CN104491843B - 一种聚乙二醇修饰的rhG‑CSF活性药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚乙二醇修饰的rhG‑CSF活性药物组合物。本发明的聚乙二醇修饰的rhG‑CSF活性组合物药物包括以下组分：组分Ⅰ：N‑末端mono‑mPEG‑rhG‑CSF，95.0%≤纯度＜98.0%；组分Ⅱ：rhG‑CSF、非N‑末端mono‑mPEG‑rhG‑CSF、di‑mPEG‑rhG‑CSF、tri‑mPEG‑rhG‑CSF中的一种或者几种，0%≤含量≤5.0%，且0%≤rhG‑CSF含量≤3.0%；组分Ⅲ：mPEG，0%≤含量≤5.0%；以及其他组分，包含外源性DNA、宿主菌蛋白等，0%≤含量＜0.5%。本发明提供的聚乙二醇修饰的rhG‑CSF组合物的药物活性，各项指标均符合药用要求，质量稳定，且体外活性、半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证聚乙二醇修饰的rhG‑CSF制剂的临床疗效及用药安全。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质修饰及纯化领域，具体而言就是涉及一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物。
背景技术
粒细胞集落刺激因子G-CSF可用于各种细胞减少症，可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移，并用于治疗由化学疗法引起的粒细胞减少症患者。蛋白质治疗药物重组人粒细胞刺激因子（rhG-CSF）的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，即其体内半衰期较短，用药后很快从体内清除，需要每天应用，从而增加了患者的痛苦。
PEG-rhG-CSF是由rhG-CSF蛋白经PEG（聚乙二醇）修饰所得，其血浆半衰期延长，并且免疫原性降低、生物利用度提高、稳定性增强、安全性更高。
中国专利申请CN1139932A（文献1）公开了一种N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF的制品，在该专利说明书中，未提示纯化后样品单PEG化的rhG-CSF的含量。我们参考该专利公开方法，采用mPEG 20kDa对rhG-CSF进行反应，单PEG化的rhG-CSF的转化率只有70%左右，同时对其产品进行体外活性检测，其生物学活性为3.5×107IU/mg。中国专利申请CN1663962A（文献2）公开了rhG-CSF N末端和非N末端聚乙二醇修饰物及其一步纯化工艺。我们参考该专利公开的方法，采用mPEG 20kDa对rhG-CSF进行反应，经纯化后的产品含98%mPEG-rhG-CSF及2%的rhG-CSF，其生物学活性为4.0×107IU/mg。
根据文献1公开的方法制得的mPEG-rhG-CSF其纯度仅有70%左右，含有杂质较多，同时其生物学活性为3.5×107IU/mg，活性较低。根据文献2制得的N末端mPEG-rhG-CSF其纯度可达到98%以上，但是其生物学活性与文献1制得的产品活性相近，仅为4.0×107IU/mg活性较低。
发明内容
为了提高N-末端mPEG-rhG-CSF的产品纯度及其生物学活性，获得药效更高的产品而提供一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物。
本发明主要是通过对制备得到的mPEG-rhG-CSF产品进行研究，发现产品中主要存在以下组分：
(1)未反应完的原料，如：mPEG，rhG-CSF；
(2)其它取代位置的单（mono）取代mPEG-rhG-CSF；
(3)多取代的mPEG-rhG-CSF，如di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF；
(4)其它组分，如外源性DNA、宿主菌蛋白等。
发明人通过大量研究发现，当产品中N末端mono-mPEG-rhG-CSF 的纯度在[95%，98%）区间，上述(2)~ (3)类组分总和含量在[2%，5%）区间，且(1)类组分中rhG-CSF含量在[0，≤3%]区间，(4)类组分含量在（0，0.5%）区间时，产品质量稳定，保障了其临床用药安全。
因此，本发明提供一种N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，包括以下组分：
组分Ⅰ：N-末端mono-mPEG-rhG-CSF，95.0%≤纯度＜98.0%；
组分Ⅱ：选自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤5.0%，且0≤rhG-CSF含量≤3.0%；
组分Ⅲ：mPEG，0≤含量≤5.0%；
以及其他组分，0≤含量＜0.5%。
上述药物活性组合物中：
优选地，组分I：96.0%≤纯度＜97.0%；组分II：选自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri- mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤3.0%；组分III：0≤mPEG含量≤3.0%；以及其他组分，0≤含量＜0.5%；
更优选地，组分I：97.0%≤纯度＜98.0%；组分II：选自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri- mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤2.0%；组分III：0≤mPEG含量≤2.0%；以及其他组分，0≤含量＜0.5%。
上述任一药物活性组合物中，所述组分II与组分III的总含量≥2%。
上述任一药物活性组合物中，所述mPEG优选为分子量为20kDa的mPEG。
上述任一药物活性组合物中，所述其他组分包含外源性DNA、宿主菌蛋白；优选地，所述外源性DNA含量≤10ng/剂量，所述宿主菌蛋白含量≤0.02%。
rhG-CSF序列中的5个赖氨酸为mPEG的结合位点，因此，上述药物活性组合物中，所述mono-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中，任一位点与PEG结合的mPEG-rhG-CSF；非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF 指的是，除N-末端外，其它任一结合位点形成的mono-mPEG-rhG-CSF；所述di-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意两个位点结合mPEG的mPEG-rhG-CSF；所述tri-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意三个位点结合mPEG的mPEG-rhG-CSF。
本发明中所述组分Ⅰ含量指的是其蛋白含量。
本发明的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物组合物制成的mPEG-rhG-CSF产品，体外活性≥9.0×107IU/mg。
本发明所述聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性组合物，其纯度可达到95%以上，且其生物学活性达到9.0×107IU/mg以上，是现有技术制备产品的生物学活性的两倍以上，因此本发明的药物组合物具有更优的药效。同时，本发明的药物组合物的其他各项指标均符合药用要求，质量稳定，且半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证N-末端mono-mPEG-rhG-CSF制剂的临床疗效及用药安全。
具体实施实例
实施例1 制备mPEG-rhG-CSF粗品
制备rhG-CSF反应溶液，浓度为5.0mg/mL，含有100mMNaH2PO4，20mM NaCNBH3，pH5.0，将其于4℃下充分搅拌后，加入摩尔数为rhG-CSF摩尔数5倍量的20kDamPEG，反应液于4℃下搅拌反应10h。然后将反应液用100mM HCl调至pH4.0，浓缩，得mPEG-rhG-CSF粗品。HPLC检测，检测结果见表3，体外活性测定结果见表4。
实施例2： N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的制备
（1）离子交换色谱法层析：将实施例1所得mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP（直径300mm，高12cm）的离子交换色谱法层析：
①上样：将mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A（10mM醋酸钠-醋酸，0.004%吐温-80，pH4.0±0.5）稀释至100~200μg/mL，以340mL/min±10%流速上样，上样量10mg蛋白/ml填料；
②冲洗：以缓冲液A 400mL/min±10%流速冲洗3个柱体积；
③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B（1M氯化钠，10mM醋酸钠-醋酸，0.004%吐温-80，pH4.0±0.5）以90mL/min±10%的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积（梯度从0%至60%），收集mPEG-rhG-CSF蛋白洗脱峰；
（2）分子筛层析：
①将离子交换层析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱（直径200mm，高60cm）以120mL/min±10%的流速上样，上样体积为柱体积的5%；
②以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集目的蛋白N-末端mono-PEG-rhG-CSF。
将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3，体外活性测定结果见表4。
实施例3： N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的制备
（1）离子交换色谱法层析：将实施例1所得mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP（直径300mm，高12cm）的离子交换色谱法层析：
①上样：将mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A（10mM醋酸钠-醋酸，0.004%吐温-80，pH4.0±0.5）稀释至100~200μg/mL，以340mL/min±10%流速上样，上样量8mg蛋白/ml填料；
②冲洗：以缓冲液A 400mL/min±10%流速冲洗3个柱体积；
③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B（1M氯化钠，10mM醋酸钠-醋酸，0.004%吐温-80，pH4.0±0.5）以90mL/min±10%的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积（梯度从0%至60%），收集mPEG-rhG-CSF蛋白洗脱峰；
（2）分子筛层析：
①将离子交换层析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱（直径200mm，高60cm）以120mL/min±10%的流速上样，上样体积为柱体积的5%；
②以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集目的蛋白N-末端mono-PEG-rhG-CSF。
将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3，体外活性测定结果见表4。
实施例4：N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的制备
（1）离子交换色谱法层析：将实施例1所得mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP（直径300mm，高12cm）的离子交换色谱法层析：
①上样：将mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A（10mM醋酸钠-醋酸，0.004%吐温-80，pH4.0±0.5）稀释至100~200μg/mL，以340mL/min±10%流速上样，上样量6mg蛋白/ml填料；
②冲洗：以缓冲液A 400mL/min±10%流速冲洗3个柱体积；
③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B（1M氯化钠，10mM醋酸钠-醋酸，0.004%吐温-80，pH4.0±0.5）以90mL/min±10%的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积（梯度从0%至60%），收集mPEG-rhG-CSF蛋白洗脱峰；
（2）分子筛层析：
①将离子交换层析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用Superdex 75柱（直径200mm，高60cm）以120mL/min±10%的流速上样，上样体积为柱体积的5%；
②以缓冲液A以120mL/min±10%的流速洗脱，收集目的蛋白N-末端mono-PEG-rhG-CSF。
将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3，体外活性测定结果见表4。
实施例5：mPEG-rhG-CSF的制备
取纯化所得rhG-CSF，稀释至2.0mg/ml，对0.1MNaH2PO4，pH5.0于4℃透析过夜，调节pH至5.0。
① 取分子量为20kD的mPEG，按mPEG：rhG-CSF摩尔比5:1比例加入mPEG，充分搅拌溶解。
② 再取1M NaCNBH3加入反应液，终浓度为20mM。充分搅拌混匀后置4℃反应过夜。
③取修饰后样品，用蒸馏水稀释两倍体积后，再用乙酸调节至pH4.0，离心去沉淀。
④取阳离子层析介质SP Sepharose F.F.，装柱后取平衡缓冲液I（10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0）平衡至基线后上样样品，再用平衡缓冲液II（10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH5.0）平衡至基线。
⑤取洗脱缓冲液I（10mmol/L乙酸-乙酸钠，pH5.6）洗脱下N-末端修饰的mPEG-rhG-CSF目的蛋白峰。
将所得流分进行浓缩至5mg/mL，HPLC检测，检测结果见表3，体外活性测定结果见表4。
实施例6：实施例组分检测方法
1.组分I及组分II中各成分的含量检测方法：高效液相色谱法
色谱条件及测定方法
仪器：WATERS 600型高效液相色谱仪
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
测定方法：以A相（三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸和99ml水加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，按下表进行梯度洗脱。上样量应不低于10µg，在波长280nm处检测。
表1 组分Ⅰ及组分Ⅱ流动相洗脱梯度
2.组分Ⅲ的含量检测方法：
仪器设备：高效液相色谱仪 HPLC，蒸发光散射检测器；
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5mm，4.6×250 mm)
测定方法：先将待测原液的空白进样100μl，再将待测原液稀释至500μg/ml蛋白，进样100μl，以A相（三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸和99ml水加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，按下表进行梯度洗脱。进行PEG峰的面积积分，根据标准曲线计算出PEG含量。
表2 组分Ⅲ流动相洗脱梯度
3.其他组分：
(1)外源性DNA残留量
依据《中华人民共和国药典》2010年版（三部）附录Ⅳ B外源性DNA残留量测定法。
(2)宿主菌蛋白残留量
依据《中华人民共和国药典》2010年版（三部）附录Ⅳ C大肠埃希菌体蛋白残留量测定法。
4.体外活性试验
依据《中华人民共和国药典》2010年版（三部）附录X E 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定。
将用完全培养基培养的NFS-60细胞株，用RPMI 1640培养液洗涤三次，然后重悬于基础培养液配成细胞浓度为2.0×105cell/ml的细胞悬液，置37℃备用。取rhG-CSF国家标准品（5×106IU/支），用基础培养液稀释至250IU/ml。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。取供试品mPEG-rhG-CSF溶液，用基础培养液稀释至约50～300IU/ml。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。然后每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5%CO2条件下培养48小时。在无菌条件下，向每孔加入20μl MTT，于37℃、5%二氧化碳条件下继续培养5小时。然后，每孔加入100μl 裂解液，混匀，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm测定吸光度，记录测定结果。
实验结果处理：
以PEG-rhG-CSF的稀释倍数为横坐标，以测量波长与参比波长的吸光度之差为纵坐标，绘制活性曲线，分别计算各实验样品的半效稀释倍数，再由公式计算出样品活性：
表3：实施例1~5样品检测结果
结论：
现有技术文献1所得mPEG-rhG-CSF粗品（实施例1）N-末端mono-mPEG- rhG-CSF的纯度为70%左右，所含其他组分主要为di-mPEG-rhG-CSF、rhG-CSF和mPEG，其中，di-mPEG-rhG-CSF含量为26%左右，rhG-CSF为4%左右，mPEG含量非常高（未反应的PEG均在其中），这里不再列出；文献2（实施例5）所得N-末端mPEG-rhG-CSF的纯度为98.9%，所含其他组分主要为rhG-CSF、mPEG，其中rhG-CSF含量为0.7%，mPEG的含量为0.4%。现有技术所得mPEG-rhG-CSF产品含有的其他组分，如外源性DNA及宿主，菌蛋白等，其中，外源性DNA≤10ng/剂量，宿主菌蛋白≤0.02%。
本发明所得的mPEG-rhG-CSF药物活性组合物（实施例2、3、4）中组分IN-末端mono-mPEG-rhG-CSF的HPLC纯度均≥95.0%，且＜98.0%；组分II主要包含di-mPEG-rhG-CSF和rhG-CSF，其中，di-mPEG-rhG-CSF含量＜5.0%，rhG-CSF含量＜3.0%，且di-mPEG-rhG-CSF和rhG-CSF总含量＜5.0%；组分III为mPEG，含量＜5.0%；且，组分II、组分以及其他组分，2.0%＜总含量≤5.0%。
优选地，组分Ⅰ，96.0%≤纯度＜97.0%，组分Ⅱ为di-mPEG-rhG-CSF、和/或rhG-CSF，且含量均≤3.0%，组分Ⅲ为mPEG，含量≤3.0%。
更优选地，组分Ⅰ，97.0%≤纯度＜98.0%；组分Ⅱ为di-mPEG20000-rhG-CSF、和/或rhG-CSF，且0＜di-mPEG-rhG-CSF含量≤2.0%，0＜rhG-CSF含量≤2.0%；组分Ⅲ为mPEG，含量≤2.0%。
本发明的mPEG-rhG-CSF活性组合物药物中的其他组分，如外源性DNA及宿主菌蛋白等，它们均为从rhG-CSF原液中的附带组分，其中，外源性DNA≤10ng/剂量，宿主菌蛋白≤0.02%。
表4实施例1~5样品体外活性检测结果
结论：本发明的mPEG-rhG-CSF药物活性组合物体外活性均高于现有技术产品，均＞4.7×107IU/mg，优选为9.0×107~1.5×108IU/mg。
综上所述，本发明提供的mPEG-rhG-CSF活性药物组合物在质量稳定、活性等方面均优于现有技术的mPEG-rhG-CSF产品，将更适于临床用药。
Claims (1)
1.一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物，其特征在于，包括以下组分：
组分Ⅰ：N-末端mono-mPEG-rhG-CSF，纯度=97.8%；
组分Ⅱ：rhG-CSF和di-mPEG-rhG-CSF， di-mPEG-rhG-CSF含量=1.6%， rhG-CSF含量=0.5%；
组分Ⅲ：mPEG，含量=0.1%；
以及其他组分，包含外源性DNA、宿主菌蛋白，外源性DNA含量=10ng/剂量，所述宿主菌蛋白含量=0.02%；
mPEG的分子量为20kDa。
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| GR01 | Patent grant | ||
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Address after: 264100, No. 212, main street, Qinshui Industrial Park, Muping District, Shandong, Yantai Patentee after: Baike (Shandong) biopharmaceutical Co., Ltd. of Shiyao group Address before: 264100, No. 212, main street, Qinshui Industrial Park, Muping District, Shandong, Yantai Patentee before: Stone Pharmaceutical Group Baike (Shandong) Biopharmaceutical Co., Ltd. |
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