MXPA04006150A - Uso de un receptor de pelicula endotelial. - Google Patents
Uso de un receptor de pelicula endotelial.Info
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Abstract
El asunto materia de la presente invencion se refiere a usos de un receptor al que nos referimos como GRP78 y a otros receptores de celulas endoteliales los cuales enlazan a la region K5 del plasminogeno de mamifero. Mas especificamente, la identificacion de las propiedades funcionales de este receptor y los otros receptores permite el desarrollo y seleccion de agente, los cuales, por ejemplo, imitan la K5 (es decir, mimeticos) y por lo tanto, inhiben la angiogenesis.
Description
USO DE UN RECEPTOR DE CÉLULA ENDOTELIAL
Campo de la Invención La presente invención se refiere a usos de un receptor al que nos referimos como la proteína GRP78 y a otros receptores de las células endoteliales, los cuales se enlazan a la región del kringle 5 del plasminogén de los mamíferos. Más específicamente, la identificación de las propiedades funcionales de este receptor y otros de dichos receptores permite el desarrollo y selección de agentes, los cuales imitan, por ejemplo, el K5 (por ejemplo, miméticos) y por lo tanto, inhiben la angiogénesis. Antecedentes de la Invención La angiogénesis es el proceso del cuerpo por medio del cual se forman nuevos vasos sanguíneos. Este proceso es esencial para las actividades normales del cuerpo, incluyendo, por ejemplo, la reproducción, desarrollo y reparación de lesiones. Bajo condiciones biológicas normales, la angiogénesis es un proceso altamente regulado. Sin embargo, muchas enfermedades son impulsadas por una angiogénesis persistente, y no regulada. Varios inhibidores de angiogénesis están en desarrollo o han sido desarrollados para utilizarlos en el tratamiento de enfermedades angiogénicas (Gasparini et al., J. Clin. Oncol., 13 (3): páginas 765-782 (1985). Dichos inhibidores incluyen, por ejemplo, suramina y K5. (Para una explicación sobre las propiedades del K5, consultar por ejemplo, las publicaciones de Cao et al., en Journal of Biol. Chem. 272: páginas 22924-22928 (1997), Ji et al., en Biochem. and Biophys. Res. Communs. 247: páginas 414-419 (1998) y de Lu et al., en Biochem. and Biophys. Res. Communs. 258: páginas 668-673 (1999)). Por lo tanto, analizando los receptores a los cuales se enlazan los inhibidores angiogénicos, y en particular, la interacción de enlace o la relación misma, se pueden seleccionar inhibidores angiogénicos adicionales, así como diseñar específicamente estos inhibidores. Los inventores actuales han determinado que un receptor al cual se enlaza el K5 es la proteína GRP78. Este chaperón molecular es expresado constitutivamente, y con frecuencia, la expresión es aumentada de manera dramática bajo condiciones de estrés, tales como el tratamiento de privación de glucosa, el tratamiento con yonoforos Ca2 + , el bloqueo de la glucosilación, el estrés oxidativo y la hipoxia (Song et al., Cáncer Research 61: páginas 8322-8330 (2001)). A la GRP78, también nos referimos como la proteína BIP de enlace de inmunoglobulina de cadena pesada, que también juega un papel importante en la protección de las células tumorales contra la toxicidad portada por los linfocitos T citotóxicos, y los efectos tóxicos del factor de necrosis de tumor in vitro (Jamora et al, PNAS 93: páginas 7690-7694 (1996); y ver también el libro de Lee A., "TENDENCIAS en Ciencias Bioquímicas" (TRENDS in Biochemical Sciences) Vol. 26, No. 8, páginas 504-510 (2001)). En vista de las características de la proteína GRP78 como se indicaron anteriormente, el hecho de que el K5 se enlaza a esta proteína es una necesidad esencial para otros agentes similares al K5, los cuales se pueden enlazar al mismo. Dichos agentes pueden ser utilizados para inhibir la angiogénesis, así como para otras funciones del receptor de la GRP78. Todas las Patentes Norteamericanas y las Publicaciones a las que nos referimos en este documento están incorporadas en su totalidad a la presente descripción como referencia. Sumario de la Invención La presente invención comprende un método de identificación de una composición, la cual inhibe la activación de un receptor de la célula endotelial. El método comprende construir un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican el receptor de la célula endotelial, y una secuencia de nucleótidos que codifican una molécula reportadora. La secuencia de nucleótidos que codifica la molécula reportadora está enlazada de manera operable a la secuencia de nucleótidos que codifican el receptor de la célula endotelial, introduciendo el sector dentro de una célula huésped por un tiempo y bajo condiciones adecuadas para la expresión del receptor de la célula endotelial, exponiendo la célula del huésped a una composición, la cual puede inhibir la activación del receptor de la célula endotelial, y un substrato específico para la molécula reportadora, y medir la señal generada por la reacción de la molécula reportadora y el substrato en comparación con la señal producida por una célula huésped de control, una señal más pequeña de la célula huésped dentro de la cual el vector modificado fue introducido, indicando que la composición inhibirá la activación de la célula endotelial. El receptor puede ser, por ejemplo, la proteína GRP78. Un ejemplo de la composición es el K5. Una modalidad adicional de la presente invención comprende un método para identificar una composición la cual inhibe la expresión de un receptor de la célula endotelial que comprende los pasos de agregar un anticuerpo seleccionado del grupo consistente de un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal producido contra el receptor de la célula endotelial a una fase sólida, agregando concentraciones conocidas del receptor de la célula endotelial expuesto a la composición de prueba, a la fase sólida, con el objeto de formar un primer complejo entre el anticuerpo y las concentraciones conocidas del receptor de la célula endotelial, agregando un segundo anticuerpo al primer complejo, seleccionado del grupo consistente de un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal, producido contra el receptor de la célula endotelial por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un segundo complejo entre el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo, poniendo en contacto el segundo complejo con un reactivo indicador, el cual comprende un compuesto generador de señal adherido a un anticuerpo contra el anticuerpo del segundo complejo, por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un tercer complejo y detectar la presencia de un señal que se puede medir, la ausencia de la señal indica que la composición inhibe la expresión del receptor de célula endotelial, y la presencia de una señal indica que la composición no inhibe la expresión del receptor de la célula endotelial. El receptor de la célula endotelial es, por ejemplo, la proteína GRP78. La composición que inhibe la expresión del receptor puede ser, por ejemplo, K5. Una modalidad adicional de la presente invención incluye un método para identificar una composición la cual se enlaza al receptor de GRP78 que comprende los pasos de exponer el receptor a dicha composición por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un complejo y determinar la presencia o ausencia de dicho complejo, indicando la presencia del complejo una composición la cual se enlaza al receptor. La composición puede ser adherida a la molécula indicadora con capacidad para generar una señal detectable. La composición que se enlaza al receptor de GRP78 puede ser, por ejemplo, K5 o un equivalente funcional del mismo. Adicionalmente, la presente invención incluye un método para la prevención o tratamiento de la angiogénesis en un paciente que necesita dicha prevención o tratamiento, el cual comprende el paso de administración de una cantidad de una composición la cual se enlaza a por lo menos un receptor de la célula endotelial suficiente para efectuar la prevención o el tratamiento. El receptor de la célula endotelial puede ser, por ejemplo, la proteína GRP78 y la composición puede ser, por ejemplo, K5. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1, ilustra la inhibición del enlace l125perro-K5 a las células EAHY por medio de un anticuerpo policlonal a la proteína GRP78. La figura 2, ilustra la inhibición del enlace de l125perro-K5 a las células EAHY por varios anticuerpos policlonales. La figura 3, ilustra la inhibición de la actividad rK5 en la migración de las células HMVEC con un receptor a-GRP78. La figura 4, ilustra el porcentaje de inhibición de proliferación cuando las células HUAVEC fueron incubadas con rK5, y varias concentraciones del anticuerpo de GRP78. La figura 5, representa las manchas de avidina-HRP por medio de las proteínas de superficie de la célula biotinilada aisladas mediante purificación por afinidad con agarosa-K5. La figura 6, ilustra el GRP78 en las células EAHY privadas de alimentos, y luego alimentadas en diferentes intervalos. La figura 7, es una determinación de la cantidad de GRP78 presente en las células HMVEC sin alimentación, expuestas al VEGF y teñidas con un anticuerpo GRP78 policlonal de cabra y un anticuerpo HRP anti cabra. La figura 8 ilustra el enlace directo del kringle 5 recombinante (rK5) con el receptor de GRP78. Descripción Detallada de la Invención Como se indicó anteriormente, los inventores actuales han descubierto que el K5 y, en particular, el sitio activo (PRKLYDY) del mismo se enlazan al receptor celular endotelial GRP78. Basados en este descubrimiento, esta proteina puede ser utilizada para muchos propósitos. Por ejemplo, la proteína puede ser utilizada para seleccionar e identificar análogos o miméticos del K5, los cuales se enlazan a la proteína también y por lo tanto, deben de ser equivalentes funcionales del K5. Dichos análogos o miméticos pueden inhibir o suprimir la angiogénesis en un paciente. También se pueden seleccionar los antagonistas o reguladores alostéricos del receptor, reduciendo también de este modo, o evitando la angiogénesis en el paciente. También se pueden seleccionar los agonistas del receptor. (Para propósitos de la presente invención, el término "equivalente funcional" es definido como un compuesto o entidad el cual se comporta de la misma manera en términos de enlace, que la entidad con la cual está siendo comparado). Adicionalmente, también se puede utilizar el receptor para identificar composiciones que inhiben la expresión del receptor.
Además, la proteína puede ser utilizada con el objeto de extender adicionalmente las propiedades de enlace del K5 a un receptor en la superficie de la célula. Una vez que se ha identificado una composición farmacéutica exitosa, ésta puede comprender una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor o regulador y un vehículo fisiológicamente aceptable apropiado (por ejemplo, agua, agua regulada o solución salina). La forma de dosificación (por ejemplo, suspensión, tableta, cápsula, etc.), y la ruta de administración de la composición farmacéutica (por ejemplo, oral, tópica, intravenosa, subcutánea, etc.) puede ser determinada fácilmente por un practicante médico y puede depender de factores, tales como por ejemplo, la edad, el peso, la condición inmunológica y la salud general del paciente. Otra modalidad de la presente invención comprende un método para ensayar muestras de prueba (por ejemplo, fluidos biológicos) para determinar la presencia o ausencia del receptor de GRP78. Por lo tanto, por ejemplo, un paciente que tiene una enfermedad puede ser examinado para determinar la presencia del receptor, basada en los ensayos de enlace aquí descritos. Ahora se describirán de manera detallada los ensayos de selección del fármaco a los que nos referimos anteriormente. Por ejemplo, en un método, se crea un vector que comprende una secuencia de ADN aislada que codifica el receptor de GRP78. Esta secuencia puede ser adherida a, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula reportadora (por ejemplo, una enzima, tal como beta-galactosidasa) o una entidad con capacidad para interactuar con un substrato, emitiendo o generando de este modo una señal que se puede medir. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un cósmido. El vector entonces es introducido en las células huésped por un período de tiempo y condiciones adecuadas para la exposición del receptor. (Las células huésped pueden ser procarióticas o eucarióticas). Las células huésped son expuestas entonces a la composición de prueba que se considera que, por ejemplo, inhibe la activación del receptor. Las células también son expuestas al substrato relevante. Entonces se mide la cantidad de señales emitidas de la reacción del substrato-molécula reportadora. Si la cantidad de señales producidas por la célula huésped expuestas a la exposición en cuestión es inferior que la producida por las células de control (por ejemplo, las células que no han sido expuestas a la composición), entonces la composición ha inhibido la actividad del receptor. Si la cantidad de señal producida por las células tratadas es igual a la cantidad producida por las células de control, la composición no ha inhibido la actividad del receptor. (Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,912,122; la Patente Norteamericana No. 5,912,120 y la Patente Norteamericana No. 5,919,450). Adicionalmente, la presente invención cubre un método de selección-afinidad, que utiliza un receptor purificado en un ensayo de filtración para identificar las composiciones que se enlazan al receptor para prevenir que el receptor se enlace a otros agentes, interactuando con los agentes, etc., evitando de este modo, que el receptor funcione como lo haría normalmente in_ vivo. Brevemente, el receptor purificado es mezclado con varios compuestos de prueba. La mezcla es pasada a través de un filtro el cual solamente permite que pasen a través del mismo, moléculas de cierto peso molecular. Las composiciones que se enlazan al receptor serán retenidas por el filtro. Los compuestos sin enlazar no son retenidos y pueden ser separados de las composiciones enlazadas. Las estructuras de las composiciones que se enlazan al receptor son determinadas, por ejemplo, mediante Espectrometría de Masa. Además, la presente invención comprende también un método de enlace del receptor que utiliza un receptor radiomarcado para enlazarlo a una célula o membranas preparadas de tejidos o células que contienen los receptores de GRP78. De esta manera, se pueden identificar las composiciones que bloquean el enlace del receptor de GRP78 con algunos agentes a los cuales se enlazarían normalmente, evitando de este modo, que el receptor funcione. En particular, la proteína receptora recombinante purificada a partir de células de mamífero es radiomarcada ([125l], [3H], [1 C], etc.). El receptor radiomarcado entonces es incubado con células o membranas preparadas a partir de tejidos o células que contienen los receptores de GRP78 en la presencia o ausencia de la composición de prueba. Las células y membranas radiomarcadas entonces son separadas de las células y membranas que no están radiomarcadas, mediante métodos de separación tales como por ejemplo, filtración y centrifugación. La cantidad de enlace del receptor a las células o membranas es determinada, contando la radioactividad. Una disminución en la radioactividad en la presencia de una composición de prueba, indica que la composición inhibe el enlace del receptor y de este modo, es útil para inhibir la función del receptor. La presente invención también cubre dos métodos, utilizando dos métodos, los cuales identifican composiciones que inhiben la síntesis y expresión del receptor. En el método de emparedado, un anticuerpo monoclonal y/o policlonal de mamíferos (por ejemplo, conejo o ratón) contra la forma madura del receptor, es recubierto sobre una superficie sólida (por ejemplo, una placa de lmmulon-4 (Dynatech Laboratorios Inc., Chantilly, VA)). La superficie será manchada por un agente de manchado conocido, por ejemplo, albúmina de suero bovino, Albúmina Suero Bovino (BSA), y lavada. Las muestras de concentraciones conocidas de receptores de GRP78 purificados son agregadas a las superficies (por ejemplo, placas). Después de que el receptor de enlaza al anticuerpo o anticuerpos, la superficie será lavada y luego incubada con un anticuerpo monoclonal y/o policlonal de mamíferos (por ejemplo, cabra, conejo o ratón), eleborado contra el receptor. El enlace del segundo anticuerpo anti-receptor será detectado mediante el uso de un reactivo indicador, el cual comprende un conjugado del anticuerpo con un compuesto generador de señal, por ejemplo, una enzima. También se agrega un substrato para la enzima, si es utilizada la enzima. Por ejemplo, pueden ser utilizados la peroxidasa de rábano (HRP) y su substrato clorhidrato de O-fenilenodiamina (OPD). En particular, la reacción de enzima-substrato genera una señal o cambio detectable, por ejemplo, un color, el cual puede ser leído, por ejemplo, en un Lector de Microplacas. Los ejemplos de las generaciones de señal de los compuestos generadores de señales diferentes a las enzimas que pueden ser utilizados, incluyen por ejemplo, un compuesto luminiscente, un elemento radioactivo, una marca visual y un compuesto quimioluminiscente. Las concentraciones conocidas del receptor son utilizadas para generar una gráfica estándar. La concentración del receptor en las muestras desconocidas puede ser determinada utilizando la gráfica estándar. Los agentes de prueba que disminuyen la concentración del receptor en los sobrenadantes son potencialmente útiles para la inhibición de la síntesis del receptor en la célula endotelial. En el método competitivo, una cantidad fija del receptor es recubierta sobre una superficie sólida, por ejemplo, una placa lmmunolon-4. La placa será manchada por medio de, por ejemplo, BSA u otro agente de manchado conocido y lavada. Las muestras son agregadas a la placa junto con el anticuerpo monoclonal y/o policlonal de mamífero (por ejemplo, cabra, conejo o ratón) contra el receptor. La placa es lavada y luego incubada con un reactivo indicador que comprende un anticuerpo conjugado con un compuesto de generación de señal, por ejemplo, una enzima (o las entidades descritas anteriormente). Si se utiliza una enzima, también se proporciona un substrato para la enzima. La enzima puede ser, por ejemplo, peroxidasa de rábano (HRP) y el substrato por lo tanto, puede ser clorhidrato de O-fenilenodiamina (OPD)). Nuevamente, la reacción de enzima-substrato genera un cambio o señal detectable, por ejemplo, un color, el cual puede ser leído en, por ejemplo, un lector de microplacas. Se pueden utilizar concentraciones conocidas del receptor purificado para generar una gráfica estándar. La concentración del receptor en las muestras desconocidas puede ser determinada utilizando la gráfica estándar. Los agentes de prueba que disminuyen la concentración del receptor en los sobrenadantes son potencialmente útiles para la inhibición de la síntesis del receptor por las células. Las concentraciones conocidas del receptor o el receptor en la muestra, compiten con la proteína del receptor recubierta sobre la placa en el enlace a los anticuerpos del receptor. Cuando está presente más receptor en la muestra, se genera una señal más pequeña. Si un agente de prueba tiene la capacidad para bloquear el receptor, la cantidad del receptor en esa muestra particular será menor en el control, y la señal en esa muestra será mayor que la del control. Descripción Detallada de la Invención La presente invención puede ser ilustrada mediante el uso de los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLO I
IDENTIFICACIÓN DE UN RECEPTOR K5 DE LA CÉLULA ENDOTELI AL La función normal del receptor de GRP78 es acompañar y ayudar a las proteínas a duplicarse en el retículo endoplásmico. Bajo condiciones de esfuerzo, las proteínas sin duplicarse o duplicadas de manera incorrecta son acompañadas por el receptor de GRP78 para los proteosomas para la degradación. Bajo condiciones de esfuerzo hipóxico, el receptor de GRP78 y un pariente cercano al receptor de GRP96, el HSP90, se encuentran en las superficies de la célula. Los reportes publicados de métodos de sobre-expresión, antisentido y ribozimas en los sistemas de cultivo de tejidos, sugieren que el receptor de GRP78 puede proteger a las células contra la muerte celular. En una variedad de líneas de células cancerosas, tumores sólidos y biopsias humanas, el nivel del receptor de GRP78 es elevado, correlacionándolo con la enfermedad. Además, se ha mostrado la inducción del receptor de GRP78 para proteger las células cancerosas de la vigilancia inmunológica y la apoptosis, mientras que suprime la inducción portada por el esfuerzo de la apoptosis mejorada del receptor de GRP78, inhibiendo la proliferación del tumor y aumentando la citotoxicidad de las células hipóxicas crónicas. Para determinar si el GRP78 es un receptor de la superficie de la célula para el 5, se utilizó un anticuerpo policlonal de cabra para el receptor de GRP78 para competir con el enlace del K5 a las células del EAHY. Se permitió que las células EAHY (20,000 por depósito) se adhirieran a 96 placas de depósito; las células luego fueron incubadas con a-GRP78 e l12 perro-K5 por 1 hora a una temperatura de 4°C. El medio fue removido y las células lavadas 5X con PBS frío. Las células fueron lisadas y enlazadas al l125perro-K5 contado. Los ensayos operaron con ocho duplicados de cada uno . El anticuerpo monoclonal para el receptor de GRP78 inhibió el enlace de 5 Nm l125K5 (perro), de un modo dependiente de la dosis con un IC50 de aproximadamente 6 Nm (figura 1). Como comparación, se permitió que las células EAHY (20,000 por depósito) se adhirieran a placas de 96 depósitos. Luego las células fueron incubadas con varios anticuerpos y el anticuerpo l125perro-K5 durante 1 hora a una temperatura de 4°C. El medio fue removido y las células fueron lavadas 5X con PBS frío. Las células fueron lisadas y enlazadas al l125perro-K5 contado. Los ensayos operaron con ocho duplicados cada uno. Un anticuerpo monoclonal creado contra el K5 también inhibió el enlace del l 25K5 (perro) a las células EAHY con un IC50 de alrededor de 15 a 20 Nm, y el panel de varios anticuerpos policlonales de cabra inhibieron de manera débil el enlace de K5 a las células EAHY (figura 3). EJEMPLO II
INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD RECOMBI N ANTE DEL K5 EN LA MIGRACIÓN DE LAS CÉLULAS HMVEC CON a-GRP78 Debido a que el anticuerpo para el receptor de GRP78 podría inhibir el enlace del K5 a las células endoteliales, éste debería inhibir la actividad del K5 en la migración y proliferación de células endoteliales. En particular, las células MVEC fueron marcadas con Casein-AM. Las células fueron cargadas a la cámara superior de una placa de migración de 96 depósitos. Los depósitos inferiores fueron previamente cargados con medio con un contenido de VEGF (10 ng/ml), rK5 (100 nM) y varias concentraciones de a-GRP78. Las placas fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante 4 horas. Las membranas fueron removidas y el asiento fue contado con un fluorómetro para la migración celular. Los ensayos se corrieron por triplicado. Los datos obtenidos se muestran en la figura 3. Adicionalmente, las células HUAVEC fueron incubadas con rK5 y varias concentraciones del anticuerpo GRP78. La cantidad de células marcadas con timidina incorporadas fue determinada después de 24 horas y utilizada para calcular el porcentaje de inhibición de la proliferación comparado con las células no tratadas. La línea verde muestra la inhibición de la proliferación de las células con a-GRP78 solo. Como se puede apreciar en la figura 4, la a-GRP78 en concentraciones más altas inhibe la proliferación celular, sin embargo, en concentraciones más bajas (1:10000) esta inhibición no fue observada. En una dilución de 1:10,000 del a-GRP78, la inhibición de la actividad del K5 en la proliferación de las células endoteliales dependió de la dosis. En vista de lo anterior, la migración de las células HMVEC (figura 3) y los ensayos de proliferación de las células HUAEC (figura 4), mostraron que la anti-GRP78 inhibió la actividad del rK5 de una manera dependiente de la dosis. EJEMPLO- MANCHAS DE AVI DI N A-HRP DE PROTEÍNAS DE SUPERFICIE CELULAR BIOTINILADAS AISLADAS POR MEDIO DE
PURIFICACIÓN POR AFINIDAD CON AGARQSA-K5. Con el objeto de determinar si el GRP78 se encuentra en la superficie celular de las células estimuladas, las proteínas de la superficie en las células EAHY fueron marcadas con biotina. Las células luego fueron lisadas y sometidas a la purificación por afinidad que se realizó en las proteínas de enlace S-tag-K5. La avidina-HRP fue utilizada para visualizar las proteínas biotiniladas (superficie celular). Se aislaron dos proteínas principales en pesos moleculares de -75 kDa y -95 kDa que contenían la marca de biotina (figura 5). Estas dos proteínas que se enlazan a la columna S-tag K5 podrían también competir con un exceso de rK5 o el péptido del sitio activo del K5 (PRKLYDY) (Figura 5, línea B y línea C), mientras que el péptido de la terminal-N del K5 no inhibió el enlace de cualquier proteína de enlace a la columna S-tag K5. En particular, las proteínas de la superficie en las células 1X106 EAHY fueron marcadas con NHS-biotina. Las células fueron lavadas tres veces con PBS y Usadas con M-pur. Los lisados celulares fueron mezclados con (A) 100 nM de S-tag-K5 (B) 100 nM de S-tag-K5 más 1 µ PRKLYDY, (C) 100 nM de S-tag-K5 más 10 µ? de rK5 frío (D) 100 nM de S-tag-K5 y el péptido K5 de la terminal-N en 1 µ? durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas de enlace K5 fueron precipitadas con agarosa proteína-S. Las proteínas enlazadas fueron eluidas con 50 mM de regulador de glicina en un pH de 3.0 y operadas para el análisis PAGE. Las proteínas de superficie (biotiniladas) que se enlazan al K5 fueron visualizadas con avidina-HPR, y un substrato quimioluminiscente. Estos resultados sugieren de manera importante que la proteína GRP78 se encuentra en la superficie de las células endoteliales estimuladas y que el K5 se enlaza a la proteína GRP78. EJEMPLO IV
VISUALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA GRP78 CON UN SUBSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE Como el enlace de rK5 a las células endoteliales estimuladas está activado por aproximadamente 4 a 10 dobleces comparado con las células sin alimentar, el nivel del receptor de GRP78 en las células endoteliales, también puede ser sobre-estimulado. En la figura 7, los niveles de proteína GRP78 fueron analizados después de que las células estuvieron sin alimento durante la noche y luego alimentadas con el medio completo con un contenido de 100 ng/mp de VEGF. En los tiempos indicados después de la alimentación (ver figura 7), los Usados celulares totales fueron operados en PAGE, y teñidos con un anticuerpo policlonal GRP-78-HRP. La proteína GRP78 fue visualizada con un substrato quimioluminiscente. Dentro de las 4 horas, los niveles de proteína celular GRP78 aumentaron dramáticamente después del estíimulo con VEGF. Esto también es observado en las superficies de la célula endotelial mediante la comparación del enlace anti-GRP78 en las células sin alimentar, así como en las células estimuladas por VEGF (figura 7). Las células HMVEC cultivadas en charolas de vidrio, se dejaron sin alimentar durante 26 horas y luego el medio fue reemplazado varias veces con un medio completo con un contenido de 100 ng/ml de VEGF. Las células fueron lavadas, fijadas y teñidas para la proteína GRP78 con un anticuerpo GRP78 policlonal de cabra, y el anticuerpo HPR anticabra. La determinación de la cantidad de proteína GRP78 presente fue determinada mediante la precipitación de un substrato de MTB para producir un color café oscuro. EJEMPLO V
ENLACE DIRECTO DEL KRINGLE 5 RECOMBINANTE CON LA PROTEÍNA GRP78 Se utilizó ultracentrifugación con 50,000 MW de filtros de corte con K5 de perro recombinante yodinada (l 25rK5 (perro)) y GRP78 (cerebro bovino). La proteína GRP78 y el l 25rK5 (perro) fueron incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego la solución fue transferida a ultracentrífugas e hilada en 10,000 Xg durante 2 minutos. La cámara superior contenía GRP78 (mw 78,000) e l125rK5 (perro) que se enlazaron. Las soluciones superior e inferior fueron contadas para determinar el 1125. Columna A: 1 nM l 25rK5 (perro). Columna B: 1nM l125rK5 (perro) + 1.5 nM GRP78. Columna C: 1 Nm i125rK5 (perro) + 1.5 nM GRIP78 + 100 nM péptido K5 terminal-N, LLPDVETPSEED. Columna D: 1 Nm i125rK5 (perro) + 1.5 nM GRP78 + 100 nM péptido K5 del sitio activo PRKLYDY. Columna E: 1 nM l 25rK5 (perro) + 1.5 nM GRP78 + 1 nM rK5 (no marcado). La proteína GRP78 enlazada al rK5 marcado ocasiona su retención en la parte superior del filtro. Este enlace puede ser inhibido por la rK5 o el péptido del sitio activo K5 pero no en el péptido K5 del terminal-N inactivo.
Claims (12)
- REIVINDICACIONES 1.- Un método de identificación de una composición la cual inhibe la activación de un receptor de célula endotelial que comprende los pasos de: a) construir un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el receptor de célula endotelial y una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula reportadora, codificando la secuencia de nucleótidos a la molécula reportadora que está siendo enlazada de manera operable a la secuencia de nucleótidos que codifican el receptor de la célula endotelial; b) la introducción del vector dentro de una célula huésped por un período y bajo condiciones adecuadas para la expresión del receptor de célula endotelial; c) la exposición de la célula huésped a una composición la cual puede inhibir la activación del receptor de la célula endotelial y un substrato específico para la molécula reportadora; y d) medir una señal generada por la reacción de la molécula reportadora y el substrato en comparación con la señal producida por la célula huésped de control, indicando una señal menor de dicha célula huésped que la composición inhibirá la activación del receptor de la célula endotelial.
- 2 - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor de la célula endotelial es GRP78.
- 3.- El método tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la composición es kringle 5 (K5).
- 4.- Un método para la identificación de una composición que inhibe la expresión del receptor de la célula endotelial, el cual comprende los pasos de: a) agregar un anticuerpo seleccionado del grupo consistente de un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal producido contra el receptor de la célula endotelial a una fase sólida; b) agregar concentraciones conocidas del receptor de célula endotelial, expuesto a la composición, a la fase sólida, con el objeto de formar un primer complejo entre el anticuerpo y las concentraciones conocidas del receptor de célula endotelial; c) agregar un segundo anticuerpo al primer complejo, seleccionado del grupo consistente de un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal producido contra el receptor de célula endotelial por un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de un segundo complejo entre el primer complejo y el segundo complejo; d) poner en contacto el segundo complejo con un reactivo indicador el cual comprende un compuesto generador de señal enlazado a un anticuerpo contra el anticuerpo del segundo complejo, por un período de tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación del tercer complejo; y e) detectar la presencia de una señal que se puede medir indicando la ausencia de la señal, que la composición inhibe la expresión del receptor de célula endotelial y la presencia de la señal indica que la composición no inhibe la expresión del receptor de célula endotelial.
- 5. - El método tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque el receptor de la célula endotelial es GRP78.
- 6. - El método tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque la composición que inhibe la expresión del receptor de la célula endotelial es K5.
- 7. - Un método para identificar una composición la cual se enlaza al receptor de GRP78 el cual comprende los pasos de: a) exponer al receptor a la composición por un período de tiempo y condiciones suficientes para la formación de un complejo; y b) determinar la presencia o ausencia del complejo, indicando la presencia del complejo una composición que se enlaza a dicho receptor.
- 8. - El método tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el compuesto es enlazado a una molécula indicadora con capacidad para generar una señal detectable.
- 9. - El método tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el compuesto que se enlaza al receptor de GRP78 es K7 o un equivalente funcional del mismo. 10. - Un método para la prevención o tratamiento de la angiogénesis en un paciente que necesita dicha prevención o tratamiento, el cual comprende el paso de administración al paciente de una cantidad de una composición la cual se enlaza a por lo menos un receptor de célula endotelial suficiente para efectuar dicha prevención o tratamiento. 11.- El método tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque el receptor de la célula endotelial es GRP78. 12.- El método tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque la composición es K5. R E S U M E N El asunto materia de la presente invención se refiere a usos de un receptor al que nos referimos como GRP78 y a otros receptores de células endoteliales los cuales se enlazan a la región K5 del plasminógeno de mamífero. Más específicamente, la identificación de las propiedades funcionales de este receptor y los otros receptores permite el desarrollo y selección de agente, los cuales, por ejemplo, imitan la K5 (es decir, miméticos) y por lo tanto, inhiben la angiogénesis.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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