KR20120034778A - 티보자닙 반응 예측 - Google Patents

티보자닙 반응 예측 Download PDF

Info

Publication number
KR20120034778A
KR20120034778A KR1020127003031A KR20127003031A KR20120034778A KR 20120034778 A KR20120034778 A KR 20120034778A KR 1020127003031 A KR1020127003031 A KR 1020127003031A KR 20127003031 A KR20127003031 A KR 20127003031A KR 20120034778 A KR20120034778 A KR 20120034778A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pgs
tumor
gene
tibozanib
genes
Prior art date
Application number
KR1020127003031A
Other languages
English (en)
Inventor
지 린
머레이 로빈슨
빈 펭
웬핑 캐서린 선
Original Assignee
아베오 파마슈티컬즈, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아베오 파마슈티컬즈, 인크. filed Critical 아베오 파마슈티컬즈, 인크.
Publication of KR20120034778A publication Critical patent/KR20120034778A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

인간 종양이 VEGF 억제제, 티보자닙 (AV-951)으로의 치료에 대해 반응성 또는 내성 (비-반응성)일지 여부에 대해 정량적으로 예측하는 진단 방법이 개시된다. 시험은 예측 유전자 세트내의 유전자의 발현 수준의 측정에 대한 알고리즘의 적용을 기반으로 한 것이다.

Description

티보자닙 반응 예측 {TIVOZANIB RESPONSE PREDICTION}
관련된 출원에 대한 상호-참조
본원은 2009년 7월 6일 출원된 미국 출원 일련 번호 12/498,183의 이점 및 그에 대한 우선권을 주장하며; 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명의 분야는 분자 생물학, 유전학, 종양학, 생물정보학 및 임상적 진단학이다.
본 발명의 배경
대부분의 암 약물은 일부 환자에게 효과적이지만, 다른 환자들에게는 효과적이지 않다. 이는 종양 사이의 유전적 변화로부터 야기되고, 동일 환자 내의 종양 사이에서조차 관찰될 수 있다. 가변적인 환자 반응이 특히 표적된 치료제에 대해 현저하다. 따라서, 표적된 요법의 완전한 잠재력은 어느 환자가 어떤 약물로부터 이득을 취할지를 결정하기 위한 적합한 시험 없이는 인식될 수 없다. 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)(NIH)에 따르면, 용어 "바이오마커"는 "치료적 개입에 대한 정상적인 생물학적 또는 병원성 과정 또는 약리 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가된 특징"으로서 정의된다.
바이오마커의 발견을 기반으로 한 개선된 진단의 개발은 사전에 주어진 약물에 대해 임상적 반응을 나타낼 가능성이 있는 환자를 확인함으로써 신규한 약물의 개발을 가속시킬 잠재력을 갖는다. 이는 임상 시험의 규모, 길이 및 비용을 의미있게 감소시킬 것이다. 기술, 예를 들면 유전체학, 단백질체학 및 분자 영상의학은 현재 특정 유전자돌연변이, 특정 유전자의 발현 수준 및 다른 분자 바이오마커의 빠르고, 세심하고, 신뢰성 있는 검출을 가능하게 한다. 종양의 분자적 특성화를 위한 다양한 기술의 유용성에 불구하고, 암 바이오마커의 임상적 이용은 적은 암 바이오마커가 발견되었기 때문에 대체로 실현되지 않은 채로 있다. 예를 들면, 최근의 검토 논문은 다음을 명시한다:
바이오마커의 신속한 개발 및 암의 진단 및 치료를 개선하기 위한 그들의 사용에 대한 중대한 필요성이 있다. (문헌 [Cho, 2007, Molecular Cancer 6:25])
암 바이오마커에 대한 또다른 최근의 검토 논문은 다음 논평을 함유한다:
도전은 암 바이오마커를 발견하는 것이다. 비록 다수의 종양 유형 - 예를 들면, 만성 골수성 백혈병, 위장관 기질적 종양, 폐암 및 다형성 교아세포종의 분자적으로 정의된 부분집합을 분자적으로 표적된 제제를 사용하여 표적하는데 임상적 성공이 있었지만 - 더 넓은 맥락에서 상기 성공을 적용시키는 능력은 환자에서 표적된 제제를 평가하기 위한 효율적인 전략의 부족에 의해 심각하게 제한되어있다. 문제는 주로 이들 흥미진진한 신규한 약물을 평가하기 위한 임상 시험을 위해 분자적으로 정의된 암이 있는 환자를 선택하는데 있어서의 무능력에 있다. 용액은 특정 제제로부터 이득을 얻을 가능성이 있는 환자를 확실히 확인하는 바이오마커를 요구한다. (문헌 [Sawyers, 2008, Nature 452:548-552, at 548])
상기와 같은 논평은 임상적으로 유용한 바이오마커 및 이러한 바이오마커를 기반으로 하는 진단 방법의 발견에 대한 필요성의 인식을 나타낸다.
암 바이오마커의 다음 3개의 별개의 유형이 있다: (1) 예후 바이오마커, (2) 예측 바이오마커 및 (3) 약역학 (PD) 바이오마커. 예후 바이오마커는 암, 예를 들면 고형 종양을 공격성, 즉 성장 속도 및/또는 전이 및 치료에 대한 굴절성에 따라 분류하기 위해 사용된다. 이를 때때로 "좋은 결과" 종양을 "안 좋은 결과" 종양과 구별한다고 한다. 예측 바이오마커는 특정 환자가 특정 약물로의 치료로부터 이득을 얻을 확률을 평가하기 위해 사용된다. 예를 들면, ERBB2 (HER2 또는 NEU) 유전자가 증폭된 유방암이 있는 환자는 트라스트주맙 (허셉틴 (HERCEPTIN)(등록상표))으로의 치료로부터 이득을 얻을 확률이 높으며, 반면 ERBB2 유전자 증폭이 없는 환자는 트라스트주맙으로의 치료로부터 이득을 얻을 확률이 낮다. PD 바이오마커는 환자가 약물을 복용하는 동안 환자에 대한 약물의 효과(들)의 징후이다. 따라서, PD 바이오마커는 종종 신규한 약물의 임상적 개발의 초기 단계 중 투여량 수준 및 투여 빈도의 지침으로서 사용된다. 암 바이오마커의 논의를 위해 예를 들면, 문헌 [Sawyers, 2008, Nature 452:548-552]을 참조한다.
티보자닙 (AV-951로도 알려짐)은 VEGF 수용체 1, 2 및 3의 효능있고 선택적인 소-분자 억제제이다. 티보자닙은 모든 3개 수용체에 대해 피코몰 억제 활성을 나타내고, 전임상적 모델에서 항종양 활성을 나타낸다 (문헌 [Nakamura et al., 2006, Cancer Res. 66:9134-9142]). 티보자닙은 272명-환자 2상 임상 시험 (문헌 [Bhargava et al., 2009, ASCO Genitourinary Cancer Symposium, Abstract No. 283)에서 양성 중간 결과를 산출하였다.
VEGF-표적된 요법에 중점을 둔 많은 전-임상 및 임상 연구에 불구하고, 항VEGF 제제의 항종양 활성의 원인이 되는 메카니즘은 완전히 이해되지 않는다. 표적된 요법의 다른 유형에 대해, 모두는 아니지만, 일부 환자는 티보자닙 요법으로부터 이득을 얻는다. VEGF 생물학의 복잡함은 임의의 주어진 종양에 대한 티보자닙의 효과를 예측 불가능하게 한다. 따라서, 티보자닙으로의 치료에 대해 반응을 나타낼 확률이 크거나 (또는 작은), 종양이 있는 환자를 확인하는데 사용될 수 있는 예측 바이오마커를 기반으로 한 진단 방법에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 (a) 마우스 및 인간에서 발현 수준의 일관성을 나타내며; (b) 개별 발현 수준이 집합적으로 마우스 종양 또는 인간 종양이 티보자닙으로 알려진 항암 약물으로의 치료에 대해 반응성 (민감성) 또는 비-반응성 (내성)일 여부를 나타내는 유전자의 세트의 발견을 기반으로 한다. 따라서, 본 발명은 인간 종양이 티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성일 여부를 정량적으로 예측하기 위한 진단 방법을 제공한다. 상기 방법은
(a) 인간 종양으로부터의 조직 샘플에서, (HUGO 유전자 기호에 의해 표시됨)
Figure pct00001
를 포함하는 예측 유전자 세트 (PGS)내의 각각의 유전자의 상대적 발현 수준을 결정하는 단계; 및
(b) 알고리즘
Figure pct00002
에 따라 PGS 점수를 계산하는 단계를 포함한다.
상기 알고리즘에서, E1, E2, ... E42는 PGS내의 42개 유전자의 발현 값이고,
정의된 한계점 (threshold) 미만의 PGS 점수는 종양이 티보자닙에 대해 반응성일 가능성이 있음을 나타내고, 정의된 한계점 초과의 PGS 점수는 종양이 티보자닙에 대해 내성일 가능성이 있음을 나타낸다.
본 발명의 일부 실시양태는 한계점 결정 분석을 수행하여 정의된 한계점을 생성하는 것을 포함한다. 한계점 결정 분석은 수용자 오퍼레이터 특성 곡선 (receiver operator characteristic) 분석을 포함할 수 있다. PGS내의 각각의 유전자에 대한 상대적 유전자 발현 수준은 그 유전자에 대해 mRNA 수준을 결정 (예를 들면, 측정)함으로써 수득될 수 있다. 종양 조직 샘플에서 mRNA 수준을 결정하기 위한 적합한 방법은 DNA 마이크로어레이 분석 및 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR), 예를 들면 타크맨 (TAQMAN)(등록상표) 검정을 포함한다.
본 발명의 또다른 일면은 인간 PGS 또는 마우스 PGS내의 각각의 유전자의 발현을 결정 (예를 들면, 측정)하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 PCR 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 PCR 프라이머 세트를 포함하는 진단 시험 키트를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 각각의 25마리의 마우스 종양 (HER2-유도된 유방 종양)에 대해 낮은 PGS 점수부터 높은 PGS 점수에 따라 배열된 PGS 점수를 나타내는 폭포 그래프이고, 각각의 종양 아래에 티보자닙 (AV-591)으로의 치료에 대한 반응 또는 비-반응을 나타낸다. 교차-해칭 (cross-hatching)은 반응성 종양을 나타내고; 교차-해칭이 없는 것은 비-반응성 종양을 나타낸다.
도 2는 도 1의 데이터를 기반으로 한 수용자 오퍼레이터 특성 (ROC) 곡선이다. 일반적으로, ROC 곡선은 최적 한계점 PGS 점수를 결정하기 위해 사용된다. 도 2의 ROC 곡선은 PGS 점수 = 0.33이 최적 한계점이라는 것을 나타내고, 이는 18.2%의 위양성율 및 5.9%의 위음성율을 산출한다.
발명의 상세한 설명
PGS의 유전자의 개별 발현 수준은 마우스 종양 및 인간 종양을 티보자닙으로 알려진 항종양 약물로의 치료에 대해 그들이 반응하는 가능성에 따라 분류하기 위한 예측 바이오마커로서 집합적으로 사용될 수 있다. 종양의 상기 분류는 임상적 환경에서 티보자닙으로의 치료에 대해 적합한 후보인 인간 환자를 확인하기 위해 유용하다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, "AV-951" 및 "티보자닙"은 N-{2-클로로-4-[(6,7-디메톡시-4-퀴놀릴)옥시]-페닐}-N'-(5-메틸-3-이속사졸릴)우레아를 의미하고, 이는 하기 화학 구조를 가지며, 그의 염 및 다형체를 포함한다:
Figure pct00003
본원에 사용된 바와 같이, "일관성"은 유전자의 세트에 적용되는 경우, 주어진 유형의 조직, 예를 들면 종양 조직 내에서 세트의 구성원의 발현 수준이 협동하여 증가되거나 또는 감소되는 통계적으로 의미있는 성향을 나타내는 것을 의미한다. 이론에 의해 제한할 의도는 없지만, 본 발명자들은 일관성이, 일관적인 유전자가 아마도 하나 이상의 생물학적 기능에 있어서 공통된 관련성을 공유한다는 것을 나타낼 수 있음에 주목한다.
본원에 사용된 바와 같이, "최적 한계점 PGS 점수"는 분류자가 위음성 판정 및 위양성 판정의 손실 사이의 가장 바람직한 균형을 제공하는 한계점 PGS 점수를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "PGS 점수"는 알고리즘
Figure pct00004
을 사용하여 계산되는 수치를 의미한다.
상기 알고리즘에서, E1, E2, ... E42는 PGS내의 42개 유전자의 발현 값이다.
본원에 사용된 바와 같이, "수용자 오퍼레이터 특성" (ROC) 곡선은 2진 분류자 시스템에 대한 위양성율 (민감성) 대 실제 양성율 (특이성)의 그래프를 의미한다. ROC 곡선의 건설에 있어서, 다음 정의가 적용된다:
위음성율: FNR = 1 - TPR
실제 양성율: TPR = 실제 양성 / (실제 양성 + 위음성)
위양성율: FPR = 위양성 / (위양성 + 음성)
본원에 사용된 바와 같이, 치료에 대해 "반응" 또는 "반응하다"는 치료된 종양과 관련하여, 그 종양이: (a) 성장의 지체, (b) 성장의 중단, 또는 (c) 퇴행을 나타내는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "한계점 결정 분석"은 특정 종양 유형에 대해 한계점 PGS 점수, 예를 들면 최적 한계점 PGS 점수를 결정하기 위해 주어진 종양 유형, 예를 들면 인간 신장 세포 암종을 제시하는 데이터 세트의 분석을 의미한다. 한계점 결정 분석에 있어서, 주어진 종양 유형을 제시하는 데이터 세트는 (a) 실제 반응 데이터 (반응 또는 비-반응), 및 (b) 종양을 갖는 마우스 또는 인간의 군으로부터의 각각의 종양에 대한 PGS 점수를 포함한다.
예측 유전자 세트 ( PGS )
티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성일 가능성이 있는 인간 종양의 확인에 관여하는 본 발명의 실시양태에서, PGS는 표 1 (하기)에 나열된 42개 인간 유전자를 포함한다:
Figure pct00005
본원에 개시된 유전자 세트의 예측 값은 표 1에 개시된 각각의 42개 유전자의 발현 수준을 결정 (예를 들면, 측정)함으로써 달성된다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 추가의 유전자는 본원에 개시된 PGS에 포함될 수 있다는 것 (또는 추가의 유전자의 발현 수준은 본원에 개시된 PGS에 추가로 측정될 수 있다는 것)이 고려되며, 추가의 유전자(들)의 포함이 인간 종양이 티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성일 여부를 정량적으로 결정하기 위한 예측 값을 변경하지 않는다.
조직 샘플
인간 환자의 종양으로부터의 조직 샘플 또는 마우스 모델이 샘플에서의 PGS 유전자 발현 수준이 본 발명에 따라 결정될 수 있도록 RNA의 공급원으로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 종양은 암종, 육종, 신경교종 또는 림프종이다. 조직 샘플은 통상의 종양 생검 기구 및 절차를 사용함으로써 수득될 수 있다. 내시경 생검, 절제 생검, 절개 생검, 미세침 생검, 펀치 (punch) 생검, 표층 생검 및 피부 생검은 본 발명을 실행하는데 사용하기 위한 종양 샘플을 수득하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있는 인정된 의학적 절차의 예이다. 종양 조직 샘플은 개별 유전자 발현 수준을 측정하는데 충분한 RNA를 제공하기 위해 충분히 커야한다.
종양 조직 샘플은 유전자 발현 분석, 예를 들면 RNA 추출 및 정량을 가능하게 하는 임의의 형태일 수 있다. 따라서, 조직 샘플은 신선할 수 있거나, 적합한 냉동 기술을 통해 보존될 수 있거나, 또는 비-냉동 기술을 통해 보존될 수 있다. 임상적 생검 표본을 다루기 위한 표준 방법은 조직 샘플을 포르말린 중에 고정시키고, 이어서 그를 파라핀 중에 매립시키는 것이다. 이 형태의 샘플은 일반적으로 포르말린-고정된, 파라핀-매립된 (FFPE) 조직으로서 알려져 있다. 후속적인 RNA 추출을 위한 조직 준비 및 조직 보존의 적합한 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
PGS내의 각각의 유전자에 대한 개별 유전자 발현 수준은 PGS 점수를 계산하기 위해 사용된 입력 값이다. 조직 샘플이 수득된 후, PGS내의 개별 유전자의 발현 수준을 결정, 즉 측정하는 것이 필요하다. 유전자 발현 수준은 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 개별 발현을 측정하기 위한 두 가지 예시적인 방법은 DNA 마이크로어레이 분석 및 qRT-PCR이고, 이들은 하기에 논의된다. 이들 대안 방법 중 하나에 대한 전제조건은 RNA 단리이다.
RNA 단리
조직 샘플로부터의 진핵 mRNA, 즉 폴리(a) RNA의 빠르고, 효율적인 추출을 위한 방법은 잘 확립되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Ausubel et al., 1997, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley & Sons]을 참조한다. 조직 샘플은 신선하거나, 냉동되거나 또는 파라핀-매립된 (FFPE) 임상적 연구 종양 표본으로 고정될 수 있다. 일반적으로, 신선하거나 또는 냉동된 조직 샘플로부터 단리된 RNA는 FFPE 샘플로부터의 RNA 보다 덜 단편화된 경향이 있다. 그러나, 종양 물질의 FFPE 샘플은 더 쉽게 구할 수 있고, FFPE 샘플은 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 RNA의 적합한 공급원이다. RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링 (프로파일링)을 위한 RNA의 공급원으로서의 FFPE 샘플의 논의에 대해 예를 들면, 문헌 [Clark-Langone et al., 2007, BMC Genomics 8:279]을 참조한다. 또한 문헌 [De Andres et al., 1995, Biotechniques 18:42044]; 및 베이커 등 (Baker et al.)의 미국 특허 출원 제2005/0095634호를 참조한다. RNA 추출 및 제조에 대한 판매자의 설명서가 있는 시판되는 키트의 사용은 광범위하고, 흔하다. 다양한 RNA 단리 생성물 및 완성된 키트의 상업적인 판매자는 퀴아젠 (Qiagen) (발렌시아, 캘리포니아 (Valencia, CA)), 인비트로젠 (Invitrogen) (칼스배드, 캘리포니아 (Carlsbad, CA)), 앰비온 (Ambion) (오스틴, 텍사스 (Austin, TX)) 및 엑시콘 (Exiqon) (오번, 매사츄세스 (Woburn, MA))를 포함한다.
일반적으로, RNA 단리는 조직/세포 붕괴로 시작된다. 조직/세포 붕괴 중에 알엔아제 (RNases)에 의한 RNA 분해를 최소화하는 것이 바람직하다. RNA 단리 절차 중에 알엔아제 활성을 제한하는 한 가지 방법은 세포가 붕괴한 즉시 변성제가 세포 내용물과 반드시 접촉하도록 하는 것이다. 또다른 일반적인 실행은 RNA 단리 절차에서 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 것이다. 임의로, 신선한 조직 샘플은 수집된 즉시 RNA 안정화 용액 중에 실온에서 담궈진다. 안정화 용액은 빠르게 세포를 침투하고, 4℃에서의 저장을 위해 RNA를 안정화시키고, 이는 후속적으로 단리된다. 상기 안정화 용액 중 하나는 알엔에이라터 (RNAlater)(등록상표) (앰비온, 오스틴, 텍사스)로서 시판된다.
일부 프로토콜에서, 총 RNA는 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리에 의해 붕괴 종양 물질로부터 단리된다. 일반적으로, mRNA는 총 세포 RNA의 대략 1% 내지 5%를 이룬다. 고정화 올리고(dT), 예를 들면 올리고(dT) 셀룰로스는 일반적으로 mRNA를 리보좀 RNA 및 트랜스퍼 RNA로부터 분리하기 위해 사용된다. 단리 후 저장되는 경우, RNA는 무-알엔아제 조건하에 저장되어야 한다. 단리된 RNA의 안정적인 저장 방법은 당업계에 공지되어 있다. RNA의 안정적인 저장을 위한 다양한 상품은 구할 수 있다.
마이크로어레이 분석
다발성 유전자에 대한 mRNA 발현 수준은 통상의 DNA 마이크로어레이 발현 프로파일링 기술을 사용하여 결정 (예를 들면, 측정)될 수 있다. DNA 마이크로어레이는 각각의 특정 DNA 절편이 어레이에서 알려진 위치를 차지하는 고체 표면 또는 기판, 예를 들면 유리, 플라스틱 또는 규소에 고착된 특정 DNA 절편 또는 프로브의 수집이다. 일반적으로 엄격 혼성화 조건하의 표지된 RNA의 샘플과의 혼성화는 어레이에서의 각각의 프로브에 상응하는 RNA 분자의 검출 및 정량을 가능하게 한다. 비-특이적으로 결합된 샘플 물질을 제거하기 위한 엄격한 세척 후, 마이크로어레이는 공초점 현미경 또는 다른 적합한 검출 방법에 의해 스캔된다. 종종 DNA 칩으로 알려진 현대의 상업적 DNA 마이크로어레이는 전형적으로 수 만개의 프로브를 함유하고, 따라서 수만개의 유전자의 발현을 동시에 측정할 수 있다. 이러한 마이크로어레이는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 별법으로, PGS의 유전자의 발현을 측정하는데 필요한 만큼 적은 수의 프로브를 함유하는 맞춤 칩, 및 예를 들면 데이터 일반화를 위해 필요한 제어 또는 기준은 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있다.
데이터 일반화를 용이하게 하기 위해, 2색 마이크로어레이 판독기가 사용될 수 있다. 2색 (2개 채널) 시스템에서, 샘플은 제1 파장에서 방출하는 제1 형광단으로 표지되며, RNA 또는 cDNA 기준은 상이한 파장에서 방출하는 제2 형광단으로 표지된다. 예를 들면, Cy3 (570 nm) 및 Cy5 (670 nm)는 종종 2색 마이크로어레이 시스템에서 함께 사용된다.
DNA 마이크로어레이 기술은 잘 발달되었고, 시판되며, 널리 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 당업자는 PGS내의 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 과도한 실험 없이 마이크로어레이 기술을 사용할 수 있다. DNA 마이크로어레이 칩, 시약 (예를 들면, RNA 또는 cDNA 제조, RNA 또는 cDNA 표지를 위한 시약, 혼성화 및 세척 용액), 기구 (예를 들면, 마이크로어레이 판독기) 및 프로토콜은 당업계에 공지되어 있고, 다양한 상업적 공급원으로부터 구할 수 있다. 마이크로어레이 시스템의 판매자는 아질런트 테크놀로지즈 (Agilent Technologies) (산타 클라라, 캘리포니아 (Santa Clara, CA)) 및 아피메트릭스 (Affymetrix) (산타 클라라, 캘리포니아)를 포함하지만, 다른 PCR 시스템이 사용될 수 있다.
정량적 RT - PCR
PGS내의 개별 유전자를 나타내는 mRNA의 수준은 통상의 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 기술을 사용하여 결정 (예를 들면, 측정)될 수 있다. qRT-PCR의 이점은 민감성, 유연도, 정량적 정확도 및 밀접하게 연관된 mRNA 사이를 구별하는 능력을 포함한다. 정량적 PCR을 위한 조직 샘플의 공정에 대한 안내는 qRT-PCR에 대한 상품의 제조자 및 판매자 (예를 들면, 퀴아젠 (Qiagen) (발렌시아, 캘리포니아 (Valencia, CA)) 및 암비온 (Ambion) (오스틴, 텍사스 (Austin, TX)))를 포함하는 다양한 공급원으로부터 구할 수 있다. qRT-PCR의 자동화된 수행을 위한 기구 시스템은 시판되며, 여러 실험실에서 일상적으로 사용된다. 잘 알려진 상업적 시스템의 예는 어플라이드 바이오시스템즈 7900HT 패스트 리얼-타임 PCR 시스템 (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System) (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 포스터 시티, 캘리포니아 (Foster City, CA))이다.
단리된 mRNA를 수득한 후, RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링의 제1 단계는 cDNA로의 mRNA 주형의 역전사이고, 이는 이어서 PCR 반응에서 기하급수적으로 증폭된다. 2개의 일반적으로 사용되는 역전사효소는 아빌로 (avilo) 골수아세포증 바이러스 역전사효소 (AMV-RT) 및 몰로니 (Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)이다. 역전사 반응은 전형적으로 특정 프라이머, 임의의 육량체 또는 올리고(dT) 프라이머로 프라임 (prime)된다. 적합한 프라이머는 시판되며, 예를 들면, 진앰프 (GeneAmp)(등록상표) RNA PCR 키트 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer), 월텀, 매사츄세스 (Waltham, MA))가 있다. 생성된 cDNA 생성물은 후속적인 중합효소 연쇄 반응에서 주형으로서 사용될 수 있다.
PCR 단계는 열안정 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행된다. PCR 시스템에서 가장 일반적으로 사용되는 폴리머라제는 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) (Taq) 폴리머라제이다. PCR의 선택성은 증폭을 위해 표적된 DNA 영역, 즉, PGS의 유전자로부터 역전사된 cDNA의 영역에 상보적인 프라이머의 사용으로부터 야기된다. 따라서, qRT-PCR이 본 발명에서 사용된 경우, PGS내의 각각의 유전자에 대해 특이적인 프라이머는 유전자의 cDNA 서열을 기반으로 한다. 상업적 기술, 예를 들면 SYBR(등록상표) 그린 또는 타크맨(등록상표) (어플라이드 바이오시스템즈, 포스터 시티, 캘리포니아)은 판매자의 설명서에 따라 사용될 수 있다. 전령 RNA 수준은 하우스키핑 (housekeeping) 유전자, 예를 들면 베타-액틴 또는 GAPDH의 수준을 비교함으로써 샘플 사이의 로딩의 차이에 대해 일반화될 수 있다. mRNA 발현의 수준은 임의의 단일 대조군 샘플, 예를 들면 정상, 비-종양 조직 또는 세포로부터의 mRNA에 비교하여 표현될 수 있다. 별법으로, 그는 종양 샘플 또는 종양 세포주로부터의 mRNA, 또는 시판되는 대조군 mRNA의 세트로부터의 mRNA에 비교하여 표현될 수 있다.
PGS내의 유전자의 발현 수준의 PCR 분석을 위한 적합한 프라이머 세트는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 설계 및 합성될 수 있다. 별법으로, 본 발명을 실행하기 위한 완전한 PCR 프라이머 세트는 상기 표 1에 제시된 PGS내의 유전자의 신분을 기반으로 하여, 상업적 공급원, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템즈로부터 구입될 수 있다. PCR 프라이머는 바람직하게는 약 17 내지 25개 뉴클레오티드의 길이이다. 프라이머는 Tm 추정을 위한 통상의 알고리즘을 사용하여 특정 융해 온도 (Tm)를 갖도록 설계될 수 있다. 프라이머 설계 및 Tm 추정을 위한 소프트웨어는 예를 들면, 프라이머 익스프레스 (Primer Express)(상표명) (어플라이드 바이오시스템즈)로부터 시판되며, 또한 예를 들면, 프라이머3 (매사츄세스 공과 대학교)으로부터 인터넷 상에서 구할 수 있다. PCR 프라이머 설계의 확립된 원리를 적용함으로써, 수많은 상이한 프라이머는 임의의 주어진 유전자의 발현 수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 PGS내의 임의의 주어진 유전자에 대해 사용된 특정 프라이머에 대해 제한되지 않는다.
PGS 점수의 해석
PGS 점수는 한계점 PGS 점수에 대해 해석된다. 본 발명에서, 한계점 PGS 점수보다 높은 PGS 점수는 티보자닙 치료에 대해 비-반응성 (내성)일 확률이 높은 종양을 나타내는 것으로 해석될 것이다. 한계점 PGS 점수보다 낮은 PGS 점수는 티보자닙 치료에 대해 반응성 (민감성)일 확률이 높은 종양을 나타내는 것으로 해석될 것이다. 주어진 한계점 PGS 점수가 종양 유형에 따라 달라질 것이라는 것이 예상된다. 본 발명의 내용상, 용어 "종양 유형"은 (a) 종 (마우스 또는 인간); 및 (b) 기관 또는 조직의 기원을 고려한다. 임의로, 종양 유형은 추가로 유전자 발현 특징, 예를 들면 HER2-양성 유방 종양, 또는 특정 EGFR 돌연변이를 발현하는 비-소세포 폐 종양을 기반으로 하는 종양 분류화를 고려한다.
임의의 주어진 종양 유형에 대해, 최적 한계점 PGS 점수는 한계점 결정 분석을 수행함으로써 실증적으로 결정 (또는 적어도 근사계산)될 수 있다. 바람직하게는, 한계점 결정 분석은 수용자 오퍼레이터 특성 (ROC) 곡선 분석을 포함한다.
ROC 곡선 분석은 확립된 통계학적 기술이며, 그의 적용은 당업계의 통상적인 기술 내에 있다. ROC 곡선 분석의 논의에 대해, 일반적으로 문헌 [Zweig et al., 1993, "Receiver operator characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine," Clin. Chem. 39:561-577]; 및 문헌 [Pepe, 2003, The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction, Oxford Press, New York]을 참조한다.
PGS 점수 및 최적 한계점 PGS 점수는 종양 유형에 따라 다를 수 있다. 따라서, 한계점 결정 분석 바람직하게는 본 발명을 사용하여 시험되는 임의의 주어진 종양 유형을 나타내는 하나 이상의 데이터 세트 상에서 수행된다. 한계점 결정 분석을 위해 사용된 데이터 세트는 (a) 실제 반응 데이터 (반응 또는 비-반응), 및 (b) 인간 종양 또는 마우스 종양의 군으로부터의 각각의 종양 샘플에 대한 PGS 점수를 포함한다. 주어진 종양 유형에 대해 PGS 점수 한계점이 결정된 후, 그 한계점은 그 종양 유형의 종양으로부터 PGS 점수를 해석하는데 적용될 수 있다.
ROC 곡선 분석은 본질적으로 다음과 같이 수행된다. 한계점보다 높은 PGS 점수를 갖는 임의의 샘플은 비-반응자로서 식별된다. 한계점 이하의 PGS 점수를 갖는 임의의 샘플은 반응자로서 식별된다. 시험된 샘플의 세트로부터의 각각의 PGS 점수에 대해, "반응자" 및 "비-반응자" (가상적인 콜 (call))는 그 PGS 점수를 한계점으로서 사용하여 분류된다. 이 방법은 가상적인 콜 대 데이터 세트에 대한 실제 반응 데이터의 비교를 통해 각각의 잠재적 한계점에 대한 TPR (y 벡터) 및 FPR (x 벡터)의 계산을 가능하게 한다. 이어서 ROC 곡선은 TPR 벡터 및 FPR 벡터를 사용하여 점 도표를 그림으로써 구축된다. ROC 곡선이 (0, 0) 점에서 (1.0, 0.5) 점까지 대각선 위에 있는 경우, 이는 PGS 시험 결과는 임의의 시험보다 더 나은 시험이라는 것을 나타낸다 (예를 들면, 도 2 참조).
ROC 곡선은 최적의 작동 점을 확인하는데 사용될 수 있다. 최적의 작동 점은 위양성의 손실을 위음성의 손실과 비교 검토한 사이에서 최적의 균형을 산출하는 점이다. 이들 손실은 동일할 필요는 없다. ROC 공간에서의 점 x,y에서의 분류의 평균 예상된 손실은 다음 식에 의해 나타낸다:
C = (1-p)알파*x + p*베타(1-y)
상기 식에서,
알파 = 위양성의 손실,
베타 = 양성을 놓친 것에 대한 손실 (위음성), 및
p = 양성 경우의 비율이다.
위양성 및 위음성은 알파 및 베타에 대해 상이한 값을 부여함으로써 상이하게 가중치가 부과될 수 있다. 예를 들면, 더 많은 비-반응자인 환자를 치료하는 것을 감수하고 반응자 군의 환자를 더 많이 포함시키는 것으로 결정된 경우, 알파에 대해 가중치를 더 둘 수 있다. 이 경우, 위양성 및 위음성의 손실은 동일한 것으로 추정된다 (알파는 베타와 동일함). 따라서, ROC 공간에서의 점 x,y에서의 분류의 평균 예상된 손실은 다음과 같다:
C' = (1-p)*x + p*(1-y).
가장 작은 C'은 위양성 및 위음성 (x, y)의 모든 쌍의 사용 후 계산될 수 있다. 최적 PGS 점수 한계점은 C'에서의 (x, y)의 PGS 점수로서 계산된다. 예를 들면, 실시예 4에 나타난 바와 같이, 이 접근법을 사용하여 결정된 바와 같이 최적 PGS 점수 한계점은 0.33인 것으로 나타났다.
종양이 티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 내성일 여부를 예상하는 것에 추가로, PGS 점수는 종양이 반응성 또는 비-반응성일 가능성에 대한 근사치이지만, 유용한 징후를 제공한다. 일반적으로, PGS 점수가 낮을수록 종양이 티보자닙에 대해 반응성일 가능성이 있고, PGS 점수가 높을수록 종양이 티보자닙에 대해 내성일 가능성이 있다.
시험 키트
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 특정 성분을 포함하는 진단 시험 키트를 포함한다. 진단 시험 키트는 진단 검정의 수행에서 편리성, 속도 및 재현성을 향상시킨다.
예를 들면, 본 발명의 예시적인 qRT-PCR-기반 실시양태에서, 염기성 진단 시험 키트는 본 발명에 따른 PGS의 모든 구성원에 대한 PCR 프라이머 (예를 들면, 프라이머의 쌍)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험 키트는 대조군 또는 기준에 대한 PCR 프라이머를, 예를 들면 데이터 일반화를 위해 임의로 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 더 정교한 시험 키트는 PCR 프라이머 만이 아니고, 또한 PCR 기술을 사용하여 PGS의 구성원의 발현 수준을 측정하기 위한 완충액, 시약 및 상세한 설명서를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 키트는 시험 프로토콜 및 RNA 샘플(들)을 제외한 시험을 위해 필요한 모든 소모성 성분을 포함한다.
본 발명의 예시적인 DNA 마이크로어레이-기반 실시양태에서, 시험 키트는 특정 기구와 함께 사용되기 위해 설계된 마이크로 유체 카드 (어레이)를 포함한다. 임의로, 마이크로 유체 카드는 상기 표 1에 제시된 PGS의 발현의 동시 측정을 위해 구체적으로 설계된 맞춤 장치이다. 상기 맞춤 마이크로 유체 카드는 시판된다. 예를 들면, 태크맨 어레이 (TaqMan Array)는 어플라이드 바이오시스템즈 7900HT 패스트 리얼 타임 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈, 포스터 시티, 캘리포니아)과 함께 사용되기 위해 설계된 384-웰 마이크로 유체 카드 (어레이)이다. 본 발명의 일부 실시양태는 표 1에 제시된 PGS의 모든 또는 본질적으로 모든 구성원의 발현을 측정하기 위한 맞춤 DNA 마이크로어레이 칩에 관여한다. 상기 맞춤 DNA 마이크로어레이 칩은 시판된다.
추가의 프로브는 PGS의 일부가 아닌 추가의 유전자의 발현을 측정하기 위해 유체 카드 상에 임의로 포함될 수 있거나, 또는 상기 추가의 유전자에 대한 프라이머는 본원에 기재된 바와 같은 프라이머 세트의 일부로서 임의로 포함될 수 있다는 것이 이해된다. 상기 추가의 유전자는 대조군 또는 기준으로서의 역할을 하기 위해, 예를 들면 데이터 일반화를 위해 포함될 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 유용한 정보를 제공할 수 있다. 상기 추가의 유전자는 티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성일 가능성이 있는 인간 종양을 확인하기 위해 본원의 표 1에 제시된 PGS의 예측 값을 변경하지 않는다는 것이 이해된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다. 실시예는 설명적 목적만을 위해 제공되며, 본 발명의 범위 또는 내용을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 티보자닙에 대한 뮤린 종양 반응
100개 초과의 뮤린 유방 종양 (BH 보관소)의 집단을 티보자닙에 대해 민감성인 종양 (반응자) 및 티보자닙에 대해 내성인 종양 (비-반응자)을 확인하기 위해 사용하였다. BH 보관소는 Her2-의존적, 유도가능한 자발적 유방 종양이 발생하는 유전자조작된 키메라 마우스로부터 유도된 100개 초과의 자발적 뮤린 유방 종양으로부터 1급 종양 물질의 생체내 증식 및 냉동보존에 의해 확립되었다. 마우스는 본질적으로 다음과 같이 생성되었다.
Ink4a 동형접합성 무표지 ES 세포를 다음 4개의 구축물로, 분리된 단편: MMTV-rtTA, TetO-Her2V664Eneu, TetO-루시페라제 및 PGK-푸로마이신으로서 동시-형질감염시켰다. 푸로마이신-내성 세포를 PCR 및 써던 블럿에 의해 염기서열 분석하였다. ES 세포에서의 종양유전자의 유도성을 노던 블럿에 의해 분석하였다. 형질감염된 ES 세포를 C57BL/6 주머니배에 주사하고, 이를 가상-임신한 암컷 마우스에 임신을 위해 이식하여 키메라 마우스의 출생을 야기하였다.
역 테트라사이클린 전사활성화제 (rtTA)의 유방-특이적인 발현을 유도하기 위해 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복 (MMTV)을 사용하였다. rtTA는 독시사이클린이 마우스에게 그들의 식수에 제공된 경우, Her2 활성화된 종양유전자의 유방-특이적인 발현을 가능하게 하였다.
Her2 종양유전자 및 루시페라제의 유도성을 마우스로부터 유도된 배양된 세포를 사용하는 RT-PCR 및 루시페라제 검정 각각에 의해 확인하였다. 유선을 키메라 마우스로부터 제거하고 콜라게나제로 소화하였다. 수집된 기관양의 반을 독시사이클린의 존재하에 배양하였고, 다른 반을 독시사이클린 없이 배양하였다. 배양 5일 후 세포를 트립신화하고, 세포의 10분의 1을 루시페라제 검정을 위해 사용하고, 나머지를 RNA 추출을 위해 사용하였다.
HER2 유방암 모델 마우스로부터 수집된 종양의 조직학 분석은 침습 선암종을 나타냈다. 2개의 주요 패턴을 구별하였다. 이들은 괴사 중심이 있는 고체 판 성장 패턴 및 네스티드 (nested) 성장 패턴이었다. 유방 종양의 면역조직화학 분석은 종양 내의 2개의 세포 유형을 밝혔다. 제1 세포 유형은 상피성 기원 (사이토케라틴 양성)이었고, HER2 발현 및 강한 증식을 나타냈다. 제2 세포 유형은 섬유모세포-유사 모습을 갖는 중간엽 기원이었다. 이들 세포는 콜라겐 양성이었고, 강한 증식을 나타내지 않았으며, 간질 기능을 나타냈다. 세포자멸이 종양의 상피성 부분의 괴사 중심에서 나타났다. 종양 퇴행 연구 (독시사이클린의 금단에 대한 반응에서의 퇴행)를 뮤린 모델 종양이 Her2 발현에 의존적이라는 것을 확인하기 위해 수행하였다. 독시사이클린에 의한 테트라사이클린-반응성 프로모터의 유도 후, 마우스에서 약 2 내지 4개월의 잠복기가 있는 유방 종양이 발생하였다.
종양 세포를 세포 스트레이너 (strainer)를 사용한 종양의 물리적 붕괴에 의해 단리하였다. 전형적으로 1x105개 세포를 매트리겔 (matrigel) (50:50 부피)과 혼합하고, 암컷 NCr nu/nu 마우스의 견갑골 사이의 상부 후방 영역에 피하 주사하였다. 이들 종양이 전형적으로 2 내지 4주가 요구되는 대략 500 mm3로 성장한 경우, 이들을 추가의 증식, 약물 반응 시험 및 분석을 위해 수집하였다. 분석은 마이크로어레이 프로파일링, 일반 조직병리학 및 IHC (종양 혈관계에 대해 CD31, 종양 세포 증식에 대해 Ki67)를 포함하였다. 이 종양 집단의 특성화는 혈관신생의 주요 파라미터, 예를 들면 마이크로혈관계, VEGF 발현 및 특정 유전자 발현 프로파일의 주목할 만한 변화의 정도를 나타냈다.
티보자닙에 대한 종양 반응의 평가를 본질적으로 다음과 같이 수행하였다. 피하 이식된 종양을 붕괴 종양 세포 (매트리겔과 혼합함)를 7주 된 암컷 NCr 누드 마우스에 물리적으로 주사함으로써 확립하였다. 종양이 대략 200-400 mm3에 이른 경우, 30마리의 종양이 있는 마우스를 3개의 군으로 무작위화하였다. 군 1은 비히클을 투여받았다. 군 2는 티보자닙을 경구 섭식에 의해 매일 5 mg/kg으로 투여받았다. 군 3은 티보자닙을 경구 섭식에 의해 매일 20 mg/kg으로 투여받았다. 종양을 밀림자에 의해 1주일에 2회 측정하고, 종양 부피를 계산하였다. 치료의 마지막에, 종양을 조직병리학적 분석 및 IHC 분석을 위해 수집하였다.
이들 연구는 티보자닙에 대한 반응에서의 의미있는 종양-대-종양 변화를 나타냈다. 종양 성장 억제 및 혈관신생 억제에 대한 전형적 조직병리학적 및 IHC (CD31) 특징을 기반으로 하여, 반응자 및 비-반응자를 확인하였다. 전형적으로, 반응자는 밀림자 측정에 의해 종양 진행을 나타내지 않았고 (조직학에 의해), 5 mg/kg 티보자닙으로 치료된 경우, 주변부를 제외하고 완전한 종양 사멸에 근접했다. 마우스 모델 종양은 자발적으로 발생하였고, 따라서 이들은 종양 혈관신생을 포함하는 종양형성으로 이어진 상이한 세트의 임의의 돌연변이를 함유하는 것이 예상되었기 때문에 반응에서의 변화는 예상되었다. 반응에서의 상기 변화는 자연적으로 발생하는 인간 종양에서의 변화와 유사하였고, 따라서 분자 서명 (signature) 또는 티보자닙 반응성을 확인하는데 사용하기 위한 티보자닙-반응성 종양 및 티보자닙-내성 종양의 확인을 가능하게 했기 때문에 바람직하였다.
실시예 2: 상이하게 발현된 유전자의 확인
BH 보관소에서의 각각의 종양으로부터의 전령 RNA (대략 6 μg)는 증폭 프로토콜에 적용되었고, 맞춤 아질런트 마이크로어레이 (아질런트 마우스 40K 칩)를 사용하여 혼성화되었다. 마우스 종양 샘플 대 대조군 샘플의 유전자 발현 프로파일의 비교 (스트라타진 (Stratagene)으로부터의 보편적인 마우스 참조 RNA, 목록 번호 740100-41)를 통상의, 시판되는 마이크로어레이 기술을 사용하여 수행하였다. 시판되는 특징 추출 소프트웨어 (아질런트 테크놀로지즈, 산타 클라라, 캘리포니아)를 특징 추출 및 데이터 일반화를 위해 사용하였다.
BH 보관소로부터의 5개의 반응자 종양을 BH 종양 보관소로부터의 6개의 비-반응자 종양과 비교한 경우, 상이하게 발현된 유전자를 확인하였다. 통상의 마이크로어레이 기술을 각각의 11개 종양을 대표하는 샘플에서의 대략 40,000개 유전자의 발현을 측정하기 위해 사용하였다. 이를 모두 아질런트 테크놀로지즈 (산타 클라라, 캘리포니아)로부터의 맞춤 마우스 40K 칩 및 특징 추출 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 각각의 유전자의 평균 발현 (반응자 대 비-반응자)의 차이의 통계학적 의미를 스튜던트 (Student's) t 시험을 통해 평가하였다. 발현 수준에서의 가장 큰 차이를 나타내는 280개 유전자 (가장 작은 p 값)를 확인하고, 특정 신호전달 경로와 연관지었다. 이를 시판되는 소프트웨어 (인제뉴이티 패스웨이 아날러시즈 툴 (Ingenuity Pathway Analysis Tool), 인제뉴이티 시스템즈 인크. (Ingenuity Systems Inc.), 레드우드 시티, 캘리포니아 (Redwood City, CA))를 사용하여 수행하였다. 다음 5개 경로를 대표하는 유전자 발현의 통계적으로 의미있는 증가를 관찰하였다: (1) 세포내 경로를 통한 바이러스 침입, (2) 림프독소 β 수용체 신호전달 경로, (3) 거대 음작용 경로, (4) 케모카인 신호전달 경로, 및 (5) 뉴론에서의 릴린 (Reelin) 신호전달 경로. 이들 5개 상향조절된 경로 중 3개는 면역 반응 및 사이토킨 경로에 관여한다. 따라서, 이들 경로는 인간 종양 샘플에서의 PGS를 확인하기 위한 후속적 생물정보학 분석의 초점이었다.
실시예 3: PGS 의 확인
뮤린 마이크로어레이 데이터 (상기)의 경로 분석을 고려하여, 우리는 유전자 발현 프로파일링 데이터 세트에 관여하는 상관관계 분석을 위해 16개 조혈 마커 유전자 (CCL2, CCL7, CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR6, CSF1R, CSF2RA, CSF2RB, CXCR4, IL3RA, IL8RA, IL8RB 및 KIT)를 선택하였다. 다시 말하면, 각각의 16개 조혈 마커 유전자는 상관관계 분석, 즉 발현 수준의 상관관계를 위해 참조 유전자로서 별도로 사용되었다.
이 정보를 이어서 티보자닙에 대한 종양 반응성에 대해 예측적인 유전자의 세트를 확인하기 위한 유전자 발현 프로파일링 데이터 세트를 조사하기 위해 사용하였다. 우리는 비록 상관관계 참조 유전자로서의 조혈 마커 유전자의 선택으로 이어진 경로 분석이 뮤린 데이터로 수행되었지만, 인간 유전자 발현 프로파일링 데이터 세트를 사용하기로 결정하였다. 이에 대한 이유는: (1) 상관된 발현은 생물학적 기능을 반영할 가능성이 있으며, 이는 마우스 및 인간에서 비슷하고; (2) 목표는 인간 바이오마커를 확인하는 것이었다. 7개 상이한 인간 종양에 관련된 7개 인간 유전자 발현 프로파일링 데이터 세트를 상관관계 분석을 위해 이용할 수 있었다 (표 2).
Figure pct00006
각각의 조혈 마커 유전자 (참조 유전자)에 대해, 7개 인간 데이터 세트에 제시된 각각의 종양에 대해 질문된 각각의 대략 30,000개 유전자에 대한 상관관계 계수를 계산하였다 (30K 유전자 x 985개 종양 x 16개 조혈 마커 유전자 = 대략 472,800,000개 상관관계 계수). 주어진 참조 유전자에 대해, 7개 데이터 세트에 걸쳐 등급이 매겨진 가장 높은 상관관계 계수를 갖는 대략 200개 유전자는 일관되게 발현된 유전자로서 확인되었다. 유전자의 세트가 주어진 참조 유전자와 상관되는 경우, 이들은 반드시 서로와 상관된다는 것이 이유이다. 더 확실하고 종합적인 분석을 하기 위해, 16개 상이한 참조 유전자 (즉, CCL2, CCL7, CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR6, CSF1R, CSF2RA, CSF2RB, CXCR4, IL3RA, IL8RA, IL8RB 및 KIT)에 대한 상관관계를 계산하였다.
이 분석은 7개 인간 데이터 세트에 걸친 발현의 공-상관관계는 16개 조혈 마커 (참조) 유전자 중 8개에 대해 특히 높았다는 것을 나타냈다. 따라서, 추가의 분석은 상기 8개 조혈 마커 유전자, 즉 CCL2, CCR1, CCR2, CCR5, CSF1R, CSF2RA, CSF2RB 및 CSF3R에 제한되었다. 이들 8개의 200개-유전자 목록 (각각의 8개 마커 유전자에 대한 1개의 200개-유전자 목록)을 비교하여, 이들 8개의 200개-유전자 목록은 42개 유전자를 공통으로 갖는 것으로 나타났다. 이 42개 유전자의 세트는 티보자닙에 대한 인간 종양 반응에 대한 후보 PGS로서 확인되었다. PGS 점수 (42개 유전자의 평균 발현 값)를 알고리즘
Figure pct00007
에 따라 계산하였다.
상기 알고리즘에서, E1, E2, ..., E42는 1개의 샘플에 대한 42개 유전자의 발현 값이다.
다시 말하면, 주어진 샘플의 PGS 점수는 샘플에서의 이들 42개 유전자의 평균 발현 값이다.
실시예 4: 뮤린 반응의 예측
본 발명의 예측 능력을 영향력이 큰 종양유전자가 Her2인 1급 마우스 종양의 소유 보관소로부터의 25개 종양을 사용하여 시험하였다. 각각의 25개 종양에 대한 PGS 점수를 마이크로어레이 데이터로부터 계산하였다. 각각의 25개 종양을 티보자닙으로 치료하고, 이어서 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 약물 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성으로서 분류하였다. 최적 한계점 PGS 점수는 ROC 곡선 분석을 사용한 한계점 결정 분석에서 0.33으로 실증적으로 결정되었다.
이 한계점을 적용하여, 시험은 25개 중 22개 종양에 대해 반응 또는 비-반응에 대한 맞는 예측을 산출하였다 (도 2). 비-반응의 예측에 있어서, 위양성율은 18.2% (11 중 2)이었고, 위위음성율은 5.88% (17 중 1)이었다.
실시예 5: 인간 반응의 예측
다음 예언적 실시예는 타크맨(등록상표) 데이터를 사용하여 티보자닙에 대한 인간 반응을 예측하기 위한 본 발명의 사용 방법에 대해 상세하게 설명한다.
주어진 종양 유형 (예를 들면, 신장 세포 암종)에 대해, 종양 샘플 (보관소의 FFPE 블록, 신선한 샘플 또는 냉동된 샘플)을 티보자닙으로의 환자의 치료 전에 인간 환자 (병원 또는 임상 실험실을 통해 간접적으로)로부터 수득하였다. 신선하거나 또는 냉동된 종양 샘플을 표준 조직학 절차에 따라 파라핀 중에 알콜 탈수 및 묻기 전에 10% 중성-완충된 포르말린 중에 5-10시간 동안 놓아두었다.
RNA를 10 μm FFPE 절편으로부터 추출하였다. 파라핀을 크실렌 추출에 이어서 에탄올 세척에 의해 제거하였다. RNA를 상업적 RNA 제조 키트를 사용하여 단리하였다. RNA를 적합한 상업적 키트, 예를 들면 리보그린 (RiboGreen)(등록상표) 형광 방법 (몰레큘러 프로브 (Molecular Probe), 유진, 오레간 (Eugene, OR))을 사용하여 정량하였다. RNA 크기를 통상의 방법에 의해 분석하였다.
역전사를 qRT-PCR을 위한 슈퍼스크립트 (SuperScript)(상표명) 제1-가닥 합성 키트 (First-Strand Synthesis Kit) (인비트로젠 (Invitrogen))를 사용하여 수행하였다. 총 RNA 및 모인 유전자-특이적인 프라이머는 10-50 ng/μl 및 100 nM (각각)으로 각각 존재한다.
PGS내의 각각의 유전자에 대해, qRT-PCR 프라이머를 적합한 상업적 소프트웨어, 예를 들면 프라이머 익스프레스 (Primer Express)(등록상표) 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈, 포스터 시티, 캘리포니아)를 사용하여 설계하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 기구 제조자 또는 판매자에 의해 권장된 상업적 합성 기구 및 적절한 시약을 사용하여 합성하였다. 프로브를 적합한 상업적 표지 키트를 사용하여 표지하였다.
타크맨(등록상표) 반응을 제조자의 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템즈 7900HT 기구를 사용하여 384-웰 플레이트에서 수행하였다. PGS내의 각각의 유전자의 발현을 반응 웰 당 총 RNA의 1 ng으로부터 합성된 cDNA를 사용하여 2벌 5 μl 반응에서 측정하였다. 최종 프라이머 및 프로브 농도는 각각 0.9 μM (각각의 프라이머) 및 0.2 μM이었다. PCR 주기를 표준 작동 절차에 따라 수행하였다. qRT-PCR 신호가 오염된 DNA가 아닌 RNA로 인한 것임을 확인하기 위해, 시험된 각각의 유전자에 대해 아무런 RT 대조군도 평형으로 수행하지 않았다. qRT-PCR 중의 주어진 증폭 곡선에 대한 한계점 주기는 프로브 절단으로부터의 형광 신호가 지정된 형광 한계점 설정을 넘어서 성장하는 시점에서 발생한다. 더 큰 초기 주형을 갖는 시험 샘플은 더 이른 증폭 주기에서의 한계점 값을 초과한다.
모든 샘플에 걸쳐 유전자 발현 수준을 비교하기 위해, 각각의 검정 웰에서의 RNA 질 및 RNA의 총 양의 변화로부터 발생하는 차이를 정정하기 위해 5개 참조 유전자 (발현 수준이 모든 샘플에 걸쳐 유사한 것으로 추정되는 하우스키핑 유전자)를 기반으로 한 일반화를 사용하였다. 각각의 샘플에 대한 참조 CT (한계점 주기)는 참조 유전자의 측정된 평균 CT로서 정의된다. 시험 유전자의 일반화된 mRNA 수준은 ΔCT+10으로서 정의되며, 여기서 ΔCT = 참조 유전자 CT에서 시험 유전자 CT를 뺀 것이다.
각각의 종양 샘플에 대한 PGS 점수를 상기 제시된 알고리즘에 따라 유전자 발현 수준으로부터 계산하였다. 시험된 종양 샘플과 연관된 실제 반응 데이터는 종양 샘플을 공급하는 병원 또는 임상 실험실로부터 수득하였다. 임상적 반응은 적합한 영상 기술, 예를 들면 CT 촬영에 의해 결정되는 바와 같이 전형적으로 종양 수축, 예를 들면 30% 수축에 대해 정의된다. 일부 경우에, 인간 임상적 반응은 시간, 예를 들면 진행 부재 생존 시간에 대해 정의된다. 주어진 종양 유형에 대한 최적 한계점 PGS 점수는 상기 기재된 바와 같이 계산하였다. 이어서, 이 최적 한계점 PGS 점수를 동일 종양 유형의 신규하게-시험된 인간 종양이 티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성일 여부를 예측하기 위해 사용하였다.
참조로 포함
본원에 인용된 각각의 특허 문서 및 과학 논문의 전체 개시는 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가
본 발명은 그의 본질적인 특징으로부터 벗어나 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 상기 실시양태는 따라서 본원에 개시된 본 발명을 제한하기보다는 설명적이라고 여겨져야 한다. 본 발명의 범위는 상기 설명보다는 첨부된 청구항에 의해 나타나며, 청구항의 등가성의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화는 그에 포함되는 것으로 의도된다. 추가로, 용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"을 포함하는 것으로 의도된다.

Claims (11)

  1. (a) 인간 종양으로부터의 샘플에서,
    Figure pct00008
    를 포함하는 예측 유전자 세트 (PGS)내의 각각의 유전자의 상대적 발현 수준을 결정하는 단계; 및
    (b) 알고리즘
    Figure pct00009
    에 따라 PGS 점수를 계산하는 단계
    를 포함하는, 인간 종양이 티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성일 가능성에 대한 확인 방법.
    상기 알고리즘에서, E1, E2, ... E42는 PGS내의 42개 유전자의 발현 값이고,
    정의된 한계점 (threshold) 미만의 PGS 점수는 종양이 티보자닙에 대해 반응성일 가능성이 있음을 나타내고, 정의된 한계점 초과의 PGS 점수는 종양이 티보자닙에 대해 내성일 가능성이 있음을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, PGS가 다음 유전자로 이루어지는 것인 방법.
    Figure pct00010
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 수용자 오퍼레이터 특성 곡선 (receiver operator characteristic curve) 분석을 포함하는 한계점 결정 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하여, 정의된 한계점을 생성하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PGS내의 각각의 유전자의 상대적 발현 수준이 DNA 마이크로어레이 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PGS내의 각각의 유전자의 상대적 발현 수준이 qRT-PCR 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항의 PGS내의 유전자의 발현 수준을 결정하는데 사용되는 프라이머 쌍을 포함하는 PCR 프라이머 세트.
  7. 제1항 또는 제2항의 PGS의 유전자의 상대적 발현을 결정하기 위한 프라이머의 쌍을 포함하며, 인간 종양이 티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성일 가능성을 확인하기 위한 PCR 프라이머 세트.
  8. 제7항의 PCR 프라이머 세트를 포함하는 진단 시험 키트.
  9. 제1항 또는 제2항의 PGS내의 유전자의 발현 수준을 결정하는데 사용되는 프로브 세트를 포함하는 DNA 마이크로어레이 칩.
  10. 고체 표면, 및 제1항 또는 제2항의 PGS의 유전자 각각에 대해 특이적인 프로브를 포함하는 프로브 세트를 포함하며, 인간 종양이 티보자닙으로의 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성일 가능성을 확인하기 위한 DNA 마이크로어레이 칩.
  11. 제10항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 진단 시험 키트.
KR1020127003031A 2009-07-06 2009-10-19 티보자닙 반응 예측 KR20120034778A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/498,183 US7615353B1 (en) 2009-07-06 2009-07-06 Tivozanib response prediction
US12/498,183 2009-07-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120034778A true KR20120034778A (ko) 2012-04-12

Family

ID=41261508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127003031A KR20120034778A (ko) 2009-07-06 2009-10-19 티보자닙 반응 예측

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7615353B1 (ko)
EP (1) EP2451967A4 (ko)
JP (1) JP2012531925A (ko)
KR (1) KR20120034778A (ko)
CN (1) CN102471799B (ko)
AU (1) AU2009349657A1 (ko)
CA (1) CA2767246A1 (ko)
WO (1) WO2011005273A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2838086A1 (en) * 2011-06-02 2012-12-06 Almac Diagnostics Limited Molecular diagnostic test for cancer
JP2015503330A (ja) * 2011-12-22 2015-02-02 アベオ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 多重遺伝子バイオマーカーの同定
WO2014087156A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Almac Diagnostics Limited Molecular diagnostic test for cancer
WO2014089055A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Tivozanib response prediction
GB201409479D0 (en) * 2014-05-28 2014-07-09 Almac Diagnostics Ltd Molecular diagnostic test for cancer
CN105506107A (zh) * 2015-12-30 2016-04-20 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测dock2基因多态热点突变情况的引物和方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070134261A1 (en) * 2001-12-03 2007-06-14 Hancock Robert E Effectors of innate immunity
AU2003274970A1 (en) * 2002-09-10 2004-04-30 Guennadi V. Glinskii Gene segregation and biological sample classification methods
US20050260652A1 (en) * 2004-04-15 2005-11-24 The General Hospital Corporation Compositions and methods that modulate RNA interference
WO2006135886A2 (en) * 2005-06-13 2006-12-21 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20090005268A1 (en) * 2005-07-18 2009-01-01 Epigenomics Ag Compositions and Methods for Cancer Diagnostics Comprising Pan-Cancer Markers
US8067189B2 (en) 2005-09-01 2011-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining sensitivity to vascular endothelial growth factor receptor-2 modulators by measuring the level of collagen type IV
EP2050335A1 (en) * 2006-02-17 2009-04-22 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
ZA200807590B (en) 2006-03-29 2009-11-25 Genentech Inc Diagnostics and treatments for tumors
AU2007284724B2 (en) * 2006-08-10 2014-03-13 Millennium Pharmaceuticals, Inc. For the identification, assessment, and treatment of patients with cancer therapy
EP1961825A1 (en) * 2007-02-26 2008-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Method for predicting the occurrence of metastasis in breast cancer patients
US20100234381A1 (en) 2007-04-13 2010-09-16 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to vascular endothelial growth factor receptor-2 modulators

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012531925A (ja) 2012-12-13
CN102471799A (zh) 2012-05-23
EP2451967A4 (en) 2012-11-28
EP2451967A1 (en) 2012-05-16
CA2767246A1 (en) 2011-01-13
WO2011005273A1 (en) 2011-01-13
CN102471799B (zh) 2014-03-26
AU2009349657A1 (en) 2012-02-02
US7615353B1 (en) 2009-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5486720B2 (ja) 結腸直腸癌の予後のための遺伝子発現マーカー
RU2654587C2 (ru) Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении
JP6351112B2 (ja) 前立腺癌の予後を定量化するための遺伝子発現プロフィールアルゴリズムおよび試験
KR101982763B1 (ko) 증식 표지 및 위장관 암에 대한 예후
JP6404304B2 (ja) メラノーマ癌の予後予測
US7736861B1 (en) Tivozanib response prediction
KR20140105836A (ko) 다유전자 바이오마커의 확인
JP6603474B2 (ja) 癌治療
KR20120034778A (ko) 티보자닙 반응 예측
KR102376220B1 (ko) 전립선암에서 후기 임상적 종점을 평가하기 위한 알고리즘 및 방법
WO2014089055A1 (en) Tivozanib response prediction
JP2020515264A (ja) 早期膵がんを診断するための方法およびキット

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid