CN108431605A

CN108431605A - 用于监测乳腺癌治疗的试剂和方法

Info

Publication number: CN108431605A
Application number: CN201680071652.1A
Authority: CN
Inventors: K·A·伊戈兰德; R·L·埃文斯; J·V·波塔拉
Original assignee: Good Health
Current assignee: Good Health; Sanford Health
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2018-08-21
Also published as: JP2021073190A; CN113848322A; EP3387441A1; US20210080462A1; JP2019505763A; EP3502701A3; WO2017100620A1; JP6818753B2; US20180348221A1; EP3502701A2

Abstract

本文公开了组合物以及它们在监测乳腺癌治疗的疗效和乳腺癌复发中的用途，所述组合物包含用于检测针对选自由A1AT、ANGPTL4、LRPIO、GFRA1、LGALS3、CST2、DKK1、CAPC、GRP78和GRN组成的组中的至少两种蛋白的人类自身抗体的试剂，其中抗体检测标志物中的至少一种选自由A1AT、LGALS3和CAPC组成的组。

Description

用于监测乳腺癌治疗的试剂和方法

交叉引用

本申请要求于2015年11月11日提交的序列号62/266189的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。

联邦资金声明：

本发明是在国家卫生研究院授予的拨款号P20GM103548的政府资助下进行的。政府在这项发明中具有一定的权利。

背景技术

诊断有局部乳腺癌(BCa)的女性的5年生存率为98.6％。区间阶段的生存率下降到83.8％，而远期阶段的生存率骤降至23.3％[3]。在首次诊断时仅5％的美国女性患有转移性BCa[4]；然而，大多数与BCa相关的死亡是由于不可治愈的转移性疾病[5]，而不是初步诊断。不幸的是，当患者出现症状例如呼吸短促、慢性咳嗽、体重减轻或骨骼疼痛时，最常发现BCa复发。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种包含至少2种抗体检测标志物的组合物，其中所述抗体检测标志物包含用于检测针对选自由以下组成的组中的至少两种蛋白的人类自身抗体的试剂：A1AT(α-1抗胰蛋白酶)(序列号：7)、ANGPTL4(血管生成素样4)(序列号：1)、LRP10(LDL受体相关蛋白10)(序列号：5)、GFRA1(GDNF家族受体α1)(序列号：3)、LGALS3(半乳凝素3)(序列号：8)、CST2(胱抑素SA)(序列号：6)、DKK1(Dickkopf WNT信号传导途径抑制剂1)(序列号：2)、CAPC(癌症中的细胞角蛋白相关蛋白)(序列号：9)、GRP78(78kDa葡萄糖调节蛋白)(序列号：12)和GRN(颗粒蛋白)(序列号：4)，其中所述蛋白中的至少一种选自由A1AT、LGALS3和CAPC组成的组。在一个实施方式中，组合物包含用于检测针对选自由A1AT、ANGPTL4、LRP10、GFRA1、LGALS3、CST2、DKK1、CAPC、GRP78和GRN组成的组中的至少3种蛋白的人类自身抗体的试剂。在另一个实施方式中，组合物包含用于检测针对所述组中的至少5、6、7、8或全部9种蛋白的人类自身抗体的试剂。在另外的实施方式中，组合物由2-1000种抗体检测标志物或4-500种抗体检测标志物组成。在另一个实施方式中，组合物包括用于检测针对ANGPTL4、GFRA1、LGALS3、DKK1和GRN中的至少2、3、4或全部5种的人类自身抗体的试剂。在另外的实施方式中，组合物还包含用于检测针对GAL1和MUC1中的一种或两种的人类自身抗体的试剂。在一个实施方式中，用于检测人类自身抗体的试剂包含至少两种蛋白或其抗原片段。在另一个实施方式中，所述至少两种蛋白或其抗原片段包含原生胞外结构域和/或原生分泌蛋白或其抗原片段。在另外的实施方式中，试剂被可检测地标记。在又另外的实施方式中，所述至少两种蛋白或其抗原片段表达为与可检测结构域融合，包括但不限于Fc结构域。在另一个实施方式中，试剂被固定在固体支撑物的表面上。

另一方面，本发明提供了用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：

(a)将来自正在进行或已经进行过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对选自由A1AT、ANGPTL4、LRP10、GFRA1、LGALS3、CST2、DKK1、CAPC、GRP78和GRN组成的组中的一种或多种蛋白的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及

(b)确定所述体液样品中针对所述一种或多种蛋白的自身抗体的量；

其中所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的减少表明了对受试者的乳腺癌治疗的疗效。

另一方面，本发明提供了用于预诊断乳腺癌复发的方法，其包括：

(a)将来自已经接受过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对选自由A1AT、ANGPTL4、LRP10、GFRA1、LGALS3、CST2、DKK1、CAPC、GRP78和GRN组成的组中的一种或多种蛋白的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及

其中所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的增加表明了受试者的乳腺癌复发的可能性。

在多个实施方式中，所述试剂包括用于检测针对所述蛋白中的3、4、5、6、7、8或全部9种的自身抗体的试剂。在另一个实施方式中，试剂包含本发明任何实施方式或实施方式组合的组合物。

在一个实施方式中，所述一种或多种试剂包含选自由ANGPTL4、GFRA1、LGALS3、DKK1和GRN组成的组中的2、3、4或全部5种蛋白或其抗原片段。

(a)将来自正在进行或已经进行过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对GRP78的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及

(b)确定所述体液样品中针对GRP78的自身抗体的量；

其中所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对GRP78的自身抗体的基线水平的增加表明了对受试者的乳腺癌治疗的疗效。

(a)将来自已经接受过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对GRP78的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及

(b)确定所述体液样品中针对GRP78的自身抗体的量；

其中所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对GRP78的自身抗体的基线水平的减少表明了受试者的乳腺癌复发的可能性。在另一个实施方式中，所述接触包括使用ELISA。在另外的实施方式中，体液样品包含来自受试者的血清样品。在一个实施方式中，在实施本发明的方法之前，受试者已经进行过移除原发性肿瘤的手术。在另一个实施方式中，受试者正在接受或已经接受过放射治疗和化疗，或激素治疗和化疗。在另一个实施方式中，所述接触包括使用纵向试验筛选，其中可以在单个测试和稀释中对所有靶向生物标志物进行检测和定量。在又另外的实施方式中，体液样品包含来自受试者的血液样品。在一个实施方式中，如果确定了所述自身抗体的量相对于来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平没有降低，则所述方法还包括改变施用于受试者的乳腺癌治疗。在另一个实施方式中，该方法用于检测乳腺癌复发。

附图说明

图1.随访12个月后，根据治疗方案针对11种肿瘤相关抗原的自身抗体水平相对于基线所观察到的几何平均变化(95％置信区间)。*表示p值<0.05。对于仅手术或单独治疗(即激素治疗、放射治疗或化疗)没有观察到显著变化。

图2.在诊断有用治疗HER2阳性乳腺癌的患者中针对ERBB2-rFc的抗体应答。在手术前瞬间、手术后6个月和12个月收集三次纵向抽血。实线表示在他们12个月随访时仍在接受治疗的患者，虚线代表在他们12个月随访前中止治疗的患者。浅绿色的圆圈表示患者BC-166，因为只获得了基线抽血。随着时间的推移，几何平均值为48、1206和600。随访水平显著高于基线(p<0.0001)，但6个月水平和12个月水平没有差异(p＝0.09)。

图3.随访6个月后，根据治疗方案针对11种肿瘤相关抗原的自身抗体水平相对于基线所观察到的几何平均变化(95％可信区间)。*表示p值<0.05。对于仅手术或单独治疗(即激素治疗、放射治疗或化疗)没有观察到显著变化。

具体实施方式

所有引用的参考文献通过引用以其全部内容并入本文。

在本申请中，除非另有说明，否则所使用的技术可以在多个公知的参考文献中的任一个中找到，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook,等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press),Gene Expression Technology(Methods inEnzymology,Vol.185,由D.Goeddel编辑,1991.Academic Press,San Diego,CA),“Guideto Protein Purification”in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis,等人1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique,2^ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),Gene Transferand Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.),和the Ambion 1998 Catalog(Ambion,Austin,TX)。

在第一方面，本发明提供了包含至少2种抗体检测标志物的组合物，其中所述抗体检测标志物包含用于检测针对选自由以下组成的组中的至少两种的人类自身抗体的试剂：A1AT(α-1抗胰蛋白酶)(序列号：7)、ANGPTL4(血管生成素样4)(序列号：1)、LRP10(LDL受体相关蛋白10)(序列号：5)、GFRA1(GDNF家族受体α1)(序列号：3)、LGALS3(半乳凝素-3)(序列号：8)、CST2(胱抑素SA)(序列号：6)、DKK1(Dickkopf WNT信号传导途径抑制剂1)(序列号：2)、CAPC(癌症中的细胞角蛋白相关蛋白)(序列号：9)、GRP78(78kDa葡萄糖调节蛋白)(序列号：12)和GRN(颗粒蛋白)(序列号：4)，其中所述蛋白中的至少一种选自由A1AT、LGALS3和CAPC组成的组。

本发明已经人出乎意料地发现针对所述蛋白的自身抗体为正在接受BCa和/或BCa复发治疗的受试者提供治疗疗效的指征。因此，本发明的组合物可以用于例如诊断试验中以监测乳腺癌治疗的效力，和/或复发。在一个实施方式中，组合物包含用于检测针对选自由A1AT、ANGPTL4、LRP10、GFRA1、LGALS3、CST2、DKK1、CAPC、GRP78和GRN组成的组中的至少两种蛋白的人类自身抗体的试剂。

在多个实施方式中，组合物包含用于检测针对所述组中的至少3、4、5、6、7、8或全部9种蛋白的人类自身抗体的试剂或由其组成。在多个另外的实施方式中，组合物包含用于检测针对ANGPTL4、GFRA1、LGALS3、DKK1和GRN中的2、3、4或全部5种的人类自身抗体的试剂或由其组成。

在另外的实施方式中，组合物还包括用于检测针对GAL1和MUC1中的一种或两种的人类自身抗体的试剂。

在多个另外的实施方式中，组合物包含2-1000、3-1000、4-1000、5-1000、6-1000、7-1000、8-1000、9-1000、2-500、3-500、4-500、5-500、6-500、7-500、8-500、9-500、2-100、3-100、4-100、5-100、6-100、7-100、8-100、9-100、2-50、3-50、4-50、5-50、6-50、7-50、8-50、9-50、2-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25或9-25种抗体检测试剂或由其组成。

如本领域技术人员将理解的，所述组合物可以包括另外的抗体检测标志物和对照物，只要其适用于组合物的预期用途。

抗体检测标志物可以是可用于检测针对所述蛋白的抗体的任何合适的试剂，包括但不限于所述蛋白、蛋白的分泌形式(例如蛋白的原生分泌形式)或蛋白的胞外结构域。分泌蛋白更容易从肿瘤细胞递送到淋巴结，其中发生免疫细胞的相互作用以产生大量的高亲和性抗体。膜表面蛋白通常通过金属蛋白酶依赖性切割以可溶形式从肿瘤细胞释放。脱落蛋白比胞内蛋白更容易转移到淋巴结。因此，在一个实施方式中，抗体检测标志物可以是所述蛋白的分泌部分或膜部分。如所指出，所述人类蛋白的示例性氨基酸序列如下所示：

没有信号序列的全长蛋白：ANGPTL4、A1AT、CST2、DKK1、GFRA1、GRN、GRP78、GAL1、MUC1。

没有信号序列的胞外结构域：CAPC、LRP10。

全长(蛋白中未预测到信号序列)：LGALS3

ANGTPL4(序列号：1)

KSPRFASWDEMNVLAHGLLQLGQGLREHAERTRSQLSALERRLSACGSACQGTEGSTDLPLAPESRVDPEVLHSLQTQLKAQNSRIQQLFHKVAQQQRHLEKQHLRIQHLQSQFGLLDHKHLDHEVAKPARRKRLPEMAQPVDPAHNVSRLHRLPRDCQELFQVGERQSGLFEIQPQGSPPFLVNCKMTSDGGWTVIQRRHDGSVDFNRPWEAYKAGFGDPHGEFWLGLEKVHSITGDRNSRLAVQLRDWDGNAELLQFSVHLGGEDTAYSLQLTAPVAGQLGATTVPPSGLSVPFSTWDQDHDLRRDKNCAKSLSGGWWFGTCSHSNLNGQYFRSIPQQRQKLKKGIFWKTWRGRYYPLQATTMLIQPMAAEAAS

DKK1(序列号：2)

VSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH

GFRA1(序列号：3)

DRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNFSLASGLEAKDECRSAMEALKQKSLYNCRCKRGMKKEKNCLRIYWSMYQSLQGNDLLEDSPYEPVNSRLSDIFRVVPFISDVFQQVEHIPKGNNCLDAAKACNLDDICKKYRSAYITPCTTSVSNDVCNRRKCHKALRQFFDKVPAKHSYGMLFCSCRDIACTERRRQTIVPVCSYEEREKPNCLNLQDSCKTNYICRSRLADFFTNCQPESRSVSSCLKENYADCLLAYSGLIGTVMTPNYIDSSSLSVAPWCDCSNSGNDLEECLKFLNFFKDNTCLKNAIQAFGNGSDVTVWQPAFPVQTTTATTTTALRVKNKPLGPAGSENEIPTHVLPPCANLQAQKLKSNVSGNTHLCISNGNYEKEGLGASSHITTKSMAAPPSCGLSPLLVLVVTALSTLLSLTETS

GRN(序列号：4)

TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL

LRP10(序列号：5)

HPDRIIFPNHACEDPPAVLLEVQGTLQRPLVRDSRTSPANCTWLILGSKEQTVTIRFQKLHLACGSERLTLRSPLQPLISLCEAPPSPLQLPGGNVTITYSYAGARAPMGQGFLLSYSQDWLMCLQEEFQCLNHRCVSAVQRCDGVDACGDGSDEAGCSSDPFPGLTPRPVPSLPCNVTLEDFYGVFSSPGYTHLASVSHPQSCHWLLDPHDGRRLAVRFTALDLGFGDAVHVYDGPGPPESSRLLRSLTHFSNGKAVTVETLSGQAVVSYHTVAWSNGRGFNATYHVRGYCLPWDRPCGLGSGLGAGEGLGERCYSEAQRCDGSWDCADGTDEEDCPGCPPGHFPCGAAGTSGATACYLPADRCNYQTFCADGADERRCRHCQPGNFRCRDEKCVYETWVCDGQPDCADGSDEWDCSYVLPRK

CST2(序列号：6)

WSPQEEDRIIEGGIYDADLNDERVQRALHFVISEYNKATEDEYYRRLLRVLRAREQIVGGVNYFFDIEVGRTICTKSQPNLDTCAFHEQPELQKKQLCSFQIYEVPWEDRMSLVNSRCQEA

A1AT(序列号：7)

EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK

LGALS3(序列号：8)

MADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI

CAPC(序列号：9)

QVSATASPSGSLGAPDCPEVCTCVPGGLASCSALSLPAVPPGLSLRLRALLLDHNRVRALPPGAFAGAGALQRLDLRENGLHSVHVRAFWGLGALQLLDLSANQLEALAPGTFAPLRALRNLSLAGNRLARLEPAALGALPLLRSLSLQDNELAALAPGLLGRLPALDALHLRGNPWGCGCALRPLCAWLRRHPLPASEAETVLCVWPGRLTLSPLTAFSDAAFSHCAQPLALRDLAV

GAL1(序列号：10)

LRVRGEVAPDAKSFVLNLGKDSNNLCLHFNPRFNAHGDANTIVCNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGSVAEVCITFDQANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEAINYMAADGDFKIKCVAFD

MUC1(序列号：11)

APKPATVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPG

GRP78(序列号：12)

EEEDKKEDVGTVVGIDLGTTYSCVGVFKNGRVEIIANDQGNRITPSYVAFTPEGERLIGDAAKNQLTSNPENTVFDAKRLIGRTWNDPSVQQDIKFLPFKVVEKKTKPYIQVDIGGGQTKTFAPEEISAMVLTKMKETAEAYLGKKVTHAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGTIAGLNVMRIINEPTAAAIAYGLDKREGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTIDNGVFEVVATNGDTHLGGEDFDQRVMEHFIKLYKKKTGKDVRKDNRAVQKLRREVEKAKRALSSQHQARIEIESFYEGEDFSETLTRAKFEELNMDLFRSTMKPVQKVLEDSDLKKSDIDEIVLVGGSTRIPKIQQLVKEFFNGKEPSRGINPDEAVAYGAAVQAGVLSGDQDTGDLVLLDVCPLTLGIETVGGVMTKLIPRNTVVPTKKSQIFSTASDNQPTVTIKVYEGERPLTKDNHLLGTFDLTGIPPAPRGVPQIEVTFEIDVNGILRVTAEDKGTGNKNKITITNDQNRLTPEEIERMVNDAEKFAEEDKKLKERIDTRNELESYAYSLKNQIGDKEKLGGKLSSEDKETMEKAVEEKIEWLESHQDADIEDFKAKKKELEEIVQPIISKLYGSAGPPPTGEEDTAEKDEL。

在另外的实施方式中，抗体检测标志物是蛋白，例如以上公开的那些蛋白，其处于其原生形式。如所附实施例所公开的，本发明人利用真核表达系统来产生适当折叠并含有非连续表位的携带构象的肿瘤抗原，用于自身抗体的检测。在另一个实施方式中，所述试剂包含至少两种蛋白或其抗原片段，并且其中所述至少两种蛋白或其抗原片段表达为与可检测结构域融合。蛋白可以以任何合适的形式使用；在一个非限制性实施方式中，蛋白可以是表面结合型Fc融合蛋白或分泌的Fc融合蛋白。

在所有上述实施方式中，抗体检测试剂可以用可检测标记物进行标记。在一个实施方式中，用于检测针对一种蛋白的自身抗体的试剂的可检测标记物与用于检测针对另一种蛋白的自身抗体的可检测标记物是可区分的。用于检测标记物的方法包括但不限于光谱学技术、光化学技术、生物化学技术、免疫化学技术、物理技术或化学技术。可以使用任何合适的可检测标记。

组合物可以冷冻储存、以冻干形式储存或储存为溶液形式。在一个实施方式中，可以将组合物放置在固体支撑物的表面上。可以使用任何合适的固体支撑物。这种支撑物的实例包括但不限于微阵列、珠状物、柱状物、光纤维、擦拭物、硝化纤维素、尼龙、玻璃、石英、重氮化膜(纸或尼龙)、有机硅、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、陶瓷、金属、准金属、半导体材料、经涂覆的珠状物、磁性颗粒；塑料例如聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯；和凝胶形成材料、例如蛋白(例如明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯聚合物；溶胶凝胶；多孔聚合物水凝胶；纳米结构表面；纳米管(例如碳纳米管)和纳米颗粒(例如金纳米颗粒或量子点)。该实施方式有利于在多种检测试验中使用组合物。例如，可以使用抗IgG预涂覆微孔板的孔，并且可以将抗体检测试剂(例如本文讨论的蛋白)添加到预涂覆的孔中。

第二方面，本发明提供了用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：

(b)确定体液样品中针对一种或多种蛋白的自身抗体的量；

其中自身抗体的量相对于对照、例如来自受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的减少表明了受试者的乳腺癌治疗的疗效。

(b)确定体液样品中针对一种或多种蛋白的自身抗体的量；

其中自身抗体的量相对于对照、例如来自受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的增加表明了受试者的乳腺癌复发的可能性。

如以下实施例中所公开的，与基线水平相比(即：乳腺癌治疗开始之前)，一种或多种所述标志物的自身抗体的量随时间降低表明了有利的治疗应答，而自身抗体水平没有降低或增加表明了不利的治疗应答。鉴于所有因素，主治医疗人员确定乳腺癌治疗开始后，方法可以在任何合适的时间进行。在多个非限制性实施方式中，在治疗开始后，所述方法可以进行至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月等。如本领域技术人员将理解的那样，可以通过主治医疗人员认为适当的方式对指定的受试者进行该方法任何次数。因此，可以对指定的受试者进行该方法1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次，以监测治疗过程。在一个非限制性实施方式中，在乳腺癌治疗开始后6个月和/或12个月进行该方法。如本领域技术人员将理解的，该方法可以在治疗期间进行，也可以在完成治疗后进行，以监测可能的乳腺癌复发。

受试者可以是接受乳癌治疗的任何合适的受试者，包括但不限于人类受试者。如本文所用，“乳腺癌治疗”包括移除原发性乳腺肿瘤的手术放射治疗、化疗、治疗和/或激素治疗中的一种或多种。在一个非限制性实施方式中，受试者已经进行了移除原发性乳房肿瘤的手术并且正在接受选自放射治疗、化疗、治疗和/或激素治疗中的另外的治疗。在三个治疗组中观察到在基线与12个月的时间点之间针对9种TAA(即A1AT、ANGPTL4、CAPC、CST2、DKK1、GFRA1、GRN、LGALS3和LRP10)的应答水平显著降低。放射治疗+化疗、放射治疗+激素治疗以及放射治疗+激素治疗+化疗针对9种显著TAA的平均几何平均下降分别为-11％、-13％和-18％(图1)。放射治疗+化疗组中针对DKK1的自身抗体显著降低。放射治疗+激素治疗组中针对A1AT、CST2、GRN和LRP10的自身抗体应答显著降低。与其它抗原和方案相比，在放射治疗+激素治疗+化疗组中，A1AT和LRP10的自身抗体应答水平下降最大(分别为-26％和-28％)。放射治疗+激素治疗+化疗的三重疗法在减少针对TAA的自身抗体应答中比任何其它治疗组合更有效。该组在针对所有9种TAA的自身抗体应答中具有显著降低。

抗体检测标志物可以是可用于检测针对所述蛋白的抗体的任何合适的试剂，包括但不限于所述蛋白、蛋白的分泌形式(例如蛋白的原生分泌形式)或蛋白的胞外结构域。分泌蛋白更容易从肿瘤细胞递送到淋巴结，其中发生免疫细胞的相互作用以产生大量的高亲和性抗体。膜表面蛋白通常通过金属蛋白酶依赖性切割以可溶形式从肿瘤细胞释放。脱落蛋白比胞内蛋白更容易转移到淋巴结。因此，在一个实施方式中，抗体检测标志物可以是所述蛋白的分泌部分或膜部分。所述蛋白的分泌部分或膜部分的示例性氨基酸序列如本文所公开。因此，使用的试剂可以是用于检测针对选自由A1AT、ANGPTL4、LRP10、GFRA1、LGALS3、CST2、DKK1、CAPC、GRP78和GRN、其分泌部分或其膜部分组成的组中的一种或多种蛋白的自身抗体的任何合适的一种或多种试剂，包括但不限于本发明组合物的任何实施方式的试剂或其组合。在多个非限制性实施方式中，所述试剂包括用于检测针对所述组中的至少3、4、5、6、7、8或全部9种蛋白的人类自身抗体的试剂。在另一个非限制性实施方式中，试剂包括所述的蛋白或其抗原片段。这些蛋白可以是原生形式。在另一个实施方式中，所述试剂包含至少两种蛋白或其抗原片段，并且其中所述至少两种蛋白或其抗原片段表达为与可检测结构域融合。蛋白可以以任何合适的形式使用；在一个非限制性实施方式中，蛋白可以是表面结合型Fc融合蛋白或分泌的Fc融合蛋白。在另一个实施方式中，可以将试剂可检测地标记。在另一个实施方式中，可以将试剂结合到固体支撑物的表面。

在多个实施方式中，抗体检测标志物中的至少1、2、3、4或5种选自由A1AT、GFRA1、LGALS3、CAPC和CST2组成的组。在多个另外的实施方式中，抗体检测标志物中的至少1、2、3、4或5种选自由ANGPTL4、GFRA1、LGALS3、DKK1和GRN组成的组。

如下面的实施例所示，GRP78是仅有的在激素治疗+化疗组中出现自身抗体应答显著增加的TAA。因此，另一方面，本发明提供了用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：

(b)确定体液样品中针对GRP78的自身抗体的量；

其中自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对GRP78的自身抗体的基线水平的增加表明了受试者中乳腺癌治疗的疗效。

另一方面，本发明提供用于预诊断乳腺癌复发的方法，包括：

(b)确定体液样品中针对GRP78的自身抗体的量；

其中自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对GRP78的自身抗体的基线水平的减少表明了受试者中乳腺癌复发的可能性。

在每个这些方面的一个实施方式中，受试者正在接受或已经接受过激素治疗和化疗。

如本领域技术人员将理解的，所述方法可以包括使用另外的抗体检测标志物和对照，只要其适合组合物的预期用途。接触可以在用于促进体液样品中的自身抗体与试剂之间的结合以形成可检测的结合复合物的任何合适条件下进行。鉴于本文的教导，本领域技术人员基于预期试验可以确定适当的这种条件。类似地，可以在所述方法中使用任何合适的附加步骤，例如去除未结合的试剂的一个或多个洗涤步骤或其它步骤。

可以使用任何合适的检测技术，包括但不限于酶联免疫吸附试验(ELISA)、基于珠状物的试验平台(例如系统)、基于2-D阵列的试验平台(例如)和‘纵向试验筛选’平台，其可以能够通过单次测试和稀释将来自患者样品的所有列出的乳腺癌生物标志物以其临床相关浓度定量。在一个实施方式中，可以将组合物置于例如微阵列、载玻片、膜、微孔板或珠状物形式的固体支撑物上。该实施方式有利于组合物的使用。在实施例中提供了示例性的这种试验。

类似地，可以使用任何合适的体液，包括但不限于来自受试者的血清样品、血浆样品或血液样品。“血浆样品”是指血浆、血液的液体成分，例如通过将全血离心分离除去血细胞来制备。血清样品是去除了血液凝固因子的血浆样品。

在一个实施方式中，当自身抗体的量相对于来自受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平没有减少时，该方法还包括改变正在施用于受试者的乳腺癌治疗。由于自身抗体没有减少表明了对受试者不利的治疗结果，所以该实施方式允许根据主治医疗人员所认为的适当改变治疗(即：增加剂量，改变治疗等)以获得更有利的治疗结果。

在另一个实施方式中，任何实施方式或实施方式组合的方法用于检测乳腺癌复发。当确定自身抗体的量相对于来自受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平没有减少(或增加)时，所述方法提供了乳腺癌复发的指征。在治疗过程中患者的自身抗体水平下降支持将对这些自身抗体水平的检测用作复发的预诊断指征的可能性。如果癌症复发，则自身抗体水平增加，并且该增加将通过试验检测。

实施例1：根据治疗方式，乳腺癌患者针对肿瘤相关性抗原的纵向自身抗体应答减少

早期诊断乳腺癌(BCa)对于增加疾病存活率至关重要，不但是在最初得病时而且在复发时(1,2)。诊断有局部BCa的女性的5年生存率为98.6％。区间阶段的生存率下降到83.8％，远期阶段的生存率骤降到23.3％(3)。首次诊断时只有5％的美国女性患有转移性BCa(4)；然而，不可治愈的转移性疾病是造成大多数BCa相关死亡的原因(5)。不幸的是，当患者出现症状如呼吸短促、慢性咳嗽、头痛、体重减轻或骨骼疼痛时，最常发现BCa复发。一旦患者诊断有转移性BCa，治疗目的不再是治愈性的；相反，目标是尽可能长时间地控制疾病(6,7)。目前，对于在身体检查时没有临床表现的无症状患者，不推荐替代筛查方法(8)。在通过身体症状确认为转移时，患者无病生存的机会大大减少。没有早期发现无症状患者的复发是无法治愈转移性BCa的因素。

早期检测到原发性乳腺癌(BCa)肿瘤使医生意图治愈地对患者进行治疗。然而，大多数与BCa有关的死亡是由不可治愈的转移性疾病，而不是原发性肿瘤。目前还不清楚BCa的初步诊断和治疗后患者自身抗体水平发生了什么变化。开发了多重珠试验法以允许同时测量单个患者样品的针对32种携带构象的TAA的自身抗体应答。抗原选自膜相关性多核糖体cDNA文库(MAPcL)，其编码在BCa中高度表达的膜蛋白和分泌蛋白，并应当优先诱导患者的抗体应答。膜蛋白和分泌蛋白的构象特别重要，因为当抗原被适当折叠时，不连续表位将仅存在于抗体识别。产生表达构建体以编码与兔Fc(rFc)融合的TAA的胞外部分。开发了一种真核表达系统来产生携带构象的抗原，其通过内质网和高尔基加工以产生具有翻译后修饰的抗原。

基于珠的多重技术允许测量患者自身抗体与一组抗原生物标志物的相互作用，使得能够在单一测试中对所有生物标志物进行定量。微球技术(Luminex，Austin，TX)基于颜色编码的5.6微米珠，其被称为微球。这些珠对于每个区域以不同的水平在内部用两种不同的荧光染料标记，其在混合物中由不同的红色/红外发射光谱识别。同时，仪器测量预先加载在珠上的由TAA捕获的自身抗体的量，作为单独检测器通道中第二抗体的荧光水平。与微孔板孔的面积相比，珠具有小得多的用于固定捕获抗体的表面积；因此，需要较小的患者样品体积并且减少了与塑料表面的非特异性结合。

在治疗前、手术后6个月和12个月，从200名BCa患者收集三次连续抽血。测量这些样品针对32种TAA的自身抗体应答，并将随访样品中存在的水平与手术时的自身抗体水平进行比较。根据治疗方案(包括手术、化疗、放射治疗、曲妥珠单抗和激素治疗)对患者进行分类。在用包括放射治疗+化疗、放射治疗+激素治疗或放射治疗+激素治疗+化疗的治疗方案手术后12个月，针对9种TAA(A1AT、ANGPTL4、CAPC、CST2、DKK1、GFRA1、GRN、LGALS3和LRP10)的自身抗体应答显著降低。与手术后6个月相比，在手术后12个月时的自身抗体水平通常更低，这与在治疗过程中患者的肿瘤负荷降低一致。因此，该数据表明自身抗体水平响应于转移而增加，并且检测到这种改变可以用作复发的早期指标。

材料和方法

质粒构建和蛋白产生

简而言之，将跨膜蛋白的胞外结构域或分泌蛋白和胞内蛋白的全长序列克隆到pSecTag2-兔Fc或pFUSE-rFc1中。这些质粒包括分泌信号以及C-末端兔Fc(rFc)标签。用EFFECTENE^TM(Qiagen，Valencia，CA)将TAA-rFc质粒转染到293T细胞中，并将编码的蛋白分泌到细胞培养上清液中。转染后收集上清液，并用抗rFc夹心ELISA测量TAA-rFc含量。

偶联到磁珠的抗体

根据制造商的说明，利用AbC试剂盒(Luminex，Austin，TX)将山羊抗兔IgG Fc抗体(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)偶联到珠。简而言之，用EDC(1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)将珠活化20分钟。用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤后，以每1×10⁶个珠20μg的浓度将抗rFc抗体加入到珠中并避光温育2小时。再次洗涤珠并在4℃避光保存直至使用。在可以混合使用的32个珠区域上进行偶联，并通过100/200仪器(Millipore)在32个不同区域中进行区分。

将肿瘤相关性抗原-兔Fc融合蛋白加载到珠上

通过与含有分泌TAA-rFc融合蛋白的细胞培养上清液一起温育，用每种TAA-rFc融合蛋白包被与抗rFc抗体偶联的珠。将32种TAA-rFc融合蛋白中的每一种都与一个珠区域结合。在4℃将珠与融合蛋白以40μg/10⁶个珠温育过夜。在4℃在黑暗中将珠储存在PBS-TBN缓冲液(含有0.1％牛血清白蛋白、0.02％吐温20和0.05％叠氮化钠的PBS)中直至使用。

患者

病例的纳入标准是在Sanford Health,Sioux Falls,SD新诊断有BCa(任何类型)的30岁以上的女性。在乳房切除术、乳房肿瘤切除术、放射治疗、化疗或其它治疗之前，患者提供一根10ml EDTA管的血。如果潜在受试者以前有过任何类型的癌症病史，则将其排除在外。从09年10月8日至12年4月17日收集了来自200名BCa患者的血样。手术后对参加研究的患者随访一年，手术后6个月和12个月在随访肿瘤访视时获取抽血。从10年4月15日至13年8月27日收集了后续抽血。所有患者都提供了书面知情同意书，并且Sanford Health IRB批准了研究方案。

血浆收集和储存

在抽血12小时内将10ml EDTA管以2000×g离心10分钟。收集血浆作为上清液，等份放置并储存于-80℃直至试验自身抗体。

多重自身抗体珠试验

使用多重珠试验在单个孔中同时测量血浆样品中针对32种TAA的自身抗体。将来自32个不同区域的各自包被有不同的TAA-rFc融合蛋白的磁珠结合并将其分配到96孔圆底板的孔中。将来自BCa患者的血浆样品在FACS缓冲液(含有5％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的PBS)中以1:10稀释，并将200μl稀释的血浆施加至单个孔中的珠。将样品与珠在冰上温育2小时。然后使珠磁力沉淀并洗涤两次，最后一次抽吸时仅留下珠。作为第二抗体，在FACS缓冲液中将R-藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人IgG(JacksonImmunoresearch，West Grove，PA)以1:200稀释，并将200μl加入到每个孔的珠中。在冰上温育1小时后，将珠洗涤两次。将每个孔中的珠重新悬浮在200μl的FACS缓冲液中并在100/200仪器上分析，对于每个珠区域分析最少100个事件。每个平板包括仅次要阴性对照，以及与珠负载的TAA-rFc融合蛋白反应的PE山羊抗兔IgG(JacksonImmunoresearch，West Grove，PA)作为阳性对照。所有洗涤和抽吸步骤均使用具有磁性能的Biotek ELx405微孔板清洗机进行。

统计方法

每个96孔板具有针对所有自身抗体的阴性对照背景和阳性对照标准。此外，每位患者具有其在相同的96孔板中分析的基线、6个月和12个月的样品。对于每种自身抗体，使患者的中位荧光强度(MFI)值减去其平板MFI背景水平，然后偏移最小常数以使所有值至少为1。然后通过标准MFI与所有8个平板上的平均标准MFI之比将该值标准化。最后，对数值进行对数转换以稳定方差并产生更对称的分布，即自身抗体应答＝LN[(自身抗体-背景+常数)*(标准-背景)/(标准-背景)平均值]。为了测量精确度，针对阳性对照和阴性对照在各平板上计算每种TAA的批间CV。

在化合物对称性相关结构的情况下，作为探索性分析，使用重复测量ANOVA(方差分析)来对随时间推移(即6个月和12个月)的每种自身抗体相对于基线的几何平均变化进行模型化。模型包括放射治疗、激素治疗和化疗随着时间的指标变量之间的所有相互作用。这种方法包括初步分析的200例BCa患者中的183例；给予曲妥珠单抗作为治疗一部分的17例患者，由4组构成，通过检验其平均应答曲线进行二次分析。在6个月和12个月，针对所有8种治疗组合(其不包括)计算点估计值和95％置信区间(CI)，从而根据阳性结果的数量对自身抗体进行分级。由于对每种TAA测试了16个(在6个月和12个月的8种治疗)点估计值，所以每种TAA预计会有一个假阳性；因此，观察到的几何平均变化是针对具有3个或更多阳性结果的自身抗体水平而存在。p值<0.05用于归因于统计显著性，并且SAS(Cary，NC)版本9.3用于所有分析。

结果

从200名新诊断的BCa患者收集系列血浆样品(13)。本研究纳入的200名BCa患者的特征先前已由我们的实验室描述，包括人口统计学信息、肿瘤大小、肿瘤标志物状态、原位组分相对于侵袭性组分以及淋巴结涉入度(13)。在原发性肿瘤手术切除后6个月和12个月在治疗前获取抽血。为了确定患者在治疗过程中对癌症抗原的自身抗体应答，产生了由20种先前分析的TAA(13)和12种新选择的癌症抗原(表1)组成的32种TAA-rFc融合蛋白。先前开发的真核表达系统(13)用于产生用于多重免疫试验的所有携带TAA-rFc构象的抗原。将包括独特的红色/红外发射光谱的32组珠用抗兔IgG包被。将32种TAA-rFc融合蛋白附着到包被的珠上，随后在手术后6个月和12个月在治疗之前与从患者采集的血浆样品一起温育。用多重珠平台在基线(在治疗开始之前)处测量的32种自身抗体应答的平均批间CV针对低对照和高对照分别为的11.1％和11.4％(表2)。相比之下，ELISA平台自身抗体试验的封闭缓冲液对照的平均批间CV为12.4％(13)。多重系统极大地提高了试验通量并略微提高了再现性。

表1.用于产生rFc融合蛋白的附加候选物

表2.在珠平台上针对32种TAA的阴性对照和阳性对照的批间变异系数

对各个受试者根据初步诊断后12个月期间接受的治疗进行分类。在研究中的所有入选的BCa患者接受了用于切除原发性肿瘤手术，包括乳房肿瘤切除术或乳房切除术。除手术外，治疗还包括激素治疗、放射治疗和细胞毒性化疗的组合(表3)。72例患者接受了细胞毒性化疗，细胞毒性化疗包括以下方案之一：阿霉素/环磷酰胺+紫杉醇＝33例患者；环磷酰胺+紫杉醇＝22例患者；阿霉素/环磷酰胺＝5例患者；卡铂+紫杉醇＝6例患者；阿霉素+环磷酰胺/紫杉醇＝3例患者；阿霉素/环磷酰胺+卡铂/健择＝1例患者；卡铂+泰素帝+米托蒽醌＝1例患者；单独紫杉醇＝1例患者。不根据用于治疗的细胞毒性化疗药物的亚类对患者进行分析。如果患者接受上述化疗方案中的任一个，则将其视为化疗治疗组的一部分。根据治疗方案将研究参与者分组为12组，范围从手术后不治疗到施用所有治疗方式(表3)。十二组中的八组除了手术外接受了至少两种治疗的组合。三组除手术外接受了单一治疗，一组仅接受了手术。

表3.每种治疗方式和随访的患者抽血次数

*所有患者接受了切除原发性肿瘤的手术

主要探索性分析包括了200例患者中的183例，并包括了未接受治疗的8个患者治疗组(表3)。使用重复测量ANOVA来对6个月和12个月时每种自身抗体相对于基线的几何平均变化进行模型化，并且该模型包括放射治疗、激素治疗和化疗随着时间的指示变量之间的所有相互作用。如果ANOVA模型在16个估计值(8组*由6个月和12个月的抽血组成的2个时间点)当中预测到至少3个抗原的显著变化，则将其选择用于进一步分析。使用该变量选择标准，该模型鉴定了11种抗原，这些抗原可能响应于手术后12个月内的治疗具有显著调节的自身抗体信号。选择用于进一步研究的TAA包括：A1AT、ANGPTL4、CAPC、CST2、DKK1、GFRA1、GRN、GRP78、LGALS3、LRP10和NY-ESO-1。

计算6个月和12个月时针对11种TAA的相对于基线的实际几何平均变化(分别为图1和图3)。对于仅接受了手术或经手术和单一治疗(激素治疗、化疗或放射治疗)治疗的患者，未观察到针对11种抗原的自身抗体应答的显著变化。在12个月的时间点，GRP78是仅有的在激素治疗+化疗组中出现44％的自身抗体应答显著增加的TAA(图1)。尽管预测NY-ESO-1在重复测量ANOVA模型中具有显著的应答水平变化，但观察到的变化不显著(图1)。然而，在三个治疗组中观察到对11种TAA中的9种(即A1AT、ANGPTL4、CAPC、CST2、DKK1、GFRA1、GRN、LGALS3和LRP10)在基线与12个月时间点之间的应答水平显著降低。放射治疗+化疗、放射治疗+激素治疗和放射治疗+激素治疗+化疗针对9种显著TAA的平均几何平均下降分别为-11％、-13％和-18％(图1)。与其它抗原和方案相比，在放射治疗+激素治疗+化疗组中，A1AT和LRP10的自身抗体应答水平下降最大(分别为-26％和-28％)。放射治疗+激素治疗+化疗的三联治疗在减少针对TAA的自身抗体应答中比任何其它治疗组合对更有效。此外，手术后6个月时的几何平均应答下降为-15％(图3)，相比之下，在12个月时间点下降更大，为-18％。显然，在治疗过程中自身抗体水平降低，并且随着患者进一步脱离初始诊断，其随着时间的推移而继续减少。

12个治疗组中的4组(共17例患者)经受治疗，如下所示： (表2)。抗体治疗通常每三周施用一次达一年(27)。我们证实了，在患者血液中循环的抗体使用基于珠的试验产生了针对ERBB2抗原的信号。ERBB2抗体应答的几何平均水平从基线处的48中位荧光强度(MFI)增加到6个月时的1206MFI，然后在12个月时降低到600MFI(图2)。与基线相比，变化在6个月和12个月时显著(均为p<0.0001)，但6个月和12个月的水平之间没有显著差异(p＝0.09)。大多数患者在6个月的时间点对ERBB2有高应答，这与患者在该时间段期间接受治疗的事实一致。患者BC-166(图2，浅绿色圆圈)在异地医疗中心接受了治疗，因此未获得6个月和12个月的抽血。6例患者(图2，虚线)在12个月随访前中止了治疗。受试者BC-021对ERBB2的抗体应答非常低，这与她在中止治疗前仅接受两种治疗是一致的。对于其它5例已经中止治疗的患者，12个月抽血的抗ERBB2抗体应答与患者上次输注的月数呈负相关。患者BC-082在她6个月的随访后停用了而到12个月的随访时，MFI值已回到基线。患者BC-149、BC-013和BC-84脱离治疗4个月，分别具有110MFI、244MFI和994MFI的水平。在最后一次输注后3个月，对患者BC-016最终抽血，其应答水平为418MFI。在用治疗前，BC-013对ERBB2有强烈的内源性自身抗体应答，在基线时间点产生高信号(图2)。其余10例患者(BC-018、BC-019、BC-033、BC-038、BC-051、BC-054、BC-130、BC-158、BC-188和BC-189)在纵向抽血期间继续接受对ERBB2抗原的抗ERBB2抗体应答在6个月随访和12个月随访之间达到平衡(图2)。

讨论

本研究提供了关于手术后BCa患者发生的自身抗体应答的纵向变化的重要数据。我们能够用独特的多重珠试验法同时评价许多TAA。此外，关于病理学和治疗信息的丰富数据使得本研究的结果与施用于每位患者的治疗方案相关联。我们的结果表明，所选择的9种抗原的组合显示出有希望开发针对早期检测转移性疾病的自身抗体试验。

本研究从纵向抽血分析中收集的数据表明，对原发性肿瘤进行手术切除并开始治疗后，对TAA的自身抗体应答随时间而下降(图1)。大肿瘤的消失可能解释对TAA自身抗体产生减少。随着大部分癌细胞被移除，免疫系统暴露于较少的癌抗原。在不继续暴露于癌症抗原的情况下，免疫系统降低自身抗体产生的水平。令人惊讶的是，我们还发现，移除原发性肿瘤后施用的治疗对这些患者的自身抗体分布具有很大的影响。在6个月的时间点可以检测到抗体应答的显著变化(表2)，手术后12个月可以检测到更大的减少(表3)。这些样品中所见的变化归因于对该患者施用的治疗，但是确认这些治疗是根据BCa的每种亚型的特征。

为此，自身抗体应答水平下降最大的治疗方式组是放射治疗+激素治疗；放射治疗+化疗；和放射治疗+激素治疗+化疗(图1)。自身抗体应答水平发生显著变化的最受影响的三组共同点是放射治疗。然而，仅放射治疗不足以显著降低自身抗体的应答水平。经所有治疗(手术、激素治疗、化疗和放射治疗)联合治疗的患者，8种不同抗原的自身抗体应答水平显著降低(图1)。最后，激素治疗+化疗方案具有针对GRP78抗原的自身抗体应答的显著变化。这组患者没有接受放射治疗，针对GRP78的自身抗体应答是独特的，因为手术后12个月的应答显著增加而非下降(图1)。

数据初步分析显示，一组患者对ERBB2抗原应答高(图2)。在进一步评价后，我们确定从这些患者中移除的肿瘤是HER-2扩增的，并且这些患者是治疗的候选者。抗体识别并结合至ERBB2的原生口袋样结合区(33,34)。通过使用抗原产生构象携带方法，产生了模拟原生ERBB2蛋白构象的ERBB2-rFc融合蛋白(13)。我们的试验是测量存在于患者外周循环中的治疗性抗体对附着于珠的ERBB2抗原的应答(图2)。由于治疗通常每三周通过输注施用一次达一年(27)，所以这种应答用作我们的多重珠试验的“体内人类内标对照(spiked control)”。对应于患者的治疗时机，存在于患者循环中的抗体产生对于ERBB2-rFc融合蛋白的高水平应答。此前，II期研究确定了曲妥珠单抗的半衰期为每3周施用18至27天(35)。这段时间与HER-2扩增肿瘤患者治疗过程中和曲妥珠单抗治疗结束时抗ERBB2抗体应答的测量水平一致。对于在完成曲妥珠单抗治疗后3个月和4个月时进行最终抽血的患者，其针对ERBB2的抗体应答显著降低。一例患者在最后一次曲妥珠单抗输注后6个月进行抽血，其应答恢复至治疗前水平(图2)。

在图2中记录的在治疗过程中自身抗体应答显著降低的9种抗原(A1AT、ANGPTL4、CAPC、CST2、DKK1、GFRA1、GRN、LGALS3和LRP10)中，在之前发现在BCa的存在下可预测的7种抗原的组中存在4种：ANGPTL4、DKK1、GFRA1和GRN(13)。

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序列表

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K·A·伊戈兰德

R·L·埃文斯

J·V·波塔拉

<120> 用于监测乳腺癌治疗的试剂和方法

<130> 15-460-PCT

<150> 62/266189

<151> 2015-12-11

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 376

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

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260 265 270

Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln Ala Arg

275 280 285

Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu Thr Leu

290 295 300

Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg Ser Thr

305 310 315 320

Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys Lys Ser

325 330 335

Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys

340 345 350

Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro Ser Arg

355 360 365

Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala

370 375 380

Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu Leu Asp

385 390 395 400

Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met Thr

405 410 415

Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln Ile

420 425 430

Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys Val Tyr

435 440 445

Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly Thr Phe

450 455 460

Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu

465 470 475 480

Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr Ala Glu

485 490 495

Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Gln

500 505 510

Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp Ala Glu

515 520 525

Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp Thr Arg

530 535 540

Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile Gly Asp

545 550 555 560

Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu Thr Met

565 570 575

Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His Gln Asp

580 585 590

Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu Glu Ile

595 600 605

Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro Pro Pro

610 615 620

Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu

625 630 635

Claims

1.一种包含至少2种抗体检测标志物的组合物，其中，所述抗体检测标志物包含用于检测针对选自由以下组成的组中的至少两种蛋白的人类自身抗体的试剂：A1AT(α-1抗胰蛋白酶)(序列号：7)、ANGPTL4(血管生成素样4)(序列号：1)、LRP10(LDL受体相关蛋白10)(序列号：5)、GFRA1(GDNF家族受体α1)(序列号：3)、LGALS3(半乳凝素3)(序列号：8)、CST2(胱抑素SA)(序列号：6)、DKK1(Dickkopf WNT信号传导途径抑制剂1)(序列号：2)、CAPC(癌症中的细胞角蛋白相关蛋白)(序列号：9)、GRP78(78kDa葡萄糖调节蛋白)(序列号：12)和GRN(颗粒蛋白)(序列号：4)，其中，所述蛋白中的至少一种选自由A1AT、LGALS3和CAPC组成的组。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含用于检测针对选自由A1AT、ANGPTL4、LRP10、GFRA1、LGALS3、CST2、DKK1、CAPC、GRP78和GRN组成的组中的至少3种蛋白的人类自身抗体的试剂。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述组合物包含用于检测针对所述组中的至少5、6、7、8或全部9种蛋白的人类自身抗体的试剂。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含2-1000种抗体检测标志物。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含4-500种抗体检测标志物。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含用于检测针对ANGPTL4、GFRA1、LGALS3、DKK1和GRN中的至少2种的人类自身抗体的试剂。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含用于检测针对ANGPTL4、GFRA1、LGALS3、DKK1和GRN中的至少3、4或全部5种的人类自身抗体的试剂。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中，用于检测人类自身抗体的所述试剂包含至少两种蛋白或其抗原片段。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述至少两种蛋白或其抗原片段包含原生胞外结构域和/或原生分泌蛋白或其抗原片段。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中，所述试剂被可检测地标记。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的组合物，其中，所述至少两种蛋白或其抗原片段表达为与可检测结构域融合，包括但不限于Fc结构域。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，所述试剂被固定在固体支撑物的表面上。

13.一种用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：

其中，所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的减少表明了对受试者的乳腺癌治疗的疗效。

14.一种用于预诊断乳腺癌复发的方法，其包括：

其中，所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的增加表明了受试者的乳腺癌复发的可能性。

15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中，所述试剂包括用于检测针对所述蛋白中的3种或更多种的自身抗体的试剂。

16.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中，所述试剂包括用于检测针对所述蛋白中的5、6、7、8或全部9种的自身抗体的试剂。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种试剂包含根据权利要求1-12中任一项所述的组合物。

18.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种试剂包含选自由ANGPTL4、GFRA1、LGALS3、DKK1和GRN组成的组中的至少2种蛋白或其抗原片段。

19.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种试剂包含选自由ANGPTL4，GFRA1，LGALS3，DKK1和GRN组成的组中的至少3、4或全部5种蛋白或其抗原片段。

20.一种用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：

(a)将来自正在进行或已经进行过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对GRP78(序列号：12)的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及

(b)确定所述体液样品中针对GRP78的自身抗体的量；

其中，所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对GRP78的自身抗体的基线水平的增加表明了对受试者的乳腺癌治疗的疗效。

21.一种用于预诊断乳腺癌复发的方法，其包括：

(a)将来自已经接受过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对GRP78(序列号：12)的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及

(b)确定所述体液样品中针对GRP78的自身抗体的量；

其中，所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对GRP78的自身抗体的基线水平的减少表明了受试者的乳腺癌复发的可能性。

22.根据权利要求13-21中任一项所述的方法，其中，所述接触包括使用ELISA。

23.根据权利要求13-22中任一项所述的方法，其中，所述体液样品包括来自所述受试者的血液样品、血浆样品或血清样品。

24.根据权利要求13-23中任一项所述的方法，其中，所述受试者已经进行过移除原发性肿瘤的手术。

25.根据权利要求13-24中任一项所述的方法，其中，所述受试者正在接受或已经接受过放射治疗和化疗。

26.根据权利要求13-25中任一项所述的方法，其中，所述接触包括使用纵向试验筛选，其中可以在单个测试和稀释中对所有靶向生物标志物进行检测和定量。

27.根据权利要求20-24和26中任一项所述的方法，其中，所述受试者正在接受或已经接受过激素治疗和化疗。

28.根据权利要求13-27中任一项所述的方法，其中，确定了所述自身抗体的量相对于来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平没有降低，并且其中所述方法还包括改变施用于受试者的乳腺癌治疗。