CN113940999A - 一种治疗非酒精性脂肪肝性肝病治疗靶点的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物标记物，具体公开了TMEM182基因作为非酒精性脂肪肝生物标记物及治疗靶点的应用。本发明研究发现，TMEM182基因的表达量与非酒精性脂肪肝存在相关性，并发现TMEM182基因能够抑制肝脏中脂滴的积累。在高脂饮食诱导下的肥胖鼠中，超表达TMEM182基因使得脂肪肝中脂滴积累显著下降，并伴有体脂率降低的现象。本发明为研究治疗非酒精性脂肪肝的新型药物提供了一个新的靶点。

Description

一种治疗非酒精性脂肪肝性肝病治疗靶点的应用
技术领域
本发明涉及TMEM182基因靶向位点，具体地说，涉及TMEM182蛋白作为治疗非酒精性脂肪肝性肝病治疗靶点的应用。
背景技术
随着社会生活的改善，许多中老年人甚至青少年患有肥胖病，肥胖可引起一系列潜在的疾病，严重影响病人的生活质量。其中非酒精性脂肪肝性肝病就是一种由于非摄入过量酒精，肝脏脂肪累积过多造成的一种疾病，其恶化可导致肝硬化甚至成为肝癌，同时又可导致肌肉组织、脂肪组织的病变，危害身体健康。
根据国家统计局和国界卫计委的数据显示，从1992年到2015年，超重率从13%上升到30%，肥胖率从3%上升到12%。同时中国儿童和青少年的肥胖率也在快速增加，从2002年到2015年，儿童和青少年超重率从4.5%上升到9.6%，肥胖率从2.1%上升到6.4%。通过数据进一步分析，有1.73亿~3.1亿人患有非酒精性脂肪肝性肝病，成为“头号肝病”。
然而，针对这一问题，临床上仍然缺乏相关有效的药物和治疗方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一个新的非酒精性脂肪肝性肝病治疗的靶向位点。
为了实现本发明目的，本发明首先提供TMEM182蛋白作为治疗非酒精性脂肪肝性肝病治疗靶点的应用。
Haas 等人于2019年发表的在Nature Metabolism上的公共脂肪肝性肝炎和正常人对照的表达谱数据（数据地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgiacc= GSE106737）， 其中正常肝组织40例， 脂肪肝性肝炎NASH组织16例）。 发明人下载了Haas等人共享的数据库，而后进行了转录组再分析，结果发现，TMEM182基因在NASH病人中表达下调，且与对照相比具有显著意义（P=0.009）。从临床上，该结果提示TMEM182和脂肪性肝炎的相关性。
TMEM182(transmembrane protein 182),GeneID:100608,是一种蛋白编码基因。
发明人为了深入研究该基因的功能， 前期在公司定制了该基因的敲除鼠。发明人的研究发现，常规饮食诱导的2月龄敲除型(KO)小鼠的肝脏重量与同窝生野生(WT)小鼠的肝脏重量有显著性差异，而6月龄的 KO小鼠与WT小鼠相比，体重显著增加，并出现白色脂肪增多、非酒精性脂肪肝性肝病。
进一步地，本发明还提供了过表达TMEM182基因的载体在制备治疗非酒精性脂肪肝药物方面的应用。提高TMEM182蛋白在肝脏中的表达量，可抑制脂滴积累，缓解非酒精性脂肪肝，起到对非酒精性脂肪肝的治疗作用。
上面所述载体的制备方法为：将TMEM182基因CDS序列，构建到慢病毒包装质粒中。在本发明的具体实施方式中，将TMEM182基因的CDS序列，插入到pLV-EGFP-2A-puro质粒中，获得PLV-EGFP-2A-puro- TMEM182质粒，再将PLV-EGFP-2A-puro- TMEM182质粒与psPAX2和Pmd2.G（均为二代慢病毒包装质粒，均购自淼灵质粒平台）共转HEK293T细胞，于48-72h收集病毒。
因此，所述药物可用来减少生物体肝脏中脂滴的积累，还可用于降低生物体的体脂率。
本发明的有益效果在于：本发明发现TMEM182蛋白的表达量与非酒精性脂肪肝存在相关性，并发现TMEM182蛋白能够抑制脂滴积累。经研究发现，利用慢病毒超表达系统在敲除鼠中回补TMEM182，可以减少其肝脏中脂滴的积累，并降低体脂率。本发明为研究治疗非酒精性脂肪肝的新型药物提供了一个新的靶点。
附图说明
图1. TMEM182在非酒精性脂肪肝（NASH）中表达下调。纵坐标：TMEM182的相对表达水平。横坐标Control为正常对照（n=40），NASH为非酒精性脂肪肝(n=16)。通过双尾T检验，两组之间P=0.009。
图2为TMEM182基因敲除示意图。
图3为TMEM182敲除小鼠和野生型小鼠在2个月和6个月的体重变化。
图4为TMEM182敲除小鼠和野生型小鼠2-6个月的肝脏、褐色脂肪、白色脂肪体重占比。
图5为TMEM182敲除小鼠和野生型小鼠肝脏病理切片染色结果。
图6为TMEM182敲除小鼠和野生型小鼠6个月的肝脏病理切片染色结果 （n=5）。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
Haas 等人于2019年发表的在Nature Metabolism上的公共脂肪肝性肝炎和正常人对照的表达谱数据（数据地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query /acc.cgiacc=GSE106737）， 其中正常肝组织40例， 脂肪肝性肝炎NASH组织16例）。 发明人下载了Haas等人共享的数据库，进行了转录组数据的再分析，结果发现，TMEM182基因在NASH病人中表达下调，且与对照相比具有显著意义（P=0.009）（图1）。
实施例2
为了研究TMEM182在小鼠体内的作用，由南京模式动物中心制备TMEM182敲除小鼠。我们通过CRISPR / Cas9系统制造TMEM182基因敲除小鼠。将Cas9 mRNA和sgRNA共注入到受精卵中，在起始密码子ATG上游和终止密码子TAA下游切割sgRNA指导Cas9内切核酸酶，并产生双链断裂。这样的断裂将通过非同源末端连接（NHEJ）修复，并导致TMEM182基因缺失。小鼠将通过PCR进行基因分型，然后进行序列分析，通过杂合子之间的杂交，得到敲除TMEM182的纯合子。（图2）
鉴定引物：
709185-Tmem182-KO-tF1- AGCTAAGAGGGACCTGTCCA
709185-Tmem182-KO-tR1- GGGCATGTAGGTGGAGAAGA
709185-Tmem182-KO-tF1- AGCTAAGAGGGACCTGTCCA
709185-Tmem182-wt-tR1- GCTGCCCTCGTTGAGACTAA
PCR程序，95℃ 5 min;95℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 45 s,35个循环；72℃ 5 min。
实施例3
选取2月和6月龄的KO和WT小鼠。将其放在电子天平秤上，待示数稳定时，记录下每只小鼠的体重，并统计。断颈处死小鼠，取出脂肪、肝脏组织，称重并记录。
体重结果表明，2月龄的KO小鼠和WT小鼠体重无显著性差异（图3）, 6月龄的KO小鼠的体重显著高于WT小鼠（图3）。
结果表明，2月和6月龄KO小鼠肝脏、白色脂肪显著重于于同龄WT鼠（图4）。
实施例4
将2月和6月龄KO小鼠和WT小鼠的肝脏组织放在4%多聚甲醛溶液中固定，进行组织冲水、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片处理。将切好的组织进行HE染色，在显微镜下观察病理染色结果。
病理染色结果表明，2月龄KO小鼠和WT小鼠的肝脏组织无差异（图5）。而在6月龄时，KO小鼠肝脏有明显的脂肪变性（图5）
实施例5
将TMEM182 CDS插入到PLV-EGFP-2A-puro质粒（购自英茂盛业公司，货号Cat. No.VL3402）中。测序结果验证正确。将PLV-EGFP-2A-puro- TMEM182质粒与psPAX2和Pmd2.G（均为二代慢病毒包装质粒，均购自淼灵质粒平台）共转染HEK293T细胞，于48-72h收集病毒，并用0.45μm滤器过滤除去细胞碎片。将PLV-EGFP-2A-puro（简称LV-null，对照载体）和PLV-EGFP-2A-puro- TMEM182（简称LV- TMEM182）病毒浓度稀释到109 TU/ml，以尾静脉注射的方式注射到5月龄小鼠体内。4周后，将小鼠禁食过夜，次日麻醉、心脏取血处死，肝脏做石蜡切片并做HE染色，结果发现I.V.注射LV-null组与野生组相比存在很多脂滴，同时LV-TMEM182组脂滴减少，即存在表型回补现象（图6）。、
虽然，上文中已经用－般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.TMEM182蛋白作为非酒精性脂肪肝生物标记物的应用。
2.TMEM182蛋白作为非酒精性脂肪肝治疗靶点的应用。
3.一种治疗非酒精性脂肪肝的药物，其特征在于，所述药物靶向TMEM182。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物能够提高TMEM182的表达量。
5.根据权利要求3或4所述的药物，其特征在于，所述药物可减少生物体肝脏中脂滴的积累。
6.根据权利要求3或4所述的药物，其特征在于，所述药物可降低生物体的体脂率。
7.过表达TMEM182基因的载体在制备治疗非酒精性脂肪肝药物方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述载体的制备方法为：将TMEM182基因的CDS序列，构建到如慢病毒等载体包装的质粒中。
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