JP2003327600A - Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質のＮ末端に水溶性ポリマーを選択
的に結合させ、均一なタンパク質を含む組成物を製造す
る。 【解決手段】 ホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素
化ナトリウムなどの還元剤を使用する還元的アルキル反
応を用いて、タンパク質のＮ末端のα−アミノ酸をポリ
エチレングリコールで選択的に修飾し、モノポリマー／
タンパク質結合体の実質的に均質で、安定なタンパク質
を含む組成物の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はタンパク質修飾の広
範な技術分野に関し、さらに詳しくは、タンパク質また
はその類似体に対する水溶性ポリマーの結合に関する
（「タンパク質」という用語は本明細書で使用する場
合、特に断わらない限り「ポリペプチド」またはペプチ
ドと同じ意味である）。また本発明は、タンパク質また
はその類似体のＮ末端を修飾する新規な方法およびその
結果得られる組成物に関する。別の態様で、本発明は新
規なＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ組成物および関連する製
造法に関する。また本発明は化学的に修飾された共働性
インターフェロン（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎ）に関する。

【０００２】

【従来の技術】治療に用いるタンパク質は大部分が、組
換えＤＮＡ法が広く進歩した結果、適切な形態で充分な
量を現在入手することができる。組換えタンパク質が入
手可能になったので、タンパク質の製造と化学修飾が進
歩している。このような修飾を行う目的の一つはタンパ
ク質の保護である。

【０００３】化学結合によって、タンパク質分解酵素が
タンパク質の骨格自体と物理的に接触するのを有効に遮
断することができその結果分解が防止される。追加の利
点としては、特定の条件下で、治療用タンパク質の安定
性と循環時間を増大しかつ免疫原性を減少させることが
挙げられる。タンパク質の修飾と融合タン パク質を説
明する総説の文献はＦｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻、４〜１０頁、
１９９２年５月（英国、ロンドンＮ２０、オールド、
フラ イアン・バーネット・レーン、マウンビュー・
コート所在、Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ社発行）である。

【０００４】ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）
は、治療用タンパク質産物を製造するのに用いられてい
る化学薬剤部分の一つである［「ＰＥＧ化する（ｐｅｇ
ｙｌａｔｅ）」という動詞は少なくとも一つのＰＥＧ分
子を結合させることを意味する］。例えば、Ａｄａｇｅ
ｎすなわちアデノシンデアミナーゼのＰＥＧ化製剤は重
篤な合併型免疫不全症を治療することが証明されてい
る；ＰＥＧ化スーパーオキシドジスムターゼは頭部外傷
を治療するための臨床試験が行われている；ＰＥＧ化α
−インターフェロンは肝炎を治療するための第１相臨床
試験で試験されている；ＰＥＧ化グルコセレブロシダー
ゼとＰＥＧヘモグロビンは前臨床試験（ｐｒｅｃｌｉｎ
ｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ）中であることが報告されて
いる。ポリエチレングリコールを結合すると、タンパク
質分解を起こさないよう防御することが報告されており
（Ｓａｄａら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７１巻、１３７〜１３９頁、
１９９１年）そして特定のポリエチレングリコール部分
を結合する方法も利用できる（１９７９年１２月１８日
付け発行のＤａｖｉｓらの米国特許第４，１７９，３３
７号「Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｌｙｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ」；および１９７７年１月１１日付け発行
のＲｏｙｅｒの米国特許第 ４，００２，５３１号「Ｍ
ｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｅ
ｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄＰｒｏｄｕｃｔ
Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｔｈｅｒｅｂｙ」参照。総説につい
ては、Ｊ．Ｓ．ＨｏｌｃｅｒｂｅｒｇおよびＪ． Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ編集「Ｅｎｚｙｍｅｓａｓ Ｄｒｕｇｓ」
３６７〜３８３頁、１９８１年のＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ
らの報告参照）。

【０００５】以下のような他の水溶性ポリマーも使用さ
れている。すなわち、エチレングリコール／プロピレン
グリコールのコポリマー、カルボキメチルセルロース、
デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，
６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマ
ー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダムコポ
リマー）などである。

【０００６】ポリエチレングリコールの場合、その分子
をタンパク質に結合するのに各種の方法が用いられてい
る。一般にポリエチレングリコール分子は、タンパク質
に見られる反応性基を通じてタンパク質に結合される。
例えばリシン残基またはＮ末端のアミノ基などのアミノ
基は上記の結合を行うのに便利である。例えばＲｏｙｅ
ｒ（上記米国特許第４，００２，５３１号）は、ポリエ
チレングリコール分子を酵素に結合するのに還元的アル
キル化反応を用いたと述べている。１９９３年４月２８
日付けで発行されたＷｒｉｇｈｔのヨーロッパ特許第０
５３９１６７号「Ｐｅｇ Ｉｍｉｄａｔｅｓ ａｎｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤｅｒｉｖａｔｅｓＴｈｅｒｅｏｆ」
には、遊離アミノ基を有するペプチドと有機化合物は、
ＰＥＧの直接的誘導体（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｄｅｒｉ
ｖａｔｉｖｅ）または類縁の水溶性有機ポリマーで修飾
されることが記載されている。 １９９０年２月２７日
付けで発行されたＳｈａｗの米国特許第４，９０４，５
８４号には、ポリエチレングリコール分子を反応性アミ
ン基を通じて結合するためタンパク質中のリシン残基の
数を改変することが記載されている。

【０００７】化学修飾された治療用タンパク質の具体例
は顆粒球コロニー刺激因子すなわち「Ｇ−ＣＳＦ」であ
る。Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球の迅速な増殖と血流中へ
の放出を誘発するので、感染と戦う治療効果がある。

【０００８】１９９０年１２月１２日付けで公表された
ヨーロッパ特許第０４０１３８４号「Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｌｙ ＭｏｄｉｆｉｅｄＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏ
ｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ」に
は、ポリエチレングリコール分子が結合されるＧ−ＣＳ
Ｆを製造する場合の材料と方法が記載されている。

【０００９】修飾Ｇ−ＣＳＦとその類似体も、１９９２
年３月４日付けで公表されたヨーロッパ特許第０４７３
２６８号「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇａ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＴｏ
Ａ Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ」に
報告されており、その明細書には、ポリエチレングリコ
ールのような水溶性粒子ポリマーに共有結合させた各種
Ｇ−ＣＳＦと誘導体の使用が述べられている。

【００１０】ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
修飾ポリペプチドは１９８９年１０月４日付けで公表さ
れたヨーロッパ特許第０３３５４２３号に報告されてい
る。

【００１１】他の例はＰＥＧ化ＩＬ−６であり、ヨーロ
ッパ特許第０４４２７２４号「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈＩ
Ｌ−６」（同時係属中のアメリカ特許出願第０７／６３
２，０７０号参照）はＩＬ−６に付加されたポリエチレ
ングリコール分子を開示している。

【００１２】１９８５年９月１１日付けで公表されたヨ
ーロッパ特許第 ０１５４３１６号は、リンホカイン
と、ポリエチレングリコールのアルデヒドとの反応を報
告している。

【００１３】ポリマーをタンパク質に結合する多くの方
法は結合基として作用する部分を用いて行われる。しか
しこのような部分は抗原性である。結合基を用いないト
レシルクロリド法（Ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ
ｍｅｔｈｏｄ）を利用できるが、トレシルクロリドを使
用すると有毒な副生物を生成することがあるので、この
方法は治療用製品を製造するのに利用することは難しい
（Ａｈｅｒｎ．、Ｔ．およびＭａｎｎｉｎｇ、Ｍ．Ｃ．
編集「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ ｖｉｖｏ ｐａ
ｔｈｗａｙｓｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔ
ａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」Ｐｌｅｎｕｍ社、米国ニュー
ヨーク１９９１年のＦｒａｎｃｉｓらの報告およびＦｉ
ｓｈｅｒら編集「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ
Ａｑｕｅｏｕｓ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｐｌｅｎｕ
ｍＰｒｅｓｓ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク、１
９８９年の２１１〜２１３頁のＤｅｌｇａｄｏらの論文
「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＰＥＧ ｔｏ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｔｒｅ
ｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｅｌｌ Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」参照）。

【００１４】Ｃｈａｍｏｗら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ Ｃｈｅｍ．、５巻、１３３〜１４０頁、１９９４年
は、還元的アルキル化反応で行う、ＣＤ４免疫アドヘジ
ン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）のモノメトキシポリ
（エチレングリコール）アルデヒドによる修飾を報告し
ている。その著者らは、ＣＤ４−Ｉｇの５０％が、ＰＥ
Ｇ化度を制御できる条件下でＭｅＰＥＧで修飾されたと
報告している（上記文献の１３７頁）。またこれらの著
者は、修飾されたＣＤ４−Ｉｇの（タンパク質ｇｐ１２
０に対する）生体外での結合能はＭｅＰＥＧ化度に相関
する比率で低下すると報告している（上記文献参照）。
およびタンパク質基質（インスリン）のＣ末端カルボキ
シル基に対するリンカー基カルボヒドラジドの選択的結
合を報告するＲｏｓｅら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２巻、１５４〜１５９頁１９９１
年も参照）。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、特定のタンパ
ク質に関する技術の現在の一般的な技術水準では、Ｇ−
ＣＳＦのようなタンパク質のＮ末端に水溶性ポリマーを
選択的に結合させることはできない。むしろ、現在の方
法では、例えばリシン側基のような反応性基（タンパク
質内のどこに位置しているかにかかわらず）またはＮ末
端に非選択的に結合する。そのため不均一な混合物が生
成する。例えば、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子の場合、いく
つかの分子は、他の分子と異なる数のポリエチレングリ
コール部分を有している。例えば、５個のリシン残基を
有するタンパク質分子が上記の方法で反応させると、あ
る分子は６個のポリエチレングリコール部分を有し、ま
たある分子は５個、またある分子は４個、またある分子
は３個、またある分子は２個、またある分子は１個のＰ
ＥＧ部分を有し、またある分子はＰＥＧ部分をもってい
ない。そして、いくつかのポリエチレングリコール部分
を有する分子において、そのポリエチレングリコール部
分は、異なる分子と同じ位置に結合していないこともあ
る。

【００１６】このことは、治療用のＰＥＧ化タンパク質
製品を開発する場合不利である。このような開発を行う
場合、生物活性を予知できることが重要である。例え
ば、スーパーオキシドジスムターゼとポリエチレングリ
コールの非選択的結合の場合、得られる修飾酵素のいく
つかの画分は全く不活性であったと報告されている
（Ｐ．ＭｃＧｏｆｆら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．、３６巻、３０７９〜３０９１頁、１９８８年）。
治療用のタンパク質がロット毎に組成が異なる場合、上
記の予知を得ることができない。ポリエチレングリコー
ル部分のいくつかは、ある位置では他の位置の場合と同
様に安定に結合できないので、このようなＰＥＧ部分は
タンパク質から解離することになる。勿論、このような
ＰＥＧ部分がランダムに結合し、したがってランダムに
解離する場合、治療用タンパク質の薬物動態を正確に予
知することはできない。消費者からみれば、その循環時
間はロット毎に変動するので投与量が不正確になる。メ
ーカーから見ると、治療用タンパク質を販売するための
法律上の承認を得るのに複雑さが加わる。その上に、上
記の方法は、（タンパク質とポリマーの間に）結合部分
なしでは選択的Ｎ末端化学修飾を行えない。結合部分を
用いると、抗原性があるかもしれないので不利である。

【００１７】したがって、選択的にＮ末端が化学修飾さ
れたタンパク質とその類似体が得られる方法が要望され
ている。そのタンパク質としてはＧ−ＣＳＦや共働性イ
ンターフェロンなどがあるがこれら２種の化学修飾され
たタンパク質を以下に例示する。本発明はこの要望をい
くつかの態様で検討するものである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｎ末端化学修
飾タンパク質の実質的に均質な製剤とその製造方法に関
する。予想外のことであったが、Ｇ−ＣＳＦのＮ末端を
化学修飾すると、この分子の別の位置に一つの化学修飾
がなされている他のＧ−ＣＳＦ種にはみられない、安定
性の利点を示した。またも予想外であったが、Ｎ末端を
化学修飾されたＧ−ＣＳＦを製造する本発明の方法で、
還元的アルキル化反応を用いて、Ｎ末端を選択的に修飾
する条件を提供することができ、かつこの方法はＧ−Ｃ
ＳＦのみならず他のタンパク質（またはその類似体）に
広く適用できることが見出されたのである。また驚くべ
きことであるが、還元的アルキル化反応を用いると、最
終生成物（水溶性ポリマーとのアミン結合を有するタン
パク質）が、アミド結合を有する同じポリマー／タンパ
ク質結合体よりはるかに安定であることが見出された。
このように修飾された他の一つのタンパク質（下記実施
例で説明する）は共働性インターフェロンである。した
がって、一層詳細に以下に説明するように、本発明に
は、特定のタンパク質の特定の修飾のみならずタンパク
質（またはその類似体）の化学修飾に関するいくつかの
態様がある。

【００１９】一つの態様で、本発明は、Ｎ末端を化学修
飾されたＧ−ＣＳＦ（またはその類似体）の実質的に均
質な製剤および関連する方法に関する。下記の一実施例
は、Ｎ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが他のタイプのモノ
ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦより安定であることを例証してい
る。さらに、Ｇ−ＣＳＦ分子のＮ末端はポリエチレング
リコールとの反応で利用し易いので、高比率のＮ末端が
ＰＥＧ化されるためこの分子種には加工面での利点があ
る。

【００２０】また本発明は、タンパク質またはその類似
体のＮ末端残基のα−アミノ基を選択的に活性化して、
そのＮ末端に水溶性ポリマー部分を選択的に結合させる
一つのタイプの還元的アルキル化反応に関する。この方
法によって、（ポリエチレングリコールが使用される場
合）タンパク質部分に直接結合されたポリエチレングリ
コール部分を有するＰＥＧ化タンパク質分子の製剤のみ
ならず、ポリマー／タンパク質結合分子の実質的に均質
な製剤が提供される。Ｇ−ＣＳＦと共働性インターフェ
ロンの場合についてこの方法を以下に説明するが、これ
らは本発明の追加の態様を提供する。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明はＮ末端化学修飾蛋白の実
質的に均質な調製物およびその製造方法に関する。

【００２２】１つの態様において、本発明はＮ末端化学
修飾Ｇ−ＣＳＦ組成物およびその製造方法に関する。

【００２３】本発明の方法（Ｎ末端修飾Ｇ−ＣＳＦの製
造方法および本発明の還元的アルキル化方法の両方）
は、モノポリマー／蛋白質結合体の実質的に均質な混合
物を与えるものである。本明細書で使用する「実質的に
均質な」という表現は、観察されるポリマー／蛋白質結
合体分子のみが１つのポリマー部分を有するものである
ことを指す。調製物は未反応の（即ちポリマー部分を欠
く）蛋白を含有してよい。ペプチド地図作成およびＮ末
端配列決定により確認されるとおり、後述する１つの実
施例は少なくとも９０％のモノポリマー／蛋白質結合体
および最大１０％の未反応蛋白質であるような調製物を
与えるものである。好ましくは、Ｎ末端モノＰＥＧ化物
質は、調製物の少なくとも９５％であり（後述する実施
例に示す）、そして最も好ましくは、Ｎ末端モノＰＥＧ
化物質は調製物の９９％以上である。モノポリマー／蛋
白質結合体は生物学的活性を有する。ここに提供される
本発明の「実質的に均質な」Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ
調製物は、例えばロット毎の薬物動態を推測することが
臨床適用上容易であること等のような、均質な調製物の
利点を示すのに十分均質であるものである。

【００２４】ポリマー／蛋白質結合体分子の混合物を調
製することを選択してもよく、本発明により提供される
利点は、混合物中に含有されるモノポリマー／蛋白質結
合体の比率を選択してよい点である。即ち、所望によ
り、種々の数の連結ポリマー部分（即ち、ジ−、トリ
−、テトラ−等）を有する種々の蛋白の混合物を調製
し、本発明の方法で調製したモノポリマー／蛋白質結合
体物質と組合わせ、そして、所定の比率のモノポリマー
／蛋白質結合体を得てよい。

【００２５】前記した通り造血疾患の治療に用いる治療
用蛋白であるＧ−ＣＳＦを用いる実施例を以下に記載す
る。一般的に、本発明の実施に用いるＧ−ＣＳＦは哺乳
類動物から単離された形態であるか、または、化学合成
方法の生成物であるか、または、ゲノムまたはｃＤＮＡ
クローニングまたはＤＮＡ合成により得られる外来性Ｄ
ＮＡ配列の原核生物または真核生物の宿主発現による産
物であってよい。適当な原核生物宿主には、種々の細菌
（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が包含され；適当な真核生物宿
主には酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および
哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、
サル細胞）が包含される。使用する宿主に応じて、Ｇ−
ＣＳＦ発現産物は、哺乳類またはその他の真核生物炭水
化物によりグルコシル化されていてもよいし、または非
グリコシル化形態であってもよい。Ｇ−ＣＳＦ発現産物
はまた（−１位に）初期メチオニンアミノ酸残基を有し
てよい。とりわけＥ．ｃｏｌｉ由来の組み換えＧ−ＣＳ
Ｆが特に商業的な現実性が最も大きいという理由から好
ましいものの、本発明は上記した形態のＧ−ＣＳＦのい
ずれかおよび全ての使用を意図したものである。

【００２６】特定のＧ−ＣＳＦ類似体は、生物学的機能
性を有することが報告されており、これらはまた、例え
ば、１つ以上のポリエチレングリコール分子を付加する
ことにより、化学修飾してよい。Ｇ−ＣＳＦ類似体は米
国特許第４，８１０，６４３号に報告されている。生物
学的活性を有することが報告されているその他のＧ−Ｃ
ＳＦ類似体の具体例は、開示された各類似体の活性に関
する記載はないが、例えばＡＵ−Ａ−７６３８０／９１
号、ＥＰ ０ ４５９ ６３０号、ＥＰ ０２７２ ７
０３号、ＥＰ ０ ４７３ ２６８号およびＥＰ ０
３３５ ４２３号に記載されている。またＡＵ−Ａ−１
０９４８／９２、ＰＣＴ ＵＳ９４／００９１３号およ
びＥＰ ０ ２４３ １５３号も参照されたい。

【００２７】一般的に、本発明で有用なＧ−ＣＳＦおよ
びその類似体は、Ｎ末端αアミノ基を選択的に化学修飾
するための本明細書に記載した化学修飾方法を実施し、
得られた生成物が所望の生物学的特性を有するかどうか
を、本明細書に記載した生物活性検定法などにより調べ
ることにより確認してよい。当然ながら、非ヒト哺乳類
を治療する際に所望により、組み換えネズミ、ウシ、イ
ヌＧ−ＣＳＦ等のような組み換え非ヒトＧ−ＣＳＦを用
いてよい。例えばＰＣＴ ＷＯ ９１０５７９８号およ
びＰＣＴ ＷＯ ８９１０９３２号を参照されたい。

【００２８】即ち、本発明の別の態様は、Ｎ末端化学修
飾Ｇ−ＣＳＦ類似体組成物を包含する。前記したとお
り、Ｇ−ＣＳＦ類似体には、アミノ酸の付加、欠失およ
び／または置換を有するようなものが包含される（後記
する実施例１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と比較され
る）。Ｎ末端ＰＥＧ化された場合に好中球の生産を選択
的に刺激するような機能を有すると予測されるようなＧ
−ＣＳＦ類似体は、Ｇ−ＣＳＦ受容体への結合のために
必要ではないＮ末端を有するものである。Ｈｉｌｌ等、
ＰＮＡＳ− ＵＳＡ ９０：５１６７−５１７１（１９
９３）およびＰＣＴＵＳ ９４／００９１３参照。

【００２９】使用するポリマー分子は水溶性ポリマーか
ら選択してよい。（本明細書に記載する還元的アルキル
化のためには、ポリマーは単一の反応性アルデヒドを有
さなければならない。）選択されたポリマーは、それに
結合する蛋白が生理学的環境のような水性の環境で沈殿
しないように、水溶性でなければならない。還元的アル
キル化のためには、本発明の方法に関して記載したとお
り重合度を制御できるように、選択されたポリマーは単
一の反応性アルデヒドを有さなければならない。ポリマ
ーは分枝鎖または非分枝鎖であってよい。好ましくは、
最終製品調製物の治療上の使用のためには、ポリマーは
薬学的に許容されるものである。当業者は、ポリマー／
蛋白質結合体を治療に用いるのかどうかという判断、そ
して、そうであれば、所望の用量、循環時間、蛋白分解
に対する耐性およびその他の判断に基づき、所望の重合
体を選択できる。Ｇ−ＣＳＦについては、これらは本明
細書に記載した検定方法を用いて確認してよく、そし
て、当業者は、その他の治療用蛋白のための適切な検定
方法を選択しなければならない。水溶性ポリマーは例え
ば、上記したもの（発明の背景参照）、および、デキス
トランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレ
ングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマ
ー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合
体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルア
ルコールよりなる群からから選択してよい。

【００３０】後述するような最適化のための条件につい
ては、ポリマーはどのような分子量のものでもよく、そ
して、分枝鎖または非分枝鎖であってよい。ポリエチレ
ングリコールについては、好ましい分子量は、約２ｋＤ
ａ〜約１００ｋＤａである（「約」という表現は、ポリ
エチレングリコールの調製においては、記載した分子量
よりも、一部の分子は高分子量、一部は低分子量になる
ことを指す）。後述する実施例１および２は、ＰＥＧ
６０００を使用しているが、これは精製が容易であり適
当なモデル系が得られることから選択したものである。
所望の治療特性（例えば所望の徐放性持続時間、作用、
場合により生物学的活性、取り扱いの容易さ、抗原性の
程度または非抗原性、および、治療用蛋白または類似体
に対するポリエチレングリコールのその他の知られた作
用）に応じて、その他の大きさのものも使用しうる。

【００３１】本発明の１つの特定の態様は、ポリエチレ
ングリコール部分およびＧ−ＣＳＦ部分を有するＮ末端
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦである。本発明の組成物を得る
ためには、種々のポリエチレングリコール分子（分子
量、分枝鎖状態等による）、反応混合物中のＧ−ＣＳＦ
蛋白分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、
実施するＰＥＧ化反応の種類、選択されたＮ末端ＰＥＧ
化Ｇ−ＣＳＦを得るための方法、および使用するＧ−Ｃ
ＳＦの種類を適宜選択してよい。更に、本発明の組成物
および方法は、医薬組成物の製造、治療および薬剤製造
の方法を包含する。

【００３２】蛋白分子に対するポリエチレングリコール
分子の比率は、反応混合物中のその濃度の変化に応じて
変化する。一般的に、最適な比率（未反応の蛋白または
ポリマーが過剰に存在しないという反応の効率の点で）
は選択されたポリエチレングリコールの分子量により決
定される。更に、本発明の１つの実施例では非特異的Ｐ
ＥＧ化およびＮ末端モノＰＥＧ化種の後の精製を行なう
ため、比率は使用できる反応性の基の数により異なる
（典型的にはαまたはεアミノ基）。本明細書に記載し
た１つの実施例では、一般的にモノＰＥＧ化物質を得る
ために蛋白：ＰＥＧ分子のかなり低い反応比を用いてい
る（蛋白分子当たり１．５ＰＥＧ分子）。

【００３３】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを得るために
は、ＰＥＧ化の方法は前記したような種々の方法から選
択してよく、または、後述する実施例２に記載するとお
り本発明の還元的アルキル化を用いてよい。ポリエチレ
ングリコール部分と蛋白部分との間に連結基を用いない
方法は、Ｆｒａｎｃｉｓ等の蛋白性薬剤の安定性：分解
のｉｎ ｖｉｖｏ経路および蛋白安定化方法（Ｓｔａｂ
ｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｐａｔｈｗａｙｓ
ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒａｔ
ｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉ
ｚａｔｉｏｎ）、（Ｅｄｓ。Ａｈｅｒｎ．、Ｔ ａｎｄ
Ｍａｎｎｎｉｎｇ、 Ｍ．Ｃ）Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９１）に記載されている。あるいは、
Ｄｅｌｇａｄｏ等の「トレシルクロライドを用いた活性
化による蛋白へのＰＥＧのカップリング、免疫親和性細
胞調製への応用（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＰＥＧ ｔ
ｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢｙＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｗｉ
ｔｈ Ｔｒｅｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓＩｎ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃ
ｅｌｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」、Ｆｉｓｈｅｒ等
編、水層系を用いた分離、細胞生物学およびバイオテク
ノロジーにおける応用、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、
Ｎ．Ｙ．Ｎ．Ｙ．、１９８９、ｐｐ．２１１−２１３は
トレシルクロライドを使用しており、このためポリエチ
レングリコール部分と蛋白部分との間には連結基が存在
しない。この方法は、トレシルクロライドの使用により
毒性副産物が形成されるため、治療用製品の製造のため
に使用するのは困難である。本発明の実施例の１つでは
カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールのＮ
−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを使用してい
る。後に詳細に記載するとおり、別の実施例では本発明
の還元的アルキル化方法を用いている。

【００３４】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ調製物を得るた
めの方法（即ち必要に応じてこの部分を別のモノＰＥＧ
化部分から分離すること）は、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子
の集団からＮ末端ＰＥＧ化物質を精製することにより行
なうことができる。例えば、下記に示す例ではＰＥＧ化
Ｇ−ＣＳＦをまずイオン交換クロマトグラフィーにより
分離してモノＰＥＧ化物質の電荷特性を有する物質を得
て（同じ見掛け上の電荷を有する別の多ＰＥＧ化物質が
存在する場合がある）、そして次に、モノＰＥＧ化物質
をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離する。この
方法では、Ｎ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが別のモノＰ
ＥＧ化種並びに別の多ＰＥＧ化種から分離される。その
他の方法も報告されている。例えば、１９９０年５月３
日に公開されたＰＣＴ ＷＯ ９０／０４６０６号はＰ
ＥＧ含有水性２相系中でＰＥＧ／蛋白付加物を分配する
ことを包含するＰＥＧ−蛋白付加物の混合物の分画方法
を報告している。

【００３５】別の態様において、本発明は、Ｎ末端化学
修飾蛋白（または類似体）を選択的に得るための方法を
提供する。特定の蛋白における誘導体形成のために使用
できる種々のタイプの第一アミノ基の反応性の差（リジ
ンｖｓＮ末端）を利用した還元的アルキル化による蛋白
修飾方法を以下に記載する。適切な反応条件のもとでカ
ルボニル基含有ポリマーを用いてＮ末端において蛋白の
実質的に選択的な誘導体形成を行なうことができる。反
応は蛋白のリジン残基のεアミノ基とＮ末端残基のαア
ミノ基とのｐＫａの差を利用することができるようなｐ
Ｈで行なう。このような選択的誘導体形成により、水溶
性ポリマーの蛋白質への結合が制御でき、ポリマーとの
結合体形成は蛋白のＮ末端で主に起り、リジン側鎖アミ
ノ基のようなその他の反応性の基の修飾はほとんど起ら
ない。

【００３６】重要かつ意外な点は、本発明はその他の化
学修飾方法を用いる場合に必要とされるような更に進ん
だ精製を行なうことなく、モノポリマー／蛋白結合体分
子の実質的に均質な調製物を製造するための方法を提供
する。また、アミン結合を有する生成物は、意外にも、
アミド結合を用いて調製した生成物よりも安定であり、
これは後に記載する凝集試験で明らかにされる。特に、
ポリエチレングリコールを用いる場合は、本発明はま
た、抗原性を有する可能性のあるような結合基を有さ
ず、そして、蛋白部分に直接カップリングするポリエチ
レングリコール部分を有するＮ末端ＰＥＧ化蛋白を毒性
副生成物を生じることなく、提供する。

【００３７】反応は以下に示すようなダイアグラムで説
明できる（還元剤の例としてシアノホウ水素化ナトリウ
ムを示した）。

【００３８】

【化１】 即ち本発明の１つの態様は、（ａ）アミノ基１つ以上を
有する蛋白部分を、水溶性ポリマー部分と、還元的アル
キル化条件下、上記蛋白部分のアミノ末端でαアミノ基
を選択的に活性化させるのに適するｐＨで反応させるこ
とにより、上記水溶性ポリマーを上記αアミノ基に選択
的に結合すること；および（ｂ）反応生成物を得るこ
と、を包含するポリマー／蛋白結合体の製造方法であ
る。場合により、そして治療用製品のためには好ましく
は反応生成物を未反応部分から分離する。

【００３９】本発明の別の態様は、このような還元的ア
ルキル化により、アミノ末端にαアミノ基を有するいか
なる蛋白にも重合体を選択的に結合することが可能であ
り、そしてモノポリマー／蛋白結合体の実質的に均質な
調製物が得られる点である。「モノポリマー／蛋白結合
体」という用語は、本明細書においては、蛋白部分に結
合した単一のポリマー部分を有する組成物を指す（更
に、本明細書に記載する蛋白類似体を用いた結合体も包
含される）。モノポリマー／蛋白結合体はＮ末端に位置
するポリマー部分を有するが、リジンの場合のようなア
ミノ側鎖基には有さない。調製物は、好ましくは８０％
を超えるモノポリマー／蛋白結合体、更に好ましくは９
５％を超えるモノポリマー／蛋白結合体である。

【００４０】モノポリマー／蛋白結合体分子の実質的に
均質な集団を得るためには、反応条件は、所望の蛋白の
Ｎ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にす
るようなものである。このような反応条件は一般的に、
リジンアミノ基とＮ末端α−アミノ基におけるｐＫａの
差を与える（ｐＫはアミノ基の５０％がプロトン化さ
れ、５０％がされないようなｐＨである）。一般的に、
Ｎ末端のα−アミノ基の修飾を最適なものとするには、
異なる蛋白に対し、異なるｐＨを用いることができる。

【００４１】ｐＨは使用する蛋白に対するポリマーの比
率にも影響を及ぼす。一般的に、ｐＨがｐＫより低い場
合は、蛋白に対してより大過剰のポリマーが必要である
（即ち、Ｎ末端α−アミノ基の反応性が低いほど、最適
な条件を達成するためにはより多くのポリマーが必要に
なる）。ｐＨがｐＫより高い場合は、ポリマー：蛋白の
比はそれほど大きくなる必要は無い（即ち、より多くの
反応性の基が使用できるため、必要なポリマー分子数は
少なくなる）。

【００４２】もう１つの重要な条件はポリマーの分子量
である。一般的に、ポリマーの分子量が高いほど、蛋白
に結合するポリマー分子の数は少なくなる。同様に、こ
れらのパラメーターを最適にする際には、ポリマーの分
枝鎖状態を考慮しなければならない。一般的に、分子量
が高いほど（または分枝鎖が多いほど）、ポリマー：蛋
白の比は大きくなる。

【００４３】本発明の還元的アルキル化のためには、還
元剤は水溶液中で安定であることが必要であり、好まし
くは、還元的アルキル化の最初の工程で形成されるシッ
フ塩基のみを還元することができるものである。好まし
い還元剤は、ナトリウムボロハイドライド、ナトリウム
シアノボロハイドライド、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ
酸トリメチルアミンおよびホウ酸ピリジンよりなる群か
ら選択される。後述する実施例ではナトリウムシアノボ
ロハイドライドを用いた。

【００４４】水溶性ポリマーは上記した種類のものであ
ってよく、そして、蛋白にカップリングするための単一
の反応性アルデヒドを有するものでなければならない。
ポリエチレングリコールについては、Ｇ−ＣＳＦへのカ
ップリングにはＰＥＧ ６０００、コンセンサスインタ
ーフェロンに対してはＰＥＧ １２０００の使用を以下
に記載している。ただし、Ｇ−ＣＳＦの場合は、ＰＥＧ
１２０００、２００００および２５０００も本発明の
方法で良好に使用される。ポリエチレングリコールプロ
ピオンアルデヒド（例えば米国特許第５，２５２，７１
４号参照）は水中の安定性の点で好都合である。

【００４５】前記したとおり、本発明の方法はＮ末端α
−アミノ基を有するいかなる蛋白またはその類似体にも
広範に適用できる。例えば、細菌内で発現された外来性
ＤＮＡ配列の産物であるような蛋白は、細菌による発現
の結果として、α−アミノ基を有するＮ末端メチオニル
残基を有している。前記したとおり、ペプチド、並びに
ペプチド類似物およびその他の修飾蛋白も包含される。
上記したＧ−ＣＳＦ類似体のような蛋白類似体、および
非天然コンセンサスインターフェロンも本発明の方法に
適している。

【００４６】即ち、本発明のＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ
のためには、本明細書に記載したいずれのＧ−ＣＳＦま
たは類似体も使用できる（例えば上記したもの）。後述
する実施例では、１７４アミノ酸および余分にＮ末端メ
チオニル残基を有する細菌生産組み換えＧ−ＣＳＦを用
いる。本明細書に記載するとおり、化学修飾は本明細書
に記載するいずれの水溶性ポリマーを用いて行ってもよ
く、実施例ではポリエチレングリコールの使用を記載し
た。コンセンサスインターフェロンは本発明の実施例で
使用されるもう１つの蛋白である。Ｎ末端モノＰＥＧ化
のための本発明の還元的アルキル化方法を用いた化学修
飾コンセンサスインターフェロンの調製を以下に記載す
る。即ち、本発明の別の態様は、これらの調製に関す
る。本発明においては、「コンセンサスインターフェロ
ン」または「ＩＦＮ−ｃｏｎ」と記載するコンセンサス
ヒト白血球インターフェロンは、非天然のポリペプチド
であり、全ての天然のヒト白血球インターフェロンサブ
タイプ配列に共通のアミノ酸残基を主に含んでおり、全
てのサブタイプに共通なアミノ酸を含まない１つ以上の
位置に、その位置に主に生じるアミノ酸であって且つ、
少なくとも１つの天然のサブタイプの該位置に存在しな
いアミノ酸残基を有することがないアミノ酸を含む、も
のである。ＩＦＮ−ｃｏｎには、ＩＦＮ−ｃｏｎ_１，Ｉ
ＦＮ−ｃｏｎ_２およびＩＦＮ−ｃｏｎ_３という名称のア
ミノ酸配列が包含され、これらは、同一の譲受人の米国
特許第４，６９５，６２３号および４，８９７，４７１
号に開示されており、これら明細書の記載内容全体は参
考のために本明細書に組み込まれる。（米国特許第４，
８９７，４７１号および４，６９５，６２３号は本明細
書で使用していない名称「α」を使用している。）ＩＦ
Ｎ−ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列は、上記した特許に
記載された通り、あるいは、その他の標準的な方法で合
成してよい。ＩＦＮ−ｃｏｎポリペプチドは好ましく
は、細菌宿主、特にＥ．ｃｏｌｉにトランスフォームま
たはトランスフェクトされた合成ＤＮＡ配列の発現産物
である。即ち、ＩＦＮ−ｃｏｎは組み換えＩＦＮ−ｃｏ
ｎである。ＩＦＮ−ｃｏｎは好ましくはＥ．ｃｏｌｉ中
で生産され、当該分野で良く知られ、そして、一般的に
はＩＦＮ−ｃｏｎ_１についてＫｌｅｉｎ等のＪ．Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇ．４５４：２０５−２１５（１９８８）に
記載された方法により精製される。精製されたＩＦＮ−
ｃｏｎはイソフォームの混合物を含有し、例えば精製Ｉ
ＦＮ−ｃｏｎ_１はメチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ_１，脱メチ
オニルＩＦＮ−ｃｏｎ_１およびブロックされたＮ末端を
有する脱メチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ_１の混合物を含有す
る（Ｋｌｅｉｎ等、Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．２７６：５３１−５３７（１９９０））。ある
いは、ＩＦＮ−ｃｏｎは特定の単離されたイソフォーム
を含有する。ＩＦＮ−ｃｏｎのイソフォームは当業者の
知る等電点電気泳動のような方法で相互に分離される。
即ち、本発明のもう１つの態様は、コンセンサスインタ
ーフェロン部分がＩＦＮ−ｃｏｎ_１、ＩＦＮ−ｃｏｎ_２
およびＩＦＮ−ｃｏｎ_３よりなる群から選択される化学
修飾コンセンサスインターフェロンである。化学修飾
は、ＰＥＧのような本明細書に記載する水溶性ポリマー
を用いて行ない、本発明の還元的アルキル化方法を用い
て選択的Ｎ末端化学修飾を行なってよい。本明細書に記
載する実施例３は、ポリエチレングリコール部分（ＰＥ
Ｇ １２０００）にＮ末端で結合されたＩＦＮ ｃｏｎ
_１部分を有する化学修飾ＩＦＮ ｃｏｎ_１を説明するも
のである。

【００４７】もう１つの態様において、本発明の方法
は、ポリエチレングリコール部分が蛋白部分に直接結合
し、別の連結基が存在せず、毒性副生成物が存在しない
ようなＰＥＧ化蛋白を提供する。実施例は本明細書に記
載するとおりＧ−ＣＳＦおよびコンセンサスインターフ
ェロンを含んでいる。ポリエチレングリコール部分がＧ
−ＣＳＦ蛋白部分に直接結合しているようなＰＥＧ化Ｇ
−ＣＳＦ蛋白分子の集団（Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分
子の集団である必要はない）を得るためには、酸性ｐＨ
を用いるか、又は用いることなく、上記還元的アルキル
化を実施してよい。

【００４８】本発明の更に別の態様においては、上記物
質の医薬組成物が提供される。このような医薬組成物は
注射による投与、または経口投与、肺投与、経鼻投与ま
たはその他の投与形態であってよい。一般的に、本発明
が意図するものは、本発明のモノポリマー／蛋白結合体
生成物の有効量を薬学的に許容される希釈剤、保存料、
可溶化剤、乳化剤、補助剤、および／または担体と共に
含有する医薬組成物である。このような組成物は、種々
の緩衝物質成分（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸、リン
酸）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶
化剤（例えばＴｗｅｅｎ ８０、ポリソルベート ８
０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸
ナトリウム）、保存料（例えばチメルソール、ベンジル
アルコール）および増量剤（例えば乳糖、マンニトー
ル）のような添加物；ポリ酢酸、ポリグリコール酸等の
ような重合体化合物の粒状調製物への、または、リポソ
ームへの活性物質の配合を含む。このような組成物は、
本発明のＮ末端化学修飾蛋白の物理的性状、安定性、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ徐放性、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアラン
ス速度に影響する。例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈ
ａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８版
（１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ １８０４２）の１４３５−
１７１２ページに記載されており、その内容は参考のた
めに本明細書に組み込まれる。

【００４９】本発明の更に別の態様において、治療方法
および医薬の製造方法が提供される。本発明のポリマー
／Ｇ−ＣＳＦ結合体（または天然のＧ−ＣＳＦの造血生
物作用を有する類似体）の投与により軽減または調節さ
れる症状は、典型的には、低下した造血または免疫機
能、特に低好中球数により特徴づけられる症状である。
このような症状は、化学療法または放射線療法のような
他の目的のための治療の過程として誘発される。このよ
うな症状は、細菌、ウィルス、カビまたはその他の感染
性疾患のような感染症に起因する場合がある。例えば、
敗血症は細菌感染から生じる。あるいは、このような症
状は、重度の慢性好中球減少症または白血病のように、
遺伝的または環境的に誘発される。成人病分野では患者
は低好中球数または低好中球運動性を有するため、年齢
も重要な因子である。このような症状の一部は、Ｆｉｌ
ｇｒａｓｔｉｍ（ｒ−ｍｅｔ Ｈｕ Ｇ−ＣＳＦ）、Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｍｏｒｓｔｙｎ、
Ｇ．およびＴ．Ｍ．Ｄｅｘｔｅｒ、ｅｄｓ．、Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．
（１９９３）、３５１頁に記載されている。本発明のポ
リマー／Ｇ−ＣＳＦ結合体の投与により軽減または調節
されるようなその他のあまり研究されていない症状に
は、Ｇ−ＣＳＦがプラスミノーゲン活性化物質の産生を
誘発することから、血流中の脂質（またはコレステロー
ル）の低下、および特定の心臓血管症状が包含される。
これらの分野におけるＧ−ＣＳＦ（または類似体）の作
用様式は、現時点では十分解明されていない。ポリエチ
レングリコールのような水溶性ポリマーを付加すること
は、生物活性の持続により治療過程当たりのＧ−ＣＳＦ
注射の回数が少なくできるため、実際の患者に利益をも
たらすものである。

【００５０】一般的に、本発明のポリマー／コンセンサ
スインターフェロンの投与により軽減または調節される
ような症状は、コンセンサスインターフェロンが適用可
能な症状であり、細胞増殖疾患、ウィルス感染、および
多発性硬化症のような自己免疫疾患が包含される。Ｍｃ
Ｍａｕｓ Ｂａｌｍｅｒ、ＤＩＣＰ、Ｔｈｅ Ａｎｎａ
ｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２４：
７６１−７６７（１９９０）（ガン治療における生物応
答調節剤の臨床使用：概説、第Ｉ部、インターフェロ
ン）参照。コンセンサスインターフェロンを用いた細胞
増殖疾患の治療のための方法および組成物は、１９９２
年４月３０日公開のＰＣＴ ＷＯ ９２／０６７０７号
に記載されており、その内容は参考のために本明細書に
組み込まれる。例えば、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）は
本発明のＰＥＧ化コンセンサスインターフェロン分子を
用いて治療可能である。後述する実施例では、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで化学修飾されたコンセンサスインターフェロ
ンは非化学修飾コンセンサスインターフェロンの生物活
性の２０％を有している。

【００５１】上記した分子の全てについて、更に研究を
実施するに従って、種々の患者の種々の症状の治療のた
めの適切な用量に関する情報が得られ、そして、当業者
は、治療内容、投与対象の年齢および全身状態を考慮し
ながら、適切な用量を確認することが可能であろう。一
般的に、注射または注入のためには、用量は０．０１μ
ｇ／ｋｇ体重（化学修飾しない蛋白のみの質量を計算）
〜１００μｇ／ｋｇ（同じ計算に基づく）である。

【００５２】以下に記載する実施例は、上記した種々の
態様を説明するものである。実施例１では、Ｎ末端ＰＥ
Ｇ化Ｇ−ＣＳＦの利点を（Ｇ−ＣＳＦ ｍｅｔ＋１７４
アミノ酸型の）リジン−３５またはリジン−４１でモノ
ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦと比較しながら説明する。実
施例２はＮ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦにおける本発明の還
元的アルキル化を説明するものである。この方法はＮ末
端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの実質的に均質な調製物を与え
る。実施例３はＮ末端ＰＥＧ化コンセンサスインターフ
ェロンの本発明の還元的アルキル化を説明するものであ
る。

【００５３】

【実施例】実施例１ Ａ．組換えヒトｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの調製 組換えヒトｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（本明細書では“ｒｈＧ
−ＣＳＦ”または“ｒ−ｍｅｔ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ”と
呼ぶ）は、上述のようにＳｏｕｚａ特許、米国特許第
４，８１０，６４３号にある方法に従って調製した。こ
の特許は参考として本明細書に組み入れる。使用したｒ
ｈＧ−ＣＳＦは、以下に示す（ＤＮＡ配列によってコー
ドされる）アミノ酸配列をもつＥ．ｃｏｌｉ由来の組換
え発現産物であった（配列番号１および２）：

【００５４】

【化２】 （これはまた対照動物に使用した非Ｐｅｇ化組成物でも
あった。）或いは以下のＰｅｇ化法には、市販のNeupog
en（登録商標）を使用してもよい（このパッケージに入
っているものは、本明細書に参考として組み入れる）。 Ｂ．Ｐｅｇ化Ｇ−ＣＳＦの調製 １０ｍｇ／ｍｌの上記ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ溶液を１００ｍ
Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ ｐＨ８．０に溶かした溶液を、平均
分子量が６０００ダルトンの固体のＳＣＭ−ＭＰＥＧ
（カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールの
Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル）（Ｕｎｉｏｎ
Ｃａｒｂｉｄｅ）に添加した。これによってｒｈ−Ｇ
−ＣＳＦよりもＳＣＭ−ＭＰＥＧが１．５モル過剰にな
った。１時間軽く攪拌した後、滅菌水で混合液を２ｍｇ
／ｍｌに希釈し、希釈したＨＣｌによってｐＨを４．０
に調整した。反応は室温で起こさせた。この段階で反応
混合物は主に３形態のモノＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦか
ら構成されており、その他、ジＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳ
Ｆ、未修飾のｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、および反応の副産物
（Ｎ−ヒドロキシスクシニミド）が含まれていた。 Ｃ．Ｎ末端ＰＥＧ化ｒＨ−Ｇ−ＣＳＦの調製 ３形態のモノＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦは、イオン交換
クロマトグラフィによって別々に分離した。反応混合液
を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）
で平衡化しているＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓセファロース
ＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ５０／３０リザ
ーバ、ベッド容量４４０ｍｌ）に添加した（１ｍｇ蛋白
質／ｍｌ樹脂）。カラムを３カラム容量の緩衝液Ａで洗
浄した。蛋白質は０〜２３％の直線勾配の緩衝液Ｂ（２
０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、１Ｍ ＮａＣｌ）
を１５カラム容量用いて溶出した。次に１カラム容量の
１００％緩衝液Ｂでカラムを洗浄し、３カラム容量の緩
衝液Ａで再度平衡化させた。操作全体の流速は８ｍｌ／
分に維持した。溶離剤を２８０ｎｍでモニターし、５ｍ
ｌの分画を収集した。モノＰＥＧ化した個々の分子種を
含む分画は、図１Ａに従ってプールした。このようにプ
ールした液をＹＭ１０ ７６ｍｍメンブランを使った３
５０ｍＬ Ａｍｉｃｏｎ攪拌セルを使って濃縮した。

【００５５】モノＰＥＧ化分子種からジＰＥＧ化分子種
を分離するため、イオン交換クロマトグラフィで得たプ
ールした分画をサイズ排除クロマトグラフィにかけた。
一般に、５〜１０ｍｇが入った２〜５ｍｌの溶液を、２
０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で平衡化した１２
０ｍｌのＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５
ＨＲ １６／６０カラムに添加した。カラムを １．
５ｍｌ／分で１００分間操作し、２ｍｌの分画を収集し
た。溶離剤の蛋白質含有量を２８０ｎｍでモニターし
た。分離されたピークの分画をプールして分析にかけ
た。以下の表は各ピークの収量比率を比較したものであ
る。

【００５６】

【表１】 このような条件下では、位置１７および２４にあるリジ
ンは多分有意にＰＥＧ化されなかったと思われる。 Ｄ．特性化 各サンプルの特性を知るために５種類の分析を実施し
た：（１）ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（図１Ｂ）、（２）サイズ
排除クロマトグラフィＨＰＬＣ（“ＳＥＣ ＨＰＬ
Ｃ”）（図２）、（３）ペプチドマッピング分析（図３
Ａ、３Ｂ、３Ｃ）、（４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｇ−ＣＳ
Ｆバイオアッセイ（図４）、および（５）ハムスターを
用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験（図５Ａおよび５Ｂ）。

【００５７】Ｎ末端にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦの各
サンプルの組成に関する分析結果は、９５％以上がＮ末
端にＰＥＧ化しており、残りは多分ＰＥＧ化していない
物質だろうということを実証するものである（サンプル
の残りはアッセイの検出限界より低かったが）。３種類
のモノＰＥＧ化物質（Ｎ末端、リジン３５でのＰＥＧ
化、リジン４１でのＰＥＧ化）の各々について、モノＰ
ＥＧ化の割合を調べたところ、Ｎ末端およびリジン４１
は９７％以上がモノＰＥＧ化されており、リジン３５で
のＰＥＧ化物質はこれよりいくらか低かった。これは多
分、アッセイ条件において分子が不安定であることによ
ると思われる。以上をまとめると次の結果が得られた：

【００５８】

【表２】 ＊シーケンシング中に蛋白質のＮ末端からポリエチレン
グリコール分子が人為的に分離される可能性があるた
め、Ｎ末端シーケンシングは、下記に説明するとおり、
ここでは定量的とはいえない。

【００５９】

【表３】 ＊ＲＩ／ＵＶは屈折率／紫外線吸光度の比のことを言
い、蛋白質１分子当りのポリエチレングリコール分子の
数を推定するのに用いられる。これはＳＥＣ ＨＰＬＣ
データからポリエチレングリコールの屈折率と蛋白質の
紫外線吸光度を用いて計算される。 ＊＊この分子種は使用したアッセイ条件下では不安定で
あることに注意。方 法 １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは非還元４〜
２０％ ＩＳＳＤａｉｉｃｈｉ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ（東京）のミニゲルにおいて、コーマシーブリ
リアントブルーＲ−２５０染色剤を用いて実施された。
ゲルはＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔを用いた動的分子濃度計
によってスキャンした。結果：結果は図１Ｂに示してあ
る。レーン番号１（左から数えて）には蛋白質の分子量
標準（Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ １２分子量標準）が入っ
ていた。レーン２には３μｇのｒｈ−Ｇ− ＣＳＦ標準
が含まれている。レーン３には１０μｇのＳＣＭ−ＰＥ
Ｇ−ＧＣＳＦ反応混合液が入っている。レーン４には１
０μｇのＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが含まれてい
る。レーン５にはＮ末端のメチオニンからの３５番目の
残基に見出されたリジンにＰＥＧ化したモノＰＥＧ化Ｇ
−ＣＳＦが１０μｇ入っている。レーン６にはＮ末端の
メチオニンから４１番目の残基に見出されたリジンにＰ
ＥＧ化したモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが１０μｇ含まれて
いる。図から分かるように、Ｎ末端にモノ ＰＥＧ化し
た物質が含まれているレーン３はバンドが一つである。

【００６０】２．サイズ排除クロマトグラフィー高圧液
体クロマトグラフィー。ＳＥＣ−ＨＰＬＣはＷａｔｅｒ
ｓのＨＰＬＣシステム、Ｂｉｏｓｅｐ ＳＥＣ ３００
０カラム、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９
を用いて、１ｍｌ／分の流速で２０分間実施した。シグ
ナルは２８０ｎｍでモニターした。結果：図２から分か
るように、Ｎ末端にモノＰＥＧ化したｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ
を含むライン“Ｃ”はピークが１個であり、ライン
“Ｄ”（リジン３５にモノＰＥＧ化した物質）および
“Ｅ”（リジン４１にモノＰＥＧ化した物質）もやはり
ピークが１個であった。これはモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ
から分離した分画は純度が実質的に高いことを示してい
る。

【００６１】３．ペプチドマッピング。次の方法を用い
た。“モノ−ＰＥＧ−１”、“モノ−ＰＥＧ−２”、
“モノ−ＰＥＧ−３”と呼ばれる３つのサンプルを分析
した。（ａ）還元アルキル化。モノ−ＰＥＧ Ｇ−ＣＳ
Ｆの５００μｇのアリコートを高速真空乾燥し、６Ｍの
塩酸グアニジンと１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．３ＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）で濃度１ｍｇ／９５０μ
ｌに再構成した。次にサンプルにヨード酢酸を加えてＳ
−カルボキシメチル化し、３７℃で２０分間インキュベ
ートした。次にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｑｕｉｃ
ｋ Ｓｐｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎカラムを用いてサンプル
を脱塩し、緩衝液を交換した。脱塩しバッファ交換した
後、緩衝液を追加することによってサンプルの濃度を
０．５ｍｇ／ｍｌに調整した。（ｂ）エンドプロテイナ
ーゼＳＶ８消化。サンプルはＳＶ８を用いて２５℃で２
６時間消化した（酵素と基質の比は１：２５）。（ｃ）
ＨＰＬＣペプチドマッピング。蛋白質消化物をＶｙｄａ
ｃ Ｃ４カラム（４．６×２００ｍｍ、粒子サイズ５
μ、孔径３００Å）に注入し、０．１％ＴＦＡ中アセト
ニトリルの直線勾配を用いて、ペプチドをＨＰＬＣによ
ってマッピングした。ペプチドを手で収集し、配列分析
のために高速真空乾燥した。結果：参照標準と比較し
て、（ｉ）（図３Ａ）“モノ−ＰＥＧ−１”（Ｎ末端モ
ノＰＥＧ化物質）の場合、ピークは５７．３分で消え、
７７．５分で新しいピークが現れた；（ｉｉ）（図３
Ｂ）“モノ−ＰＥＧ−２”（リジン３５にＰＥＧ化した
物質）の場合、リテンションタイム３０．３分のペプチ
ドのピーク高さが低下し、６６．３分に新しいピークが
溶出された；（ｉｉｉ）（図３Ｃ）“モノ−ＰＥＧ−
３”（リジン４１にＰＥＧ化した物質）の場合、リテン
ションタイム３０．３分のピークはなく、６６．４分に
新しいピークが現れた。これらのペプチドはサンプルマ
ップでの唯一の有意な差であった。わずかな消化の差の
ために、８６．１分のペプチドの一方の側にいくらか、
小さい不完全な切断があった。（ｄ）Ｎ末端の配列分
析。上記のマップに現れた“新しい”ペプチドの各々
を、同定のためＮ末端を配列分析した。乾燥したペプチ
ドを０．１％ ＴＦＡで再構成し、ＡＢＩ蛋白質シーケ
ンサで配列決定した。“モノ−ＰＥＧ−１”（Ｎ末端に
ＰＥＧ化した物質）の場合、“新しい”ピーク（７７．
５分）の６０％が１０サイクルで配列決定された。初期
収率は５％未満であったが、これはＮ末端のメチオニル
残基がポリエチレングリコール分子によってブロックさ
れていることを示している。この最初のペプチドは初期
収率が０％となるはずであったが、収率が５％未満であ
ったのは、配列分析中にＮ末端のメチオニルからポリエ
チレングリコールが脱着した結果かもしれない。検出さ
れた配列は、Ｎ末端ペプチドのものでＭ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−
Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｓであった。“モノ−ＰＥＧ−２”
（リジン３５にＰＥＧ化した物質）の場合、総ピーク体
積の８０％が６６．３分のピークに集まり、９サイクル
で配列決定された。リジン３５の回収率は有意に低かっ
たが、これは位置３５でのＰＥＧ化を示している。リジ
ン４１の回収率はその他の残基と同じくらいで、この位
置では修飾が行われていないことを示唆していた。３
０．３分のペプチドは、標準参照マップの対応するピー
クと比べて、ピーク高さが低かった。３０．３分のペプ
チドは、対応するペプチドのピーク面積の５７．５％し
かなかった。この分子種で検出された配列はＫ−Ｌ−Ｃ
−Ａ−Ｔ−Ｙ−Ｋ−Ｌであった。“モノ−ＰＥＧ−３”
（リジン４１にＰＥＧ化した物質）の場合、６６．４分
に溶出したペプチドについて収集された総ピーク体積の
８０％が９サイクルで配列決定された。検出された配列
はＫ−Ｌ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｙ−Ｋ−Ｌであり、リジン残基
３５および４１を含んでいた。リジン３５の回収率は他
の残基の回収率と同じであった。リジン４１の回収率は
有意に低く、これは位置４１でのＰＥＧ化を示してい
た。結果：“モノ−ＰＥＧ−１”はＮ末端にモノＰＥＧ
化された物質である；“モノ−ＰＥＧ−２”はリジン３
５に一部ＰＥＧ化された物質である；また“モノ−ＰＥ
Ｇ−３”はリジン４１にＰＥＧ化された物質である。参
照標準（非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）とＧＣＳＦモノＰＥＧ
化１、２、３のペプチドマップを比較することによっ
て、“モノ−ＰＥＧ−２”（リジン３５）と“モノ−Ｐ
ＥＧ−３”（リジン４１）のマップは、Ｎ末端ペプチド
よりもピーク高さがわずかに低いことが分かった。これ
はリジン３５およびリジン４１物質に少量のＮ末端ＰＥ
Ｇ化物質が含まれていること、またはＮ末端のメチオニ
ンのＰＥＧ化率が低いことを示唆している。

【００６２】４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性。物質は活性で
あった。図４はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を表し
ている。記載の通り、Ｎ末端モノＰＥＧ化された物質の
活性は、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦの活性の６８％であっ
た。 方法：Ｇ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイは
マウス３２Ｄ細胞のＧ−ＣＳＦ依存クローンを利用する
細胞分裂アッセイである。細胞を５％のＦＢＳおよび２
０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧ−ＣＳＦが入ったＩｓｃｏｖｅｓ
培地に入れて維持した。サンプルを加える前に、ｒｈＧ
−ＣＳＦを含まない成長培地で細胞を２回洗浄した。４
８から０．５ｎｇ／ｍｌ（４８００〜５０ＩＵ／ｍｌに
相当）までの長い１２ポイントのｒｈＧ−ＣＳＦ標準曲
線を作製した。標準曲線の直線部分（１０００〜３００
０ＩＵ／ｍｌ）に入ると予想される４つの希釈液を各サ
ンプルについて調製し、それぞれ３回ずつランした。こ
れらの物質の見かけのｉｎｖｉｔｒｏ活性は低いため、
ＰＥＧ化したｒｈＧ−ＣＳＦサンプルを約４〜１０倍に
希釈した。各希釈度のサンプルまたは標準４０μｌを、
１０，０００細胞／ウェルを含む９６ウェル・マイクロ
タイタープレートの適当なウェルに添加する。３７℃、
５．５％ＣＯ_２という条件下に４８時間置いた後、各ウ
ェルに０．５μｍＣｉのメチル−^３Ｈ−チミジンを追加
した。１８時間後、プレートを収穫し、カウントした。
用量応答曲線（ｒｈＧ−ＣＳＦ濃度の対数（ｌｏｇ）ｖ
ｓ ＣＰＭ−バックグラウンド）を作成し、標準曲線の
直線部分に入るポイントについて、直線回帰分析を行っ
た。未知のテストサンプルの濃度は、得た直線式を使っ
て求め、希釈率について補正した。 結果：結果は図４に示した。記載の通り、３種類のモノ
ＰＥＧ化種のうちＮ末端にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦ
のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性が最高である。

【００６３】５．Ｉｎ ｖｉｖｏ活性。Ｉｎ ｖｉｖｏ
試験によってＮ末端にＰＥＧ化した物質の活性を確認し
た。Ｉｎ ｖｉｖｏ試験は０．１ｍｇ／ｋｇのサンプル
を１回皮下注射によって雄のゴールデンハムスターに投
与することによって行った。１群、１時点当り４匹の動
物から末梢血液を採取した。血清検体は採血当日に完全
血球算定にかけた。平均白血球数を計算した。図５Ａお
よび５Ｂから分かるように、各物質による反応は、０．
１ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射の翌日後に最大に達してい
る。２つのモノＰＥＧ化物質（Ｎ末端とリジン３５）は
反応時間が長く、一方リジン４１で蛋白質をＰＥＧ化し
た物質の反応は未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｖｏ
活性より高くなかった（実際低い、図５Ｂ）。これらの
結果は、ポリエチレングリコール分子を１個結合させる
ことによって、蛋白質の治療プロフィールが劇的に変化
する可能性があり、蛋白質をＰＥＧ化することの利点は
修飾の部位に依存する可能性があることを示唆してい
る。（単回皮下注射後の曲線下の正味平均ＷＢＣ面積
（ＣＲＣ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ
ｌ Ｔａｂｌｅｓ、２６ｔｈ Ｅｄ．（Ｂｅｙｅｒ、
Ｗ．Ｈ．、 Ｅｄ．）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、
Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ １９８１．Ｐ．１２５）
に従って算出）は、リジン３５とＮ末端のモノＰＥＧ化
種では類似していた。） Ｅ．安定性試験 更に、上述のように調製したＮ末端およびリジン３５に
モノＰＥＧ化した分子種について、安定性試験を実施し
た。（リジン４１物質は、活性が未修飾Ｇ−ＣＳＦを上
回らないことが実証されたため使用しなかった）。これ
らの試験によって、Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦが
もう一方のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦであるモノＰＥＧ化
リジン３５と比べて、保管中に予想外に安定しているこ
とが実証された。安定性はＳＥＣ−ＨＰＬＣを使って視
覚化させた生成物の分解という点で評価した。 方法：Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦとリジン３５に
モノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦを、ｐＨ４．０およびｐＨ
６．０という２種類のｐＨ、温度４℃の下でそれぞれ最
高１６日間保管した。ｐＨを６．０に上げると、加速安
定性試験の環境ができあがる。ｐＨ６．０のサンプルの
場合、上述のように調製した、Ｎ末端にモノＰＥＧ化し
たＧ−ＣＳＦおよびリジン３５にモノＰＥＧ化したＧ−
ＣＳＦを、２０ｍＭの燐酸ナトリウム、５ｍＭの酢酸ナ
トリウム、２．５％マンニトール、０．００５％Ｔｗｅ
ｅｎ−８０を含むｐＨ６．０の緩衝液に入れ、最終蛋白
質濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌとなるようにした。このア
リコート１ｍｌを３ｍｌの滅菌済み注射用バイアルに入
れて保管した。バイアルは各々４℃および２９℃におい
て最高１６日間保管した。安定性はＳＥＣ−ＨＰＬＣト
レーシングによって評価した。後の測定値が最初（時間
＝０）の測定値と同じであった場合（肉眼検査によって
確認）、そのサンプルはその期間だけ安定していたと見
なされた。 結果：結果は図６Ａ〜６Ｃに示した。 （ａ）ｐＨ６．０、温度４℃での比較。図６ＡはＮ末端
にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦをｐＨ６、４℃で保管し
た場合のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示しており、
図６Ｂはリジン３５にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦをｐ
Ｈ６、４℃で保管した場合のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィ
ールを示している。リジン３５物質は分解されて、未修
飾Ｇ−ＣＳＦと類似の分子量の物質になりつつあると解
釈できる。 （ｂ）ｐＨ４．０、温度４℃での長期保管。ＰＨ４．
０、温度４℃という条件は、Ｎ末端種が分解を示さない
比較的安定した条件を示すある種の対照を提供する。リ
ジン３５種の場合、物質の分解がまだ起こっているが、
速度はかなり遅い。 （ｃ）ｐＨ６．０、温度４℃での比較。図６Ｃはこのよ
うな条件下に長期間保管した場合のモノＰＥＧ化Ｇ−Ｃ
ＳＦのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示している。記
載の通り、ｐＨ６．０、温度４℃の場合、リジン３５物
質は１６日目または３５日目では、６日目に観察された
もの（図６Ｂ）を上回る脱ＰＥＧ化は観察されなかっ
た。これはこのような条件下では６日目を越えても脱Ｐ
ＥＧ化（不安定性）に変化がないことを示している。実施例２ この実施例は、還元アルキル化を用いて実質的に均質な
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ群を調製する方法、およびこの
群の特徴を示している。上記実施例で説明した組換えＧ
−ＣＳＦを使用した。記載のように、この方法は、Ｎ末
端を化学的に修飾した物質の収率という点で利点がある
だけでなく、この還元アルキル化法のアミン結合は実質
的に安定した生成物を産生するという利点がある。これ
は保存後の凝集の程度に大きな差があることによって実
証される。 Ａ．Ｎ末端のα−アミノ残基に結合させたモノ−メトキ
シポリエチレングリコール−ＧＣＳＦ結合体の調製 ２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ_３ を含む１００ｍＭのリン酸
ナトリウム（ｐＨ５）中の、冷却し（４℃）攪拌したｒ
ｈＧ−ＣＳＦ溶液（１ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、上記実施例
のところで説明済み）に、５倍モル過剰のメトキシポリ
エチレングリコールアルデヒド（ＭＰＥＧ）（平均分子
量、６ｋＤａ）を加えた。同じ温度で反応混合物を攪拌
し続けた。

【００６４】反応中に蛋白質の修飾がどの程度起こった
かは、Ｂｉｏ− Ｓｉｌ ＳＥＣ２５０−５カラム（Ｂ
ＩＯ−ＲＡＤ）を用いてＳＥＣ ＨＰＬＣによってモニ
ターした。溶離剤には０．０５ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、
０．０５ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．１５ＭのＮａＣｌ、
０．０１ ＭのＮａＮ_３をｐＨ６．８にて用い、流速は
１ｍｌ／分とした。

【００６５】１０時間ＳＥＣ ＨＰＬＣ分析を行った結
果、蛋白質の９２％がモノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体
に変換されていることが分かった。これは蛋白質濃度
（Ａ_{２ ８０}における吸光度によって決定）の記録である
図７から分かる。この図からは、８．７２分にモノＰＥ
Ｇ化Ｇ−ＣＳＦの溶離ピークがあり、また９．７８分に
溶離する未反応Ｇ−ＣＳＦのマイナーピークがあること
が分かる。

【００６６】図８はＭＰＥＧのＮ−ヒドロキシサクシニ
ミジルエステルを用いて得たピークを示している。分子
量は約６ｋＤａであった。図から分かるように、この反
応によって得られた混合物は次のとおりであった：トリ
−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体（約７．２５分のところに
ショルダー）、ジ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体（７．６
２分にピーク）、モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体
（８．４３分にピーク）、および未反応のＧ−ＣＳＦ
（９．８７分にピーク）。

【００６７】蛋白質の９２％がモノＰＥＧ化物質に変換
されたこの１０時間の時点で、反応混合物のｐＨを１０
０ｍＭのＨＣｌでｐＨ４に調整し、反応混合物を１ｍＭ
のＨＣｌで５倍に希釈した。

【００６８】モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体は、２０
ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）で平衡化したＨ
ｉＬｏａｄ １６／１０ＳセファロースＨＰカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、イオン交換クロマトグラ
フィによって精製した。反応混合物をカラムに添加して
流速１ｍｌ／分でランし、同緩衝液を３カラム容量用い
て未反応のＭＰＥＧアルデヒドを溶出した。次に１Ｍの
ＮａＣｌを含む０％〜４５％直線４００分勾配の２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を用いて、４℃において蛋
白質−ポリマー結合体を溶出した。

【００６９】モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体を含む分
画をプールして濃縮し、滅菌濾過した。

【００７０】同様にして、種々の平均分子量（１２、２
０、２５ｋＤａ）のＭＰＥＧアルデヒドでｒｈ−Ｇ−Ｃ
ＳＦを修飾することによって得られる様々なモノ−ＭＰ
ＥＧ−ＧＣＳＦ結合体を調製した。 Ｂ．モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの分析 １．分子量 モノＰＥＧ化結合体における分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、ゲル濾過、マトリックスアシステッドレーザーデソ
ープション質量分析、平衡遠心分離によって求めた。結
果は以下の表４に示した。

【００７１】

【表４】 調製したＮ末端モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体の構造
は、Ｎ末端の蛋白質シーケンシングとペプチドマッピン
グによって確認した。Ｎ末端のメチオニル残基の臭化シ
アン切断の結果、ポリエチレングリコールが除去され
た。

【００７２】２．生物学的活性 ＰＥＧ化ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ
生物学的活性は、^３Ｈチミジンのマウス骨髄細胞への刺
激取り込みを測定することによって求めた。

【００７３】Ｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性は、ＭＰＥＧ
−ＧＣＳＦ結合体またはｒｈＧ−ＣＳＦ（１００ｍｇ／
ｋｇ）をハムスターに皮下注射し、総白血球数を測定す
ることによって求めた。非誘導体化Ｇ−ＣＳＦと比較し
た生物活性は、ベヒクル（媒体）の対照曲線を引き算し
た後のＷＢＣ／時間曲線下の面積として計算した。ＭＰ
ＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体の相対的生物活性は、未修飾Ｇ−
ＣＳＦと比較した生物活性のパーセンテージとして表し
た。

【００７４】これは、様々な分子量（６ｋＤａ、１２ｋ
Ｄａ、および２０ｋＤａ）のＭＰＥＧアルデヒドによる
ｒｈＧ−ＣＦの還元アルキル化によって調製したモノ−
Ｎ末端ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体に対する総白血球反応
を示す図９に示してある。図から分かるように、モノＰ
ＥＧ化分子はすべて反応を誘導した。使用したポリエチ
レングリコールの分子量が高いほど、白血球数が多くな
った。但し、１２ｋＤａ型は２日目において２０ｋＤａ
型と比較して、白血球数がわずかに多いだけであった。

【００７５】３．安定性試験 ２種類の化学的方法（アミドｖｓ還元アルキル化のアミ
ン）によって調製したＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦ
の凝集程度を比較した。予想外のことだが、アミン化学
を用いてＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦは、アミド結
合によってＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦよりもかな
り安定していることが分かった（ＮＨＳ化学反応は実施
例１に説明済み）。

【００７６】方法：Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦサ
ンプルはどちらも、５％ソルビトールを含む１０ｍＭの
ＮａＯａｃ（ｐＨ４．０）に濃度１ｍｇ蛋白質／ｍｌで
含まれていた。Ｇ−ＣＳＦはどちらもＰＥＧ ６０００
でＰＥＧ化した。アミド結合結合体は実施例１のとおり
に調製し、アミン結合結合体は実施例２のとおりに調製
した。各々６個ずつのサンプルを４５℃において８週間
保存した。８週目の終りにサイズ排除クロマトグラフィ
およびイオン交換クロマトグラフィによって凝集程度を
判断した。

【００７７】結果：現在の還元アルキル化法は、驚くべ
きことに高温で８週間保存した後も凝集が遥かに少ない
物質を生成し、アセチル化よりも利点があることが実証
された。以下の表は、サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓ
ＥＣ）またはイオン交換（ＩＥ）を用いて得た、両方の
物質の非凝集物質（“メインピーク”物質）の割合を示
している：

【００７８】

【表５】 ＊イオン交換では凝集について完全な分析はできないた
め、これはかなり高い。実施例３ この実施例は化学的修飾コンセンサスインターフェロン
を実証するものである。もっと詳しく言えば、この例は
かなり均質なモノＰＥＧ化ＩＦＮ−ｃｏｎ_１群の調製方
法、およびこの群の特性を実証している。

【００７９】この実施例はＩＦＮ−ｃｏｎ_１を使用して
いるが、上述のコンセンサスインターフェロンのいずれ
も化学的に修飾される可能性があることに注意すべきで
ある。このような化学的修飾には、上にリストしたよう
な任意の水溶性ポリマーを使用してよいが、ここではＰ
ＥＧを使用している。ＰＥＧ化にはここではＰＥＧ１２
０００を使用しているが、任意の水溶性ＰＥＧ種を使用
してもよい（ＰＥＧ１２０００は取扱いが容易で便利な
ために選択した）。また、化学的修飾の方法としては種
々あるが（アセチル化など）、Ｎ末端ＰＥＧ化のような
選択的Ｎ末端化学的修飾については、この実施例で説明
している本還元アルキル化法が好ましい。

【００８０】Ａ．コンセンサスインターフェロンの調製 モノＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンの調製に
は、米国特許第４，６９５，６２３号（この全体を参照
として本明細書に組み入れる）の図２にあるＩＦＮ−α
ｃｏｎ_１（本明細書ではＩＦＮ−ｃｏｎ_１と呼ぶ）を使
用した。ＩＦＮ−ｃｏｎ_１は細菌内での外因性ＤＮＡの
発現によって生成されたもので、Ｎ末端にメチオニル残
基を持っていた。

【００８１】Ｂ．コンセンサスインターフェロンのＰＥ
Ｇ化 ２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ_３を含む、冷却し（４℃）攪拌
しておいた１００ｍＭのリン酸ナトリウム中のＩＦＮ−
ｃｏｎ_１溶液、ｐＨ４．０（３．４５ｍｇ／ｍｌ、Ｎ末
端がブロックされた形態を３２．２５％含む）に、８倍
モル過剰のメトキシポリエチレングリコールアルデヒド
（ＭＰＥＧ）（平均分子量１２ｋＤａ）を加えた。

【００８２】反応中に蛋白質修飾がどの程度起こるか
は、ＰＬＲＰ−Ｓ （ＰＬ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）のようなポリマーベースのポリ（スチレン／ジ
ビニルベンゼン）カラムを使った逆相ＨＰＬＣによって
モニターした。

【００８３】１０時間の逆相ＨＰＬＣ分析の結果、Ｎ末
端にブロックされたα−アミノ基を持つ蛋白質の８０％
がＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ_１誘導体に変換されたこと
が分かった。

【００８４】１０時間の時点で、反応混合物を５倍の水
で希釈し、モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ_１誘導体
を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で
平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／１０ Ｓセファロース
ＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換
クロマトグラフィで精製した。反応混合物を流速１ｍｌ
／分の流速でカラムに添加し、未反応のＭＰＥＧアルデ
ヒドを３カラム容量の同緩衝液で溶出した。次に１Ｍの
ＮａＣｌを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０
の０％〜７５％の４２０分直線勾配を用いて、４℃にお
いて蛋白質−ポリマー結合体を溶出した。

【００８５】モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ_１誘導体
を含む分画をプールし、濃縮して、滅菌濾過した。

【００８６】Ｃ．モノＰＥＧ化コンセンサスインターフ
ェロンの分析 １．均質性 精製したモノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ_１結合体の均
質性は、１０〜２０％または４〜２０％プレキャストグ
ラジェントゲル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって調べた。分子量３５ｋＤａのところにメインバ
ンドが現れた。

【００８７】各モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ_１種の
有効サイズ（流体力学的半径）を調べるために、Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅ ６ＨＲ １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）ゲル濾過カラムを使用した。蛋白質は２８０ｎｍに
おける紫外線吸光度によって検出した。ＢＩＯ−ＲＡＤ
ゲル濾過標準は、球状蛋白質分子量マーカーとして用い
た。

【００８８】精製されたＮ末端モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ
−ｃｏｎ_１結合体の構造は、Ｎ末端蛋白質シーケンシン
グおよびペプチドマッピングの手法によって確認した。

【００８９】このＩＦＮ−ｃｏｎ_１調製物にはＮ末端が
ブロックされている物質が少し含まれており、この物質
はＰＥＧ化されていなかった。しかしＰＥＧ化されてい
た物質は、Ｎ末端がモノＰＥＧ化されていた。このよう
に、この種の状況では、イオン交換クロマトグラフィや
サイズ排除クロマトグラフィといった他の方法によっ
て、ブロックされている物質とされていない物質を分離
したほうが良いかもしれない。

【００９０】２．生物学的活性 モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ_１結合体のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ生物学的活性は、その抗ウイルス生物活性を測定
することによって決定した。モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−
Ｃｏｎ_１結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性は、ヒ
ト（ＨｅＬａ）細胞におけるその抗ウイルス生物活性を
測定することによって決定した。

【００９１】モノ−ＭＰＥＧ（１２ｋＤａ）−ＩＦＮ−
Ｃｏｎ_１結合体は、未修飾種と比較して２０％のｉｎ
ｖｉｔｒｏ生物活性（Ｕ／ｍｇ蛋白質）を示すことが分
かった。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのところで指摘したよう
に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは生物学的活性を実証す
るのには有用であるが、特徴的な徐放性のために、化学
的に修飾した蛋白質の活性がかなり低く出ることがあ
る。Ｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性はｉｎ ｖｉｔｒｏ生
物学的活性より高いかも知れない。

【００９２】Ｄ．Ｎ末端ブロック分子を除去した化学的
修飾コンセンサスインターフェロン 予め除去したＮ末端ブロック分子の一部を持つ上述のＩ
ＦＮ−ｃｏｎ_１に対しても、本還元アルキル化を実施し
た。上述のように還元アルキル化法にはＰＥＧ１２００
０とＰＥＧ ２００００の両方を用いた。

【００９３】分子の見かけの分子量は以下のとおりであ
った：

【００９４】

【表６】 ＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィを使ったＩＦＮ−
ｃｏｎ_１ ２０ｋＤＡＰＥＧ結合体の分析では、３つの
ピークが現れた： モノＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ_１：総面積の６６％（２
６５．９３ｍｌで溶出） 蛋白質凝集物およびオリゴＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ_１
結合体：総面積の２４％（２３８．４２ｍｌで溶出） 未反応のＩＦＮ−ｃｏｎ_１：総面積の１０％（３２８．
７７ｍｌで溶出）。

【００９５】条件はこれ以上最適化しなかった。クロマ
トグラフィまたはその他の方法を使えば、モノＰＥＧ化
物質を更に分離することができるかも知れない。

【００９６】本発明を好ましい実施例について説明した
が、当業者には修正や変更が可能であることは理解され
よう。従って添付の請求の範囲はその発明の範囲内にあ
るこういったすべての同等の変更を包含するものであ
る。 ［配列表］ 配列番号：１ 配列の長さ：５３１塩基対 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列：

【００９７】

【化３】 配列番号：２ 配列の長さ：１７５ 配列の型 ：アミノ酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列：

【００９８】

【化４】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのイオン交換クロマトグ
ラフィーから得たピークのクロマトグラムを図示したも
のである。

【図１Ｂ】モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの各種の分子種のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥである。

【図２】ＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールであり、（レー
ンＡ）：組換えヒトメチオニルＧ−ＣＳＦの標準品；
（レーンＢ）：ＳＣＭ−ＰＥＧ−ＧＣＳＦ反応混合物；
（レーンＣ）：Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；（レーン
Ｄ）：リシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；（レーン
Ｅ）：リシン４１モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦである。

【図３Ａ】ＨＰＬＣエンドプロテイナーゼＳＶ８ペプチ
ドマッチングトレーシングであり、Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−
ＣＳＦを示す。

【図３Ｂ】ＨＰＬＣエンドプロテイナーゼＳＶ８ペプチ
ドマッチングトレーシングであり、リシン３５モノＰＥ
Ｇ化Ｇ−ＣＳＦを示す。

【図３Ｃ】ＨＰＬＣエンドプロテイナーゼＳＶ８ペプチ
ドマッチングトレーシングであり、リシン４１モノＰＥ
Ｇ化Ｇ−ＣＳＦを示す。

【図４】モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ種のｉｎ ｖｔｒｏ生
物活性を非ＰＥＧ化標準品のそれと比較して示す棒グラ
フである。

【図５Ａ】モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ誘導体のｉｎ ｖｉ
ｖｏ生物活性のアッセイ結果を示すグラフであり、Ｎ末
端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、リシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−Ｃ
ＳＦまたはリシン４１モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを一回皮
下注射した後のハムスターの平均白血球数を示す。

【図５Ｂ】モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ誘導体のｉｎ ｖｉ
ｖｏ生物活性のアッセイ結果を示すグラフであり、上記
の各種モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ誘導体を一回皮下注射し
た後の、正味の平均白血球数の曲線下面積を示す。

【図６Ａ】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン３５
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの安定性の試験結果のＳＥＣ−
ＨＰＬＣプロフィールである。Ｎ末端モノＰＥＧ化Ｇ−
ＣＳＦのｐＨ６．０で４℃にて行った安定性試験のプロ
フィールを示す。

【図６Ｂ】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン３５
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの安定性の試験結果のＳＥＣ−
ＨＰＬＣプロフィールである。リシン３５モノＰＥＧ化
Ｇ−ＣＳＦのｐＨ６．０で４℃にて行った安定性試験の
プロフィールを示す。

【図６Ｃ】Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン３５
モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの安定性の試験結果のＳＥＣ−
ＨＰＬＣプロフィールである。リシン３５モノＰＥＧ化
Ｇ−ＣＳＦのｐＨ６．０で４℃にて行った時間を延長し
た安定性試験の結果を示すプロフィールである。時間
（「Ｔ」）は日数を示す。

【図７】ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦとメトキシポリエチレングリ
コールアルデヒド（ＭＷ６ｋＤａ）との還元的アルキル
化反応の過程での反応混合物のサイズ排除ＨＰＬＣによ
る分析結果を示す。

【図８】ＭＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステル（ＭＷはやはり６ｋＤａ）を用いた反応混合物の
サイズ排除ＨＰＬＣによる分析結果を示す。

【図９】分子量が異なる（６ｋＤａ、１２ｋＤａおよび
２０ｋＤａ）ＭＰＥＧアルデヒド類でｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ
の還元的アルキル化を行うことによって製造したモノＮ
末端ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体に対する、一回の皮下投
与後の全白血球応答を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 9/10 7/06 25/00 9/10 31/12 25/00 35/00 31/12 37/04 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/555 37/04 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｆ Ｃ０７Ｋ 14/555 37/02 (72)発明者 ナンシー・イー・カブリエル アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーベリイー・パーク、ベア・クリー ク・コート・3501 (72)発明者 クリステイン・イー・フアーラー アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーベリイー・パーク、バリー・オー ク・レーン・667 (72)発明者 ランドルフ・ビー・デプリンス アメリカ合衆国、ノースカロライナ・ 27614、ローリイ、ハートランド・コー ト・129 Ｆターム(参考） 4C076 AA95 BB11 CC41 EE06 EE59 4C084 AA01 AA30 BA37 BA44 DA19 DA21 MA66 NA05 NA12 ZA02 ZA36 ZA40 ZA55 ZA75 ZB07 ZB09 ZB22 ZB26 ZB33 ZC33 4H045 AA10 BA10 BA62 CA40 DA15 EA20 FA30 FA51 FA81 GA22 GA23

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ末端がモノＰＥＧ化されたタンパク質
   を含む実質的に均質な調製物であって、Ｎ末端以外の部
   位がＰＥＧ化されたタンパク質を含まない調製物。
2. 【請求項２】 結合に使用されるポリエチレングリコー
   ルが約２ｋＤａから１００ｋＤａの分子量を有すること
   を特徴とする請求項１に記載の調製物。
3. 【請求項３】 前記ポリエチレングリコールが約６ｋＤ
   ａから２５ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請
   求項２に記載の調製物。
4. 【請求項４】 ９０％以上のＮ末端モノＰＥＧ化タンパ
   ク質と１０％以下の非ＰＥＧ化タンパク質を含む請求項
   １に記載の調製物。
5. 【請求項５】 ９５％以上のＮ末端モノＰＥＧ化タンパ
   ク質と５％以下の非ＰＥＧ化タンパク質を含む請求項４
   に記載の調製物。
6. 【請求項６】 タンパク質がコンセンサスインターフェ
   ロンである請求項１、３または４に記載の調製物。