CN114341364A

CN114341364A - Tau病理靶向配体

Info

Publication number: CN114341364A
Application number: CN202080062422.5A
Authority: CN
Inventors: 阿南特·安纳普拉贾达; 穆青山; 卡洛·麦迪奇
Original assignee: Alzeca Biosciences LLC; Texas Childrens Hospital
Current assignee: Alzeca Biosciences LLC; Texas Childrens Hospital
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2022-04-12
Also published as: US20210128755A1; WO2021007232A1; JP2022550237A; EP3997244A1; EP3997244A4; KR20220054288A

Abstract

本申请描述了用于检测tau病理的方法和组合物。所述用于检测tau病理的组合物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含显像剂的脂质体连接。该组合物可用于对受试者进行tau病理成像的方法中，该方法包括对受试者施用有效量的组合物，并对受试者的至少一个部位进行成像，确定该部位是否表现出tau病理。该组合物还可用于检测从受试者身上获取的生物样本的tau病理。

Description

TAU病理靶向配体

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年7月8日提交的美国临时专利申请第62/871,380号的优先权，该美国临时专利申请通过援引以其全文并入本文。

序列表

序列表采用ASCII格式以电子形式提交，通过援引以其全文并入本文。所述ASCII格式的文件副本于2020年7月7日创建,命名为“Alzeca-122_Sequence Listing_PCT_ST25.txt”,大小为47,652字节。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)等tau蛋白病的发病机制主要包括微管相关蛋白tau。Tau蛋白由MAPT基因编码。选择性剪接产生6种tau蛋白亚型，其不同之处在于调控插入靠近N端(0N、1N、2N)的两个插入片段以及对应于靠近C端的保守微管结合区的3个或4个重复序列(3R、4R)。正常脑组织中mRNA与蛋白的4R:3R比接近1:1，但在病理状态下会升高。

以下几种分子变化会诱导tau病理发生：磷酸化、乙酰化、泛素化、类泛素化、糖化、硝化和截断。然而，所有这些分子变化均与异常磷酸化有关，从而得出异常磷酸化是tau病理形成的第一步的结论。Tau蛋白异常磷酸化导致成对螺旋丝的形成，而成对螺旋丝构成了在阿尔茨海默病发病中退化的神经元细胞中发现的大部分神经原纤维缠结。神经原纤维缠结与淀粉样斑块一起构成了阿尔茨海默病的两大病理特征。

根据美国国立老化研究所与阿尔茨海默病协会支持的最新标准,对阿尔茨海默病的确诊需要病理性淀粉样蛋白和tau蛋白(A+,T+)，其中淀粉样蛋白通过一种经核准的PET显像剂进行测量，tau蛋白则通过显像剂或脑脊液(CSF)水平进行测量。随着疾病的进展，淀粉样蛋白PET和CSF tau蛋白等关键生物标志物的时间进程研究由来已久。最新的共识表明，tau蛋白的病理水平滞后于淀粉样蛋白的病理水平数年。可通过常规方法检测到两种标志物显著升高时，疾病通常已经处于晚期。此外，尽管PET示踪剂对淀粉样斑块的鉴定较为客观明确，但CSF和血液中的tau蛋白标志物会受到许多其他因素的干扰，包括其他病症和患者可能正在接受的治疗。人工智能对血清生物标志物的蛋白质组学分析最近引起了人们的极大兴趣，但相对于PET金标准来说，其准确度仍然不高。

Tau病理的早期指标可能使阿尔茨海默病的诊断提前几年得出，可能提前到症状出现前的阶段。

发明内容

提供了一种用于鉴定tau病理的组合物，所述组合物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含显像剂的脂质体连接，例如磁共振成像(MRI)对比增强剂。在一些方面，所述靶向配体包括适配子或稳定适配子。在一些方面，所述靶向配体包括硫代适配子。在一些方面，所述靶向配体包含选自以下一种或多种序列的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ ID NO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ IDNO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ ID NO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。在一些方面，所述tau病理细胞表面标志物包括tau蛋白过度磷酸化的细胞表面标志物。在一些方面，所述tau病理细胞表面标志物包括选自角蛋白6A(KRT6A)、角蛋白6B(KRT6B)、热休克蛋白(HSP)和波形蛋白(VIM)的蛋白。在一些方面，采用指数富集的配体系统进化(SELEX)方法测定所述靶向配体与tau病理细胞表面标志物特异性结合。在一些方面，所述靶向配体与聚乙二醇连接，所述聚乙二醇偶联至与所述脂质体结合的磷脂。在一些方面，所述脂质体由膜组成，所述膜包含：第一磷脂；能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂；由第一聚合物衍生的第二磷脂；由与所述靶向配体偶联的第二聚合物衍生的第三磷脂；被膜包封或与膜结合的显像剂。

还提供了一种对受试者进行tau病理成像的方法，所述方法包括：对受试者施用可检测到有效量的靶向配体-脂质体偶联物，所述偶联物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含显像剂的脂质体偶联；对受试者的至少一个部位进行成像，确定该部位是否表现出tau病理。在一些方面，所述部位包括受试者大脑的一部分。在一些方面，所述成像显示tau病理水平足以诊断受试者患有早期阿尔茨海默病。在一些方面，该方法还包括对受试者的阿尔茨海默病提供预防或治疗。在一些方面，所述显像剂是MRI对比增强剂，通过MRI测定结合水平。

还提供了一种用于检测tau病理的方法，所述方法包括：将生物样本与有效量的靶向配体-脂质体偶联物接触，所述偶联物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含可检测标记的脂质体偶联；洗涤生物样本，去除未结合的靶向配体脂质体偶联物；通过测定生物样本中剩余可检测标记的量来检测生物样本的tau病理。在一些方面，生物样本是含有神经细胞的样本。

还提供了一种靶向组合物，所述靶向组合物包括：与聚合物连接的磷脂，所述聚合物与特异性结合tau病理细胞表面标志物的靶向配体连接。在一些方面，所述靶向配体为适配子或稳定适配子。在一些方面，所述靶向配体为硫代适配子。在一些方面，所述适配子或稳定适配子包含选自以下一种或多种序列的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ ID NO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ ID NO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ ID NO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQ ID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

还提供了一种适配子或稳定适配子，所述适配子或稳定适配子包含选自以下一种或多种序列的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ IDNO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQID NO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ ID NO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ IDNO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQ ID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

附图说明

结合以下附图，本发明更加容易理解，其中：

图1为适配子功能化脂质体的示例描述。

图2为显示tau蛋白的六种选择性剪接是如何被选定激酶和磷酸酶依次磷酸化和去磷酸化的示意图。通常因磷酸酶下调引起的激酶和磷酸酶活性失衡导致平衡向右移动，并形成成对螺旋丝和tau蛋白缠结。

图3A-3H为SH-SY5Y细胞的初步Cell-SELEX图像，用以鉴定与过度磷酸化细胞结合的适配子。A：用视黄酸处理的SH-SY5Y细胞分化为具有轴突和树突结构的神经元样表型B：用冈田酸处理后，细胞使tau蛋白剧烈磷酸化。上排：AT8染色的pTau蛋白Thr205/Ser202为细胞核。下排：PHF-1染色的pTau蛋白Ser396主要为胞质。C：SELEX选定轮次(1、5、10、13、17、19、21、23、26和-ve对照)的膜结合适配子。第13轮和第21轮是针对非过度磷酸化细胞的阴性选择，分离上清液，从而确保结合的特异性。D：经IonTorrent测序后，第26轮最丰富的10个适配子以及该适配子如何通过筛选进化。E：显示三个不同族且含有20个最丰富序列的树状图。F：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)和Tau_17(SEQ ID NO:13)的M-折叠结构，显示结构相似性。G、H：Tau_1(SEQ ID NO:5)和Tau_3(SEQ ID NO:6)适配子，Cy5标记与过度磷酸化SH-SY5Y细胞的膜和轴突结合。

图4为显示MAPT基因与来自VisANT数据库的Tau_1(SEQ ID NO:5)和Tau_3(SEQ IDNO:6)适配子的蛋白靶标：HSPD90、KRT6A、KRT6B和VIM的相互作用组示意图。

图5A-5C，其中A：为显示硫代适配子Tau_3(SEQ ID NO:6)(红色)在AT100抗体对神经元(绿色)也进行染色的区域与P301S小鼠大脑海马组织紧密结合的图像；B：表明AT8染色(绿色)和Tau_3(SEQ ID NO:6)结合(红色)之间没有相关性；C：表明正常小鼠大脑海马中Tau_3结合明显。

图6提供的图表和成像显示静脉注射靶向Tau_1(SEQ ID NO:5)适配子、靶向Tau_3(SEQ ID NO:6)适配子或非靶向对照纳米粒之前和之后4天使用GRE/45°FA序列的MRI示例，这些适配子或纳米粒都带有共价结合的Gd-DOTA作为对比剂。上图：2月龄转基因P301S小鼠的脑轴位前图像和4日后图像。下图：野生型同科小鼠的脑轴位前图像和4日后图像。(所有图像均在相同颜色的地图上显示。)还显示了针对每个实验组的20只动物计算的Tau_1(SEQID NO:5)和Tau_3(SEQ ID NO:6)靶向颗粒的受试者工作特征(ROC)曲线及其95％置信限。Tau_1和Tau_3(SEQ ID NO:6)靶向颗粒在转基因动物的大脑皮层、海马和下丘脑区域显示出明显的信号增强(黄色箭头)，表明颗粒与过度磷酸化tau蛋白的神经元结合。两种制剂的准确率为80％、敏感度约为57％、特异性约为93％。

图7显示了2月龄P301S小鼠接受Tau_3(SEQ ID NO:6)适配子靶向纳米粒治疗的图像。轴向自旋回波和45°FA GRE图像显示丘脑/下丘脑增强(红色箭头)，而T1图显示海马T1显著缩短(绿色箭头)。T1图谱成像技术提供了更多信息并突出了可量化的信号。

图8显示了对比剂注射前和注射后4天，分别给2月龄野生型(WT)和P301S转基因(Tg)小鼠注射ADx-Tau_1(SEQ ID NO:5)、ADx-Tau_3(SEQ ID NO:6)和含非靶向ADx-tau蛋白对照(ADx-Un)适配子的脂质体纳米粒的图像。转基因小鼠在皮质区和海马区表现出高信号增强(金色箭头)，特别是在注射ADx-Tau_1(SEQ ID NO:5)适配子的情况下。T1加权自旋回波(T1w-SE)和快速自旋回波反转恢复(FSE-IR)序列证明了体内疗效。

图9通过DAPI核染色和AF488标记的AT100与(a)野生型和(b)转基因小鼠皮质区pTau蛋白结合的代表性荧光显微图像，对7月龄转基因P301S小鼠大脑中过度磷酸化tau蛋白(pTau蛋白)进行了死后确认。放大倍数为10倍。AT100图像以相同的色条比例显示。

图10显示了按六点顺序量表生成的ROC曲线(经验值—绿色，拟合值—蓝色),表明相对于T1加权自旋回波(T1w-SE)图像，快速自旋回波反转恢复(FSE-IR)图像的分析精度更高(测试了42只动物，每种基因型和每种制剂类型7只)。显示了T1w-SE序列的(a)ADx-Tau_1(SEQ ID NO:5)和(b)ADx-Tau_3(SEQ ID NO:6)制剂，以及FSE-IR序列的(c)ADx-Tau_1(SEQID NO:5)和(d)ADx-Tau_3(SEQ ID NO:6)制剂的ROC曲线。

为了说明本发明，现在将更详细地描述本发明的几个实施例。请参考上文概述的附图。本领域技术人员应认识到，本文提供的实施例具有许多有用的替代方案，这些替代方案均属于本发明的范围。

具体实施方式

本公开提供了用于检测tau病理的方法和组合物。所述用于检测tau病理的组合物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含显像剂的脂质体连接。请见图1。该组合物可用于对受试者进行tau病理成像的方法中，该方法包括对受试者施用有效量的组合物，并对受试者的至少一个部位进行成像，确定该部位是否表现出tau病理。该组合物还可用于检测从受试者身上获取的生物样本的tau病理。

定义

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如果发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。

除非另有说明，“一个”、“一种”、“所述”、“一个或多个”和“至少一个”可互换使用。单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括其复数形式。

按端点叙述的数值范围包括该范围内包含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

术语“约”在涉及质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，旨在包含相对于指定量±10％的变化。

术语“包括”和“包含”等效，无限制。

短语“基本上由......组成”是指组合物或方法可以包括其他成分和/或步骤，但前提是所述其他成分和/或步骤不会实质性地改变请求保护的组合物或方法的基本和新颖特征。

短语“选自由......组成的组”是指包括所列组的混合物。

组合物的“有效量”或“可检测有效量”是指足以检测与tau病理相关的细胞表面标志物的存在，或利用可供临床使用的设备生成适当图像的量。可检测有效量的检测剂或显像剂可在多次注射中施用。检测剂或显像剂的可检测有效量可根据个体的易感性程度、个体的年龄、性别和体重、个体的特异反应和剂量测定法等因素而变化。检测剂或显像剂的可检测有效量也可根据仪器和胶片相关因素而变化。对此类因素的优化完全属于本领域的技术水平。用于诊断的显像剂用量和显像研究的持续时间将取决于所用的特定显像剂、患者的体重、所治疗疾病的性质和严重程度、患者接受的治疗的性质以及患者的特异反应。最终，主治医师将决定给每位患者使用的显像剂用量以及显像研究的持续时间。

术语“诊断”可能包括确定受试者所患疾病的性质，以及确定疾病或疾病发作的严重程度和可能的结果，康复前景(预后)，或两者兼而有之。“诊断”也可包括合理治疗情况下的诊断，其中诊断指导治疗，包括初步选择疗法、矫正疗法(例如，调整剂量和/或给药方案)等。

术语“抗原”是指能够被靶向配体结合的分子或分子的一部分。抗原通常也能够诱导动物产生能够结合该抗原表位的抗体。抗原可以有一个或多个表位。上述特异性反应是指该抗原将以高度选择性的方式与其相应的抗体发生反应，而不是与其他抗原所能诱发的众多其他抗体发生反应。

术语“表位”是指任何分子中能够被抗体或适配子等靶向配体识别并结合的部分。表位通常由具有化学活性的分子表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。

短语“特异性结合”是指靶向配体与靶结构结合，其中靶向配体与靶结构或其亚单位结合，但不与非靶结构的生物分子结合，或者靶向配体至少优先与靶结构结合。与靶结构或其亚单位特异性结合的靶向配体(如适配子或抗体)可能不会与靶结构族之外的生物分子发生交叉反应。针对tau病理的特异性靶向配体可以是能够以约10^-8-10^-11M的特异性亲和力与该特异性蛋白结合的靶向配体。在一些实施例中，抗体或抗体片段大于约10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M或10^-11M，介于约10^-8M、10^-11M、10^-9M和10^-10M之间、介于约10^-10-10^-11M之间的特异性亲和力与选定抗原结合。在一些方面，使用Ausubel FM的文章(1994，《精编分子生物实验指南》，Chichester:John Wiley和Sons(“Ausubel”))中所述的竞争性结合分析来测量比活性，通过援引并入本文。

术语“多核苷酸”是指包括DNA、RNA和微RNA在内的核酸序列，可以指双链或单链标志物。多核苷酸也可以指含有替代糖的合成变体，如锁核酸。

Tau病理成像

对tau蛋白过度磷酸化进行成像是一种鉴定tau病理的新方法。之前一直试图针对凝聚蛋白本身进行tau病理成像。虽然已经认识到tau蛋白过度磷酸化是成对螺旋丝形成的关键，最终形成tau蛋白缠结，但尚未对作为tau病理替代物或前体的过度磷酸化标志物进行研究。发明人已经鉴定了处于过度磷酸化状态的神经元细胞及其在大脑中的解剖分布，从而作为未来tau病理的一种新型敏感特异性标志物。

该显像剂将靶向tau蛋白过度磷酸化的细胞表面标志物，消除了对细胞膜通透性的需求。Tau蛋白是一种胞内蛋白，tau蛋白缠结主要在细胞内，但有一个例外：神经元死亡后，tau蛋白缠结仍然是“幽灵缠结”。因此，到目前为止，tau病理的所有成像标志物必须穿透神经元细胞膜后，才与其靶结合。当然，唯一的例外是与“幽灵缠结”结合。因此，所有tau蛋白显像剂均受膜通透性的限制。与“幽灵缠结”结合只会标志着神经元死亡，这是疾病的晚期状态。所请求保护的组合物和方法消除了穿透细胞膜的要求，为具有强信号但可能难以内化到细胞中的纳米粒读出物打开了大门。

这种细胞表面标志物的鉴定可以为tau蛋白原纤化和缠结形成的生物学提供新的线索。发明人在不知道结合靶的情况下，在“黑盒”模式下进行了硫代适配子筛选，发现特异性结合到过度磷酸化细胞的硫代适配子与KRT6A、KRT6B、HSP和VIM结合。

Tau蛋白有许多磷酸化位点。例如，最长的同源异构体tau蛋白441有80个可以磷酸化的丝氨酸/苏氨酸位点和5个可以磷酸化的酪氨酸位点。研究表明神经原纤维缠结中有40个以上的tau蛋白磷酸化位点。tau蛋白磷酸化由几种激酶介导，包括GSK3β、CDK-5、CaMKII、PKA和MARK p110。已知的tau蛋白磷酸化位点包括S199-202/T205、T231、T212/S214和S396，采用AT8、AT180、AT100和PHF-1抗体标记。磷酸化是一个连续的过程，特定位点的每次磷酸化都被认为是通过暴露关键结合位点为下一次磷酸化做准备。通常认为S396/PHF-1位点在该过程中被磷酸化较晚，主要与成对螺旋丝和缠结相关，但最近的研究表明S396/PHF-1位点在某些条件下甚至可能比S199-202/T205(AT8染色)位点更早被磷酸化。

Tau蛋白去磷酸化由蛋白磷酸酶介导，其中PP2A的功能占70％以上。研究表明，阿尔茨海默病患者的大脑PP2A活性低于正常值的50％，这种激酶和磷酸酶活性失衡被认为是导致tau蛋白过度磷酸化和神经原纤维缠结形成的重要因素。请见图2。因此，PP2A在神经元替代物中被抑制，硫代适配子与负载纳米粒结合，用于鉴定这种过度磷酸化状态的表面标志物。

用于鉴定tau病理的组合物

在一个方面，提供了一种用于鉴定tau病理的组合物，所述组合物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含显像剂的脂质体连接。

在一些方面，所述tau病理细胞表面标志物为tau蛋白过度磷酸化的细胞表面标志物。Tau病理是指导致tau蛋白病的异常tau蛋白。Tau病理是由tau蛋白过度磷酸化所致。正常tau蛋白每摩尔蛋白含2-3摩尔磷酸盐，而过度磷酸化tau蛋白中的磷酸盐含量要高很多。Tau蛋白过度磷酸化导致神经原纤维缠结的形成。Tau蛋白存在于细胞内，难以直接检测。然而，发明人鉴定出与潜在tau病理相关的细胞表面标志物(即表位)。在一些实施例中，这些细胞表面标志物是采用Cell-SELEX方法鉴定出的表位，其中表现出tau病理的神经元或神经元细胞模型用作靶配体(如适配子)的靶。在一些实施例中，所述tau病理细胞表面标志物包括选自KRT6A、KRT6B、HSP和VIM的蛋白。

靶向配体

本文所使用的术语“靶向配体”包括任何可与脂质体连接的分子，以结合特定靶标，特别是识别tau病理。合适的靶向配体包括但不限于抗体、抗体片段、适配子、稳定适配子等。在一些实施例中，靶向配体可以是与tau病理细胞表面标志物特异性结合的适配子或稳定适配子。

本发明的靶向配体能够与表现出tau病理的细胞特异性结合。特异性结合是指区分选定靶标和其他潜在靶标，并与选定靶标有较高亲和力的结合。较高亲和力表示靶向配体的结合解离常数至少约为10^-8mol/m³，但在其他实施例中，靶向配体的结合解离常数可以至少为约10^-9mol/m³、约10^-10mol/m³、约10^-11mol/m³或至少为约10^-12mol/m³。

在一些实施例中，所述靶向配体为适配子。适配子是一种核酸，其通过非沃森-克里克碱基配对的相互作用以高度特异性和亲和力与特定靶分子或细胞结构结合。合适的适配子可以是单链RNA、DNA、修饰核酸或其混合物。适配子也可以采用线状或环状。在一些实施例中，适配子为单链DNA，而在其他实施例中，适配子为单链RNA。

适配子功能与核苷酸序列本身无关，而是基于多核苷酸形成的二级/三级结构，因此适配子最好视为非编码序列。核酸配体与靶分子的结合不是由核酸碱基配对决定，而是由适配子的三维结构决定。在溶液中，核苷酸链形成分子内相互作用，将分子折叠成复杂的三维形状。核酸配体的形状使其能够紧密结合在其靶分子的表面。除了表现出显著的特异性外，核酸配体通常以非常高的亲和力与其靶标结合，例如，大多数抗蛋白核酸配体的平衡解离常数在毫微微摩尔至低纳摩尔范围内。

适合用作靶向配体的适配子的长度没有特别限制，包括含有约10至200个核苷酸、约100个核苷酸或更少、约50个核苷酸或更少、约40个核苷酸或更少、或约35个核苷酸或更少的适配子。在一些实施例中，适配子的大小为约15-40个核苷酸。此外，在几乎所有已知的情况下，与适配子结合有关的非沃森-克里克型相互作用中涉及的各种结构基序，例如发夹环、对称和不对称隆起以及假结，可以在30个核苷酸或更少的核酸序列中形成。

在一些方面，适配子为稳定适配子，包括化学修饰，以增强其稳定性。修饰包括但不限于提供其他化学基团的修饰，将附加电荷、极化性、疏水性、氢键、静电相互作用和流变性引入核酸配体碱基或整个核酸配体。上述修饰包括但不限于2-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺修饰、4-硫尿苷取代、5-溴或5-碘尿嘧啶取代、主链修饰、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修饰、甲基化、异常碱基配对组合，如异碱基异胞苷和异胍等。修饰还可包括3’端和5’端修饰，如加帽。在一些实施例中，核酸配体包含在嘧啶残基的糖配基上由2’-氟(2’-F)修饰的RNA分子。

合适的稳定适配子还可以包括核苷酸类似物，例如黄嘌呤或次黄嘌呤、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、脱氧肌苷或甲基化胞嘧啶，如5-甲基胞嘧啶、N4-甲氧基脱氧胞嘧啶等。还包括多核苷酸类似物的碱基，例如甲基化核酸，如2’-O-methRNA、肽核酸、锁核酸、修饰肽核酸，以及其他任何与核苷酸或碱基作用相似的结构部分，例如，通过表现出与DNA或RNA中的一个或多个碱基的碱基互补性。

在一些实施例中，所述稳定配体包括硫代适配子。硫代适配子是其中一个或两个非桥氧原子被硫取代的适配子。氧被硫取代不仅增加了适配子的稳定性，而且在某些情况下还增加了其结合亲和力。

靶向配体(如适配子)通常与包含显像剂的脂质体连接。然而，本发明的另一方面涉及适配子本身。在一些实施例中，所述适配子包括稳定适配子。在另一些实施例中，所述稳定配体为硫代适配子。在一些实施例中，所述适配子或稳定适配子特异性结合tau病理。合适的适配子包括含DNA核苷酸序列的适配子，在某些情况下，所述DNA核苷酸序列选自由以下序列组成的组：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ ID NO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQID NO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ ID NO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

在一些实施例中，适配子位于两个引物核苷酸序列之间，这有利于扩增适配子序列，例如通过聚合酶链式反应(PCR)。例如，在一些实施例中，适配子的DNA核苷酸序列位于序列GATATGTCTAGAGCCTCAGATCA(SEQ ID NO:1)和CGGAGTTATGTTAGCAGTAGC(SEQ ID NO:2)之间。在其他实施例中，适配子的DNA核苷酸序列位于序列CGC TCG ATA GAT CGA GCT TCG(SEQ ID NO:3)和GTC GAT CAC GCT CTA GAG CAC(SEQ ID NO:4)之间。

适配子的选择

在一些实施例中，可采用SELEX方法鉴定与tau病理细胞表面标志物特异性结合的适配子或稳定适配子。可采用本领域已知的任何方法鉴定合适的核酸配体，例如Gold等人(美国专利第5,270,163号)所述的SELEX，通过援引以其全文并入本文。其他核酸配体鉴定方法见Gilman等人(美国专利申请号2011/0104667)的文章，通过援引以其全文并入本文。合适的适配子的鉴定见本文示例。

SELEX是一种为鉴定能通过其三维构象以高亲和力和特异性与靶分子结合的核酸而制定的策略。该技术包括从随机核酸库中鉴定对靶分子具有高亲和力的稀有核酸分子。该过程是迭代完成的，随后反复进行多轮选择和扩增。研究证明该程序针对许多靶分子分离紧密结合的寡核苷酸配体(适配子)非常有用，如核酸结合蛋白、非核酸结合蛋白和某些小分子。SELEX是一种有效的筛选方法，因为可以通过PCR进行迭代循环选择。

SELEX工艺通常包括确定靶分子，例如蛋白、小分子或超分子结构。创建随机寡核苷酸库(约1x10¹⁵个寡核苷酸)。在随机DNA库中，每个寡核苷酸的末端通常有引物结合位点，这为查找和PCR扩增与靶分子结合的寡核苷酸提供了一种有效的方法。靶分子暴露于寡核苷酸“库”中，库中的一些寡核苷酸将与靶标结合，从而确定靶特异性适配子。将非结合寡核苷酸与结合寡核苷酸分离。

适配子鉴定方法可能包括将以最大亲和力与靶分子结合的核酸与以较小亲和力与靶分子结合的核酸和完全不与靶分子结合的核酸进行一步分离，从而鉴定靶分子的核酸配体。在选择性分离方案产生的条件下，以较小亲和力与靶分子结合的核酸和完全不与靶分子结合的核酸不能与靶分子形成复合物，或者只能在短时间内与靶分子形成复合物。相比之下，分离方案的条件使以最大亲和力与靶分子结合的核酸能够与靶分子形成复合物，和/或在最长时间段内与靶分子结合，从而从候选混合物的剩余核酸中一步分离出对靶分子具有最大亲和力的核酸，即核酸配体。

可通过众多方法中的任何一种来完成分离，可通过所述方法对以最大亲和力与靶分子结合的核酸与以较小亲和力与靶分子结合的核酸和不与靶分子结合的核酸进行选择性一步分离。适当的分离程序包括HPLC梯度洗脱和凝胶电泳。

孵育后，用缓冲液洗涤混合物，去除未结合的靶分子。然后将结合有靶分子的磁珠与候选核酸混合物一起进行孵育。与靶分子结合的磁珠先装入HPLC柱中，之后再与候选混合物一起孵育。如果与靶分子结合的磁珠在与候选混合物一起孵育之前已装入HPLC柱中，则在HPLC柱中孵育候选混合物和靶分子。

待候选混合物与结合到磁珠上的靶分子孵育足够时间，形成磁珠/靶分子/核酸复合物后，对色谱柱进行HPLC梯度洗脱，获得靶分子的核酸配体。在洗脱过程中，流出物将富含对靶分子具有较高亲和力的核酸配体，最终的馏分包含对靶分子具有最高亲和力的核酸配体。

在一些实施例中，可采用Cell-SELEX方法鉴定与tau病理细胞表面标志物特异性结合的适配子或稳定适配子。Cell-SELEX利用复杂的全细胞作为靶标选择适配子。然后采用反选择策略分离出仅与靶细胞而不与对照细胞相互作用的适配子序列。通过该过程，可以在较短时间内选择一组细胞特异性适配子，即使不知道哪些靶分子存在于细胞表面，哪些膜分子可能在检测的病理中起重要作用。

在一些实施例中，可采用Conjugate-SELEX方法鉴定与tau病理细胞表面标志物特异性结合的适配子或稳定适配子。Conjugate-SELEX是对基本SELEX程序的改进，其中对整个适配子-脂质体偶联物的亲和力进行评估，而不是单独评估适配子。

测序

鉴定后，可对适配子进行测序。测序可采用本领域已知的任何方法。DNA测序技术包括采用标记终止子或引物在平板或毛细管中进行凝胶分离的经典双脱氧测序反应(Sanger法)、使用可逆终止标记核苷酸的合成测序、焦磷酸测序、454测序法、标记寡核苷酸探针库的等位基因特异性杂交、通过标记克隆库的等位基因特异性杂交进行合成测序，然后进行连接、聚合步骤中标记核苷酸掺入的实时监测、聚合酶克隆测序以及SOLiD测序。测序可采用本领域已知的任何方法。例如，参见Sanger等人(《美国国家科学院院刊》，74(12):5463 67,1977)、Maxam等人(《美国国家科学院院刊》，74:560-564,1977)和Drmanac等人(《自然生物技术》，16:54-58,1998)的文章，这些参考文献描述了常规整体测序技术的实例。也可参见Lapidus等人(美国专利第7,169,560号)，Quake等人(美国专利第6,818,395号)，Harris(美国专利第7,282,337号)，Quake等人(美国专利申请号2002/0164629)以及Braslaysky等人(《美国国家科学院院刊》，100:3960-3964,2003)的文章，这些参考文献描述了通过合成技术进行单分子测序的实例。上述参考文献均通过援引以其全文并入本文。

发明人鉴定了与tau病理特异性结合的适配子。适配子示例见表1。因此，在一些实施例中，适配子或稳定适配子包含选自由以下序列组成的组中的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ ID NO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ ID NO:15)、Tau_25(SEQ IDNO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ ID NO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQ ID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。在另一个实施例中，适配子或稳定适配子包含DNA核苷酸序列Tau_1(SEQID NO:5)和Tau_3(SEQ ID NO:6)，或同时包含二者。

表1：特异性结合tau病理的适配子

标识符	核苷酸序列	序列号
			Tau_1	CCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAAGTTCAC	SEQ ID NO:5
Tau_3	CCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAAGTCCAC	SEQ ID NO:6
			Tau_9	CCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAGGTTCAC	SEQ ID NO:7
Tau_11	CCCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAAGTTCA	SEQ ID NO:8
			Tau_10	CTCGTGGGTGTGTGGTGGTGTTGTTGTGTG	SEQ ID NO:9
Tau_13	CCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAAGCCCAC	SEQ ID NO:10
			Tau_8	CTCGTCCCACCACAACATCATCTCAACGCC	SEQ ID NO:11
Tau_4	CTCGTCCCACCACAACATTATCTCAACGCC	SEQ ID NO:12
			Tau_17	CTCGTGGGTGTACGGTGGTGTTGTTGTGTG	SEQ ID NO:13
Tau_5	CTCCGACGGGATGTTCGATGAGCACACACT	SEQ ID NO:14
			Tau_21	CCCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAAGTCCA	SEQ ID NO:15
Tau_25	CCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAGGTCCAC	SEQ ID NO:16
			Tau_7	CCCCCATTGGCTCCGCTCCACACAGCTTCA	SEQ ID NO:17
Tau_31	CCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAAGCTCAC	SEQ ID NO:18
			Tau_42	CCCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAGGTTCA	SEQ ID NO:19
Tau_14	CTCGTCCCACCACAACATTGTCTCAACGCC	SEQ ID NO:20
			Tau_19	CTCGTCCCACCACAACACCATCTCAACGCC	SEQ ID NO:21
Tau_15	CTCCGACGGGGTGTTCGATGAGCACACACT	SEQ ID NO:22
			Tau_56	CCCCCCGCGGTCTCCGCTCCACAAGTTCAC	SEQ ID NO:23
Tau_34	TGGGTGTGTGGTGGTGTTGTTGTGTGGGTG	SEQ ID NO:24
			Tau_23	CTCGCCCCACCACAACATCATCTCAACGCC	SEQ ID NO:25
Tau_99	CCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAAGTTCGC	SEQ ID NO:26
			Tau_102	CCCCCCCACGGTCTCCGCTCCACAAGCTCA	SEQ ID NO:27

在一些实施例中，所述靶向配体是特异性结合tau病理的抗体。本文所使用的术语“抗体”是指活化B细胞在受到抗原刺激后产生的一种蛋白，能够与抗原特异性结合，从而促进生物系统的免疫反应。全抗体通常由四个亚单位组成，包括两条重链和两条轻链。术语“抗体”包括天然和合成抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体或其片段。合适的抗体包括IgA、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgM等。合适的片段包括Fab Fv、Fab’F(ab’)₂等。单克隆抗体是一种特异性结合表位的单一特定空间和极性结构的抗体，因此被定义为与表位的单一特定空间和极性结构互补的抗体。在某些形式下，单克隆抗体也可以具有相同的结构。多克隆抗体是指不同单克隆抗体的混合物。在某些形式下，多克隆抗体可以是单克隆抗体的混合物，其中至少有两种单克隆抗体与不同的抗原表位结合。不同抗原表位可位于同一靶标、不同靶标或组合靶标上。抗体可采用本领域众所周知的技术制备，例如免疫宿主并收集血清(多克隆)，或制备连续杂交瘤细胞系并收集分泌蛋白(单克隆)。

靶向配体偶联物

在一些实施例中，所述靶向配体(如适配子)与脂质体或其他载体连接，用于靶向递送显像剂或检测剂。例如，显像剂或检测剂可封装在脂质体内。采用这种技术，本发明中与脂质体囊泡偶联的tau病理特异性适配子可向表达tau病理的细胞靶向递送显像剂或检测剂。在一些实施例中，单个靶向配体与脂质体连接。在其他实施例中，多个靶向配体与脂质体连接(如Tau_1和Tau-3)。

本文所使用的术语“脂质体”表示由脂质组成的囊泡结构。脂质通常具有含长烃链的尾基和亲水性头基。脂质排列形成脂质双层(即膜),其内部水环境适于容纳待释放的试剂(如显像剂)。这种脂质体的外表面可能含有与tau病理细胞表面标志物特异性结合的合适的靶向配体。例如，合适的脂质体平台可以是Alzeca Biosciences公司的“ADx”平台，包括氢化大豆L-α-磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(Chol)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(甲氧基(聚乙二醇)-2000)(DSPE-mPEG2000)和Gd(III)-DSPE-DOTA(大环钆成像部分，Gd(III)-DOTA，与磷脂1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)偶联)，以及与靶向配体DSPE-PEG-3400(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-3400])偶联的实体。

在一些实施例中，脂质体的膜可能包含至少三种类型的磷脂。该膜可能包含可能未经修饰的第一磷脂。合适的第一磷脂包括美国专利第7,785,568号和第10,537,649号公开的磷脂，所述专利均通过援引以其全文并入本文。在一个实施例中，第一磷脂为HSPC。该膜可能包含可由第一聚合物衍生的第二磷脂。合适的聚合物衍生第二磷脂包括美国专利第7,785,568号和第10,537,649号公开的磷脂。在一个实施例中，由第一聚合物衍生的第二磷脂为DSPE-mPEG2000。该膜可能包括由第二聚合物衍生的第三磷脂，其中第二聚合物最终与靶向配体偶联。合适的聚合物衍生的第三磷脂包括美国专利第7,785,568号和第10,537,649号公开的磷脂。在一个实施例中，由第二聚合物衍生的第三磷脂为DSPE-PEG-3400。

在一些实施例中，该膜可能包含能够稳定脂质体的位阻大体积赋形剂。合适的赋形剂包括美国专利第7,785,568号和第10,537,649号公开的赋形剂。在一个实施例中，所述能够稳定脂质体的位阻大体积赋形剂是胆固醇。

在一些实施例中，磷脂-聚合物靶向配体偶联物中的磷脂部分可由以下结构式表示：

变量m可以是以下数值之一：12、13、14、15、16、17或18。例如，m可以是14或16。在不同实施例中，第一磷脂、第二磷脂和磷脂-聚合物靶向配体偶联物中的任何一种的磷脂部分可以是：HSPC、DPPC、DSPE、DSPC或DPPE的其中之一。

在一些实施例中，磷脂-聚合物靶向配体偶联物中的聚合物部分是多元醇。形成含多元醇的聚合物的结构单元包括季戊四醇、乙二醇和甘油等单体多元醇。含多元醇的聚合物包括聚酯、聚醚和多糖等。合适的聚醚包括但不限于二醇，例如通式为HO-(CH₂CH₂O)_p-H的二醇，p≥1，如聚乙二醇、聚丙二醇和聚(四亚甲基醚)二醇。合适的多糖包括但不限于环糊精、淀粉、糖原、纤维素、甲壳素和β-葡聚糖。合适的聚酯包括但不限于聚碳酸酯、聚丁酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯，均以羟基作为末端基。含多元醇的聚合物包括分子量约为500,000Da或更小的聚合物，包括分子量约为300至100,000Da的聚合物。

在一些实施例中，磷脂-聚合物靶向配体偶联物中的聚合物部分包括亲水性聚(氧化烯)聚合物。亲水性聚(氧化烯)可以包括约10-100个重复单元，且其分子量例如约为500-10,000Da。亲水性聚(氧化烯)可能包括例如聚(氧化乙烯)、聚(氧化丙烯)等。磷脂-聚合物靶向配体偶联物中的聚合物部分可以通过酰胺或氨基甲酸酯基团与磷脂部分偶联。磷脂-聚合物靶向配体偶联物中的聚合物部分可以通过酰胺、氨基甲酸酯、聚(氧化烯)、三唑及其组合等偶联。例如，磷脂-聚合物靶向配体偶联物中的聚合物部分可由以下结构式之一表示：

变量n可以是约10-100的任何整数，例如约60-100、约70-90、约75-85或约77。

在一些实施例中，磷脂-聚合物靶向配体偶联物中的磷脂-聚合物部分可由以下结构式之一表示：

变量n可以是约10-100的任何整数，例如约60-100、约70-90、约75-85或约77。变量m可以是以下数值之一：12、13、14、15、16、17或18。例如，n可以是77，m可以是14。在另一个实例中，n可以是77，m可以是16。

靶向配体(例如适配子)可通过或不通过一个或多个连接体连接到磷脂-聚合物靶向配体偶联物的一个或多个聚合物(如PEG)部分。PEG部分可以是任何类型的PEG部分(线性、支链、多支链、星形、梳状或树枝状)，并且具有任何分子量。可使用相同或不同的连接体或不使用连接体将相同或不同的PEG部分连接到适配子。常见的连接体包括但不限于胺、硫醇和叠氮化物，可以包括磷酸基团。例如，在一些实施例中，所述靶向配体与聚乙二醇连接，所述聚乙二醇偶联至与所述脂质体结合的磷脂。

在一些实施例中，所述脂质体由膜组成，所述膜包含：选自HSPC、DPPC、DSPE、DSPC和DPPE的第一磷脂；胆固醇；由PEG衍生的DPPC、DSPE、DSPC和/或DPPE；由PEG和特异性结合tau病理细胞表面标志物的靶向配体衍生的DPPC、DSPE、DSPC和/或DPPE；被膜包封或与膜结合的显像剂。在另一些实施例中，所述靶向配体是硫代适配子，所述显像剂是MRI对比增强剂。

在一些方面，本发明提供了一种靶向组合物。所述靶向组合物包括与聚合物连接的磷脂，所述聚合物与靶向配体连接，所述靶向配体与tau病理细胞表面标志物特异性结合。所述磷脂可以是本文所述的任何磷脂。在一些实施例中，所述磷脂包括DPPC、DSPE、DSPC和DPPE中的一种或多种。同样，所述聚合物可以是本文所述的任何聚合物(如多元醇)。在一些实施例中，所述聚合物是聚乙二醇。

显像剂或检测剂

本文所述用于检测tau病理的组合物可以包括显像剂或检测剂。所述显像剂或检测剂通常与组合物的脂质体部分结合。所述显像剂或检测剂可以保持在脂质体内，也可以与脂质体偶联。在一个实施例中，所述显像剂或检测剂与连接磷脂的聚合物连接，其中该磷脂与形成脂质体的膜结合。在一个实施例中，所述显像剂或检测剂与连接磷脂的聚合物连接，其中该磷脂与形成含Gd(III)-DSPE-DOTA的脂质体的膜结合。

在一些实施例中，所述用于检测tau病理的组合物包括检测剂。检测剂包括GFP、生物素、胆固醇、荧光染料等染料、电化学活性报道分子以及含放射性残基的组合物，例如适用于正电子发射断层扫描(PET)检测的放射性核素，如¹⁸F、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁸²Rb或⁶⁸Ga。

在一些实施例中，所述用于检测tau病理的组合物包括显像剂。显像剂与检测剂的不同之处在于，显像剂不仅显示tau病理的存在，而且适用于各种成像方法，其中能够通过该成像方法创建并显示tau病理的组织区域的图像。显像剂包括近红外显像剂、正电子发射断层扫描显像剂、单光子发射断层扫描显像剂、荧光成分、放射性同位素和MRI对比剂等。

在一些实施例中，所述显像剂是MRI对比增强剂。往往很难通过MRI检测疾病，因为病区与周围健康组织的信号强度相似。在进行MRI检查时，显像剂也可以称为对比剂。MRI对比增强剂可以是非放射性MRI对比增强剂，可以是被膜包封或与膜结合的对比增强剂，也可以是既被膜包封又与膜结合的对比增强剂。例如，非放射性MRI对比增强剂可以既被膜包封又与膜结合，例如，双对比剂脂质体。脂质体组合物的特征在于每个粒子的弛豫率(以mM^-1s^-1计)至少约为以下一种或多种：100,000、125,000、150,000、165,000、180,000、190,000和200,000。采用MRI检测脂质体的制剂可在例如约1-3.5T或约1.5-3T的磁场范围内进行。非放射性MRI对比增强剂可包括钆。合适的非放射性MRI对比增强剂可以包括Gd(III)-DSPE-DOTA和(二乙烯三胺五乙酸)-双(硬脂酰胺)、钆盐(Gd-DTPA-BSA)。GdDTPA、GdDOTA、GdHPDO3A、GdDTPA-BMA和GdDTPA-BSA等顺磁性钆螯合物也是合适的已知MRI对比剂。参见授予Klaveness等人的美国专利第5,676,928号，通过援引以其全文并入本文。

Tau病理成像或检测方法

在另一个方面，本发明提供了一种对受试者进行tau病理成像的方法。所述方法包括对受试者施用可检测到有效量的靶向配体-脂质体偶联物，所述偶联物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含显像剂的脂质体偶联；对受试者的至少一个部位进行成像，确定该部位是否表现出tau病理。

术语“受试者”是指脊椎动物或无脊椎动物等动物。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，包括但不限于灵长类动物，包括类人猿和人类、马类(如马)、犬科动物(如狗)、猫科动物、各种驯养家畜(如生猪、猪、山羊、绵羊等有蹄类动物)，以及驯养宠物和动物园饲养的动物。在一些实施例中，受试者是人类受试者。在一些实施例中，受试者是阿尔茨海默病患病风险增加的受试者。阿尔茨海默病的风险因素包括遗传易感性、吸烟、糖尿病、头部受伤史、抑郁症和高血压。参见Burns A、Iliffe S.的文章(《英国医学杂志》，338:b158(2009))。

所述靶向配体-脂质体偶联物可以包括本文所述的任何特征。例如，在一些实施例中，所述靶向配体是适配子或稳定适配子，而在另一些实施例中，所述靶向配体是硫代适配子。在又一些实施例中，该方法中使用的适配子或稳定适配子包含选自由以下序列组成的组中的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ ID NO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQID NO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ ID NO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

在一些实施例中，本发明可提供一种生成受试者组织区域图像的方法，该方法包括对受试者施用可检测有效量的用于检测tau病理的组合物，以及生成受试者分布有含显像剂的组合物的部位(即组织区域)的图像。为了生成该组织区域的图像，有必要让可检测有效量的显像剂到达所述组织区域，但显像剂并不一定仅局限于该区域。然而，在一些实施例中，含显像剂的组合物靶向或局部施用，因此主要存在于所述组织区域。图像包括二维截面图和三维图像等。在一些实施例中，采用计算机分析显像剂产生的数据，以便生成视觉图像。所述受试者的组织区域或部位可以是受试者的器官，例如大脑、心脏、肺部或血管。在其他实施例中，所述受试者的部位可以是已知包括神经细胞的组织区域，例如大脑。成像方法包括光学成像、荧光成像、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层扫描和MRI等。可以考虑本领域技术人员已知的任何其他适当类型的成像方法。

在一些实施例中，所述显像剂是MRI对比增强剂，通过MRI测定结合水平。MRI是核磁共振的一种医学应用，其利用强磁场、磁场梯度和无线电波生成受试者某个部位的图像，从而形成身体解剖和生理过程的图像。MRI常用于神经成像、心血管成像、肌肉骨骼成像、肝脏成像和胃肠道成像。由于组织或血液的不同特性提供了自然的对比，因此用于解剖结构或血流成像的MRI不需要对比剂。然而，对于更具体的成像类型，可以使用外源性对比剂。关于神经成像技术的综述，参见Mehrabian等人的文章(《肿瘤学前沿》9:440(2019))。

本发明的另一方面可提供一种用于检测tau病理的方法。所述方法包括将生物样本与有效量的靶向配体-脂质体偶联物接触，所述偶联物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含可检测标记的脂质体偶联；洗涤生物样本，去除未结合的靶向配体脂质体偶联物；通过测定生物样本中剩余可检测标记的量来检测生物样本的tau病理。

检测标记的方法是本领域技术人员所熟知的。因此，举例来说，如果标记是放射性标记，检测方法包括闪烁计数器或放射自显影中的照相胶片。如果标记是荧光标记，可用适当波长的光激发荧光染料并通过检测产生的荧光来测定荧光标记。荧光可借助于照相胶片，采用电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等电子检测器进行目视检测。同样，可以通过为酶提供适当底物以及检测所得反应产物来检测酶标记。可将检测到的标记水平与对照水平进行比较，确定生物样本是否表现出tau病理的细胞表面标志物水平升高。

生物样本可以是哺乳动物的体液、血液(包括全血及其血浆和血清)等血清、CSF(脊髓液)、尿液、汗液、唾液、眼泪、肺分泌物、乳房吸出物、前列腺液、精液、粪便、宫颈刮片、囊肿、羊水、眼内液、粘液、呼出的水汽、动物组织、细胞裂解物、肿瘤组织、毛发、皮肤、口腔刮片、指甲、骨髓、软骨、朊病毒、骨粉、耳垢等，甚至来自外部或存档来源，如肿瘤样本(即新鲜样本、冷冻样本或石蜡包埋样本)。在临床试验过程中获得的体液或血清等样本可能是合适的生物样本。在一些实施例中，生物样本包括CSF或含有神经细胞的样本，例如神经(如大脑)组织样本。

生物样本可以是新鲜样本，也可以是储存样本。样本可储存不同时间，例如储存1小时、1天、1周、1个月或1个月以上。获得的生物样本可以明确用于本发明的方法，也可以是用于其他用途的样本，可以针对本发明的分析进行二次取样。在一些实施例中，对生物样本进行过滤、离心或以其他方式进行预处理，可有利于去除杂质或去除其他可能干扰生物样本分析的不良物质。

在一些实施例中，该方法包括从受试者身上获取生物样本的步骤。获取生物样本的方法根据所获取的生物样本的类型而变化，此类方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。例如，脑组织样本可以通过立体定向脑针活检获取，而脑脊液样本可以通过腰椎穿刺获取。

阿尔茨海默病

在一些实施例中，所述成像显示tau病理水平足以诊断受试者患有阿尔茨海默病。在另一些实施例中，该方法表明受试者患有早期阿尔茨海默病、患阿尔茨海默病的风险增加或两者兼有。足以诊断受试者患有阿尔茨海默病或早期阿尔茨海默病的tau病理水平可归因于反映细胞(如神经细胞)内tau蛋白磷酸化(如过度磷酸化)水平增加的细胞表面标志物水平增加。反映tau蛋白磷酸化水平升高的细胞表面标志物包括KRT6A、KRT6B、HSP和VIM等。

阿尔茨海默病是一种慢性神经退行性疾病，通常发病缓慢，随着时间的推移逐渐恶化，占痴呆症病例的60-70％。阿尔茨海默病的特点是大脑皮层和某些皮层下区域的神经元和突触缺失。这种缺失导致相应区域大面积萎缩，包括颞叶、顶叶、部分额叶皮质和扣带回退化。阿尔茨海默病是一种由大脑中异常折叠的淀粉样β蛋白和tau蛋白斑块聚集引起的蛋白错误折叠疾病(蛋白病)。

通常可诊断出中度阶段的阿尔茨海默病。通常，阿尔茨海默病的症状是认知功能障碍或缺陷，包括经医学和心理检查确诊的痴呆症、至少两个精神功能方面的问题以及记忆和其他精神功能进行性丧失，特别是在40岁至90岁之间开始出现症状的情况下，没有其他疾病可以解释痴呆症，也不存在其他可能类似痴呆症的病症，包括甲状腺功能减退、用药过度、药物相互作用、维生素B12缺乏症和抑郁症。随着疾病的进展，症状可能包括语言问题、定向障碍(包括容易迷路)、情绪波动、缺乏动力、不能自理和行为问题。在一些实施例中，本文所述的方法和组合物用于检测早期阿尔茨海默病，早期阿尔茨海默病可在一种或多种此类症状显现之前出现。因此，在一些实施例中，所述方法用于诊断未表现出任何其他阿尔茨海默病症状的受试者。

在一些实施例中，该方法还包括预防受试者患阿尔茨海默病或提供治疗。预防阿尔茨海默病包括改变生活方式和饮食，降低患阿尔茨海默病的风险。例如，阅读、棋盘游戏、解谜、演奏乐器、学习第二语言等智力活动，甚至常规社交，都会降低患阿尔茨海默病的风险。同样，日式或地中海式饮食等健康饮食也与降低患阿尔茨海默病的风险有关。

还发现了几种可用于治疗阿尔茨海默病相关认知问题的药物。这些药物包括他克林、卡巴拉汀、加兰他敏和多奈哌齐等乙酰胆碱酯酶抑制剂，以及NMDA受体拮抗剂美金刚。石杉碱甲是一种很有前途的治疗阿尔茨海默病的药物，非典型抗精神病药物可用于减少阿尔茨海默病患者的攻击性和精神病。

药物组合物

在一些实施例中，本文所述的组合物以药物组合物的形式给药。包含本发明所述组合物的药物组合物根据标准技术制备，还包含药学上可接受的载体。生理盐水通常用作药学上可接受的载体。其他合适的载体包括，例如水、缓冲水、等渗溶液(如葡萄糖)、0.4％生理盐水、0.3％甘氨酸等，包括用于增强稳定性的糖蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。上述组合物可通过众所周知的常规灭菌技术进行灭菌。所得水溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在给药前与无菌水溶液混合。根据近似生理条件的要求，所述组合物可含有药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。此外，本发明的脂质体组合物可悬浮在含有脂质保护剂的悬浮液中，该脂质保护剂可防止脂质在储存时受自由基和脂质过氧化反应损伤。α-生育酚等亲脂性自由基猝灭剂和铁草胺等水溶性铁特异性螯合剂均合适。

本发明脂质体组合物在药物制剂中的浓度差异很大，即从低于约0.05％，通常为或至少约2-5％，到高达10-30％(按重量计)，主要根据所选择的特定给药方式，通过液量、粘度等进行选择。例如，可以增加浓度以降低与治疗有关的液体负荷量。组合物的给药量将取决于所使用的特定适配子、病情治疗情况以及临床医生的判断。组合物的给药量通常足以提供治疗有效剂量的核酸。本领域技术人员可确定提供治疗有效剂量所需的组合物用量。典型剂量通常为每千克体重约0.01-50mg核酸，优选为每千克体重约0.1-10mg核酸，最优选为每千克体重约2.0-5.0mg核酸。小鼠的给药剂量通常为每20g小鼠50-100μg。

试剂盒

在一些实施例中，本发明还提供了用于制备上述脂质体复合物/组合物的试剂盒。该试剂盒可由上述现成材料和试剂制备。例如，该试剂盒可包括下列材料中的任何一种或多种：脂质体、核酸(浓缩或非浓缩)、亲水性聚合物、由适配子等靶向配体衍生的亲水性聚合物以及说明书。根据试剂盒的预期使用者和使用者的特定需要，可以制备多种试剂盒和组分。例如，如上所述，该试剂盒可包含用于将复合物靶向特定细胞类型的若干靶向部分中的任何一个靶向部分。

可以包括用于制备和使用脂质体复合物的指导材料。虽然指导材料通常包括书面或印刷材料，但不限于此。可以考虑任何能够存储该指导并将其传达给最终用户的介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(如CD ROM)等。此类介质可能包括提供该指导材料的互联网网站的地址。

在不同实施例中，说明书可以指导使用者执行本文所述的任何方法步骤。例如，说明书可以指导使用者通过使用本文所述的靶向脂质体组合物检测tau病理的存在来诊断受试者患阿尔兹海默病的风险。

为了更清楚地说明本发明的具体实施例，提供了不同的实例。然而，在本发明的范围内还有很多其他实施例，本发明的实施例并不限定于本文提供的具体实例。

实例

实例1—配体和靶标鉴定

鉴定细胞表面标志物的优秀方法包括众所周知的噬菌体展示技术(Koivunen等人，《生物化学杂志》268，20205–20210(1993))和cell-SELEX：一种针对细胞携带的靶标筛选DNA适配子的方法(Shangguan等人，《化学生物学和生物化学》8，603–606(2007))。发明人采用了cell-SELEX鉴定与分化为神经元表型的过度磷酸化SH-SY5Y细胞(一种神经母细胞瘤细胞系)结合的适配子。筛选和硫代适配子鉴定总结情况如图3所示。用视黄酸处理SH-SY5Y细胞可诱导具有轴突和神经突结构的神经元表型(图3A)。用冈田酸(PP2A的有效抑制剂)处理可诱导过度磷酸化，AT8抗体染色的核pTau Thr205/Ser202(图3B，上排)和PHF-1抗体染色的胞质pTau Ser396(图3B，下排)证明了这一点。

针对神经元细胞的细胞Cell-SELEX在“黑盒”模式下进行，通过差速离心分离细胞膜结合的硫代适配子，并使用前导序列特异性引物对其进行PCR扩增。硫代适配子起始库是一个有10¹⁵个硫代适配子的库，包含两个引物区(5’-GATATGTCTAGAGCCTCAGATCA-(N30)-CGGAGTTATGTTAGCAGTAGC-3’SEQ ID NO:28)的30个碱基随机序列。在第13轮和第21轮包括两个阴性SELEX步骤，包括筛选用视黄酸处理但未用冈田酸处理的细胞，从而模拟“正常”或非过度磷酸化的神经元。在上述步骤中，分离上清液，即未与细胞膜结合或未被内化的硫代适配子，以便进行扩增，从而确保筛选时依然存在的仅有的硫代适配子是选择性结合过度磷酸化神经元的硫代适配子。在第26次循环中鉴定的前250个序列如表2所示，该表位于本实施例1末尾。然后采用

法和

芯片对Cell SELEX(图3C)第26轮和选定中间轮(1、5、10、13、17、19、21、23、26)剩余的适配子进行下一代测序，随后使用Aptaligner代码进行序列比对。Lu等人，《生物化学》53，3523–3525(2014)。前20个序列属于三个不同的结构家族(图3E所示的树状图)。阴性筛选策略成功的证据如图3D所示，其中硫代适配子Tau_2(SEQ ID NO:218)(橙色条)在第10轮占据了库的主导地位，但是在第13轮的阴性筛选后，Tau_2(SEQ ID NO:218)几乎消失并被例如Tau_1(蓝条)所取代。Tau_1(SEQ IDNO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)和Tau_17(SEQ ID NO:13)的M-折叠结构显示出显著的相似性，这与它们与一致的选择性靶标的结合相一致。当以从头序列合成并暴露于过度磷酸化的SH-SY5Y细胞时，Tau_1(SEQ ID NO:5)和Tau_3(SEQ ID NO:6)与膜和轴突突起(图3G和3H)紧密结合。

硫代适配子Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_4(SEQ ID NO:12)和Tau_5(SEQ ID NO:14)的蛋白靶标通过亲和拉下(使用硫代适配子作为捕获剂)进行鉴定，随后进行质谱分析。使用换序DNA序列R4作为对照。用冷PBS缓冲液洗涤90-95％汇合的过度磷酸化神经转化SH-SY5Y细胞，并在PBS(含氯化钙和氯化镁的Dulbecco’s PBS)中分别与生物素化硫代适配子和R4(各24mM)于4℃的温度下孵育2小时，同时轻轻搅拌。孵育后，细胞在室温下用1％甲醛交联10分钟。用甘氨酸猝灭甲醛交联。将细胞从瓶中刮出，洗涤，用裂解液裂解，并用蛋白酶抑制剂混合物处理。裂解物在冰上冻融30分钟后，通过在4℃下10,000g离心2分钟进行澄清。

为了拉下交联蛋白，将等量的细胞裂解物与预洗涤的链霉亲和素磁珠在室温下连续转动孵育1小时。对磁珠进行蛋白消化，以分离靶蛋白，并处理样本进行质谱分析。每份样本做三次分析。原始数据文件经处理后，用Mascot Distiller生成Mascot通用格式，并使用内部服务器上运行的Mascot搜索引擎v2.3.02对SwissProt_2012_01(人类)数据库进行搜索。试验硫代适配子下拉中忽略对照(R4)下拉中的蛋白。留下来的被认为是独一无二的点击数。因此，Tau_1与HSPD1(emPAI>6)和KRT6A/KRT6B(emPAI～0.38)紧密结合。Tau_3与VIM(emPAI＝2.7)和HSPD1(emPAI～0.62)紧密结合。Tau_4与HSPD1(emPAI～1.08)和KRT6A(emPAI～0.79)结合。VisANT数据库产生了其中每一种与tau蛋白之间的联系，如图4所示。HSP的鉴定间接证实了细胞模型确实造成错误折叠。VIM在细胞骨架和膜中重新分布被认为与tau蛋白聚集体形成有关。然而，尚未进行任何机制研究。角蛋白9与tau病理有关，但与KRT6A/KRT6B无关。

硫代适配子Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_4(SEQ ID NO:12)和Tau_5(SEQ ID NO:14)分别用3’Cy3标签合成后，与P301S小鼠脑组织一起孵育，然后用其中一种pTau抗体AT100(指示晚期磷酸化)或AT8(指示早期磷酸化)复染。Tau_3染色最强，并以与AT100抗体高度相关的方式结合海马组织(图5A)，但与AT8(图5B)不相关，也未对正常脑组织(图5C)染色。因此，Tau_3是Tau磷酸化的合适标志物。

表2：SELEX第26次循环的前250个适配子序列(表2中标识符的数值与表1中标识符的数值相关)

实例2—在P301S小鼠tau蛋白沉积模型中，使用含钆的硫代适配子靶向脂质体纳米粒对体内过度磷酸化神经元进行MRI可视化

如上所述的体外和离体研究表明，Tau_3是一种合适的候选硫代适配子，可与AT100阳性的过度磷酸化神经元结合(指示晚期过度磷酸化)。因此，发明人选择测试Tau_3(SEQ ID NO:6)适配子在阿尔茨海默病蛋白病小鼠模型(P301S)中将负载纳米粒靶向tau病理部位的能力。此外，对Tau_1(SEQ ID NO:5)靶向纳米粒进行了测试，因为它们在SELEX筛选中最常见，尽管没有表现出以pTau特异性方式在体外与小鼠脑组织结合。合成的适配子3’端具有可偶联的胺端，并通过碳二亚胺化学方法(EDC+磺基-NHS)与含羧基的脂质体(HSPC:胆固醇:DSPE-DOTA-Gd:DSPE-PEG3400-COOH:MPEG2000DSPE:PE-罗丹明，31.3:40:25:0.5:3:0.2摩尔比)连接。更具体地说，脂质体的制备首先是将脂质和偶联物溶解在叔丁醇中，并在总脂质浓度为50mM的盐水中水合，然后通过400和200nm核孔径迹蚀刻膜挤出，然后用PBS透析并使用吸湿凝胶浓缩至100mM总脂质浓度。用2mM EDC和3mM磺基-NHS(相当于10倍过量的EDC)活化脂质体(5mL)，随后在pH 7.5下加入500μL适配子(共1μmole)，并在室温下反应2小时。脂质体在4℃下保存过夜后，使用截留分子量为1000kDa、pH为7.5的PBS透析，去除游离适配子。透析后，使用截留分子量为3000Da的离心柱将脂质体浓缩至1.9mL，并通过nanodrop进行分析，量化适配子浓度。估计每个脂质体上附着有约400个硫代适配子分子。相关程序在近期的出版物中有所描述，通过援引以其全文并入本文。Mu,Q.等人，《分子疗法-核酸》5，e382(2016)；Mann等人，《肿瘤靶点》2，298–304(2011)。

在MRI方面，对2、6和9月龄的P301S小鼠以及年龄匹配的非转基因同科小鼠进行了测试。该模型在6月龄时开始出现胞内tau病理，在9月龄时出现典型的胞内和胞外(幽灵)病理。这样，发明人对疾病的病理前期、病理发作期和病理晚期进行了测试。在注射前按照以下序列进行预扫描：T2加权FSE(2个外部平均值)—扫描时间：12min(解剖参考扫描)TR＝6500、TE＝80、SliceThk＝1.2mm、矩阵＝192x192、NEX＝2FA＝90、切片＝16、FOV＝30mm。T1加权SE(4个外部平均值)—扫描时间：14min。TR＝260、TE＝8.8、SliceThk＝1.2mm、矩阵＝192x192、NEX＝4FA＝90、切片(2D/3D)＝8/16、FOV＝30mm。T1加权GRE(5个翻转角)—扫描时间：7min。TR＝20、TE＝3.6、SliceThk＝1.2mm、矩阵＝192x192、NEX＝1FA＝[8 15 25 35 4570]°、切片＝16、FOV＝30mm。

然后用Tau_1(SEQ ID NO:5)适配子靶向脂质体、Tau_3(SEQ ID NO:6)适配子靶向脂质体或含有所有剩余成分(Gd螯合剂偶联物、罗丹明和基质脂质)的非靶向聚乙二醇化对照脂质体制剂处理动物。脂质体剂量为每只小鼠约250μL，校准为每千克体重0.2mmol Gd的总量。快速“定位扫描”证实了已加入对比剂，随后在麻醉恢复后将动物放回笼子，并允许对比剂在4天内循环、外渗并与靶标结合。在96小时标记处(从循环中清除对比剂后，任何剩余的对比剂必须以某种方式结合或隔离)，所有动物按与上述相同的顺序进行成像后，处死，采集大脑、肝脏、脾脏和肾脏进行后续分析。脾脏和肝脏组织的组织学检查显示对比剂蓄积(通过罗丹明信号可见)，但无明显毒性迹象。

Tau_1(SEQ ID NO:5)和Tau_3(SEQ ID NO:6)靶向脂质体似乎能与幼小(2月龄)P301s转基因动物的皮层、海马及丘脑和下丘脑的部分区域结合，但不与野生型同科小鼠(图5)的皮层、海马及丘脑和下丘脑的部分区域结合。在年龄段较大的动物中也得到了类似的结果。为了量化Tau_1(SEQ ID NO:5)和Tau_3(SEQ ID NO:6)靶向脂质体制剂的预测准确性，计算了Paxinos图谱第55节附近大脑区域(包括大脑皮层、海马和下丘脑)的1.2mm厚切片的信号增强。为此使用了45°GRE序列，因为该序列似乎具有最佳信号。在独立研究中，同一只动物在不同日期的基线信号强度的扫描-扫描可变性(95％置信区间)约为5％。因此，在每次对比时，涵盖所有3个年龄组的所有20只动物的信号强度变化采用6分量表进行量化：

1：绝对负值(<-10％)；2：很可能负值(-5％至-10％)；3：可能负值(0至-5％)；4：可能正值(0至+5％)；5：很可能正值(+5％至+10％)；6：绝对正值(>+10％)。

以基因型为金标准，使用JROCFIT计算器计算ROC曲线，以及预测准确性、敏感性和特异性。P301S小鼠在3月龄时开始出现突触tau病理，在约6月龄时出现胞内细丝，在约9月龄时出现神经原纤维缠结。在2月龄时很少有任何tau病理。值得注意的是，即使在2月龄小鼠中，适配子靶向纳米粒通过MRI显示阳性信号，估计准确性为80％(敏感性约为57％，特异性约为92％)。这是前所未有的结果，因为适配子靶向纳米粒可以在细胞内缠结形成之前预测tau病理发作。

实例3—T1图的信号量化

由于获取了多个翻转角图像，因此对造影前和造影后图像的实际T1值进行了计算。扰相梯度回波序列的信号方程为：

其中k为比例因子，[H]为自旋密度的函数。假设自旋密度恒定，相对于T2*的短TE与T1加权序列一致，可通过信号在多个翻转角的非线性拟合估计T1，这是一种众所周知的技术。

这种方法的优点是，虽然T1加权信号强度本身与对比剂浓度没有定量关系，但1/ΔT1值与浓度成正比，比例常数等于T1缩短剂的摩尔弛豫率。因此，可以通过这种方式估计局部对比剂浓度并量化局部给药量。此外，T1图是对比剂定位标志。由于T1图有效地考虑了所有翻转角的信息，因此T1图可以突出显示在单个翻转角不明显的变化，如图7所示，其中45°翻转角图像主要显示丘脑/下丘脑增强，但T1图还显示海马中T1明显缩短。

实例4—在P301S小鼠tau蛋白沉积模型中，使用含钆的硫代适配子靶向脂质体纳米粒对体内过度磷酸化神经元进行MRI可视化

制备了两种脂质体制剂(“ADx-Tau1”和“ADx-Tau3”)进行体内试验。ADx-Tau1制剂包含端氨基Tau-1(SEQ ID NO:5)适配子(5’-/5AmMC6/CGC TCG ATA GAT CGA GCT TCG CCCACG GTC TCC GCT CCA CAA GTT CAC GTC GAT CAC GCT CTA GAG CAC TG-3’-SEQ ID NO:256)。ADx-Tau3制剂包含端氨基Tau_3(SEQ ID NO:6)适配子(5’-/5AmMC6/CGC TCG ATAGAT CGA GCT TCG CCC ACG GTC TCC GCT CCA CAA GTC CAC GTC GAT CAC GCT CTA GAGCAC TG-3’-SEQ ID NO:257)。合成的适配子3’端具有可偶联的胺端，并通过已知的碳二亚胺化学方法(EDC+磺基-NHS)与含DSPE-PEG3400-COOH的脂质体连接。用于制备ADx-Tau制剂的脂质组成和摩尔比(％)为HSPC:胆固醇:DSPE-mPEG2000:DSPE-PEG3400-COOH:DSPE-DOTA-Gd＝31.5:40:3:0.5:25。含有约250-500个分子的Tau_1适配子和含有约150-400个分子的Tau_3适配子与脂质体偶联。

作为对照，还制备了缺乏靶向适配子的非靶向ADx-Tau制剂(“ADx-Un”)(制备为脂质双层时不含DSPE-PEG3400-COOH)，并纳入了体内研究。

在P301S小鼠Tau病理模型中测试了ADx-Tau制剂的功效。动物(野生型和转基因)在早期(2-3月龄)进行了ADx-Tau激活的MRI检查，以检测任何前体Tau病理。脑切片组织学分析显示，≥7月龄转基因小鼠的皮质、海马和脑干中有纤维状tau蛋白沉积。

在1T永磁扫描仪(M7系统，Aspect Imaging，Shoham，Israel)上进行MRI。使用2.5％异氟烷对小鼠进行镇静处理，并将小鼠置于带有集成面罩的定制床上，通过吸入(1-2％异氟烷)进行持续麻醉。通过置于小鼠腹部下方的气动控制压力垫监测呼吸速率。采用以下序列和扫描方案获取MR图像：(1)T1加权自旋回波(T1w-SE)序列(重复时间(TR)＝260ms，回波时间(TE)＝8.5ms，切片＝16，体素尺寸：0.16x0.16x1.2mm，扫描时间＝8min)，(2)快速自旋回波反转恢复(FSE-IR)序列，其近似于T1w-液体衰减反转恢复(T1w-FLAIR)序列(TR＝13500ms,TE＝86ms,TI＝2000ms,切片＝6，体素尺寸：0.16x0.16x2.4mm)。使用1T扫描仪是因为其场强更接近常用的临床1.5T，因此增加了这些小动物研究的转化相关性，而且Gd纳米粒的弛豫率在低场强时更高。静脉注射对比剂(ADx-Tau1、ADx-Tau3或ADx-Un)四天后，进行了延迟造影后扫描。使用T1w-SE和FSE-IR序列进行造影前和造影后扫描，参数如上所列。小鼠饲喂至7-9月龄后，使用AT100抗体处死进行死后脑组织学检查，以验证pTau病理。

为了说明小鼠之间的差异以及因定位或MR仪器因素造成的潜在伪影，确定了所有野生型和转基因小鼠的T1w-SE和FSE-IR序列的MR信号强度的平均值和标准偏差。然后估计两个序列的截留分子量阈值信号强度，设定为高于平均值的两个标准偏差，并以平均信号强度的百分比表示：5.1％(FSE-IR)和5.6％(T1w-SE)。

在OsiriX(版本5.8.5，64位)和MATLAB(版本2015a)中对MRI图像进行定性和定量分析。在OsiriX中采用阈值和人工分割相结合的方法进行大脑提取。通过量化图像栈中心附近皮质区的信号强度，评估造影前和延迟造影后图像之间的信号变化。通过评估造影前和延迟造影后皮质和海马的信号增强鉴定Tau蛋白阳性小鼠。通过整合感兴趣区域(ROI)的信号量化造影前和造影后图像之间的信号变化，感兴趣区域包括MRI容积中央切片的皮质组织。观测到ADx-Tau激活的Tau蛋白阳性小鼠延迟MR图像中的信号增强(由7-9月龄时共济失调和/或后肢瘫痪的基因型和表达表型确定)高于信号方差阈值，视为真阳性结果。相反，tau蛋白阴性小鼠造影前和延迟造影后图像之间的信号增强低于信号方差阈值被视为真阴性结果。按六分等级量表生成ROC曲线，以评估ADx-Tau的敏感性和特异性。通过由MRI鉴定的真阳性与真阳性总数的比率确定敏感性。将特异性确定为由MRI鉴定的真阴性与真阴性总数的比率。准确性以经验ROC曲线的曲线下面积(AUC)表示。

在2月龄转基因小鼠中，当tau蛋白沉积尚未发生时，注射ADx-Tau1或ADx-Tau3后MR信号增强，而野生型小鼠(图8)的信号增强较少。转基因小鼠注射非靶向制剂(ADx-Un)后，MR信号未见增强。P301S皮质脑切片AT100染色显示，相对于野生型小鼠(图9)，pTau水平升高。将7-9月龄时共济失调和/或后肢瘫痪的基因型验证和表达表型作为金标准进行比较，ADx-Tau1和ADx-Tau3适配子靶向粒子使用FSE-IR序列(图10)所得的准确性均在75％左右。

所有专利、专利申请和出版物以及本文引用的电子版材料全文均通过援引并入本文。上述详细描述和实例只是为了清楚地理解。因此，不应理解任何不必要的限制。本发明并不限于所显示和描述的具体细节，对于本领域技术人员来说显而易见的变化将包括在权利要求所限定的本发明内。

SEQUENCE LISTING

<110> Alzeca Biosciences, LLC

Texas Children's Hospital

<120> TARGETING LIGANDS FOR TAU PATHOLOGY

<130> Alzeca-122

<150> 62/871380

<151> 2019-07-08

<160> 257

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 1

gatatgtcta gagcctcaga tca 23

<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> Synthetic

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cggagttatg ttagcagtag c 21

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

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cgctcgatag atcgagcttc g 21

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> Synthetic

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gtcgatcacg ctctagagca c 21

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ccccccacgg tctccgctcc acaagttcac 30

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<213> Artificial Sequence

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ccccccacgg tctccgctcc acaagtccac 30

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ctcgtgggtg tacggtggtg ctgttgtgtg 30

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ctcgtcccac cacaacatta tctcaacgcc 30

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ctcgtgggtg tacggtggtg ttgttgtgtg 30

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<212> DNA

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<221> misc_feature

<222> (24)..(53)

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

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<223> Synthetic

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<213> Artificial Sequence

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<223> Synthetic

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> Synthetic

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> Synthetic

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 213

ctcgccgacc agatgaaggg gggtttactg 30

<210> 214

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 214

ctcgctgacc agatggaggg gggtttactg 30

<210> 215

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 215

ctcgctgacc aggtgaaggg gggtttactg 30

<210> 216

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 216

ctcgctggcc agatgaaggg gggtttactg 30

<210> 217

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 217

ctcgctgacc ggatgaaggg gggtttactg 30

<210> 218

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 218

ctcgctgacc agacgaaggg gggtttactg 30

<210> 219

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 219

ctcgctgacc agatgaaggg gggtttgctg 30

<210> 220

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 220

ctcgctgacc agatgagggg gggtttactg 30

<210> 221

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 221

ctcgctgacc agatgaaggg gggtttactg 30

<210> 222

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 222

ctcgctgacc agatgaaggg gggcttactg 30

<210> 223

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 223

ctgaccagat gaaggggggg tttactgggg 30

<210> 224

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 224

ctgaccagat ggaggggggt ttactggggg 30

<210> 225

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 225

ccgaccagat gaaggggggt ttactggggg 30

<210> 226

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 226

ctggccagat gaaggggggt ttactggggg 30

<210> 227

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 227

ctgaccaggt gaaggggggt ttactggggg 30

<210> 228

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 228

ctgaccggat gaaggggggt ttactggggg 30

<210> 229

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 229

ctgaccagat gagggggggt ttactggggg 30

<210> 230

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 230

ctgaccagat gaaggggggt ttgctggggg 30

<210> 231

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 231

ctgaccagat gaaggggggt ttactggggg 30

<210> 232

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 232

ctgaccagat gaaggggggc ttactggggg 30

<210> 233

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 233

gtgggtgtgt atgtgtggcg ggggtgcgtt 30

<210> 234

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 234

ggtgtattct ccgtggcggg ggtgcgttgg 30

<210> 235

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 235

ttgggtgtat tctccgtggc ggggtgcgtt 30

<210> 236

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 236

ctcgggttca tgtgttgtgt gggtgggggt 30

<210> 237

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 237

ggttcatgtg ttgtgtgggt gggggtgtgt 30

<210> 238

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 238

ctcggtgtcc agattgatgt tggggtgggg 30

<210> 239

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 239

tgggtgtgcg gtggtgttgt tgtgtgggtg 30

<210> 240

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 240

tgggtgtgtg gtggtgttgt tgtgtggatg 30

<210> 241

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 241

tgggtgtacg gtggtgttgt tgtgtgggtg 30

<210> 242

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 242

tgggtatacg gtggtgttgt tgtgtgggtg 30

<210> 243

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 243

tgggtgtacg gtagtgttgt tgtgtgggtg 30

<210> 244

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 244

tgggtgtacg gttgtgttgt tgtgtgggtg 30

<210> 245

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 245

ctcgtgggta tgcggtggtg ttgttgtgtg 30

<210> 246

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 246

ctcgtgggtg tatggtggtg ttgttgtgtg 30

<210> 247

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 247

ctcgcgggtg tgtggtggtg ttgttgtgtg 30

<210> 248

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 248

ctcgtgggtg tgtggtagtg ttgttgtgtg 30

<210> 249

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 249

ctcgtgggtg tgtggttgtg ttgttgtgtg 30

<210> 250

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 250

ctcgtgggtg tgtggtggtg ctgttgtgtg 30

<210> 251

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 251

ctcgtgggtg tgcggtggtg ttgttgtgtg 30

<210> 252

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 252

ctcgtgggta tacggtagtg ttgttgtgtg 30

<210> 253

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 253

ctcgtgggta tacggttgtg ttgttgtgtg 30

<210> 254

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 254

ctcgtgggta tacggtggtg ttgttgtgtg 30

<210> 255

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 255

ctcgtgggtg tacggtagtg ttgttgtgtg 30

<210> 256

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 256

ctcgtgggtg tacggttgtg ttgttgtgtg 30

<210> 257

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 257

ctcgtgggtg cacggtggtg ttgttgtgtg 30

Claims

1.一种用于鉴定tau病理的组合物，包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与含有显像剂的脂质体连接。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述靶向配体包括适配子。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述靶向配体包括稳定适配子。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述靶向配体包括硫代适配子。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述tau病理细胞表面标志物包括tau蛋白过度磷酸化的细胞表面标志物。

6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于采用指数富集的配体系统进化(SELEX)方法测定所述靶向配体与tau病理细胞表面标志物的特异性结合。

7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述靶向配体包含选自由以下序列组成的组中的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ IDNO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ ID NO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ IDNO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQ ID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于所述靶向配体包含DNA核苷酸序列Tau_1(SEQ ID NO:5)。

9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于所述靶向配体包含DNA核苷酸序列Tau_3(SEQ ID NO:6)。

10.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述tau病理的细胞表面标志物包括选自KRT6A、KRT6B、HSP和VIM的蛋白。

11.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于多个靶向配体与所述脂质体连接。

12.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述靶向配体与聚乙二醇连接，所述聚乙二醇偶联至与所述脂质体结合的磷脂。

13.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述显像剂包括磁共振成像(MRI)对比增强剂。

14.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述脂质体由膜组成，所述膜包含：

第一磷脂；

能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂；

由第一聚合物衍生的第二磷脂；

由与所述靶向配体偶联的第二聚合物衍生的第三磷脂；

被膜包封或与膜结合的显像剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于所述靶向配体包括硫代适配子，所述显像剂包括MRI对比增强剂。

16.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于：

所述第一磷脂包括HSPC；

所述能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂包括胆固醇；

所述由第一聚合物衍生的第二磷脂包括DSPE-PEG；

所述由与所述靶向配体偶联的第二聚合物衍生的第三磷脂包括与Tau_1和Tau_3中至少一种偶联的DSPE-PEG；

所述被膜包封或与膜结合的显像剂包括DSPE-DOTA-Gd。

17.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于：

所述第一磷脂包括HSPC；

所述能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂包括胆固醇；

所述由第一聚合物衍生的第二磷脂包括DSPE-PEG2000；

由与所述靶向配体偶联的第二聚合物衍生的所述第三磷脂包括与Tau_1(SEQ ID NO:5)和Tau_3(SEQ ID NO:6)中至少一种偶联的DSPE-PEG3400；

所述被膜包封或与膜结合的显像剂包括DSPE-DOTA-Gd。

18.根据权利要求17所述的组合物，其特征在于HSPC:胆固醇:DSPE-mPEG2000:DSPE-PEG3400:DSPE-DOTA-Gd的比率约为31.5:40:3:0.5:25。

19.根据权利要求18所述的组合物，还包括约有250-500个分子的偶联Tau_1(SEQ IDNO:5)。

20.根据权利要求18所述的组合物，还包括约有150-400个分子的偶联Tau_3(SEQ IDNO:6)。

21.一种对受试者进行tau病理成像的方法，所述方法包括：

(i)对受试者施用可检测到有效量的靶向配体-脂质体偶联物，所述偶联物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含显像剂的脂质体偶联；

(ii)对受试者的至少一个部位进行成像，确定该部位是否表现出tau病理。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述靶向配体包括适配子。

23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述靶向配体包括稳定适配子。

24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述靶向配体包括硫代适配子。

25.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶向配体包含选自由以下序列组成的组中的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ IDNO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ ID NO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ IDNO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQ ID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

26.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述部位包括受试者大脑的一部分。

27.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述成像显示的tau病理水平足以诊断受试者患有早期阿尔茨海默病。

28.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述显像剂是MRI对比增强剂，通过MRI测定结合水平。

29.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述tau病理细胞表面标志物包括选自KRT6A、KRT6B、HSP和VIM的蛋白。

30.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述脂质体由膜组成，所述膜包含：

第一磷脂；

能够稳定所述脂质体的位阻大体积赋形剂；

由第一聚合物衍生的第二磷脂；

由与所述靶向配体偶联的第二聚合物衍生的第三磷脂；

被膜包封或与膜结合的显像剂。

31.一种用于检测tau病理的方法，所述方法包括：

将生物样本与有效量的靶向配体-脂质体偶联物接触，所述偶联物包含与tau病理细胞表面标志物特异性结合的靶向配体，其中所述靶向配体与包含可检测标记的脂质体偶联；

洗涤生物样本，去除未结合的靶向配体脂质体偶联物；

通过测定生物样本中剩余可检测标记的量来检测生物样本的tau病理。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于生物样本由神经细胞组成。

33.根据权利要求31所述的方法，其特征在于所述靶向配体包括适配子。

34.根据权利要求31所述的方法，其特征在于所述靶向配体包括稳定适配子。

35.根据权利要求31所述的方法，其特征在于所述靶向配体包括硫代适配子。

36.根据权利要求31所述的方法，其特征在于所述靶向配体包含选自由以下序列组成的组中的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ IDNO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ ID NO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ IDNO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQ ID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

37.根据权利要求31所述的方法，还包括从受试者身上获取生物样本的步骤。

38.一种靶向组合物，包括与聚合物连接的磷脂，所述聚合物与特异性结合tau病理细胞表面标志物的靶向配体连接。

39.根据权利要求38所述的靶向组合物，其特征在于所述靶向配体包括适配子。

40.根据权利要求38所述的靶向组合物，其特征在于所述靶向配体包括稳定适配子。

41.根据权利要求38所述的靶向组合物，其特征在于所述靶向配体包括硫代适配子。

42.根据权利要求38所述的靶向组合物，其特征在于所述靶向配体包含选自由以下序列组成的组中的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ ID NO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ ID NO:15)、Tau_25(SEQ ID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ IDNO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ ID NO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQ ID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

43.根据权利要求38所述的靶向组合物，其特征在于所述磷脂包括DPPC、DSPE、DSPC和DPPE中的一种或多种。

44.根据权利要求38所述的靶向组合物，其特征在于所述聚合物包括聚乙二醇。

45.一种适配子或稳定适配子，包含选自由以下序列组成的组中的DNA核苷酸序列：Tau_1(SEQ ID NO:5)、Tau_3(SEQ ID NO:6)、Tau_9(SEQ ID NO:7)、Tau_11(SEQ ID NO:8)、Tau_10(SEQ ID NO:9)、Tau_13(SEQ ID NO:10)、Tau_8(SEQ ID NO:11)、Tau_4(SEQ ID NO:12)、Tau_17(SEQ ID NO:13)、Tau_5(SEQ ID NO:14)、Tau_21(SEQ ID NO:15)、Tau_25(SEQID NO:16)、Tau_7(SEQ ID NO:17)、Tau_31(SEQ ID NO:18)、Tau_42(SEQ ID NO:19)、Tau_14(SEQ ID NO:20)、Tau_19(SEQ ID NO:21)、Tau_15(SEQ ID NO:22)、Tau_56(SEQ ID NO:23)、Tau_34(SEQ ID NO:24)、Tau_23(SEQ ID NO:25)、Tau_99(SEQ ID NO:26)和Tau_102(SEQ ID NO:27)。

46.根据权利要求45所述的适配子或稳定适配子，其特征在于所述DNA核苷酸序列位于SEQ ID NO:1)和SEQ ID NO:2之间。

47.根据权利要求45所述的适配子或稳定适配子，其特征在于所述适配子或稳定适配子包括硫代适配子。