JP2017532045A - アデノシンデアミナーゼ−2(ada2)、その変異体の組成物およびそれを使用する方法 - Google Patents
アデノシンデアミナーゼ−2(ada2)、その変異体の組成物およびそれを使用する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017532045A JP2017532045A JP2017519862A JP2017519862A JP2017532045A JP 2017532045 A JP2017532045 A JP 2017532045A JP 2017519862 A JP2017519862 A JP 2017519862A JP 2017519862 A JP2017519862 A JP 2017519862A JP 2017532045 A JP2017532045 A JP 2017532045A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ada2
- seq
- mutant
- catalytically active
- t147del
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102100025976 Adenosine deaminase 2 Human genes 0.000 title claims abstract description 506
- 101710142940 Adenosine deaminase 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 506
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 84
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 52
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 52
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102220607630 Methylmalonyl-CoA mutase, mitochondrial_S262N_mutation Human genes 0.000 claims description 1551
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 156
- 102220530094 Linker for activation of T-cells family member 2_R20E_mutation Human genes 0.000 claims description 95
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 91
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 90
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 90
- 102220530054 Testis-expressed protein 10_E179V_mutation Human genes 0.000 claims description 84
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 84
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 65
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 65
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 51
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 42
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 33
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 33
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 claims description 32
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 32
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 32
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 claims description 28
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 28
- QWTLUPDHBKBULE-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QWTLUPDHBKBULE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 26
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 22
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 22
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 21
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 20
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 102220271762 rs146066553 Human genes 0.000 claims description 19
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims description 18
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 17
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 claims description 17
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 17
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 17
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 claims description 17
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims description 16
- 102220479663 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase PTEN_K13E_mutation Human genes 0.000 claims description 15
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 15
- 102220005376 rs33915947 Human genes 0.000 claims description 15
- 102200071614 rs41331747 Human genes 0.000 claims description 15
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 14
- 102220532812 Villin-1_D86L_mutation Human genes 0.000 claims description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 14
- 102220005405 rs33915947 Human genes 0.000 claims description 14
- 102220053624 rs573892607 Human genes 0.000 claims description 14
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 14
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 claims description 13
- 102220493797 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain_D86S_mutation Human genes 0.000 claims description 13
- 102220578763 Mapk-regulated corepressor-interacting protein 1_R20D_mutation Human genes 0.000 claims description 13
- 102200143877 c.257A>G Human genes 0.000 claims description 13
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 13
- 102220584011 Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2_K26D_mutation Human genes 0.000 claims description 12
- 102220355380 c.76A>G Human genes 0.000 claims description 12
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 claims description 11
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 claims description 11
- 102220519562 Uroporphyrinogen decarboxylase_D86E_mutation Human genes 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 108010025198 decaglycine Proteins 0.000 claims description 11
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102220251280 rs1555165811 Human genes 0.000 claims description 10
- 102220493796 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain_D86A_mutation Human genes 0.000 claims description 9
- NYXRHTOXAYVBMV-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-(2-hydroxyethoxy)acetate;2-methoxyethanol Chemical compound COCCO.OCCOCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O NYXRHTOXAYVBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102100021102 Hyaluronidase PH-20 Human genes 0.000 claims description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 claims description 7
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 101150055528 SPAM1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 claims description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 6
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 5
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims description 5
- -1 XTEN sequence Proteins 0.000 claims description 5
- SSJJWVREPZVNBF-DGXVIIAXSA-N dG10 Chemical compound C1=NC(C(NC(N)=N2)=O)=C2N1[C@H](O[C@@H]1COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CO)C[C@@H]1OP(O)(=O)OC[C@@H](O1)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 SSJJWVREPZVNBF-DGXVIIAXSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 5
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 101100178973 Homo sapiens SPAM1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 4
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 108010028584 nucleotidase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011363 radioimmunotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 102220027007 rs267607740 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220007514 rs376960358 Human genes 0.000 claims description 4
- 102220049003 rs587783671 Human genes 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 4
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 229920001734 PEG propionaldehyde Polymers 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001256 adenosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003128 head Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 3
- WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutyric acid Chemical compound CCC(C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000192019 Human endogenous retrovirus K Species 0.000 claims description 2
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220501037 Kinesin-like protein KIF20A_R366A_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 2
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 2
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000013059 antihormonal agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 claims description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 claims description 2
- 229940045200 cardioprotective agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 2
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 2
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 claims description 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 229950010773 pidilizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 2
- 102200074035 rs111033550 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200016463 rs1449216377 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220137369 rs200935960 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200006098 rs34968276 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220185905 rs61754326 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220059224 rs786202312 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220151559 rs886060514 Human genes 0.000 claims description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 claims description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 2
- 229950007217 tremelimumab Drugs 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 2
- 102220614785 Calmodulin-3_K11A_mutation Human genes 0.000 claims 30
- 102220506513 Alpha-sarcoglycan_R20A_mutation Human genes 0.000 claims 29
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 claims 10
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims 10
- 102220612902 Small EDRK-rich factor 1_K13A_mutation Human genes 0.000 claims 4
- 101001041117 Homo sapiens Hyaluronidase PH-20 Proteins 0.000 claims 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 102220467025 Tubulin monoglutamylase TTLL4_K26A_mutation Human genes 0.000 claims 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims 2
- 102220335467 rs761922057 Human genes 0.000 claims 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims 2
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims 1
- 101000579587 Gallus gallus Limbic system-associated membrane protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims 1
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- 102200026356 rs104893736 Human genes 0.000 claims 1
- 102220072395 rs376780156 Human genes 0.000 claims 1
- 102220329762 rs760939854 Human genes 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 135
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 87
- 102220516987 Double homeobox protein 4_R20A_mutation Human genes 0.000 description 67
- 102220521975 THAP domain-containing protein 1_K11A_mutation Human genes 0.000 description 67
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 64
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 41
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 15
- 102220581881 RNA N6-adenosine-methyltransferase METTL16_K26A_mutation Human genes 0.000 description 10
- 102220507306 Rab11 family-interacting protein 1_K13A_mutation Human genes 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000009066 Hyaluronoglucosaminidase Human genes 0.000 description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 7
- 102220105494 rs879254567 Human genes 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220173368 rs74740454 Human genes 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 101000720051 Homo sapiens Adenosine deaminase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 102000056434 human ADA2 Human genes 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 241000282620 Hylobates sp. Species 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102220575132 Leucine-rich repeat transmembrane protein FLRT1_S86N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000282576 Pan paniscus Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 102220533819 Protein BEX2_K19E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- JLPULHDHAOZNQI-JLOPVYAASA-N [(2r)-3-hexadecanoyloxy-2-[(9e,12e)-octadeca-9,12-dienoyl]oxypropyl] 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC JLPULHDHAOZNQI-JLOPVYAASA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- DDIZZZUDYHCPHS-TXEPZDRESA-N acetic acid;2-[(4s)-4-[[5-(dimethylamino)naphthalen-1-yl]sulfonylamino]-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-5-oxopentyl]guanidine Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.O=C([C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=C2C=CC=C(C2=CC=C1)N(C)C)N1CCN(C)CC1 DDIZZZUDYHCPHS-TXEPZDRESA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012659 cardioprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N phosphorylcholine chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O PYJNAPOPMIJKJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 102220328196 rs1555593511 Human genes 0.000 description 1
- 102200105055 rs4790235 Human genes 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 208000024719 uterine cervix neoplasm Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
- C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Christopher Thanos、Lin WangおよびH. Michael ShepardによるCOMPOSITIONS OF ADENOSINE DEAMINASE-2 (ADA2), VARIANTS THEREOF AND METHODS OF USING SAMEという名称の2014年10月14日に出願された米国仮出願番号第62/063,936号に対して優先権の利益を主張する。認められる場合、この出願の主題は、その全体が参照により援用される。
電子版の配列表が、本明細書とともに提出され、その内容は、それらの全体が参照により援用される。電子ファイルは、2015年10月14日に作られ、サイズが3,177キロバイトであり、3121seqPC1.txtという題名である。
H264E、R219Q/S262N/H264F、R219Q/S262N/H264I、R219Q/S262N/H264K、R219Q/S262N/H264L、R219Q/S262N/H264M、R219Q/S262N/H264P、R219Q/S262N/H264R、R219Q/S262N/H264S、R219Q/S262N/H264T、R219Q/S262N/H264V、R219Q/S262N/H264W、R219Q/S262N/H264Y、R219Q/S262N/S266A、R219Q/S262N/S266C、R219Q/S262N/S266D、R219Q/S262N/S266E、R219Q/S262N/S266F、R219Q/S262N/S266G、R219Q/S262N/S266H、R219Q/S262N/S266I、R219Q/S262N/S266K、R219Q/S262N/S266L、R219Q/S262N/S266M、R219Q/S262N/S266N、R219Q/S262N/S266P、R219Q/S262N/S266Q、R219Q/S262N/S266R、R219Q/S262N/S266T、R219Q/S262N/S266V、R219Q/S262N/S266W、R219Q/S262N/S266Y、R219Q/S262N/K267A、R219Q/S262N/K267C、R219Q/S262N/K267D、R219Q/S262N/K267E、R219Q/S262N/K267F、R219Q/S262N/K267G、R219Q/S262N/K267H、R219Q/S262N/K267I、R219Q/S262N/K267L、R219Q/S262N/K267M、R219Q/S262N/K267N、R219Q/S262N/K267P、R219Q/S262N/K267Q、R219Q/S262N/K267R、R219Q/S262N/K267S、R219Q/S262N/K267T、R219Q/S262N/K267V、R219Q/S262N/K267W、R219Q/S262N/K267Y、R219Q/S262N/V296A、R219Q/S262N/V296C、R219Q/S262N/V296D、R219Q/S262N/V296E、R219Q/S262N/V296F、R219Q/S262N/V296G、R219Q/S262N/V296H、R219Q/S262N/V296I、R219Q/S262N/V296K、R219Q/S262N/V296L、R219Q/S262N/V296M、R219Q/S262N/V296N、R219Q/S262N/V296P、R219Q/S262N/V296Q、R219Q/S262N/V296R、R219Q/S262N/V296S、R219Q/S262N/V296T、R219Q/S262N/V296WおよびR219Q/S262N/V296Yのいずれかの中から選択される修飾を含有する。ある態様においては、変異型ADA2タンパク質は、R219Q/K11A/R20A、R219Q/K11A/R20A/K371A、R219Q/R20A/K371A、219Q/K11A/K371A、S262N/K11A/R20A、S262N/K11A/R20A/K371A、S262N/R20A/K371A、S262N/K11A/K371A、R219Q/C105−T147del→(Gly)n、R219Q/V99−Q144del→(GGGGS)n、R219Q/C105−T147del→(GGGGS)n、R219Q/N98−N156del、R219Q/C105−E148del、R219Q/C105−T147del、R219Q/V99−Q144del、S262N/C105−T147del→(Gly)n、S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n、S262N/C105−T147del→(GGGGS)n、S262N/N98−N156del、S262N/C105−E148del、S262N/C105−T147delおよびS262N/V99−Q144delの中から選択される修飾を含有する。
下記修飾は、ヘパリン結合の低減を付与し得る。ヘパリンへの結合は、投与されるADA2の循環レベルを激減させ得る。したがって、下記ADA2変異体は、投与されるADA2のバイオアベイラビリティおよび薬物動態を増加し得る:
K11A;K11D;K11E;K13A;K13D;K13E;K371A;K371D;K371E;K372A;K372D;K372E;K452A;K452D;K452E;R20A;R20D;R20E;R366A;R366D;R366E;K26A;K26D;K26E;R217A;R217D;R217E;K258A;K258D;K258E;R277A;R277D;R277E;R283A;R283D;R283E;K309A;K309D;K309E;K317A;K317D;K317E;K321A;K321D;K321E;R352A;R352D;R352E;R441A;R441D;R441E;K444A;K444D;K444E;K461A;K461D;K461E;K469A;K469D;K469E;K470A;K470D;およびK470E。
K11A(配列番号13);K11D(配列番号14);K11E(配列番号15);K13A(配列番号16);K13D(配列番号17);K13E(配列番号18);K371A(配列番号19);K371D(配列番号20);K371E(配列番号21);K372A(配列番号22);K372D(配列番号23);K372E(配列番号24);K452A(配列番号25);K452D(配列番号26);K452E(配列番号27);R20A(配列番号28);R20D(配列番号29);R20E(配列番号30);R366A(配列番号31);R366D(配列番号32);R366E(配列番号33);K26A(配列番号71);K26D(配列番号72);K26E(配列番号73);R217A(配列番号74);R217D(配列番号75);R217E(配列番号76);K258A(配列番号77);K258D(配列番号78);K258E(配列番号79);R277A(配列番号80);R277D(配列番号81);R277E(配列番号82);R283A(配列番号83);R283D(配列番号84);R283E(配列番号85);K309A(配列番号86);K309D(配列番号87);K309E(配列番号88);K317A(配列番号89);K317D(配列番号90);K317E(配列番号91);K321A(配列番号92);K321D(配列番号93);K321E(配列番号94);R352A(配列番号95);R352D(配列番号96);R352E(配列番号97);R441A(配列番号98);R441D(配列番号99);R441E(配列番号100);K444A(配列番号101);K444D(配列番号102);K444E(配列番号103);K461A(配列番号104);K461D(配列番号105);K461E(配列番号106);K469A(配列番号107);K469D(配列番号108);K469E(配列番号109);K470A(配列番号110);K470D(配列番号111);およびK470E(配列番号112)。
下記修飾は、触媒効率の増加を付与し得る。修飾は、活性部位の限定された残基に存在し、アデノシンに関する触媒効率(kcat/KM)の改善を達成し得る。ヘパリンへの結合は、投与されるADA2の循環レベルを激減させ得る。したがって、下記ADA2変異体は、アデノシンデアミナーゼ活性の増加を付与し得る:
H264A;H264Q;H264N;H264G;R219K;R219Q;R219N;R219A;L221A;L221V;L221G;E179D;E179A;E179S;E179T;E179V;E179G;S262A;S262V;S262M;S262N;D86A;D86C;D86E;D86F;D86G;D86H;D86I;D86K;D86L;D86M;D86N;D86P;D86Q;D86R;D86S;D86T;D86V;D86W;D86Y;E179C;E179F;E179H;E179I;E179K;E179L;E179M;E179N;E179P;E179Q;E179R;E179W;E179Y;R219C;R219D;R219E;R219F;R219G;R219H;R219I;R219L;R219M;R219P;R219S;R219T;R219V;R219W;R219Y;L221C;L221D;L221E;L221F;L221H;L221I;L221K;L221M;L221N;L221P;L221Q;L221R;L221S;L221T;L221W;L221Y;S262C;S262D;S262E;S262F;S262G;S262H;S262I;S262K;S262L;S262P;S262Q;S262R;S262T;S262W;S262Y;H264C;H264D;H264E;H264F;H264I;H264K;H264L;H264M;H264P;H264R;H264S;H264T;H264V;H264W;H264Y;S266A;S266C;S266D;S266E;S266F;S266G;S266H;S266I;S266K;S266L;S266M;S266N;S266P;S266Q;S266R;S266T;S266V;S266W;S266Y;K267A;K267C;K267D;K267E;K267F;K267G;K267H;K267I;K267L;K267M;K267N;K267P;K267Q;K267R;K267S;K267T;K267V;K267W;K267Y;V296A;V296C;V296D;V296E;V296F;V296G;V296H;V296I;V296K;V296L;V296M;V296N;V296P;V296Q;V296R;V296S;V296T;V296W;およびV296Y。
H264A(配列番号34);H264Q(配列番号35);H264N(配列番号36);H264G(配列番号37);R219K(配列番号38);R219Q(配列番号39);R219N(配列番号40);R219A(配列番号41);L221A(配列番号42);L221V(配列番号43);L221G(配列番号44);E179D(配列番号45);E179A(配列番号46);E179S(配列番号47);E179T(配列番号48);E179V(配列番号49);E179G(配列番号50);S262A(配列番号51);S262V(配列番号52);S262M(配列番号53);S262N(配列番号54);D86A(配列番号113);D86C(配列番号114);D86E(配列番号115);D86F(配列番号116);D86G(配列番号117);D86H(配列番号118);D86I(配列番号119);D86K(配列番号120);D86L(配列番号121);D86M(配列番号122);D86N(配列番号123);D86P(配列番号124);D86Q(配列番号125);D86R(配列番号126);D86S(配列番号127);D86T(配列番号128);D86V(配列番号129);D86W(配列番号130);D86Y(配列番号131);E179C(配列番号132);E179F(配列番号133);E179H(配列番号134);E179I(配列番号135);E179K(配列番号136);E179L(配列番号137);E179M(配列番号138);E179N(配列番号139);E179P(配列番号140);E179Q(配列番号141);E179R(配列番号142);E179W(配列番号143);E179Y(配列番号144);R219C(配列番号145);R219D(配列番号146);R219E(配列番号147);R219F(配列番号148);R219G(配列番号149);R219H(配列番号150);R219I(配列番号151);R219L(配列番号152);R219M(配列番号153);R219P(配列番号154);R219S(配列番号155);R219T(配列番号156);R219V(配列番号157);R219W(配列番号158);R219Y(配列番号159);L221C(配列番号160);L221D(配列番号161);L221E(配列番号162);L221F(配列番号163);L221H(配列番号164);L221I(配列番号165);L221K(配列番号166);L221M(配列番号167);L221N(配列番号168);L221P(配列番号169);L221Q(配列番号170);L221R(配列番号171);L221S(配列番号172);L221T(配列番号173);L221W(配列番号174);L221Y(配列番号175);S262C(配列番号176);S262D(配列番号177);S262E(配列番号178);S262F(配列番号179);S262G(配列番号180);S262H(配列番号181);S262I(配列番号182);S262K(配列番号183);S262L(配列番号184);S262P(配列番号185);S262Q(配列番号186);S262R(配列番号187);S262T(配列番号188);S262W(配列番号189);S262Y(配列番号190);H264C(配列番号191);H264D(配列番号192);H264E(配列番号193);H264F(配列番号194);H264I(配列番号195);H264K(配列番号196);H264L(配列番号197);H264M(配列番号198);H264P(配列番号199);H264R(配列番号200);H264S(配列番号201);H264T(配列番号202);H264V(配列番号203);H264W(配列番号204);H264Y(配列番号205);S266A(配列番号206);S266C(配列番号207);S266D(配列番号208);S266E(配列番号209);S266F(配列番号210);S266G(配列番号211);S266H(配列番号212);S266I(配列番号213);S266K(配列番号214);S266L(配列番号215);S266M(配列番号216);S266N(配列番号217);S266P(配列番号218);S266Q(配列番号219);S266R(配列番号220);S266T(配列番号221);S266V(配列番号222);S266W(配列番号223);S266Y(配列番号224);K267A(配列番号225);K267C(配列番号226);K267D(配列番号227);K267E(配列番号228);K267F(配列番号229);K267G(配列番号230);K267H(配列番号231);K267I(配列番号232);K267L(配列番号233);K267M(配列番号234);K267N(配列番号235);K267P(配列番号236);K267Q(配列番号237);K267R(配列番号238);K267S(配列番号239);K267T(配列番号240);K267V(配列番号241);K267W(配列番号242);K267Y(配列番号243);V296A(配列番号244);V296C(配列番号245);V296D(配列番号246);V296E(配列番号247);V296F(配列番号248);V296G(配列番号249);V296H(配列番号250);V296I(配列番号251);V296K(配列番号252);V296L(配列番号253);V296M(配列番号254);V296N(配列番号255);V296P(配列番号256);V296Q(配列番号257);V296R(配列番号258);V296S(配列番号259);V296T(配列番号260);V296W(配列番号261);およびV296Y(配列番号262)。
下記修飾は、ADA2において非自然グリコシル化を導入する。N連結されたグリコシル化部位などの非自然グリコシル化部位の導入は、安定性および薬物動態プロファイルの増加を付与し得る。したがって、下記ADA2変異体は、ADA2の過グリコシル化を達成して、投与されるADA2の安定性および薬物動態プロファイルを増加することができる:
−−→N1/−−→A2/−−→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405SおよびG404N/P406S。
−−→N1/−−→A2/−−→S3(配列番号274)、R20N/V22S(配列番号275)、K371N/D373S(配列番号276)、K372N/I374S(配列番号277)、T403N/H405S(配列番号278)およびG404N/P406S(配列番号279)。
下記変異体は、修飾PRBドメインを含有する。PRBドメインの修飾として、PRBドメインの全てもしくは一部の欠失(すなわち、PRBドメインの1以上の残基の欠失)、PRBドメインへの1つもしくは複数のアミノ酸残基の挿入、PRBドメインの1つもしくは複数の残基のアミノ酸置き換えまたはそれらの組合せが挙げられ得る。例えば、PRBドメインの欠失および/または置換は、活性の変更、受容体への結合および/または受容体により媒介される活性の低減を付与し得る。
C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);C105−T147del→(Gly)15;C105−T147del→(Gly)10;C105−T147del→(Gly)7;C105−T147del→(Gly)5;C105−T147del→(Gly)3;N98−N156del;C105−E148del;C105−T147del;V99−Q144del;V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);V99−Q144del→(GGGGS)1;V99−Q144del→(GGGGS)2;V99−Q144del→(GGGGS)3;C105−T147del→(GGGGS)1;C105−T147del→(GGGGS)2;およびC105−T147del→(GGGGS)3。
C105−T147del→(Gly)n(配列番号280);C105−T147del→(Gly)15(配列番号281);C105−T147del→(Gly)10(配列番号282);C105−T147del→(Gly)7(配列番号283);C105−T147del→(Gly)5(配列番号284);C105−T147del→(Gly)3(配列番号285);N98−N156del(配列番号548);C105−E148del(配列番号549);C105−T147del(配列番号550);V99−Q144del(配列番号579);V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号581);C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号582);V99−Q144del→(GGGGS)1(配列番号583);V99−Q144del→(GGGGS)2(配列番号584);V99−Q144del→(GGGGS)3(配列番号585);C105−T147del→(GGGGS)1(配列番号586);C105−T147del→(GGGGS)2(配列番号587);およびC105−T147del→(GGGGS)3(配列番号588)
下記修飾は、PRBドメインにおいて非自然グリコシル化部位を導入することができる。PRBドメインにおけるN連結されたグリコシル化部位などの非自然グリコシル化部位の導入は、安定性および薬物動態プロファイルおよび/または他の活性の増加、例えば受容体への結合の低減を付与し得る。したがって、下記ADA2変異体は、PRBドメインにおいてADA2の過グリコシル化を達成して、受容体結合を低減させて、投与されるADA2の安定性および薬物動態プロフィールを増加させることができる:
R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139TおよびP111N/G113S。
R125N/P126A(配列番号552);S127N/K129S(配列番号553);P126N/E128T(配列番号554);R112N/I114T(配列番号555);I134N/L135C/L136T(配列番号556);I134N/L135S/L136T(配列番号557);R142N/Q144S(配列番号558);E137N/Y139T(配列番号559);およびP111N/G113S(配列番号560)。
下記修飾は、PRBドメインとADA2の残余(アデノシンデアミナーゼ(ADA)ドメイン)との間の相互作用の変更を付与し得る。PRBドメインとADAドメインなどのADA2の残余との間の相互作用を変更させることにより、活性、例えばアデノシンデアミナーゼ活性の増加および受容体結合の低減を付与し得る:
F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124AおよびP124S。
F119S(配列番号561);F119K(配列番号562);Y224R(配列番号563);Y224N(配列番号564);Y191S(配列番号565);Y191D(配列番号566);F183K(配列番号567);Y191D/Y224R(配列番号568);F109S(配列番号569);F109A(配列番号570);R118D(配列番号571);R118A(配列番号572);Y139T(配列番号573);Y139A(配列番号574);W133S(配列番号575);W133T(配列番号576);P124A(配列番号577);およびP124S(配列番号578)。
下記変異体は、R219Qおよび/またはS262Nなどのアデノシンに関する触媒効率(kcat/KM)の改善を達成する修飾を、非自然グリコシル化部位を導入する突然変異と組み合わせる:
R219Q/S262N/−−→N1/−−→A2/−−→S3、R219Q/S262N/R20N/V22S、R219Q/S262N/K371N/D373S、R219Q/S262N/K372N/I374S、R219Q/S262N/T403N/H405SおよびR219Q/S262N/G404N/P406S。
R219Q/S262N/−−→N1/−−→A2/−−→S3(配列番号596);R219Q/S262N/R20N/V22S(配列番号597);R219Q/S262N/K371N/D373S(配列番号598);R219Q/S262N/K372N/I374S(配列番号599);R219Q/S262N/T403N/H405S(配列番号600);およびR219Q/S262N/G404N/P406S(配列番号601)。
下記変異体は、R219Qおよび/またはS262Nなどのアデノシンに関する触媒効率(kcat/KM)の改善を達成する修飾を、PRBドメインにおいて非自然グリコシル化部位を導入する修飾と組み合わせる:
R219Q/S262N/R125N/P126A;R219Q/S262N/S127N/K129S;R219Q/S262N/P126N/E128T;R219Q/S262N/R112N/I114T;R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T;R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T;R219Q/S262N/R142N/Q144S;R219Q/S262N/E137N/Y139T;およびR219Q/S262N/P111N/G113S。
R219Q/S262N/R125N/P126A(配列番号607);R219Q/S262N/S127N/K129S(配列番号608);R219Q/S262N/P126N/E128T(配列番号609);R219Q/S262N/R112N/I114T(配列番号610);R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T(配列番号611);R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T(配列番号612);R219Q/S262N/R142N/Q144S(配列番号613);R219Q/S262N/E137N/Y139T(配列番号614);およびR219Q/S262N/P111N/G113S(配列番号615)。
下記変異体は、R219Qおよび/またはS262Nなどのアデノシンに関する触媒効率(kcat/KM)の改善を達成する修飾を、PRBドメインとADA2の残部(例えば、アデノシンデアミナーゼ(ADA)ドメイン)との間の相互作用を変更させる修飾と組み合わせる:
R219Q/S262N/F119S;R219Q/S262N/F119K;R219Q/S262N/Y224R;R219Q/S262N/Y224N;R219Q/S262N/Y191S;R219Q/S262N/Y191D;R219Q/S262N/F183K;R219Q/S262N/Y191D/Y224R;R219Q/S262N/F109S;R219Q/S262N/F109A;R219Q/S262N/R118D;R219Q/S262N/R118A;R219Q/S262N/Y139T;R219Q/S262N/Y139A;R219Q/S262N/W133S;R219Q/S262N/W133T;R219Q/S262N/P124A;およびR219Q/S262N/P124S。
R219Q/S262N/F119S(配列番号616);R219Q/S262N/F119K(配列番号617);R219Q/S262N/Y224R(配列番号618);R219Q/S262N/Y224N(配列番号619);R219Q/S262N/Y191S(配列番号620);R219Q/S262N/Y191D(配列番号621);R219Q/S262N/F183K(配列番号622);R219Q/S262N/Y191D/Y224R(配列番号623);R219Q/S262N/F109S(配列番号624);R219Q/S262N/F109A(配列番号625);R219Q/S262N/R118D(配列番号626);R219Q/S262N/R118A(配列番号627);R219Q/S262N/Y139T(配列番号628);R219Q/S262N/Y139A(配列番号629);R219Q/S262N/W133S(配列番号630);R219Q/S262N/W133T(配列番号631);R219Q/S262N/P124A(配列番号632);およびR219Q/S262N/P124S(配列番号633)。
下記変異体は、R219Qおよび/またはS262Nなどのアデノシンに関する触媒効率(kcat/KM)の改善を達成する修飾および/またはK371Dなどのヘパリン結合の低減を付与する修飾を、PRBドメインにおける修飾、例えば欠失、挿入、置換および/または置き換えと組み合わせる:
K371D/V99−Q144del→(GGGGS)1;K371D/V99−Q144del→(GGGGS)2;K371D/V99−Q144del→(GGGGS)3;K371D/C105−T147del→(GGGGS)1;K371D/C105−T147del→(GGGGS)2;K371D/C105−T147del→(GGGGS)3;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)15;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)10;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)7;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)5;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)3;R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)1;R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)2;R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)3;R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)1;R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)2;R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)3;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)1;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)2;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)3;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)1;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)2;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)3;K371D/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);K371D/C105−T147del→(Gly)15;K371D/C105−T147del→(Gly)10;K371D/C105−T147del→(Gly)7;K371D/C105−T147del→(Gly)5;K371D/C105−T147del→(Gly)3;K371D/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);K371D/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);K371D/N98−N156del;K371D/C105−E148del;K371D/C105−T147del;K371D/V99−Q144del;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/S262N/N98−N156del;R219Q/S262N/C105−E148del;R219Q/S262N/C105−T147del;R219Q/S262N/V99−Q144del;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)15;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)10;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)7;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)5;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)3;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/S262N/K371D/N98−N156del;R219Q/S262N/K371D/C105−E148del;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del;R219Q/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);R219Q/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/N98−N156del;R219Q/C105−E148del;R219Q/C105−T147del;R219Q/V99−Q144del;S262N/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);S262N/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);S262N/N98−N156del;およびS262N/C105−E148del;S262N/C105−T147del;およびS262N/V99−Q144del。
K371D/V99−Q144del→(GGGGS)1(配列番号589);K371D/V99−Q144del→(GGGGS)2(配列番号590);K371D/V99−Q144del→(GGGGS)3(配列番号591);K371D/C105−T147del→(GGGGS)1(配列番号592);K371D/C105−T147del→(GGGGS)2(配列番号593);K371D/C105−T147del→(GGGGS)3(配列番号594);R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)15(配列番号602);R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)10(配列番号603);R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)7(配列番号604);R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)5(配列番号605);R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)3(配列番号606);R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)1(配列番号634);R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)2(配列番号635);R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)3(配列番号636);R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)1(配列番号637);R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)2(配列番号638);R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)3(配列番号639);R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)1(配列番号640);R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)2(配列番号641);R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)3(配列番号642);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)1(配列番号643);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)2(配列番号644);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)3(配列番号645);K371D/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20)(配列番号646);K371D/C105−T147del→(Gly)15(配列番号647);K371D/C105−T147del→(Gly)10(配列番号648);K371D/C105−T147del→(Gly)7(配列番号649);K371D/C105−T147del→(Gly)5(配列番号650);K371D/C105−T147del→(Gly)3(配列番号651);K371D/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号652);K371D/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号653);K371D/N98−N156del(配列番号654);K371D/C105−E148del(配列番号655);K371D/C105−T147del(配列番号656);K371D/V99−Q144del(配列番号657);R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20)(配列番号658);R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号664);R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号665);R219Q/S262N/N98−N156del(配列番号666);R219Q/S262N/C105−E148del(配列番号667);R219Q/S262N/C105−T147del(配列番号668);R219Q/S262N/V99−Q144del(配列番号669);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20)(配列番号670);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)15(配列番号671);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)10(配列番号672);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)7(配列番号673);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)5(配列番号674);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)3(配列番号675);R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号676);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号677);R219Q/S262N/K371D/N98−N156del(配列番号678);R219Q/S262N/K371D/C105−E148del(配列番号679);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del(配列番号680);R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del(配列番号681);R219Q/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20)(配列番号918);R219Q/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号919);R219Q/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号920);R219Q/N98−N156del(配列番号921);R219Q/C105−E148del(配列番号922);R219Q/C105−T147del(配列番号923);R219Q/V99−Q144del(配列番号924);S262N/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20)(配列番号925);S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号926);S262N/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5)(配列番号927);S262N/N98−N156del(配列番号928);S262N/C105−E148del(配列番号929);S262N/C105−T147del(配列番号930);およびS262N/V99−Q144del(配列番号931)。
下記変異体は、R219Qおよび/またはS262Nなどのアデノシンに関する触媒効率(kcat/KM)の改善を達成する修飾、K371Dなどのヘパリン結合の低減を付与する修飾および他の修飾などの各種修飾を組み合わせる:
K11A/R20A;K11A/R20A/K371A;R20A/K371A;K11A/K371A;S262N/K371D;S262N/K371E;S262N/R20E;S262N/R20E/K371D;S262N/R20E/K371E;R219Q/K371E;R219Q/K371D;R219Q/R20E;R219Q/K371E/R20E;R219Q/K371D/R20E;R219Q/S262N/K371E;R219Q/S262N/K371D;R219Q/S262N/R20E;R219Q/S262N/K371E/R20E;R219Q/S262N/K371D/R20E;R219Q/S262N;R219Q/S262N/K11A;R219Q/S262N/K11D;R219Q/S262N/K11E;R219Q/S262N/K13A;R219Q/S262N/K13D;R219Q/S262N/K13E;R219Q/S262N/K371A;R219Q/S262N/K372A;R219Q/S262N/K372D;R219Q/S262N/K372E;R219Q/S262N/K452A;R219Q/S262N/K452D;R219Q/S262N/K452E;R219Q/S262N/R20A;R219Q/S262N/R20D;R219Q/S262N/R366A;R219Q/S262N/R366D;R219Q/S262N/R366E;R219Q/S262N/H264A;R219Q/S262N/H264Q;R219Q/S262N/H264N;R219Q/S262N/H264G;R219K/S262N;R219N/S262N;R219A/S262N;R219Q/S262N/L221A;R219Q/S262N/L221V;R219Q/S262N/L221G;R219Q/S262N/E179D;R219Q/S262N/E179A;R219Q/S262N/E179S;R219Q/S262N/E179T;R219Q/S262N/E179V;R219Q/S262N/E179G;R219Q/S262A;R219Q/S262V;R219Q/S262M;R219Q/S262N/K11A/R20A;R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A;R219Q/S262N/R20A/K371A;R219Q/S262N/K11A/K371A;R219Q/S262N/K26A;R219Q/S262N/K26D;R219Q/S262N/K26E;R219Q/S262N/R217A;R219Q/S262N/R217D;R219Q/S262N/R217E;R219Q/S262N/K258A;R219Q/S262N/K258D;R219Q/S262N/K258E;R219Q/S262N/R277A;R219Q/S262N/R277D;R219Q/S262N/R277E;R219Q/S262N/R283A;R219Q/S262N/R283D;R219Q/S262N/R283E;R219Q/S262N/K309A;R219Q/S262N/K309D;R219Q/S262N/K309E;R219Q/S262N/K317A;R219Q/S262N/K317D;R219Q/S262N/K317E;R219Q/S262N/K321A;R219Q/S262N/K321D;R219Q/S262N/K321E;R219Q/S262N/R352A;R219Q/S262N/R352D;R219Q/S262N/R352E;R219Q/S262N/R441A;R219Q/S262N/R441D;R219Q/S262N/R441E;R219Q/S262N/K444A;R219Q/S262N/K444D;R219Q/S262N/K444E;R219Q/S262N/K461A;R219Q/S262N/K461D;R219Q/S262N/K461E;R219Q/S262N/K469A;R219Q/S262N/K469D;R219Q/S262N/K469E;R219Q/S262N/K470A;R219Q/S262N/K470D;R219Q/S262N/K470E;R219Q/S262N/D86A;R219Q/S262N/D86C;R219Q/S262N/D86E;R219Q/S262N/D86F;R219Q/S262N/D86G;R219Q/S262N/D86H;R219Q/S262N/D86I;R219Q/S262N/D86K;R219Q/S262N/D86L;R219Q/S262N/D86M;R219Q/S262N/D86N;R219Q/S262N/D86P;R219Q/S262N/D86Q;R219Q/S262N/D86R;R219Q/S262N/D86S;R219Q/S262N/D86T;R219Q/S262N/D86V;R219Q/S262N/D86W;R219Q/S262N/D86Y;R219Q/S262N/E179C;R219Q/S262N/E179F;R219Q/S262N/E179H;R219Q/S262N/E179I;R219Q/S262N/E179K;R219Q/S262N/E179L;R219Q/S262N/E179M;R219Q/S262N/E179N;R219Q/S262N/E179P;R219Q/S262N/E179Q;R219Q/S262N/E179R;R219Q/S262N/E179W;R219Q/S262N/E179Y;R219C/S262N;R219D/S262N;R219E/S262N;R219F/S262N;R219G/S262N;R219H/S262N;R219I/S262N;R219L/S262N;R219M/S262N;R219P/S262N;R219S/S262N;R219T/S262N;R219V/S262N;R219W/S262N;R219Y/S262N;R219Q/S262N/L221C;R219Q/S262N/L221D;R219Q/S262N/L221E;R219Q/S262N/L221F;R219Q/S262N/L221H;R219Q/S262N/L221I;R219Q/S262N/L221K;R219Q/S262N/L221M;R219Q/S262N/L221N;R219Q/S262N/L221P;R219Q/S262N/L221Q;R219Q/S262N/L221R;R219Q/S262N/L221S;R219Q/S262N/L221T;R219Q/S262N/L221W;R219Q/S262N/L221Y;R219Q/S262C;R219Q/S262D;R219Q/S262E;R219Q/S262F;R219Q/S262G;R219Q/S262H;R219Q/S262I;R219Q/S262K;R219Q/S262L;R219Q/S262P;R219Q/S262Q;R219Q/S262R;R219Q/S262T;R219Q/S262W;R219Q/S262Y;R219Q/S262N/H264C;R219Q/S262N/H264D;R219Q/S262N/H264E;R219Q/S262N/H264F;R219Q/S262N/H264I;R219Q/S262N/H264K;R219Q/S262N/H264L;R219Q/S262N/H264M;R219Q/S262N/H264P;R219Q/S262N/H264R;R219Q/S262N/H264S;R219Q/S262N/H264T;R219Q/S262N/H264V;R219Q/S262N/H264W;R219Q/S262N/H264Y;R219Q/S262N/S266A;R219Q/S262N/S266C;R219Q/S262N/S266D;R219Q/S262N/S266E;R219Q/S262N/S266F;R219Q/S262N/S266G;R219Q/S262N/S266H;R219Q/S262N/S266I;R219Q/S262N/S266K;R219Q/S262N/S266L;R219Q/S262N/S266M;R219Q/S262N/S266N;R219Q/S262N/S266P;R219Q/S262N/S266Q;R219Q/S262N/S266R;R219Q/S262N/S266T;R219Q/S262N/S266V;R219Q/S262N/S266W;R219Q/S262N/S266Y;R219Q/S262N/K267A;R219Q/S262N/K267C;R219Q/S262N/K267D;R219Q/S262N/K267E;R219Q/S262N/K267F;R219Q/S262N/K267G;R219Q/S262N/K267H;R219Q/S262N/K267I;R219Q/S262N/K267L;R219Q/S262N/K267M;R219Q/S262N/K267N;R219Q/S262N/K267P;R219Q/S262N/K267Q;R219Q/S262N/K267R;R219Q/S262N/K267S;R219Q/S262N/K267T;R219Q/S262N/K267V;R219Q/S262N/K267W;R219Q/S262N/K267Y;R219Q/S262N/V296A;R219Q/S262N/V296C;R219Q/S262N/V296D;R219Q/S262N/V296E;R219Q/S262N/V296F;R219Q/S262N/V296G;R219Q/S262N/V296H;R219Q/S262N/V296I;R219Q/S262N/V296K;R219Q/S262N/V296L;R219Q/S262N/V296M;R219Q/S262N/V296N;R219Q/S262N/V296P;R219Q/S262N/V296Q;R219Q/S262N/V296R;R219Q/S262N/V296S;R219Q/S262N/V296T;R219Q/S262N/V296W;R219Q/S262N/V296Y;R219Q/K11A/R20A;R219Q/K11A/R20A/K371A;R219Q/R20A/K371A;R219Q/K11A/K371A;S262N/K11A/R20A;S262N/K11A/R20A/K371A;S262N/R20A/K371A;およびS262N/K11A/K371A。
K11A/R20A(配列番号55);K11A/R20A/K371A(配列番号56);R20A/K371A(配列番号57);K11A/K371A(配列番号58);S262N/K371D(配列番号59);S262N/K371E(配列番号60);S262N/R20E(配列番号61);S262N/R20E/K371D(配列番号62);S262N/R20E/K371E(配列番号63);R219Q/K371E(配列番号263);R219Q/K371D(配列番号264);R219Q/R20E(配列番号265);R219Q/K371E/R20E(配列番号266);R219Q/K371D/R20E(配列番号267);R219Q/S262N/K371E(配列番号268);R219Q/S262N/K371D(配列番号269);R219Q/S262N/R20E(配列番号270);R219Q/S262N/K371E/R20E(配列番号271);R219Q/S262N/K371D/R20E(配列番号272);R219Q/S262N(配列番号273);R219Q/S262N/K11A(配列番号659);R219Q/S262N/K11D(配列番号660);R219Q/S262N/K11E(配列番号661);R219Q/S262N/K13A(配列番号662);R219Q/S262N/K13D(配列番号663);R219Q/S262N/K13E(配列番号682);R219Q/S262N/K371A(配列番号683);R219Q/S262N/K372A(配列番号684);R219Q/S262N/K372D(配列番号685);R219Q/S262N/K372E(配列番号686);R219Q/S262N/K452A(配列番号687);R219Q/S262N/K452D(配列番号688);R219Q/S262N/K452E(配列番号689);R219Q/S262N/R20A(配列番号690);R219Q/S262N/R20D(配列番号691);R219Q/S262N/R366A(配列番号692);R219Q/S262N/R366D(配列番号693);R219Q/S262N/R366E(配列番号694);R219Q/S262N/H264A(配列番号695);R219Q/S262N/H264Q(配列番号696);R219Q/S262N/H264N(配列番号697);R219Q/S262N/H264G(配列番号698);R219K/S262N(配列番号699);R219N/S262N(配列番号700);R219A/S262N(配列番号701);R219Q/S262N/L221A(配列番号702);R219Q/S262N/L221V(配列番号703);R219Q/S262N/L221G(配列番号704);R219Q/S262N/E179D(配列番号705);R219Q/S262N/E179A(配列番号706);R219Q/S262N/E179S(配列番号707);R219Q/S262N/E179T(配列番号708);R219Q/S262N/E179V(配列番号709);R219Q/S262N/E179G(配列番号710);R219Q/S262A(配列番号711);R219Q/S262V(配列番号712);R219Q/S262M(配列番号713);R219Q/S262N/K11A/R20A(配列番号714);R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A(配列番号715);R219Q/S262N/R20A/K371A(配列番号716);R219Q/S262N/K11A/K371A(配列番号717);R219Q/S262N/K26A(配列番号718);R219Q/S262N/K26D(配列番号719);R219Q/S262N/K26E(配列番号720);R219Q/S262N/R217A(配列番号721);R219Q/S262N/R217D(配列番号722);R219Q/S262N/R217E(配列番号723);R219Q/S262N/K258A(配列番号724);R219Q/S262N/K258D(配列番号725);R219Q/S262N/K258E(配列番号726);R219Q/S262N/R277A(配列番号727);R219Q/S262N/R277D(配列番号728);R219Q/S262N/R277E(配列番号729);R219Q/S262N/R283A(配列番号730);R219Q/S262N/R283D(配列番号731);R219Q/S262N/R283E(配列番号732);R219Q/S262N/K309A(配列番号733);R219Q/S262N/K309D(配列番号734);R219Q/S262N/K309E(配列番号735);R219Q/S262N/K317A(配列番号736);R219Q/S262N/K317D(配列番号737);R219Q/S262N/K317E(配列番号738);R219Q/S262N/K321A(配列番号739);R219Q/S262N/K321D(配列番号740);R219Q/S262N/K321E(配列番号741);R219Q/S262N/R352A(配列番号742);R219Q/S262N/R352D(配列番号743);R219Q/S262N/R352E(配列番号744);R219Q/S262N/R441A(配列番号745);R219Q/S262N/R441D(配列番号746);R219Q/S262N/R441E(配列番号747);R219Q/S262N/K444A(配列番号748);R219Q/S262N/K444D(配列番号749);R219Q/S262N/K444E(配列番号750);R219Q/S262N/K461A(配列番号751);R219Q/S262N/K461D(配列番号752);R219Q/S262N/K461E(配列番号753);R219Q/S262N/K469A(配列番号754);R219Q/S262N/K469D(配列番号755);R219Q/S262N/K469E(配列番号756);R219Q/S262N/K470A(配列番号757);R219Q/S262N/K470D(配列番号758);R219Q/S262N/K470E(配列番号759);R219Q/S262N/D86A(配列番号760);R219Q/S262N/D86C(配列番号761);R219Q/S262N/D86E(配列番号762);R219Q/S262N/D86F(配列番号763);R219Q/S262N/D86G(配列番号764);R219Q/S262N/D86H(配列番号765);R219Q/S262N/D86I(配列番号766);R219Q/S262N/D86K(配列番号767);R219Q/S262N/D86L(配列番号768);R219Q/S262N/D86M(配列番号769);R219Q/S262N/D86N(配列番号770);R219Q/S262N/D86P(配列番号771);R219Q/S262N/D86Q(配列番号772);R219Q/S262N/D86R(配列番号773);R219Q/S262N/D86S(配列番号774);R219Q/S262N/D86T(配列番号775);R219Q/S262N/D86V(配列番号776);R219Q/S262N/D86W(配列番号777);R219Q/S262N/D86Y(配列番号778);R219Q/S262N/E179C(配列番号779);R219Q/S262N/E179F(配列番号780);R219Q/S262N/E179H(配列番号781);R219Q/S262N/E179I(配列番号782);R219Q/S262N/E179K(配列番号783);R219Q/S262N/E179L(配列番号784);R219Q/S262N/E179M(配列番号785);R219Q/S262N/E179N(配列番号786);R219Q/S262N/E179P(配列番号787);R219Q/S262N/E179Q(配列番号788);R219Q/S262N/E179R(配列番号789);R219Q/S262N/E179W(配列番号790);R219Q/S262N/E179Y(配列番号791);R219C/S262N(配列番号792);R219D/S262N(配列番号793);R219E/S262N(配列番号794);R219F/S262N(配列番号795);R219G/S262N(配列番号796);R219H/S262N(配列番号797);R219I/S262N(配列番号798);R219L/S262N(配列番号799);R219M/S262N(配列番号800);R219P/S262N(配列番号801);R219S/S262N(配列番号802);R219T/S262N(配列番号803);R219V/S262N(配列番号804);R219W/S262N(配列番号805);R219Y/S262N(配列番号806);R219Q/S262N/L221C(配列番号807);R219Q/S262N/L221D(配列番号808);R219Q/S262N/L221E(配列番号809);R219Q/S262N/L221F(配列番号810);R219Q/S262N/L221H(配列番号811);R219Q/S262N/L221I(配列番号812);R219Q/S262N/L221K(配列番号813);R219Q/S262N/L221M(配列番号814);R219Q/S262N/L221N(配列番号815);R219Q/S262N/L221P(配列番号816);R219Q/S262N/L221Q(配列番号817);R219Q/S262N/L221R(配列番号818);R219Q/S262N/L221S(配列番号819);R219Q/S262N/L221T(配列番号820);R219Q/S262N/L221W(配列番号821);R219Q/S262N/L221Y(配列番号822);R219Q/S262C(配列番号823);R219Q/S262D(配列番号824);R219Q/S262E(配列番号825);R219Q/S262F(配列番号826);R219Q/S262G(配列番号827);R219Q/S262H(配列番号828);R219Q/S262I(配列番号829);R219Q/S262K(配列番号830);R219Q/S262L(配列番号831);R219Q/S262P(配列番号832);R219Q/S262Q(配列番号833);R219Q/S262R(配列番号834);R219Q/S262T(配列番号835);R219Q/S262W(配列番号836);R219Q/S262Y(配列番号837);R219Q/S262N/H264C(配列番号838);R219Q/S262N/H264D(配列番号839);R219Q/S262N/H264E(配列番号840);R219Q/S262N/H264F(配列番号841);R219Q/S262N/H264I(配列番号842);R219Q/S262N/H264K(配列番号843);R219Q/S262N/H264L(配列番号844);R219Q/S262N/H264M(配列番号845);R219Q/S262N/H264P(配列番号846);R219Q/S262N/H264R(配列番号847);R219Q/S262N/H264S(配列番号848);R219Q/S262N/H264T(配列番号849);R219Q/S262N/H264V(配列番号850);R219Q/S262N/H264W(配列番号851);R219Q/S262N/H264Y(配列番号852);R219Q/S262N/S266A(配列番号853);R219Q/S262N/S266C(配列番号854);R219Q/S262N/S266D(配列番号855);R219Q/S262N/S266E(配列番号856);R219Q/S262N/S266F(配列番号857);R219Q/S262N/S266G(配列番号858);R219Q/S262N/S266H(配列番号859);R219Q/S262N/S266I(配列番号860);R219Q/S262N/S266K(配列番号861);R219Q/S262N/S266L(配列番号862);R219Q/S262N/S266M(配列番号863);R219Q/S262N/S266N(配列番号864);R219Q/
S262N/S266P(配列番号865);R219Q/S262N/S266Q(配列番号866);R219Q/S262N/S266R(配列番号867);R219Q/S262N/S266T(配列番号868);R219Q/S262N/S266V(配列番号869);R219Q/S262N/S266W(配列番号870);R219Q/S262N/S266Y(配列番号871);R219Q/S262N/K267A(配列番号872);R219Q/S262N/K267C(配列番号873);R219Q/S262N/K267D(配列番号874);R219Q/S262N/K267E(配列番号875);R219Q/S262N/K267F(配列番号876);R219Q/S262N/K267G(配列番号877);R219Q/S262N/K267H(配列番号878);R219Q/S262N/K267I(配列番号879);R219Q/S262N/K267L(配列番号880);R219Q/S262N/K267M(配列番号881);R219Q/S262N/K267N(配列番号882);R219Q/S262N/K267P(配列番号883);R219Q/S262N/K267Q(配列番号884);R219Q/S262N/K267R(配列番号885);R219Q/S262N/K267S(配列番号886);R219Q/S262N/K267T(配列番号887);R219Q/S262N/K267V(配列番号888);R219Q/S262N/K267W(配列番号889);R219Q/S262N/K267Y(配列番号890);R219Q/S262N/V296A(配列番号891);R219Q/S262N/V296C(配列番号892);R219Q/S262N/V296D(配列番号893);R219Q/S262N/V296E(配列番号894);R219Q/S262N/V296F(配列番号895);R219Q/S262N/V296G(配列番号896);R219Q/S262N/V296H(配列番号897);R219Q/S262N/V296I(配列番号898);R219Q/S262N/V296K(配列番号899);R219Q/S262N/V296L(配列番号900);R219Q/S262N/V296M(配列番号901);R219Q/S262N/V296N(配列番号902);R219Q/S262N/V296P(配列番号903);R219Q/S262N/V296Q(配列番号904);R219Q/S262N/V296R(配列番号905);R219Q/S262N/V296S(配列番号906);R219Q/S262N/V296T(配列番号907);R219Q/S262N/V296W(配列番号908);R219Q/S262N/V296Y(配列番号909);R219Q/K11A/R20A(配列番号910);R219Q/K11A/R20A/K371A(配列番号911);R219Q/R20A/K371A(配列番号912);R219Q/K11A/K371A(配列番号913);S262N/K11A/R20A(配列番号914);S262N/K11A/R20A/K371A(配列番号915);S262N/R20A/K371A(配列番号916);およびS262N/K11A/K371A(配列番号917)。
概要
A. 定義
B. アデノシンデアミナーゼ(ADA2)およびアデノシン媒介性腫瘍免疫抑制の調節
1. 腫瘍免疫および免疫回避
2. がんおよび腫瘍微小環境(TME)におけるアデノシン免疫調節
3. がんの処置におけるアデノシンデアミナーゼおよび標的化アデノシン
C. アデノシンデアミナーゼ2(ADA2)およびその変異型
1. ADA2の構造および活性
a. ADA2の構造
b. ADA2の活性
2. ADA2変異型
a. 例示的な修飾
i. アミノ酸置き換え
ii. PRBドメインの修飾
iv. 過グリコシル化
b. 核酸分子
c. 変異型ADA2タンパク質の生成
D. ADA2コンジュゲートおよび融合タンパク質
1. 半減期延長部分
a. 低複雑性ポリペプチド
b. ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのC末端ペプチド(CTP)
c. 免疫グロブリン定常領域(Fc)またはその一部
d. アルブミンまたはその断片または変異型
e. アルブミン結合部分
f. PAS配列
g. HAP配列
h. XTEN配列
i. トランスフェリンまたはその断片
j. ポリマーコンジュゲーション
i. ポリエチレングリコール(PEG)
ii. ヒドロキシエチルデンプン(HES)
iii. ポリシアル酸(PSA)
iv. 他のポリマー
2. コンジュゲートまたは融合タンパク質を生成する方法
リンカー
i. ペプチドリンカー
ii. ヘテロ二機能性連結剤
E. ADA2およびそのポリペプチドをコードする核酸を生成する方法
1. ADA2ポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
2. 突然変異体または修飾された核酸およびコードするポリペプチドの生成
3. ベクターおよび細胞
本明細書に提供されるADA2変異型をコードおよび発現する免疫細胞
4. 発現
a. 原核生物細胞
b. 酵母細胞
c. 昆虫細胞
d. 哺乳動物細胞
e. 植物
5. 精製技術
F. ADA2の活性および物理的特性を評価する方法
1. アデノシンデアミナーゼアッセイ
2. ヘパリン結合を評価する方法
a. アフィニティアッセイ
b. ELISAアッセイ
c. ドットブロットおよび他の放射性標識ヘパリン結合アッセイ
3. 安定性を評価するための方法
a. 条件
i. 血漿中の安定性
ii. 熱安定性
iii. pHでの安定性または最適pH
iv. 他の条件
b. 物理的特性の決定
i. 酵素活性
ii. タンパク質純度のクロマトグラフィー分析
iii. 示差走査熱量測定
iv. 示差走査蛍光定量法
v. 内部蛍光分光法
vi. 円偏光二色性
vii. 動的光散乱
viii. 静的光散乱
ix. 濁度測定
x. 安定性を決定するための他の方法
4. 治療活性のアッセイ
a. インビトロ試験
b. インビボ動物モデル
i. 腫瘍代謝活性
ii. 腫瘍のサイズおよび容量
c. 臨床モニタリング
5. 薬力学/薬物動態学および耐性
G. 医薬組成物および製剤
1. 製剤−液体、注射用、エマルジョン
凍結乾燥粉末
2. 他の投与経路用の組成物
3. 投薬量および投与
4. 包装および製品
H. アデノシンデアミナーゼ2(ADA2)を用いる処置の方法
1. 例示的な疾患および状態
a. がんおよび腫瘍
b. 非がん性過剰増殖性疾患
c. 線維症
d. 感染性疾患
e. 他の疾患および状態
2. 患者選択の方法
a. アデノシン関連バイオマーカー
i. 血漿アデノシンレベル
ii. アデノシン受容体(ADR)
iii. エクトヌクレオチダーゼCD39およびCD73
b. 患者選択
3. 投薬量および投与
4. 併用療法
a. 抗がん剤
i. 抗がん抗体
ii. 化学療法剤
iii. 放射線療法
iv. 抗血管新生剤
v. 免疫チェックポイント阻害剤
(a)抗CTLA4療法
(b)抗PD−1および抗PD−L1療法
b. 他の免疫調節剤
c. ヒアルロン酸分解酵素
可溶性ヒアルロン酸分解酵素(例えば、可溶性PH20)
d. 感染性疾患を処置するための抗体
e. 抗生物質および抗真菌剤
I. 実施例
特に断らない限り、本明細書中で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の開示全体にわたって言及される特許、特許出願、公開済の出願および刊行物、ジェンバンク配列、データベース、ウェブサイトおよび他の出版物は全て、特に断らない限り、それらの全体が参照により援用される。本明細書中の用語に関して複数の定義が存在する事象では、このセクションにおける定義が優勢である。URLまたは他のかかる識別子もしくはアドレスに対して言及する場合、かかる識別子は変化することができ、インターネットに関する特定の情報が移り変わり得るが、インターネットを検索することにより、等価な情報を見出すことができることが理解されよう。それらに対する言及は、かかる情報の利用可能性および公的普及を証拠立てる。
本明細書に提供されるのは、任意のアデノシンデアミナーゼ2(ADA2)タンパク質、例としては、その変異型またはコンジュゲートを対象に投与することによって、がんまたは腫瘍などの疾患または状態を処置する方法である。細胞外アデノシンは、免疫調節などの重要な生物学的プロセスの調節を担う[Blay, J. (2012) Encyclopedia of Cancer pp.49-52]。腫瘍微小環境(TME)などの病態生理学的状態では、細胞外アデノシン濃度は、TMEの特定の部分で急激に増大し、腫瘍増殖を促進する免疫抑制ニッチを生じる。ADA2は、細胞外環境においてアデノシンレベルを調節し、それによって、アデノシンシグナル伝達およびアデノシン依存性免疫抑制に影響する。ADA2は、アデノシンをイノシンに変換することによって細胞外アデノシンレベルを増大し、TMEにおける免疫抑制効果を克服し得る。例えば、本明細書に示されるとおり、ADA2の投与は、アデノシン依存性免疫抑制を逆転し得、かつインビボにおいて腫瘍増殖を低減し得る。
がん細胞は、免疫系によって認識される腫瘍特異的抗原を含む。腫瘍免疫では、免疫系の目標は、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞およびマクロファージを含む免疫細胞の作用を通じてこれらのがん細胞を攻撃し、かつ根絶することである。例えば、CD4+およびCD8+T細胞は、それぞれ、主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはクラスII分子に対する抗原提示細胞上に提示された抗原性ペプチドの認識の際に活性化され得る。活性化されたCD8+細胞または細胞傷害性T細胞は、CD4+T細胞の存在によって補助され得る、抗原を発現する腫瘍細胞を殺傷し得る。細胞傷害性T細胞の直接殺傷効果に加えて、T細胞はまた、種々のサイトカインおよびケモカインを生成し得、これが腫瘍微小環境に対して、好中球、マクロファージまたはNK細胞などの他のエフェクター免疫細胞を補充し得る。NK細胞はまた、がん細胞を直接殺傷し得る。
アデノシン(アデニン−9−β−D−リボフラノシド;Ado)は、細胞エネルギー代謝に広範に関与するアデニンヌクレオチド(AMP、ADPおよびATP)の一部として存在し、多くのプロセスにおいて前駆体分子として作用するヌクレオシドである。アデノシンは、細胞の内側および外側の両方で遊離型で存在し得る。
アデノシンのレベルは、アデノシンをイノシンへまたは2’−デオキシアデノシンを2’−デオキシイノシンに変換する酵素である、アデノシンデアミナーゼ(ADA)の作用によって調節され得る。具体的には、ADAは、アデノシンまたはデオキシアデノシンのいずれかを、水の存在下で、イノシンまたはデオキシイノシンおよびアンモニアに以下のとおり変換する:アデノシン+H2O=イノシン+NH3または2’−デオキシアデノシン+H2O=2’−デオキシイノシン+NH3。局所腫瘍微小環境におけるアンモニアの増大は、pHを増大し得る。
本明細書に提供されるのは、野性型ヒトADA2、ADA2変異型および/またはコンジュゲートまたはそれらの他の修飾型を含む、アデノシンデアミナーゼ2(ADA2)を用いる処置の方法である。本明細書に提供されるのは、特性が変更されているADA2の変異型である。ADA2は、腫瘍微小環境中または炎症の場合などの、アデノシン依存性の免疫調節または他のアデノシン依存性の活性の調節が必要である環境中でアデノシンレベルを調節するために用いてもよい。
アデノシンデアミナーゼは、アデノシンをイノシンに変換する酵素である。3つの公知のADAである、ADA1、ADA2およびADA3が存在するが、ADA3の活性は、未知である。公知のアデノシンデアミナーゼ活性を有するタンパク質に関して、ヒトは、ADA2およびADA1の両方を有するが、ハエでは、ADA2のホモログ(ADGFホモログとして知られる)は、唯一の活性なアデノシンデアミナーゼ酵素であり、げっ歯類は、ADA1のみを有し、これは、2つのタンパク質が、重複するがまた別個の機能を有することを示している。別個の機能は、酵素活性の発現、細胞位置および動態学的特性の相違、他の構造的特徴の相違、ならびに追加の増殖因子およびヘパリン結合特性に関する[Zavialov et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。
ADA2はまた、樹状細胞由来増殖因子(DCDGF)またはアデノシンデアミナーゼ増殖因子(ADGF)としても公知であり、タンパク質のアデノシンADGFファミリーのメンバーである。ADA2は、真核生物でおよび主には多細胞生物体でのみ見出される。対照的に、ADA1は、原核生物および真核生物の両方で見出される。具体的には、ADA2/ADGFホモログは、昆虫および他の脊椎動物、例えば、Xenopus laevisで、同様にヒトで特徴付けられた。昆虫におけるADGFファミリーのタンパク質は、最初、増殖因子活性を有するタンパク質として特定され、後には、アデノシンデアミナーゼ活性を保有することも見出された。
ADA2は、いくつかの活性を有する。ADA2は、アデノシンデアミナーゼ(ADA)活性を有し、この活性は、アデノシンをイノシン(アデノシン+H2O=イノシン+NH3)および2’−デオキシアデノシンを2’−デオキシイノシン(2’−デオキシアデノシン+H2O=2’−デオキシイノシン+NH3)反応に触媒する。コホルマイシンおよび2’−デオキシコホルマイシンは、ADA1およびADA2の強力な阻害剤である。しかし、基質結合ポケットにおける相違に起因して、阻害剤(+)−エリスロ−9−(2−ヒドロキシ−3−ノニル)アデニン(EHNA)は選択的に、ADA1を阻害するが、ADA2は阻害しない。また、基質結合ポケットにおける相違は、ADA1とADA2との間の基質結合親和性の相違を説明する。例えば、アデノシンに対するkcat値は、ADA2およびADA1における触媒性残基の高い構造的類似性に起因して同様であるが、アデノシンについてのKmは異なる。アデノシンについてのADA2のKmは、約2.25mMである。ADA2は、基質結合のための疎水性サブポケットを有するので、基質に対するADA2の親和性は、ADA1の親和性とは異なる。アデノシンに対するADA2のKmは、ADA1のもの(約0.1mM)よりも約100倍高い。
本明細書に提供されるのは、参照または未修飾のADA2に比較して1以上のアミノ酸修飾(すなわち、アミノ酸配列の変化)を含むポリペプチドを含んでいるADA2の変異型または突然変異体である。その修飾は、参照ADA2が既にその修飾された位置でアミノ酸変化を含まない限り、任意の参照または未修飾のADA2ポリペプチドにあってもよい。例えば、この修飾は、ADA2ポリペプチド中にあってもよく、このポリペプチドは、配列番号5または326〜336、338〜342、375もしくは380〜383のいずれかに記載するアミノ酸の配列、その触媒活性断片、あるいは配列番号5または326〜336、338〜342、375もしくは380〜383のいずれかに対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列またはその触媒活性断片を含むが、修飾は含まない。
i. アミノ酸置き換え
一例では、修飾は、アミノ酸置き換えであってもよい。本明細書に提供されるのは、配列番号5に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸残基11、13、20、22、26、86、109、118、119、124、133、139、179、183、191、217、219、221、224、258、262、264、266、267、277、283、296、309、317、321、352、366、371、372、373、374、403、404、405、406、441、444、452、461、469または470に相当するアミノ酸位置でADA2ポリペプチド中に1以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ADA2ポリペプチドである。例えば、アミノ置き換えは、配列番号5に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸残基K11、K13、R20、V22、K26、D86、F109、R118、F119、P124、W133、Y139、E179、F183、Y191、R217、R219、L221、Y224、K258、S262、H264、S266、K267、R277、R283、V296、K309、K317、K321、R352、R366、K371、K372、D373、I374、T403、G404、H405、P406、R441、K444、K452、K461、K469またはK470に相当するアミノ酸位置であってもよい。
他の例では、また本明細書に提供されるのは、修飾されたPRBドメインを含む修飾されたADA2ポリペプチドである。PRBドメインは、触媒活性には必要ではなく、したがって、本明細書に示されるとおり、除去されてもよく、その結果、ADA2によって媒介される、デアミナーゼ活性以外のADA2変異型タンパク質活性は、軽減されるかまたは排除される。ADA2の報告されたドメイン組織化によれば、PRBドメインは、配列番号5に記載する成熟ADA2の残基98〜156または105〜148に相当する。PRBドメインの修飾は、PRBドメインの全てまたは一部の欠失(すなわち、PRBドメインの1以上の残基の欠失)、PRBドメインへの1以上のアミノ酸残基の挿入、PRBドメインの1以上の残基のアミノ酸置き換えまたはそれらの組合せであって、それによって、受容体に対するドメインの結合もしくはその他の活性を低減もしくは阻害するそれらの組合せを包含し得る。例えば、PRBドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58もしくは59または最大でその値またはほぼその値の修飾位置、例えば、一般には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43もしくは44または最大でその値またはほぼその値の修飾位置を含んでもよい。
さらに他の例では、また本明細書に提供されるのは、PRBドメインと残りのADA2(例えば、アデノシンデアミナーゼ(ADA)ドメイン)との間の相互作用の変化を付与するアミノ酸置換を含む修飾されたADA2ポリペプチドである。例えば、ADA2の報告されたドメイン組織化によれば、PRBドメインは、配列番号5に記載する成熟ADA2の残基98〜156または105〜148に相当する。本明細書に提供されるのは、配列番号5に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸残基109、118、119、124、133、139、183、191または224に相当するアミノ酸位置でADA2ポリペプチド中に1以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ADA2ポリペプチドである。例えば、アミノ置き換えは、配列番号5に記載するアミノ酸残基に関して、アミノ酸残基F109、R118、F119、P124、W133、Y139、F183、Y191またはY224に対応するアミノ酸位置であってもよい。各々の位置での修飾またはそれらの組合せは、ADAドメインなどの、ADA2中のPRBドメインと他のドメインとの間の相互作用を変更し得る。
本明細書に提供される変異型ADA2の中に含まれるのは、未修飾のADA2と比較してグリコシル化のレベルおよび/または種類を変更することによって改変されたADA2
である。グリコシル化は、未修飾のADA2ポリペプチドと比較して増大されてもよくまたは低下されてもよい。いくつかの場合には、グリコシル化のレベルまたは程度は、増大され、過グリコシル化されたADA2ポリペプチドまたはタンパク質が生じる。これは、例えば、未修飾のADA2ポリペプチドまたは炭水化物が連結されるタンパク質中で見出されない少なくとも1つの天然でないグリコシル化部位の組込みによって達成され得る。過グリコシル化されたADA2ポリペプチドはまた、未修飾のADA2ポリペプチド中で見出されたがグリコシル化されていない少なくとも1つの天然のグリコシル化部位に対する炭水化物部分の連結によって生成されてもよい。
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される任意の変異型ADA2ポリペプチドをコードする核酸分子である。本明細書に提供される任意の変異型ADA2ポリペプチドをコードする修飾された核酸分子は、本明細書に提供される修飾に相当するコドン変化(例えば、1以上のヌクレオチドの置き換えもしくは置換、挿入もしくは付加または欠失)を含む。本明細書の修飾されたアミノ酸の例証に基づいてこのようなコドン変化を特定することは、種々のアミノ酸に相当するコドンに精通している、当業者の水準の範囲内である。特定の例では、核酸配列は、例えば、コードされた配列の発現レベルを増大するために、最適化されたコドンであり得る。特定のコドン用法は、修飾されたポリペプチドが発現される宿主生物体に依存する。当業者は、哺乳動物またはヒト細胞中で、例えば、エシュリキア・コリまたはサッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)を含む、細菌または酵母の発現のための最適コドンについて精通している。例えば、コドン用法の情報は, kazusa.or.jp.codonで利用可能なCodon Usage Detabaseから入手可能である[データベースの詳細については、例えば、Richmond(2000)Genome Biology,1:241を参照のこと]。また、Forsburg(2004)Yeast,10:1045-1047;Brown et al.(1991)Nucleic Acids Research, 19:4298;Sharp et al.(1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211;Sharp et al.(1991) Yeast, 657-78も参照のこと。ADA2ポリペプチドの発現および産生のための核酸分子を含むベクターが提供される。
本明細書に提供される変異型ADA2ポリペプチドおよびコードする核酸分子は、当業者に公知の標準的な組換えDNA技術によって生成され得る。標的タンパク質中で任意の1以上のアミノ酸の突然変異を達成するために当該分野で公知の任意の方法を使用してもよい。方法は、コードする核酸分子の標準の部位指向性もしくはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法を包含する。具体的には、ペプチド合成に続いてペプチド連結を含む全化学合成法を使用してもよい。ADA2ポリペプチドをコードする核酸分子を、突然変異誘発、例えば、コードする核酸のランダム突然変異誘発、エラープローンPCR、部位指向性突然変異誘発(例えば、キット、例えば、Stratageneから入手可能なQuikChangeなどのキット)、オーバーラップPCR、遺伝子シャッフリングまたは他の組換え方法に供してもよい。次いで、ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入して、異種で発現させてもよい。いくつかの例では、変異型ADA2ポリペプチドを、全化学合成、固相または溶液相ペプチド合成などを用いて、合成的に生成する。
本明細書に提供されるいずれかを含む、任意のADA2分子は、1以上の異種部分に対して直接または間接的にコンジュゲートされてもよい。ADA2は、対立遺伝子および種変異型を含む、野性型ADA2であってもよくまたは本明細書において、上記でセクションC.2に記載される任意の変異型であってもよい。コンジュゲート中のADA2分子は、単量体または二量体、例えば、ヘテロ二量体またはホモ二量体であってもよい。典型的には、コンジュゲート中のADA2はホモ二量体である。異種部分は、二量体の一方のポリペプチドサブユニットにコンジュゲートされてもよくまたは両方のポリペプチドサブユニットにコンジュゲートされてもよい。
異種部分の非限定的な例としては、ADA2分子に対してコンジュゲートされるかまたは連結された(直接または間接的に)場合、遊離のまたはコンジュゲートされていないADA2と比較して、インビボおよび/またはインビトロの半減期の延長を付与する部分が挙げられる。本明細書に提供される任意のADA2の半減期は、当業者に公知のおよび/または本明細書に記載の任意の方法、例えば、アデノシンデアミナーゼ活性アッセイによって決定され得る。このような半減期延長部分の例は、以下の小区分に記載される。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、低い組成上および/または構造上の複雑性を有するポリペプチド(例えば、生理学的条件下で溶液中で二次構造も三次構造もない無秩序なポリペプチド)である少なくとも1つの異種部分に対して直接または間接的に連結されるADA2を含んでもよい。一例では、低い複雑性のポリペプチド配列は、構造化されていない親水性のアミノ酸ポリマーからできている。この低い複雑性のポリペプチドは、例えば、タンパク質が、HPLC精製などの高い温度または厳しい条件に供される場合、有益な特性を提供し得る。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットの1つのC末端ペプチド(CTP)またはその断片、変異型、もしくは誘導体を含む異種部分に対して直接または間接的に結合されるADA2を含んでもよい。組換えタンパク質に挿入された1以上のCTPペプチドは、そのタンパク質のインビボ半減期を延長することが公知である(例えば、米国特許第5,712,122号を参照のこと)。例示的なCTPペプチドとしては、DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(配列番号303)またはSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(配列番号304)が挙げられる(例えば、米国特許出願公開第2009/0087411号を参照のこと)。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、Fcドメインまたはその変異型に対して、直接または間接的に連結されているADA2を含み得る。Fcドメイン、断片、変異型および誘導体は、当業者に公知であり、例えば、各々その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第5,457,035号;米国特許出願公開第2006/0024298、国際公開WO2011/069164、WO2012/006623、WO2012/006635またはWO2012/006633に記載される。抗体由来ポリペプチドの種々の部分(Fcドメインを含む)に融合されたポリペプチドを含む融合タンパク質の調製物は、記載されており、例えば、Ashkenazi et al.(1991) PNAS 88:10535;Byrn et al.(1990)Nature, 344:667;and Hollenbaugh and Aruffo,(2002)「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins,」 in Current Protocols in Immunology, Ch. 10, pp. 10.19.1-10.19.11.を参照のこと。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、アルブミンまたはその機能的な断片を含む異種部分に対して直接または間接的に連結されるADA2を含んでもよい。ヒト血清アルブミン(HSAまたはHA)、609アミノ酸のタンパク質は、その全長型(配列番号305に記載する例示的な配列)で、血清の浸透圧のかなりの割合を担い、また内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。アルブミンは、全長アミノ酸であってもまたはその機能的な断片、変異型、誘導体もしくはアナログであってもよい。アルブミンまたはその断片もしくは変異型の例は、米国特許出願公開第2008/0194481号、同第2008/0004206号、同第2008/0161243号、同第2008/0261877または同第2008/0153751号またはPCT公開番号2008/033413、2009/058322または2007/021494(その各々が全体が参照によって本明細書に援用される)に開示される。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、アルブミン結合部分である異種部分、例えば、アルブミン結合ペプチド、細菌のアルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、脂肪酸またはそれらの任意の組合せに対して直接または間接的に連結されるADA2を含み得る。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、主にアラニンおよびセリン残基を含むかまたは主にアラニン、セリンおよびプロリン残基を含むアミノ酸配列である、PAS配列である少なくとも1つの異種部分に対して直接または間接的に連結されるADA2を包含し得る。このアミノ酸配列は、生理学的条件下でランダムコイル高次構造を形成する。したがって、PAS配列は、構築ブロック、アミノ酸ポリマーまたは配列カセット(アラニン、セリンおよびプロリンからできている)であり、これは、本明細書に提供される任意のADA2にコンジュゲートされた異種部分の一部として用いられ得る。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、グリシン−リッチなホモ−アミノ酸ポリマー(HAP)である少なくとも1つの異種部分に対して直接または間接的に連結されているADA2を包含し得る。このHAP配列は、少なくとも50アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、120アミノ酸、140アミノ酸、160アミノ酸、180アミノ酸、200アミノ酸、250アミノ酸、300アミノ酸、350アミノ酸、400アミノ酸、450アミノ酸または500アミノ酸長である、グリシンの反復性配列を包含し得る。一例では、HAP配列は、そのHAP配列に対して融合されるかまたは連結された部分の半減期を延長し得る。HAP配列の非限定的な例としては、限定するものではないが、(Gly)n(配列番号368)、(Gly4Ser)n(配列番号343)またはSer(Gly4Ser)n(配列番号595)が挙げられ、ここでnは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19,または20である。一例では、nは、20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40である。別の例では、nは、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190,または200である。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、XTEN配列、そのポリペプチドまたはその断片、変異型、もしくは誘導体を含む、少なくとも1つの異種部分に対して、直接または間接的に連結されるADA2を含んでもよい。XTEN配列は、主に小型の親水性アミノ酸から構成される、天然には存在しない、実質的に非反復性の配列を用いて伸長された長さのポリペプチド配列であって、この配列は、生理学的条件下で、低い次元のまたは非二次構造または三次構造を有する[Schellenberger et al.(2009) Nat Biotechnol. 27(12):1186-1190]。例示的なXTEN配列は、この部分に融合されたタンパク質の血漿半減期を延長する、864個のアミノ酸の構造化されていない組換えポリペプチド(配列番号373)である。異種部分として、XTEN配列は、半減期延長部分として機能し得る。さらに、XTEN配列は、限定するものではないが、薬物動態学的パラメーターの向上および溶解性の特徴を含む所望の特性を提供し得る。例えば、本明細書に提供される任意のADA2に対するXTEN配列のコンジュゲーションは、以下の有利な特性のうちの1つまたは複数を付与し得る:高次構造の可塑性、水溶性の向上、高い程度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳動物受容体に対する低い結合または流体力学的(またはストークス)半径の増大。いくつかの例では、XTEN配列は、インビボ半減期の延長または曲線下面積(AUC)の増大などの薬物動態学的特性を増大し得、それによって、本明細書に提供される任意のADA2が、インビボで維持され、かつXTEN異種部分なしの同じADA2と比較して、期間が延びてもアデノシンデアミナーゼ活性が保持される。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、トランスフェリンまたはその断片である少なくとも1つの異種部分に対して、直接または間接的に連結されるADA2を包含し得る。任意のトランスフェリンが、本明細書に提供される任意のADA2にコンジュゲートされてもよい。例えば、野性型ヒトTf(Tf)は、約75kDa(グリコシル化を除く)という679個のアミノ酸のタンパク質(配列番号320および324に記載するアミノ酸配列;GenBankアクセッション番号NP_001054.1およびAAB22049.1;配列番号319および322〜323に記載する核酸配列、GenBankアクセッション番号NM001063、M12530、XM039845およびS95936)であって、2つの主なドメインである、N末端ドメイン(約330アミノ酸)およびC末端ドメイン(約340アミノ酸)があり、これは、遺伝子複製が起源であると思われる。このNドメインは、2つのサブドメイン、N1ドメインおよびN2ドメインを含み、このCドメインは、2つのサブドメイン、C1ドメインおよびC2ドメインを含む。
本明細書に提供されるADA2コンジュゲートは、重合体分子(ポリマー)である、少なくとも1つの異種部分に対して、直接または間接的に連結されるADA2を含み得る。ポリマーの例は、例えば、ポリオール(すなわち、ポリ−OH)、ポリアミン(すなわち、ポリ−NH2)およびポリカルボキシル酸(すなわち、ポリ−COOH)およびさらなるヘテロポリマー、すなわち、1以上の種々のカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーである。適当な重合体分子の例としては、ポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリプロピレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)およびポリプロピレングリコールを含むポリアルキレングリコール(PAG)、PEG−グリシジルエーテル(Epox−PEG)、PEG−オキシカルボニルイミダゾール(CDI−PEG)分枝ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリ−D,L−アミノ酸、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、カルボキシメチル−デキストランを含むデキストラン、ヘパリン、相同的アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース、キトサンの加水分解物、デンプン、例えばヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物、バイオポリマーおよび当該分野で開示されるもの、例えば、米国特許第8,741,283および国際公開のPCT公開番号WO2007/149686に開示されるものの中から選択されるポリマー分子が挙げられる。
[R−NH]z−(ADA2)
に相当し得、ここで(ADA2)は、本明細書に記載の任意のADA2、例えば、その野性型、変異型または修飾型を表し;
NH−は、ポリマーに対する結合のために本明細書に提供されるADA2で見出されるアミノ酸のアミノ基である;
zは、正の整数、例えば、約1〜約32または1〜3、2〜4、3〜5、4〜6、5〜7、6〜8、7〜9、8〜10、9〜11、10〜12、11〜13、12〜14、13〜15、14〜16、15〜17、16〜18、17〜19、18〜20、19〜21、20〜22、21〜23、22〜24、23〜25、24〜26、25〜27、26〜28、27〜29、28〜30、29〜31または30〜32であり;
Rは、遊離型または非遊離型で本明細書に提供されるADA2に結合される、実質的に非抗原性のポリマー分子である。例示的な非抗原性の重合体の分子は、本明細書のいずれかに記載され得、かつ例えば、米国特許第8,741,283号および国際公開番号WO2007/149686において、当該分野で開示されるものであってもよい。
ポリエチレングリコール(PEG)は、生体材料、バイオテクノロジーおよび医薬において広範に用いられており、この理由は主に、PEGが、典型的には非免疫原性である生体適合性の非毒性の水溶性ポリマーであるからである(Zhao and Harris、ACS Symposium Series 680:458-72, 1997)。薬物送達の領域では、PEG誘導体は、免疫原性、タンパク質分解および腎クリアランスを低下するため、ならびに溶解度を向上するため、タンパク質に対する共有結合(すなわち、「PEG化」)において広範に用いられていた(Zalipsky、Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995)。同様に、PEGは、溶解度を向上し、毒性を低下し、生体分布を変更するために、低分子量の比較的疎水性の薬物に対して結合されていた。典型的には、PEG化薬物は、溶液として注射される。
J−O−(CH2CH2O)u−
J−O−(CH2CH2O)u−CH2C(O)−O−、
J−O−(CH2CH2O)u−CH2CH2NR−および
J−O−(CH2CH2O)u−CH2CH2SH−、
式中、uは、重合体化の程度であって、すなわち、約10〜約2,300であり;
Rは、水素、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜12分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール置換アリール、アラルキル、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシおよびC1〜6ヘテロアルコキシの中から選択され、かつ
Jは、キャッピング基、すなわち、ポリマーの末端で見出される基であって、ある面では、NH2(またはCH2CH2NH2)、H、SH(またはCH2CH2SH)、CO2H(またはCH2CO2H)、C1〜6アルキル、例えば、メチルまたは当該分野で公知の他のPEG末端活性化基の中から選択され得る。
CH3−O−(CH2CH2O)u−、CH3−O−(CH2CH2O)u−CH2C(O)−O−、
CH3−O−(CH2CH2O)u−CH2CH2NH−およびCH3−O−(CH2CH2O)u−CH2CH2SH−、
の中から選択されてもよく、
式中、uは、ポリマー部分の平均総分子量が、約2kDa〜約100kDaに及ぶような正の整数である。
−Y1−(CH2CH2O)u−CH2CH2Y1−、
−Y1−(CH2CH2O)u−CH2C(=Y2)−Y1−、
−Y1−C(=Y2)−(CH2)a1−Y3−(CH2CH2O)u−CH2CH2−Y3−(CH2)a1−C(=Y2)−Y1−、
−Y1−(CR2R3)a2−Y3−(CH2)b1−O−(CH2CH2O)b1−(CH2)b1−Y3−(CR2R3)a2−Y1−、
−Y1−(CH2CH2O)u−CH2CH2−、
−Y1−(CH2CH2O)u−CH2C(=Y2)−、
−C(=Y2)−(CH2)a1−Y3−(CH2CH2O)u−CH2CH2−Y3−(CH2)a1−C(=Y2)−および
−(CR2R3)a2−Y3−(CH2)b1−O−(CH2CH2O)u−(CH2)b1−Y3−(CR2R3)a2−、
式中、Y1およびY3は、独立して、O、S、SO、SO2、NR4または結合であり;
Y2は、O、SまたはNR5である;
R2−R5は独立して、水素、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜19分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、アリールオキシ、C1〜6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、C2〜6アルカノイル、アリールカルボニル、C2〜6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、C2〜6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、C2〜6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、C2〜6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、C2〜6置換アルカノイルオキシおよび置換アリールカルボニルオキシの中から選択され;
a1、a2およびb1は、独立してゼロまたは1〜6の正の整数、例えば、0、1または2であり;かつ
uは、約10〜約2300の整数である。
−C(=Y4)−(CH2)m−(CH2CH2O)u−、
−C(=Y4)−Y−(CH2)m−(CH2CH2O)u−、
−C(=Y4)−NR2−(CH2)m−(CH2CH2O)u−、
−CR6R7−(CH2)m−(CH2CH2O)u−
において官能化されてもよく、
式中、R2、R6およびR7は独立して、H、C1〜6アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキルおよび置換C1〜6アルキルの中から選択され;
mは、ゼロであるかまたは正の整数、例えば1または2であり、
Y4は、OまたはSであり、
uは、重合化の程度を示す。
いくつかの例では、少なくとも1つの異種部分は、ポリマー、例えば、ヒドロキシエチルデンプン(HES)またはその誘導体である。ヒドロキシエチルデンプン(HES)は、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であって、身体内でアルファ−アミラーゼによって分解される。HESは、最大で95重量%までの濃度でコーンスターチ中に存在する、炭水化物ポリマーアミロペクチンの置換誘導体である。HESは、有利な生物学的特性を示し、かつ血液代用剤としておよび血液希釈療法で臨床で用いられる。
特定の例では、少なくとも1つの異種部分はポリマー、例えば、ポリシアル酸(PSA)またはその誘導体である。ポリシアル酸(PSA)は、特定の細菌株によっておよび特定の細胞中の哺乳動物において産生されるシアル酸の天然に存在する未分岐のポリマーである[Roth J., et al.(1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A.(Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335-348]。それらは、限られた酸加水分解によってまたはノイラミニダーゼでの消化によってまたはポリマーの天然の細菌由来型の断片化によって、約80以上のシアル酸残基から約2という種々の程度の重合化で産生され得る。
他の例では、本明細書に提供される任意のADA2に対するコンジュゲーションのためのポリマー部分は、当該分野で公知であるかおよび/または米国特許第6,153,655号に記載の他のポリマーを含む1以上の事実上非抗原性の材料、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、炭水化物系のポリマー、ヒドロキシプロピルメタ−アクリルアミド(HPMA)、ポリアルキレンオキシドおよび/またはそれらのコポリマーの中から選択され得る。使用の目的に基づいてポリマーを選択し、適切なコンジュゲーション方法を選択することは当業者の水準の範囲内である。
異種部分は、本明細書に提供される任意のADA2に対して直接コンジュゲートされてもまたは間接的にコンジュゲートされてもよい。例えば、異種部分は、翻訳後方式で、ADA2ポリペプチドの組換え生成の後に、直接の化学結合によってまたはリンカーを介して間接的にコンジュゲートされてもよい。他の例では、タンパク質またはポリペプチド部分である異種部分は、本明細書に提供される任意のADA2に対して直接コンジュゲートされてもまたは間接的にコンジュゲートされてもよい。一例では、タンパク質またはポリペプチド部分は、例えば、融合タンパク質として直接連結されてもよい。他の例では、この異種部分は、間接的に、リンカーを介してコンジュゲートされる。他の例では、異種部分は、異種部分中のチオール基と、本明細書に提供されるADA2中のシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合によって連結されてもよい。
リンカーまたはスペーサーを用いて、本明細書に提供される任意のADA2などの、異種部分およびポリペプチドを接続してもよい。リンカーとは、ペプチドまたはポリペプチド配列(例えば、合成のペプチドまたはポリペプチド配列)または非ペプチドリンカー(その主な機能は、本明細書に提供されるADA2および異種部分などの2つの部分を接続することである)を指す。リンカーを用いて、個々の残基の構造的可塑性および他の高次構造的特徴をまたはポリペプチドコンジュゲートもしくは融合タンパク質のドメインもしくは部分の二次、三次または四次構造レベルで維持して、その部分の機能的特性を維持してもよい。リンカーはまた、ポリペプチドコンジュゲートまたは融合タンパク質に対して、追加の有益な特性、例えば、哺乳動物発現系におけるタンパク質発現の増大、安定性および溶解度などの生物物理学的特性の改善、タンパク質精製および検出の改善、ならびに/または酵素活性の増大を提供する。いくつかの例では,2つ以上のリンカーが、直列に連結されてもよい。リンカーは、ADA2ポリペプチドに対してタンパク質またはポリペプチドを連結するペプチドリンカーであってもよい。他の例示的なリンカーとしては、化学連結剤およびヘテロ二機能性連結剤が挙げられる。
ペプチドリンカーを用いて、本明細書に提供されるADA2ポリペプチドに対して異種部分に連結してもよい。一例では、ペプチドリンカーは、第1ポリペプチド(例えば、ADA2ポリペプチド)のC末端および第2のポリペプチド(例えば、タンパク質またはポリペプチド異種部分)のN末端に融合されてもよい。この構造を、少なくとも1つ、好ましくは2、3、4またはそれ以上のポリペプチドが、それらのそれぞれの末端でペプチドリンカーを介してお互いに連結されるように何度も繰り返してもよい。
(1)Gly4SerとNcoI末端(配列番号351)
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GCCATGG
(2)(Gly4Ser)2とNcoI末端(配列番号352)
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GGCGGCGGCG GCTCTGCCAT GG
(3)(Ser4Gly)4とNcoI末端(配列番号353)
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG
(4)(Ser4Gly)2とNcoI末端(配列番号354)
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG
本明細書に提供される任意のADA2および異種部分の連結は、直接であってもまたは間接的であってもよい。例えば、連結は、当該分野で公知であるかまたは本明細書に提供される任意のものなど、化学的連結によって達成されてもよくまたは二機能的もしくはヘテロ二機能性リンカーによって容易にされてもよい。
−C(O)CH2OCH2C(O)−;
−C(O)CH2NHCH2C(O)−;
−C(O)CH2SCH2C(O)−;
−C(O)CH2CH2CH2C(O)−および
−C(O)CH2CH2C(O)−。
を有するリンカーが挙げられる。
変異型またはその修飾型を含む、本明細書に記載の任意のADA2のポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現について当該分野で周知の方法によって得てもよい。ポリペプチドはまた化学合成されてもよい。修飾型または改変型を、標準的な組換えDNA法を用いて野性型ポリペプチドから遺伝子操作してもよい。例えば、変異型または修飾型を含む任意のADA2を、部位指向性突然変異誘発などによって、野性型ポリペプチドから遺伝子操作してもよい。
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するために当該分野で公知の任意の利用可能な方法を用いてクローニングしてもまたは単離してもよい。このような方法としては、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含む、核酸のPCR増幅およびライブラリーのスクリーニングが挙げられる。例えば、ポリペプチドが組換え手段によって生成される場合、所望の遺伝子をコードする核酸の特定について当業者に公知の任意の方法を用いてもよい。当該分野で利用可能な任意の方法を用いて、細胞または組織供給源などから、ADA2ポリペプチドをコードする全長または部分的な(すなわち、全コード領域を包含する)cDNAまたはゲノムDNAクローンを得てもよい。
本明細書に提供される修飾は、当業者に慣用的であるとおり、標準的な組換えDNA技術によって作製してもよい。標的タンパク質中の任意の1以上のアミノ酸の突然変異を達成する、当該分野で公知の任意の方法を使用してもよい。方法は、コードする核酸分子の標準の部位指向性の突然変異誘発(例えば、Stratageneから入手可能なQuikChangeなどのキットを用いる)を含むかまたは固相ポリペプチド合成法による。野性型ADA2または本明細書に提供される任意のADA2変異型に対する部位特異的な改変をまた、このような方法を用いてADA2をコードする核酸配列を生成する場合、化学的な遺伝子合成または半合成遺伝子アセンブリの間に導入してもよい。
本明細書に記載の任意のADA2ポリペプチドなどの、所望のタンパク質の1以上の組換え発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む核酸を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳について必須のエレメントを含むベクター中に挿入してもよい。必須の転写および翻訳シグナルはまた、酵素遺伝子の天然のプロモーターおよび/またはそれらの隣接領域によって提供されてもよい。
本明細書に提供される任意の修飾されたアデノシンデアミナーゼ2(ADA2)変異型は、養子免疫治療の方法で使用され得る。治療用タンパク質または他のタンパク質を発現するために修飾された免疫細胞を用いる養子免疫治療のための方法、ならびに、適宜、がんの免疫抑制効果を克服するかおよび/または特定の細胞に対して免疫細胞を標的化するために免疫応答を増大する、他のタンパク質および受容体は、当業者に周知である。したがって、提供されるのは、本明細書に提供されるADA2変異型のうちの1つまたは複数をコードする免疫細胞および特に、特定の腫瘍の免疫抑制効果を克服するために、腫瘍標的化および免疫応答を増強する適宜追加される分子である。この免疫細胞としては、限定するものではないが、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、ナチュラルキラー(NK)細胞、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞および免疫細胞、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞が挙げられる。
変異型ADA2ポリペプチドを含む任意のアデノシンデアミナーゼ2(ADA2)ポリペプチドを、インビボおよびインビトロの方法を含む、当業者に公知の任意の方法で生成してもよい。所望のタンパク質を、例えば、投与および処置に必要な量および形態など、タンパク質の必要な量および形態を生じるのに適切な任意の生物体中で発現してもよい。発現宿主としては、原核生物および真核生物、例えば、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む哺乳動物細胞が挙げられる。発現宿主は、それらのタンパク質産生のレベルおよび発現されるタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類が異なる場合がある。発現宿主の選択は、これらおよび他の要因、例えば、調節性および安全性の考慮、生成のコスト、ならびに精製の必要性および方法に基づいて行われ得る。本明細書に提供される任意のADA2はまた、インビボ発現のための発現ベクター、特に、腫瘍細胞中の発現のための腫瘍標的化または腫瘍溶解性のベクターの中にコードされてもよい。
原核生物、特に大腸菌は、大量のタンパク質を生成するための系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の簡便かつ迅速な技術である。大腸菌用の発現ベクターは、誘導性プロモーターを含んでもよく、そのようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに有用であり、宿主細胞に対してなんらかの毒性を示すタンパク質を発現させるのにも有用である。誘導性プロモーターの例としては、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6 RNAプロモーター、ならびに温度調節型λPLプロモーターなどが挙げられる。
サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母は、タンパク質(例えば本明細書に記載する任意のタンパク質)の生産に使用することができる周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターで形質転換させてもよくまたは相同組換えによる安定染色体組込みで形質転換させてもよい。典型的には、遺伝子発現を調節するために、誘導性プロモーターを用いる。そのようなプロモーターの例としては、GAL1、GAL7およびGAL5、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えばCUP1、AOX1または他のピキア(Pichia)プロモーターもしくは他の酵母プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、形質転換されたDNAを選択し維持するために、LEU2、TRP1、HIS3およびURA3などの選択マーカーを含む場合が多い。酵母中で発現されたタンパク質は、溶解性であることが多い。シャペロニン、例えば、Bipおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現により、発現レベルおよび溶解性が改善され得る。さらに、酵母中で発現されるタンパク質は、例えばサッカロミセス・セレビシェに由来する酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物およびAga2p接合付着受容体またはアークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を用いて、分泌について指示され得る。発現されたポリペプチドが分泌経路を出た時に、融合された配列が発現されたポリペプチドから除去されるように、プロテアーゼ切断部位、例えばKex−2プロテアーゼの切断部位を遺伝子操作してもよい。酵母はAsn−X−Ser/Thrモチーフでグリコシル化が可能である。
昆虫細胞、特にバキュロウイルス発現を用いるものは、任意のADA2ポリペプチドまたは変異型などのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、かつ高度の真核生物が使用する翻訳後修飾のほとんどを行うことができる。バキュロウイルスは、宿主範囲が制限されており、それによって安全性が向上し、かつ真核細胞発現に関する規制上の懸念が減少する。典型的な発現ベクターは、高レベル発現用のプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを用いる。通常用いられるバキュロウイルス系は、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス(AcNPV)およびカイコ(Bombyx mori)核多核体病ウイルス(BmNPV)などのバキュロウイルス、ならびに、例えばツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)由来のSf9、シューダレチア・ユニパンクタ(Pseudaletia unipuncta)(A7S)およびオオカバマダラ(Danaus plexippus)(DpN1)などの昆虫細胞株を含む。高レベル発現のためには、発現されるべき分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳類分泌シグナルは、昆虫細胞で正確にプロセシングされ、これらのシグナルを用いて、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌させ得る。さらに、細胞株シューダレチア・ユニパンクタ(A7S)およびオオカバマダラ(DpN1)は、哺乳動物細胞系と類似するグリコシル化パターンを持つタンパク質を産生する。
哺乳動物発現系を用いて、変異型ADA2ポリペプチドなどの任意のADA2ポリペプチドを含むタンパク質を発現してもよい。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのウイルス感染によってまたはリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランなどの直接的DNA導入によって、ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、哺乳動物細胞に導入してもよい。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、典型的には、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列(コザック(Kozak)コンセンサス配列)およびポリアデニル化エレメントを含む。選択マーカーなどの別の遺伝子との2シストロン性発現が可能になるように、IRESエレメントも追加してもよい。そのようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばSV40プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス(RSV)の末端反復配列などを含む場合が多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞タイプにおいて活性である。発現には、組織型および細胞型のプロモーターおよびエンハンサー領域も用いてもよい。例示的なプロモーター/エンハンサー領域としては、限定するものではないが、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α1アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域などの遺伝子に由来するものが挙げられる。発現コンストラクトを持つ細胞を選択し、かつ維持するために、選択マーカーを用いてもよい。選択マーカー遺伝子の例としては、限定するものではないが、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)およびチミジンキナーゼが挙げられる。例えば、DHFR遺伝子を発現させる細胞だけを選択するために、メトトレキサートの存在下で発現を行ってもよい。TCR−ζおよびFcεRI−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合により、細胞表面上で活性な状態にあるタンパク質の発現を指向してもよい。
トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を用いて、本明細書に記載する任意のタンパク質などのタンパク質を発現してもよい。発現コンストラクトは、典型的には、微粒子銃およびプロトプラストへのPEG媒介性の移入などといった直接的DNA導入を用いておよびアグロバクテリウム媒介性の形質転換を用いて、植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含んでもよい。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常は、アラビドプシス(Arabidopsis)およびタバコなどの双子葉植物宿主用と、トウモロコシおよびイネなどの単子葉植物宿主用との間で分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびUBQ3プロモーターが挙げられる。形質転換細胞の選択と維持が容易になるように、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーを用いる場合が多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)として培養物中で維持してもよくまたは全植物体に再生してもよい。トランスジェニック植物細胞としては、任意のADA2ポリペプチドを産生するように遺伝子操作された藻類も挙げられる。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主中で生産されたタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。
変異型ADA2ポリペプチドなどの任意のADA2ポリペプチドを含む、ポリペプチドを宿主細胞から精製するための方法は、選択した宿主細胞および発現系に依存するであろう。分泌される分子について、タンパク質は一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現に関しては、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製してもよい。トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物を発現に用いる場合は、組織または臓器を、溶解細胞抽出物を作るための出発物質として用いてもよい。さらに、トランスジェニック動物生産には、乳または卵におけるポリペプチドの生産を含んでもよく、それらを収集し、必要であれば、当技術分野における標準的方法を用いて、タンパク質を抽出し、さらに精製してもよい。
アッセイを用いて、本明細書に提供される、その野性型および変異型および修飾型を含む任意のADA2タンパク質分子の物理的特性、安定性および/または活性を評価してもよい。特性および活性は、生物学的活性および/または腫瘍処置活性に関連し得る。そのアッセイは、インビトロで行われてもまたはインビボで行われてもよい。例えば、そのアッセイを用いて、ADA2のアデノシンデアミナーゼ活性、ヘパリン結合、熱安定性、最適pH、薬物動態、腫瘍増殖阻害活性および他の活性および特性を評価してもよい。別の例では、そのアッセイを用いて、投与の効果および投与経路を含めて、本明細書に提供される任意のADA2を投与する効果を評価してもよい。そのアッセイはまた、ADA2の活性を治療用途に関して保持したままで、本明細書に提供される製剤に対するわずかな調節を行うために用いてもよい。このようなアッセイは、当業者に周知である。非限定的な例示的アッセイは、以下のサブセクションに記載される。
野性型、変異型またはコンジュゲートを含む、本明細書に記載される任意のADA2のアデノシンデアミナーゼ(ADA;EC3.5.4.4)活性を、当該分野で周知の方法を用いて評価してもよい。ADA活性アッセイは通常、酵素反応の生成物の生成の速度を、直接または間接的に測定する。例えば、イノシンまたはアンモニアの生成は、直接測定されてもまたは間接的に測定されてもよい。他の例では、酵素、例えば、アデノシンまたは2−デオキシアデノシンの基質の低下が測定される。基質の低下または生成物の増大は、分光光度法によって直接測定されてもよくまたはその後酵素または酸化−還元反応によって間接的に測定されてもよく、これは発色性基質を用いるかまたは反応の吸収スペクトルを変化させる。
1mU/mL=(ΔA556/分×Tv)/(Sv×ε×l)
式中Tv=反応の総容量;Sv=試料容量、ε=32.2×10−3μM−1cm−1、l=0.5cmである。
1mU/mL=(ΔA/分×Tv)/(Sv×ε×l)
式中、Tv=総容量、Sv=試料容量、ε=6.22×10−3μM−1cm−1、1=1cmである。
単位/mL酵素=[(ΔA265/分)(Tv)(df)]/(8.1)(VE)
式中、Tv=アッセイの総容量(mL);df=希釈係数;8.1=265nmでのアデノシンのミリモル吸光係数;VE=用いられる酵素の容量(ミリリットル)。
ヘパリン結合または別のGAGに対する結合(野性型、変異型またはコンジュゲートを含む、本明細書に記載される任意のADA2による)を、当該分野で周知の方法を用いて評価してもよい。GAGに対する結合を評価するための、これらの方法および当該分野で公知の他の方法を用いて、ヘパリン結合が変化した(例えば、ヘパリン結合の減弱またはヘパリン結合の増大)ADA2変異型に対する結合を評価するかおよび/またはADA2変異型を選択してもよい。一般には、ヘパリン結合は、金属イオン、尿素および界面活性剤(陰イオン性、非イオン性および両性イオン性)の存在に対して鋭敏である。Ca2+およびMg2+ならびに両性イオン性界面活性剤3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホネートは、ヘパリン結合を増大する。NaCl、尿素、ドデシル硫酸ナトリウムおよびLa3+の存在は、ヘパリン結合を低下する。
ADA2がヘパリンに結合する能力は、固定されたヘパリンによってアフィニティ結合アッセイを用いて評価してもよい。ヘパリンは、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであり、かつ一般的なアフィニティリガンドとして広範に用いられる。その硫酸化の程度が高いことによって、分子の強力な酸性の性質が付与され、したがって、これは、ADA2を含む多くの物質に、イオン相互作用によって結合する。さらに、ヘパリンは、固有の炭水化物配列を含み、これがいくつかのタンパク質の特定の結合部位として作用する。固定されたヘパリンを含むカラムを用いて、ヘパリンと高い親和性を有するタンパク質、例えば、DNA結合タンパク質、凝固因子、リポタンパク質およびタンパク質合成因子との結合を評価してタンパク質を精製する。例えば、市販のヘパリン樹脂カラム、例えば、ヘパリン−Sepharose(商標)樹脂(GE Healthcare, Pittsburgh, PA;カタログ番号17−0998−01)をロードされたHiTrap Heparin HPを用いて、ADA2などの特定のタンパク質の結合を評価してもよい。ヘパリン−Sepharose(商標)樹脂では、ヘパリンを、N−ヒドロキシスクシンアミドカップリング方法を介してSeparose High Performanceベースマトリックスにカップリングして、高い能力、パフォーマンスおよび低い漏出レベルを得る。
本明細書に提供される任意のADA2などのタンパク質のヘパリン結合はまた、酵素連結免疫吸着剤アッセイ(ELISA)ベースの方法を用いて評価してもよい。ELISAベースの方法は、マイクロタイタープレートなどの表面に固定されたヘパリンを用いる。本明細書に提供される任意のADA2などの、ヘパリンに結合する目的のタンパク質を、ヘパリンコーティングプレート中でインキュベートして、結合を本明細書に提供される任意のADA2などの、目的のタンパク質を検出する抗体を用いて検出する。
ヘパリン結合の程度はまた、放射性標識したヘパリンによるブロットベースの方法を用いて検出してもよい。例えば、ドットブロットの方法を用いて、目的のヘパリン結合タンパク質のピコモル量を検出して定量してもよい。タンパク質をニトロセルロース上にスポットし、次いで125I−ヘパリンとともにインキュベートする。タンパク質に対するヘパリンの結合は、オートラジオグラフィーによって検出して、スキャンニングデンシトメトリーによって定量する;タンパク質はアミドブラック染色のニトロセルロースのデンシトメトリー分析によって定量する[Hirose et al.(1986) Analytical Biochemistry 156(2):320-325]。別の例では、放射性標識したヘパリン、例えば、3H−ヘパリンを、96ウェルマイクロタイター形式中で、その野性型、変異型または修飾型を含む、本明細書に提供される任意のADA2などの、目的のヘパリン結合タンパク質とともにインキュベートする。次いで、この混合物を、96ウェルマイクロタイターフィルタープレートに移して、未結合のヘパリンおよび目的のタンパク質を濾過する。結合は、シンチレーションカウントによって検出する[Proudfoot et al.(2003). PNAS 100(4):1885-1890を参照のこと]。
特定の条件で本明細書に提供される任意のADA2の安定性は、タンパク質安定性を評価するために用いられる当業者に公知の任意の方法によって決定され得る。特定の条件での安定性(例えば、熱安定性に関する高温条件、pH耐容性に関する高いまたは低いpH条件、血漿安定性のための血漿条件および長期安定性に関する長期間保管)を、限定するものではないが、構造的な構成または高次構造、酵素活性、タンパク質アンフォールディング、凝集および溶解度を含むポリペプチドの物理的特性における変化を、特定の条件に対して暴露することなく前後で、決定することによって評価してもよい。安定性はまた、天然、野性型または参照のADA2ポリペプチドと比較して、1以上の変性条件の存在下で任意の1以上の活性、凝集または他の物理的特性を比較することによって評価されてもよい。
i. 血漿中の安定性
治療用途のために、例えば、腫瘍またはがんの処置のために、治療効果に十分な時間、血漿のアデノシンデアミナーゼ(ADA)活性を維持する投与量のADA2を対象に投与することが望ましい。したがって、処置の有効性には、血漿および腫瘍微小環境(TME)中の安定性の十分な保持が必要である。野性型、変異型またはコンジュゲートなどの本明細書に記載される任意のADA2の血漿安定性は、酵素活性および/または他の物理的特性の変化を、血漿、例えば、エキソビボの哺乳動物血漿中でのインキュベーションの前後に、測定することによって決定してもよい。
タンパク質は、熱安定性[または熱的安定性]の程度が異なる。具体的には、生物学的活性を有するタンパク質、例えば、酵素は、種々の最適温度を有し得る。比較的高温でその化学的または物理的構造における可逆性の変化に耐えるタンパク質の質である、熱安定性は、タンパク質の全体的な安定性の指標である。温度の上昇は通常は、タンパク質アンフォールディングおよびタンパク質の二次的、三次的および四次的な構造の破壊を誘導し、タンパク質の不安定化につながる。本明細書に提供される任意のADA2ポリペプチドなどのタンパク質の熱安定性は、比較的高温または低温でのインキュベーションの前後に、酵素活性および/または他の物理的特性の変化を測定することによって決定され得る。
タンパク質はまた、pHの変化に抵抗する能力も異なりまたは生物学的活性について異なる最適pHを有する場合もある。環境におけるpHの変動は、天然の構造を不安定化し得る静電気的相互作用の変化を生じるタンパク質中のアミノ酸側鎖の塩基性基および酸性基に対する荷電の変化を生じ得る。pHの比較的小さい変化は、タンパク質の高次構造安定性においてかなり劇的な低下を生じ得、かつ高次構造安定性の変化はまた、タンパク質の凝集も生じ得る。溶液中のイオン性強度および溶液の等電点(pI)はまた、異なるpH条件での溶液中のタンパク質の安定性に寄与する。
環境または製剤の他の条件、例えば、イオン強度、緩衝液組成物、腫瘍微小環境中の他のタンパク質などの他の物質の存在、薬学的賦形剤の存在または併用療法に用いられる他の剤の存在は、本明細書に提供される任意のADA2ポリペプチドなどの処置の方法で用いられるポリペプチドの安定性に寄与し得る。タンパク質の安定性および機能に影響し得る条件でのポリペプチドの安定性は、下に記載の方法を用いて試験してもよいが、特定の条件でのインキュベーション後に試験してもよい。用いられ得るアッセイは、本明細書に提供される製剤に対してわずかに調節されるが、併用療法で用いられるADA2および/または他の剤の安定性は保持されている。
本明細書に提供される任意のADA2ポリペプチドなどのポリペプチドの安定性は、当該分野で公知の任意の方法を用いて、酵素的活性、構造的な構成または高次構造、酵素的活性、タンパク質アンフォールディング、凝集および溶解度など、ポリペプチドの物理的または機能的な特性または活性の変化を測定することによって決定してもよい。評価される機能的または物理的な特性は、条件(例えば、血漿、温度、pHまたは他の条件)の有無で比較してもよい。ある条件の存在下で、その条件がない場合と比較して、タンパク質の安定性を比較または評価するためのアッセイは、存在する条件の存在または程度を除いて、実質的に同じであることが理解される。
安定性の破壊は、酵素活性の破壊につながる酵素の活性部位の三次構造で変化を生じ得る。生物学的活性は、円偏光二色性スペクトルなどの、タンパク質の他の物理的特性の変化と密接に相関する場合が多い。機能分析、例えば、酵素的活性のアッセイ(上記の任意のアデノシンデアミナーゼ(ADA)活性アッセイを含む)を、評価された条件の有無で、タンパク質安定性の指標として用いてもよい。例えば、アデノシンデアミナーゼ(ADA)の安定性は、特定の条件、例えば、セクションF.2.aで上記で記載された条件に対する暴露の前後で測定して、本明細書に提供される任意のADA2の安定性を評価してもよい。血漿中でのインキュベーションなどの特定の条件に対する暴露は、固定した時点で行ってもよくまたはいくつかの時点にまたがって評価してもよい。
天然のタンパク質の純度を評価する方法を指標として用いて、タンパク質の分解の状態または他の脱安定化事象を決定してもよい。タンパク質純度は、クロマトグラフィーの方法、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)を用いて測定してもよい。タンパク質純度とは、RP−HPLCによって決定した場合、存在するタンパク質種の全てと比較した、存在する主なADA2タンパク質ピークのパーセントである。したがって、RP−HPLCおよび当業者に公知の同様の方法は、酵素の分解を評価し得る。タンパク質純度は、経時的に評価してもよい。タンパク質純度は、1以上の条件、例えば、セクションF.2.aにおいて上記する条件の存在下で、かつその種々の量で評価してもよい。回収パーセントはまた、参照試料と比較して異なる長さの時間について種々の条件の存在下でポリペプチドの相対パーセンテージとして決定してもよい。本明細書に提供される、その野性型、変異型、コンジュゲートまたは他の修飾型を含む任意のADA2ポリペプチドの安定性はまた、RP−HPLCによるポリペプチドの酸化を測定することによって決定してもよい。酸化パーセントは、主要ピーク(ox−1)およびマイナーピーク(ox−2)のピーク面積の合計の測定である。
本明細書に提供される、その野性型、変異型および修飾型を含む任意のADA2などの、溶液中でのポリペプチドの熱安定性を、示差走査熱量測定法(DSC)を用いて決定してもよい。DSCでは、試料細胞(タンパク質および緩衝液を含む)および参照の細胞(緩衝液のみ)を、一緒に加熱して、温度を定常状態に上げ、両方の細胞で等しい温度を維持するために試料細胞中で必要な過剰な熱(温度の増大につれて、フォールディングされた天然状態のタンパク質からアンフォールディング型への移行に起因する)を記録する。熱移行の中間点温度(または熱融解温度、Tm)を、共通して、熱安定性の指標として用いる。DSCによってまた、実験条件が、可逆的な熱移行を可能にする場合、エンタルピーの変化(ΔH)、エントロピーの変化(ΔS)、ギブスの自由エネルギーの変化(ΔG)および熱容量の変化(ΔCp)を含む、タンパク質アンフォールディングの熱力学的なパラメーターに対する詳細情報も得られる。DSCを用いて、溶液条件(pH、イオン強度)の効果およびタンパク質製剤化の間のタンパク質安定性に対する賦形剤を決定してもよい[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
示差走査蛍光定量法(DSF)はまた、蛍光熱シフトアッセイとも呼ばれ、蛍光色素の存在下でアンフォールディングなどのタンパク質の温度遷移をモニターするために用いられる方法である。DSFに用いられる極性に敏感な蛍光色素は、非極性の環境では(例えば、(部分的に)アンフォールディングのタンパク質の疎水性ポケットでは)高度に蛍光性であるが、蛍光は、水溶液中でおよび/または天然のタンパク質の存在下でクエンチされる。DSFを用いて、タンパク質の高次構造の安定性を決定してもよい。タンパク質の存在下での色素の蛍光強度を温度の関数としてプロットした時、そのタンパク質の遷移温度(Th)の中間点は、得られたS字形グラフの変曲点に由来し得る。DSF実験から得られるとおり、種々の溶液中の種々のタンパク質のTh値は、示差走査熱量測定法によって決定される熱融解温度(Tm)とよく相関する。さらに、マルチドメインタンパク質中の協力的な(2状態)または複合のアンフォールディング遷移についての情報は、DSFによって得ることができる[Chaudhury et al.(2014)The AAPS Journal 16(1):48-64]。
本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型、コンジュゲートおよび他の修飾型を含む)などのポリペプチドの安定性は、その内部蛍光の変化を測定することによって決定してもよい。内部蛍光分光法は、芳香族アミノ酸残基トリプトファンおよびチロシンなどのタンパク質の内部フルオロフォアからの蛍光を検出する。トリプトファンの蛍光の特性(その強度および最大発光の波長を含む)は特に、それらの局所環境に鋭敏である。結果として、その発光は、タンパク質の高次構造における変化を研究するためのプローブとして用いられる場合が多い。タンパク質アンフォールディングは、蛍光強度の低下およびTrp残基の最大発光のより長い波長へのシフト(赤方偏移)を伴う場合が多い。プレートリーダーおよび温度管理能力を装備した蛍光光度計を使用して、タンパク質治療剤の高次構造の安定性を評価してもよい[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
円偏光二色性(CD)分光法は、左右の円偏光の示差的吸収を測定し、温度および溶液の条件の関数として、タンパク質の二次的な構造の内容(すなわち、αらせんおよびβシート)を特徴付けるための一般向けのツールである。遠UVのCDスペクトル(160〜250nm)をこの目的に用いるが、近UVのCDスペクトル(230〜320nm)は、芳香族アミノ酸側鎖およびジスルフィドの局所環境についての情報を提供し得、次にこれを用いて、三次構造の変化をモニターしてもよい。CDは、特定の緩衝液および添加物(高いUV吸収を有する)とは不適合である[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
動的光散乱(DLS)はまた、光子相関分光法または準弾性光散乱としても公知であり、溶液中のタンパク質の水力学的特性(例えば、凝集)の変化をモニターし、また絶対サイズ測定を行うために用いられる。DLSは、溶液からの散乱した光の強度の時間依存性の変動を測定し、自己相関分析を通じて、拡散係数、流体力学半径および数ナノメートルから最大で約1μmまでのサイズを有する粒子のサイズ分布を含む情報を提供し得る。DLSシグナルは、溶液中の最大サイズの粒子の存在に極めて鋭敏である。DLSは、高次のタンパク質オリゴマーおよび凝集物の検出に有用である。DLSは、溶液のpHおよび温度の関数としてモノクローナル抗体など、タンパク質治療剤のコロイド安定性を特徴付けるために使用される。DLSはまた、多くのタンパク質の生成、送達および投与の間に存在する物理的なストレスに応答したタンパク質の凝集特性を評価するためにも適用される[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。特定の条件に曝した後のADA2凝集物の形成は、種々の条件(例えば、変性条件または他の貯蔵条件)下で動的光散乱によって粒子の流体力学半径を測定することによって決定され得る。
静的光散乱(SLS)は、散乱光の時間平均強度を測定する技術であり、溶液中に懸濁された粒子のサイズについての情報を提供する。多角度光散乱(MALS)は、多角度からの静的光散乱強度を収集して分析する技術であって、タンパク質およびより大きい分子量のオリゴマーの絶対的分子量および回転運動の半径を決定するために用いられ得る。MALS検出は、タンパク質凝集物を分離し、次いで特徴付けるために、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)または流動場分別(flow field fractionation:FFF)と組み合わされてもよい。光散乱はまた、蛍光および光散乱の両方を含むスペクトル領域全体を通じた単純な走査によって蛍光検出を用いて測定されてもよい。これによって、高次構造安定性および凝集の両方のデータを得ることが可能になる[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
溶液の濁度(または光学密度)の大きさは、溶液中のタンパク質凝集体のサイズおよび量の両方と比例する(光学密度=吸光度+光散乱)。濁度は通常は、320〜400nmの波長で測定する。なぜならタンパク質は通常は、この波長範囲では有意な吸光度を有さず、光散乱シグナルの大きさは、波長が低くなるにつれて大きくなるからである。安定性試験の間、種々の製剤中のタンパク質の凝集体の特性は、温度傾斜法(濁度変化を、漸増する温度の関数として測定する)または速度論的方法(濁度変化を一定温度での時間の関数として測定する)のいずれかによって評価され得る[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
本明細書に提供される処置の方法において、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)の安定性を決定するために用いられ得る当業者に公知の他の方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびタンパク質強度の視覚的分析、イムノブロッティング、核磁気共鳴(NMR)分光法、等温滴定熱量計、トランスバース尿素勾配電気泳動(transverse urea gradient electrophoresis:TUG−PAGE)、中性子散乱、分析用超遠心、トリチウムX線断層撮影および粘度測定分析が挙げられる。タンパク質の完全性の視覚的分析としては、例えば、PAGEゲルでの低分子量分解生成物または高分子量凝集生成物の観察が挙げられる。
本明細書に提供される処置の方法で用いる任意のADA2の治療活性、例えば、抗がん活性は、インビトロおよびインビボの機能的アッセイを用いて測定してもよい。本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される任意のADA2での処置の治療効果をモニターするために用いられる例示的なアッセイおよびシステムである。
本明細書に提供される任意のADA2(その野性型ならびに変異型、コンジュゲートおよび他の修飾型を含む)の抗がん活性、ならびに本明細書に提供される任意のADA2および他の剤を用いる併用療法を、インビトロで、例えば、がん細胞培養物を、誘導体とともにインキュベートすることによって、次いで、培養物中での細胞増殖阻害を評価することによって試験してもよい。このような試験のための適切な細胞としては、限定するものではないが、マウスP388白血病、B16黒色腫およびLewis肺がん細胞、同様に、MCF7ヒト乳がん細胞、OVCAR−3がん細胞、A549肺がん細胞、MX−1ヒト乳房腫瘍細胞、HT29結腸がん細胞株、HepG2肝臓がん細胞、HCT116結腸がん細胞、Caco−2ヒト大腸がん細胞、U138MGヒトグリオーマ細胞株、DU145ヒト前立腺がん細胞、L1210リンパ管白血病細胞、L4946リンパ管白血病細胞、6C3HEDリンパ肉腫細胞、TA3乳腺腺癌細胞、E2エーリッヒ癌腫細胞、755腺癌細胞、180肉腫細胞およびB16黒色腫細胞が挙げられる。
動物モデルを用いて、本明細書に提供される腫瘍増殖阻害活性などの治療活性の効果を、本明細書に提供される任意のADA2を用いて評価してもよい。例えば、動物モデルを用いて、腫瘍のサイズ、容量または増殖を評価してもよい。さらに、動物モデルを用いて、組成物または組合せの薬物動態または耐性を評価してもよい。
腫瘍代謝活性の低下は、本明細書に提供されるADA2処置について試験され得る。腫瘍代謝活性は、当該分野で公知の標準的な手順を用いて評価してもよい。例えば、[18F]−フルオロデオキシグルコースポジトロン放出断層撮影(FDG−PET)を用いてもよい。PETは、非侵襲性の診断であって、灌流、細胞生存、組織の増殖および/または代謝活性の画像および定量的パラメーターを提供する。この画像は、ポジトロン放出放射性同位体で標識した種々の生物学的物質(例えば、糖、アミノ酸、代謝前駆体、ホルモン)の使用から生じる。例えば、FDGは、グルコースのアナログであって、正常なグルコース経路の第1段階を介して生きている細胞によって取り込まれる。がんでは、解糖系活性の増大の存在によって、がん細胞でのFDGの捕捉が生じる。FDG捕捉の低下は、腫瘍代謝活性および抗がん活性の低下と相関する。PET画像化のガイドラインは、当業者に公知であって、いずれかの処置医師または技師に従うべきである。
例えば、腫瘍および/または転移のサイズおよび位置をモニターしてもよい。腫瘍および転移のサイズは、外部評価法または断層撮影または磁気画像化法、例えば、本明細書に記載の検出法を含む、当該分野で公知の任意の種々の方法によってモニターしてもよい。いくつかの時点にまたがるモニタリングのサイズは、本明細書に記載の治療方法の有効性に関する情報を提供し得る。さらに、腫瘍または転移のサイズの増減をモニタリングして、対象に追加の腫瘍および/または転移が存在することに関する情報(すなわち、検出および/または診断)を得てもよい。いくつかの時点にまたがる腫瘍のサイズのモニタリングでは、対象における新生物疾患の発症に関する情報、例としては、本明細書に提供される処置などの、対象における新生物疾患の処置の有効性が提供され得る。
本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される任意のADA2を用いる腫瘍処置などの処置効果をモニタリングする1以上の工程をさらに包含し得る。対象は、腫瘍、対象の一般的健康度および/または対象の疾患の経過をモニタリングすることによってモニターしてもよい。任意の種々のモニタリング工程が、本明細書に提供される方法に含まれてもよく、これには限定するものではないが、腫瘍のサイズのモニタリング、抗−(腫瘍抗原)抗体力価のモニタリング、転移の存在および/またはサイズのモニタリング、対象のリンパ節のモニタリングおよび血液または尿のマーカーを含む対象の体重または他の健康の指標のモニタリングが挙げられる。モニタリングの目的は、対象の健康状態、もしくは対象の治療処置の進行を評価するためであってもよくまたはADA2のさらなる投与が正当化されるか否かを決定するためであってもよくまたはさらなる剤または処置を施す時点もしくは施すか否かを決定するためであってもよくまたは併用療法を施すかもしくは継続するか否かを決定するためであってもよい。
任意の投与された剤の薬物動態および薬力学的特性に対する、単独でまたは別の治療剤と組み合わせた、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)の投与の効果はまた、臨床試験の条件などで、動物モデルおよび/またはヒト対象を用いて、インビボで評価されてもよい。薬物動態または薬力学的な研究は、動物モデルを用いて行ってもよくまたは本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)を投与された患者での研究の間に行ってもよい。
本明細書に提供されるのは、アデノシンデアミナーゼ2(ADA2)、例えば、その野性型ADA2、変異型、コンジュゲートまたは他の修飾型および薬学的に許容される賦形剤または添加物を含む医薬組成物である。この医薬組成物は、アデノシンレベルの上昇に関連する疾患または状態(例えば、過剰増殖性疾患または状態、例えば、腫瘍またはがん)の処置に用いられ得る。任意のADA2を、単剤の治療に投与してもよくまたは本明細書に記載されるようなさらなる剤または処置との併用療法で投与してもよい。この組成物は、単一剤投与のために製剤化してもまたは複数回の投与のために製剤化してもよい。この剤は、直接投与のために製剤化してもよい。この組成物は、液体として提供されてもまたは凍結乾燥製剤として提供されてもよい。
この製剤は一般には、投与経路に適するように作製される。非経口投与(一般には、皮下、筋肉内、静脈内または皮内のいずれかの注射または注入によって特徴付けられる)が本明細書で考慮される。非経口投与のための調製物としては、注射用滅菌溶液、無菌乾燥溶液生成物、例えば、皮下注射用錠剤、注射用滅菌懸濁液、使用直前にすぐ媒体と組み合わせる無菌の乾燥不溶性製品および無菌のエマルジョンなどの凍結乾燥粉末(使用直前にすぐ溶媒と組み合わせる)が挙げられる。注射液は、従来型で、液体の溶液または懸濁物のいずれかとして、注射前に液体中で溶液または懸濁液に適切な固体型としてまたはエマルジョンとして、調製してもよい。凍結乾燥製剤は、後の使用または貯蔵のための大きい単位用量の貯蔵に理想的である。
本明細書で目的とするのは、溶液、エマルジョンおよび他の混合物などの投与のために再構成され得る凍結乾燥粉末である。それらはまた、再構成されて、固体またはゲルとして製剤化されてもよい。この凍結乾燥された粉末は、上記の任意の溶液から調製されてもよい。この医薬調製物は、使用前に、水または他の適切な媒体との再構成のための凍結乾燥型で提示されてもよい。
処置される条件次第で、他の投与経路、例えば、局所適用、経皮パッチ、経口および直腸投与も本明細書において考慮する。
野性型、変異型、コンジュゲートまたは他の修飾型を含む本明細書のいずれかに記載の、組成物中のADA2は、単回投与または複数回投与のための医薬組成物として製剤化され得る。このタンパク質は、処置される患者に対する望ましくない副作用がない、治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれてもよい。例えば、薬学的に活性な化合物の濃度は、所望の薬理学的効果を生じるのに有効な量を注射がもたらすように調節される。治療上有効な濃度は、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知のアッセイを用いることなどによって、公知のインビトロおよびインビボ系でタンパク質を試験することによって経験的に決定できる。例えば、標準的な臨床技術を使用してもよい。さらに、インビトロアッセイおよび動物モデルを、最適投与量範囲の同定を容易にするために使用してもよい。経験的に決定できる正確な投与量は、患者または動物の年齢、体重および状態、投与される特別なADA2分子、投与経路、処置される疾患の種類、ならびに疾患の重症度に依存し得る。
また提供されるのは、包装材料を含む製品、本明細書に提供される任意の医薬組成物およびその組成物が、本明細書に記載される疾患または状態の処置に用いられることを示す表示である。例えば、この表示は、その処置が腫瘍またはがんであることを示し得る。この表示はまた、その処置が、本明細書に記載されるようなマーカーの上昇、例えば、組織または細胞でのアデノシンレベルの上昇または蓄積、アデノシン受容体(ADR)の上昇および/またはCD73もしくはCD39のレベルの上昇と関連する疾患または状態についてであることを示し得る。
本明細書に提供される方法は、その症状が、対象のアデノシンまたはデオキシアデノシンのレベルが低下することによって、減弱または低減され得る疾患または状態を有する対象を処置するために、本明細書に記載される任意のアデノシンデアミナーゼ2(ADA2)、例えば、その野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、PEG化ADA2)または他の修飾型を投与するかまたは用いる方法を包含する。例えば、その疾患または状態は、アデノシンレベルの上昇を伴うものである。例えば、ADA2は、アデノシンに関してKmが約200×10−5Mという低い結合親和性を示すので、ADA2は、アデノシンのレベルが上昇したかまたは高いという条件下で優先的に活性を示す。したがって、治療剤としてのADA2の使用は、疾患または異常な環境について特異性を示すという利点を提供するが、アデノシンレベルが低い正常な環境下では活性を示さない。特定の例では、下に記載のとおり、この疾患または状態は、腫瘍またはがんである。この対象は、細胞外アデノシンのレベル、アデノシン受容体(ADR)発現のレベルおよび/またはエクトヌクレオチダーゼ発現のレベルに基づいて選択され得る。さらに、抗がん剤または抗ヒアルロン酸剤などの、処置のための1以上の追加の剤との併用療法もまた提供される。
低レベルでストレスのない組織の間質液中に生理学的に存在するアデノシンの濃度は、低酸素症、虚血、腫瘍環境または外傷などの病理学的条件に応答して急速に増大し得る。細胞外腔に放出された場合、アデノシンは、危険のシグナルとして機能し、アデノシン受容体(ADR)の活性化を通じて、種々の細胞応答が生じて、組織の恒常性が修復される。アデノシンは、限定するものではないが、腫瘍増殖および血管形成の刺激、サイトカイン合成および内皮壁に対する免疫細胞の接着の阻害、T細胞、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞の機能の阻害、ならびに腫瘍転移の促進を含む、疾患または状態の疫学に寄与し得る種々の活性に関連する。
ADA2、例えば、本明細書に記載される、野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、PEG化ADA2)または他の修飾型を含む任意のADA2を、腫瘍またはがんを処置するために用いてもよい。腫瘍微小環境(TME)における高い細胞外アデノシンは、局所免疫抑制環境を生み出し、T細胞およびNK細胞の活性を抑制する。特定の腫瘍および免疫細胞に対する免疫抑制性のTMEおよびADRシグナル伝達の生成を通じて、アデノシンは、一般には、腫瘍の増殖、血管新生および転移に好都合であるTMEを生じる。
良性腫瘍)、横紋筋肉腫、心臓肉腫が挙げられる。消化管の腫瘍としては、例えば、口腔、食道、胃、小腸、結腸および結腸直腸の腫瘍、ならびに消化器の分泌臓器、例えば、唾液腺、肝臓、膵臓および胆管の腫瘍が挙げられる。中枢神経系の腫瘍としては、脳、網膜および脊髄の腫瘍が挙げられ、また関連する結合組織、骨、血管または神経組織にも由来し得る。末梢神経系の腫瘍の処置もまた考慮される。末梢神経系の腫瘍としては、悪性の末梢神経鞘腫瘍が挙げられる。腎臓系の腫瘍としては、腎臓の腫瘍、例えば、腎細胞癌、ならびに尿管および膀胱の腫瘍が挙げられる。生殖系の腫瘍としては、頸部、子宮、卵巣、前立腺、精巣および関連の分泌腺の腫瘍が挙げられる。免疫系の腫瘍としては、血液系の腫瘍および固形腫瘍の両方が挙げられ、これには、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方が挙げられる。呼吸器系の腫瘍としては、鼻腔、気管支および肺の腫瘍が挙げられる。乳房の腫瘍としては、小葉および腺管癌の両方が挙げられる。
本明細書に記載する任意のADA2、例えば、その野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、PEG化ADA2)または他の修飾型を用いて、対象における非がん性過剰増殖性疾患を処置してもよい。アデノシンおよびADRシグナル伝達は、種々の細胞性応答、例えばマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化、遺伝子転写および増殖に対して、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を含む種々のシグナル伝達経路、サイクリックAMP(cAMP)シグナル伝達および/またはサイトカインシグナル伝達においてある役割を果たす。A1受容体などの、特定のアデノシン受容体(ADR)の活性化は、細胞増殖につながる細胞経路を開始し得る。過剰な発現および/または過剰な刺激が過剰増殖を生じ得る。本明細書に提供される任意のADA2を用いて、過剰増殖性障害に関与する細胞でADRの活性化を低下することによって、非がんの過剰増殖性障害を処置してもよい。
本明細書に提供される任意のADA2、例えば、その野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、PEG化ADA2)または他の修飾型を用いて、線維症および特にアデノシンの上昇と関連した疾患を処置してもよい。アデノシンのレベルは、ストレスのある状態、例えば、低酸素症、虚血、炎症、腫瘍環境または外傷で上昇する。これらの状態では、細胞外アデノシンは、危険のシグナルとして作用して、組織の恒常性に種々の応答を促進する。しかし、急性損傷段階を超えてアデノシン濃度の増大が続けば、免疫抑制を誘発するかまたは絶え間のない創傷治癒プロセスを促進する経路を活性化することによって組織に対して有害になり得、これが線維の再構築につながる[Antonioli et al.(2013) Nat Rev Can 13:842-857]。細胞外アデノシン中のストレス関連増大を低下し得る、本明細書に提供されるADA2の投与を用いて、過剰な線維の組織沈着を伴う疾患または状態、例えば、線維症(修復過程または反応過程での臓器または組織中の過剰の線維性結合組織の形成)を処置してもよい。線維症に関連する疾患または状態としては、例えば、特発性肺線維症および嚢胞性線維症を含む肺の線維症;肝硬変を含む肝臓の線維症;心内膜心筋線維症、心筋梗塞、動脈線維症を含む心臓の線維症;ならびに他の線維症状態、例えば、縦隔線維症(縦隔の軟部組織の線維症)、骨髄線維症(骨髄の線維症)、後腹膜線維症(後腹膜の軟部組織の線維症)、進行性塊状線維症(肺の線維症)、腎性全身性線維症(皮膚の線維症)、クローン病(腸の線維症)、ケロイド(皮膚の線維症)、強皮症/全身性硬化症(皮膚、肺の線維症)、関節線維症(膝、肩、他の関節の線維症)、ペイロニー病(陰茎の線維症)、デュプイトラン拘縮(手、指の線維症)および癒着性関節包炎(肩の関節症)が挙げられる。
本明細書に記載される任意のADA2、例えば、その野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、PEG化ADA2)または他の修飾型は、アデノシンの上昇と関連する感染性疾患を処置するために用いてもよい。侵襲性の病原体は、宿主の内因性の免疫抑制機構、例えば、アデノシン媒介性の免疫抑制を利用して、宿主内の伝播または生存を促進し得る。例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の菌糸は、アデノシンを放出して、生物体の好中球媒介性殺傷を抑制し、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)はまた、アデノシンを生成して、宿主の免疫応答を抑制する。さらに、新生児および高齢者での感染に対する感受性の増大はまた、上昇したアデノシンレベルシグナル伝達とも関連している[Hasko et al.(2013) Front Immunol. 4:85]。
ADA1遺伝子の有害な突然変異を保有する個体は、軽度から重度の種々の程度の免疫不全障害を発症し得る。このような免疫不全障害は、酵素基質、アデノシンおよびデオキシアデノシンの、未熟なリンパ系細胞中での毒性の蓄積に起因する。この障害の発症はまた、遺伝した突然変異によって、幼児期から成人に及んでもよい。ADA1の不全は、小児の重症複合免疫不全(SCID)の主な原因の1つであって、遺伝子治療アプローチの主な標的の1つである(R. Parkman et al., 2000,”Gene therapy for adenosine deaminase deficiency”, Ann. Rev. Med., 51:33-47)。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるアデノシン関連バイオマーカーのレベルに基づいた、本明細書に提供される任意のADA2を用いる処置のための患者選択の方法である。例示的なアデノシン関連のバイオマーカーとしては、血漿アデノシンレベル、アデノシン受容体(ADR)レベルおよびエクトヌクレオチダーゼレベルが挙げられる。
本明細書に提供されるのは、ADA2を用いる処置が適用可能な腫瘍を有する患者を選択する方法である。本明細書に提供される方法は、アデノシンレベルの上昇と関連するかおよび/または処置される対象におけるアデノシンもしくはデオキシアデノシンレベルの低下の影響を受けやすい状態および疾患を処置することに適用可能である。例えば、このような状態または疾患としては、腫瘍またはがんが挙げられる。アデノシン関連のバイオマーカーのレベル、例えば、血漿アデノシンレベル、アデノシン受容体(ADR)レベルおよびエクトヌクレオチダーゼレベルは、アデノシン関連の疾患もしくは状態の診断もしくは予後診断に、本明細書に提供される任意のADA2もしくは併用療法に対するアデノシン関連の疾患もしくは状態を有する対象の応答性を予測するためおよび/または、本明細書に提供されるADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)を用いて処置されたアデノシン関連の疾患もしくは状態を有する対象の処置の有効性をモニターもしくは予測するために用いられ得る。
一例では、患者または対象は、血漿などの試料中の細胞外アデノシンのレベルまたは発現に基づいて、本明細書に提供される任意のADA2を用いる処置のために選択され得る。他の例では、特定の腫瘍の腫瘍微小環境における細胞外アデノシンのレベルを用いてもよい。血漿のアデノシンレベルは、クロマトグラフィーベースの方法を含む、当該分野で公知の任意の方法を用いて測定してもよい。当該分野で公知のアッセイを用いて血漿試料中のアデノシンレベルを評価、定量、決定および/または検出することは、当業者の水準の範囲内である。アッセイには、インビトロアッセイまたはインビボアッセイが挙げられる。試料中のアデノシンレベルを、評価、推定、決定、定量および/またはそうでなければ特異的に検出するために用いられ得る例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)ベースのアッセイ[例えば、Jackson and Ohnishi(1987) Hypertension 10:189-197を参照のこと]、分光光度的な方法、放射性酵素アッセイ[例えば、German and Kredich(1984) Anal Biochem. 142(2):536-541を参照のこと]、微小電極ベースの検出およびインビボ画像化法、例えば、生物発光ベースの方法が挙げられる。いくつかの例では、血漿アデノシンレベルは、アデノシンを蛍光誘導体、例えば、アデノシンレベルの検出のための1,N6−エタノアデノシンに変換する反応を利用する改変HPLC法を用いて検出され得る[Howard et al.(1998) Investigative Opthalmology & Visual Science, 39(10):1942-1946]。
アデノシン受容体(ADR)の発現のレベルは、本明細書に提供される任意のADA2を用いる処置のための患者または対象の選択のためのバイオマーカーとして用いられ得る。具体的には、腫瘍細胞および/または腫瘍免疫に関与する免疫細胞中で発現されるADR、例えば、A2A(配列番号534に記載するアミノ酸配列)およびA2B(配列番号535に記載するアミノ酸配列)のアデノシン受容体を用いてもよい。A2AおよびA2Bアデノシン受容体などの、上昇したかまたは高いレベルのADRを発現する腫瘍は、ADA2を用いる処置に対してさらに反応性であり得る。なぜなら、アデノシンおよび腫瘍増殖に対する効果は、腫瘍細胞で発現されるADRに対するアデノシン結合によって媒介され得る。いくつかの腫瘍は、上昇した発現のADR、特にA2AおよびA2Bを有し、これらの受容体の発現は、下流のがん促進性効果を有する。他の例では、アデノシンシグナル伝達は、A2AおよびA2B受容体の刺激を通して、内皮炎症性プロセスおよび腫瘍血管形成を調節する。他の例では、A2AおよびA2Bアデノシン受容体などのADRの発現は、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫細胞の活性化および分化に対して阻害性の効果を有する。したがって、A2AおよびA2Bアデノシン受容体などのADRの測定を用いて、アデノシンレベルの上昇に関連するかおよび/またはアデノシンもしくはデオキシアデノシンレベルの低下の影響を受けやすい、がんを含む腫瘍を選択してもよい。A2AおよびA2Bアデノシン受容体などのADRのレベルは、処置に対して応答性であることが予測される患者を選択もしくは特定するためおよび/または、処置および処置の有効性をモニターし、それによって、腫瘍またはがんなどの、アデノシン関連の疾患または状態の改善された処置レジメンを提供するために用いてもよい。
腫瘍細胞中で発現される、エクトヌクレオチダーゼCD39およびCD73の発現のレベルを、本明細書で提供される任意のADA2を用いる処置について患者または対象の選択のためのバイオマーカーとして用いてもよい。CD39およびCD73は、アデノシン三リン酸(ATP)から細胞外アデノシンを生成するエクトヌクレオチダーゼである。CD39(エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1;EC3.6.1.5;配列番号542に記載するアミノ酸配列)は、細胞外ATPを代謝して、アデノシン二リン酸(ADP)およびアデノシン一リン酸(AMP)を生成し、ならびにCD73(エクト−5’−ヌクレオチダーゼ;EC3.1.3.5;配列番号543に記載するアミノ酸配列)はAMPを代謝して、アデノシンを生成する。CD39およびCD73は、低酸素症、虚血、炎症、腫瘍環境または外傷などの、アデノシンレベルの急激な上昇と関連する状態の間の細胞外アデノシンの主な供給源である。これらの状態では、細胞外ATPが増大し、これが、CD39およびCD73エクトヌクレオチダーゼの作用によって、アデノシンレベルのその後の増大につながる。特定のがんの種類では、CD39およびCD73のレベルは過剰発現され、上昇したCD73のレベルは、良くない予後予測および早期の腫瘍再発の高さと関連している。したがって、エクトヌクレオチダーゼCD39およびCD73の発現のレベルは、アデノシンレベルの上昇を伴う腫瘍のためおよび本明細書に提供される任意のADA2を用いた処置のための患者の選択のためのバイオマーカーとして用いられ得る。
一旦、バイオマーカーのレベル、例えば、血漿アデノシンレベル、A2AまたはA2BなどのADRのレベルまたはCD39およびCD73エクトヌクレオチダーゼのレベルの量が決定されれば、その量を対照または閾値のレベルと比較してもよい。対照または閾値のレベルは一般には、アデノシンレベルの上昇と関連する疾患または状態(例えば、腫瘍またはがん)の指標である所定の閾値のレベルまたは量である。このようなレベルまたは量は、当業者によって経験的に決定され得る。本明細書の方法に関する特定の所定の選択または分類の基準は、アデノシン関連のバイオマーカーのレベルを検出するために用いられる特定のアッセイおよび試験されている特定の試料に依存する。あるアッセイが特定の試料を試験することに適合するか否かを決定することは当業者の水準の範囲内である。インビトロの固相アッセイまたは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)ベースのアッセイを、体液試料を試験するために用いてもよい。組織化学または免疫組織化学などのアッセイを、組織試料を試験するために用いてもよい。所定のレベルもしくは量に対してまたは対照もしくは参照の試料に対しての比較を包含する方法では、同じ種類の試料を用いて、ならびに同じアッセイおよび試薬(同じ検出部分および検出方法を含む)を用いて参照を行うことも理解される。
本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、単回投与または複数回投与のための医薬組成物として製剤化されてもよい。ADA2ポリペプチドは、この組成物中に、処置される患者に対する望ましくない副作用の非存在下で治療上有用な効果を発揮するために十分な量で含まれる。治療上有効な濃度は、本明細書に提供されるかまたは当該分野で公知のアッセイを用いることなどにより、公知のインビトロおよびインビボのシステムでそのポリペプチドを試験することによって、経験的に決定され得[例えば、Taliani et al.(1996) Anal. Biochem., 240: 60-67;Filocamo et al.(1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al.(1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Bouffard et al.(1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al.(1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al.(1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al.(1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza et al.(1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al.(1997) Anal. Biochem., 247:242-246を参照のこと;また、例えば、Shimizu et al.(1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al.(1996) J. Virol. 70:7219-7223;Mizutani et al.(1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci., 93:1412-1417; Hahm et al.,(1996) Virology, 226:318-326;Ito et al.(1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054;Mizutani et al.(1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al.(1997) J. Virol. Meth. 65:201-207も参照のこと]、次いで、ヒトへの投与についてそれから推定され得る。
本明細書に提供される方法では、本明細書に提供されるADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、1以上の他の治療レジメンまたは剤の前後またはそれと同時に投与され得る。熟練した医療従事者は、経験的にまたは薬剤の薬物動態および作用方式を考慮することによって、各々の治療レジメンまたは薬剤の適切な用量、ならびに投与の適切なタイミングおよび方法を決定し得る。追加の治療レジメンまたは薬剤は、本明細書に提供されるADA2の有効性または安全性を改善し得る。いくつかの例では、追加の治療レジメンまたは薬剤は、本明細書に提供されるADA2の作用を変更するのではなく、同じ疾患または併存疾患を処置し得る。いくつかの例では、追加の治療レジメンまたは薬剤は、本明細書に提供される任意のADA2の投与と関連する1以上の副作用を軽減、低減または排除し得る。
本明細書に提供されるADA2を用いる処置方法は、当該分野で公知の1以上の抗がん剤と組み合わせて施してもよい。本発明の併用処置は、ADA2を、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知の抗がん剤の有効量とともに、同時にまたは連続して投与することを包含する。抗がん剤は、例えば、化学療法剤、抗体、ペプチドまたは遺伝子治療ベクター、ウイルスもしくはDNAまたはそれらの組合せであってもよい。
)];イリノテカン[例えば、CAMPTOSAR(登録商標)];レトロゾール[例えば、FEMARA(登録商標)];ロイコボリン[例えば、WELLCOVORIN(登録商標)、LEUCOVORIN(登録商標)];レバミソール[例えば、ERGAMISOL(登録商標)];ロムスチン/CCNU[例えば、CeeBU(登録商標)];メクロレタミン/ナイトロジェンマスタード[例えば、MUSTARGEN(登録商標)];メゲストロールアセテート[例えば、MEGACE(登録商標)];メルファラン/L−PAM[例えば、ALKERAN(登録商標)];6−MPを含むメルカプトプリン[例えば、PURINETHOL(登録商標)];メスナ[例えば、MESNEX(登録商標)];メトトレキサート;メトキサレン[例えば、UVADEX(登録商標)];マイトマイシンC[例えば、MUTAMYCIN(登録商標)、MITOZYTREX(登録商標)];ミトタン[例えば、LYSODREN(登録商標)];ミトキサントロン[例えば、NOVANTRONE(登録商標)];ナンドロロンフェンプロピオネート[例えば、DURABOLIN−50(登録商標)];ノフェツモマブ[例えば、VERLUMA(登録商標)];オプレルベキン[例えば、NEUMEGA(登録商標)];オキサリプラチン[例えば、ELOXATIN(登録商標)];パクリタキセル[例えば、PAXENE(登録商標)、TAXOL(登録商標)];パミドロネート[例えば、AREDIA(登録商標)];ペガデマーゼ[例えば、ADAGEN(登録商標)];ペガスパルガーゼ[例えば、ONCASPAR(登録商標)];ペグフィルグラスチム[例えば、NEULASTA(登録商標)];ペントスタチン[例えば、NIPENT(登録商標)];ピポブロマン[例えば、VERCYTE(登録商標)];プリカマイシン/ミトラマイシン[例えば、MITHRACIN(登録商標)];ポルフィマーナトリウム[例えば、PHOTOFRIN(登録商標)];プロカルバジン[例えば、MATULANE(登録商標)];キナクリン[例えば、ATABRINE(登録商標)];ラスブリカーゼ[例えば、ELITEK(登録商標)];リツキシマブ[例えば、RITUXAN(登録商標)];サルグラモスチム[例えば、PROKINE(登録商標)];ストレプトゾシン[例えば、ZANOSAR(登録商標)];スニチニブマレート[例えば、SUTENT(登録商標)];タルク[例えば、SCLEROSOL(登録商標)];タモキシフェン[例えば、NOLVADEX(登録商標)];テモゾロミド[例えば、TEMODAR(登録商標)];テニポシド/VM−26[例えば、VUMON(登録商標)];テストラクトン[例えば、TESLAC(登録商標)];6−TGを含むチオグアニン;チオテパ[例えば、THIOPLEX(登録商標)];トポテカン[例えば、HYCAMTIN(登録商標)];トレミフェン[例えば、FARESTON(登録商標)];トシツモマブ[例えば、BEXXAR(登録商標)];トラスツマブ[例えば、HERCEPTIN(登録商標)];トレチノイン/ATRA[例えば、VESANOID(登録商標)];ウラシルマスタード;バルルビシン[例えば、VALSTAR(登録商標)];ビンブラスチン[例えばVELBAN(登録商標)];ビンクリスチン[例えば、ONCOVIN(登録商標)];ビノレルビン[例えば、NAVELBINE(登録商標)];およびゾレドロネート[例えば、ZOMETA(登録商標)]が挙げられる。本明細書に提供される任意のADA2は、他の抗がん剤、例えば、本明細書に提供されるものおよび/またはGoodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eds. Hardman and Limbird, Tenth edition(2002)に記載のものとの併用療法に用いられ得る。
本明細書に提供される任意のADA2と同時投与され得る抗がん抗体の例としては、限定するものではないが、抗17−IA細胞表面抗原抗体、例えば、Panorex(登録商標)(ドレコロマブ);抗4−1BB抗体;抗4Dc抗体;抗A33抗体、例えば、A33およびCDP−833;抗α1インテグリン抗体、例えば、ナタリズマブ;抗α4β7インテグリン抗体、例えば、LDP−02;抗αVβ1インテグリン抗体、例えば、F−200、M−200およびSJ−749;抗αVβ3インテグリン抗体、例えば、アブシキシマブ、CNTO−95、Mab−17E6およびVitaxin(登録商標);抗補体因子5(C5)抗体、例えば、5G1.1;抗CA125抗体、例えば、OvaRex(登録商標)(オレゴボマブ);抗CD3抗体、例えば、Nuvion(登録商標)(ビシリズマブ)およびRexomab;抗CD4抗体、例えば、IDEC−151、MDX−CD4、OKT4A;抗CD6抗体、例えば、オンコリシン(Oncolysin)BおよびオンコリシンCD6;抗CD7抗体、例えば、HB2;抗CD19抗体、例えば、B43、MT−103およびオンコリシンB;抗CD20抗体、例えば、2H7、2H7.v16、2H7.v114、2H7.v115、Bexxar(登録商標)(トシツモマブ)、Rituxan(登録商標)(リツキシマブ),およびZevalin(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン);抗CD22抗体、例えば、Lymphocide(登録商標)(エプラツズマブ);抗CD23抗体、例えば、IDEC−152;抗CD25抗体、例えば、バシリキシマブおよびZenapax(登録商標)(ダクリズマブ);抗CD30抗体、例えば、AC10、MDX−060およびSGN−30;抗CD33抗体、例えば、Mylotarg(登録商標)(ゲムツズマブオゾガマイシン)、オンコリシンMおよびSmart Ml 95;抗CD38抗体;抗CD40抗体、例えば、SGN−40およびトラリズマブ;抗CD40L抗体、例えば、5c8、Antova(登録商標)およびIDEC−131;抗CD44抗体、例えば、ビバツズマブ;抗CD46抗体;抗CD52抗体、例えば、Campath(登録商標)(アレムツズマブ);抗CD55抗体、例えば、SC−1;抗CD56抗体、例えば、huN901−DM1;抗CD64抗体、例えば、MDX−33;抗CD66e抗体、例えば、XR−303;抗CD74抗体、例えば、IMMU−110;抗CD80抗体、例えば、ガリキシマブおよびIDEC−114;抗CD89抗体、例えば、MDX−214;抗CD123抗体;抗CD138抗体、例えば、B−B4−DM1;抗CD146抗体、例えば、AA−98;抗CD148抗体;抗CEA抗体、例えば、cT84.66、ラベツズマブおよびPentacea(登録商標);抗CTLA4抗体、例えば、MDX−101;抗CXCR4抗体;抗EGFR抗体、例えば、ABX−EGF、Erbitux(登録商標)(セツキシマブ)、IMC−C225およびMerck Mab 425;抗EpCAM抗体、例えば、Crucellの抗EpCAM、ING−1およびIS−IL−2;抗エフリンB2/EphB4抗体;抗Her2抗体、例えば、Herceptin(登録商標)]、MDX−210;抗FAP(線維芽細胞活性化タンパク質)抗体、例えば、シブロツズマブ;抗フェリチン抗体、例えば、NXT−211;抗FGF−1抗体;抗FGF−3抗体;抗FGF−8抗体;抗FGFR抗体,抗フィブリン抗体;抗G250抗体、例えば、WX−G250およびRencarex(登録商標);抗GD2ガングリオシド抗体、例えば、EMD−273063およびTriGem;抗GD3ガングリオシド抗体、例えば、BEC2、KW−2871およびミツモマブ;抗gpIIb/IIIa抗体、例えば、ReoPro;抗ヘパリナーゼ抗体;抗Her2/ErbB2抗体、例えば、Herceptin(登録商標)(トラスツズマブ)、MDX−210およびペルツズマブ;抗HLA抗体、例えば、Oncolym(登録商標)、Smart 1D10;抗HM1.24抗体;抗ICAM抗体、例えば、ICM3;抗IgA受容体抗体;抗IGF−1抗体、例えば、CP−751871およびEM−164;抗IGF−1R抗体、例えば、IMC−A12;抗IL−6抗体、例えば、CNTO−328およびエルシリモマブ;抗IL−15抗体、例えば、HuMax(登録商標)−IL15;抗KDR抗体;抗ラミニン5抗体;抗Lewis Y抗原抗体、例えば、Hu3S193およびIGN−311;抗MCAM抗体;抗Muc1抗体、例えば、BravaRexおよびTriAb;抗NCAM抗体、例えば、ERIC−1およびICRT;抗PEM抗原抗体、例えば、TheragynおよびTherex;抗PSA抗体;抗PSCA抗体、例えば、IG8;抗Ptk抗体;抗PTN抗体;抗RANKL抗体、例えば、AMG−162;抗RLIP76抗体;抗SK−1抗原抗体、例えば、Monopharm C;抗STEAP抗体;抗TAG72抗体、例えば、CC49−SCAおよびMDX−220;抗TGF−β抗体、例えば、CAT−152;抗TNF−α抗体、例えば、CDP571、CDP870、D2E7、Humira(登録商標)(アダリムマブ)およびRemicade(登録商標)(インフリキシマブ);抗TRAIL−R1およびTRAIL−R2抗体;抗VE−カドヘリン−2抗体;ならびに抗VLA−4抗体、例えば、Antegren(登録商標)が挙げられる。さらに、抗イディオタイプ抗体、例としては、限定するものではないが、GD3エピトープ抗体BEC2およびgp72エピトープ抗体105AD7を用いてもよい。さらに、限定するものではないが、抗CD3/CD20抗体Bi20を含む二重特異性抗体を用いてもよい。
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、1以上の化学療法剤とともに投与される。化学療法剤の例としては、限定するものではないが、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド[CYTOXAN(登録商標)];スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン;抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;抗エストロゲン、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)−イミダゾール、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY 117018、オナプリストンおよびトレミフェン(Fareston);代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび5−フルオロウラシル(5−FU);葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;アジリジン、例えば、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパおよびウレデパ;エチレンイミンおよびメチルメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミン;葉酸補給物質、例えば、フロリン酸;ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン;白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;タンパク質、例えば、アルギニンデイミナーゼおよびアスパラギナーゼ;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン,5−FU;タキサン、例えば、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)およびドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000;チミジレート合成酵素阻害剤(例えば、Tomudex);追加の化学療法剤、例えば、アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキセート;デフォスファミド;デメコルシン;ジアジコン;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);エフロルニチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標);ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2’’−トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;クロラムブシル;ゲムシタビン;6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;エトポシド(VP−16);イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;Xeloda;イバンドロネート;CPT−11;レチノイン酸;エスペラマイシン;カペシタビン;ならびにトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカンが挙げられる。任意の上記の薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまた用いられてもよい。
本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、他の治療レジメンと組み合わされてもよい。例えば、一態様では、本明細書に提供される任意のADA2を用いて処置される患者は、放射線療法を受けてもよい。放射線療法は、当該分野で通常使用され、当業者に公知であるプロトコールに従って投与され得る。このような治療としては、限定するものではないが、セシウム、イリジウム、ヨード、コバルトの照射、X線の照射、γ線、例えば、直接照射およびトモグラフィー標的化の両方、移植された放射性ペレットもしくは「シード」を用いるがん組織の処置、ホウ素化合物をプライムした組織の中性子ビーム照射、ならびに/または当該分野で公知の他の種類の粒子ビーム治療が挙げられる。放射線療法は、全身照射であってもよくまたは肺、膀胱もしくは前立腺などの身体内もしくは身体上の特定の部位または組織に対して局所的に指し向けられ得る。通常は、放射線療法は、約1〜2週の期間にわたってパルスで施される。しかし、放射線療法は、長期間にわたって施されてもよい。例えば、放射線療法は、頭頸部がんを有する患者に対して、約6〜約7週間施されてもよい。適宜、放射線療法は、単回用量で投与されてもまたは複数回の連続用量で投与されてもよい。熟練した医療従事者は、本明細書で有用な放射線療法の適切な用量を経験的に決定し得る。いくつかの例では、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)および適宜1以上の他の抗がん療法を使用して、エキソビボでがん細胞を処置する。このようなエキソビボ処置は、骨髄移植および特に自家骨髄移植において有用であり得ると考えられる。例えば、本明細書に提供される任意のADA2および1以上の抗がん治療を用いる、がん細胞を含む細胞および組織の処置を使用して、レシピエント患者における移植前にがん細胞を枯渇させてもよくまたは実質的に枯渇させてもよい。放射線療法はまた、同位体的に標識された分子、例えば、抗体を用いる処置を包含し得る。ただし、放射免疫療法の例としては、Zevalin(登録商標)(Y−90標識の抗CD20)、LymphoCide(登録商標)(Y−90標識の抗CD22)およびBexxar(登録商標)(1−131標識の抗CD20)が挙げられる。さらに、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、手術または光線療法などのさらに他の治療技術と組み合わせて患者または対象に施され得る。
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、1以上の抗血管新生剤とともに投与される。例えば、抗血管新生因子は、血管新生を促進することに関与する増殖因子または増殖因子受容体に結合する、低分子またはタンパク質(例えば、抗体、Fc融合物またはサイトカイン)であってもよい。抗血管新生剤の例としては、限定するものではないが、血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor:VEGF)に結合するかまたはVEGF−Rに結合する抗体、VEGFもしくはVEGF−R発現のレベルを低下するRNAベースの治療剤、VEGF−毒素融合物、RegeneronのVEGF−トラップ、アンギオスタチン(プラスミノーゲン断片)、アンチトロンビンIII、アンジオザイム、ABT−627、Bay12−9566、BeneFin、ベバシズマブ、ビスホスホネート、BMS−275291、軟骨由来阻害剤(CDI)、CAI、CD59補体断片、CEP−7055、Col3、コンブレスタチンA−4、エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片)、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、フィブロネクチン断片、グロ−ベータ(gro-beta)、ハロフギノン、ヘパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカライド断片、HMV833、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、IM−862、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロン誘導性タンパク質10(IP−10)、インターロイキン−12、クリングル5(プラスミノーゲン断片)、マリマスタット、メタロプロテイナーゼ阻害剤(例えば、TIMP)、2−メトキシエストラジオール、MMI270(CGS27023A)、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤(PAI)、血小板因子−4(PF4)、プリノマスタット、プロラクチン16kDa断片、プロリフェリン関連タンパク質(PRP)、PTK787/ZK222594、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、SS3304、SU5416、SU6668、SU11248、テトラヒドロコルチゾール−S、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンスポンジン−1(TSP−1)、TNP470,トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)、バスキュロスタチン、バソスタチン(カルレティキュリン断片)、ZS6126,およびZD6474が挙げられる。
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、免疫チェックポイントタンパク質をブロックすることによって免疫応答を増大する1以上の剤(すなわち、免疫チェックポイント阻害剤)とともに投与される。本明細書に提供される併用療法では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体、例えば、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA4またはCD152)、プログラムされた細胞死タンパク質1(PD−1)またはプログラムされた細胞死タンパク質1リガンド1(PD−L1)に対する抗体であってもよい。
CTLA4をブロックする2つの抗体、イピリムマブおよびトレメリムマブは、いくつかのがん、例えば、黒色腫、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、腎細胞がん(RCC)、結腸直腸がん(CRC)、胃がんおよびNSCLCの有効な処置のために用いられてきた[概説については、Kyi et al.,(2014) FEBS Letters 588:368-376を参照のこと]。治療的なCTLA4遮断は、治療の終了後、数か月から数年の腫瘍退行を果たし得る[Prieto et al.,(2012) Clin Cancer Res. 18(7):2039-2047;Kirckwood et al.,(2010) Clin Cancer Res. 16(3):1042-1048]が、他の宿主組織に対する抵抗も低下し得、免疫関連有害事象(immune-related adverse events:irAE)などの有害事象につながる。
本明細書に提供される併用療法(組成物およびその方法および使用を含む)は、PD−1またはPD−L1を阻害する治療剤を包含する。抗体および融合タンパク質、アプタマー、抗体、アプタマーおよび融合タンパク質阻害剤(PD−1またはPD−L1に結合し、かつPD−1阻害性シグナル伝達を阻害する)を含む阻害剤は公知である。例示的な融合タンパク質としては、WO2010/027827およびWO2011/066342に記載されるPD−L2−Fc融合可溶性受容体であるAMP−224(B7−DCIgとしても公知)が挙げられる。
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、1以上の免疫調節剤とともに投与される。このような剤は、1以上のサイトカインの産生を増加または減少してもよく、自己抗原提示を上方制御または下方制御してもよく、MHC抗原をマスクしてもよくまたは1種または複数の免疫細胞の増殖、分化、遊走もしくは活性化状態を促進してもよい。免疫調節剤の例としては、限定するものではないが、非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)、例えば、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、オキサプロジン、ナブメトン、スリンダク、トルメチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェンおよびナブメトン;ステロイド(例えば、グルココルチコイド、デキサメサゾン、コルチゾン、ヒドロキシコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、エイコサノイド、例えばプロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエン;ならびに局所ステロイド、例えばアントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾールおよびタザロテン);サイトカイン、例えばTGFb、IFNa、IFNb、IFNg、IL−2、IL4、IL−10;サイトカイン、ケモカインまたは受容体アンタゴニスト、例えば、BAFF、B7、CCR2、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD14、CD15、CD17、CD18、CD20、CD23、CD28、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD52、CD64、CD80、CD86、CD147、CD152、補体因子(C5、D)CTLA4、エオタキシン、Fas、ICAM、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNAR、IgE、IL−1、IL−2、IL−2R、IL−4、IL−5R、IL−6、IL−8、IL−9、IL−12、IL−13、IL−13R1、IL−15、IL−18R、IL−23、インテグリン、LFA−1、LFA−3、MHC、セレクチン、TGFβ、TNFα、TNFβ、TNF−R1に対する抗体、可溶性受容体および受容体−Fc融合体、T細胞受容体、例えば、Enbrel(登録商標)(エタネルセプト)、Humira(登録商標)(アダリムマブ)およびRemicade(登録商標)(インフリキシマブ);異種抗リンパ球グロブリン;他の免疫調節分子、例えば2−アミノ−6−アリール−5置換ピリミジン、MHC結合ペプチドおよびMHC断片に対する抗イディオタイプ抗体、アザチオプリン、ブレキナール(brequinar)、ブロモクリプチン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、D−ペニシラミン、デオキシスペルグアリン、FK506、グルタラルデヒド、金、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、マロノニトロアミド(例えば、レフルノミド)、メトトレキサート、ミノサイクリン、ミゾルビン、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシンおよびスルファサラジンが挙げられる。
本明細書に提供される、併用ならびにその方法および用途を含む併用療法には、本明細書に提供されるADA2に加えて、抗ヒアルロナン剤、例えば、可溶性のヒアルロナン分解酵素を含んでもよい。ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンの加水分解を触媒し、かつヒアルロナンを一時的に分解し得る酵素である。ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの成分および間質性障壁の主な構成要素である。ヒアルロナン分解酵素群は、交互のβ−1→4およびβ−1→3グリコシド結合を介して互いに連結されている二糖類単位であるD−グルクロン酸(GlcA)およびN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)の反復から構成されるヒアルロナンポリマーを開裂することにより、ヒアルロナンを分解するように働く。ヒアルロナン鎖は、約25,000二糖反復以上の長さに達し得、ヒアルロナンのポリマーのサイズはインビボで約5,000〜20,000,000Daの範囲であり得る。間質性障壁の主な構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロナン分解酵素群はヒアルロナンの粘度を下げ、それにより組織透過性を高める。そのようなものとして、ヒアルロナン分解酵素群、例えばヒアルロニダーゼ群は、例えば、分散および送達を亢進するために他の薬剤、薬物およびタンパク質と組み合わせて展着剤または分散剤として使用されている。
具体的には、本明細書で提供されるのは、任意の変異型ADA2タンパク質および可溶性ヒアルロナン分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼ(例えば、可溶性PH20)など、本明細書に提供される任意のADA2を含む併用治療の方法および組成物である。可溶性ヒアルロナン分解酵素としては、発現の際に細胞(例えば、CHO細胞)から分泌されて、可溶型で存在する任意のヒアルロナン分解酵素が挙げられる。このような酵素としては、限定するものではないが、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、非ヒト可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、非ヒト動物可溶性ヒアルロニダーゼ、細菌可溶性ヒアルロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼ、Hyal1、ウシPH20およびヒツジPH20、それらの対立遺伝子変異型およびそれらの他の変異型が挙げられる。例えば、可溶性ヒアルロナン分解酵素の中でも、可溶性になるように改変された任意のヒアルロナン分解酵素が含まれる。例えば、GPIアンカーを含むヒアルロナン分解酵素は、GPIアンカーの全部または一部の切断および除去によって可溶型にされてもよい。一例では、GPIアンカーを介して正常に膜固定されているヒトヒアルロニダーゼPH20は、C末端でのGPIアンカーの全部または一部の切断および除去によって可溶性にされてもよい。
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のADA2、例えば、その野性型、変異型および修飾型は、感染性疾患を処置するために1以上の抗体または抗体断片とともに投与される。感染性疾患を処置するために投与され得る抗体の例としては、限定するものではないが、抗炭疽菌抗体、例えばABthrax、抗CMV抗体、例えばCytoGamおよびセヴィルマブ、抗クリプトスポリジウム抗体、例えばCryptoGAM、Sporidin−G、抗ヘリコバクター抗体、例えばPyloran、抗B型肝炎抗体、例えばHepeX−B、Nabi−HB、抗HIV抗体、例えばHRG−214、抗RSV抗体、例えばフェルビズマブ、HNK−20、パリビズマブ、RespiGamおよび抗ブドウ球菌抗体、例えばAurexis、Aurograb、BSYX−A110およびSE−Mabが挙げられる。
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のADA2(その野性型、変異型および修飾型を含む)を、1以上の抗生物質、例えば、限定するものではないが:アミノグリコシド抗生物質(例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン)、アミノシクリトール(例えば、スペクチノマイシン)、アンフェニコール抗生物質(例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコールおよびチアンフェニコール)、アンサマイシン抗生物質(例えば、リファミドおよびリファンピン)、カルバペネム(例えば、イミペネム、メロペネム、パニペネム);セファロスポリン(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セファレキシン、セフラジン)、セファマイシン(セフブペラゾン、セフォキシチン、セフミノクス、セフメタゾールおよびセフォテタン);リンコサミド(例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン);マクロライド(例えば、アジスロマイシン、ブレフェルジンA、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トブラマイシン)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、カルモナムおよびチゲモナム);ムピロシン;オキサセフェム(例えば、フロモキセフ、ラタモキセフおよびモキサラクタム);ペニシリン(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナメシリン、ペネタマートヨウ化水素酸塩、ペニシリンo−ベネタミン、ペニシリンO、ペニシリンV、ペニシリンVベンゾエート、ペニシリンVヒドラバミン、ペニメピサイクリンおよびフェネチシリンカリウム);ポリペプチド(例えば、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンB、テイコプラニン、バンコマイシン);キノロン(アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリニン酸、ペフロキサシン、ピペミド酸、ロソクサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシンおよびトロバフロキサシン);リファンピン;ストレプトグラミン(例えば、キヌプリスチン、ダルホプリスチン);スルホンアミド(スルファニルアミド、スルファメトキサゾール);テトラサイクリン(クロルテトラサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、デメチルクロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、デュラマイシン、ミノサイクリン、ネオマイシン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリンおよびバンコマイシン)とともに投与する。
以下の実施例は、例示の目的で含まれるだけであって、本発明の範囲を限定する意図ではない。
A. 野性型(WT)ADA2のクローニング
野性型ヒトアデノシンデアミナーゼ(ADA2)遺伝子であって、そのシグナル配列(配列番号1に記載する核酸配列;配列番号2に記載するアミノ酸配列(前駆体)をコードする)を増幅して、pCMV−Scriptベクター(Agilent Technologies, Santa Clara, CA;カタログ番号212220;配列番号6に記載する配列)のScaIとXhoIの制限部位の間でクローニングした。コード配列のC末端では、停止コドンを、FLAG(商標)タグ(配列番号8に記載する核酸配列;配列番号9に記載するアミノ酸配列をコードする)をコードする核酸配列および停止コドンによって、タンパク質精製および/または検出の目的のために置き換えた。得られたコンストラクトpCMV−Script−hADA2−FLAGは、WT組換えヒトADA2−FLAGポリペプチド(配列番号7に記載するアミノ酸配列)をコードする。
上記のWT rHuADA2をコードする得られたコンストラクトを用いて、部位特異的なアミノ酸置換を導入して、ADA2変異型を創出する。下のサブセクションに記載されるように、部位特異的なアミノ酸置換は、ADA2のモデリング研究に基づいて行い、ヘパリン結合、触媒活性に関与するかおよび/またはADA2とADA2が結合する任意の他の受容体との間のタンパク質間相互作用を減弱することが示されている残基を特定した。生成されたADA2変異型の各々は、上記のpCMV−Script−hADA2−FLAGベクターから、QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Santa Clara, CA;カタログ番号210514)を用いる部位特異的な置換によって、製造業者の指示に従って作成した。
生成された変異型は、下の表7〜12に示す。この変異型は、PDBアクセッション番号3LGGおよび3LGD[配列番号4に記載する結晶構造で用いられるポリペプチドのアミノ酸配列;Zavialov et al., J. Biol. Chem. 285:12367-12377(2010)に基づく]で用いられるナンバリングに採用された、Zavialovナンバリングを用いておよび配列番号5に記載する成熟ヒトADA2アミノ酸配列(Uniprotアクセッション番号Q9NZK5に基づく;シグナル配列のアミノ酸残基1〜29を含む前駆体アミノ酸配列は配列番号2に記載する)に基づく、成熟ADA2ナンバリングを用いて命名される。表1は、Zavialovナンバリング(配列番号4)および成熟ADA2ナンバリング(配列番号5)の対応する位置の数を示す。
ヘパリンは、身体全体の組織の表面に広く存在する、天然に存在するグリコサミノグリカンである。ADA2は、ヘパリンと物理的に相互作用することが知られており[Zavialov et al., J. Biol. Chem. 285:12367-12377(2010)]、ヘパリンに対する結合は、投与されたADA2の循環レベルを枯渇させるであろう。薬物動態の改善されたADA2変異型を生成するために、モデリング研究に基づいて、ヘパリン結合に関与すると本明細書で特定された残基の置き換えを行った。Zavialov et al., J. Biol. Chem. 285:12367-12377(2010)に記載の、ヒトADA2の2つの利用可能な結晶構造を用いて、突然変異誘発の候補位置を特定した:結合したヘパリンを欠いており、かつショウジョウバエの細胞から発現されるADA2の結晶構造(RCSB Protein Data Bank(PDB)No.3LGG;遷移状態アナログコンホルマイシンに結合したヒトADA2);およびアポ型のヒトADA2(Protein Data Bankアクセッション番号3LGD;補因子も結合した基質もない空の(empty)酵素)。血漿構造から、静電気表面電位を算出し、オープンソースの3D分子可視化パッケージPyMOLを用いて、正の静電ポテンシャルを有するADA2上の表面を特定した。正の静電ポテンシャルを有する表面は、高度に負に荷電されたヘパリン硫酸との相補的な静電相互作用を形成し得る。静電表面ポテンシャルの算出から、1セットのリジンおよびアルギニン残基を、ヘパリンとADA2変異型との間の電荷斥力を生じるため、アミノ酸であるアラニン(タンパク質のファイ−プサイ角に影響することのない、メチレン基での正に荷電されたリジンまたはアルギニン側鎖の置換のため)、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩(2つの公知の負に荷電されたアミノ酸)での置換のための候補部位として特定した。
モデリングに基づいて、Zavialovナンバリングによるアミノ酸残基14、16、23、29、220、261、280、286、312、320、324、369、374、375、444、447、455、464、472または473(成熟ナンバリングによる、それぞれ、残基11、13、20、26、217、258、277、283、309、317、321、352、366、371、372、441、444、452、461、469または470に対応する)を、突然変異誘発のために標的化した。ADA2変異型は、アラニン、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩に対する位置で、アミノのアミノ酸置き換えによって生成した。単一のアミノ酸置き換え、ならびに、二重および三重のアミノ酸置き換えも行った。表7は、例示的な候補変異型におけるアミノ酸置換を示す。実施例7は、表7に示される選択候補変異型のヘパリン結合およびアデノシンデアミナーゼ活性を評価する研究を記載する。
触媒効率が改善されたADA2変異型を生成するために、候補変異型は、分子モデリング研究に基づいて特定した活性部位でのアミノ酸残基の置き換えによって生成した。上記のような、遷移状態アナログであるコホルマイシン(Protein Data Bankアクセッション番号3LGG)およびそのアポ型(Protein Data Bankアクセッション番号3LGD)に結合したヒトADA2の結晶構造は、オープンソース3D分子モデリングプログラムPyMolを用いて可視化した。インシリコの部位特異的突然変異誘発は、PyMolを用いて行い、活性部位内のアデノシンまたは隣接の残基に対する導入されたアミノ酸側鎖のパッケージングを評価し、活性部位付近または活性なポケットの割れ目での隣接残基に対するパッキングを評価し、導入された残基の立体的衝突の距離およびポテンシャルを測定し、活性部位ポケットの相対凹面に対する変化を評価し、アデノシンについての電位を評価して活性部位を評価した。突然変異誘発について標的化された選択された残基は、アデノシンについて触媒効率(kcat/Km)の改善を達成するための候補として本明細書で特定され、そのためアデノシンデアミナーゼ活性が増大しているものであった。
モデリングに基づいて、Zavialovナンバリングによるアミノ酸残基89、182、222、224、265、267、269、270および299(成熟ナンバリングによる残基86、179、219、221、262、264、266、267,または296に相当する)を、突然変異誘発のために標的化した。ADA2変異型は、全部で19の他のアミノ酸に対する位置でのアミノ酸のアミノ酸置き換えによって生成した。表8は、例示的な候補変異型のアミノ酸置き換えを示す。実施例10は、選択候補変異型のアデノシンデアミナーゼ活性を評価する研究を記載している。
過グリコシル化されているADA2変異型を生成するために、候補変異型を残基の突然変異(例えば、挿入および/またはアミノ酸置き換え)によって生成して、新しいN−グリコシル化部位モチーフ(Asn−Xaa−Ser/Thr)の組込みによりN−グリコシル化部位を創出した。表9は、例示的な候補変異型の突然変異を示す。
受容体結合(PRB)ドメインを欠くADA2変異型を生成するために、残基V102−Q147(成熟ナンバリングによるV99−Q144)またはC108−T150(成熟ナンバリングによるC105−T147)を、欠失させて、種々の長さ(例えば、3、5、7、10または15;配列番号280を参照のこと)のグリシンリンカーまたは種々の長さ(例えば、n=1、2または3;配列番号581および582を参照のこと)の(GGGGS)nリンカーで置き換えた。表10は、例示的な候補変異型の突然変異を示す。
受容体結合(PRB)を通じて潜在的受容体とのADA2の潜在的相互作用を破壊するために、ADA2候補変異型を、残基の突然変異(例えば、挿入および/またはアミノ酸置き換え)を導入することによって生成して、PRBドメイン中の新しいN−グリコシル化部位モチーフ(Asn−Xaa−Ser/Thr)の組込みによりN−グリコシル化部位を創出した。表11は、例示的な候補変異型の突然変異を示す。
受容体結合(PRB)ドメインと残りのADA2(例えば、アデノシンデアミナーゼ(ADA)ドメイン)との間の相互作用が変更されたADA2変異型を生成するために、突然変異を、PRBドメイン中の個々のまたは複数のアミノ酸中に導入した。構造ベースのデザインを用いて、PRBドメインがADA2中のPRBドメインの外側の他の接触残基と相互作用する能力を破壊し得るその三次元構造の状況で、ADA2の表面上で残基を特定した。表12は、例示的な候補変異型の突然変異を示す。
A. 一過性発現
実施例1で生成された野性型ADA2および変異型の一過性発現のために、300mlの1.0×106細胞/mlのCHO−S細胞(Invtrogen、カタログ番号11619−012)を、375μgのpCMV−Script−hADA2−FLAGプラスミドまたは変異型プラスミドによって、FreeStyle(商標)MAX試薬(Life Technologies, Carlsbad, CA;カタログ番号16447−500)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を4日間増殖して、培養上清を100rpmで10分間の遠心分離によって収集した。
収集された上清を用いて、各々がFLAGタグを有する、配列番号5に記載する成熟ADA2または成熟変異型(例えば、表7〜12に示される変異型)のいずれかのタンパク質を精製した。バッチ精製を、製造業者の指示に従って、抗FLAG M2アフィニティ樹脂(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO、カタログ番号A2220)を用いて行った。ADA2は、FLAG(商標)ペプチドを用いて樹脂から溶出した。溶出したタンパク質の純度は、SDS−PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて評価した。SECの結果により、精製されたタンパク質が二量体であることが確認された。N末端配列決定も行って、シグナル配列が配列番号2のアミノ酸残基1〜29に相当することを確認し、その結果、精製された成熟タンパク質は、配列番号5に記載するアミノ酸残基IDETで開始する。
野性型ヒトADA2遺伝子(配列番号1に記載する核酸配列)またはC末端FLAG(商標)タグを有する変異型(配列番号8に記載する核酸配列;配列番号9に記載するアミノ酸配列をコードする)を、レンチウイルス発現ベクターpLV−EF1a−MCS−IRES−GFP−Bsdのマルチクローニング部位(MCS)中にサブクローニングした。得られた発現ベクター、pLV−EF1a−hADA2−Flag−IRES−GFP−Bsd(配列番号10に記載する核酸配列)を用いて、CHO−S細胞を安定にトランスフェクトできるレンチウイルスを生成した。発現ベクター中では、組換えヒトADA2遺伝子の発現は、EF1aプロモーターによって駆動された。IRES配列を、トランス遺伝子後に挿入し、続いて、緑色蛍光タンパク質(GFP)のcDNAを、形質導入された細胞の選択のために用いられるブラスチシジン耐性遺伝子(Bsd)と組み合わせて、顕微鏡による形質導入された細胞の特定のために用いた。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element:WPRE)をGFP−Bsd配列の後に挿入して、遺伝子発現を増強した。
SDS−PAGEによって評価した、rHuADA2−FLAGタンパク質調製物の純度は、95%以上であった。その調製物をまた、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって特徴付け、これによって、rHuADA2−FLAGタンパク質が、曲線下面積(AUC)計算で評価した場合、95%より大きい純度で単一分子量種として存在することが示された。
あるいは、野性型rHuADA2および変異型は、製造業者の仕様に従い、CHO Freedom CHO-S Kit(Invtrogen)を用いて発現して、上記のとおり精製した。
A. 野性型(WT)ADA1のクローニング
ヒトアデノシンデアミナーゼ1(ADA1)遺伝子(配列番号11に記載する核酸配列;配列番号12に記載するアミノ酸配列をコードする)を増幅して、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導性プロモーター(DNA 2.0,Menlo Park、CA)の制御下で、pD444−SR:T5−sRBS−ORF(DNA 2.0, Menlo Park, CA;カタログ番号FPB−27−444)大腸菌発現ベクター中にクローニングした。そのコンストラクトはまた、タンパク質の親和性精製を容易にするために、リンカー(配列番号64に記載するアミノ酸配列)およびC末端Strepタグ(配列番号65に記載するアミノ酸配列)を含んだ。コードされたADA1−Strepのアミノ酸配列は、配列番号3に示す。タンパク質の成熟型では、N末端メチオニン残基が除去されており、その結果、成熟ADA1−Strepポリペプチドは、配列番号67に記載するアミノ酸配列(Strepタグなしで、配列番号66に記載する成熟ポリペプチド配列に相当する)を有する。
WT rHuADA1−Strepをコードするこの得られたコンストラクトを用いて、部位特異的なアミノ酸置換を導入して、配列番号67に記載する成熟ADA1に基づくナンバリングによるADA1変異型C74S(配列番号12に記載するポリペプチドに基づくナンバリングによるC75Sに相当する)を創出した。この変異型は、活性を安定化する候補として生成した。なぜなら、ADA1中の溶媒露出システイン残基は、血漿中で酸化され得、かつ血漿中の酵素活性に負に影響し得るからである。部位特異的な置換は、製造業者の指示に従って、QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies,Santa Clara, CA;カタログ番号210514)を用いて行った。成熟型のタンパク質では、成熟C74S−ADA1−Strep変異型は、配列番号69に記載するアミノ酸の配列を有する(Strepタグなしで、配列番号70に記載する成熟ポリペプチド配列に相当する)。
野性型ADA1および変異型の発現のために、得られたクローニングされたコンストラクトをエシュリキア・コリBL21−DE3(Calbiochem,San Diego, CA)中に形質転換した。形質転換された細菌をLuria Broth(LB)アガーアンピシリンプレート(TekNova, Hollister, CA)上にプレートして、単一のコロニーを大規模培養のために選択した。選択されたコロニー由来の細菌を、抗生物質カルベニシリン(50μg/mL;EMD Millipore, Billerica, MA)を補充したLB培地中で一晩(37℃、200rpm)増殖させた。その培養物を用いて、大きいシェーカー培養物に播種した。培養物を、約0.8のOD600に達するまで増殖させ、次いでタンパク質の発現を1mMのIPTGの添加によって誘導した。次いで培養物を25℃のインキュベーターに移して、200rpmで振盪しながら一晩増殖させた(約15時間)。翌日、細菌の細胞を、9000×gで30分間遠心分離し、ペレット中の細胞を、約5分間20%のデューティーサイクルで、氷上で反復パルスを用いて、Branson Sonifier 250(Emerson, Danbury, CT)を用いる超音波処理によって溶解した。次いで、細菌の溶解液をリゾチーム(100μg/mL;Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)およびベンゾナーゼ(50U/mL;Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)とともに、穏やかに撹拌しながら4℃で4時間インキュベートした。細菌の溶解液を遠心分離して(5000×g;45分)、細胞細片を除去した。
培養溶解液を用いて、各々がStrepタグを有する、配列番号66に記載する成熟ADA1または配列番号69に記載する成熟C74S−ADA1変異型のいずれかのタンパク質を精製した。浄化された溶解液を取り出して、無菌ろ過した後、StrepTactin(商標)アフィニティ樹脂を含むStrepTrap(商標)カラム(5mL容量;GE Healthcare, Pittsburgh, PA)上にロードした。次いで、カラムをAKTA精製装置に接続し、タンパク質を、緩衝液(100mM Tris−HCl、pH8.0,150mMのNaCl,1mMのEDTA)中に2.5mMのd−デスチオビオチンが含有される溶液を用いて溶出した。精製されたタンパク質を含有する画分をプールして、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette(20kD MWCO;Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いる2つの緩衝液交換により4時間の間4リットルの1×リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)緩衝液中で、4℃で透析した。次いで、そのタンパク質調製物を、Amicon Ultra遠心分離濃縮器(30kD MWCO;EMD Milipore, Billerica, MA)を用いて濃縮し、最終のタンパク質濃度を、Pierce(商標)BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いて決定した。SDS−PAGEによって評価した、タンパク質調製物の純度は、95%以上であった。
アデノシンデアミナーゼ活性は、アデノシンデアミナーゼ(ADA)アッセイキット(Genway, San Diego, CA;カタログ番号BQ014EALD)をわずかに改変して用いて決定した。ADAアッセイは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)によってヒポキサンチンに変換される、アデノシンからイノシンへの酵素的脱アミノ反応に基づく。次いで、ヒポキサンチンは、キサンチンオキシダーゼ(XOD)によって尿酸および過酸化水素に変換される。過酸化水素はさらに、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(EHSPT)および4−アミノアンチピリン(4−AA)と、ペルオキシダーゼ(POD)の存在下で反応して、反応速度論的方式でモニターされるキノン色素が生成される。
要するに、二連の5μLの試料(定常状態の飽和でない酵素活性を測定するために適切な希釈で)を、製造業者の指示に従って、96ウェルプレート中で120μLのR1試薬(製造業者によって提供される;50mM Tris HCL、pH8.0、2mMの4−AA、0.1U/mLのPNP、0.2U/mLのXOD、0.6U/mLペルオキシダーゼ)に添加した。その混合物を、37℃で約5分間インキュベートし、60μLのR2試薬(製造業者によって提供される;50mMのTris HCl、pH4.0、10mMのアデノシン,2mMのEHSPT)を、混合物に添加した。次いで、37℃で556nmの吸光度(ΔA)の変化を経時的に測定した。1単位のADAとは、37℃で1分あたりアデノシンから1μモルのイノシンを生じるADAの量である。アデノシンデアミナーゼ活性(mU/mL)は、以下の式を用いて算出した:
1mU/mL=(ΔA/分×Tv)/(Sv×ε×l)
式中、Tv=総容量(185μL)、Sv=試料容量(5μL)、ε=32.2×10−3μM−1cm−1、l=0.5cm。
WT rHuADA1、rHuADA1−C74SおよびrHuADA2の精製された調製物の酵素活性を、24時間にわたる哺乳動物血漿中のインキュベーションの前後にアッセイして、組換えタンパク質調製物の安定性を試験した。変異型rHuADA1−C74Sをまた試験して、血漿中の安定性が、溶媒露出されたシステイン残基の置換によって改善され得るか否かを決定した。
精製されたrHuADA1、rHuADA2およびrHuADA1−C74S調製物を個々に、エキソビボで25%BALB/cマウス血漿に、0.17mg/ml(マウス中で10mg/kgの等価というほぼ等価用量に相当する)という最終濃度で添加した。その試料を、37℃で24時間インキュベートした。対照として、タンパク質を個々に、0.2%のBSA(安定化剤として)を含有するPBS中で0.17mg/mlの濃度でインキュベートした。インキュベーション後、0、4および24時間で、各々の血漿インキュベートした試料および各々のPBSインキュベートした対照の3つの小さいアリコートを取り出して、その後の分析まで−20℃で保管した。
インキュベーション後のエキソビボの血漿中のタンパク質の安定性は、実施例4に記載される方法を用いてアデノシンデアミナーゼ酵素活性の変化を比較することによって決定した。タンパク質の分子量および安定性もまた、ウエスタンブロットによって検査して、可能性のあるタンパク質分解を検出した。約200ngのタンパク質を、ウエスタンブロットを用いて個々にアッセイして、タンパク質バンドをECL(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて検出した。ウサギ抗ヒトADA1(Abcam, Cambridge, MA)およびヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(EMD Millipore, Billerica, MA)を、rHuADA1用のそれぞれ一次抗体および二次抗体として用いた。抗FLAG−HRP(Abcam)を用いて、rHuADA2を検出した。
1. rHuADA1安定性
表13は、WT rHuADA1およびrHuADA1−C74Sのアデノシンデアミナーゼ活性試験の平均および標準偏差(stdev)を示す。その結果、37℃で血漿中の24時間のインキュベーション後にrHuADA1活性の有意な低下があったことが示される。例えば、24時間の血漿での処置後、1%未満の活性が保持されたが、同じ期間の間、PBS/BSA対照での場合は、80%を超える活性が保持された。活性で観察された低下は、タンパク質分解では生じない。なぜならタンパク質レベルは、ウエスタンブロットで測定した場合、全ての時点で比較的一定であったからである。
その結果また、溶媒露出されたシステイン残基(C74)が血漿中の酵素活性に対する負の影響の主な原因ではないことも示される。なぜなら同様の結果がC74S変異型について得られたからである。例えば、74位に露出したチオールを有さないにもかかわらず、変異型はやはり、血漿中での24時間インキュベーション後、活性の強力な低下を示した。その結果、24時間後、変異型酵素の活性の約1%が血漿での処置後に保持されるが、PBS/BSAの対照での場合、活性のうち80%より多くが保持されることが示された。
正常には、ADA1は、細胞内の様式で発現され、転位して、細胞外ジペプチジルペプチダーゼ−4(DPPIV)と関連することが公知である。これらの結果、この環境外では、ADA1は血漿に対する暴露によって急速に不活性化されることおよび表面露出システイン74の変異は、不活性化を妨げなかったことが実証される。
下の表14は、血漿とのインキュベーション24時間後、rHuADA2のアデノシンデアミナーゼ活性試験の平均および標準偏差(stdev)を示す。ADA1の結果と対照的に、この結果により、ADA2は実質的に、37℃での24時間インキュベーション後に血漿中で実質的にさらに安定であったことが示される。例えば、24時間の血漿での処置後に約65%の活性が保持されたが、同じ期間のPBS/BSA対照での処置の場合は、活性の変化は観察されなかった。
細胞外アデノシンは、免疫応答の炎症性調節因子であり、腫瘍微小環境におけるアデノシンのレベルの上昇は、T細胞およびNK細胞のエフェクター機能を低下および/または阻害し得、それによって腫瘍増殖が支持される。アデノシンの効果が、免疫細胞増殖を評価することによってモニター可能か否かを評価するために、NK細胞およびT細胞の混合物(NK/T)を用いて、増殖実験を行った。さらに実験を行って、rHuADA2が、アデノシンのイノシンへの酵素的変換を通じて、アデノシン媒介性の増殖阻害から免疫細胞を救済し得るか否かを評価した。
NK細胞およびT細胞の混合物(NK/T)を、健常ドナー末梢血単核球(PBMC)から調製した。要するに、10×107個のヒトPBMCを、20ng/mLの抗CD3 eBioscience, San Diego, CA;カタログ番号16−0039)および500IU/mLの組換えヒトインターロイキン2(rhIL−2;カタログ番号200−02, PeproTech, Rocky Hill, NJ)の存在下で、AB型の血液のドナー由来の5%ヒト血清(ヒトAB血清;カタログ番号35−060−Cl, Mediatech, Mannassas, VA)を有する幹細胞増殖培地(SCGM;Order No.20802−0500、CellGenix, Freiburg, Germany)中で6〜7日間培養した。次いで、細胞を、500IU/mLのrhIL−2の存在下で、SCGM中でさらに2〜3週間培養した。2〜4週間培養したNK/T細胞を実験に用いた。
NK/T細胞増殖のアデノシン媒介性の阻害を試験するために、NK/T細胞(10, 000細胞/ウェル)を、200μL容量中で透明な底の96ウェル白色プレートにプレートした。その細胞を、20μLのアデノシン(SKU No.A925, Sigma Aldrich)を用いて、1mMで開始して3倍希釈系列で得られる濃度、すなわち、1mM、300μM、100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μMおよび0.1μMで処置した。NK/T細胞は、5%のCO2を用いて、37℃で、加湿組織培養インキュベーター中で5日間増殖させた。処置の5日後、細胞を96ウェルプレート中で12, 000rpmで5分間遠心分離した。細胞の各々のウェルから100μLの培地を取り出し、続いて、100μLのCell Titer Glow(CTG)試薬(カタログ番号G7570、Promega, Madison, WI)を添加して、室温で15分間インキュベートし、その後、製造業者の指示に従って、SpectraMax M3プレートリーダーで蛍光を測定した。平均の細胞生存(%)は、アデノシンで処理していない対照の細胞に対して、測定した発光を比較することによって決定した。
その結果を表15に示す。この結果では、5日間アデノシンを用いたNK/T細胞の処置は、NK/T細胞増殖の用量依存性のアデノシン阻害を生じることが示された。応答が半分まで低下されるアデノシンの濃度であるIC50は、16.2μMであった。
rHuADA2を試験して、これが、NK/T細胞増殖のアデノシン媒介性の阻害を1mMのアデノシンで逆転し得るか否かを評価した。NK/T細胞(10,000細胞/ウェル)を、180μL全容量中で、透明な底の96ウェル白色プレートにプレートした。細胞を、20μLのrHuADA2を用いて、3倍希釈系列から生じる濃度で処理して、100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM、0.1nMおよび0.03nMという最終のrHuADA2濃度を得て、次いで、各々のウェルもまた、20μLのアデノシンを1mMで用いて処理した。処理後、NK/T細胞を、培養し、処理し、発光を上記のように測定した。平均細胞生存(%)は、アデノシンまたはrHuADA2で処理していない対照の細胞に対して、測定した発光を比較することによって決定した。
その結果を表17に示す。上記の結果と同様に、rHuADA2によるNK/T細胞増殖の用量依存性の救済が、種々のアデノシン濃度で観察された。種々の固定濃度のアデノシンでのrHuADA2についてのEC50値を表18に示す。その結果、アデノシンがNK/T細胞増殖を阻害することおよびrHuADA2の追加が、アデノシン媒介性の増殖阻害からヒトNK/T細胞を救済し得ることが示される。
SD - 標準偏差
ヘパリン結合に関与する残基中のアミノ酸置換を有する、上記の表7に記載される選択された候補変異型を、スクリーニングして、ヘパリン結合の減弱が示されるか否かを評価した。表19は、試験された変異型を列挙する。ヘパリン結合は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いるかおよび/または酵素連結免疫吸着剤アッセイ(ELISA)を用いて評価した。さらに、変異型のアデノシンデアミナーゼ活性も評価した。実験を行うために、精製されたWT rHuADA2および試験された変異型を、各々の実験でタンパク質の量を正規化するために0.3mg/mL濃度で調製した。
1. ヘパリン親和性クロマトグラフィー
ヘパリンに対する変異型の結合を評価するために、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを使用して、ヘパリン結合の変異型を特定した。ヘパリン結合は、35μLのrHuADA2 WTおよび変異型と、20μLのヘパリン−Sepharose(商標)樹脂(GE Healthcare, Pittsburgh, PA;カタログ番号17−0998−01)とを混合すること、続いて30分間室温でインキュベートすることによって試験した。次いで、混合物を、0.22μmの遠心分離フィルターを通して遠心分離し、未結合のタンパク質を含有する流出物をSDS−PAGEゲルでの分析用に収集した。35μLの1.5MのNaClを、ヘパリン−Sepharose樹脂に添加して、室温で(RT)10分間インキュベートして残りのヘパリン結合したタンパク質を、ヘパリン−Sepharoseから溶出した。精製されたWT rHuADA2および試験された変異型の試料を、ヘパリン−Sepharose樹脂との混合の前後に、SDS−PAGEによって分析して、ヘパリン結合の程度を比較した。
ヘパリンコーティングしたマイクロタイタープレートを用いる酵素連結免疫吸着剤アッセイ(ELISA)を行って、上記でスクリーニングしたrHuADA2のHBP変異型のヘパリン結合特性の減弱を確認した。96ウェルプレートを、Na2CO3緩衝液(pH9.6)中に含有される200μg/mLのヘパリンナトリウム塩(Calibochem, EMD Milipore, Billerica, MA;カタログ番号375095)の100μLで、4℃で一晩コーティングした。そのウェルを、PBS中に含有される5%のミルクでブロックして、PBSを用いて6回洗浄した。3μMの選択rHuADA2変異型(表20を参照のこと)、WT rHuADA2(陽性対照)およびWT rHuADA1(陰性対照)を、個々にウェルに添加して、室温で2時間インキュベートし、続いて、PBSを用いて6回洗浄した。100μLの1:1000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)抗FLAG抗体(Abcam、Cambridge,UK;カタログ番号Ab1238)を、ウェルに添加して、結合を検出し、室温で1時間インキュベートした。ELISA反応は、製造業者の指示に従って、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を添加して発色させ、光学密度を450nm(OD450)で、プレートリーダー上で読んだ。
上記で試験したWT rHuADA2および変異型のアデノシンデアミナーゼ活性を、実施例4に記載のアデノシンデアミナーゼ活性(ADA)アッセイを用いて決定した。活性は、5μg/mLに希釈した精製されたrHuADA2 WTおよび変異型でアッセイし、次いで連続して2倍希釈して、4つの測定値を得た。
表21がこの結果を示す。最後の列は、rHuADA2 WTと比較した相対的な酵素的活性(WTに対する活性%)を示す。
この結果によって、ヘパリン結合の低下を示すほとんどの変異型が、WT ADA2に比較して同様であるかまたは増大したかいずれかのアデノシンデアミナーゼ活性を示すことが示される。具体的には、Zavialovナンバリングによる変異型R23E、K374D、K374E、K375D、K375E、K455D、K455EおよびR369E(成熟ナンバリングによる、それぞれ、R20E、K371D、K371E、K372D、K372E、K452D、K452EおよびR366E)は、ヘパリン結合の減弱を示すだけでなく、酵素的活性の改善も示す。
対照的に、変異型R23A、R23DおよびR369A(成熟ナンバリングによりそれぞれR20A、R20DおよびR366A)は、ヘパリン結合の低下を示すだけでなく、アデノシンデアミナーゼ活性の低下も示す。
rHuADA2、K374D−ADA2変異型(成熟ナンバリングによるK371D)またはR23E−ADA2変異型(成熟ナンバリングによるR20E)を、直鎖PEG−20Kとの反応によって表面露出リジン上でPEG化した。PEG化したrHuADA2または変異型をヘパリン結合およびアデノシンデアミナーゼ活性について評価した。
酵素をPEG化するために、3mg/mLのWT rHuADA2、rHuADA2−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)またはrHuADA2−R23E(成熟ナンバリングによるR20E)変異型を、各々個々に、直鎖PEG−20K(JenKem Technology, Plano, TX;カタログ番号M−SCM−20K)と1:15のモル比で混合して、4℃で16時間インキュベートした。その反応混合物を0.22μmの遠心分離フィルターを通して遠心分離して、PEG化した酵素を含む流出物を収集した。
PEG化したrHuADA2または変異型のヘパリン結合を、捕獲ELISAによって評価した。rHuADA1の結合を、陰性対照として評価した。100μLの0.2mg/mLビオチン−ヘパリン(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO;カタログ番号B9806−10MG)を、ストレプトアビジンコーティングした96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL;カタログ番号15520)に添加して、室温で1時間インキュベートした。そのプレートをPBSを用いて6回洗浄した。次いで、150μLの1μMのPEG化したrHuADA2を、ヘパリンコーティングしたプレートに添加して、3×連続希釈で滴定し、室温で2時間インキュベートした。次いで、そのプレートを、PBSを用いて6回洗浄した。1000×希釈のヤギHRP抗FLAG pAb(Abcam, Cambridge, UK;カタログ番号Ab1238)を、ELISAプレートに添加して、室温で1時間インキュベートした。次いで、ELISAプレートを、Tween含有リン酸緩衝化生理食塩水(PBST)を用いて6回洗浄し、製造業者の指示に従って3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いて発色させ、プレートリーダーで450nmの光学密度(OD450)を読んだ。
PEG化したrHuADA2および変異型のアデノシンデアミナーゼ活性を、実施例4に記載の方法を用いて評価し、対応するPEG化されていない形態の活性と比較した。
その結果を表23に示す。この結果では、PEG化したWT rHuADA2が、PEG化されていない形態と比較して匹敵するアデノシンデアミナーゼ活性を有したことが示される。同様に、PEG化したrHuADA2−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)およびrHuADA2−R23E(成熟ナンバリングによるR20E)変異型はまた、PEG化されていない形態と比較して匹敵するアデノシンデアミナーゼ活性を示した。WT rHuADA2は、32リジン残基を単量体としておよび64リジン残基を二量体として含むが、PEG化はリジン残基では、rHuADA2のアデノシンデアミナーゼ活性に影響を有さなかった。
実験の結果、rHuADA2変異型のPEG化は、アミノ酸置換から生じるヘパリン結合の減弱に加えてヘパリン結合を低下するが、ただしアデノシンデアミナーゼ活性の損失はないことが実証される。したがって、この結果では、ヘパリン結合変異型のPEG化は、アデノシンデアミナーゼ活性に影響することなく、rHuADA2変異型の薬物動態学的特性を改善し得ることが示される。PEG化を変異の代わりに用いて、ヘパリン結合を減弱してもよい。
ZavialovナンバリングによるWT rHuADA2、ADA2−K374DおよびADA2−R23E変異型(成熟ナンバリングによって、それぞれK371DおよびR20E)の非PEG化形態およびPEG化形態の薬物動態(PK)を、免疫適格性マウスモデルで分析した。
54匹の雄性BALB/cマウスを、6つの投薬群に分け、種々の時点での血液のサンプリングのために各々3つの群にさらに分けた。このように、マウスを全部で18の群に無作為化した。マウスを研究の開始前に秤量して、それらの体重に基づいて18の群に無作為化した。各々のサンプリング群では、(3)マウスの3つの群を、各試験品を投与するために用いて、動物からの血液の重複を防いだ。ベースラインのADA2レベルの測定のために、血液試料を、12匹の無作為に選択されたマウスから得て、血漿を、抗凝固剤カリウム(K3)エチレンジアミン四酢酸(K3−EDTA)を用いて調製した。全ての血液は顎下の静脈穿刺によって収集した。
各々のマウスに、表24に示される6つのADA2試験品、すなわち、rHuADA2−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)、PEG−rHuADA2−K374D(PEG−成熟ナンバリングによるK371D)、rHuADA2−R23E(成熟ナンバリングによるR20E)、PEG−rHuADA2−R23E(PEG−成熟ナンバリングによるR20E)またはWT ADA2およびPEG−WTADA2のうちの1つの7.5mg/kgの用量を、静脈内の尾静脈注射によって注射した。PEG化したADA2変異型は、実施例8Aに記載のPEG化方法を用いて調製した。各々の試験品の濃度は、1.5mg/mLであって、これによってマウスの体重(BW)次第で93〜119μLの投与容量範囲とした。個々の動物の投与容量および体重は、表25に示す。
1. PEG化されていないrHuADA2 WTおよび変異型の薬物動態
Zavialovナンバリングによる変異型ADA2−K374DおよびADA2−R23E(成熟ナンバリングによって、それぞれ、K371DおよびR20E)と比較したWT rHuADA2の薬物動態(PK)の特性を、表26および27に示す。表26は、曲線下面積(AUC)算出を用いて測定した総暴露を示し、表27は半減期(t1/2)を示す。この結果では、変異型の各々が、野性型ADA2と比較して薬物動態パラメーターの改善を示したことが示される。例えば、変異型rHuADA2−R23E(成熟ナンバリングによるR20E)は、WT rHuADA2についてよりも19%高いAUCおよびWT rHuADA2よりも119%長い半減期を示した。変異型rHuADA2−K374Dは、WT rHuADA2について128%高いAUCおよびWT rHuADA2について230%長い半減期を示した。
変異型、PEG−R23E(成熟ナンバリングによるR20E)およびPEG−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)のPEG化形態と比較した天然およびPEG化したWT rHuADA2の薬物動態学的(PK)特性を、表28および29に示す。表28は、曲線下面積(AUC)算出を用いて測定した総暴露を示し、表29は、半減期(t1/2)を示す。
野性型ADA2に関しては、この結果では、PEG化は実質的に薬物動態プロフィールを改善する。この結果では、PEG−WTADA2は、非PEG化WT ADA2よりも4291%高いAUCおよびPEG化されていないWT ADA2よりも1078%長い半減期を呈することが示される。同様に、改変型のPEG化はまた、非PEG化形態と比較して薬物動態の改善を生じた。したがって、測定されるPK成分であるAUCおよびt1/2の両方に関して、PEG化は、PEG化されていない形態と比較してPK値の改善をもたらした。
この結果では、ADA2改変型のPEG化形態はまたPEG−WT DA2と比較してPK成分の一方または両方の改善を呈するが、これらの改善は、PEG−R23E(成熟ナンバリングによるR20E)についてよりも、変異型PEG−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)について大きかったことも示される。例えば、PEG−R23E(成熟ナンバリングによるR20E)は、PEG化されていないWT ADA2よりも4271%高いAUC(PEG−WT ADA2についての4291%と比較)およびPEG化されていないWT ADA2よりも1420%長い半減期(PEG−WTADA2についての1078%と比較)を呈した。対照的に、PEG−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)は、PEG化されていないWT ADA2よりも8187%高いAUC(PEG−WT ADA2についての4291%と比較)およびPEG化されていないWT ADA2よりも1791%長い半減期(PEG−WTADA2についての1078%と比較)を呈した。
上記の表8に記載される選択された候補変異型(酵素活性において役割を果たす残基中のアミノ酸置換を含む)を、実施例4に記載の方法を用いてそれらのアデノシンデアミナーゼ活性について評価した。表30は、試験された変異型を列挙する。実験を行うために、精製されたWT rHuADA2および試験された変異型を5μg/mL濃度で調製して、各々の実験でのタンパク質の量を正規化した。
アデノシンデアミナーゼ活性アッセイの結果を、下の表30に示す。WT−ADA2と比較した各々の変異型の活性パーセント(%)を示す。この結果では、182位(成熟ナンバリングによる179位)で置換を含む全ての試験した変異型の活性が実質的に低下されたことが示され、このことは、グルタミン酸(E)残基が酵素活性に重要であることを示している。
酵素活性を増大し、ヘパリン結合を減弱したアミノ酸置換を含む組合せ変異型(combination variat)を生成した。具体的には、実施例10に記載されるような酵素活性の最大増大をもたらすアミノ酸置換S265Nおよび/またはR222Q(成熟ナンバリングによるS262Nおよび/またはR219Q)を、実施例7に特定されるアミノ酸置換K374D、K374Eおよび/またはR23E(成熟ナンバリングにより、それぞれ、K371D、K371Eおよび/またはR20E)のうちの1つまたは複数と組み合わせた。変異型は、QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて実施例1で上記されるように生成した。生成された組合せ変異型を表31に示す。組合せ変異型および対応する単一のアミノ酸置換を、アデノシンデアミナーゼ活性の反応速度論的パラメーターについておよびヘパリン結合について評価した。
1. アッセイ方法
アデノシンデアミナーゼ活性は、イノシンへ壊されたとき、アデノシンから放出されるアンモニアの測定によって決定した。アンモニアは、市販のアンモニアアッセイキット(カタログ番号AA0100,Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)を用いて測定した。このキットは、α−ケトグルタル酸およびNADPHを含む乾燥試薬を含み、これは、アッセイでの使用前に5mLの水で再構成された。アンモニアは、α−ケトグルタル酸(KGA)および還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)と、L−グルタミン酸ジヒドロゲナーゼ(GDH)の存在下で反応する。NADPHの酸化に起因する、340nmでの吸光度の低下は、アンモニア濃度と、したがってアデノシンデアミナーゼ活性と比例する。
rHuADA2 WTおよび変異型の反応速度論的パラメーターを、このアッセイを用いて、pH7.5および6.5で種々のアデノシン濃度で比較した。20μM〜20mMに及ぶアデノシン濃度を用いた。モル濃度未満のアデノシンストックを1NのNaOH中で調製した。
pH7.6での酵素的アッセイのために、アデノシンを、100mMの酢酸ナトリウム(NaOAc)、pH4.9を用いて連続希釈した。2×反応混合物を、調製し、これは再構成されたアンモニアアッセイ試薬(約4mMのα−ケトグルタル酸塩および約300μMのNADPHを含む)、WT rHuADA2または変異型を1μg/mL(17nM)でおよびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH,1:50希釈)を含んだ。85μLのアデノシンを、UV透明ハーフエリアプレート中に二連で、85μLの2×混合物に添加した。室温での経時的な340nmでの吸光度の変化(ΔA)をモニターした。
アデノシンデアミナーゼ活性(mU/mL)(μM/分等価物)を、以下の式を用いて算出した:
1mU/mL=−(−ΔA/分×Tv)/(Sv×ε×l)
式中、Tv=総容量(170μL)、Sv=試料容量(85μL)、ε=6.22×10−3μM−1cm−1、l=1cmである。
活性データを、Graphpad Prismソフトウェアを用いてミカエリス−メンテン式の非線形回帰にあてはめ、KmおよびVmaxを得た。他の反応速度論パラメーター、例えば、kcatおよびkcat/Kmも決定した。
kcat(1/s)=Vmax/[E]0
Vmax単位=μM/分
[E]0=8.5nMまたは0.0085μM
kcat=Vmax/0.0085/60
kcat/Km単位=1/Ms
表32および33は、それぞれ、pH7.6およびpH6.5で、rHuADA2野性型および変異型の反応速度論的パラメーターを示す。WT rHuADA2のKmは、pH7.6で5.25mMおよびpH6.5で3.66mMであり、WT rHuADA2の触媒効率(kcat/Km)は、pH7.6で9,753およびpH6.5で17,060であった。したがって、これらの結果では、WT rHuADA2は、pH6.5でより大きい活性を呈することが示される。全ての試験した変異型が、WT−ADA2と比較して改善された酵素の反応速度論を示した。一般には、設計した変異型の酵素反応速度論の改善は、pH7.6よりもpH6.5でさらに顕著に観察された。
例えば、S265N(成熟ナンバリングによるS262N)は、WTと比較して有意に改善された反応速度論的特性を有した。rHuADA2の活性部位でセリン残基265(成熟ナンバリングによる262)のアスパラギンへの置換は、Kmの値をpH7.6で3.02mMまでおよびpH6.5で1.49mMに低下し、触媒効率(kcat/Km)を、pH7.6で9,753〜52,208(1/Ms)におよびpH6.5で17,060〜60,339(1/Ms)に増大した。R222Q(成熟ナンバリングによるR219Q)はまた、WTと比較して有意に改善された反応速度論の特性を有した。リジン残基222(成熟ナンバリングによる219)のグルタミンへの置換は、pH7.6でKmの値を1.92mMにおよびpH6.5で0.994mMに低下させ、触媒効率(kcat/Km)を、pH7.6で9,753から60,697(1/Ms)におよびpH6.5で17,060から83,146(1/Ms)に増大した。
ヘパリン結合の減弱をもたらすと特定された、ZavialovナンバリングにおけるADA2変異型K374D、K374EおよびR23E(成熟ナンバリングにより、それぞれ、K371D、K371EおよびR20E)はまた、pH6.5で大きかった、WTと比較して、反応速度論特性の改善も示した。S265N(成熟ナンバリングによるS262N)を含む組合せ変異型はさらに、WTと比較して触媒活性の改善を示した。具体的には、組合せ変異型S265N/K374E、S265N/R23EおよびS265N/R23E/K374Eは、試験した変異型の中でもpH6.5で触媒活性の最大の改善を示した。
単一の突然変異体およびS265N(成熟ナンバリングによるS262N)を含む組合せ変異型のヘパリン結合活性を、上記の実施例7.Aに記載のELISAベースのヘパリン結合アッセイを用いて評価した。その結果を表34に示す。その結果、変異型K374D、K374EおよびR23Eが、WT−ADA2に比較してヘパリンに対する結合の減弱を示すことが確認された。さらに、活性部位残基の改変による酵素活性の改善のために設計されたS265N(成熟ナンバリングによるS262N)変異型はまた、ヘパリンコーティングしたプレートに対する結合の減弱を保有しており、これによって、酵素活性部位の改変が、アロステリックな方式でヘパリン結合に影響し得ることが示される。さらに、全ての試験された組合せ変異型が、ヘパリンに対する有意に減弱した結合を示し、このことは、アデノシンに向かう酵素活性の改善およびヘパリンに対する結合の減弱を示す変異型の組合せが創出され得ることを例示している。
rHuADA2 WTおよび変異型の安定性は、漸増温度で示差走査蛍光定量法(DSF)によって測定した。DSFは、熱安定性と相関する、高次構造的な安定性を測定する。DSF中の融解温度(Tm)は、タンパク質アンフォールディング遷移の中間点と定義する。
非PEG化WT rHuADA2、非PEG化rHuADA2変異型、ならびにWT rHuADA2およびrHuADA2変異型のPEG化形態を、0.1〜1mg/mLの濃度で調製し、ROX(商標)タンパク質熱シフト色素(Applied Biosystems, Carlsbad, CA;カタログ番号4461146)と、125倍希釈のストックROX(商標)溶液に相当する最終色素濃度まで混合した。次いで、タンパク質試料を、三連で、1ウェルあたり20μLという容量で96ウェルプレート中にロードした。ViiA7 RT-PCR System(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)を用いて、試料の温度が上昇するにつれて、蛍光のシフトを測定した。その反応物を、以下の工程に供した:25℃で2分間のインキュベーション;25〜99℃の温度で1秒あたり0.05℃の速度の傾斜;続いて2分間、99℃でのインキュベーション。発光および励起に用いられる波長は、それぞれ、623ナノメートル(nm)および580nmであった。
rHuADA2のアデノシンデアミナーゼ活性および変異型を種々のpHで評価して、各々の最適pHを決定した。アデノシンデアミナーゼ活性は、アデノシン吸光度の変化の直接測定によって分光光度的に決定した。アデノシン(ADO)およびイノシン(INO)のUV吸収スペクトルは極めて類似しており、それらは有意に重複し、それぞれの吸光度ピークは261nmおよび249nmである。脱アミノ反応反応の間、ADOの吸光度は低下するが、INOの吸光度は時間とともに増大する。吸光度の動的な変化によって、単一波長で活性をモニターすることは困難になるので、相対的なADO活性は、等吸収点(すなわち、ADOおよびINOが同じ吸光係数を有する波長)に対するADOピークの比として決定した。253nmである等吸収点は、未変化のままであり、濃度とは独立しており、その結果、等吸収点は、容量または強度の矛盾について較正するための参照ポイントである。それゆえ、アデノシン濃度、したがってアデノシンデアミナーゼ活性の変化は、標準曲線に基づいて、261nmの吸光度/253nmの吸光度の比(A261/A253)として評価した。
ADOおよびINOについて標準曲線を作成するために、種々の濃度のADOおよびINOを含む0.001%のTween−20中の一連の溶液混合物を調製した。ADOおよびINO混合物の総濃度は、1×PBS(10mMのリン酸塩、137mMのNaCl、2.7mMのKCl)、pH7.4の中で50μMであった。この試料を、220nm〜300nmの波長を用いてスキャンして、全てのスペクトルが交差する等吸収点を決定した。表36は、標準曲線の測定値を示す。A261/A253比を、ADO濃度に対してプロットし、線形フィッティングによって、A261/A253=0.0249[ADO]−0.0152(R2=0.999)という標準曲線を生じた。
ADA2および変異型の分光光度的なアデノシンデアミナーゼアッセイを行うため、100mMのリン酸カリウム緩衝液(KPB)、種々のpH(すなわち、5.5、6、6.5、6.75、7、7.25、7.4、7.75および8)の0.1%のTween−20中に、10mMのADOを含有する2X溶液を調製した。2μg/mLのWT rHuADA2または変異型を含有する別の2×溶液を、同じ100mMリン酸カリウム緩衝液(KPB)、0.1%のTween−20中で、それぞれのpH(すなわち、5.5、6、6.5、6.75、7、7.25、7.4、7.75および8)で調製した。等容量のADO溶液およびADA2溶液(野性型または変異型)を混合して、反応を開始した。各時点(すなわち、1、3、5、7、9、11、13および15分)で、小さいアリコート(4μl)を取り出して、196μlの1×PBS、pH7.4に添加することによって50倍希釈した。希釈された試料をさらに、UV透明ハーフエリアプレート中の85μlの1×PBSへ85μlの試料を添加することによって、2倍(二連で)希釈した。各々の希釈された試料の253nmおよび261nmの吸光度を測定した。
アデノシン濃度は、A261/A253の比および標準曲線を用いて決定した。アデノシンデアミナーゼ活性は、1分あたりのADO濃度の負の変化×100によって測定した。
表37は、種々のpHで、分光光度的なアッセイによって測定した、アデノシンデアミナーゼ活性の結果を示す。この結果では、WT rHuADA2活性について最適pH(最高のデアミナーゼ活性)は、約6.5であることが示された。ADA2変異型K374D(成熟ナンバリングによるK371D)およびK374E(成熟ナンバリングによるK371E)は、WT rHuADA2と同様の活性pHプロファイルを有する。
Zavialovナンバリングによる、PEG化したADA2−K374D、PEG化したADA2−R222Q/S265NおよびPEG化したADA2−R222Q/S265N/K374D変異型(成熟ナンバリングによって、それぞれ、K371D、R219Q/S262NおよびR219Q/S262N/K371D)の薬物動態(PK)を、免疫適格性マウスモデルで分析した。
27匹の雄性BALB/cマウスを3つの投与群に分け、さらに、種々の時点で血液のサンプリングのために各々3つの群に分けた。したがって、マウスを全部で九(9)つの群に無作為化した。マウスは研究の開始前に秤量し、その体重に基づいて、9つの群に無作為化した。各々のサンプリング群では、動物から血液の過剰なサンプリングを防ぐために、3つの群の(3)マウスを、各試験品を投与するために用いた。ベースラインのADA2レベルを測定するために、血液試料を、12匹の無作為に選択したマウスから得て、血漿を、抗凝固剤カリウム(K3)エチレンジアミン四酢酸(K3−EDTA)を用いて調製した。全ての血液は顎下の静脈穿刺によって収集した。
各々のマウスに、表38に示される3つのPEG化ADA2変異型試験品(すなわち、PEG−rHuADA2−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)、PEG−rHuADA2−R222Q/S265N(成熟ナンバリングによるR219Q/S262N)またはPEG−rHuADA2−R222Q/S265N/K374D(成熟ナンバリングによるR219Q/S262N/K371D)のうちの1つの3mg/kg用量を、静脈内の尾静脈注射によって注射した。PEG化ADA2変異型は、わずかに改変して実施例8.Aに記載のとおり、PEG化方法を用いて調製した。要するに、全てのADA2変異型を、10mg/mLで、直鎖PEG−20K(JenKem Technology、Plano、TX;カタログ番号M−SCM−20K)を1:15モル比で用いてPEG化し、最初、37°で30分間、次いで4℃で16時間インキュベートした。SDS−PAGEおよび分析SECの結果、ADA2変異型の100%が、最適化されたPEG化条件下でPEG化され、全てのPEG化したADA2変異型が100%の酵素的活性を保持したことが示される。
約200μLの全血を、下の表38に示すようなマウスの適切な群から指定のサンプリング時点で収集し、血漿の調製まで氷上で保持した。最初の2つの血液試料は、顎下の静脈穿刺によって収集した。最終試料は、末端の採血から収集した。血漿は、血液を遠心分離すること(500×gで5分間、4℃)、血漿を新鮮なチューブに移すことおよびアデノシンデアミナーゼ活性アッセイまで−80℃で直ちに凍結することによって調製した。アデノシンデアミナーゼ活性は、実施例4に記載のとおり決定した。
1. 非PEG化rHuADA2 WTおよび変異型の薬物動態
PEG化したADA2変異型である、PEG−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)、PEG−R222Q/S265N(成熟ナンバリングによるR219Q/S262N)およびPEG−R222Q/S265N/K374D(成熟ナンバリングによるR219Q/S262N/K371D)の薬物動態学的(PK)特性を、表39および表40に示す。表39は、曲線下面積(AUC)算出を用いて測定した総暴露を示し、表40は、試験されたPEG化したrHuADA2変異型の半減期(t1/2)を示す。
この結果、PEG化は実質的に、ADA2の薬物動態学的プロファイルを改善し、かつ全ての試験されたPEG化したADA2変異型が、非PEG化のWT rHuADA2よりも有意に高いAUCおよび長い半減期を呈したことが示される(実施例9、ならびに表26および表27を参照のこと)。PEG−R222Q/S265N(成熟ナンバリングによるR219Q/S262N)は、最大の改善を呈し、AUCは、非PEG化WT rHuADA2よりも49661%高く、かつ半減期は、非PEG化WT rHuADA2よりも4043%長かった。PEG−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)は、試験品を調製するのに用いられる最適化PEG条件に起因し得る、実施例9ならびに表26および27における同じ試験品群と比べてPK特性の大きい改善を呈した。
追加の組合せ変異型を生成し、これは、酵素活性が増大したアミノ酸置換および/またはヘパリン結合の減弱をもたらすアミノ酸置換を組み合わせており、他の活性の変更をもたらす、欠失/挿入/置換およびアミノ酸置き換えなどの他の修飾を有する。具体的には、実施例10に記載の酵素活性の最大増大をもたらす、アミノ酸置換S265Nおよび/またはR222Q(成熟ナンバリングによる、S262Nおよび/またはR219Q)を、前の実施例に記載の他のADA2修飾と組み合わせた。アミノ酸置き換えK374D(成熟ナンバリングによるK371D)をまた、前の実施例に記載の他のADA2修飾とも組み合わせた。組合せ変異型は、表41に示される。
配列番号588〜593に示される、K374D変異(成熟ナンバリングによるK371D)および(GGGGS)nリンカーで置き換えたPRB欠失を含む、組合せ変異型を、上記実施例11.Aに記載のアッセイ法を用いて、アデノシンデアミナーゼ活性の反応速度論的パラメーターについて評価した。第1セットの変異型は、種々の長さの(GGGGS)nリンカー(例えば、n=1、2または3;配列番号588〜590に記載する)で置き換えられた、残基V102〜Q147(成熟ナンバリングによるV99〜Q144)の欠失を含み、第2のセットの変異型は、種々の長さの(GGGGS)nリンカー(例えば、n=1、2または3;配列番号591〜593に記載する)で置き換えられた、残基C108〜T150(成熟ナンバリングによるC105〜T147)の欠失を含む。反応速度論的パラメーターを、pH7.6で試験し、結果を表42に示す。
この結果では、全ての試験されたADA2 PRBドメイン欠失変異体が酵素活性を保持し、かつ一般にはWT ADA2と比較して、約5〜7倍低いKmおよび8〜11倍高い触媒効率(kcat/Km)をpH7.6で呈することが示される。
マウスCT26同系腫瘍モデルを用いて、ADA2の抗腫瘍活性を評価した。
44匹の雄性BALB/cマウスに、動物1匹あたり0.1mLの注射容量で5×106個のマウス結腸がん腫瘍細胞(CT26、ATCC CRL−2638)を皮下注射した。腫瘍容量は、固形腫瘍塊の長さ(L)および幅(W)のキャリパー測定によってデジタルキャリパーを用いて決定した。腫瘍容量(TV)は、(L×W2)/2として算出した。腫瘍を増殖させて、腫瘍保有マウスを、腫瘍が触診可能であり、かつ約50〜100mm3であると測定される時まで病期分類した。
PEG化rHuADA2−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)を、わずかに改変して、実施例8.Aに記載のとおり調製して、分子のうちほぼ100%がSDS−PAGEで評価してPEG化されている、調製物を生成した。要するに、10mg/mLでのrHuADA2−K374D(成熟ナンバリングによるK371D)の調製を、直鎖PEG−20K(JenKem Technology,Plano,TX;カタログ番号M−SCM−20K)と、1:15モル比で混合し、最初に4℃で16時間、次いで30℃で60分間インキュベートした。
処置のために、動物を4つの群(n=8/群)に無作為化した。次いで、CT26腫瘍保有マウスに、1日おきに、3mg/体重kg、10mg/体重kgもしくは30mg/体重kg用量のPEG−K374D(成熟ナンバリングによるPEG−K371D)または媒体対照(緩衝液のみ)を1日おきに静脈内注射した。腫瘍容量は、上記のようなキャリパー測定を用いて0日目および8日目に測定した。各々のそれぞれの腫瘍モデルについての腫瘍増殖阻害(Tumor Growth Inhibition:TGI)パーセントは、以下の式を用いて算出した:
%TGI=[1−(Tn−T0)÷(Cn−C0)]×100%
式中、「Tn」は、最終用量のPEG−K374Dまたは対照の後、「n」日目での処置群についての平均腫瘍容量であり;「T0」は、処置前、0日目の処置群の平均腫瘍容量であり;「Cn」は、「n」日目での対応する対照群についての平均腫瘍容量であり;「C0」は、処置前、0日目の対照群における平均腫瘍容量である。媒体群由来の1匹のマウスを、有意な腫瘍増殖阻害に起因して排除した。
表43は、媒体注射対照と比較して、PEG−K374Dを投与されたマウス中で8日目の平均腫瘍容量および腫瘍増殖阻害の結果を示す。8日目に、媒体対照群の平均腫瘍容量は、446.67mm3であった(n=7)。3mg/kgのPEG−K374Dを注射した群では、平均腫瘍容量は257.72mm3であって、これは50%の腫瘍増殖阻害(TGI)を示す(n=8;p値=0.037)。10mg/kgのPEG−K374Dを注射した群では、平均腫瘍容量は207.84mm3であって、63%のTGIを示す(n=8;p値=0.0056)。30mg/kgのPEG−K374Dを注射された群では、平均腫瘍容量は187.32mm3であって、これは68%のTGIを示す(n=8;p値=0.0085)。この結果、PEG−K374Dの投与は、有意な腫瘍増殖阻害を生じることが示される。
マウスCT26同系腫瘍モデルを用いて、チェックポイント阻害剤抗PD−1および抗CTLA4抗体によるPEG化したADA2を用いる併用療法の抗腫瘍活性を比較した。CT26同系腫瘍を、雄性Balb/Cマウスの右脛骨周囲の筋肉中に1匹の動物あたり0.05mLの注射溶液に含まれる2×105個のCT26細胞を注射することによって生成した。腫瘍保有マウスを、平均の腫瘍のサイズが150mm3に達する時に処置群に分類した。
処置のために、動物を以下のとおり8群(n=8/群)に無作為化した:1)生理食塩水媒体対照、2)PEG−ADA2−K374D、3)α−CTLA4抗体(Clone 9D9、カタログ番号BE0164;BioXCell, West Lebanon, NH, 4)α−PD−1抗体(Clone RMP1-14、カタログ番号BE0146;BioXCell, West Lebanon, NH)、5)PEG−ADA2−K374D+α−CTLA4;6)PEG−K374D+α−PD−1;7)α−CTLA4+α−PD−1または8)三つ組みの組合せ(triple combo)(PEG−ADA2−K374D+α−CTLA4+α−PD−1)。PEG−ADA2−K374Dを、10mg/kgで週に3×静脈内投与し、α−CTLA4を、4mg/kgで週に2回腹腔内投与し、α−PD−1は、週に2回4mg/kgで腹腔内投与した。組合せ群での投与の順序は以下のとおりであった:PEG−ADA2−K374D、続いて、α−CTLA4、続いてα−PD−1。
腫瘍容量は、Vevo2100(Visual Sonics, Toronto, Canada)を用いて超音波画像化を介して毎週2回評価して、腫瘍増殖阻害(TGI)を決定した。動物を、腫瘍容量を測定する間、浅いイソフルラン麻酔を用いて麻酔した。腫瘍測定のために、目的の領域を超音波ゲル(Parker Laboratories, Fairfield, NJ)中でカバーし、RMV−716(焦点深度=17.5mm)スキャンヘッドを、目的の領域上に直接配置した。2Dモードの間、腫瘍のほぼ中心を配置させて、引き続き、画像(約150〜200フレーム)を、3Dモードを用いてキャプチャーした。150〜200フレームのうちほぼ15〜30フレームを分析し、腫瘍容量を算出して、mm3で表した。腫瘍増殖阻害(TGI)は上記のように算出した。
腫瘍微小環境または正常臓器中の投与されたPEG−ADA2−K374Dの分布および排出を評価するために、免疫蛍光を用いて、マウスに投与されたPEG−ADA2−K374Dの存在を評価した。PEG−ADA2−K374Dは、室温で60分間、DyLight755スルフヒドリル反応色素(Sulfydryl-Reactive Dye)(DL755)、近IR蛍光を用いて、DyLight 755抗体標識キット(Thermo Scientific,Rockford,IL)を用いて標識した。Alexa Fluor 750(AF 750)標識したウシ血清アルブミン(BSA, 1mg/mL)から購入した(Life Technology,Carlsbad,CA)。
CT26同系腫瘍を、雄性Balb/Cマウスの右脛骨周囲筋肉への動物1匹あたり0.05mLの注射容量で2×105個の細胞を注射することによって生成した。平均の腫瘍のサイズが600mm3に達する時、腫瘍保有マウスを、PEG−ADA2−K374DDL755の0.5mg/kgまたはBSAAF750の0.5mg/kgのいずれかを静脈内に投与するために2群(n=4/群)に分類した。マウスの腫瘍における、DL755標識したPEG−ADA2−K374D(PEG−ADA2−K374DDL755)およびAF 750標識したBSA(BSAAF750)の分布は、745nmの励起波長および800nmの発光波長によるIVIS Calipe蛍光画像化システム(Caliper Life Sciences, Alameda, CA)を用いて評価し、シグナル強度は、LivingImageソフトウェアを用いて測定した。画像を、標識したタンパク質の投与前に、ならびに標識タンパク質の投与後、10分、2、6時間および毎日撮った。
ナイーブなマウスにおける分布を比較するために、CT26−腫瘍保有マウスを、上記のように生成し、PEG−ADA2−K374DDL755を0.5mg/kgで静脈内に投与した(n=3)。別に、ナイーブなBalb/cマウスはまた、PEG−ADA2−K374DDL755を0.5mg/kgで静脈内投与された(n=4)。そのマウスを屠殺して、PEG−ADA2−K374DDL755注射24時間後にヘパリン添加生理食塩水を、心臓を通じてかん流させた。腫瘍保有マウス由来の腫瘍およびナイーブなマウス由来の臓器を収集して、IVIS画像システムで画像化して、DL755シグナル強度を、上記のとおりLivingImageソフトウェアを用いて測定した。シグナル強度は、組織臓器重量によって正規化した。
マウスMH194+PSC4同系腫瘍モデルを用いて、PEG化組換えアデノシンデアミナーゼ2(ADA2)、PEG化したrHuADA2−R222Q/S265N(PEG−R222Q/S265N;成熟ナンバリングによるPEG−R219Q/S262N)の抗腫瘍有効性を評価した。MH194マウス膵臓がん細胞を、KrasLSL.G12D/+p53R172H/+PdxCretg/+遺伝子操作マウスモデルから誘導する。PSC4細胞を単離して、膵臓の星状細胞を不死化する。
マウスMH194+PSC4同系腫瘍モデルを用いて、PEG化組換えアデノシンデアミナーゼ2(ADA2)、PEG化rHuADA2−R222Q/S265N(PEG−R222Q/S265N;成熟ナンバリングによるPEG−R219Q/S262N)の抗腫瘍有効性を評価した。
PSC4細胞を単離して、膵臓の星状細胞を不死化する。PSC4細胞を生成するために、C57BL/6マウス由来の膵臓を剃刀の刃で刻んで、Geyの平衡塩溶液(GBSS)に含有される0.05%のコラゲナーゼP、0.1%のDNAseおよび0.02%のプロナーゼを含有する2mLの消化緩衝液中に入れた。各々のインキュベーションの後、よく混合して37℃の2回の15分の消化インキュベーションの後、得られた細胞懸濁液を、100μmのナイロンメッシュを通してろ過し、0.3%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むGBSS中で2回洗浄して、10mLのGBSS/BSA中に再懸濁した。8mLのHistodenz(Sigma、カタログ番号D2158)を細胞懸濁液に添加して、全体の容量を6mLのGBSS/BSA下でピペッティングして、不連続密度勾配を生成した。ゼロでブレーキセットで1,400gで20分間の遠心分離後、所望の細胞を2つの密度容量の間の境界面から回収して、PBSを用いて1回および2mMのLグルタミン、10%のウシ胎仔血清および1%のアンホテリシンB(完全DMEM)を補充したDMEM培地を用いて1回洗浄した。細胞を、製造業者のプロトコールを用いて、Lenti-SV40(Capital Biosciences、カタログ番号CIP−0011)を用いて不死化した。PSC4と命名される、得られた細胞株を、完全DMEM中で粘着性の単層として組織培養中で、37℃かつ5%CO2で維持した。MH194マウス膵臓がん細胞は、KrasLSL.G12D/+p53R172H/+PdxCretg/+遺伝子操作されたマウスモデルに由来する。
MH194+PSC4同系腫瘍モデルを生成するために、マウス(Taconic Farmsから4〜6週で入手して、1ケージあたり4匹収容した雄性C57BL/6マウス)に、右脛骨骨膜に隣接して、筋肉内に、5×105個のPSC4(全部で5×106個の細胞)とともに親のMH194細胞を含む50μLの細胞懸濁物を注射した。
PEG−R222Q/S265Nを、わずかに改変して、実施例8.Aに記載されるものと同様の方法を用いて調製し、分子のうち約100%がSDS−PAGEによって評価した場合PEG化された調製物を生成した。要するに、rHuADA2−R222Q/S265N(成熟ナンバリングによるR219Q/S262N)の10mg/mLの調製物を、直鎖PEG−20K(JenKem Technology,Plano,TX;カタログ番号M−SCM−20K)とともに1:15のモル比で混合し、最初に4℃で16時間、次いで30℃で60分インキュベートした。
%TGI=[1−(Tn−T0)÷(Cn−C0)]×100%
式中、「Tn」は、PEG−R222Q/S265Nまたは対照の最終投与後「n」日目での処置群についての平均腫瘍容量であり;「T0」は、その処置群の0日目(処置前)の平均腫瘍容量であり;「Cn」は、「n」日目での対応する対照群の平均腫瘍容量であり;かつ「C0」は、0日目(処置前)の対照群における平均腫瘍容量である。中央生存時間(MST)(日数)とは、個々の群のマウスの50%が以下のエンドポイントのうちの1つに達した時点として算出した:(1)腫瘍容量が2000mm3に達する時か、(2)動物が、その体重のうち25%超を失う時かまたは(3)動物が瀕死とみられる時。
表47は、媒体対照と比較して、PEG−R222Q/S265Nを投与されたマウスでの11日目の平均腫瘍容量および腫瘍増殖阻害の結果を示す。11日目に、媒体対照群の平均腫瘍容量は、約840mm3であった。PEG−R222Q/S265N(0.003mg/kg)で処置された群については、平均腫瘍容量は約324mm3であって、対照群に対して、約72%(n=8;p=0.036)という腫瘍増殖阻害(TGI)であり、これによって、PEG−R222Q/S265N投与は、有意な腫瘍増殖阻害を生じることが実証される。
マウス肺がんKLN205同系腫瘍モデルを用いて、チェックポイント阻害剤抗PD−1抗体と組み合わせたPEG化したADA2−K374D(PEG−K374D;成熟ナンバリングによるPEG−K371D)の抗腫瘍活性を比較した。
KLN205同系腫瘍モデルを、1匹の動物あたり0.1mLの注射容量中に含有される、5×105 KLN205マウス肺がん腫瘍細胞(ATCC CRL−1453)を、32匹のDBA/2マウスに皮下注射することによって生成した。腫瘍保有マウスを、平均の腫瘍のサイズが約100mm3に達する時に処置群に分類した。
処置に関して、動物を4つの群(n=8/群)に無作為化した:1)生理食塩水媒体対照、2)PEG−K374D、3)α−PD−1抗体(Clone RMP1-14、カタログ番号BE0146;BioXCell, West Lebanon, NH)または4)PEG−K374D+α−PD−1。PEG−K374Dは、0.3mg/kgで週に2回静脈内投与し、α−PD−1は、2mg/kgで週に2回腹腔内に投与した)。併用群における投薬の順序は、PEG−K374Dの直後にα−PD−1であった。腫瘍容量は、実施例17.Aにおいて上記されるようにキャリパー測定を用いて週に2回測定した。各々のそれぞれの腫瘍モデルについての腫瘍増殖阻害(TGI)パーセントは、以下の式を用いて算出した:
%TGI=[1−(Tn−T0)÷(Cn−C0)]×100%
式中、「Tn」は、PEG−K374Dおよびα−PD−1または対照の最終投与後「n」日目での処置群についての平均腫瘍容量であり;「T0」は、その処置群の0日目(処置前)の平均腫瘍容量であり;「Cn」は、「n」日目での対応する対照群の平均腫瘍容量であり;かつ「C0」は、0日目(処置前)の対照群における平均腫瘍容量である。
コンジュゲートしていない、遊離PEG化部分を、Capto Phenyl樹脂カラムを用いて、PEG化ADA2変異型に対する反応から除去した。遊離PEGを、実施例8.Aおよび20.Aに記載のPEG化方法を用いて調製した、PEG化ADA2−K374D(PEG−K374D;成熟ナンバリングによるPEG−K371D)およびPEG化rHuADA2−R222Q/S265N(PEG−R222Q/S265N;成熟ナンバリングによるPEG−R219Q/S262N)の調製物から取り出した。
PEG−K374D調製物から遊離PEGを除去するために、3.5Mの硫酸アンモニウムを、PBS中のPEG−K374Dに添加して、PBS中で0.70Mの硫酸アンモニウムという最終濃度を達成した。次いで、硫酸アンモニアとともにPEG−K374Dを、PBS中に0.70Mの硫酸アンモニウムで事前平衡化したCapto Phenyl樹脂カラム(GE Healthcare)に対して、1mlの樹脂あたり5mgのPEG化タンパク質という比で加えた。ロードされたCapto Phenyl樹脂を、PBS中の0.70Mの硫酸アンモニウムの10カラム溶液で洗浄した。PEG−K374Dを、PBS中の0.70M硫酸アンモニウムから、PBS中の0Mの硫酸アンモニウムまで漸減する勾配で溶出した。40%勾配溶出(PBS中の0.42M硫酸アンモニウム)後に溶出した画分をプールした。プールした溶出画分を、1〜2mg/mLの濃度まで濃縮し、SDS−PAGEによって分析した。遊離PEGを、Corona(商標)Charged Aerosol Detector(Thermo Scientific,Sunnyvale, CA)を用いて検出した。
全身投与のために、ヒアルロニダーゼ、例えば可溶性ヒアルロニダーゼを、リポソームなどの脂質小胞中に調製してもよい。これらの例は、多小胞体リポソーム(MVL)である。種々の徐放性の多小胞体リポソームPH20(MVL−PH20)製剤を、以下の一般的手順を用いて調製した。またPCT公開番号WO2012/109387および米国特許出願公開第2013/0251786も参照のこと。この脂質溶液は、種々の中性脂質の混合物、例えば、トリグリセリド(TG)トリオレイン(C18:1)、トリカプリリン(C8:0)およびコレステロール、ならびに正の電荷および負の電荷を有する脂質、例としては、ホスファチジルコリン類(PC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC、C18:1)、ジエルコイルホスファチジルコリン(DEPC、C22:1)およびジパルミトイルホスホリルグリセロール(DPPG、C16:1)が挙げられる。総PC濃度は最大19.8mMであって、コレステロール濃度は30mM、TG濃度は最大3.9mMであって、DPPG濃度は4.2mMであった。
種々のモルパーセントのDEPCおよびDOPC(0〜100%)、ならびに種々のモルパーセントのトリオレインおよびトリカプリリン(0〜100%)、DPPG、コレステロールおよび0.1、0.25、0.5、1または2mg/mLのPH20を含むMVL製剤を調製した。第1の工程では、クロロホルム中の脂質(油相)および第1の水溶液中のPH20(水相)を組み合わせて、乳化して、油中水型エマルジョンを形成し、それによって、PH20を、リン脂質単層によってカプセル化した。第2の工程では、第2の水溶液を添加して、乳化し、それによって水中油中水型(water−in−oil−in−water)エマルジョンを形成した。第2の水溶液の第2のアリコートの添加後、クロロホルム溶媒を蒸発させて、多小胞体リポソームを含む得られた生成物を、第3の水溶液中で数回洗浄して、約50%のリポクリット(パックされた粒子容量)に再懸濁し、2〜8℃で保管した。
例示的な製剤は、ミニボルテックスを用いて調製するかまたはOmniミキサー(Omni Macro ES, Omni International, Kennesaw, GA)を用いて大規模に調製した。後者のOmniミキサー法では、クロロホルム(6mL)に含有される脂質溶液を、7,000rpmで8分間、Omniミキサーを用い、6mLの第1の水溶液[10mMのHis−HCl、pH6.5、5%スクロースを含む(種々の濃度のPH20含有)]で乳化して、油中水型エマルジョンを生成した。40mMのリジン(pH10.0)を含有する3.2%グルコースの20mLの第2の水溶液を用いて1〜3分間、4500rpmで引き続き乳化して、水中油中水型の第2のエマルジョンを得た。この第2のエマルジョンを、2つのエーレンマイヤーフラスコに等しく移し、別の50mLアリコートの第2の水溶液を、両方のフラスコに添加した。そのエマルジョンの表面上に窒素をフラッシュすることによって、35℃でクロロホルムを取り除いた。PH20を含有するMVL粒子を、50mLの第3の水溶液[25mMのHis−HCl緩衝液、pH6.0(120mMのNaClを含む)]を用いて、この溶液を添加すること、反転して遠心分離管を混合することおよび冷蔵卓上遠心分離器で、4℃で3500rpmで、10分間の遠心分離によって、3回洗浄した。最終的に、MVL粒子を第3の水溶液中に再懸濁して、約50%のリポクリット製剤を形成して、2〜8℃で凍結保存した。ミニボルテックス手順は同様であって、表30に示すパラメーターを用いた。
種々のモル比の脂質、PH20および他の添加物を含有するいくつかのMVL−PH20製剤を、上記と同じ一般的手順を用いて調製した。種々の追加の添加物を、第1の水溶液中に含めて、カプセル化したPH20の安定性を向上または保存した。例えば、製剤F68およびF69は、塩化カルシウムを含んだ。製剤F82は、600μLのクロロホルム相および600μLの第1の水溶液相を分ける中間相として150μLのグリセロールを含んだ。製剤F83は、0.1%デキストラン40,000および0.1%のPEG−6000を含んだ。製剤F85−F87は、ヒアルロン酸(HA)オリゴマーを含んだ。いくつかの製剤は、それらの混合/乳化手順で変化した。例えば、製剤F66に関しては、第1の乳化工程を、8分ではなく4分行い、それによって少量のリポソームペレットを得た。製剤F67を、ミニボルテックスではなくローターホイールで混合して、混合の間に生じる剪断を少なくした。
2液体溶液中の血小板由来コレステロールの代わりに用いられる動物由来のコレステロール
3第1のエマルジョン混合時間がより短く(4分)、第2のエマルジョン混合時間がより短い(30秒)
表53は、本明細書に例証される変異型ADA2ポリペプチドのまとめを示す。この表は、Zavialovナンバリングおよび成熟配列ナンバリングに基づく修飾の位置、ならびにこのような修飾を含むADA2変異型のタンパク質の例示的な配列番号を示す。修飾が組み合わされてもよいことおよび追加の変異型が考慮されることが理解される。注記されたアミノ酸残基は一般には、保存的置換がグリコシル化部位を創出しない過グリコシル化などの場合を除き、保存的アミノ酸置換(例えば、表3を参照のこと)で置き換えてもよい。したがって、例えば、Nは、QまたはHで置き換えられてもよい。各々の注記された修飾を含むADA2変異型ポリペプチドが示される。これらの中でも、配列が配列識別子で参照されるポリペプチドが含まれる。任意の修飾の組合せも提供される。また、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含む、修飾されたADA2変異型二量体も提供される。また提供されるのは変異型の多量体である。また、本明細書に記載されるような処置方法、処置のための使用、併用および医薬組成物と同様、変異型および多量体および二量体を含むコンジュゲートも提供される。最後の列は、修飾の領域もしくはドメインまたは修飾が付与する活性を同定する。一般には、変異は、例えば、活性を増大するか、ヘパリン結合を低下するか、望ましくない相互作用を妨げるグリコシル化を誘導するかおよび/または血清半減期を延長するか、ADA触媒活性部分を有するPRBドメインの相互作用を妨げるかもしくは低下するかおよび/またはデアミナーゼ活性以外の活性、例えば、このような活性を媒介する受容体に対する結合を妨げることによってADA2の増殖因子活性を低下する。
Claims (209)
- 未修飾アデノシンデアミナーゼ2(ADA2)ポリペプチドまたはその触媒活性部分のアミノ酸の配列において修飾を含む変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分であって、
未修飾ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸の配列、もしくは配列番号5に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも85%配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むかまたはそれらの触媒活性部分であり、
アミノ酸修飾がアミノ酸置き換え、欠失および挿入の中から選択され、
変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、配列番号5の未修飾ADA2タンパク質の相当する二量体形態またはその相当する触媒活性部分の二量体形態と比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の増加、ヘパリン結合の低減、より長い血清半減期、pH最適条件の変更、熱安定性の増加、受容体結合の変更および過グリコシル化の中から選択される1以上の特性を示し、
変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性を示して、アデノシンをイノシンに変換する、
変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。 - 二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性の増加またはアデノシンデアミナーゼ活性の増加およびヘパリン結合の低減を示す、請求項1に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 未修飾ADA2タンパク質がホモ二量体であり、単量体形態が配列番号5に記載するアミノ酸残基の配列を含む、請求項1または2に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 未修飾ADA2タンパク質が配列が配列番号5に記載されるポリペプチドの相当する触媒活性部分のホモ二量体であり、相当する部分がアラインメントにより決定される、請求項1または2に記載の変異型ADA2タンパク質の触媒活性部分。
- ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸残基に関するナンバリングを用いて、H7R、G18A、G18R、G18V、I64T、A80D、H83Q、V90A、C108G、A120V、H121R、W133G、R125C、R140Q、K141R、R142W、P164L、P222L、W235S、H306R、E330G、W333G、V365L、Y424C、F464Sに相当するアミノ酸置き換えまたはR8−K14del→−−に相当する欠失の中から選択される修飾を含有しない、請求項1〜4のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 未修飾ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸の配列またはその相当する触媒活性部分に対して少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 未修飾ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸の配列とまたはその相当する触媒活性部分と少なくとも95%配列同一性を有する、請求項1〜6のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 未修飾ADA2タンパク質が配列番号5、326〜334、340、375および380〜383のいずれかに記載するアミノ酸の配列を含むかまたはその触媒活性部分である、請求項1〜7のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 未修飾ADA2タンパク質が配列番号5、326〜334、340、375および380〜383のいずれかに記載するアミノ酸の配列からなるかまたはその触媒活性部分である、請求項1〜7のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 未修飾ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 未修飾ADA2タンパク質の触媒ドメインが配列番号5に記載するタンパク質の残基77〜473として記載される配列を有する、請求項1〜10のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 変異型ADA2タンパク質が最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70個またはそれ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項1〜11のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異体が最大2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸修飾を含む、請求項1〜12のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- ADA2タンパク質変異体の一次アミノ酸配列が配列番号1、5、68、286〜302、326〜342または374〜383のいずれかに記載するアミノ酸の配列からならない、請求項1〜13のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約5×103M−1s−1、6×103M−1s−1、7×103M−1s−1、8×103M−1s−1、9×103M−1s−1、1×104M−1s−1、2×104M−1s−1、3×104M−1s−1、4×104M−1s−1、5×104M−1s−1、6×104M−1s−1、7×104M−1s−1、8×104M−1s−1、9×104M−1s−1、1×105M−1s−1、2×105M−1s−1、3×105M−1s−1、4×105M−1s−1、5×105M−1s−1またはそれ以上である触媒効率(kcat/KM)を示す、請求項1〜14のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、少なくとも58℃の融解温度(Tm)を有して熱安定性を示す、請求項1〜15のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- Tmが少なくとも59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃またはそれ以上である、請求項16に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 修飾がアミノ酸置き換えであり、
変異型ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基11、13、20、22、26、86、179、217、219、221、258、262、264、266、267、277、283、296、309、317、321、352、366、371、372、373、374、403、404、405、406、441、444、452、461、469または470に相当するアミノ酸位置で、1以上のアミノ酸置き換えを含む、
請求項1〜17のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。 - 配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基11、20、109、118、119、124、133、139、183、191、219、221、224、262、264、366、371、372または452に相当するアミノ酸位置で、1以上のアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜17のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 修飾がアミノ酸置き換えであり、
変異型ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基219および262に相当する位置の一方または両方でアミノ酸置き換えを含む、
請求項1〜19のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。 - S262NまたはS262Qに相当する置き換えを含む、請求項1〜19のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- S262Nに相当する置き換えを含む、請求項1〜19のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R219K、R219Q、R219NまたはR219Aに相当する置き換えを含む、請求項1〜22のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R219Qに相当する置き換えまたは置き換えR219Q/R20Eを含む、請求項1〜23のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R219Q/S262Nに相当する置き換えを含む、請求項1〜24のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R219Q/S262N/R20N/V22S、R219Q/S262N/K371N/D373S、R219Q/S262N/K372N/I374S、R219Q/S262N/T403N/H405S、R219Q/S262N/G404N/P406S、R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)15、R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)10、R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)7、R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)5、R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)3、R219Q/S262N/R125N/P126A、R219Q/S262N/S127N/K129S、R219Q/S262N/P126N/E128T、R219Q/S262N/R112N/I114T、R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T、R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T、R219Q/S262N/R142N/Q144S、R219Q/S262N/E137N/Y139T、R219Q/S262N/P111N/G113S、R219Q/S262N/F119S、R219Q/S262N/F119K、R219Q/S262N/Y224R、R219Q/S262N/Y224N、R219Q/S262N/Y191S、R219Q/S262N/Y191D、R219Q/S262N/F183K、R219Q/S262N/Y191D/Y224R、R219Q/S262N/F109S、R219Q/S262N/F109A、R219Q/S262N/R118D、R219Q/S262N/R118A、R219Q/S262N/Y139T、R219Q/S262N/Y139A、R219Q/S262N/W133S、R219Q/S262N/W133T、R219Q/S262N/P124A、R219Q/S262N/P124S、R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)1、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)2、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)n、R219Q/S262N/K11A、R219Q/S262N/K11D、R219Q/S262N/K11E、R219Q/S262N/K13A、R219Q/S262N/K13D、R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/N98−N156del、R219Q/S262N/C105−E148del、R219Q/S262N/C105−T147del、R219Q/S262N/V99−Q144del、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)n、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)15、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)10、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)7、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)5、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)3、R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)n、R219Q/S262N/K371D/N98−N156del、R219Q/S262N/K371D/C105−E148del、R219Q/S262N/K371D/C105−T147del、R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del、R219Q/S262N/K13E、R219Q/S262N/K371A、R219Q/S262N/K372A、R219Q/S262N/K372D、R219Q/S262N/K372E、R219Q/S262N/K452A、R219Q/S262N/K452D、R219Q/S262N/K452E、R219Q/S262N/R20A、R219Q/S262N/R20D、R219Q/S262N/R366A、R219Q/S262N/R366D、R219Q/S262N/R366E、R219Q/S262N/H264A、R219Q/S262N/H264Q、R219Q/S262N/H264N、R219Q/S262N/H264G、R219K/S262N、R219N/S262N、R219A/S262N、R219Q/S262N/L221A、R219Q/S262N/L221V、R219Q/S262N/L221G、R219Q/S262N/E179D、R219Q/S262N/E179A、R219Q/S262N/E179S、R219Q/S262N/E179T、R219Q/S262N/E179V、R219Q/S262N/E179G、R219Q/S262A、R219Q/S262V、R219Q/S262M、R219Q/S262N/K11A/R20A、R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A、R219Q/S262N/R20A/K371A、R219Q/S262N/K11A/K371A、R219Q/S262N/K26A、R219Q/S262N/K26D、R219Q/S262N/K26E、R219Q/S262N/R217A、R219Q/S262N/R217D、R219Q/S262N/R217E、R219Q/S262N/K258A、R219Q/S262N/K258D、R219Q/S262N/K258E、R219Q/S262N/R277A、R219Q/S262N/R277D、R219Q/S262N/R277E、R219Q/S262N/R283A、R219Q/S262N/R283D、R219Q/S262N/R283E、R219Q/S262N/K309A、R219Q/S262N/K309D、R219Q/S262N/K309E、R219Q/S262N/K317A、R219Q/S262N/K317D、R219Q/S262N/K317E、R219Q/S262N/K321A、R219Q/S262N/K321D、R219Q/S262N/K321E、R219Q/S262N/R352A、R219Q/S262N/R352D、R219Q/S262N/R352E、R219Q/S262N/R441A、R219Q/S262N/R441D、R219Q/S262N/R441E、R219Q/S262N/K444A、R219Q/S262N/K444D、R219Q/S262N/K444E、R219Q/S262N/K461A、R219Q/S262N/K461D、R219Q/S262N/K461E、R219Q/S262N/K469A、R219Q/S262N/K469D、R219Q/S262N/K469E、R219Q/S262N/K470A、R219Q/S262N/K470D、R219Q/S262N/K470E、R219Q/S262N/D86A、R219Q/S262N/D86C、R219Q/S262N/D86E、R219Q/S262N/D86F、R219Q/S262N/D86G、R219Q/S262N/D86H、R219Q/S262N/D86I、R219Q/S262N/D86K、R219Q/S262N/D86L、R219Q/S262N/D86M、R219Q/S262N/D86N、R219Q/S262N/D86P、R219Q/S262N/D86Q、R219Q/S262N/D86R、R219Q/S262N/D86S、R219Q/S262N/D86T、R219Q/S262N/D86V、R219Q/S262N/D86W、R219Q/S262N/D86Y、R219Q/S262N/E179C、R219Q/S262N/E179F、R219Q/S262N/E179H、R219Q/S262N/E179I、R219Q/S262N/E179K、R219Q/S262N/E179L、R219Q/S262N/E179M、R219Q/S262N/E179N、R219Q/S262N/E179P、R219Q/S262N/E179Q、R219Q/S262N/E179R、R219Q/S262N/E179W、R219Q/S262N/E179Y、R219C/S262N、R219D/S262N、R219E/S262N、R219F/S262N、R219G/S262N、R219H/S262N、R219I/S262N、R219L/S262N、R219M/S262N、R219P/S262N、R219S/S262N、R219T/S262N、R219V/S262N、R219W/S262N、R219Y/S262N、R219Q/S262N/L221C、R219Q/S262N/L221D、R219Q/S262N/L221E、R219Q/S262N/L221F,R219Q/S262N/L221H,R219Q/S262N/L221I、R219Q/S262N/L221K、R219Q/S262N/L221M、R219Q/S262N/L221N、R219Q/S262N/L221P、R219Q/S262N/L221Q、R219Q/S262N/L221R、R219Q/S262N/L221S、R219Q/S262N/L221T、R219Q/S262N/L221W、R219Q/S262N/L221Y、R219Q/S262C、R219Q/S262D、R219Q/S262E、R219Q/S262F、R219Q/S262G、R219Q/S262H、R219Q/S262I、R219Q/S262K、R219Q/S262L、R219Q/S262P、R219Q/S262Q、R219Q/S262R、R219Q/S262T、R219Q/S262W、R219Q/S262Y、R219Q/S262N/H264C、R219Q/S262N/H264D、R219Q/S262N/H264E、R219Q/S262N/H264F、R219Q/S262N/H264I、R219Q/S262N/H264K、R219Q/S262N/H264L、R219Q/S262N/H264M、R219Q/S262N/H264P、R219Q/S262N/H264R、R219Q/S262N/H264S、R219Q/S262N/H264T、R219Q/S262N/H264V、R219Q/S262N/H264W、R219Q/S262N/H264Y、R219Q/S262N/S266A、R219Q/S262N/S266C、R219Q/S262N/S266D、R219Q/S262N/S266E、R219Q/S262N/S266F、R219Q/S262N/S266G、R219Q/S262N/S266H、R219Q/S262N/S266I、R
219Q/S262N/S266K、R219Q/S262N/S266L、R219Q/S262N/S266M、R219Q/S262N/S266N、R219Q/S262N/S266P、R219Q/S262N/S266Q、R219Q/S262N/S266R、R219Q/S262N/S266T、R219Q/S262N/S266V、R219Q/S262N/S266W、R219Q/S262N/S266Y、R219Q/S262N/K267A、R219Q/S262N/K267C、R219Q/S262N/K267D、R219Q/S262N/K267E、R219Q/S262N/K267F、R219Q/S262N/K267G、R219Q/S262N/K267H、R219Q/S262N/K267I、R219Q/S262N/K267L、R219Q/S262N/K267M、R219Q/S262N/K267N、R219Q/S262N/K267P、R219Q/S262N/K267Q、R219Q/S262N/K267R、R219Q/S262N/K267S、R219Q/S262N/K267T、R219Q/S262N/K267V、R219Q/S262N/K267W、R219Q/S262N/K267Y、R219Q/S262N/V296A、R219Q/S262N/V296C、R219Q/S262N/V296D、R219Q/S262N/V296E、R219Q/S262N/V296F、R219Q/S262N/V296G、R219Q/S262N/V296H、R219Q/S262N/V296I、R219Q/S262N/V296K、R219Q/S262N/V296L、R219Q/S262N/V296M、R219Q/S262N/V296N、R219Q/S262N/V296P、R219Q/S262N/V296Q、R219Q/S262N/V296R、R219Q/S262N/V296S、R219Q/S262N/V296T、R219Q/S262N/V296WおよびR219Q/S262N/V296Yのいずれかの中から選択される、請求項25に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。 - 変異型ADA2タンパク質がR219Q/K11A/R20A、R219Q/K11A/R20A/K371A、R219Q/R20A/K371A、R219Q/K11A/K371A、S262N/K11A/R20A、S262N/K11A/R20A/K371A、S262N/R20A/K371A、S262N/K11A/K371A、R219Q/C105−T147del→(Gly)n、R219Q/V99−Q144del→(GGGGS)n、R219Q/C105−T147del→(GGGGS)n、R219Q/N98−N156del、R219Q/C105−E148del、R219Q/C105−T147del、R219Q/V99−Q144del、S262N/C105−T147del→(Gly)n、S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n、S262N/C105−T147del→(GGGGS)n、S262N/N98−N156del、S262N/C105−E148del、S262N/C105−T147delおよびS262N/V99−Q144delの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項24に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、未修飾ADA2の相当する二量体形態の少なくとも110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、225%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%またはそれ以上の活性を示し、アデノシンデアミナーゼ活性が同じ条件下で評価される、請求項18〜27のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、未修飾ADA2タンパク質の相当する二量体形態の触媒効率(kcat/KM)と比較して、少なくともまたは少なくとも約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍またはそれ以上である触媒効率(kcat/KM)を示し、アデノシンデアミナーゼ活性の触媒効率が同じ条件下で評価される、請求項28に記載の変異型ADA2タンパク質。
- 二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約2×104M−1s−1、3×104M−1s−1、4×104M−1s−1、5×104M−1s−1、6×104M−1s−1、7×104M−1s−1、8×104M−1s−1、9×104M−1s−1、1×105M−1s−1、2×105M−1s−1、3×105M−1s−1、4×105M−1s−1、5×105M−1s−1またはそれ以上である触媒効率(kcat/KM)を示す、請求項28または29に記載の変異型ADA2タンパク質。
- 変異型ADA2タンパク質がK371D/V99−Q144del→(GGGGS)1、K371D/V99−Q144del→(GGGGS)2、K371D/V99−Q144del→(GGGGS)3、K371D/C105−T147del→(GGGGS)1、K371D/C105−T147del→(GGGGS)2、K371D/C105−T147del→(GGGGS)3、R219Q/S262N/−−→N1/−−→A2/−−→S3、K371D/C105−T147del→(Gly)n、K371D/C105−T147del→(Gly)15、K371D/C105−T147del→(Gly)10、K371D/C105−T147del→(Gly)7、K371D/C105−T147del→(Gly)5、K371D/C105−T147del→(Gly)3、K371D/V99−Q144del→(GGGGS)n、K371D/C105−T147del→(GGGGS)n、K371D/N98−N156del、K371D/C105−E148del、K371D/C105−T147delおよびK371D/V99−Q144delの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜25のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質がR125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T、P111N/G113S、F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124A、P124S、V99−Q144del→(GGGGS)n、C105−T147del→(GGGGS)n、V99−Q144del→(GGGGS)1、V99−Q144del→(GGGGS)2、V99−Q144del→(GGGGS)3、C105−T147del→(GGGGS)1、C105−T147del→(GGGGS)2およびC105−T147del→(GGGGS)3の中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜25のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、K11A、K11D、K11E、K13A、K13D、K13E、R20A、R20D、R20E、R20N、V22S、K26A、K26D、K26E、D86A、D86C、D86E、D86F、D86G、D86H、D86I、D86K、D86L、D86M、D86N、D86P、D86Q、D86R、D86S、D86T、D86V、D86W、D86Y、E179A、E179C、E179D、E179F、E179G、E179H、E179I、E179K、E179L、E179M、E179N、E179P、E179Q、E179R、E179S、E179T、E179V、E179W、E179Y、R217A、R217D、R217E、R219A、R219C、R219D、R219E、R219F、R219G、R219H、R219I、R219K、R219L、R219M、R219N、R219P、R219Q、R219S、R219T、R219V、R219W、R219Y、L221A、L221C、L221D、L221E、L221F、L221G、L221H、L221I、L221K、L221M、L221N、L221P、L221Q、L221R、L221S、L221T、L221V、L221W、L221Y、K258A、K258D、K258E、S262A、S262C、S262D、S262E、S262F、S262G、S262H、S262I、S262K、S262L、S262M、S262N、S262P、S262Q、S262R、S262T、S262V、S262W、S262Y、H264A、H264C、H264D、H264E、H264F、H264G、H264I、H264K、H264L、H264M、H264N、H264P、H264Q、H264R、H264S、H264T、H264V、H264W、H264Y、S266A、S266C、S266D、S266E、S266F、S266G、S266H、S266I、S266K、S266L、S266M、S266N、S266P、S266Q、S266R、S266T、S266V、S266W、S266Y、K267A、K267C、K267D、K267E、K267F、K267G、K267H、K267I、K267L、K267M、K267N、K267P、K267Q、K267R、K267S、K267T、K267V、K267W、K267Y、R277A、R277D、R277E、R283A、R283D、R283E、V296A、V296C、V296D、V296E、V296F、V296G、V296H、V296I、V296K、V296L、V296M、V296N、V296P、V296Q、V296R、V296S、V296T、V296W、V296Y、K309A、K309D、K309E、K317A、K317D、K317E、K321A、K321D、K321E、R352A、R352D、R352E、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K371N、K372A、K372D、K372E、K372N、D373S、I374S、T403N、G404N、H405S、P406S、R441A、R441D、R441E、K444A、K444D、K444E、K452A、K452D、K452E、K461A、K461D、K461E、K469A、K469D、K469E、K470A、K470DおよびK470Eに相当する置き換えの中から選択される1以上のアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜32のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 変異型ADA2タンパク質がH264A;H264Q;H264N;H264G;R219K;R219Q;R219N;R219A;L221A;L221V;L221G;E179D;E179A;E179S;E179T;E179V;E179G;S262A;S262V;S262M;S262N;D86A;D86C;D86E;D86F;D86G;D86H;D86I;D86K;D86L;D86M;D86N;D86P;D86Q;D86R;D86S;D86T;D86V;D86W;D86Y;E179C;E179F;E179H;E179I;E179K;E179L;E179M;E179N;E179P;E179Q;E179R;E179W;E179Y;R219C;R219D;R219E;R219F;R219G;R219H;R219I;R219L;R219M;R219P;R219S;R219T;R219V;R219W;R219Y;L221C;L221D;L221E;L221F;L221H;L221I;L221K;L221M;L221N;L221P;L221Q;L221R;L221S;L221T;L221W;L221Y;S262C;S262D;S262E;S262F;S262G;S262H;S262I;S262K;S262L;S262P;S262Q;S262R;S262T;S262W;S262Y;H264C;H264D;H264E;H264F;H264I;H264K;H264L;H264M;H264P;H264R;H264S;H264T;H264V;H264W;H264Y;S266A;S266C;S266D;S266E;S266F;S266G;S266H;S266I;S266K;S266L;S266M;S266N;S266P;S266Q;S266R;S266T;S266V;S266W;S266Y;K267A;K267C;K267D;K267E;K267F;K267G;K267H;K267I;K267L;K267M;K267N;K267P;K267Q;K267R;K267S;K267T;K267V;K267W;K267Y;V296A;V296C;V296D;V296E;V296F;V296G;V296H;V296I;V296K;V296L;V296M;V296N;V296P;V296Q;V296R;V296S;V296T;V296W;およびV296Yに相当する置き換えの中から選択される1以上のアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜33のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139T、P111N/G113S、F119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124A、P124S、V99−Q144del、V99−Q144del→(GGGGS)n、C105−T147del→(GGGGS)n、V99−Q144del→(GGGGS)1、V99−Q144del→(GGGGS)2、V99−Q144del→(GGGGS)3、C105−T147del→(GGGGS)1、C105−T147del→(GGGGS)2およびC105−T147del→(GGGGS)3の中から選択される1以上のアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜34のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、K11A、K11E、R20A、R20E、R219K、R219Q、L221A、L221V、L221G、S262N、H264Q、H264G、R366E、K371A、K371D、K371E、K372D、K372E、K452DおよびK452Eの中から選択される1以上のアミノ酸置き換えを含む、請求項18〜35のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371D、S262N/R20E/K371E、R219Q/K371E、R219Q/K371D、R219Q/R20E、R219Q/K371E/R20E、R219Q/K371D/R20E、R219Q/S262N/K371E、R219Q/S262N/K371D、R219Q/S262N/R20E、R219Q/S262N/K371E/R20E、R219Q/S262N/K371D/R20EおよびR219Q/S262Nの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜36のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、配列番号5のADA2タンパク質またはその相当する触媒活性部分と比較して、ヘパリン結合の低減を示す、請求項1〜36のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、未修飾ADA2タンパク質の相当する二量体形態の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%以下のヘパリン結合を示し、ヘパリン結合が同じ条件下で評価される、請求項38に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基20、262、366、371、372または452に相当するアミノ酸位置で、1以上のアミノ酸置き換えを含む、請求項39または39に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- K11A;K11D;K11E;K13A;K13D;K13E;K371A;K371D;K371E;K372A;K372D;K372E;K452A;K452D;K452E;R20A;R20D;R20E;R366A;R366D;R366E;K26A;K26D;K26E;R217A;R217D;R217E;K258A;K258D;K258E;R277A;R277D;R277E;R283A;R283D;R283E;K309A;K309D;K309E;K317A;K317D;K317E;K321A;K321D;K321E;R352A;R352D;R352E;R441A;R441D;R441E;K444A;K444D;K444E;K461A;K461D;K461E;K469A;K469D;K469E;K470A;K470DおよびK470Eに相当する1以上のアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜30のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、R20A、R20D、R20E、S262N、R366A、R366D、R366E、K371A、K371D、K371E、K372A、K372D、K372EおよびK452Eの中から選択される1以上のアミノ酸置き換えを含む、請求項38〜41のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、K11A/R20A、K11A/R20A/K371A、R20A/K371A、K11A/K371A、S262N/K371D、S262N/K371E、S262N/R20E、S262N/R20E/K371DおよびS262N/R20E/K371Eの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項37〜41のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R219Q/S262N/−−→N1/−−→A2/−−→S3、R219Q/S262N/R20N/V22S、R219Q/S262N/K371N/D373S、R219Q/S262N/K372N/I374S、R219Q/S262N/T403N/H405SまたはR219Q/S262N/G404N/P406Sに相当する修飾を含む、請求項18〜35のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、より長い血清半減期(t1/2)を示す、請求項1〜43のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 未修飾ADA2タンパク質の二量体形態である変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合に半減期が同じ条件下で評価される場合、相当する条件の半減期よりも少なくともまたは少なくとも約110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、225%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%またはそれ以上長い半減期を示す、請求項45に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、熱安定性の増加を示す、請求項1〜46のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、未修飾ADA2タンパク質の相当する二量体形態の融解温度(Tm)と比較して、少なくともまたは少なくとも約0.5℃、1.0℃、2.0℃、3.0℃、4.0℃、5.0℃、6.0℃、7.0℃、8.0℃、9.0℃、10.0℃またはそれ以上増加されるTmを有して熱安定性を示し、Tmは、同じ条件下で評価される、請求項47に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が少なくともまたは少なくとも約67.6℃、67.8℃、68.0℃、68.2℃、68.4℃、68.6℃、68.8℃、69.0℃、69.2℃、69.4℃、69.6℃、69.8℃、70.0℃、70.2℃、70.4℃C、70.6℃、70.8℃、71.0℃、71.2℃、71.4℃、71.6℃、71.8℃またはそれより高い熱融解温度(Tm)を有する、請求項47または48に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異体またはその触媒活性部分がpH6.5±0.2でまたは約pH6.5±0.2で、アデノシンデアミナーゼ活性を示す、請求項1〜31のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性に関するpH最適条件の変更を示す、請求項1〜50のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、未修飾ADA2の相当する二量体形態のpH最適条件と比較して、より高いpHであるアデノシンデアミナーゼ活性に関するpH最適条件を示す、請求項51に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5またはより高いpHを伴ってpH最適条件を有する、請求項52に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 二量体形態である場合、未修飾ADA2の相当する二量体形態のpH最適条件と比較して、より低いpHであるアデノシンデアミナーゼ活性に関するpH最適条件を示す、請求項51に記載の変異型ADA2タンパク質。
- 二量体形態である場合、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0もしくはそれ以下よりも低いかまたは約6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0もしくはそれ以下よりも低いpHを伴ってpH最適条件を有する、請求項51に記載の変異型ADA2タンパク質。
- 1以上のさらなるグリコシル化部位を含む、請求項1〜54のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- −−→N1/−−→A2/−−→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405SおよびG404N/P406Sの中から選択される修飾の1つまたは複数に相当する修飾を含む、請求項56に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R219Q/S262N/R125N/P126A;R219Q/S262N/S127N/K129S;R219Q/S262N/P126N/E128T;R219Q/S262N/R112N/I114T;R219Q/S262N/I134N/L135C/L136T;R219Q/S262N/I134N/L135S/L136T;R219Q/S262N/R142N/Q144S;R219Q/S262N/E137N/Y139TまたはR219Q/S262N/P111N/G113Sに相当するアミノ酸置き換えを含む、請求項18〜35のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R125N/P126A、S127N/K129S、P126N/E128T、R112N/I114T、I134N/L135C/L136T、I134N/L135S/L136T、R142N/Q144S、E137N/Y139TおよびP111N/G113Sの中から選択される修飾の1つまたは複数に相当する推定受容体結合ドメイン(PRB)における修飾を含む、請求項56に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が推定受容体結合(PRB)における1以上のアミノ酸の修飾を含み、修飾がアミノ酸欠失、挿入または置き換えおよびそれらの組合せであるがただし、修飾は、アミノ酸置き換えC108G、A120V、H121R、R125C、R140Q、K141RまたはR142Wに相当しない、請求項1〜58のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- その触媒活性部分が推定受容体結合(PRB)ドメインの全てもしくは一部を欠如するかまたはPRBの修飾を有し、それにより任意の受容体結合または増殖因子活性が低減もしくは排除されるかまたはデアミナーゼ活性以外のADA2の他の活性が低減もしくは排除されるかまたはADAドメインとの相互作用が低減もしくは排除され、
PRBドメインは、配列番号5に記載する残基98〜156に相当する、
請求項60に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。 - 残基105〜148または105〜147または99〜144を欠如する、請求項61に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質の触媒活性部分が配列番号548〜550および579のいずれかに記載するアミノ酸の配列を含む、請求項61または62に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- PRBドメインの全てまたは一部の欠失および適宜ペプチドリンカーの挿入を含む、請求項60〜63のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基98と156もしくはアミノ酸残基105と148との間または約アミノ酸残基98と156もしくはアミノ酸残基105と148との間の(両端を含む)、任意の1以上の連続するアミノ酸残基に相当する1以上の連続するアミノ酸残基の欠失を含む、請求項60〜64のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質がペプチドリンカーによる欠失領域の置換をさらに含む、請求項65に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- ペプチドリンカーが(Gly)n(配列番号368)(式中、nは、2〜20である)、(GGGGS)n(配列番号343)(式中、nは、1〜6である)、(SSSSG)n(配列番号344)(式中、nは、1〜6である)、(AlaAlaProAla)n(配列番号350)(式中、nは、1〜6である)、GKSSGSGSESKS(配列番号345)、GGSTSGSGKSSEGKG(配列番号346)、GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(配列番号347)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号348)およびEGKSSGSGSESKEF(配列番号349)の中から選択される、請求項66に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- ペプチドリンカーがGGG(配列番号369)、GGGGG(配列番号360)、GGGGGGG(配列番号370)、GGGGGGGGGG(配列番号371)およびGGGGGGGGGGGGGGG(配列番号372)の中から選択される、請求項66または67に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- PRBドメインにおける修飾が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、C105−T147del→(Gly)n(式中、nは、2〜20である)に相当する、請求項60〜68のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- PRBドメインにおける修飾が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、C105−T147del→(Gly)15、C105−T147del→(Gly)10、C105−T147del→(Gly)7、C105−T147del→(Gly)5またはC105−T147del→(Gly)3に相当する、請求項60〜69のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);C105−T147del→(Gly)15;C105−T147del→(Gly)10;C105−T147del→(Gly)7;C105−T147del→(Gly)5;C105−T147del→(Gly)3;N98−N156del;C105−E148del;C105−T147del;V99−Q144del;V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);V99−Q144del→(GGGGS)1;V99−Q144del→(GGGGS)2;V99−Q144del→(GGGGS)3;C105−T147del→(GGGGS)1;C105−T147del→(GGGGS)2およびC105−T147del→(GGGGS)3に相当し、それらの中から選択されるPRBドメインにおける修飾を含む、請求項60〜70のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 配列番号5のF119S、F119K、Y224R、Y224N、Y191S、Y191D、F183K、Y191D/Y224R、F109S、F109A、R118D、R118A、Y139T、Y139A、W133S、W133T、P124AおよびP124Sに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項59〜70のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- R219Q/S262N/F119S;R219Q/S262N/F119K;R219Q/S262N/Y224R;R219Q/S262N/Y224N;R219Q/S262N/Y191S;R219Q/S262N/Y191D;R219Q/S262N/F183K;R219Q/S262N/Y191D/Y224R;R219Q/S262N/F109S;R219Q/S262N/F109A;R219Q/S262N/R118D;R219Q/S262N/R118A;R219Q/S262N/Y139T;R219Q/S262N/Y139A;R219Q/S262N/W133S;R219Q/S262N/W133T;R219Q/S262N/P124AおよびR219Q/S262N/P124Sに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項59〜72のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- K371D/V99−Q144del→(GGGGS)1;K371D/V99−Q144del→(GGGGS)2;K371D/V99−Q144del→(GGGGS)3;K371D/C105−T147del→(GGGGS)1;K371D/C105−T147del→(GGGGS)2;K371D/C105−T147del→(GGGGS)3;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)15;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)10;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)7;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)5;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)3;R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)1;R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)2;R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)3;R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)1;R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)2;R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)3;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)1;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)2;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)3;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)1;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)2;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)3;K371D/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);K371D/C105−T147del→(Gly)15;K371D/C105−T147del→(Gly)10;K371D/C105−T147del→(Gly)7;K371D/C105−T147del→(Gly)5;K371D/C105−T147del→(Gly)3;K371D/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);K371D/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);K371D/N98−N156del;K371D/C105−E148del;K371D/C105−T147del;K371D/V99−Q144del;R219Q/S262N/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);R219Q/S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/S262N/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/S262N/N98−N156del;R219Q/S262N/C105−E148del;R219Q/S262N/C105−T147del;R219Q/S262N/V99−Q144del;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)15;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)10;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)7;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)5;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(Gly)3;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/S262N/K371D/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/S262N/K371D/N98−N156del;R219Q/S262N/K371D/C105−E148del;R219Q/S262N/K371D/C105−T147del;R219Q/S262N/K371D/V99−Q144del;R219Q/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);R219Q/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);R219Q/N98−N156del;R219Q/C105−E148del;R219Q/C105−T147del;R219Q/V99−Q144del;S262N/C105−T147del→(Gly)n(式中、n=2〜20);S262N/V99−Q144del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);S262N/C105−T147del→(GGGGS)n(式中、n=1〜5);S262N/N98−N156delおよびS262N/C105−E148del;S262N/C105−T147delおよびS262N/V99−Q144delに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項59〜72のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2が二量体形態である場合、同じ条件下での同じ受容体への未修飾ADA2ポリペプチドの結合と比較して、A1、A2A、A2BおよびA3の中から選択される任意の1以上のアデノシン受容体(ADR)への結合の低減を示す、請求項59〜74のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 結合が少なくともまたは少なくとも約0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍またはそれ以上低減される、請求項75に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が非自然グリコシル化部位の導入によりグリコシル化を変更させる修飾(複数)を含み、それにより、グリコシル化が可能な細胞において発現されると、変異型ADA2は、未修飾ADA2タンパク質と比較して過グリコシル化される、請求項1〜76のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 非自然グリコシル化部位が1個、2個または3個のアミノ酸のアミノ酸置き換えまたは挿入により導入される、請求項77に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 修飾が配列番号5に記載するアミノ酸位置に関して、−−→N1/−−→A2/−−→S3、R20N/V22S、K371N/D373S、K372N/I374S、T403N/H405SおよびG404N/P406Sに相当する修飾の中から選択される、請求項77または78に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 単離または精製された、請求項1〜79のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 配列番号5に対してまたはその相当する触媒活性部分に対して少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%配列同一性を有する、請求項1〜80のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質。
- 変異型ADA2タンパク質が配列番号13〜63もしくは71〜285のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項1に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 変異型ADA2タンパク質が配列番号551〜579もしくは581〜931のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項1に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 配列番号5に関して、K11A/R20A;K11A/R20A/K371A;R20A/K371A;K11A/K371A;S262N/K371D;S262N/K371E;S262N/R20E;S262N/R20E/K371D;S262N/R20E/K371E;R219Q/K371E;R219Q/K371D;R219Q/R20E;R219Q/K371E/R20E;R219Q/K371D/R20E;R219Q/S262N/K371E;R219Q/S262N/K371D;R219Q/S262N/R20E;R219Q/S262N/K371E/R20E;R219Q/S262N/K371D/R20E;R219Q/S262N;R219Q/S262N/K11A;R219Q/S262N/K11D;R219Q/S262N/K11E;R219Q/S262N/K13A;R219Q/S262N/K13D;R219Q/S262N/K13E;R219Q/S262N/K371A;R219Q/S262N/K372A;R219Q/S262N/K372D;R219Q/S262N/K372E;R219Q/S262N/K452A;R219Q/S262N/K452D;R219Q/S262N/K452E;R219Q/S262N/R20A;R219Q/S262N/R20D;R219Q/S262N/R366A;R219Q/S262N/R366D;R219Q/S262N/R366E;R219Q/S262N/H264A;R219Q/S262N/H264Q;R219Q/S262N/H264N;R219Q/S262N/H264G;R219K/S262N;R219N/S262N;R219A/S262N;R219Q/S262N/L221A;R219Q/S262N/L221V;R219Q/S262N/L221G;R219Q/S262N/E179D;R219Q/S262N/E179A;R219Q/S262N/E179S;R219Q/S262N/E179T;R219Q/S262N/E179V;R219Q/S262N/E179G;R219Q/S262A;R219Q/S262V;R219Q/S262M;R219Q/S262N/K11A/R20A;R219Q/S262N/K11A/R20A/K371A;R219Q/S262N/R20A/K371A;R219Q/S262N/K11A/K371A;R219Q/S262N/K26A;R219Q/S262N/K26D;R219Q/S262N/K26E;R219Q/S262N/R217A;R219Q/S262N/R217D;R219Q/S262N/R217E;R219Q/S262N/K258A;R219Q/S262N/K258D;R219Q/S262N/K258E;R219Q/S262N/R277A;R219Q/S262N/R277D;R219Q/S262N/R277E;R219Q/S262N/R283A;R219Q/S262N/R283D;R219Q/S262N/R283E;R219Q/S262N/K309A;R219Q/S262N/K309D;R219Q/S262N/K309E;R219Q/S262N/K317A;R219Q/S262N/K317D;R219Q/S262N/K317E;R219Q/S262N/K321A;R219Q/S262N/K321D;R219Q/S262N/K321E;R219Q/S262N/R352A;R219Q/S262N/R352D;R219Q/S262N/R352E;R219Q/S262N/R441A;R219Q/S262N/R441D;R219Q/S262N/R441E;R219Q/S262N/K444A;R219Q/S262N/K444D;R219Q/S262N/K444E;R219Q/S262N/K461A;R219Q/S262N/K461D;R219Q/S262N/K461E;R219Q/S262N/K469A;R219Q/S262N/K469D;R219Q/S262N/K469E;R219Q/S262N/K470A;R219Q/S262N/K470D;R219Q/S262N/K470E;R219Q/S262N/D86A;R219Q/S262N/D86C;R219Q/S262N/D86E;R219Q/S262N/D86F;R219Q/S262N/D86G;R219Q/S262N/D86H;R219Q/S262N/D86I;R219Q/S262N/D86K;R219Q/S262N/D86L;R219Q/S262N/D86M;R219Q/S262N/D86N;R219Q/S262N/D86P;R219Q/S262N/D86Q;R219Q/S262N/D86R;R219Q/S262N/D86S;R219Q/S262N/D86T;R219Q/S262N/D86V;R219Q/S262N/D86W;R219Q/S262N/D86Y;R219Q/S262N/E179C;R219Q/S262N/E179F;R219Q/S262N/E179H;R219Q/S262N/E179I;R219Q/S262N/E179K;R219Q/S262N/E179L;R219Q/S262N/E179M;R219Q/S262N/E179N;R219Q/S262N/E179P;R219Q/S262N/E179Q;R219Q/S262N/E179R;R219Q/S262N/E179W;R219Q/S262N/E179Y;R219C/S262N;R219D/S262N;R219E/S262N;R219F/S262N;R219G/S262N;R219H/S262N;R219I/S262N;R219L/S262N;R219M/S262N;R219P/S262N;R219S/S262N;R219T/S262N;R219V/S262N;R219W/S262N;R219Y/S262N;R219Q/S262N/L221C;R219Q/S262N/L221D;R219Q/S262N/L221E;R219Q/S262N/L221F;R219Q/S262N/L221H;R219Q/S262N/L221I;R219Q/S262N/L221K;R219Q/S262N/L221M;R219Q/S262N/L221N;R219Q/S262N/L221P;R219Q/S262N/L221Q;R219Q/S262N/L221R;R219Q/S262N/L221S;R219Q/S262N/L221T;R219Q/S262N/L221W;R219Q/S262N/L221Y;R219Q/S262C;R219Q/S262D;R219Q/S262E;R219Q/S262F;R219Q/S262G;R219Q/S262H;R219Q/S262I;R219Q/S262K;R219Q/S262L;R219Q/S262P;R219Q/S262Q;R219Q/S262R;R219Q/S262T;R219Q/S262W;R219Q/S262Y;R219Q/S262N/H264C;R219Q/S262N/H264D;R219Q/S262N/H264E;R219Q/S262N/H264F;R219Q/S262N/H264I;R219Q/S262N/H264K;R219Q/S262N/H264L;R219Q/S262N/H264M;R219Q/S262N/H264P;R219Q/S262N/H264R;R219Q/S262N/H264S;R219Q/S262N/H264T;R219Q/S262N/H264V;R219Q/S262N/H264W;R219Q/S262N/H264Y;R219Q/S262N/S266A;R219Q/S262N/S266C;R219Q/S262N/S266D;R219Q/S262N/S266E;R219Q/S262N/S266F;R219Q/S262N/S266G;R219Q/S262N/S266H;R219Q/S262N/S266I;R219Q/S262N/S266K;R219Q/S262N/S266L;R219Q/S262N/S266M;R219Q/S262N/S266N;R219Q/S262N/S266P;R219Q/S262N/S266Q;R219Q/S262N/S266R;R219Q/S262N/S266T;R219Q/S262N/S266V;R219Q/S262N/S266W;R219Q/S262N/S266Y;R219Q/S262N/K267A;R219Q/S262N/K267C;R219Q/S262N/K267D;R219Q/S262N/K267E;R219Q/S262N/K267F;R219Q/S262N/K267G;R219Q/S262N/K267H;R219Q/S262N/K267I;R219Q/S262N/K267L;R219Q/S262N/K267M;R219Q/S262N/K267N;R219Q/S262N/K267P;R219Q/S262N/K267Q;R219Q/S262N/K267R;R219Q/S262N/K267S;R219Q/S262N/K267T;R219Q/S262N/K267V;R219Q/S262N/K267W;R219Q/S262N/K267Y;R219Q/S262N/V296A;R219Q/S262N/V296C;R219Q/S262N/V296D;R219Q/S262N/V296E;R219Q/S262N/V296F;R219Q/S262N/V296G;R219Q/S262N/V296H;R219Q/S262N/V296I;R219Q/S262N/V296K;R219Q/S262N/V296L;R219Q/S262N/V296M;R219Q/S262N/V296N;R219Q/S262N/V296P;R219Q/S262N/V296Q;R219Q/S262N/V296R;R219Q/S262N/V296S;R219Q/S262N/V296T;R219Q/S262N/V296W;R219Q/S262N/V296Y;R219Q/K11A/R20A;R219Q/K11A/R20A/K371A;R219Q/R20A/K371A;R219Q/K11A/K371A;S262N/K11A/R20A;S262N/K11A/R20A/K371A;S262N/R20A/K371A;およびS262N/K11A/K371Aに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項1〜81のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- ADA2部分の配列が配列番号273に記載される、請求項25に記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分。
- 触媒活性部分がADAドメインを含む、請求項1〜85のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質の触媒活性部分。
- 請求項1〜86のいずれかに記載の複数の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分を含む変異型ADA2多量体。
- 請求項1〜86のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分を含む変異型ADA2二量体。
- 同じである2つの変異型ADA2タンパク質またはそれらの触媒活性部分を含むホモ二量体である、請求項88に記載の変異型ADA2二量体またはその触媒活性部分。
- 請求項1〜86のいずれかに記載の少なくとも1つの変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分および異なるADA2タンパク質またはその触媒活性部分を含む変異型ADA2二量体であって、異なるADA2タンパク質またはその触媒活性部分は、変異体もしくは未修飾ADA2タンパク質またはその触媒活性部分であり得る、変異型ADA2二量体。
- 互いに異なる2つの変異型ADA2タンパク質またはそれらの触媒活性部分を含むヘテロ二量体である、請求項88に記載の変異型ADA2二量体またはその触媒活性部分。
- 請求項1〜91のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質もしくはその触媒活性部分または二量体をコードする核酸。
- 請求項92に記載の核酸分子を含むベクター。
- 原核生物ベクターまたは真核生物ベクターである、請求項93に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項93または94に記載のベクター。
- 哺乳動物ベクターである、請求項93〜95のいずれかに記載のベクター。
- ウイルスベクターがデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスおよびサイトメガロウイルスの中から選択される、請求項95に記載のベクター。
- ウイルスベクターが腫瘍溶解性ベクターである、請求項95に記載のベクター。
- 可溶性ヒアルロニダーゼもコードする、請求項96〜98のいずれかに記載のベクター。
- 請求項93〜99のいずれかに記載のベクターを含む単離細胞または細胞培養物。
- 真核細胞である、請求項100に記載の細胞または細胞培養物。
- 非ヒト細胞であるかまたはヒト幹細胞ではない、請求項101に記載の細胞。
- 真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項101または102に記載の細胞または細胞培養物。
- 哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項103に記載の細胞または細胞培養物。
- 細胞が免疫細胞である、請求項100〜104のいずれかに記載の細胞または細胞培養物。
- 細胞がT細胞である、請求項105に記載の細胞または細胞培養物。
- 細胞が腫瘍浸潤リンパ球T細胞(TIL)、細胞傷害性T細胞(CTL)、ナチュラルキラー(NK)細胞またはリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞から選択される、請求項105に記載の細胞または細胞培養物。
- 細胞がキメラ抗原受容体(CAR)および変異型ADA2タンパク質または二量体をコードおよび発現するT細胞である、請求項106に記載の細胞または細胞培養物。
- CARが腫瘍細胞抗原に特異的である、請求項108に記載の細胞または細胞培養物。
- 腫瘍抗原がHER2、CD19、HERV−K、CD20、CD22、ROR1、メソセリン、CD33/IL3Ra、c−Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD−2、NY−ESO−1 TCR、MAGE A3 TCRおよびGD2ならびにそれらの組合せの中から選択される、請求項109に記載の細胞または細胞培養物。
- ADA2変異体またはその触媒活性部分を産生する方法であって、ADA2変異体が発現される条件下で、請求項100〜106のいずれかに記載の細胞を培養することを含む方法。
- ADA2変異体またはその触媒活性部分が単離される、請求項111に記載の方法。
- ADA2変異体または触媒活性部分が発現されて、その二量体が単離される、請求項111に記載の方法。
- 細胞が2つの異なるADA2ポリペプチドをコードする核酸を含み、それにより発現時にヘテロ二量体が生じる、請求項111に記載の方法。
- がんの処置方法であって、
請求項105〜110のいずれかに記載の細胞を培養または増殖させることおよび
細胞を、腫瘍の処置のためにヒト対象に投与すること
を含む方法。 - 細胞がヒト対象から予め得られている、請求項115に記載の方法。
- 細胞が可溶性ヒアルロニダーゼを発現するように修飾される、請求項115または116に記載の方法。
- 腫瘍を処置するための使用のための、請求項105〜110のいずれかに記載の細胞または細胞培養物。
- 腫瘍を処置するための使用のための医薬の製剤化のための、請求項105〜110のいずれかに記載の細胞または細胞培養物。
- 腫瘍を処置するための使用のための、請求項105〜110のいずれかに記載の細胞または細胞培養物。
- 直接的にまたはリンカーを介して間接的に異種部分に連結されている、請求項1〜86のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質もしくは触媒活性部分または請求項87〜91のいずれかに記載の変異型ADA2二量体を含むコンジュゲート。
- 直接的にまたはリンカーを介して間接的に異種部分に連結されているADA2タンパク質を含むコンジュゲート。
- ADA2タンパク質が単量体または二量体である、請求項122に記載のコンジュゲート。
- ADA2タンパク質がホモ二量体である二量体である、請求項123に記載のコンジュゲート。
- 異種部分が二量体における一方または両方のポリペプチドサブユニットにコンジュゲートしている、請求項121〜124のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 異種部分がペプチド、小分子、核酸、炭水化物およびポリマーの中から選択される、請求項121〜125のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 異種部分が半減期延長部分またはポリマーである、請求項121〜126のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 半減期延長部分が生体適合性脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(Glyx−Sery)n、ホモアミノ酸ポリマー(HAP)、ヒアルロン酸(HA)、ヘパロサンポリマー(HEP)、ホスホリルコリンベースのポリマー(PCポリマー)、フレキシマー(Fleximer)、デキストラン、ポリシアル酸(PSA)、Fcドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、XTEN配列、アルブミン結合ペプチド、CTPペプチドおよびそれらの任意の組合せの中から選択される、請求項127に記載のコンジュゲート。
- ポリマーまたは半減期延長部分がPEGであり、ADA2タンパク質分子がペグ化される、請求項127または128に記載のコンジュゲート。
- PEGがメトキシ−ポリエチレングリコール(mPEG)、PEG−グリシジルエーテル(Epox−PEG)、PEG−オキシカルボニルイミダゾール(CDI−PEG)、分岐状PEGおよびポリエチレンオキシド(PEO)の中から選択される、請求項129に記載のコンジュゲート。
- PEGが1kDa〜100kDaまたは約1kDa〜約100kDaの分子量を有する、請求項129または130に記載のコンジュゲート。
- PEGが直鎖状または分岐状である、請求項129〜131のいずれかに記載のコンジュゲート。
- PEG部分がmPEG−スクシンイミジルプロピオネート(mPEG−SPA)、mPEGスクシンイミジルカルボキシメチルエステル(mPEG−SCM)、mPEG−スクシンイミジルブタノエート(mPEG−SBA)、mPEG2−N−ヒドロキシスクシンイミド、mPEG−スクシンイミジルブタノエート(mPEG−SBA)、mPEG−スクシンイミジルα−メチルブタノエート(mPEG−SMB)、mPEG−ブチルアルデヒド、PEG−p−ニトロフェニル−カーボネートおよびPEG−プロピオンアルデヒドの中から選択されるPEG試薬との反応に起因する、請求項129〜132のいずれかに記載のコンジュゲート。
- PEG部分がmPEG−SCM(20kDa)、mPEG−SCM(30kDa)、mPEG−SBA(5kDa)、mPEG−SBA(20kDa)、mPEG−SBA(30kDa)、mPEG−SMB(20kDa)、mPEG−SMB(30kDa)、mPEG−ブチルアルデヒド(30kDa)、mPEG−SPA(20kDa)、mPEG−SPA(30kDa)、mPEG2−NHS(10kDa分岐)、mPEG2−NHS(20kDa分岐)、mPEG2−NHS(40kDa分岐)、mPEG2−NHS(60kDa分岐)、PEG−NHS−ビオチン(5kDaビオチン化)、PEG−p−ニトロフェニル−カルボネート(30kDa)およびPEG−プロピオンアルデヒド(30kDa)の中から選択されるPEG試薬との反応に起因する、請求項129〜133のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分がアミノ酸置き換えR219QおよびS262Nの一方または両方を含む、請求項121〜134のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分がアミノ酸置き換えR219Q/S262Nを含む、請求項121〜134のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分がアミノ酸置き換えR219Q/S262Nを含み、変異型ADA2タンパク質またはその触媒活性部分がペグ化されている、請求項136に記載のコンジュゲート。
- ペグ化されるホモ二量体を含む、請求項137に記載のコンジュゲート。
- ADA2部分の配列が配列番号273に記載される、請求項135〜138のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 請求項1〜86のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質、請求項87〜91のいずれかに記載の変異型ADA2多量体もしくは二量体または請求項121〜139のいずれかに記載のコンジュゲートおよび
がんまたは他の過剰増殖疾患を処置するためのものである治療剤
を含む組合せ。 - ADA2タンパク質および
がんまたは他の過剰増殖疾患を処置するためのものである治療剤
を含む組合せ。 - ADA2タンパク質が単量体または二量体である、請求項141に記載の組合せ。
- 二量体がホモ二量体である、請求項142に記載の組合せ。
- 治療剤が抗体、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤(cardioprotectant)、免疫賦活剤、免疫抑制剤、免疫チェックポイント阻害剤、抗生物質および抗血管新生剤の中から選択される、請求項140〜143のいずれかに記載の組合せ。
- 治療剤が抗がん剤である、請求項140〜144のいずれかに記載の組合せ。
- 抗がん剤が抗がん抗体、化学療法剤、放射免疫治療薬、抗血管新生剤および免疫チェックポイント阻害剤の中から選択される、請求項145に記載の組合せ。
- 抗がん剤が免疫チェックポイント阻害剤であり、
免疫チェックポイント阻害剤の標的がCTLA4、PD−1およびPD−L1の中から選択される、
請求項146に記載の組合せ。 - 抗がん剤が抗体、融合タンパク質、アプタマーおよびそれらの免疫チェックポイントタンパク質結合断片の中から選択される免疫チェックポイント阻害剤である、請求項146または147に記載の組合せ。
- 抗がん剤が抗免疫チェックポイントタンパク質抗体またはその抗原結合断片である免疫チェックポイント阻害剤である、請求項146〜148のいずれかに記載の組合せ。
- 抗がん剤が
抗CTL4抗体、その誘導体またはそれらの抗原結合断片、
抗PD−L1抗体、その誘導体またはそれらの抗原結合断片および
抗PD−1抗体、その誘導体またはそれらの抗原結合断片
の中から選択される免疫チェックポイント阻害剤である、請求項146〜149のいずれかに記載の組合せ。 - 抗がん剤が
イピリムマブ、その誘導体またはそれらの抗原結合断片、
トレメリムマブ、その誘導体またはそれらの抗原結合断片、
ニボルマブ、その誘導体またはそれらの抗原結合断片および
ピジリズマブ、その誘導体またはそれらの抗原結合断片
の中から選択される免疫チェックポイント阻害剤である、請求項146〜150のいずれかに記載の組合せ。 - 治療剤が抗ヒアルロナン剤である、請求項140〜151のいずれかに記載の組合せ。
- 抗ヒアルロナン剤が可溶性ヒアルロニダーゼである、請求項152に記載の組合せ。
- 可溶性ヒアルロニダーゼがウシPH20、ヒツジPH20またはグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー結合配列の全てもしくは一部を欠如するC末端切断型ヒトPH20の中から選択されるPH20ヒアルロニダーゼである、請求項152または153に記載の組合せ。
- 抗ヒアルロナン剤または可溶性ヒアルロニダーゼがポリマーにコンジュゲートしているかまたはリポソーム中に供給されるかまたはベクター中でコードされる、請求項152〜154のいずれかに記載の組合せ。
- ヒアルロニダーゼがPEGにコンジュゲートしている、請求項155に記載の組合せ。
- ADA2タンパク質が配列番号5、326〜334、340、375もしくは380〜383のいずれかに記載するアミノ酸の配列、配列番号5、326〜334、340、375もしくは380〜383に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも95%配列同一性を示す配列またはその触媒活性な形態を含む、請求項140〜156のいずれかに記載の組合せまたは請求項121に記載のコンジュゲート。
- ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸の配列を含む、請求項140〜156のいずれかに記載の組合せまたは請求項121に記載のコンジュゲート。
- ADA2タンパク質またはその触媒活性部分がアミノ酸置き換えR219Q/S262Nを含む、請求項140〜156のいずれかに記載の組合せ。
- ADA2タンパク質が配列番号273に記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項140〜156のいずれかに記載の組合せ。
- 請求項1〜86のいずれかに記載の変異型ADA2タンパク質、請求項87〜91のいずれかに記載のADA2二量体、ADA2多量体もしくは二量体または請求項121〜139のいずれかに記載のコンジュゲートを薬学的に許容される媒体中に含む医薬組成物。
- 請求項85に記載の変異型ADA2タンパク質もしくはその触媒活性部分または請求項137に記載のコンジュゲートを薬学的に許容される媒体中に含む医薬組成物。
- 局所または全身投与用に製剤化されている、請求項161または162に記載の医薬組成物。
- 静脈投与用に製剤化されている、請求項161〜163のいずれかに記載の医薬組成物。
- ADA2タンパク質がアミノ酸置き換えR219Q/S262Nを含むADA2変異体またはその触媒活性形態である、請求項161〜164のいずれかに記載の医薬組成物。
- ADA2変異体またはその触媒活性部分がペグ化されている、請求項165に記載の医薬組成物。
- ADA2変異体が配列番号273に記載するアミノ酸残基の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項165に記載の医薬組成物。
- 対象における腫瘍またはがん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害、免疫不全疾患を処置する方法であって、請求項1〜86のいずれかに記載のADA2変異体もしくはその触媒活性部分、請求項87〜91のいずれかに記載のADA2二量体、ADA2多量体もしくは二量体、請求項121〜139のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項140〜160のいずれかに記載の組合せを投与することを含む方法。
- 対象における腫瘍、がん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害、免疫不全疾患を処置する方法であって、配列番号5のアミノ酸の配列もしくはその触媒活性部分または配列番号5に記載するアミノ酸の配列に対して、もしくはその相当する触媒活性部分に対して少なくとも85%、90%もしくは95%配列同一性を有する変異型ADA2タンパク質を含むADA2タンパク質を対象に投与すること含む方法。
- 対象における腫瘍、がん、非がん過剰増殖性疾患を処置する方法であって、請求項1〜86のいずれかに記載のADA2変異体もしくはその触媒活性部分、請求項87〜91のいずれかに記載のADA2二量体、ADA2多量体もしくは二量体、請求項121〜139のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項140〜160のいずれかに記載の組合せを含む変異型ADA2タンパク質を対象に投与することを含む方法。
- 疾患ががんであり、腫瘍が固形腫瘍または転移性腫瘍または血液がんである、請求項168〜170のいずれかに記載の方法。
- 腫瘍が癌腫、神経膠腫、肉腫、腺癌、腺肉腫または腺腫である、請求項168〜171のいずれかに記載の方法。
- 腫瘍が胸部、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部または肝臓の腫瘍である、請求項168〜171のいずれかに記載の方法。
- 対象が対象から予め得られた試料中の血漿アデノシンのレベルの上昇、アデノシン受容体(ADR)の腫瘍関連発現またはヌクレオチダーゼの腫瘍関連発現に基づいて処置のために選択される、請求項168〜173のいずれかに記載の方法。
- ADRがA2AまたはA2Bである、請求項174に記載の方法。
- ヌクレオチダーゼがCD39またはCD73である、請求項174に記載の方法。
- レベルの上昇が既定レベルまたは既定量または対照試料と比較して、0.5倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、500倍、1000倍またはそれ以上である、請求項174〜176のいずれかに記載の方法。
- 1つもしくは複数の抗がん剤または処置の投与をさらに含む、請求項168〜177のいずれかに記載の方法。
- 抗がん剤が抗がん抗体、化学療法剤、放射免疫治療薬、抗血管新生剤および免疫チェックポイント阻害剤の中から選択される、請求項178に記載の方法。
- ADA2タンパク質を、可溶性ヒアルロニダーゼと同時投与することを含む、請求項168〜179のいずれかに記載の方法。
- 可溶性ヒアルロニダーゼがウシPH20、ヒツジPH20またはグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー結合配列の全てもしくは一部を欠如するC末端切断型ヒトPH20の中から選択されるPH20ヒアルロニダーゼである、請求項180に記載の方法。
- 可溶性ヒアルロニダーゼがポリマーにコンジュゲートしているかまたはリポソーム中に供給されるかまたはベクター中でコードされる、請求項180または181のいずれかに記載の方法。
- ヒアルロニダーゼがADA2タンパク質と別個に投与されるかまたは同時製剤化される、請求項180〜182のいずれかに記載の方法。
- 疾患が非がん過剰増殖性疾患である、請求項168〜170および請求項174〜183のいずれかに記載の方法。
- 疾患または状態が非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害および重症複合免疫不全(SCID)の中から選択される、請求項184に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項168〜185のいずれかに記載の方法。
- ADA2タンパク質が非経口的に、局所的にまたは全身的に投与される、請求項168〜186のいずれかに記載の方法。
- ADA2タンパク質が鼻腔内に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、静脈内に、皮下に、経口的にまたは肺投与により投与される、請求項168〜187のいずれかに記載の方法。
- ADA2タンパク質がグリコシル化されている、請求項1〜86のいずれかに記載のADA2変異体もしくはその触媒活性部分、請求項87〜91のいずれかに記載のADA2二量体、ADA2多量体もしくは二量体、請求項121〜139のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項140〜160のいずれかに記載の組合せ。
- 腫瘍またはがん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(SCID)を処置するための医薬の製剤化のための、請求項1〜86のいずれかに記載のADA2変異体もしくはその触媒活性部分、請求項87〜91のいずれかに記載のADA2二量体、ADA2多量体もしくは二量体、請求項121〜139のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項140〜160のいずれかに記載の組合せの使用。
- 腫瘍またはがん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(SCID)を処置するための使用のための、請求項1〜86のいずれかに記載のADA2変異体もしくはその触媒活性部分、請求項87〜91のいずれかに記載のADA2二量体、ADA2多量体もしくは二量体、請求項121〜139のいずれかに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- 腫瘍またはがん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(SCID)を処置するための使用のための、請求項140〜160のいずれかに記載の組合せ。
- 腫瘍またはがん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(SCID)を処置するための医薬の製剤化のためのADA2タンパク質の使用。
- 腫瘍またはがん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(SCID)を処置するための使用のためのADA2タンパク質を含む医薬組成物。
- 腫瘍またはがん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(SCID)を処置するための使用のためのADA2タンパク質および治療剤を含む組合せ。
- 疾患または状態が腫瘍またはがんである、請求項190〜195のいずれかに記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- 腫瘍が固形腫瘍または転移性腫瘍である、請求項190〜196のいずれかに記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- 腫瘍が癌腫、神経膠腫、肉腫、腺癌、腺肉腫または腺腫である、請求項190〜197のいずれかに記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- 腫瘍が胸部、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部または肝臓の腫瘍である、請求項190〜198のいずれかに記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- ADA2タンパク質が単量体または二量体である、請求項190〜199のいずれかに記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- 二量体がホモ二量体である、請求項200に記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- ADA2タンパク質が配列番号5に記載するアミノ酸の配列またはそれに対して、もしくは配列番号5のADA2タンパク質の触媒活性部分に対して少なくとも85%、90%もしくは95%配列同一性を有する変異体を含む、請求項190〜201のいずれかに記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- ADA2タンパク質またはその触媒活性部分が配列番号5に関して、アミノ酸置き換えR219Q/S262Nを含む、請求項190〜202のいずれかに記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- ADA2タンパク質が配列番号273に記載するアミノ酸残基の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項203に記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- ADA2タンパク質またはその触媒活性部分がペグ化されている、請求項204に記載の使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せ。
- 腫瘍またはがん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(SCID)を処置するための使用のためのADA2タンパク質を含む医薬組成物であって、ADA2タンパク質が請求項1〜86のいずれかに記載の変異体もしくはその触媒活性部分、請求項87〜91のいずれかに記載のADA2二量体、ADA2多量体もしくは二量体または請求項121〜139のいずれかに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
- ADA2タンパク質またはその触媒活性部分が配列番号5に関して、アミノ酸置き換えR219Q/S262Nを含む、請求項206に記載の医薬組成物。
- ADA2タンパク質が配列番号273に記載するアミノ酸残基の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項207に記載の医薬組成物。
- ADA2タンパク質またはその触媒活性部分がペグ化されている、請求項208に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462063936P | 2014-10-14 | 2014-10-14 | |
US62/063,936 | 2014-10-14 | ||
PCT/US2015/055613 WO2016061286A2 (en) | 2014-10-14 | 2015-10-14 | Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017532045A true JP2017532045A (ja) | 2017-11-02 |
JP2017532045A5 JP2017532045A5 (ja) | 2017-12-14 |
JP6625627B2 JP6625627B2 (ja) | 2019-12-25 |
Family
ID=54601993
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017519862A Active JP6625627B2 (ja) | 2014-10-14 | 2015-10-14 | アデノシンデアミナーゼ−2(ada2)、その変異体の組成物およびそれを使用する方法 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9969998B2 (ja) |
EP (1) | EP3207130B1 (ja) |
JP (1) | JP6625627B2 (ja) |
KR (1) | KR102122463B1 (ja) |
CN (1) | CN108064282A (ja) |
AU (2) | AU2015332533B2 (ja) |
BR (1) | BR112017007765B1 (ja) |
CA (3) | CA3126536C (ja) |
DK (1) | DK3207130T3 (ja) |
EA (1) | EA201700181A1 (ja) |
ES (1) | ES2753391T3 (ja) |
IL (1) | IL251527B (ja) |
NZ (2) | NZ746680A (ja) |
PL (1) | PL3207130T3 (ja) |
SG (1) | SG11201702934TA (ja) |
WO (1) | WO2016061286A2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019098385A1 (ja) * | 2017-11-20 | 2019-05-23 | コニカミノルタ株式会社 | 薬剤評価方法 |
JP2021531754A (ja) * | 2018-07-09 | 2021-11-25 | プレシゲン,インコーポレイテッド | 融合構築物およびその使用法 |
JP7502861B2 (ja) | 2019-12-27 | 2024-06-19 | 旭化成株式会社 | 標的物質と両親媒性高分子との複合体の形成反応の反応温度の評価方法 |
Families Citing this family (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10322949B2 (en) | 2012-03-15 | 2019-06-18 | Flodesign Sonics, Inc. | Transducer and reflector configurations for an acoustophoretic device |
US9950282B2 (en) | 2012-03-15 | 2018-04-24 | Flodesign Sonics, Inc. | Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation |
US10967298B2 (en) | 2012-03-15 | 2021-04-06 | Flodesign Sonics, Inc. | Driver and control for variable impedence load |
US9752113B2 (en) | 2012-03-15 | 2017-09-05 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic perfusion devices |
US10689609B2 (en) | 2012-03-15 | 2020-06-23 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic bioreactor processes |
US9458450B2 (en) | 2012-03-15 | 2016-10-04 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves |
US9745548B2 (en) | 2012-03-15 | 2017-08-29 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic perfusion devices |
US10704021B2 (en) | 2012-03-15 | 2020-07-07 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic perfusion devices |
US10737953B2 (en) | 2012-04-20 | 2020-08-11 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustophoretic method for use in bioreactors |
US9745569B2 (en) | 2013-09-13 | 2017-08-29 | Flodesign Sonics, Inc. | System for generating high concentration factors for low cell density suspensions |
PL3081576T3 (pl) | 2013-12-12 | 2020-03-31 | Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. | Przeciwciało anty pd-1, jego fragment wiążący antygen i ich zastosowanie medyczne |
WO2015105955A1 (en) | 2014-01-08 | 2015-07-16 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber |
US9744483B2 (en) | 2014-07-02 | 2017-08-29 | Flodesign Sonics, Inc. | Large scale acoustic separation device |
HUE043847T2 (hu) | 2014-08-28 | 2019-09-30 | Halozyme Inc | Hialuronán-lebontó enzimmel és egy immun checkpoint inhibitorral végzett kombinációs terápia |
EA201700181A1 (ru) | 2014-10-14 | 2017-09-29 | Галозим, Инк. | Композиции аденозиндеаминазы-2 (ада-2), их варианты и способы использования |
US11021699B2 (en) | 2015-04-29 | 2021-06-01 | FioDesign Sonics, Inc. | Separation using angled acoustic waves |
US11708572B2 (en) | 2015-04-29 | 2023-07-25 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic cell separation techniques and processes |
US11377651B2 (en) | 2016-10-19 | 2022-07-05 | Flodesign Sonics, Inc. | Cell therapy processes utilizing acoustophoresis |
US10874724B2 (en) * | 2015-05-22 | 2020-12-29 | University Of Houston System | Enzymatic immunomodulation of solid tumors and uses thereof |
US11474085B2 (en) | 2015-07-28 | 2022-10-18 | Flodesign Sonics, Inc. | Expanded bed affinity selection |
US11459540B2 (en) | 2015-07-28 | 2022-10-04 | Flodesign Sonics, Inc. | Expanded bed affinity selection |
CA3056071A1 (en) * | 2016-03-11 | 2017-09-14 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Methods and compositions for treating tumors |
US11085035B2 (en) | 2016-05-03 | 2021-08-10 | Flodesign Sonics, Inc. | Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis |
US11214789B2 (en) | 2016-05-03 | 2022-01-04 | Flodesign Sonics, Inc. | Concentration and washing of particles with acoustics |
AU2017281497B2 (en) * | 2016-06-22 | 2023-04-06 | Proqr Therapeutics Ii B.V. | Single-stranded RNA-editing oligonucleotides |
WO2018014260A1 (en) | 2016-07-20 | 2018-01-25 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof |
CN110140176B (zh) * | 2016-09-30 | 2023-11-14 | 分子装置有限公司 | 用于检测最优候选化合物的计算机装置及其方法 |
WO2018068201A1 (en) | 2016-10-11 | 2018-04-19 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4 |
CA3041517A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Flodesign Sonics, Inc. | Affinity cell extraction by acoustics |
US20180271939A1 (en) * | 2017-03-24 | 2018-09-27 | Milton J. Silverman, JR. | Genetic method to kill cancer cells by suffocation |
WO2018218137A1 (en) | 2017-05-25 | 2018-11-29 | Leidos, Inc. | Pd-1 and ctla-4 dual inhibitor peptides |
EP3641827A1 (en) * | 2017-06-21 | 2020-04-29 | XL-protein GmbH | Conjugates of protein drugs and p/a peptides |
US10391154B2 (en) * | 2017-07-19 | 2019-08-27 | Leadiant Biosciences Ltd. | Compositions and methods for treating or ameliorating fibrosis, systemic sclerosis and scleroderma |
WO2019020543A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | Transgene Sa | ONCOLYTIC VIRUSES EXPRESSING AGENTS TARGETING METABOLIC IMMUNE MODULATORS |
CA3073379A1 (en) * | 2017-08-19 | 2019-02-28 | Ohio State Innovation Foundation | Novel peptide-based cancer imaging agents |
US20210093684A1 (en) * | 2017-10-31 | 2021-04-01 | KaliVir Immunotherapeutics LLC | Platform oncolytic vector for systemic delivery |
EP3725092A4 (en) | 2017-12-14 | 2021-09-22 | FloDesign Sonics, Inc. | DRIVE AND CONTROL UNIT FOR ACOUSTIC CONVERTER |
CA3082280A1 (en) | 2017-12-28 | 2019-07-04 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Single-domain antibodies and variants thereof against tigit |
WO2019134710A1 (en) * | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof |
TWI802633B (zh) | 2018-01-15 | 2023-05-21 | 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 | 針對pd-1之單域抗體及其變異體 |
AU2018410849A1 (en) | 2018-02-27 | 2020-09-10 | Leidos, Inc. | PD-1 peptide inhibitors |
WO2019166701A1 (en) * | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Turun Yliopisto | Anti-adenosine signaling pathway antibodies conjugated or fused with adenosine deaminase or capable of binding adenosine deaminase |
US11598769B2 (en) * | 2018-07-27 | 2023-03-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Oligomerized protein-polymer conjugates |
US20230101597A1 (en) * | 2019-02-13 | 2023-03-30 | Beam Therapeutics Inc. | Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency |
CN116497067A (zh) | 2019-02-13 | 2023-07-28 | 比姆医疗股份有限公司 | 治疗血红素病变的组合物和方法 |
CN114040970A (zh) * | 2019-02-13 | 2022-02-11 | 比姆医疗股份有限公司 | 使用腺苷脱氨酶碱基编辑器编辑疾病相关基因的方法,包括遗传性疾病的治疗 |
CN109988816A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-07-09 | 浙江夸克生物科技有限公司 | 一种腺苷脱氨酶测定试剂盒 |
EP3725323A1 (en) * | 2019-04-17 | 2020-10-21 | Targovax Asa | Oncolytic adenoviral vector expressing a member of the b7 family of costimulatory ligands and ada |
CN110063970A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-30 | 上海心脉途医疗科技有限公司 | 与irAE相关的肠道菌群及irAE的治疗和预防方法 |
JP2022533711A (ja) | 2019-05-22 | 2022-07-25 | レイドス, インコーポレイテッド | Lag3結合ペプチド |
US20220228133A1 (en) * | 2019-05-22 | 2022-07-21 | Toolgen Incorporated | Single base substitution protein, and composition comprising same |
JP2022546608A (ja) * | 2019-09-09 | 2022-11-04 | ビーム セラピューティクス インク. | 新規核酸塩基エディター及びその使用方法 |
CN110607348B (zh) * | 2019-10-14 | 2023-03-10 | 中国医学科学院北京协和医院 | 应用试剂盒和全自动生化仪同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的方法 |
CA3185657A1 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Leidos, Inc. | Immunomodulatory compounds |
CA3189692A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-03 | Leidos, Inc. | Lag3 binding peptides |
US11987646B2 (en) | 2020-10-12 | 2024-05-21 | Leidos, Inc. | Immunomodulatory peptides |
US20240025971A1 (en) * | 2020-10-23 | 2024-01-25 | Atreca, Inc. | Antibodies to coronavirus sars-cov-2 |
CN114350691B (zh) * | 2021-03-05 | 2023-12-08 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法 |
CN113416735B (zh) * | 2021-03-17 | 2023-01-31 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用 |
CA3214494A1 (en) * | 2021-03-26 | 2022-09-29 | Beam Therapeutics Inc. | Adenosine deaminase variants and uses thereof |
IL308018A (en) | 2021-04-30 | 2023-12-01 | Kalivir Immunotherapeutics Inc | Oncolytic viruses for different MHC expression |
CN113533279B (zh) * | 2021-07-15 | 2022-07-29 | 河北农业大学 | 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法 |
KR20240050428A (ko) * | 2021-08-31 | 2024-04-18 | 더 텍사스 에이 앤드 엠 유니버시티 시스템 | 키메라 항원 수용체(car) t 세포 요법 플랫폼 |
WO2023086920A2 (en) * | 2021-11-12 | 2023-05-19 | Georgia Tech Research Corporation | Adenosine deaminase 2 compositions and methods for using same |
AU2023289270A1 (en) * | 2022-06-22 | 2024-06-27 | Alteogen Inc. | N-terminal and/or c-terminal cleaved soluble ph20 polypeptide and use thereof |
CN114935572A (zh) * | 2022-07-25 | 2022-08-23 | 香港科技大学深圳研究院 | 一种基于纳米材料的可视化尿酸检测方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001511648A (ja) * | 1997-02-06 | 2001-08-14 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ,インコーポレイテッド | 樹状細胞由来成長因子 |
WO2005000099A2 (en) * | 2003-06-09 | 2005-01-06 | Genzyme Corporation | BLOOD FACTOR DOMAINS (BFDs) |
JP2010524472A (ja) * | 2007-04-20 | 2010-07-22 | エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | 安定な組換えアデノシン・デアミナーゼ |
Family Cites Families (263)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2488564A (en) | 1947-06-03 | 1949-11-22 | Orthe Pharmaecutlcal Corp | Preparation of hyaluronidase |
US2488565A (en) | 1947-06-04 | 1949-11-22 | Ortho Pharma Corp | Preparation of hyaluronidase |
US2676139A (en) | 1950-09-01 | 1954-04-20 | American Home Prod | Hyaluronidase |
US2808362A (en) | 1952-05-02 | 1957-10-01 | Armour & Co | Preparation of hyaluronidase |
US2795529A (en) | 1954-06-17 | 1957-06-11 | American Home Prod | Stabilized hyaluronidase solution containing calcium chloride |
US2806815A (en) | 1955-04-12 | 1957-09-17 | Ortho Pharma Corp | Stabilized hyaluronidase |
US3536809A (en) | 1969-02-17 | 1970-10-27 | Alza Corp | Medication method |
US3598123A (en) | 1969-04-01 | 1971-08-10 | Alza Corp | Bandage for administering drugs |
US3630200A (en) | 1969-06-09 | 1971-12-28 | Alza Corp | Ocular insert |
US3710795A (en) | 1970-09-29 | 1973-01-16 | Alza Corp | Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane |
US3847770A (en) | 1972-04-10 | 1974-11-12 | Continental Can Co | Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates |
GB1429184A (en) | 1972-04-20 | 1976-03-24 | Allen & Hanburys Ltd | Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols |
US4044126A (en) | 1972-04-20 | 1977-08-23 | Allen & Hanburys Limited | Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof |
US3845770A (en) | 1972-06-05 | 1974-11-05 | Alza Corp | Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent |
US3916899A (en) | 1973-04-25 | 1975-11-04 | Alza Corp | Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4002531A (en) | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
US4008719A (en) | 1976-02-02 | 1977-02-22 | Alza Corporation | Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent |
GB8322007D0 (en) | 1983-08-16 | 1983-09-21 | Wellcome Found | Pharmaceutical delivery system |
US4952496A (en) | 1984-03-30 | 1990-08-28 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
US4769027A (en) | 1984-08-15 | 1988-09-06 | Burroughs Wellcome Co. | Delivery system |
IE58110B1 (en) | 1984-10-30 | 1993-07-14 | Elan Corp Plc | Controlled release powder and process for its preparation |
US4751180A (en) | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
US4935233A (en) | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
EP0307434B2 (en) | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
US5033252A (en) | 1987-12-23 | 1991-07-23 | Entravision, Inc. | Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product |
US5052558A (en) | 1987-12-23 | 1991-10-01 | Entravision, Inc. | Packaged pharmaceutical product |
US5716826A (en) | 1988-03-21 | 1998-02-10 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
US5073543A (en) | 1988-07-21 | 1991-12-17 | G. D. Searle & Co. | Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle |
US6780613B1 (en) | 1988-10-28 | 2004-08-24 | Genentech, Inc. | Growth hormone variants |
JP3045539B2 (ja) | 1989-02-21 | 2000-05-29 | ワシントン ユニバーシティ | 改変型生殖ホルモン |
IT1229203B (it) | 1989-03-22 | 1991-07-25 | Bioresearch Spa | Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative. |
US5122614A (en) | 1989-04-19 | 1992-06-16 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
US5324844A (en) | 1989-04-19 | 1994-06-28 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
US5120548A (en) | 1989-11-07 | 1992-06-09 | Merck & Co., Inc. | Swelling modulated polymeric drug delivery device |
US5733566A (en) | 1990-05-15 | 1998-03-31 | Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii | Controlled release of antiparasitic agents in animals |
US5846951A (en) | 1991-06-06 | 1998-12-08 | The School Of Pharmacy, University Of London | Pharmaceutical compositions |
US5262522A (en) | 1991-11-22 | 1993-11-16 | Immunex Corporation | Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor |
US5580578A (en) | 1992-01-27 | 1996-12-03 | Euro-Celtique, S.A. | Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers |
US5323907A (en) | 1992-06-23 | 1994-06-28 | Multi-Comp, Inc. | Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications |
US5349001A (en) | 1993-01-19 | 1994-09-20 | Enzon, Inc. | Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides |
US5591767A (en) | 1993-01-25 | 1997-01-07 | Pharmetrix Corporation | Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac |
WO1994028024A1 (en) | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Enzon, Inc. | Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity |
US5457035A (en) | 1993-07-23 | 1995-10-10 | Immunex Corporation | Cytokine which is a ligand for OX40 |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5605976A (en) | 1995-05-15 | 1997-02-25 | Enzon, Inc. | Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids |
US5919455A (en) | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5446090A (en) | 1993-11-12 | 1995-08-29 | Shearwater Polymers, Inc. | Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules |
SK166695A3 (en) | 1994-03-31 | 1997-02-05 | Amgen Inc | Mgdf polypeptide for stimulating growth and megakaryocyte differentiation |
US5795569A (en) | 1994-03-31 | 1998-08-18 | Amgen Inc. | Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation |
US20020159979A1 (en) | 1994-06-06 | 2002-10-31 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
IT1270594B (it) | 1994-07-07 | 1997-05-07 | Recordati Chem Pharm | Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida |
US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
GB9422383D0 (en) | 1994-11-05 | 1995-01-04 | Wellcome Found | Antibodies |
US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US6086875A (en) | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
US6030613A (en) | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US6485726B1 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
US5747027A (en) | 1995-04-07 | 1998-05-05 | The Regents Of The University Of California | BH55 hyaluronidase |
US5739277A (en) | 1995-04-14 | 1998-04-14 | Genentech Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US6121022A (en) | 1995-04-14 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US6096871A (en) | 1995-04-14 | 2000-08-01 | Genentech, Inc. | Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life |
US7153510B1 (en) | 1995-05-04 | 2006-12-26 | Yale University | Recombinant vesiculoviruses and their uses |
US5756593A (en) | 1995-05-15 | 1998-05-26 | Enzon, Inc. | Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids |
FR2735789B1 (fr) | 1995-06-23 | 1997-07-25 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant |
US5672662A (en) | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
JPH11514853A (ja) | 1995-09-08 | 1999-12-21 | ジエンザイム コーポレイション | 遺伝子治療のための改良されたaavベクター |
US7001765B2 (en) | 1996-03-06 | 2006-02-21 | Medigene Ag | Adeno-associated virus vector for boosting immunogenicity of cells |
US5747322A (en) | 1996-05-09 | 1998-05-05 | The Regents Of The University Of California | Recombinant crab collagenase |
CA2262405A1 (en) | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Bristol-Myers Squibb Company | A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis |
US6214966B1 (en) | 1996-09-26 | 2001-04-10 | Shearwater Corporation | Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution |
US6258351B1 (en) | 1996-11-06 | 2001-07-10 | Shearwater Corporation | Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels |
WO1998023289A1 (en) | 1996-11-27 | 1998-06-04 | The General Hospital Corporation | MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
ES2246069T3 (es) | 1997-05-02 | 2006-02-01 | Genentech, Inc. | Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos. |
US5990237A (en) | 1997-05-21 | 1999-11-23 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines |
US6635472B1 (en) | 1997-08-15 | 2003-10-21 | Rubicon Laboratory, Inc. | Retrovirus and viral vectors |
EP1015619A1 (en) | 1997-09-19 | 2000-07-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses |
US20050158273A1 (en) | 1997-09-25 | 2005-07-21 | Harris J. M. | Soluble, degradable polyethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution |
GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
US6448369B1 (en) | 1997-11-06 | 2002-09-10 | Shearwater Corporation | Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation |
US6180095B1 (en) | 1997-12-17 | 2001-01-30 | Enzon, Inc. | Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents |
CA2312975C (en) | 1997-12-17 | 2012-08-21 | Enzon, Inc. | Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents |
US5985263A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
US6624142B2 (en) | 1997-12-30 | 2003-09-23 | Enzon, Inc. | Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs |
US5965119A (en) | 1997-12-30 | 1999-10-12 | Enzon, Inc. | Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents |
PT1061954E (pt) | 1998-03-12 | 2004-10-29 | Nektar Therapeutics Al Corp | Derivados de poli(etileno glicol) com grupos reactivos proximos |
US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
US6528624B1 (en) | 1998-04-02 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
US6242195B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-06-05 | Genentech, Inc. | Methods for determining binding of an analyte to a receptor |
EP1068241B1 (en) | 1998-04-02 | 2007-10-10 | Genentech, Inc. | Antibody variants and fragments thereof |
US6153655A (en) | 1998-04-17 | 2000-11-28 | Enzon, Inc. | Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same |
US6251382B1 (en) | 1998-04-17 | 2001-06-26 | Enzon, Inc. | Biodegradable high molecular weight polymeric linkers and their conjugates |
US6824766B2 (en) | 1998-04-17 | 2004-11-30 | Enzon, Inc. | Biodegradable high molecular weight polymeric linkers and their conjugates |
GB9809951D0 (en) | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Univ Cambridge Tech | Binding molecules |
US6436392B1 (en) | 1998-05-20 | 2002-08-20 | University Of Iowa Research Foundation | Adeno-associated virus vectors |
WO2000002017A2 (en) | 1998-07-03 | 2000-01-13 | Neles Field Controls Oy | Method and arrangement for measuring fluid |
CA2341029A1 (en) | 1998-08-17 | 2000-02-24 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
US6420339B1 (en) | 1998-10-14 | 2002-07-16 | Amgen Inc. | Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility |
US6491907B1 (en) | 1998-11-10 | 2002-12-10 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Recombinant parvovirus vectors and method of making |
EP1006183A1 (en) | 1998-12-03 | 2000-06-07 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Recombinant soluble Fc receptors |
CZ302706B6 (cs) | 1998-12-23 | 2011-09-14 | Pfizer Inc. | Lidská monoklonální protilátka, farmaceutická kompozice tuto protilátku obsahující, bunecná linie produkující tuto protilátku, izolovaná molekula kódující težký nebo lehký retezec uvedené protilátky, hostitelská bunka obsahující tuto izolovanou molek |
EE05627B1 (et) | 1998-12-23 | 2013-02-15 | Pfizer Inc. | CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
KR100940380B1 (ko) | 1999-01-15 | 2010-02-02 | 제넨테크, 인크. | 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체 |
GB9904582D0 (en) | 1999-02-26 | 1999-04-21 | Nycomed Imaging As | Process |
US6428968B1 (en) | 1999-03-15 | 2002-08-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Combined therapy with a chemotherapeutic agent and an oncolytic virus for killing tumor cells in a subject |
CZ299516B6 (cs) | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
PE20010288A1 (es) | 1999-07-02 | 2001-03-07 | Hoffmann La Roche | Derivados de eritropoyetina |
DE19933288A1 (de) | 1999-07-15 | 2001-01-18 | Medigene Ag | Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung |
US6461802B1 (en) | 1999-08-02 | 2002-10-08 | Agfa-Gevaert | Adhesive layer for polyester film |
MXPA02001911A (es) | 1999-08-24 | 2003-07-21 | Medarex Inc | Anticuerpos ctla-4 humanos y sus usos. |
US7605238B2 (en) | 1999-08-24 | 2009-10-20 | Medarex, Inc. | Human CTLA-4 antibodies and their uses |
US7241447B1 (en) | 1999-10-07 | 2007-07-10 | University Of Iowa Research Foundation | Adeno-associated virus vectors and uses thereof |
US6723316B2 (en) | 1999-12-22 | 2004-04-20 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Herpes simplex virus-1 Glycoprotein C mutants for treating unwanted hyperproliferative cell growth |
DK1259562T3 (da) | 1999-12-22 | 2006-04-18 | Nektar Therapeutics Al Corp | Sterisk hindrede derivater af vandoplöselige polymerer |
US6413507B1 (en) | 1999-12-23 | 2002-07-02 | Shearwater Corporation | Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol) |
US7223593B2 (en) | 2000-01-21 | 2007-05-29 | Biovex Limited | Herpes virus strains for gene therapy |
US6602498B2 (en) | 2000-02-22 | 2003-08-05 | Shearwater Corporation | N-maleimidyl polymer derivatives |
US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
EP2267026A1 (en) | 2000-04-12 | 2010-12-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US7306902B2 (en) | 2002-06-28 | 2007-12-11 | Oncolyties Biotech Inc. | Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms |
ES2256234T3 (es) | 2000-05-16 | 2006-07-16 | Lipoxen Technologies Limited | Derivatizacion de proteinas en solucion acuosa. |
IL152804A0 (en) | 2000-05-16 | 2003-06-24 | Bolder Biotechnology Inc | Methods for refolding proteins containing free cysteine residues |
GB0029407D0 (en) | 2000-12-01 | 2001-01-17 | Affitech As | Product |
ES2649037T3 (es) | 2000-12-12 | 2018-01-09 | Medimmune, Llc | Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas |
DE60144439D1 (de) | 2000-12-20 | 2011-05-26 | Hoffmann La Roche | Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg) |
TWI246524B (en) | 2001-01-19 | 2006-01-01 | Shearwater Corp | Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles |
US20020096037A1 (en) | 2001-01-25 | 2002-07-25 | Richard Muller | Color-coded melody text and method of teaching |
US6888319B2 (en) | 2001-03-01 | 2005-05-03 | Palomar Medical Technologies, Inc. | Flashlamp drive circuit |
EP1377306A1 (en) | 2001-03-09 | 2004-01-07 | Dyax Corp. | Serum albumin binding moieties |
US6653103B2 (en) | 2001-03-30 | 2003-11-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Inhibition of nucleocytoplasmic transport by vesicular stomatitis virus M protein-like polypeptides |
US20040106794A1 (en) | 2001-04-16 | 2004-06-03 | Schering Corporation | 3,4-Di-substituted cyclobutene-1,2-diones as CXC-chemokine receptor ligands |
NZ527687A (en) | 2001-05-11 | 2005-10-28 | Wellstat Biolog Corp Formerly | Preferential binding of an oncolytic virus such as Newcastle Disease Virus (NDV) to leukocytes compared with erythrocytes used as a therapy for cancer |
IL149701A0 (en) | 2001-05-23 | 2002-11-10 | Pfizer Prod Inc | Use of anti-ctla-4 antibodies |
JP2004537305A (ja) | 2001-07-11 | 2004-12-16 | ユニバーシティー オブ マイアミ | 腫瘍細胞の処置のための組換えvsv |
US6908963B2 (en) | 2001-10-09 | 2005-06-21 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith |
JP4758608B2 (ja) | 2001-11-07 | 2011-08-31 | ネクター セラピューティックス | 分枝ポリマーおよびそれらの結合体 |
PT1463751E (pt) | 2001-12-21 | 2013-08-26 | Human Genome Sciences Inc | Proteínas de fusão de albumina |
US20080194481A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-08-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
KR101271635B1 (ko) | 2001-12-21 | 2013-06-12 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 알부민 융합 단백질 |
US20040002587A1 (en) | 2002-02-20 | 2004-01-01 | Watkins Jeffry D. | Fc region variants |
US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
EP1487879B1 (en) | 2002-03-01 | 2012-12-26 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance |
US8188231B2 (en) | 2002-09-27 | 2012-05-29 | Xencor, Inc. | Optimized FC variants |
JP2005526769A (ja) | 2002-03-15 | 2005-09-08 | ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド | 治療剤を全身搬送するための中央気道投与 |
CA2479763A1 (en) | 2002-03-27 | 2003-10-09 | Baylor College Of Medicine | Potent oncolytic herpes simplex virus for cancer therapy |
US20030225260A1 (en) | 2002-04-30 | 2003-12-04 | Snyder Richard O. | Production of recombinant AAV virions |
IL149820A0 (en) | 2002-05-23 | 2002-11-10 | Curetech Ltd | Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency |
CA2489523A1 (en) | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Wellstat Biologics Corporation | Administration of therapeutic viruses |
US7122189B2 (en) | 2002-08-13 | 2006-10-17 | Enzon, Inc. | Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers |
US7087229B2 (en) | 2003-05-30 | 2006-08-08 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers |
CA2495251C (en) | 2002-08-14 | 2018-03-06 | Macrogenics, Inc. | Fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof |
US20050260601A1 (en) | 2002-09-09 | 2005-11-24 | Whitt Michael A | Recombinant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof |
US7569214B2 (en) | 2002-09-09 | 2009-08-04 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Method for preparing water-soluble polymer derivatives bearing a terminal carboxylic acid |
DK2345671T3 (en) | 2002-09-27 | 2016-02-15 | Xencor Inc | Optimized Fc variants and methods for their formation |
NZ521851A (en) | 2002-10-08 | 2005-02-25 | Auckland Uniservices Ltd | Nitroaniline-based unsymmetrical mustard alkylating agents for gene dependent enzyme prodrug therapy |
SI1562972T1 (sl) | 2002-10-15 | 2010-12-31 | Facet Biotech Corp | ALTERACIJA FcRn VEZANIH AFINITET ALI SERUMSKIH RAZPOLOVNIH DOB ANTITELESC Z MUTAGENEZO |
KR20040040782A (ko) | 2002-11-08 | 2004-05-13 | 선바이오(주) | 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법 |
GB2395337B (en) | 2002-11-14 | 2005-12-28 | Gary Michael Wilson | Warning Unit |
US7355008B2 (en) | 2003-01-09 | 2008-04-08 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
EP1596887B1 (en) | 2003-02-26 | 2022-03-23 | Nektar Therapeutics | Polymer-factor viii moiety conjugates |
US8388955B2 (en) | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
US20090010920A1 (en) | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
US7786071B2 (en) | 2003-03-04 | 2010-08-31 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Pon polypeptides polynucleotides encoding same and compositions and methods utilizing same |
US20060104968A1 (en) | 2003-03-05 | 2006-05-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases |
US7871607B2 (en) | 2003-03-05 | 2011-01-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases |
JP4464395B2 (ja) | 2003-03-05 | 2010-05-19 | ヘイローザイム インコーポレイテッド | 可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、その調製プロセス、使用およびそれを含む薬学的組成物 |
ES2319424T3 (es) | 2003-03-27 | 2009-05-07 | Ottawa Health Research Institute | Virus mutantes de la estomatitis vesivular y sus usos. |
US7731974B2 (en) | 2003-03-27 | 2010-06-08 | Ottawa Hospital Research Institute | Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof |
US7610156B2 (en) | 2003-03-31 | 2009-10-27 | Xencor, Inc. | Methods for rational pegylation of proteins |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
KR100512483B1 (ko) | 2003-05-07 | 2005-09-05 | 선바이오(주) | 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법 |
CA2510040C (en) | 2003-05-23 | 2012-01-03 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Polymeric reagents and polymer-biomolecule conjugates comprising carbamate linkages |
KR101113726B1 (ko) | 2003-08-12 | 2012-02-27 | 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 | 단백질 유도 및 컨쥬게이션용 시알산 유도체 |
EP2298926A1 (en) | 2003-09-30 | 2011-03-23 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses thereof |
GB0324368D0 (en) | 2003-10-17 | 2003-11-19 | Univ Cambridge Tech | Polypeptides including modified constant regions |
GB0326798D0 (en) | 2003-11-17 | 2003-12-24 | Crusade Lab Ltd | Methods for generating mutant virus |
WO2005049846A2 (en) | 2003-11-17 | 2005-06-02 | Crusade Laboratories Limited | Mutant herpes simplex virus and use thereof in the treatment of squamous cell cancer |
US7897146B2 (en) | 2003-11-17 | 2011-03-01 | Crusade Laboratories Limited | Treatment using herpes simplex virus |
CA2548817A1 (en) | 2003-12-04 | 2005-06-23 | Xencor, Inc. | Methods of generating variant proteins with increased host string content and compositions thereof |
PT1718677E (pt) | 2003-12-19 | 2012-07-18 | Genentech Inc | Fragmentos de anticorpo monovalentes úteis como agentes terapêuticos |
EP1697520A2 (en) | 2003-12-22 | 2006-09-06 | Xencor, Inc. | Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites |
ATE437184T1 (de) | 2004-01-12 | 2009-08-15 | Applied Molecular Evolution | Varianten der fc-region |
EP1718667B1 (en) | 2004-02-23 | 2013-01-09 | Genentech, Inc. | Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates |
EP1737890A2 (en) | 2004-03-24 | 2007-01-03 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin variants outside the fc region |
WO2005123780A2 (en) | 2004-04-09 | 2005-12-29 | Protein Design Labs, Inc. | Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
WO2005118799A1 (en) | 2004-04-15 | 2005-12-15 | Ista Pharmaceuticals, Inc. | Ovine hyaluronidase |
WO2005116224A2 (en) | 2004-05-18 | 2005-12-08 | Children's Memorial Hospital | Tetracycline-regulated adeno-associated viral (aav) vectors for gene delivery to the nervous system |
US7427396B2 (en) | 2004-06-03 | 2008-09-23 | Genzyme Corporation | AAV vectors for gene delivery to the lung |
US7731952B2 (en) | 2004-06-24 | 2010-06-08 | New York University | Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response |
WO2006085967A2 (en) | 2004-07-09 | 2006-08-17 | Xencor, Inc. | OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS |
EP1919950A1 (en) | 2004-07-15 | 2008-05-14 | Xencor, Inc. | Optimized fc variants |
US20070166281A1 (en) | 2004-08-21 | 2007-07-19 | Kosak Kenneth M | Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods for their synthesis |
WO2006047350A2 (en) | 2004-10-21 | 2006-05-04 | Xencor, Inc. | IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION |
EP1819823A2 (en) | 2004-12-01 | 2007-08-22 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Generation of replication competent viruses for therapeutic use |
CA2602316A1 (en) | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Pfizer Products Inc. | Anti-ctla4 antibody and indolinone combination therapy for treatment of cancer |
EP3530736A3 (en) | 2005-05-09 | 2019-11-06 | ONO Pharmaceutical Co., Ltd. | Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics |
US20070020238A1 (en) | 2005-06-01 | 2007-01-25 | David Baltimore | Method of targeted gene delivery using viral vectors |
CA2613310C (en) | 2005-06-23 | 2014-06-17 | Baylor College Of Medicine | Use of mutant herpes simplex virus-2 for cancer therapy |
SI1907424T1 (sl) | 2005-07-01 | 2015-12-31 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Humana monoklonska protitelesa proti programiranem smrtnem ligandu 1 (PD-L1) |
MX2008001865A (es) | 2005-08-12 | 2008-04-15 | Human Genome Sciences Inc | Proteinas de fusion de albumina. |
US7943374B2 (en) | 2005-08-21 | 2011-05-17 | Markus Hildinger | Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb |
US7301003B2 (en) | 2005-08-26 | 2007-11-27 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Method of preparing polymers having terminal amine groups |
US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
US7846445B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-07 | Amunix Operating, Inc. | Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof |
US7601798B2 (en) | 2005-10-04 | 2009-10-13 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Methods of preparing polymers having terminal amine groups using protected amine salts |
US7989554B2 (en) | 2006-01-10 | 2011-08-02 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Reacting polyalkylene oxide with base, tertiary alkyl haloacetate, then acid to prepare polyalkylene oxide carboxylic acid |
US8048848B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof |
US7973495B2 (en) | 2006-03-13 | 2011-07-05 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Adaptive control apparatus and method for a solid state lighting system |
WO2007149686A2 (en) | 2006-06-21 | 2007-12-27 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Stabilized proteins |
US20100254944A1 (en) | 2006-09-14 | 2010-10-07 | Mani Subramanian | Albumin Fusion Proteins |
KR20090083334A (ko) | 2006-09-15 | 2009-08-03 | 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 | 방해된 에스테르 기재 생분해성 링커를 갖는 폴리알킬렌 옥시드 |
US20100178684A1 (en) | 2006-12-21 | 2010-07-15 | Woo Savio L C | Transgenic oncolytic viruses and uses thereof |
EP2114420B1 (en) | 2007-02-16 | 2016-01-27 | Virttu Biologics Limited | Herpes simplex viruses and methods of viral replication |
JP5595904B2 (ja) | 2007-04-20 | 2014-09-24 | シグマ−タウ レア ディジージズ エスィアー | 酵素による抗癌治療 |
AU2008266951B2 (en) | 2007-06-18 | 2013-12-12 | Merck Sharp & Dohme B.V. | Antibodies to human programmed death receptor PD-1 |
NZ580670A (en) | 2007-06-21 | 2011-09-30 | Univ Muenchen Tech | Biological active proteins having increased in vivo and/or vitro stability |
JP2010536341A (ja) | 2007-08-15 | 2010-12-02 | アムニクス, インコーポレイテッド | 生物学的に活性なポリペプチドの特性を改変するための組成物および方法 |
KR20140130512A (ko) | 2008-03-06 | 2014-11-10 | 할로자임, 아이엔씨 | 가용성 히알루로니다아제의 대규모 제조 |
US8313896B2 (en) | 2008-04-04 | 2012-11-20 | The General Hospital Corporation | Oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in the treatment of brain cancer |
EP2307033A4 (en) | 2008-05-29 | 2012-06-13 | Gen Hospital Corp | USE OF ONCOLYTIC HERPESVIRUS FOR THE KILLING OF CANCER STEM CELLS |
US20110159023A1 (en) | 2008-08-25 | 2011-06-30 | Solomon Langermann | Pd-1 antagonists and methods for treating infectious disease |
EP2335221B8 (en) | 2008-09-16 | 2016-05-25 | Novartis AG | Reproducible quantification of biomarker expression |
DK3037529T3 (da) | 2008-12-09 | 2019-05-20 | Halozyme Inc | Udvidede opløselige ph20-polypeptider og anvendelse deraf |
CN108997498A (zh) | 2008-12-09 | 2018-12-14 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途 |
US8481297B2 (en) | 2009-01-08 | 2013-07-09 | Yale University | Compositions and methods of use of an oncolytic vesicular stomatitis virus |
US8680050B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-03-25 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same |
US8703717B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
EP2393828B1 (en) | 2009-02-03 | 2016-10-12 | Amunix Operating Inc. | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
ES2385251B1 (es) | 2009-05-06 | 2013-05-06 | Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge | Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer. |
EP2437786B1 (en) | 2009-06-01 | 2016-05-18 | Yeda Research and Development Co. Ltd. | Prodrugs containing albumin binding probe |
MX354555B (es) | 2009-06-08 | 2018-03-09 | Amunix Operating Inc | Polipeptidos de la hormona de crecimiento y metodos de preparacion y su uso. |
EP2440228B8 (en) | 2009-06-08 | 2023-02-22 | Amunix Operating Inc. | Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same |
WO2011028229A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same |
WO2011028344A2 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same |
JP5934099B2 (ja) | 2009-10-01 | 2016-06-15 | アメリカ合衆国 | 抗血管内皮増殖因子受容体−2キメラ抗原受容体及び癌の治療のためのその使用 |
EP3279215B1 (en) | 2009-11-24 | 2020-02-12 | MedImmune Limited | Targeted binding agents against b7-h1 |
EP2504028A4 (en) | 2009-11-24 | 2014-04-09 | Amplimmune Inc | SIMULTANEOUS INHIBITION OF PD-L1 / PD-L2 |
EP4382170A2 (en) | 2009-12-06 | 2024-06-12 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof |
AU2011274423B2 (en) | 2010-07-09 | 2016-02-11 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Chimeric clotting factors |
EP3508573A1 (en) | 2010-07-09 | 2019-07-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Systems for factor viii processing and methods thereof |
US20130017997A1 (en) | 2010-08-19 | 2013-01-17 | Amunix Operating Inc. | Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same |
PT3012268T (pt) | 2010-09-08 | 2018-01-31 | Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus | Recetores de antigénio quimérico com uma região de charneira otimizada |
WO2012033953A1 (en) | 2010-09-08 | 2012-03-15 | Halozyme, Inc. | Methods for assessing and identifying or evolving conditionally active therapeutic proteins |
KR20230133410A (ko) | 2010-12-09 | 2023-09-19 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 암을 치료하기 위한 키메릭 항원 수용체 변형 t 세포의 용도 |
WO2012109387A1 (en) | 2011-02-08 | 2012-08-16 | Halozyme, Inc. | Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia |
CA2833212C (en) | 2011-05-12 | 2020-06-09 | Genentech, Inc. | Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides |
TW201840336A (zh) | 2011-08-01 | 2018-11-16 | 美商建南德克公司 | 利用pd-1軸結合拮抗劑及mek抑制劑治療癌症之方法 |
CA2851795C (en) | 2011-10-20 | 2018-11-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-cd22 chimeric antigen receptors |
WO2013085925A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-13 | Igenica, Inc. | Antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods |
IL298330A (en) | 2011-12-30 | 2023-01-01 | Halozyme Inc | Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof |
CN104379602B (zh) | 2012-03-08 | 2017-05-03 | 哈洛齐梅公司 | 具有条件活性的抗表皮生长因子受体抗体及其使用方法 |
EP2872526B1 (en) | 2012-07-13 | 2020-04-01 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Enhancing activity of car t cells by co-introducing a bispecific antibody |
US9629877B2 (en) | 2013-05-14 | 2017-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Human application of engineered chimeric antigen receptor (CAR) T-cells |
CN113957061A (zh) | 2013-08-30 | 2022-01-21 | 得克萨斯大学体系董事会 | 用于肿瘤疗法的犬尿氨酸耗竭酶的施用 |
SG11201601844TA (en) | 2013-09-13 | 2016-04-28 | Beigene Ltd | Anti-pd1 antibodies and their use as therapeutics and diagnostics |
EP3097117B1 (en) | 2014-01-21 | 2023-10-04 | Novartis Ag | Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules |
EA201700181A1 (ru) | 2014-10-14 | 2017-09-29 | Галозим, Инк. | Композиции аденозиндеаминазы-2 (ада-2), их варианты и способы использования |
-
2015
- 2015-10-14 EA EA201700181A patent/EA201700181A1/ru unknown
- 2015-10-14 CA CA3126536A patent/CA3126536C/en active Active
- 2015-10-14 AU AU2015332533A patent/AU2015332533B2/en active Active
- 2015-10-14 CA CA2964317A patent/CA2964317C/en active Active
- 2015-10-14 DK DK15797486T patent/DK3207130T3/da active
- 2015-10-14 KR KR1020177012446A patent/KR102122463B1/ko active IP Right Grant
- 2015-10-14 NZ NZ746680A patent/NZ746680A/en unknown
- 2015-10-14 BR BR112017007765-5A patent/BR112017007765B1/pt active IP Right Grant
- 2015-10-14 JP JP2017519862A patent/JP6625627B2/ja active Active
- 2015-10-14 SG SG11201702934TA patent/SG11201702934TA/en unknown
- 2015-10-14 PL PL15797486T patent/PL3207130T3/pl unknown
- 2015-10-14 EP EP15797486.6A patent/EP3207130B1/en active Active
- 2015-10-14 NZ NZ730563A patent/NZ730563A/en unknown
- 2015-10-14 WO PCT/US2015/055613 patent/WO2016061286A2/en active Application Filing
- 2015-10-14 CN CN201580067535.3A patent/CN108064282A/zh active Pending
- 2015-10-14 CA CA3203273A patent/CA3203273A1/en active Pending
- 2015-10-14 ES ES15797486T patent/ES2753391T3/es active Active
-
2016
- 2016-04-08 US US15/094,908 patent/US9969998B2/en active Active
-
2017
- 2017-04-03 IL IL251527A patent/IL251527B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-03-29 US US15/940,803 patent/US11584923B2/en active Active
- 2018-09-25 AU AU2018236742A patent/AU2018236742B2/en active Active
-
2022
- 2022-11-28 US US18/059,135 patent/US20230203470A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001511648A (ja) * | 1997-02-06 | 2001-08-14 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ,インコーポレイテッド | 樹状細胞由来成長因子 |
WO2005000099A2 (en) * | 2003-06-09 | 2005-01-06 | Genzyme Corporation | BLOOD FACTOR DOMAINS (BFDs) |
JP2010524472A (ja) * | 2007-04-20 | 2010-07-22 | エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | 安定な組換えアデノシン・デアミナーゼ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J. BIOL., CHEM., 2010, VOL.285, NO.16, P.12367-12377, JPN6018041295, ISSN: 0004089259 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019098385A1 (ja) * | 2017-11-20 | 2019-05-23 | コニカミノルタ株式会社 | 薬剤評価方法 |
JPWO2019098385A1 (ja) * | 2017-11-20 | 2020-12-24 | コニカミノルタ株式会社 | 薬剤評価方法 |
JP2021531754A (ja) * | 2018-07-09 | 2021-11-25 | プレシゲン,インコーポレイテッド | 融合構築物およびその使用法 |
JP7502861B2 (ja) | 2019-12-27 | 2024-06-19 | 旭化成株式会社 | 標的物質と両親媒性高分子との複合体の形成反応の反応温度の評価方法 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230203470A1 (en) | Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same | |
JP6422933B2 (ja) | Ph20ポリペプチド変異体、その製剤および使用 | |
US11414489B2 (en) | Combination therapy with a hyaluronan-degrading enzyme and an immune checkpoint inhibitor | |
US9278124B2 (en) | Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods | |
ES2661089T3 (es) | Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano | |
CN107964539B (zh) | 治疗性核酸酶组合物和方法 | |
MX2014004870A (es) | Diagnostico acompañante para terapia con agente anti-hialuronano y metodos de uso del mismo. | |
TW201534726A (zh) | 熱穩定ph20玻尿酸酶變異體及其用途 | |
JP2020528742A (ja) | 改変された膜型セリンプロテアーゼ1(mtsp−1)ポリペプチドおよび使用方法 | |
JP2020501518A (ja) | キメラタンパク質を用いたアレルギー疾患の治療 | |
EA041896B1 (ru) | Композиции аденозиндеаминазы-2 (ада-2), их варианты и способы использования |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171102 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171102 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181023 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190122 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190320 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190806 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191003 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20191105 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191127 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6625627 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |