeur ten minste 25, met meer voorkeur ten minste 50, met nog meer voorkeur ten minste 75 en met de meeste voorkeur met ten minste 90% verlaagt.

4. Verbinding volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat de verbinding een peptidomimeticum is.

5. Verbinding volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de verbinding een farmaceutisch aanvaardbare verbinding is.

6. Werkwijze voor het nalopen van een serie verbindingen op het vermogen ervan om de vrije lichte keten van 25 immunoglobuline te binden onder gebruikmaking van een gelabelde verbinding waarvan bekend is dat deze i) de vrije lichte keten van immunoglobuline kan binden, en ii) een competitiereactie kan aangaan met het pepti- 30 de met de formule (I) van het formuleblad, waarbij het nalopen geschiedt onder gebruikmaking van een test welke een competitiereactie omvat tussen een te testen verbinding en de gelabelde verbinding om binding aan de lichte keten van immunoglobuline. j 35

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, i dat de test een homogene test is. i 1009601

8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, met het kenmerk, dat de test,is gebaseerd op fluorescentie (de)polarisatie of interne energie-overdracht.

9. Werkwijze voor het nalopen van een serie verbin- 5 dingen op het vermogen ervan om sensibilisatie van mestcellen te verminderen, waarbij het nalopen geschiedt door een te testen verbinding en een gelabelde vrije lichte keten van immunoglobuline te incuberen met een mestcel en een verminderde binding van de gelabelde vrije lichte keten van immuno- 10 globuline te meten.

10. Toepassing van een verbinding volgens één van de conclusies 1 tot 5 of verkregen met de werkwijze volgens één van de conclusies 6 tot 9 voor de bereiding van een geneesmiddel voor een ziekte met als symptoom i) een concentratie 15 van de vrije lichte keten van immunoglobuline in serum van ten minste 8 mg/1, in het bijzonder ten minste 15 mg/1 en meer in het bijzonder 20 mg/1; en/of ii) een concentratie van de vrije lichte kappa-keten van immunoglobuline in liquor van ten minste 70 μg/l, in het bijzonder ten minste 100 ^g/l en 20 meer in het bijzonder 150 Mg/l; en of iii) een concentratie van de vrije lichte lambda-keten van immunoglobuline in liquor van ten minste 300 μg/l, in het bijzonder ten minste 400 μg/l en meer in het bijzonder 500 μg/l.

11. Toepassing volgens conclusie 10, met het 25 kenmerk, dat een verbinding wordt toegepast welke een peptide of peptidomimeticum is met een massa van minder dan 10 kDal, bij voorkeur minder dan 2 kDal.

12. Toepassing volgens één van de conclusies 10 of 11, met het kenmerk, dat de verbinding wordt toegepast voor 30 de bereiding van een geneesmiddel voor de behandeling van astma, allergie, chronische inflammatoire darmaandoeningen, virale infectie en multiple sclerose.

13. Farmaceutisch preparaat dat een verbinding volgens één van de conclusies 1 tot 5 of verkregen volgens één 35 van de conclusies 6 tot 9 bevat te zamen met een farmaceutisch aanvaardbare drager of vulstof.

14. Werkwijze voor het diagnostiseren van een ziekte bij een patiënt met een verhoogde concentratie van de vrije lichte keten van immunoglobuline in een lichaamsvloeistof, mnaRO 1 waarbij een voor de ziekte specifiek lichaamsvreemd antigeen in contact wordt gebracht met de van de patiënt afkomstige lichaamsvloeistof, en vervolgens de aanwezigheid wordt vastgesteld van een complex tussen het lichaamsvreemde antigeen 5 en de vrije lichte keten van immunoglobuline.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat het complex wordt aangetoond met behulp van een tegen de vrije lichte keten gericht gelabeld antilichaam. i 1009601