RU2766774C1 - Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A - Google Patents

Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A Download PDF

Info

Publication number
RU2766774C1
RU2766774C1 RU2021122490A RU2021122490A RU2766774C1 RU 2766774 C1 RU2766774 C1 RU 2766774C1 RU 2021122490 A RU2021122490 A RU 2021122490A RU 2021122490 A RU2021122490 A RU 2021122490A RU 2766774 C1 RU2766774 C1 RU 2766774C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ppargc1a
ccnd1
lymph nodes
copy number
regional lymph
Prior art date
Application number
RU2021122490A
Other languages
English (en)
Inventor
Денис Сергеевич Кутилин
Александр Владимирович Снежко
Мадина Мажитовна Кечерюкова
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2021122490A priority Critical patent/RU2766774C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2766774C1 publication Critical patent/RU2766774C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии. Предложен малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A. Рассчитывают относительную копийность генов (rC) по формуле rC=2-ΔC. При значениях rC CCND1 >(2,5±0,19)*10-3 и rC PPARGC1A <(4,1±0,02)*10-3 диагностируют метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов. При значениях rC CCND1 <(0,5±0,01)*10-3 и rC PPARGC1A >(6,9±0,72)*10-3 диагностируют отсутствие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов. Изобретение обеспечивает создание нового, простого в исполнении, недорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями праймеров для малоинвазивной диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может быть использовано для малоинвазивной диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки.
Рак шейки матки является наиболее частой злокачественной опухолью женской репродуктивной системы (см. Кечерюкова М.М., Снежко А.В., Вереникина Е.В., Меньшенина А.П., Адамян М.Л., Арджа А.Ю., Кечерюкова Т.М. Комплексная молекулярная характеристика рака шейки матки: маркеры метастазирования. Современные проблемы науки и образования. 2020; 2: URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29769). Примерно 50% больных РШМ являются кандидатами на хирургическое лечение в объеме радикальной гистерэктомии III типа. В результате подобных операций образуется обширная раневая поверхность и в забрюшинных пространствах малого таза в значительных количествах скапливается раневой экссудат, что может приводить к осложнениям, угрожающим жизни больных (см. Дигай Л.К., Шаназаров Н.А., Васьковская О.В., Асабаева Р.И. Клинико-экономический анализ диагностики и лечения больных раком шейки матки. Медицинская наука и образование Урала. 2012; 4 (72): 15-17.; Kenter G.G., Heintz A.P. Surgical treatment of low stage cervical carcinoma: back to the old days? Int J Gynecol Cancer. 2002;12(5):429-34). В настоящее время все неинвазивные диагностические методы не дают 100% точности в оценке распространенности опухоли. Основной проблемой является диагностика микро-метастазов в лимфоузлах размерами до 10 мм (см. Трухачёва Н.Г., Фролова И.Г., Коломиец Л.А., Усова А.В., Григорьев Е.Г., Величко С.А., Чернышова А.Л., Чуруксаева О.Н. Оценка степени распространенности рака шейки матки при использовании МРТ. Сибирский онкологический журнал. 2015;1(2):64-70).
Для эффективной и одновременно малоинвазивной ранней диагностики регионарных метастазов большим потенциалом обладает определение молекулярных маркеров во внеклеточной ДНК плазмы крови. К внеклеточной ДНК (внДНК) относится ядерная и митохондриальная ДНК из соматических и опухолевых клеток, подвергшихся апоптозу или некрозу; ДНК из клеток крови, вирусная и бактериальная ДНК (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Чубарян А.В., Туркин И.Н., Водолажский Д.И., Николаева Н.В., Лысенко И.Б. Изменение относительной копийности генетических локусов во внеклеточной ДНК у пациентов с аденокарциномой легкого. Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2017. № 3-2 (195-2). С. 74-82).
Анализ баз данных TCGA и многоэтапный лабораторный скрининг позволил выделить гены (CCND1 и PPARGC1A), показатель копийности которых можно использовать для малоинвазивной диагностики регионарных метастазов
Показатель копийности генов (Copy Number Variation (CNV)) - генетический полиморфизм, приводящий к изменению числа копий определенного гена, и, следовательно, уровня продукта этого гена - белка или не кодирующей РНК (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Карнаухов Н.С., Кит О.И. Изменение копийности генов в опухолевых клетках и внеклеточной ДНК у больных аденокарциномой лёгкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. 167(6). С. 731-738). Показатель CNV может выступать в качестве высокоспецифичного биологического маркера, позволяющего осуществлять как раннюю диагностику, так и молекулярное типирование опухолей (см. Колесников Е.Н., Максимов А.Ю., Кит О.И., Кутилин Д.С. Зависимость общей и без рецидивной выживаемости больных от молекулярно-генетического подтипа плоскоклеточного рака пищевода. Вопросы онкологии. 2019. 65(5). С. 691-700).
Ген PPARGC1A (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) является основным регулятором глюконеогенеза в печени, вызывающим повышенную экспрессию генов, участвующих в энергетическом метаболизме (см. Klein M.A., Denu J.M. Biological and catalytic functions of sirtuin 6 as targets for small-molecule modulators. Journal of Biological Chemistry. 2020; 295 (32):11021-11041). Это ген также является главным регулятором в митохондриального биогенеза. Кодируемый им белок влияет на поляризацию макрофагов посредством STAT6/PPAR и ингибирование образования провоспалительных цитокинов (см. Zago G., Saavedra P.H.V., Keshari K.R., Perry J.S.A. Immunometabolism of Tissue-Resident Macrophages - An Appraisal of the Current Knowledge and Cutting-Edge Methods and Technologies. Front Immunol. 2021; 12: 665782).
Ген CCND1 кодирует белок циклин D1. Циклины действуют как регуляторы циклин-зависимых киназ (CDK). Данный циклин образует комплекс и функционирует как регуляторная субъединица CDK4 или CDK6, активность которой необходима для межфазового перехода G1/S клеточного цикла. Мутации, амплификация и сверхэкспрессия этого гена часто наблюдаются в различных опухолях и могут способствовать онкогенезу (см. Musgrove E.A., Caldon C.E., Barraclough J., Stone A., Sutherland R.L.Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nature Reviews. Cancer. 2011, 11 (8): 558-72) Сверхэкспрессия циклина D1 коррелирует с более короткой выживаемостью больных раком и увеличением метастазов (см. Jares P., Colomer D., Campo E. Genetic and molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma: perspectives for new targeted therapeutics. Nature Reviews. Cancer. 2007, 7 (10): 750-62).
Поэтому, в качестве маркеров для малоинвазивной диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки допустимо использование показателя относительной копийности генов CCND1 и PPARGC1A.
Из патентных источников известны следующее изобретения:
1. «Способ визуализации "сторожевых" лимфатических узлов при раке эндометрия» (см. патент (19)RU(11)2705433(13)C1 от 7.11.2019). Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, гинекологии и лучевой диагностике, и может быть использовано для визуализации «сторожевых» лимфатических узлов при эндометриоидной аденокарциноме. Способ обеспечивает повышение точности, информативности и доступности визуализации «сторожевых» лимфатических узлов при раке эндометрия путем введения радиофармацевтического препарата на основе меченного технецием-99m наноколлоида гамма-оксида алюминия в шейку матки в две или четыре точки накануне операции, совмещения изображений ОЭКТ и МРТ и интраоперационного поиска «сторожевых» лимфатических узлов с помощью лапароскопического гамма-сканера.
2. «Способ прогнозирования неблагоприятного течения местнораспространенных форм рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека» (см. патент (19)RU(11)2504326(13)C1 от 20.01.2014). Изобретение относится к области медицины, а именно к онкогинекологии. Определяют иммунологические показатели: абсолютное количество лимфоцитов (лим_аб), TNFα (TNFα_к) и IL-10 (IL-10_к) в периферической крови, а также TNFα (TNFα_c) и IL-4 (IL-4_c) в цервикальной слизи. На основании полученных данных вычисляют показатель F(x): F(x)=9,265+1,749×(лим_аб)+0,013×(IL-4_c)+0,005×(IL-10_к)-0,410×(TNFα_к)-0,206×(TNFα_c). При значении F(x) больше 0,555 прогнозируют неблагоприятное течение опухолевого процесса, а если меньше - благоприятное течение.
Однако, описанные выше способы принципиально отличаются от нашего, обладают меньшей точностью, чувствительностью и специфичностью, чем предлагаемый нами.
Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A».
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для малоинвазивной диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки.
Технический результат достигается тем, что проводят определение показателя копийности генетических локусов CCND1 и PPARGC1A относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и высокспецифичных праймеров на матрице выделенной внДНК, рассчитывают относительную копийности гена (rC) по формуле rC =2-ΔCt, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔCt =Ct(ген мишень) – Ct(референсный ген), и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rC CCND1 >(2,5±0,19)*10-3 и rC PPARGC1A <(4,1±0,02)*10-3 диагностируют у пациентки метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов, а при значениях rC CCND1 <(0,5±0,01)*10-3 и rC PPARGC1A >(6,9±0,72)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов.
Сущность способа заключается в том, что образцы крови (8 мл крови и 2 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 600 g и 18ºС. Из плазмы крови выделяют внДНК фенол-хлороформным методом и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для локусов CCND1, PPARGC1A и GAPDH, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле 2 -ΔCt , где ΔCt =Ct(ген мишень) – Ct(референсный ген). Затем сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях rC CCND1 >(2,5±0,19)*10-3 и rC PPARGC1A <(4,1±0,02)*10-3 диагностируют у пациентки метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов, а при значениях rC CCND1 <(0,5±0,01)*10-3 и rC PPARGC1A >(6,9±0,72)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов (чувствительность 90%, специфичность 95%).
Заявленный анализ основан на определении количества копий генов CCND1 и PPARGC1A относительно референсного гена GAPDH во внДНК плазмы крови больных раком шейки матки, и последующем сравнении полученных значений интервалов копийности rC для этих генов с характерными для рака шейки матки с метастатическим поражением лимфоузлов или без поражения.
Заявленный способ включает следующие приёмы:
• выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;
• определение относительной копийности генетических локусов CCND1 и PPARGC1A методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной внДНК;
• анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;
• расчёт относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,
• сравнением rC пробы с прогностическими значениями копийности rC стандарт , определенными для больных раком шейки матки с метастатическим поражением лимфоузлов или без поражения.
Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для локусов CCND1, PPARGC1A и GAPDH. Дизайн праймеров (см. таблица 1) осуществлялся с использованием программы Primer-BLAST и базы данных NCBI GenBank.
Таблица 1
Праймеры для малоинвазивного способа диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A
Наименование праймеров Последовательность №ID
CCND1_F
CCND1_R		 TGAGGGACGCTTTGTCTGTC GCCTTTGGCCTCTCGATACA SEQ ID №1
SEQ ID №2
PPARGC1A_F
PPARGC1A_R		 CCGAGAGTTTCCGTTCCCTT
AAGAGGGTGTCTTCCGACAG		 SEQ ID №3
SEQ ID №4
GAPDH_F
GAPDH_R		 GCTGAACGGGAAGCTCACT
GCAGGTTTTTCTAGACGGCAG		 SEQ ID №5
SEQ ID №6
Заявленный способ осуществляется следующим образом:
На первом этапе образцы крови (8 мл крови и 2 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 600 g и 18ºС.
Из плазмы крови внДНК выделяют фенол-хлороформным методом в модификации: к плазме крови добавляют равный объем лизирующего буфера (10 мМ TrisHCl pH=8.0, 1мМ ЭДТА, 2% SDS, 1,5% меркаптоэтанол) и 50 мкл протеиназы К, инкубируют в термостате при 580С 30 минут; к полученному лизату добавляют равный объем щелочного фенола и хлороформа (соотношение 1:1), центрифугируют 30 минут 3000 об/мин при 18ºС. После разделения фаз отбирают водную фазу в отдельную стерильную пробирку. К водной фазе добавляют равный объем 95% изопропилового спирта и раствор 5М NaCl до концентрации 100 mM, пробирку охлаждают до -20ºС и инкубируют при этой температуре 45 минут. Далее центрифугируют 20 минут при 12700 об/мин и -10ºС, декантируют супернатант, а осадок промывают 80% этиловым спиртом, центрифугированием удаляют остатки этанола, высушивают осадок в твердотельном термостате и растворяют в 10 мМ ТЕ-буфере. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 0,3 нг/мкл.
Амплификацию проводят в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1,5 нг внДНК, 0,20 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl2, 1х ПЦР-буфер, 1х краситель EvaGreen, 0,2 е.а./мкл ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и по 400 нМ прямого и обратного праймеров для референсного локуса или гена-мишени.
Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере по следующей программе: t=950С в течение 3 мин. 40 циклов: t=950С в течение 10 с, t=570С (чтение сигнала) в течение 20 с, t=720С в течение 30 с.
Относительная копийность локусов CCND1 и PPARGC1A вычисляется следующим образом: определяют Ct для каждого целевого локуса и референсного GAPDH, далее рассчитывается величина ΔCt =Ct(ген мишень- CCND1 и PPARGC1A) – Ct(референсный ген - GAPDH) и копийность генетического локуса относительно референсного гена (rC) по формуле 2 -ΔCt .
Сравниваются полученные значения rC с интервалом прогностического коэффициента копийности:
• при значениях rC CCND1 >(2,5±0,19)*10-3 и rC PPARGC1A <(4,1±0,02)*10-3 диагностируют у пациентки метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов,
• при значениях rC CCND1 <(0,5±0,01)*10-3 и rC PPARGC1A >(6,9±0,72)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов (чувствительность 90%, специфичность 95%).
Предлагаемым способом было осуществлено обследование 100 пациенток, у которых был диагностирован рак шейки матки. Медиана возраста исследуемых составила 55,1±6,3 лет. У всех больных до хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК (как описано в способе).
Для 39 пациенток значения rC CCND1 находились в интервале от 2,31*10-3 до 5,11*10-3 , rC PPARGC1A в интервале от 1,24*10-3 до 4,08*10-3, что соответствует показателям rC характерным для метастатического поражения регионарных лимфатических узлов. У 35 пациенток при последующих обследованиях и манипуляциях было подтверждено метастатическое поражение лимфаузлов, у 4 больных раком шейки матки при последующих обследованиях и манипуляциях метастатические поражения лимфаузлов, выявлены не были, однако по прошествии 1 года наблюдения у 3 из них были обнаружены метастазы в разных органах (печень, легкие).
Для 61 пациентки значения rC CCND1 находились в интервале от 0,11*10-3 до 0,501*10-3 , rC PPARGC1A в интервале от 6,18*10-3 до 10,02*10-3, что соответствует показателям rC характерным для отсутствия метастатического поражения регионарных лимфатических узлов, позже подтвержденном при последующих обследованиях и манипуляциях.
Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводим следующие примеры.
Пример 1. Пациентка А., 1968 года рождения. По данным цитологического исследования злокачественная опухоль шейки матки. По данным УЗИ метастазы в регионарных лимфоузлах. До хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК. Были получены значения rC CCND1 =3,04*10-3 и rC PPARGC1A = 2,14*10-3, что соответствует показателям rC характерным для метастатического поражения регионарных лимфатических узлов. После хирургического вмешательства получен материал для гистологического анализа (ГА). Результаты ГА - G2 плоскоклеточный рак без ороговения, с инвазией 4,5 мм., в 1 лимфоузле метастаз (T1b1N1M0).
Пример 2. Пациентка С., 1977 года рождения. По данным цитологического исследования злокачественная опухоль шейки матки. По данным УЗИ метастазы в регионарных лимфоузлах отсутствуют. До хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК. Были получены значения rC CCND1 =0,24*10-3 и rC PPARGC1A = 7,75*10-3, что соответствует показателям rC характерным для отсутствия метастатического поражения регионарных лимфатических узлов. После хирургического вмешательства получен материал для гистологического анализа (ГА). Результаты ГА - G2 плококлеточный рак с ороговением, инвазией 12 мм., экзофитная форма (T2bNоMо).
Заявляемый способ, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданным для диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов при раке шейки матки, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с плазмой крови, занимает не более 5 часов.
Авторы: Кутилин Денис Сергеевич
Снежко Александр Владимирович
Кечерюкова Мадина Мажитовна

Claims (4)

1. Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A, включающий выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови, отличающийся тем, что проводят определение копийности генов CCND1 и PPARGC1A относительно референсного гена GAPDH методом ПЦР-РВ в присутствии высокоспецифичных праймеров на матрице выделенной внДНК, рассчитывают относительную копийность генов (rC) по формуле rC=2-ΔCt, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔCt=Ct(ген-мишень) – Ct(GAPDH), и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rC CCND1 >(2,5±0,19)*10-3 и rC PPARGC1A <(4,1±0,02)*10-3 диагностируют у пациентки метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов, а при значениях rC CCND1 <(0,5±0,01)*10-3 и rC PPARGC1A >(6,9±0,72)*10-3 у пациентки диагностируют отсутствие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена CCND1 используют праймеры: SEQ ID 1 и SEQ ID 2.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена PPARGC1A используют праймеры: SEQ ID 3 и SEQ ID 4.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для оценки уровня копийности гена GAPDH используют праймеры: SEQ ID 5 и SEQ ID 6.
RU2021122490A 2021-07-28 2021-07-28 Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A RU2766774C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021122490A RU2766774C1 (ru) 2021-07-28 2021-07-28 Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021122490A RU2766774C1 (ru) 2021-07-28 2021-07-28 Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2766774C1 true RU2766774C1 (ru) 2022-03-15

Family

ID=80736705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021122490A RU2766774C1 (ru) 2021-07-28 2021-07-28 Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2766774C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012271516A1 (en) * 2011-06-16 2014-01-23 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Biomarker compositions and methods
RU2750769C2 (ru) * 2020-12-22 2021-07-02 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) Способ диагностики метастазов в лимфатические узлы малого таза у больных резектабельным раком шейки матки

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012271516A1 (en) * 2011-06-16 2014-01-23 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Biomarker compositions and methods
RU2750769C2 (ru) * 2020-12-22 2021-07-02 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) Способ диагностики метастазов в лимфатические узлы малого таза у больных резектабельным раком шейки матки

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHOTTERL S. et al. Mistletoe-Based Drugs Work in Synergy with Radio-Chemotherapy in the Treatment of Glioma In Vitro and In Vivo in Glioblastoma Bearing Mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. Vol. 2019; Article ID 1376140. Published 3 July 2019. *
МКРТЧЯН Г.Б. Оценка эффективности детекции сигнальных лимфатических узлов методом флуоресценции у больных раком шейки матки. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Санкт-Петербург, 2019, 29 c. *
МКРТЧЯН Г.Б. Оценка эффективности детекции сигнальных лимфатических узлов методом флуоресценции у больных раком шейки матки. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Санкт-Петербург, 2019, 29 c. SCHOTTERL S. et al. Mistletoe-Based Drugs Work in Synergy with Radio-Chemotherapy in the Treatment of Glioma In Vitro and In Vivo in Glioblastoma Bearing Mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. Vol. 2019; Article ID 1376140. Published 3 July 2019. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Eissa et al. Integrative functional genetic-epigenetic approach for selecting genes as urine biomarkers for bladder cancer diagnosis
ES2608322T3 (es) Procedimiento para predecir la respuesta a la quimioterapia en un paciente que padece o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama recurrente
US20220186320A1 (en) MicroRNA Marker Combination for Diagnosing Gastric Cancer and Diagnostic Kit
US7507534B2 (en) Rapid efficacy assessment method for lung cancer therapy
CA2786860A1 (en) Diagnostic gene expression platform
ES2973607T3 (es) Métodos de análisis de la metilación del ADN y mutacional para la vigilancia del cáncer de vejiga
WO2017054325A1 (zh) 乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒
Carozzi et al. Association of human papillomavirus with prostate cancer: analysis of a consecutive series of prostate biopsies
US20120244531A1 (en) Method for providing information for diagnosing cancer using quantitative real-time pcr and kit for diagnosing cancer for the same
CN113981087A (zh) 一种用于辅助诊断胃癌的生物标志物及其应用
CN104694623A (zh) 一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物及应用
CN116970705B (zh) 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用
RU2766774C1 (ru) Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A
CN106460047B (zh) 用于鉴定癌前结肠直肠息肉和结肠直肠癌的方法及试剂盒
CN113355412A (zh) 用于辅助诊断癌症的甲基化标志物及试剂盒
RU2750472C1 (ru) Малоинвазивный способ диагностики серозной аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности на основании показателя копийности генов SULT1E1, CYP1B1 и ESR1
Ma et al. Discovery of candidate gene expression signatures in peripheral blood for the screening of cervical cancer
US20110097271A1 (en) Colon Cancer Associated Transcript 1 (CCAT1) As A Cancer Marker
EA010571B1 (ru) Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления
RU2451937C2 (ru) Способ диагностики рака молочной железы по уровню рнк интерлейкинов il-8 и/или il-18 в плазме крови
CN108796082A (zh) 长链非编码RNAs的应用
Thway et al. The comparative utility of fluorescence in situ hybridization and reverse transcription-polymerase chain reaction in the diagnosis of alveolar rhabdomyosarcoma
CN108165546A (zh) 一种miRNA生物标志物、组合物及其用途
WO2021191485A1 (es) Biomarcadores para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia con bcg, métodos y usos basados en los mismos
TWI670498B (zh) 一種用以評估大腸直腸癌肝轉移病患之預後的方法