CN108872579A - 用于在受试者中诊断胰腺癌的工具和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断方法领域。具体地，本发明考虑用于在受试者中诊断胰腺癌的方法，用于鉴定受试者是否需要胰腺癌疗法的方法或用于测定胰腺癌疗法是否成功的方法。本发明也涉及用于实施上述方法的工具，例如诊断设备。

Description

用于在受试者中诊断胰腺癌的工具和方法
本申请为2011年5月26日提交的、发明名称为“用于在受试者中诊断胰腺癌的工具和方法”的中国专利申请CN201610096699.5的分案申请。
本发明涉及诊断方法领域。具体地，本发明考虑用于在受试者中诊断胰腺癌的方法，用于鉴定受试者是否需要胰腺癌疗法的方法或用于测定胰腺癌疗法是否成功的方法。本发明也涉及用于实施上述方法的工具，例如诊断设备。
胰腺癌在所有实体瘤中具有最差的预后，具有低于5％的5年存活率但增加的发病率(Everhart 2009,Gastroenterology 136:1134–11449)。普遍认为需要建立创新的工具和技术用于即时(point-of-care)利用特异性生物标志物和新型分子成像工具用于早期诊断、预后分层和胰腺癌的鉴别诊断。在这些领域中的进步对提高此恶性肿瘤的预后是关键的，因为及时手术切除早期肿瘤是目前治疗此可怕疾病的唯一有效的手段。
在欧洲和西方国家，此癌症类型的死亡率是任意癌症类型中最高的。由于缺乏早期检测的手段，人在诊断后不久就死亡。早期症状很少且不典型。因此，PDAC一般在疾病晚期被诊断出。至今检测PDAC的最好的成像技术是内窥镜超声波(EUS)、螺旋式计算机断层摄影(CT)、磁共振胰胆管成像(MRCP)或内镜逆行胰胆管造影(ERCP)(Dewitt 2006,Gastroenterol Hepatol.(4):717-25)。不幸地是，这些技术用于检测胰腺内瘤性病变的分辨率在3-10mm的范围中。因此，它们不能在可治愈的阶段检测出胰腺的瘤形成。在胰腺瘤患者亚群中常规肿瘤标志物例如CA19-9的血清浓度增加(Fry 2008,Langenbecks ArchSurg.(393):883-90)。然而，至今所有可用的标志物缺乏灵敏度和肿瘤特异性。因此，迫切需要新的方法提高对极小的、早期PDAC及其前体病变(PanIN和IPMN)，以及晚期肿瘤预后亚组的检测的诊断灵敏度。
慢性炎症和产生恶性肿瘤之间的联系已发现了多年。对胰腺癌最近才证实了此联系，并且共识大会同意将胰腺上皮内瘤形成新归类为非侵入性前体病变(Hruban 2004,AmJ Surg Path(28):977-987)。慢性胰腺炎被定义为反复发作的无菌炎性疾病，其特征是经常进行性和不可逆的形态学变化，通常导致疼痛和胰腺功能的永久损伤。慢性胰腺炎代表胃肠道疾病的常见病，在每100 000群体中具有8.2的发病率，27.4的患病数，在未经选择的尸检样本中具有0.04％至5％的频率。多种病因导致发展出慢性胰腺炎。在AB Lowenfels及其同事进行的国际合作研究中显示，患有慢性胰腺炎的患者死于胰腺癌的风险增加，所述研究是在1993年从6个国家的临床中心募集的2015位慢性胰腺炎患者的多中心历史组研究。此研究发现在慢性胰腺炎患者中累积的胰腺癌风险，10年后风险为1.8％和20年后风险为4％，具有14.4的标准化发病比。在跟踪最少2年的患者中胰腺癌的风险是一般群体的16.5倍(Lowenfels 1993,N Engl J Med(328):1433-1437)。在1996年发现在7号染色体(7q35)上的阳离子胰蛋白酶原基因的第三外显子中的单个点突变与遗传性胰腺炎相关之后，有关慢性胰腺炎和胰腺癌的联系的研究增多，并随后鉴定和报导了多个类似突变。直到最近，EUROPAC研究组展示了他们在遗传性胰腺炎的临床和遗传特征上的工作。在使用从欧洲遗传性胰腺炎登记表(European Registry of Hereditary Pancreatitis)得到的数据的多水平比例危险模型中，此研究组展示了14个国家中的112个家族(418个患病个体)(Howes 2004,Clinical Gastroenterology and Hepatology(2):252-261)。在症状发作后70年胰腺癌的累积风险(95％CI)是44.0％(8.0％-80.0％)，具有67％(50％-82％)的标准化发病比。以前的研究也显示胰腺癌的估计的终生风险为40％(Lowenfels 2001,JAMA286:169-170,Lowenfels 1997,J Natl Cancer Inst 89:442-44656)。
在胰腺癌中，成像研究不能在可治愈的阶段检测出早期胰腺恶性肿瘤，而在慢性胰腺炎的背景下，成像研究例如EUS,CT或MRI的灵敏度和特异性则降低至和掷硬币同样可靠的程度。因此血清标志物将是在高风险组中检测胰腺恶性肿瘤的不可替代的工具。
患有胰腺相关疾病的患者中的代谢变化的报导很少。Schrader等人(Schrader2009,Panceas 38:416-421)指出，患有胰腺癌和慢性胰腺炎的患者显示了血清氨基酸水平的显著变化。研究指出在神经酰胺中，在癌细胞表面上的鞘磷脂积极参与了细胞信号转导。已知神经酰胺在癌细胞中诱导凋亡。低水平的鞘磷脂表示对吉西他滨(gemcitabine)治疗的较低响应性(Modrak 2009,Mol Cancer Res 7:890-896)。
总之，胰腺癌在所有人肿瘤中具有最差的预后(具有0.5-5％的5年存活率)，并且是全世界癌症相关死亡的第四个主要原因。因此其是具有重要社会经济影响的疾病。早期肿瘤的准确诊断和及时的手术切除是目前改善患者预后的唯一现实的前景。
因此，本发明涉及在受试者中诊断胰腺癌的方法，包括以下步骤：
(a)测定疑为患有胰腺癌的受试者的样品中的来自表2a、2b、3a、3b的至少一种生物标志物的量；和
(b)比较所述至少一种生物标志物的量与参考量，由此诊断胰腺癌。
根据本发明提及的方法包括基本上由上述步骤组成的方法，或包括其他步骤的方法。然而，应理解，在优选的实施方案中，方法为离体进行的方法，即不是在人体或动物体上实施的方法。方法优选地可通过自动化辅助。
本文使用的术语“诊断”指评估受试者是否患有胰腺癌。如本领域技术人员所理解的，这种评估，尽管优选对100％的研究的受试者是正确的，但通常可能并非对100％的研究的受试者是正确的。然而，该术语要求统计学上显著份额的受试者能够被正确评估和因此被诊断。份额是否统计学上显著的能够由本领域技术人员使用各种熟知的统计评价工具(例如置信区间确定、p-值确定、Student氏t检验(Student′s t-test)、曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)等)立即确定。具体内容可见于Dowdy和Wearden，Statistics forResearch，John Wiley&Sons，New York 1983中。优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。p-值优选为0.2、0.1或0.05。
该术语包括胰腺癌或其症状的个体诊断，以及患者的连续监控。监控，即在多个时点诊断存在或不存在胰腺癌及其伴随症状，包括监控已知患有胰腺癌的患者以及监控已知处于患上胰腺癌的风险的受试者。此外，监控也可用于测定患者是否被成功治疗或随时间某疗法是否至少减轻胰腺癌的症状。
本文使用的术语“胰腺癌”(“pancreatic cancer”或“pancreas cancer”)涉及来源于胰腺细胞的癌症。优选地，本文使用的胰腺癌是胰腺腺癌。胰腺癌的伴随症状是医学标准课本例如Stedmen或Pschyrembl中众所周知的。
本文使用的术语“生物标志物”是指作为本说明书提到的疾病或效果的指示物的分子种类。所述分子种类可以是在受试者的样品中发现的代谢产物本身。而且，该生物标志物也可以是衍生自所述代谢产物的分子种类。在这样的情况下，实际的代谢产物将在样品中或在测定过程中被化学修饰，并且作为所述修饰的结果，一种化学上不同的分子种类(即分析物)将是被测定的分子种类。在这种情况下应理解，该分析物代表实际的代谢产物并且具有作为各个病症指示物的相同能力。
而且，根据本发明的生物标志物不必然地对应一种分子种类。而是，该生物标志物可能包含化合物的立体异构体或对映异构体。此外，生物标志物还可以表示同分异构分子的生物种类的异构体的总和。所述异构体在一些情况下将显示相同的分析特征，并且因此不能够通过多种分析方法(包括在下面描述的所附实施例中应用的那些)区分的。然而，这些异构体将共享至少相同的总的式参数，并且因此，例如在脂类的情况下，共享脂肪酸中的相同的链长和相同的双键数和/或鞘碱(sphingo base)部分。
在根据本发明的方法中，测定表2a、2b、3a、3b中显示的生物标志物的至少一种代谢产物。但是更优选地测定生物标志物组，以增强评估的特异性和/或灵敏度。这样的组优选地包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少10种或至多全部表2a、2b、3a、3b中显示的所述生物标志物。
优选地，在本发明的方法中测定的至少一种生物标志物是如表2a和2b中显示的1类生物标志物，或如表3a和3b中显示的2类生物标志物。更优选地，至少一种生物标志物是1类或2类生物标志物，并且最优选地，其是1类生物标志物。
更优选地，在本发明的方法中测定的至少一种生物标志物是如表2a中显示的氨基酸，最优选脯氨酸、苏氨酸、鸟氨酸或反式4-羟脯氨酸。如果多于一种生物标志物待测定，优选地设想所述更多的生物标志物涵盖脯氨酸、苏氨酸、鸟氨酸和/或反式4-羟脯氨酸，和优选地，所有所述氨基酸。
更优选地，在本发明的方法中测定的至少一种生物标志物是鞘磷脂。
更优选地，在本发明的方法中测定的至少一种生物标志物是如表2a中显示的碳水化合物，更优选地麦芽糖、麦芽三糖或甘露糖。
更优选地，在本发明的方法中测定的至少一种生物标志物是辅酶Q10或辅酶Q9。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，至少一种生物标志物是2类生物标志物，且受试者更优选地展示潜在的胰腺疾病例如胰腺炎，这是患上胰腺癌的风险因素。
本文使用的代谢产物指至少一个分子的代谢产物的至少一个分子，多至所述特定代谢产物的多个分子。还应当理解，代谢产物组是指多种化学上不同的分子，其中对于每一种代谢产物，可以存在至少一个分子，多至多个分子。根据本发明的代谢产物涵盖所有类型的有机或无机化学化合物，包括包含在生物材料(例如生物体)中的那些。优选地，根据本发明的代谢产物为小分子化合物。更优选地，在考虑多种代谢产物的情况下，所述多种代谢产物表示代谢组，即在特定时间和特定条件下包含在生物体、器官、组织、体液或细胞中的代谢产物的集合。
除了说明书中陈述的特定生物标志物以外，在本发明的方法中也优选地测定其他生物标志物。这些生物标志物可包括肽或多肽生物标志物，或糖苷例如CA19.9抗原。
本文使用的术语“样品”指来自体液(优选血液、血浆、血清、唾液或尿液)的样品、或源自(例如通过活组织检查)细胞、组织或器官的样品，特别是来自心脏的样品。更优选地，样品为血液、血浆或血清样品，最优选血浆样品。生物样品可源自本文别处详述的受试者。获得前述不同类型生物样品的技术为本领域公知的。例如，血液样品可通过采血获得，而组织或器官样品可以例如通过活组织检查获得。
前述样品优选在它们用于本发明方法之前被预处理。如在下文更详细的描述，所述的预处理可包括释放或分离化合物或除去过量的材料或废弃物所需要的处理。适当的技术包括离心、萃取、分馏、超滤、蛋白质沉淀随后过滤和纯化和/或化合物富集。而且，进行其它预处理从而提供适合进行化合物分析的形式或浓度的化合物。例如，如果在本发明的方法中使用气相色谱-质谱联用，则需要在进行所述的气相色谱法之前将化合物进行衍生。适当的和必要的预处理取决于用于实施本发明方法的工具，且为本领域技术人员所熟知的。如前文所述的经预处理的样品也包含在根据本发明所用的术语“样品”中。
本文使用的术语“受试者”涉及动物，和优选哺乳动物。更优选地，受试者是灵长类，并且最优选地是人。受试者优选地疑为患有胰腺癌，即其可已经显示了与疾病相关的一些或全部症状。然而优选地，除了前述疾病和病症外，受试者为表观健康的。所述受试者优选地处于增高的患上胰腺癌的风险(Brand RE等人,Gut.2007；56:1460-9)。更优选地，处于增高风险的此类受试者具有一位或多位患有胰腺癌的亲属，具有确定的患上胰腺癌(包括但不限于Peutz-Jeghers综合征)的遗传倾向，具有一位或多位患有胰腺炎的亲属，和/或具有确定的患上胰腺炎的遗传倾向。
本文所用术语“测定...的量”是指测定样品中待通过本发明的方法测定的生物标志物的至少一种特性特征。根据本发明的特性特征是指表征生物标志物的物理和/或化学性质(包括生物化学性质)的特征。此类性质包括例如分子量、粘度、密度、电荷、自旋、光学活性、颜色、荧光、化学发光、元素组成、化学结构、与其它化合物反应的能力、在生物读出系统中引发应答(例如诱导报告基因)的能力等。所述性质的值可以作为特性特征，并能够根据本领域公知的技术进行测定。而且，特性特征可以是通过标准操作(例如，数学计算例如乘法、除法或对数微积分)衍生自生物标志物的物理和/或化学性质的值的任何特征。最优选地，至少一种特性特征允许测定和/或化学鉴定所述的至少一种生物标志物及其量。因此，特征值优选地也包含涉及衍生出特征值的生物标志物的丰度的信息。例如，生物标志物的特征值可为质谱中的峰。此类峰含有生物标志物的特征信息，即m/z信息，以及与所述生物标志物在样品中的丰度(即其量)相关的强度值。
如上讨论的，优选地根据本发明可定量或半定量地测定包含在样品中的每种生物标志物。对于定量测定，基于上文提到的特性特征的测定值，测量生物标志物的绝对量或准确量或测量生物标志物的相对量。在不能或不应测定生物标志物的准确量的情况下可以测定相对量。在所述的情况下，可以测定存在的生物标志物的量相对于包含第二种量的所述生物标志物的第二种样品是扩大了还是减少了。在优选的实施方案中，包含所述生物标志物的所述第二种样品应为在本文别处详述的计算的参考值。因此，定量分析生物标志物还包括时常提到的生物标志物的半定量分析。
而且，如本发明方法所用的测定优选包括在前文提到的分析步骤之前进行化合物分离的步骤。优选地，所述的化合物分离步骤得到样品包含的代谢产物的时间分辨分离。因此，根据本发明优选使用的用于分离的适当技术包括所有色谱分离技术例如液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法、大小排阻或亲和色谱法。这些技术为本领域公知的，并能够被本领域技术人员毫不费力地应用。最优选地，LC和/或GC为本发明方法设想的色谱技术。用于生物标志物的此类测定的适当设备为本领域公知的。优选地，使用质谱法，尤其是气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、直接注入质谱法或傅里叶变换-离子回旋共振质谱法(FT-ICR-MS)、毛细管电泳质谱法(CE-MS)、高效液相色谱法-质谱法联用(HPLC-MS)、四级杆质谱法、任何串联偶联的质谱(例如MS-MS或MS-MS-MS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、热解质谱法(Py-MS)、离子迁移率质谱法或飞行时间质谱法(TOF)。最优选地，如下文详述的那样使用LC-MS和/或GC-MS。所述的技术在例如Nissen 1995，Journal of Chromatography A，703：37-57、US 4,540,884或US 5,397,894中公开，此处将其公开内容引入作为参考。作为质谱技术的备选技术或者除了质谱技术外，可以使用下列技术进行化合物测定：核磁共振(NMR)、磁共振成像(MRI)、傅里叶变换红外分析(FT-IR)、紫外(UV)光谱法、折射指数(RI)、荧光检测、放射化学检测、电化学检测、光散射(LS)、散射拉曼光谱或火焰离子化检测(FID)。这些技术为本领域技术人员熟知的，并可毫不费力地应用。本发明的方法优选由自动化进行辅助。例如，样品加工或预处理可以由机器人自动完成。数据处理和比较优选由适当的计算机程序和数据库来辅助。前文所述的自动化允许以高通量方法使用本发明的方法。
而且，至少一种生物标志物还能够由特定化学或生物测定法进行测定。所述的测定法包含允许特异性地检测样品中的至少一种生物标志物的工具。优选地，所述的工具基于生物标志物与其它化合物反应的能力或它在生物读出系统中引发应答(例如诱导报告基因)的能力而能够特异性地识别生物标志物的化学结构或能够特异性地鉴别生物标志物。能够特异性地识别生物标志物的化学结构的工具优选是抗体或与化学结构特异性相互作用的其它蛋白质(例如受体或酶)。特异性抗体，例如可通过本领域公知的方法采用生物标志物作为抗原获得。本文提到的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及其片段，例如能够结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明还包括人源化的杂交抗体，其中表现出想要的抗原-特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组合。而且，涵盖单链抗体。供体序列通常包括至少供体的结合抗原的氨基酸残基，但还可以包含供体抗体的其它结构和/或功能相关的氨基酸残基。可以通过本领域公知的一些方法进行制备此类杂交体(hybrids)。能够特异性识别生物标志物的适当的蛋白质优选为与所述生物标志物的代谢转化有关的酶。所述的酶可以使用生物标志物作为底物或可以将底物转化为生物标志物。而且，所述的抗体可以用作生成特异性识别生物标志物的寡肽的基础。例如这些寡肽包含对于所述生物标志物的酶结合结构域或口袋。适当的基于抗体和/或酶的测定法可以是RIA(放射性免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心酶免疫测试、电化学发光夹心免疫测定(ECLIA)、解离放大镧系荧光免疫测定(DELFIA)或固相免疫测试。而且，还可以基于生物标志物与其它化合物反应的能力(即通过特异性化学反应)来测定生物标志物。此外，由于生物标志物在生物读出系统中引发应答的能力，可以在样品中测定生物标志物。检测作为表明样品中包含的生物标志物的存在和/或量的读数的生物学应答。生物学应答可以为例如基因表达的诱导或者细胞或有机体的表型应答。在优选的实施方案中，至少一种生物标志物的测定是定量方法，例如也允许测定样品中至少一种生物标志物的量。
如上述，所述至少一种生物标志物的测定可优选地包括质谱法(MS)。本文所用的质谱法涵盖所有允许测定对应于根据本发明的待测化合物(即生物标志物)的分子量(即质量)或质量变化的技术。优选地，本文所用的质谱法涉及GC-MS、LC-MS、直接注入质谱、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四极杆质谱法、任何的串联偶联的质谱(例如MS-MS或MS-MS-MS)、ICP-MS、Py-MS、TOF或应用前述技术的任何组合的方法。如何应用这些技术是本领域技术人员熟知的。而且，合适的设备是可以商购的。更优选地，本文所用质谱法涉及LC-MS和/或GC-MS，即涉及与先前的色谱分离步骤有效连接的质谱法。更优选地，本文所用质谱法涵盖四极杆MS。最优选地，如下进行所述四极杆MS：a)选择在质谱仪的第一个分析四极杆中电离生成的离子的质量/电荷商(m/z)，b)通过在额外的随后的四极杆中应用加速电压破碎步骤a)中所选的离子，所述随后的四极杆充满碰撞气体并用作碰撞室，c)在另一随后的四级杆中选择在步骤b)的破碎方法中产生的离子的质量/电荷商，其中方法的步骤a)到c)至少执行一次，并且分析作为电离过程的结果存在于物质混合物中的所有离子的质量/电荷商，其中在该分析中四极杆充满了碰撞气体，但没有应用加速电压。根据本发明应用的所述最优选的质谱法的细节可以在WO 03/073464中找到。
更优选地，所述质谱法是液相色谱(LC)MS和/或气相色谱(GC)MS。本文所用液相色谱是指允许在液相或者超临界相分离化合物(即代谢产物)的所有技术。液相色谱的特征在于使流动相中的化合物通过固定相。因为每种个体化合物有其特定的保留时间(即化合物通过该体系所需要的时间)，当化合物以不同速率通过固定相时，它们在时间上变为分离的。本文所用液相色谱还包括HPLC。用于液相色谱的装置是可商购的，例如从AgilentTechnologies,美国购得。根据本发明应用的气相色谱和液相色谱的操作原则上类似。然而，化合物(即代谢产物)不是存在于通过固定相的液体流动相中，而是存在于气体中。化合物通过柱，所述柱含有作为固定相的固体支持材料，或柱壁可作为固定相或涂敷有固定相。同样地，每一化合物具有通过柱所需的特定时间。而且，在气相色谱的情况下，优选在气相色谱之前对化合物进行衍生化。合适的衍生化技术是本领域公知的。优选地，根据本发明的衍生化涉及优选地，极性化合物的甲氧基化和三甲基硅烷基化，以及优选地，非极性(即亲脂性的)化合物的转甲基化、甲氧基化、三甲基硅烷基化。
术语“参考值”指可与医学病况(即存在或不存在本文提及的疾病、疾病状态或效果)相关的各个生物标志物的特性特征值。优选地，参考值是生物标志物的阈值(例如量或量的比率)，其中在待研究的样品中发现的高于阈值或与阈值基本相同的值指示存在医学病况，而在待研究样品中发现的低于阈值的值指示不存在医学病况。应当理解，也为优选地，参考值可为生物标志物的阈值，其中在待研究样品中发现的低于阈值或与阈值基本相同的值指示存在医学病况，而在待研究样品中发现的高于阈值的值指示不存在医学病况。
根据本发明的上述方法，参考值优选地是从已知患有胰腺癌的受试者或受试者组的样品中得到的参考值。在此类情况下，在测试样品中发现的基本相同的至少一种生物标志物的值指示存在疾病。此外，参考值也可优选地来自已知未患有胰腺癌的受试者或受试者组，优选表观健康的受试者。在此类情况下，在测试样品中发现的相对参考值发生改变的至少一种生物标志物的值指示存在疾病。作必要修改后，同样地适用于个体群体(包含待研究的受试者)中至少一种生物标志物的相对或绝对值的计算参考值，其最优选地为平均数或中位数。如本文其它地方的说明，可以测定所述个体群体的至少一种生物标志物的绝对值或相对值。怎样计算合适的参考值(优选平均值或中位值)为本领域公知的。前面提到的受试者的群体应包含多个受试者，优选至少5、10、50、100、1,000或10,000个受试者。应理解通过本发明方法诊断的受试者和所述的多个受试者中的受试者为相同物种。
如果特性特征值和在定量测定情况下的强度值是基本相同的，则测试样品的至少一种生物标志物的值和参考值是基本相同的。基本相同的意思是，2个数值之间的差异优选地不显著，且其特征在于强度值至少在参考值的第1和第99百分位数之间、第5和第95百分位数之间、第10和第90百分位数之间、第20和第80百分位数之间、第30和第70百分位数之间、第40和第60百分位数之间的区间内，优选地，参考值的第50、第60、第70、第80、第90或第95百分位数。测定2个量是否基本相同的统计学检测是本领域熟知的，也在本文别处描述。
另一方面，观察到的2个值的差异应为统计上显著的。优选地，在参考值的第45和第55百分位数之间、第40和第60百分位数之间、第30和第70百分位数之间、第20和第80百分位数之间、第10和第90百分位数之间、第5和第95百分位数之间、第1和第99百分位数之间的区间之外，相对值或绝对值的差异是显著的。中位数的优选变化和比率在随附的表和实施例中描述。
优选地，参考值即至少一种生物标志物的至少一种特性特征值或其比率将存储在适当的数据存储介质(例如数据库)中，因此也可用于将来的评估。
术语“比较”指确定生物标志物的测定值是否与参考值基本相同或与其有差异。优选地，如果观察到的差异是统计上显著的则认为生物标志物的值与参考值有差异，可通过在本说明书别处提及的统计学技术确定统计显著性。如果差异在统计上不显著，则生物标志物的值与参考值基本相同。基于上述比较可评估受试者是否患有疾病。
对在本说明书中提及的特定生物标志物，优选的变化值的相对量或比率(即以中位数比率表示的变化)见下表。基于下表2a、2b、3a、3b中显示的在患有胰腺癌的受试者和表观健康的对照中发现的代谢产物的比率和计算的t值，可以推导出表2a、2b、3a、3b的给定生物标志物的增加或减少是否指示胰腺癌的存在。生物标志物的负t值表示生物标志物的减少指示胰腺癌，而正t值表示生物标志物的增加指示胰腺癌。应当理解在所述情况下，参考值来源于已知不患有胰腺癌的受试者或受试者组，或是本文别处定义的计算的参考值。
比较优选由自动化进行辅助。例如，可以应用包括用于比较两个不同的数据集(例如包含特性特征值的数据集)的算法的适当的计算机程序。此类计算机程序和算法是本领域公知的。尽管有上述规定，仍可以进行手动比较。
有利地，在本发明相关研究中已发现，上述特定生物标志物的量是胰腺癌的指示物。因此，样品中的上述至少一种生物标志物可原则上用于评估受试者是否患有胰腺癌。这特别有助于有效诊断疾病，以及改善胰腺癌的临床前和临床管理，以及有效监控患者。此外，本发明相关的发现也将促进有效的基于药物的疗法的开发或下面详细陈述的针对胰腺癌的其他干预。
除了在本文中另外说明以外，上面进行的术语的定义和解释经必要修正后应用于本发明的以下实施方案。
本发明也涉及用于鉴定受试者是否需要胰腺癌疗法或改变疗法的方法，所述方法包括本发明方法的步骤和如果诊断为胰腺癌，鉴定有需要的受试者的另外步骤。
本文使用的词语“需要胰腺癌疗法”的意思是受试者中的疾病处于这样的状态，其中治疗干预是必需或有利的，以减轻或治疗胰腺癌或其相关症状。因此，本发明相关研究发现不仅允许诊断受试者中的胰腺癌，而且允许鉴定应接受胰腺癌疗法治疗的受试者或其胰腺癌疗法需要调整的受试者。一旦鉴定了受试者，所述方法可还包括推荐胰腺癌疗法的步骤。
根据本发明使用的胰腺癌疗法优选地包括手术、放射疗法或药物治疗。优选的基于手术的疗法包括切除胰腺或其部分，例如胰十二指肠切除术、胰尾切除术(tailpancreatectomy)、全部或部分胰切除术、姑息桥接操作。基于药物的疗法优选地包括施用一种或多种具有抗肿瘤性能的药物，包括但不限于铂衍生物、氟嘧啶、嘧啶类似物、吉西他滨、抗代谢物、烷化剂、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、靶向抗体和酪氨酸激酶抑制剂。
本发明还涉及测定针对胰腺癌的疗法在受试者中是否成功的方法，所述方法包括本发明的步骤和如果未诊断出胰腺癌，测定疗法是否成功的另外步骤。
应当理解，较之未受治疗的受试者，如果胰腺癌或至少其某些症状得到治疗或减轻，则胰腺癌疗法是成功的。此外，较之未受治疗的受试者，如果疾病进展可被阻止或至少减慢，则如本文所指地，疗法也是成功的。
本发明也涉及用于诊断受试者样品中的胰腺癌的设备或系统，包含：
(a)包含表2a、2b、3a、3b的至少一种生物标志物的检测器的所述受试者样品的分析单元，所述检测器允许测定样品中所述至少一种生物标志物的量；和与所述分析单元有效连接的
(b)包含数据处理单元和数据库的评价单元，所述数据库包含储存的参考值，并且所述数据处理单元能够(i)将由分析单元测定的至少一种生物标志物的量与储存的参考值进行比较，和(ii)生成输出信息，基于所述输出信息可建立诊断。
本文使用的设备将至少包含上述单元。设备的单元彼此有效连接。如何以有效的方式连接所述工具将取决于设备包括的单元类型。例如，当检测器允许自动定性或定量测定生物标志物时，可通过，例如，计算机程序处理由所述自动操作分析单元得到的数据，以协助在评价单元中的评估。优选地，在此类情况下所述单元包含在单个设备中。所述设备可因此包括生物标志物的分析单元和作为评价单元的计算机或数据处理设备，所述评价单元用于处理评估获得的结果数据和用于稳定输出信息。优选的设备为无需专科临床医师的特别知识即可以应用的设备，例如仅需装载样品的电子设备。设备的输出信息优选地是数值，其允许对胰腺癌的存在或不存在下结论，因此有助于诊断。更优选地，输出信息是基于上述数值的初步诊断，即指示受试者是否患有胰腺癌的分类物。此类初步诊断可能需要其他信息的评估，所述其他信息可通过在本发明的设备中包括专家知识数据库系统来提供。
备选地，可以将所述单元应用到包含彼此有效地连接的多个设备的系统中。取决于用于本发明的系统的单元，可通过采用允许在所述的工具之间进行数据传输的方式(例如，玻璃纤维电缆和其它用于高通量数据传输的电缆)使各工具相互连接来对所述的工具进行功能性连接。尽管如此，本发明还考虑工具之间的无线数据传递，例如经由LAN(无线LAN，W-LAN)。优选的系统包含用于测定生物标志物的工具。本文所用的用于测定生物标志物的工具涵盖用于分离生物标志物的工具(例如色谱设备)和用于代谢产物测定的工具(例如质谱设备)。适当的设备已在上文进行详细描述。用在本发明系统中的用于化合物分离的优选工具包括色谱设备，更优选用于液相色谱法、HPLC和/或气相色谱法的设备。用于化合物测定的优选设备包含质谱设备，更优选GC-MS、LC-MS、直接注入质谱、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四极杆质谱、串联偶联质谱(包括MS-MS或MS-MS-MS)、ICP-MS、Py-MS或TOF。分离工具和测定工具优选彼此偶联。最优选地，在本说明书其它地方详述的本发明的系统中使用LC-MS和/或GC-MS。应进一步包含用于比较和/或分析结果的工具，所述结果获自用于测定生物标志物的工具。所述用于比较和/或分析结果的工具可以包含至少一种数据库和用于比较结果的应用计算机程序。上述系统和设备的优选实施方案也在下面详细描述。
此外，本发明涉及数据集，该数据集包含指示上文陈述的医学病况或效果(即在受试者中诊断胰腺癌，鉴定受试者是否需要胰腺癌疗法或确定胰腺癌疗法是否成功)的至少一种生物标志物的特征值。
术语“数据集”指的是可以在物理和/或逻辑上其集合到一起的数据的集合。因此，数据集可在单个数据存储介质中执行，或在彼此有效连接的物理分离的数据存储介质中执行。优选地，通过数据库方式执行数据集。因此，本文所用的数据库包含在适当的存储介质中的数据集。而且，数据库优选还包含数据库管理系统。数据库管理系统优选为基于网络的、分级的或面向对象的数据库管理系统。而且，数据库可以为联合数据库或集中数据库。更优选地，数据库作为分布式(联合)系统(例如作为客户机-服务器-系统)执行。更优选地，构造数据库以允许检索算法比较测试数据组和数据集所包含的数据组。具体来说，通过使用此类算法，能够检索数据库中指示如上示出的医学病况或效果的相似或相同的数据组(例如查询检索)。因此，如果能够在数据集中鉴别出相同或相似的数据组，则测试数据组与所述医学病况或效果相关。因此，从数据集中获得的信息可用作，例如，上述本发明方法的参考值。更优选地，该数据集包含上述任一组中包含的所有生物标志物的特征值。
鉴于上述情况，本发明涵盖包含前述数据集的数据存储介质。
本文所用的术语“数据存储介质”涵盖基于单个物理实体的数据存储介质，例如CD、CD-ROM、硬盘、光存储介质或软盘。而且，该术语进一步包括由物理分离的实体组成的数据存储介质，所述物理分离实体以提供前述的数据集的方式，优选地，以适于查询检索的方式，有效地彼此连接。
本发明还涉及系统，其包含：
(a)与(b)有效连接的用于比较样品的至少一种生物标志物的特征值的工具
(b)上述数据存储介质。
本文所用的术语“系统”涉及彼此有效连接的不同工具。所述的工具可以应用在单一的设备中或可以是彼此有效地连接的物理分离的设备。用于比较生物标志物的特征值的工具优选基于前文提到的比较算法。数据存储介质优选包含前述数据集或数据库，其中每一存储的数据组指示上述医学病况或效果。因此，本发明的系统允许鉴别存储在数据存储介质中的数据集是否包含测试数据组。因此，本发明的系统可以实施本发明的方法。
在系统的优选实施方案中，包含用于测定样品的生物标志物的特征值的工具。术语“用于测定生物标志物的特征值的工具”优选涉及前述用于测定代谢产物的设备，例如质谱设备、NMR设备或进行生物标志物的化学或生物测定的设备。
此外，本发明涉及诊断工具，其包含选自上面涉及的任何一组的、用于测定至少一种生物标志物的工具。
术语“诊断工具”优选涉及在本说明书其他处详述的诊断设备、系统或生物或化学测定。
表达法“用于测定至少一种生物标志物的工具”是指能特异性识别生物标志物的设备或活性剂。合适的设备可以是光谱设备，例如质谱、NMR设备或进行生物标志物的化学或生物测定的设备。合适的活性剂可以是特异性地检测生物标志物的化合物。本文所用的检测可以为两步骤过程，即化合物可以首先特异性性地与待检测的生物标志物结合，随后生成可检测的信号，例如荧光信号、化学发光信号、放射性信号等。对于生成可检测信号，可能需要其它化合物，其全部被术语“用于测定至少一种生物标志物的工具”所包含。特异性地与生物标志物结合的化合物在本说明书其他地方进行详细描述并优选包括特异性地与生物标志物结合的酶、抗体、配体、受体或其它生物分子或化学物质。
此外，本发明涉及诊断组合物，其包含选自上述任意一组的至少一种生物标志物。
选自前述任意组的至少一种生物标志物将作为生物标志物，即在本文别处描述的受试者中的医学病况或效果的指示分子。因此，优选地，通过可视化或通过本文提及的工具的检测，生物标志物分子本身可作为诊断组合物。因此，根据本发明的指示生物标志物存在的诊断组合物还可物理上包含所述生物标志物，例如抗体和待检测的生物标志物的复合物可作为诊断组合物。因此，该诊断组合物可进一步包含如本说明书其他地方说明的用来检测代谢产物的工具。备选地，如果使用例如基于MS或NMR技术的检测工具，则作为风险病况指示物的分子种类将是待研究的测试样品所包含的至少一种生物标志物。因此，由于其鉴别为生物标志物，根据本发明的至少一种生物标志物本身可作为诊断组合物。
大体上，本发明考虑受试者样品中的表2a、2b、3a、3b的至少一种生物标志物用于诊断胰腺癌的用途。
本文提到的所有参考文献就它们整体公开内容以及上面提到的具体公开内容一并引入作为参考。
现在将通过下面的实施例对本发明进行说明，但这些实施例并非旨在对本发明范围加以限定或限制。
实施例
现在将通过下面的实施例对本发明进行说明，但这些实施例并非旨在对本发明范围加以限定或限制。
实施例1：样品制备和MS分析
38份胰腺腺癌血浆样品，20份患有醇诱导的肝硬化患者的血浆样品和41份来自患有醇诱导的慢性胰腺炎患者的血浆样品的分析显示了107种可能的候选生物标志物，将其分为2类。如下进行血浆样品的分析：
如下所述，准备血浆样品并进行LC-MS/MS和GC-MS或XLC-MS/MS(激素)分析：
按下面的方法准备样品：通过沉淀从血浆中分离蛋白质。在添加水以及乙醇和二氯甲烷的混合物后，剩余的样品分级为水性的、极性相和有机的、亲脂相(脂类级份)。
向经蒸发的提取物中加入140μl氯仿、37μl盐酸(水中以重量计37％的HCl)、320μl甲醇以及20μl甲苯，用于脂类提取物的转甲醇分解(transmethanolysis)。密封容器并在100℃下振摇加热2小时。随后蒸干溶液。使残留物完全干燥。
在密封容器中与甲氧胺盐酸盐反应(在吡啶中20mg/ml，100μl，1.5h，60℃)，从而进行羰基基团的甲氧基化。作为时间标准，加入20μl奇数的、直链脂肪酸溶液(在3/7(v/v)吡啶/甲苯中的溶液，7至25个碳原子的脂肪酸每种为0.3mg/mL，以及27、29和31个碳原子的脂肪酸每种为0.6mg/mL)。最后，还在该密封容器中用100μL N-甲基-N-(三甲基硅基)-2,2,2-三氟乙酰胺(MSTFA)在60℃进行衍生化30分钟。注入GC前的最终体积是220μl。
对于极性相，衍生化按以下方法进行：在密封容器中与甲氧胺盐酸盐反应(在吡啶中20mg/ml，50μl，1.5h，60℃)，从而进行羰基基团的甲氧基化。作为时间标准加入10μl奇数的、直链脂肪酸溶液(在3/7(v/v)吡啶/甲苯中的溶液，7至25个碳原子的脂肪酸每种为0.3mg/mL，以及27、29和31个碳原子的脂肪酸每种为0.6mg/mL)。最后，还在该密封容器中用50μL N-甲基-N-(三甲基硅基)-2,2,2-三氟乙酰胺(MSTFA)在60℃进行衍生化30分钟。注入GC前的最终体积是110μl。
GC-MS系统由与Agilent 5973MSD偶联的Agilent 6890GC组成。自动进样器是来自CTC的CompiPal或GCPal。
对于分析，取决于分析的样品材料以及来自相分离步骤的级份，使用具有不同的聚甲基硅氧烷固定相的常用的商业毛细管分离柱(30m x 0.25mm x 0.25μm)，该固定相含有0％多至35％的芳香部分(例如：DB-1ms,HP-5ms,DB-XLB,DB-35ms,AgilentTechnologies)。无分流地注入至多1μL的最终体积，并且根据样品材料以及来自相分离步骤的级份以不同的加热速率，烘箱温度程序从70℃开始并于340℃结束，以实现充分的色谱分离以及每一个分析物峰内的扫描次数。此外，RTL(保留时间锁定，AgilentTechnologies)被用于分析和常用的GC-MS标准条件(例如标称的1至1.7ml/min的恒定流量以及氦作为流动相气体)，用70eV的电子冲击进行电离，用2.5至3次扫描/秒的扫描速率及标准调谐条件在从15至600的m/z范围内进行扫描。
HPLC-MS系统由与API 4000质谱法仪(Applied Biosystem/MDS SCIEX，Toronto，加拿大)偶联的Agilent 1100LC系统(Agilent Technologies，Waldbronn，德国)组成。HPLC分析在具有C18固定相的市售反相分离柱上进行(例如：GROM ODS 7pH,Thermo BetasilC18)。注入至多10μL的经蒸发和重构的极性和亲脂相的最终样品体积，并且用甲醇/水/甲酸或乙腈/水/甲酸梯度以200μL/min的流速进行梯度洗脱来实施分离。
质谱法是通过电喷雾离子化进行的，正模式用于非极性(脂类)级份，负模式用于极性级份，采用多反应监测-(MRM)-模式和100-1000原子量(amu)的全扫描。
分析在血浆样品中的复合脂类：
通过使用氯仿/甲醇进行液/液萃取从血浆中萃取总脂类。随后根据Christie(Journal of Lipid Research(26),1985,507-512)通过正相液相色谱(NPLC)将脂类提取物分馏为11个不同的脂类组。
通过GC测量脂类类型游离脂肪酸(FFA)、二酰基甘油(DAG),三酰基甘油(TAG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷酯酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、游离甾醇(FS)、磷脂酰丝氨酸(PS)。
在用TMSH(三甲基氢氧化锍)衍生化，得到对应于种类分离的脂类的酰基部分的脂肪酸甲基酯(FAME)后，通过GC-MS分析级份。在每个级份中测定C14至C24的FAME浓度。
使用电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)通过LC-MS/MS分析脂类种类胆固醇酯(CE)和鞘磷脂(SM)，分别检测胆固醇酯和鞘磷脂的特异性多反应监测(MRM)转换。
在血浆样品中分析类固醇类和儿茶酚胺类：
通过在线SPE-LC-MS(固相萃取-LC-MS)测定类固醇类及其代谢产物。如Yamada等人[21]Yamada H,Yamahara A,Yasuda S,Abe M,Oguri K,Fukushima S,Ikeda-Wada S:Dansyl chloride derivatization of methamphetamine:a methode with advantagesfor screening and analysis of methamphetamine in urine.Journal of AnalyticalToxicology,26(1):17-22(2002)所述，通过在线SPE-LC-MS测定儿茶酚胺类及其代谢产物。
在血浆样品中分析类花生酸类：
通过离线和在线SPE LC-MS/MS(固相萃取-LC-MS/MS)(Masoodi M和Nicolaou A:Rapid Commun Mass Spectrom.2006；20(20):3023–3029)从血浆中测量类花生酸类及相关产物。通过稳定同位素标记的标准物进行绝对定量。
实施例2：数据评估
在随机化的分析序列设计中进行血浆样品分析，从每份样品的等分试样生成混合的样品(所谓的“池(Pool)”)。将原始峰数据对每种分析序列的池的中位值进行归一化，以说明方法变异性(所谓的“比值”)。比率进行log10转化以接近数据的正态分布。通过具有以下固定效应的简单线性模型(ANOVA)进行统计学分析：疾病、体重指数(BMI)、年龄、储存时间(储存)和募集地点(地点)：
疾病+BMI+年龄+储存+地点
对ANOVA模型的结果应用2种不同的方法鉴定胰腺癌的生物标志物。这些不同的方法得到在表1中解释的不同生物标志物类别，鉴定的生物标志物列在下表2a、2b、3a、3b中。

Claims (17)

1.表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物、或检测表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物的工具用于制备诊断设备或诊断组合物的用途，所述诊断设备或诊断组合物用于在受试者中诊断胰腺癌，
其中所述诊断设备或诊断组合物能够在疑为患有胰腺癌的受试者的样品中测定表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物的量；并通过比较所述至少一种生物标志物的量与参考值，诊断胰腺癌。
2.权利要求1的用途，其中所述参考值源自已知不患有胰腺癌的受试者或受试者组的样品，或为计算的参考值。
3.权利要求1的用途，其中所述参考值源自已知患有胰腺癌的受试者或受试者组的样品。
4.表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物、或检测表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物的工具用于制备诊断设备或诊断组合物的用途，所述诊断设备或诊断组合物用于鉴定受试者是否需要胰腺癌疗法，
其中所述诊断设备或诊断组合物能够在疑为患有胰腺癌的受试者的样品中测定表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物的量；通过比较所述至少一种生物标志物的量与参考值，诊断胰腺癌；如果所述受试者被诊断为患有胰腺癌，鉴定需要胰腺癌疗法的受试者。
5.表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物、或检测表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物的工具用于制备诊断设备或诊断组合物的用途，所述诊断设备或诊断组合物用于确定受试者中针对胰腺癌的疗法是否成功，
其中所述诊断设备或诊断组合物能够在疑为患有胰腺癌的受试者的样品中测定表2a、2b、3a、3b中至少一种生物标志物的量；通过比较所述至少一种生物标志物的量与参考值，诊断胰腺癌；如果未诊断出胰腺癌，确定疗法是否成功的。
6.权利要求4或5的用途，其中所述参考值源自已知不患有胰腺癌的受试者或受试者组的样品，或为计算的参考值。
7.权利要求4或5的用途，其中所述参考值源自已知患有胰腺癌的受试者或受试者组的样品。
8.权利要求4或5的用途，其中所述胰腺癌疗法包含手术、放射疗法或药物治疗。
9.权利要求1、4和5中任一项的用途，其中所述样品是血浆、血液或血清样品。
10.权利要求1、4和5中任一项的用途，其中所述受试者是人。
11.权利要求1、4和5中任一项的用途，其中所述胰腺癌是胰腺腺癌。
12.权利要求1、4和5中任一项的用途，其中所述至少一种生物标志物是2类生物标志物。
13.权利要求12的用途，其中所述受试者表现出胰腺炎作为潜在的胰腺疾病。
14.权利要求1、4和5中任一项的用途，其中所述生物标志物是辅酶Q9和任选地表2a、2b、3a、3b的至少一种生物标志物。
15.在受试者样品中诊断胰腺癌的设备，所述设备包含：
(a)所述受试者样品的分析单元，所述分析单元包含表2a、2b、3a、3b的至少一种生物标志物的检测器，所述检测器允许测定样品中所述至少一种生物标志物的量；和与所述分析单元有效连接的
(b)评价单元，其包含数据处理单元和数据库，所述数据库包含储存的参考值，并且所述数据处理单元能够(i)将由分析单元测定的至少一种生物标志物的量与储存的参考值进行比较，和(ii)生成输出信息，基于所述输出信息可建立诊断。
16.检测疑为患有胰腺癌的受试者样品中的表2a、2b、3a、3b的至少一种生物标志物的工具用于制备诊断胰腺癌的诊断设备或诊断组合物的用途。
17.检测疑为患有胰腺癌的受试者血浆、血液或血清样品中的辅酶Q9和任选地表2a、2b、3a、3b的至少一种生物标志物的工具用于制备诊断胰腺癌的诊断设备或诊断组合物的用途。
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