KR20150095780A

KR20150095780A - 세포 사멸 유도제

Info

Publication number: KR20150095780A
Application number: KR1020157018250A
Authority: KR
Inventors: 요시로 니이추; 히로키 니시타; 히로유키 타나카
Original assignee: 닛토덴코 가부시키가이샤
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-08-21
Also published as: US20150328248A1; US9914983B2; CA2895690A1; WO2014098210A1; BR112015014842A2; EP2937099A4; RU2015129287A; TW201440788A; CN104884090A; JP6340162B2; JP2014122175A; AU2013364893A1; CA2895690C; EP2937099A1

Abstract

본 발명은 세포에서 효과적으로 사멸 및/또는 증식 억제를 유도하기 위한 조성물 및 그것을 이용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 세포 사멸을 유도하기 위한 약제, 이를 포함하는 약학 조성물, 이를 이용한 세포 사멸의 이상에 따른 질환 처리 방법 등에 관한 것이다.

Description

세포 사멸 유도제{APOPTOSIS-INDUCING AGENT}

본 발명은 신규한 세포 사멸(apoptosis) 유도제, 세포 증식 억제제, 자가 소화 작용(autophagy) 억제제, 상기 세포 사멸 유도제, 세포 증식 억제제 또는 자가 소화 작용 억제 물질을 포함하는 약학적 조성물 및 세포 사멸, 세포 증식 또는 자가 소화 작용의 이상에 따른 질환의 신규한 치료 방법에 관한 것이다.

암은 인류가 직면하고 있는 가장 중요하고 빈번한 질환의 하나이며, 그 치료를 위해 엄청난 노력의 연구가 이루어지고 있다. 암은 유전자의 돌연변이와 유전자 외적 요인(epigenetic factor)의 이상 등에 의해, 세포가 아무런 제어없이 증식하는 질환이다. 암에 관한 유전자 이상은 이미 많은 것으로 보고되고 있으며(예를 들어, 비 특허문헌 1 등), 그 대부분이 세포 증식, 분화, 생존과 관련된 신호 전달에 어떤 관련을 갖을 것이라 생각되고 있다. 또한, 이러한 유전자 이상에 의해 정상적인 분자로 구성된 세포 내의 신호 전달 이상을 초래하고, 이것은 특정 신호 캐스케이드의 활성화 및 비활성화를 가져오며, 결국 세포의 이상 증식을 일으키는 원인 원인이 될 수 있다. 초기의 암 치료는 세포 증식 자체의 억제에 주안점을 두고 있었지만, 이러한 치료는 생리적으로 정상적이게 증식하는 세포 증식도 억제해 버리기 때문에, 탈모, 소화 장애, 골수 억제 등의 부작용을 동반하고 있다. 따라서, 이러한 부작용을 줄이기 위해 암 특유의 유전자 이상이나 신호 전달의 이상을 대상으로 한 분자 표적 약 등 새로운 발상에 기초한 암 치료제의 개발이 진행되고 있다.

글루타치온(glutathione) 화합물을 촉매하는 효소의 하나인 글루타치온 (glutathione)-S-전이 효소(GST), 특히 GST-π(glutathione S-transferase pi, GSTP1)의 발현이, 여러 가지 암 세포에서 증가하고 있으며, 이것이 일부 항암제에 대한 내성의 요인이 되고 있을 가능성이 지적되고 있다. 실제로 GST-π를 과잉 발현하고, 약물 내성을 나타내는 암 세포 계열에 GST-π에 대한 안티센스 (Antisense) DNA와 GST-π 저해 물질을 작용시키면, 약제 내성이 억제되는 것으로 알려져 있다(비 특허 문헌 2 내지 4). 또한, 최근 보고서는, GST-π를 과잉 발현하는 안드로겐 비의존성 전립선 암 세포 계열에 GST-π에 대한 siRNA를 작용시키면 그 증식이 억제되어 세포 사멸(apoptosis)이 증가하는 것으로 보고된바 있다(비 특허 문헌 5). 또한 KRAS 변이를 가진 암 세포 계열에 GST-π에 대한 siRNA를 작용시키면, Akt의 활성화가 억제되어 자가 소화 작용(autophagy)이 증가하지만, 세포 사멸(apoptosis) 유도는 중간 정도가 되는 것으로 보고되고 있다(비특허 문헌 6).

그러나 GST-π와 세포 증식 및 세포 사멸(apoptosis)과의 관계, GST-π 분자 메커니즘, 다양한 세포 내 신호 전달에 있어서 GST-π의 역할 등에 대해서는 아직 대부분 밝혀지지 않았다. 세포 내 신호 전달은 매우 복잡하고, 하나의 분자가 여러 분자의 작용에 영향을 주거나, 반대로 하나의 분자가 여러 분자의 영향을 받거나 할 수 있는데다, 분자의 작용을 억제해도 다른 신호 캐스케이드(Signaling cascade)가 활성화되어 원하는 효과를 얻지 못할 수 있다. 따라서 더 우수한 분자 표적 약의 개발에는 복잡하게 얽힌 세포의 신호 전달 메커니즘의 규명이 필요하지만, 오랜 연구에 의해 그 극히 일부가 규명되고 있는 것에 지나지 않아 더욱 노력이 요구되고 있다.

비특허문헌1: Futreal et al., Nat Rev Cancer. 2004;4(3):177-83 비특허문헌2: Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994;21(7):945-51 비특허문헌3: Ban et al., Cancer Res. 1996;56(15):3577-82 비특허문헌4: Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003;306(3):861-9 바특허문헌5: Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008;29(6):1134-8 非특허문헌6: Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstact No. 1065

본 발명은 세포에서 효과적으로 세포 사멸(apoptosis) 및/또는 증식 저해를 유도하기 위한 조성물 및 그것을 이용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 GST-π의 분자 메커니즘을 해명하기 위해 예의 연구를 계속하는 가운데, GST-π와 Akt의 발현을 동시에 저해하면, 둘 중 하나만의 발현을 저해 한 경우에 비해 세포 증식이 더 강력하게 억제되어, 세포 죽음도 더 강하게 유도되는 것을 발견하고, GST-π의 발현 저해에 의해 유도된 자가 소화 작용(autophagy)이, Akt의 발현을 동시에 저해하여 현저하게 억제되는 것을 관찰하고, 본 발명을 완성하였다.

즉 본 발명은, 하기에 관한 것이다.

(1) GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 세포 사멸(apoptosis)을 유도하기 위한 약제.

(2) Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, GST-π가 억제된 세포에서 자가소화 작용(autophagy)을 억제하기 위한 약제.

(3) Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, GST-π가 억제된 세포에서 자가소화 작용(autophagy)을 억제하기 위한 약제.

(4) Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, GST-π를 억제하는 약물에 의한 세포사멸(apoptosis) 유도 및/또는 세포 증식 억제를 강화하기 위한 약제.

(5) (1) 내지 (4)의 활성 성분이 RNAi 분자, 리보자임(ribozyme), 안티센스(Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드(Chimeric polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제.

(6) (1) 내지 (5)의 조성물을 포함하는 약학적 조성물.

(7) (6)에서 기재된, 세포의 이상 증식으로 인한 질환의 치료용 약학적 조성물.

(8) (6)에서 기재된, 암 치료용 약학적 조성물.

본 발명의 세포 사멸(apoptosis) 유도제는 기존의 것과 비교하여 보다 효과적으로 세포 사멸을 유도하여 세포 증식을 억제할 수 있기 때문에 약학적 조성물로써 매우 유용하다. 특히 암 치료에서 암 세포를 세포 사멸에 의해 사멸시킬 수 있기 때문에 암의 진행을 억제할 뿐만 아니라 암을 감퇴시키는 효과도 기대할 수 있다.

도 1은 PANC-1 세포에서 GST-π 또는 Akt의 녹다운에 의한 세포 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 A549 세포에서 GST-π 또는 Akt의 녹다운에 의한 세포 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 PANC-1 세포에서 GST-π 및 Akt의 더블 녹다운에 의한 세포 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 A549 세포에서 GST-π 및 Akt의 더블 녹다운에 의한 세포 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 GST-π siRNA 및 Akt 저해 약물과의 병용에 의한 세포 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다. * P <0.05, ** P <0.01.
도 6은 GST-π 및 Akt의 더블 녹다운에 의한 자가 소화 작용(autophagy)의 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물의 활성 성분을 포함하는 세포 증식을 억제하기 위한 약제 또는 조성물(이하 "세포 증식 억제제" 또는 "세포 증식 억제용 조성물"이라고 한다) 및 세포 사멸(apoptosis)을 유도하기 위한 약제 또는 조성물(이하 "세포 사멸 유도제" 또는 "세포 사멸 유도 조성물"이라고 한다)에 관한 것이다.

본 명세서에서, GST-π는 GSTP1 유전자에 의해 코딩되는 글루타치온(glutathione) 화합물을 촉매하는 효소를 말한다. GST-π는 인간을 포함한 각종 동물에 존재하고 그 배열 정보도 알려져 있다(예를 들면, 인간 : NP_000843 (NM_000852), 쥐(랫트) : NP_036709 (NM_012577), 마우스 : NP_038569 (NM_013541) 등. 번호는 NCBI 데이터베이스의 액세스 세션 번호, 괄호 밖은 아미노산 배열, 괄호 안은 염기 서열의 번호이다).

본 명세서에서, Akt는 Akt 유전자에 의해 코딩되는 PH 도메인을 갖는 세린/ 트레오닌 키나아제를 가리킨다. Akt는 Akt1 내지 3의 3 종류의 아이소타입이 알려져 있지만, PI3K/ AKT/ mTOR 경로에 관련 있는 것은 Akt1이기 때문에 본 발명에서는 특히 별도로 기재하지 않는 한 Akt는 Akt1를 가리키는 것으로 한다. Akt는 인간을 포함한 각종 동물에 존재하고, 배열 정보도 알려져 있다(예를 들면, 인간 : NP_005154 (NM_005163) 등. 번호는 NCBI 데이터베이스 액세스 세션 번호, 괄호 밖은 아미노산 배열, 괄호 안은 염기 서열의 번호이다).

생물 개체 간은 단백질의 생리적 기능을 해치지 않는 유전자 배열과 아미노산 서열의 변이가 발생할 수 있기 때문에, 본 발명의 GST-π 또는 GSTP1 유전자 또는 Akt 또는 Akt 유전자는 알려진 배열과 동일한 서열을 갖는 단백질과 핵산에 한정되지 않고, 이 배열에 1개 또는 2개 이상, 일반적으로 하나 또는 몇 개만 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 또는 염기가 상이한 배열이 있으며, 또한 상기 공지의 GST-π 또는 Akt와 동일한 기능을 갖는 것을 포함할 수 있다. GST-π 및 Akt의 구체적인 기능에 대해서는 다음과 같다.

또한, 본 명세서에서 "본 발명에서 사용하는 경우","본 명세서에서 사용", "본 명세서에서", "본 명세서에 기재되는" 등의 어구는 특히 별도로 기재하지 않는 한 이에 이어지는 기재가 본 명세서에 기재된 모든 발명에 적용되는 것을 의미한다. 또한 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 참조하는 모든 특허 공보 및 기타 간행물은 그 전체를 본 명세서에 인용한다.

본 명세서에서 사용되는 "GST-π를 억제하는 약물"은 제한되지 않고, 예를 들어, GST-π의 생산 및/또는 활성을 억제하는 약물과 GST-π의 분해 및/또는 비 활성화 를 촉진하는 약물 등이 포함된다. GST-π의 생산을 억제하는 약물로는 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 GST-π를 코드하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임(ribozyme), 안티센스(Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드(Chimeric polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터 등을 들 수 있다.

GST-π의 활성을 억제하는 약물로는 예를 들어, GST-π에 결합하는 물질, 예를 들어, 글루타치온(glutathione), 글루타치온 (glutathione) 아날로그(예를 들어, WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346, 비 특허 문헌 4 등에 기재된 것), 케토 프로펜(비 특허 문헌 2), 인도메타신(Hall et al., Cancer Res 1989; 49 (22) : 6265-8 ), 에타크린 산, 피로푸로스토(Tew et al., Cancer Res 1988; 48 (13) : 3622-5), 항 GST-π 항체, GST-π의 우성-음성 돌연변이 등이 잇으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 약물은 시판되고 있거나 공지된 기술에 따라 적절하게 제조될 수 있다.

GST-π의 생산 또는 활성을 억제하는 약물로는, 특이성이 높고, 부작용의 가능성이 낮은, GST-π를 코드하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보 자임(ribozyme), 안티센스(Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드 (Chimeric polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터가 바람직하다.

GST-π 억제는 GST-π 억제 물질을 작용시키지 않은 경우에 비해 세포에서 GST-π의 발현 및 활성이 억제되는 것으로 결정할 수 있다. GST-π의 발현은, 예를 들면, 안티 GST-π 항체를 이용한 면역 침강법, EIA, ELISA, IRA, IRMA, 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 법, 면역 조직 화학법, 면역 세포 화학법, 유동 세포 계측법, GST-π를 코드하는 핵산 또는 그 특이한 조각 또는 그의 핵산의 전사산물(예 : mRNA) 또는 접합 산물에 특이적으로 하이브 리다이즈하는 핵산을 이용한 다양한 이종 교잡법, 노던 블랏법, 서던 블롯 방법, 다양한 PCR법 등으로 평가할 수 있으나, 알려진 임의의 방법에 의해 제한되지 않는다.

또한 GST-π의 활성은 GST-π 알려진 활성은, 예를 들면, Raf-1(특히 인산화 Raf-1) 및 EGFR(특히 인산화 EGFR) 등의 단백질과의 결합성 등 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 면역 침강법, 웨스턴 블랏팅(Western blotting)법, 질량 분석법 풀다운법, 표면 플라즈몬 공명(SPR)법 등에 의해 분석하여 평가할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

본 명세서에서 "Akt를 억제하는 약물"은, 예를 들면, Akt의 생산 및/또는 활성을 억제하는 약물, Akt의 분해 및/또는 비활성화를 촉진하는 약물 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. Akt의 생산을 억제하는 약물로는 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 Akt를 코드하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임(ribozyme), 안티센스(Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드(Chimeric polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

Akt의 활성을 억제하는 약물로는 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, Akt에 결합하는 물질, 예를 들면, 머크 밀리포어(Merck Millipore)사의 Akt Inhibitor(Akt Inhibitor, Akt Inhibitor II ~ XIII), MK-2206, Perifosine, GSK690693, AT7867, CCT128930, PHT-427, Palomid 529, PF-04691502, 토리시리빈, 인산 토리시리빈(NSC-280594) A-674563, sc-221226 항 Akt 항체, Akt의 우성-음성 돌연변이 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 약물은 시판되고 있거나 공지된 기술에 따라 적절하게 제조될 수 있다.

Akt의 생산 또는 활성을 억제하는 약물로는 특이성이 높고, 부작용의 가능성이 낮은 Akt를 코드하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임(ribozyme), 안티센스 (Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드(Chimeric polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터가 바람직하다.

Akt 억제는 Akt 억제 물질을 작용시키지 않은 경우에 비해 세포에서 Akt의 발현 및 활성이 억제되는 것으로 결정할 수 있다. Akt의 발현은, 예를 들면, 항 Akt 항체를 이용한 면역 침강법, EIA, ELISA, IRA, IRMA, 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 법, 면역 조직 화학법, 면역 세포 화학법, 유동 세포 계측법, Akt를 코드하는 핵산 또는 그 특이한 조각 또는 그의 핵산의 전사산물(예: mRNA) 또는 접합 산물에 특이적으로 하이브리다이즈하는 핵산을 이용한 다양한 하이브리드화법 노던 블랏법, 서던 블롯방법, 다양한 PCR 법 등으로 평가할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

또한 Akt의 활성은 Akt 알려진 활성은, 예를 들어 mTOR 등의 단백질과 결합성 등 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 면역 침강법, 웨스턴 블랏팅(Western blotting)법 질량 분석법 풀다운법, 표면 플라즈몬 공명(SPR)법 등에 의해 분석하여 평가할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

본 명세서에서, RNAi 분자는 RNA 간섭을 유발하는 임의의 분자를 의미하나, 이에 국한되지 않고 siRNA(small interfering RNA), miRNA(micro RNA), shRNA(short hairpin RNA), ddRNA(DNA- directed RNA), piRNA(Piwi-interacting RNA), rasiRNA(repeat associated siRNA) 등의 이중 가닥 RNA 및 이러한 변형체 등을 포함한다. 이러한 RNAi 분자는 시판되고 있거나, 공지된 배열 정보에 기반하여 설계, 제작하는 것이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용하는 경우, 안티센스(Antisense) 핵산은 RNA, DNA, PNA 또는 이러한 복합물을 포함한다.

본 명세서에서, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드(Chimeric polynucleotide)는, 예를 들면, 특개 2003-219893에 기재된 표적 유전자의 발현을 저해하는 DNA 및 RNA로 이루어진 2개의 체인 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물은 단일 제제에 포함되어 있어도 바람직하며, 2개 이상의 제제를 별도로 포함하여도 바람직하다. 후자의 경우, 각 제제는 동시에 투여 가능하며, 시간 간격을 두고 투여 가능하다. 시간 간격을 두고 투여되는 경우 GST-π를 억제하는 약물을 포함한 제제를 Akt를 억제하는 약물을 포함한 제제 전에 투여하여도 가능하며, 후에 투여하여도 가능하다.

또한, 본 발명은 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 GST-π를 억제하는 약물에 의한 세포 사멸 유도 및/또는 세포 증식의 억제를 강화하기 위한 약제 또는 조성물(이하 "세포 사멸 유도 증강제", "세포 증식 억제 강화", "세포 사멸 유도 증강용 조성물" 또는 "세포 증식 억제 증강용 조성물"이라고도 한다)에 관한 것이다.

본 발명의 약제 또는 조성물의 활성 성분 배합량은 약제 또는 조성물이 투여 된 경우 세포 사멸을 유도 및/또는 세포 증식이 억제되는 양이 바람직하다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하여 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 공지되어 있거나, 배양 세포 등을 이용한 in vitro 실험과 마우스, 랫트, 개, 돼지등의 동물 모델의 실험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 실험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 세포 사멸 유도는 여러 가지 공지된 방법, 예를 들면, DNA 조각, 아네키신 V의 세포막에 결합 미토콘드리아 막전위의 변화, 카스파아제의 활성화 등의 세포 사멸 특유의 현상 검출 및 TUNEL 염색 등으로 평가할 수 있다. 또한, 세포 증식 억제는 다양한 공지된 방법, 예를 들어, 시간경과에 따라 살아있는 세포 수의 계수, 종양의 크기, 부피 또는 무게 측정, DNA 합성량을 측정하고, WST-1 법, BrdU(브로모 데오딘)법, 3H 티미딘 포착법 등을 통해 평가할 수 있다. 활성 성분의 배합량은 약제나 조성물의 투약 형태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 1회 투여로 여러 단위의 조성물을 사용하는 경우, 조성물 1단위에 배합 유효 성분의 양은 1회 투여에 필요한 유효 성분의 양을 여러 분의 1로 할 수 있다. 소요 배합량의 조정은 당업자가 적절히 정할 수 있다.

또한, 본 발명은 GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 함유하는 것을 포함하는, 세포 사멸을 유도하거나 세포 증식을 억제하기 위한 약제 또는 조성물의 제조 방법, GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물의 세포 사멸을 유도하거나 세포 증식을 억제하기 위한 약제 또는 조성물의 제조에 사용, 세포 사멸의 유도 또는 세포 증식 억제에 사용, GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물의 조합, 및, 유효량의 GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함, 세포 사멸을 유도하거나 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 함유하는 것을 포함하여 GST-π를 억제하는 약물에 의한 세포 사멸 유도 및/또는 세포 증식 억제를 강화하기 위한 약제 또는 조성물을 제조하는 방법, Akt를 억제하는 약물의 GST-π를 억제하는 약물에 의한 세포 사멸 유도 및/또는 세포 증식 억제를 강화하기 위한 약제 또는 조성물의 제조에 사용, GST-π를 억제하는 약물에 의한 세포 사멸 유도 및/또는 세포 증식 억제를 강화하기 위하여 사용하는 Akt를 억제하는 약물, 및, 유효량의 Akt를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는 GST -π을 억제하는 약물에 의한 세포 사멸 유도 및/또는 세포 증식 억제를 강화하는 방법에 관한 것이다.

상기 제조 방법 또는 사용과 약물과 그 배합량은 이미 서술한 바와 같다. 각 약물의 배합은 공지된 임의의 방법에 따라 실시할 수 있다.

상기 세포 사멸 유도 또는 세포 증식 억제 방법은 모두 in vitro의 방법이라도, in vivo의 방법도 있다. 또한, 해당 방법에 있어서 약물에 대해서는 이미 서술한 바와 같고, 약물의 유효량은 투여한 세포에서 세포 사멸을 유도하거나 세포 증식이 억제되는 양이 바람직하다. 또한, 투여에 의한 이익을 초과하여 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 공지되거나, 배양 세포 등을 이용한 in vitro 실험 등에 의해 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 실험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 세포 사멸을 유도하거나 세포 증식의 억제는 상기에서 설명한 내용을 포함한 다양한 알려진 방법에 의해 평가할 수 있다. 상기 유효량은 약물을 살아있는 세포 집단에 투여 한 경우, 반드시 세포 집단의 모든 세포에 세포 사멸 또는 증식 억제를 가져오지 않아도 된다. 예를 들어, 상기 유효량은 세포 집단에서 세포의 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 8% 이상, 10% 이상, 12% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 심지어 25% 이상 등으로 세포 사멸 또는 증식 억제를 일으키는 양이 될 수 있다.

본 발명의 세포 사멸 유도 및 세포 증식 억제 물질은 세포 증식에 이상이 있는 세포 등에서도 효과적으로 세포 사멸 또는 증식 억제를 유도할 것이며, 약학적 조성물의 성분으로 효과적이다. 따라서 본 발명의 한 측면은 본 발명의 세포 사멸유도제 또는 세포 증식 억제 물질을 포함한 약학적 조성물이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물은 특히 세포 사멸에 이상이 있는 질환을 치료하는 데 효과적이다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 상기 세포 사멸 유도제를 포함하는 세포 사멸에 이상이 있는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서, 세포 사멸에 이상이 있는 질환은, 예를 들면, 세포의 이상 증식으로 인한 질환, KRAS 변이로 인한 질환, GST-π의 과잉 발현에 기인하는 질환 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 세포의 이상 증식으로 인한 질환은, 예를 들면, 양성 또는 악성 종양, 과형성증, 켈로이드, 쿠싱 증후군, 원발성 부신 질환, 홍반증, 진성 다혈증, 백반증, 과형성 흉터, 편평 태선 및 흑자 증 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. KRAS 돌연변이에 기인하는 질환은, 예를 들면, 양성 또는 악성 종양(암, 악성신생물이라고도 한다) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. GST-π의 과잉 발현에 기인하는 질환은, 예를 들면, 양성 또는 악성 종양, 특히 약제 내성(예를 들어, 멜 팔란, 사이클로 포스파마이드 등의 알킬화제, 아드리아 마이신 등의 안트라 사이크린계 항종양성 항생 물질, 시스플라틴 등의 백금착체, 에토포시드 등에 대해 내성)의 악성 종양 등이 포함되나 이에 한정되지 않느다. 본 발명의 실시예에서는, 세포 사멸에 이상이 있는 질환은 암이다.

본 발명의 암은, 예를 들면, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구 종, 지방육종, 횡문근육종, 평활근육종, 혈관육종, 카포시육종, 림프육종, 활막 육종, 연골육종, 골육종 등의 육종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장암, 충수암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암종, 항문암, 신장암, 요관암, 방광암, 전립선암, 음경암, 고환암, 자궁암, 난소암, 외음부암, 질암, 피부암 등 암, 심지어 백혈병과 악성 림프종 등을 들 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 본 발명에서 "암"은 상피성 악성 종양 및 비상피 악성 종양을 포함한다. 본 발명의 암은 신체의 어떤 부위, 예를 들어, 뇌, 두경부, 흉부, 사지, 폐, 심장, 흉선, 식도, 위, 소장(십이지장, 공장, 회장), 대장(결장, 맹장, 충수 직장), 간, 췌장, 담낭, 항문, 신장, 요관, 방광, 전립선, 음경, 고환, 자궁, 난소, 외음부, 질, 피부, 횡문근, 평활근, 활막 연골, 뼈, 갑상선 부신 복막, 장간막, 골수, 혈액, 혈관, 림프절 등의 림프 시스템 림프 등에 존재하고 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 암은 상기에서 정의된 돌연변이 KRAS를 가진 암 세포를 포함한다. 본 발명의 한 실시예에서, 암은 호르몬이나 성장 인자 독립성의 증식을 나타내는 암 세포를 포함한다. 본 발명의 한 실시예에서, 암은 GST-π의 과발현을 나타내는 암 세포를 포함한다. 본 발명의 한 실시예에서, 암은 약제 내성이다. 본 발명의 한 실시예에서, 암, 멜 팔란, 사이클로 포스파마이드 등의 알킬화제, 아드리아 마이신 등의 안트라 사이크린계 항종양성 항생 물질, 시스플라틴 등의 백금착체, 에토포시드로 이루어진 군에서 선택되는 약의 내성이다. 본 발명의 한 실시예에서, 암, 멜 팔란, 사이클로 포스파마이드, 아드리아 마이신, 시스플라틴, 에토포시드로 이루어진 군에서 선택되는 약제에 내성을 가진다.

또한, 본 발명은 GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, 세포 사멸에 이상이 있는 질환을 치료하는 약학적 조성물, GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 함유하는 것을 포함하는 세포 사멸에 이상이 있는 질환을 치료하는 약학적 조성물의 제조 방법, GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물의 세포 사멸에 이상이 있는 질환을 치료하는 약학적 조성물을 제조하기 위해 사용, 세포 사멸에 이상이 있는 질환의 치료에 사용, GST-π를 억제하는 약물과 Akt를 억제하는 약물과 조합, 및 상기 약학 적 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 세포 사멸에 이상이 있는 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

상기 제조 방법 또는 사용의 약물 및 배합량, 세포 사멸에 이상이 있는 질환에 대해서는 이미 서술한 바와 같다. 또한 각 약물의 배합은 공지된 임의의 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 세포 사멸 유도제, 세포 증식 저해 방지제 및 이를 포함하는 조성물은 다른 유효 성분과 병용하여도 바람직하다. 여기서, 병용은 예를 들어, 다른 유효 성분을 별도의 제제로 투여하는 것 및 다른 유효 성분을 1종 이상의 다른 약물과 합체하여 투여하는 것 등을 포함한다. 별도의 제제로 투여하는 경우에는 다른 유효 성분을 포함 제제를 다른 제제보다 전, 다른 제제와 동시 또는 다른 제제 이후에 투여해도 좋다.

이러한 다른 유효 성분으로는 대상이 되는 질환의 치료에 효과적인 것을 들 수 있다. 예를 들어, 처리하는 질환이 암인 경우는 항암제를 병용할 수 있다. 항암제의 예로는, 예를 들어, 이포스파미도, 염산니무스틴, 시클로 포스파미드, 다카바진, 멜팔란, 라니무스틴 등의 알킬화제, 염산젬시타빈, 에노시타빈, 시타라빈· 옥호스화토, 시타라빈 제제, 테가후루·우라실, 테가후루·기메라실·오테라실 칼륨 복합제(예 : TS-1), 도키시프르리신, 히드록시카르바미드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 맬캡토퓨린 등의 대사 길항제, 염산이다루비신, 염산에피루비신, 염산다우노루비신, 구연산다우노루비신, 염산독솔비신, 염산염피라루비신, 염산부레오마이신, 황산페플로마이신, 염산미토헥산트론, 미토마이신 C 등의 항종양성 항생 물질, 에토포시드, 염산이리노테칸, 주석산비노렐빈, 도세탁셀 수화물, 파클리탁셀, 황산빈크리스틴, 황산빈데신, 황산빈블라스틴 등의 알칼로이드, 아나스트로 졸, 구연산타목시펜 시트르산, 토레미펜, 비칼루타마이드, 플루타마이드, 인산에스트라무스탄 등 호르몬 요법제, 카르보플라틴, 시스플라틴(CDDP), 네다플라틴 등의 백금착체, 탈리도마이드, 네오바스타트, 베바시주맙 등의 혈관 신생 저해제, L- 아스파라기나아제 등을 들 수 있다.

다른 유효 성분의 다른 예로는 자가 소화 작용(autophagy)을 억제하는 약물을 들 수 있다. 본 명세서에서, 자가 소화 작용은 매크로 자가 소화 작용, 마이크로 자가 소화 작용, 샤페론-매게 자가 소화 작용 등을 포함할 수 있지만, 일반적으로 매크로 자가 소화 작용을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 "자가 소화 작용 (autophagy)"이라는 용어는 특히 별기하지 않는 한 "매크로 자가 소화 작용 (autophagy)"을 의미한다.

자가 소화 작용은 "자기 식"이라고도 불리는 세포 내 단백질 분해 메커니즘의 하나이며, 세포 내에서 단백질의 분해, 재활용을 담당하고 있다. 자가 소화 작용은 효모와 포유 동물을 포함한 광범위한 생물종에서 보이며, 대체로 (a) PAS (phagophore assembly site)의 형성, (b) 분해해야 할 단백질을 둘러싼 파고포아 (격리막)의 신장 및 확대와 이로 인한 분리해야 할 단백질을 내포하는 오토파고좀의 형성 (c) 오토파고좀 및 리소좀의 융합에 의한 자동 리소좀의 형성, (d) 오토 리소좀 내에서 단백질의 분해를 포함한 일련 과정을 수반한다.

상기 (a) ~ (c) 프로세스는 특유의 자가 소화 작용 관련 인자가 관여하고 있다. 자가 소화 작용 관련 인자는 당초 효모에서 연구가 이루어져 지금까지 Atg 1 내지 27을 비롯한 많은 것이 확인되어있지만(Klionsky et al., Dev Cell 2003; 5 (4) : 539-45), 포유 동물에서의 연구도 진행되어 동질화가 여러 동정되어 자가 소화 작용의 핵심 분자 메커니즘도 밝혀지고 있다(Yang and Klionsky, Curr Opin Cell Biol. 2010; 22 (2) : 124-31).

포유 동물의 자가 소화 작용의 핵심 분자 메커니즘에 관여하는 자가 소화 작용 관련 인자로는, 예를 들어 PAS의 형성에 관여하는 VMP1, TP53INP2, mAtg9, ULK 복합체(ULK1, ULK2, mAtg13, FIP200로 구성), PI3K 복합체(Beclin1, hVps34, p150, Ambra1, Atg14L로 구성된 Atg14L 복합체, 그리고 Beclin1, hVps34, p150, Bif-1 UVRAG로 구성된 UVRAG 복합체), 파고포아 신장에 관여하는 LC3-II, Atg12-Atg5-Atg16L 복합체 등을 들 수 있다.

따라서, 자가 소화 작용을 억제하는 약물은, 예를 들어, 상기의 것을 포함하는 자가 소화 작용 관련 인자(관련 인자가 복합체인 경우에는 상기 복합체 자체뿐만 아니라 이를 구성하는 개별 성분을 포함)의 생산 및/또는 활성을 억제하는 약물이나, 자가 소화 작용 관련 인자의 분해 및/또는 비활성화를 촉진하는 약물 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 자가 소화 작용관련 인자의 생산을 억제하는 약물로는 자가 소화 작용 관련 인자를 코딩하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임(ribozyme), 안티센스(Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드(Chimeric polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터 등을 들 수 있다.

자가 소화 작용 관련 인자의 활성을 억제하는 약물로는, 예를 들어, PI3K의 저해제(예, 와토마닌 등), 특히 클래스 IIIPI3K의 저해제(예, 3-MA(3-메틸아데닌) 등), 오토파고좀 및 리소좀의 융합을 저해하는 물질 (예를 들어, 바필로마이신 A1 등), 오토리소좀의 단백질 분해를 저해하는 물질 (예, 클로로퀸, 류펩틴 등), 자가 소화 작용 관련 인자에 결합하는 물질(예를 들어, 자가 소화 작용 관련 인자에 대한 항체 등), 자가 소화 작용 관련 인자의 우성-음성 돌연변이 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 약물은 시판되고 있거나 공지된 기술에 따라 적절하게 제조할 수 있다.

자가 소화 작용을 억제하는 약물로는 특이성이 높고, 부작용의 가능성이 낮은, 자가 소화 작용 관련 인자를 코딩하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임 (ribozyme), 안티센스(Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드 (Chimeric polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터가 바람직하다.

자가 소화 작용의 억제는 본 발명의 자가 소화 작용 억제용 물질을 적용시키지 않은 경우에 비해, 세포에서 자가 소화 작용이 억제되는 것으로 결정할 수 있다. 자가 소화 작용의 억제는 공지된 임의의 방법이고, 제한되지 않으며, 예를 들어 전자 현미경법에 의한 오토파고좀의 검출, 자가 소화 작용 마커(예를 들어, Atg5, Atg12, LC3 특히 LC3-II 등)의 검출 등에 따라 평가할 수 있다. LC3-II는 한정되지 않으며, 예를 들면, LC3-II에 대한 특이 항체를 검출하여도 좋고, 시료를 전기영동 등으로 분리한 후, LC3-I과는 다른 밴드로 나누어진 LC3- II를 LC3-II 또는 LC3-I과 LC3-II 모두에 반응하는 항체를 사용하여 웨스턴 블롯법 등에 의해 검출할 수 있다. 또한 LC3-I은 세포질에 산재하는 한편, LC3-II는 격리막 오토파고좀, 오토리소좀 등의 자가 소화 작용 특유의 구조에 편재하기 위해, LC3-II에 반응하는 항체(LC3-I과 LC3-II 모두에 반응하는 항체를 포함)에 의한 면역 염색 등으로 표면화하며, 이러한 구조를 나타내는 점 모양 신호의 존재 및 수는 자가 소화 작용의 지표로도 바람직하다 .

또한, 본 발명은 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 GST-π가 억제된 세포에서 자가 소화 작용을 억제하기 위한 약제 또는 조성물("자가 소화 작용 억제용" 또는 "자가 소화 작용 억제 조성물" 이라고도 한다)에 관한 것이다.

본 발명에서 자가 소화 작용의 억제는 본 발명의 약제 또는 조성물을 적용시키지 않은 경우에 비해, 세포에서 자가 소화 작용이 억제되는 것으로 결정할 수 있다. 자가 소화 작용의 평가 방법은 서술한 바와 같다.

본 명세서에서, "GST-π가 억제됐다"는, 예를 들어, GST-π가 발현되는 세포에서 GST-π가 억제되어있는 상태를 포함한다. 이러한 상태로는 예를 들어, GST-π가 발현하는 세포에 GST-π를 억제하는 약물(예를 들어, 상기에서 설명한 내용 등)을 투여한 상태 등을 들 수 있다.

살아있는 세포에서 GST-π가 발현하는지 여부는 문헌적으로 알려져 있거나 또는 세포에서 GST-π의 발현을 실제로 검출함으로써 결정할 수 있다. GST-π의 발현은 이미 서술한 것을 포함하여, 공지된 임의의 방법을 이용하여 검출할 수 있다.

또한, 본 발명은 Akt를 억제하는 약물을 배합하는 공정을 포함하는 GST-π가 억제된 세포에서 자가 소화 작용을 억제하기 위한 약제 또는 조성물의 제조 방법, Akt를 억제하는 약물의, GST-π가 억제된 세포에서 자가 소화 작용을 억제하기 위한 약제 또는 조성물의 제조의 사용, GST-π가 억제된 세포의 자가 소화 작용 억제에 사용되는 Akt를 억제하는 약물, 및, 유효량의 Akt를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는 GST-π가 억제된 세포에서 자가 소화 작용을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 자가 소화 작용을 억제하기 위한 약제 또는 조성물은 GST-π가 억제된 상황에서 자가 소화 작용의 항진에 따른 상태 등의 처리에 유용하다. 이러한 상태는 한정되지 않으며, 예를 들어, GST-π의 발현과 활성이 저하된 상태, GST-π의 발현과 활성을 억제하는 약물이 투여된 상태 등을 들 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 GST-π가 억제된 상황에서 자가 소화 작용의 항진에 수반하는 상태를 치료하기 위한 약학적 조성물, Akt를 억제하는 약물을 배합하는 공정을 포함하는 GST-π가 억제된 상황에서 자가 소화 작용의 항진에 수반하는 상태를 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조 방법, Akt를 억제하는 약물의 GST-π가 억제된 상황에서 자가 소화 작용의 항진에 수반하는 상태를 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용, GST-π가 억제된 상황에서 자가 소화 작용의 항진에 수반하는 상태의 치료에 사용 Akt를 억제하는 약물, 및, 유효량의 Akt를 억제하는 약물을 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 GST-π가 억제된 상황에서 자가 소화 작용의 항진에 따른 상태를 처리하는 방법에 관한 것이다.

자가 소화 작용의 억제에 관하여, 본 발명의 상기 약제 또는 조성물의 활성 성분의 배합량은 해당 약제 또는 조성물이 투여된 경우, 자가 소화 작용의 억제를 달성하는 양일 수 있다. 또한 투여에 의해 이익을 초과하여 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 공지되거나, 배양 세포 등을 이용한 in vitro 실험과 마우스, 랫트, 개, 돼지 등의 동물 모델에서 실험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 실험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 자가 소화 작용의 억제는 상기에서 설명한 내용을 포함하는 다양한 알려진 방법에 의해 평가할 수 있다. 활성 성분의 배합량은 약제나 조성물의 투약 형태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 1회 투여로 여러 단위의 조성물을 사용하는 경우, 조성물 1단위에 배합 유효 성분의 양은 1회 투여에 필요한 유효 성분의 양을 여러 분의 1로 할 수 있다. 소요 배합량의 조정은 당업자가 적절히 정할 수 있다.

자가 소화 작용의 억제에 따른 상기 약제 또는 조성물의 제조 방법 또는 사용과 약물과 그 배합량은 이미 서술한 바와 같다. 각 약물의 배합은 공지된 임의의 방법에 따라 실시할 수 있다.

자가 소화 작용의 억제에 따른 상기 방법은 모두 in vitro의 방법이라도, in vivo의 방법도 있다. 또한, 상기 방법에 있어서 약물의 유효량은 투여한 세포에서 원하는 효과(즉, 자가 소화 작용의 억제)가 달성되는 양이 바람직하다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하여 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 공지되거나, 배양 세포 등을 이용한 in vitro 실험 등에 의해 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 실험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 원하는 효과의 달성은 상기에서 설명한 내용을 포함하는 다양한 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 상기 유효량은 약물을 살아있는 세포 집단에 투여한 경우, 반드시 세포 집단의 모든 세포에 원하는 효과를 유도하는 것은 아니어도 된다. 예를 들어, 상기 유효량은 세포 집단에서 세포의 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 8% 이상, 10% 이상, 12% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 심지어 25% 이상 등으로 원하는 효과를 유도하는 양일 수 있다.

본 명세서에 기재된, 본 발명의 각종 약제나 조성물, 처리 방법 등의 활성 성분은 핵산, 예를 들어, RNAi 분자, 리보자임(ribozyme), 안티센스(Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드(Chimeric polynucleotide) 등의 경우, 이러한 핵산 자체 그대로 사용할 수도 있지만, 여러 가지의 벡터에 포함시킬 수도 있다. 벡터로는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터 등의 공지된 임의의 것을 사용할 수 있다. 벡터는 포함된 핵산의 발현을 증강하는 프로모터를 적어도 하나 이상 포함하는 것이 바람직하며, 이 경우 해당 핵산은 프로모터와 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 것은 프로모터의 작용에 의해 해당 핵산을 코드하는 단백질이 적절하게 생산되도록 해당 핵산과 프로모터가 배치되어있는 것을 의미한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능하지만, 없어도 좋으며, 유전자의 전사는 숙주 세포의 핵 외부에서 수행되더라도 핵 내에서 이루어질 수 있다. 후자의 경우, 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합되어 있다.

또한, 유효 성분은 각종 비바이러스성 지질이나 단백질 담체에 포함시킬 수도 있다. 이러한 담체는 한정되지 않고, 예를 들면, 콜레스테롤, 리포좀, 항체프로토마, 사이클로 덱스트린 나노입자, 융합펩타이드, 앱타머, 생분해성폴리젖산코 폴리머, 폴리머 등을 들 수 있고, 세포 내부에 포착 효율을 높일 수 있다(예를 들어, Pirollo and Chang, Cancer Res 2008; 68 (5) : 1247-50 등 참조). 특히 양이온성 리포좀과 고분자(예를 들어, 폴리에틸렌 이민 등)가 유용하다. 이용되는 담체로써 유용한 폴리머의 추가 예로는 예를 들어, US 2008/0207553, US 2008/0312174 등에 기재된 것 등을 들 수 있다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 각종 약학적 조성물에 있어서는, 활성 성분의 효과를 방해하지 않는 한, 활성 성분을 다른 어떤 성분과 결합할 수 있다. 이러한 성분으로는 예를 들어, 다른 화학 치료제 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 들 수 있다. 또한, 투여 경로 및 약물 방출 양식 등에 따라 상기 조성물을 적절한 재료, 예를 들어, 장용성 코팅 및 시한 붕해성 재료로 피복하여도 좋고, 또한 적절한 약물 방출 시스템에 통합하여도 좋다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 각종 방지제 및 조성물(각종 약학적 조성물을 포함)은 경구 및 비경을 모두 포함하는 다양한 경로가 바람직하며, 예를 들어, 경구, 정맥, 근육내, 피하, 국소, 종양내, 직장, 동맥내, 문맥내, 심실내, 경점막, 경피, 비강, 복강내, 폐내부와 자궁 등의 경로로 투여하여도 좋으나 이에 한정되지 않고, 각 투여 경로에 적합한 제형으로 제제하여도 좋다. 상기 제형 및 제제 방법은 임의의 공지의 것을 적절히 적용할 수 있다(예를 들어, 표준 약제학적 와타나베 喜照ら 편, 南江堂 2003 년 등 참조).

예를 들어, 경구 투여에 적합한 제형은, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 액제, 현탁제, 유제, 겔 화제, 시럽제 등이고, 또한 비경구 투여에 적합한 제형으로는 용액성 주사제, 현탁성 주사액, 유탁성 주사제, 사용시 조제형 주사제 등의 주사제가 꼽히나 이에 한정되지 않는다. 비경구 투여용 제제는 수성 또는 비수성의 등장성 무균 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 각종 약제 또는 조성물(각종 약학적 조성물을 포함)은 특정 조직이나 세포에 표적화되어 있어도 좋다. 표적화는 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 암에 대한 전달을 도모하는 경우, 한정되지 않고, 예를 들어 제제를 EPR(enhanced permeability and retention) 효과의 발현에 적합한 직경 50 내지 200 μm 특히 75 내지 150 μm 등의 크기가 되는 수동형 타겟팅과 CD19, HER2, 트랜스페린 수용체, 엽산 수용체, VIP 수용체, EGFR(Torchilin, AAPS J. 2007; 9 (2) : E128-47), RAAG10(특표 2005-532050), PIPA(특표 2006-506071), KID3(특표 2007-529197) 등 리간드와 RGD 모티브 및 NGR 모티브를 갖는 펩타이드, F3, LyP-1(Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6) : 759-68) 등을 표적화제로서 이용하는 액티브 타겟팅 등의 방법을 사용할 수 있다. 또한, 레티노이드 또는 그 유도체가 암 세포에 표적화제로서 유용하게 알려져 있기 때문에(WO 2008/120815), 레티노이드를 표적화제로 포함하는 담체를 이용할 수 있다. 이러한 담체는 상기 문헌 외에도 WO 2009/036368, WO 2010/014117, WO 2012/170952에 기재되어있다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 각종 약제 또는 조성물(각종 약학적 조성물을 포함)은 어떤 형태로 공급되어도 좋지만, 저장 안정성의 관점에서 사용시 조제 가능한 형태, 예를 들면, 의료 현장 또는 그 근방에서 의사 및/또는 약사, 간호사, 또는 기타 치료사 등에 의해 준비될 수 있는 형태로 제공하고 있다. 이러한 예는 본 발명의 약제 또는 조성물이 지질과 단백질, 핵산 등의 안정적인 저장이 어려운 성분을 포함할 때 특히 유용하다. 이 경우, 본 발명의 약제 또는 조성물은 이러한 필수 구성 요소 중 적어도 하나를 포함하여 1개 또는 2개 이상의 용기로 제공되며, 사용 전에 예를 들어, 24시간 전 이내, 바람직하게는 3시간 전 이내, 그리고 보다 바람직하게는 사용 직전에 준비된다. 조제시에는 준비하는 장소에서 보통 사용 가능한 시약, 용매 분배기구 등을 적절하게 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 각종 약제 또는 조성물에 포함될 수 있는 활성 성분을 단독으로 또는 조합하여 포함하여 1개 또는 2개 이상의 용기를 포함하는 조성물의 제조 키트, 및 그러한 키트 형태에서 제공하는 각종 약제 또는 조성물의 필요 구성 요소에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 상기 외에 본 발명의 각종 약제 또는 조성물의 제조 방법 및 투여 방법 등이 기재된 지시, 예를 들면 설명서와 CD, DVD 등 전자 기록 매체 등을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 본 발명의 각종 약제 또는 조성물을 완성하기 위한 구성 요소 모두를 포함해도 되지만, 반드시 모든 구성 요소를 포함하지 않아도 된다. 따라서, 본 발명의 키트는 의료 현장이나 실험실 등에서 일반적으로 사용 가능한 시약과 용매, 예를 들어, 무균 물이나 생리 식염수, 포도당 용액 등을 포함 않아도 된다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 각종 처리 방법에 있어서 유효량은 예를 들어, 질환의 증상을 감소 또는 질환의 진행을 지연 또는 중단하는 양이며, 바람직하게는 질환을 억제하거나, 치유하는 양이다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하여 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 배양 세포 등을 이용한 in vitro 실험과 마우스, 랫트, 개, 돼지 등의 동물 모델에서 실험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 실험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 본 발명의 처리 방법에 사용되는 약물의 용량은 당업자에게 공지되어 있다거나 위의 실험 등에 의해 적절히 결정할 수 있다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 처리 방법에 투여하는 활성 성분의 구체적인 복용량은 치료를 필요로 하는 대상의 다양한 조건, 예를 들어, 증상의 위독도, 대상의 일반 건강 상태, 나이, 체중 대상의 성별, 식사, 투여시기 및 빈도, 병용하고있는 약학적, 치료에 반응, 제형 및 치료에 대한 적합성 등을 고려하여 결정될 수있다.

투여 경로로는 경구 및 비경구를 모두 포함하는 다양한 경로, 예를 들면, 경구, 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 종양내, 직장, 동맥내, 문맥내, 심실내, 경점막, 경피, 비강, 복강내, 폐내부와 자궁 등의 경로가 포함된다.

투여 빈도는 사용 약제나 조성물의 성상이나 상기의 것을 포함한 해당 조건에 따라 다르지만, 예를 들면, 1일 여러번(즉 1일 2, 3, 4회 또는 5회 이상) 1일 1 회 며칠마다(즉 2, 3, 4, 5, 6, 7일마다 등), 1주일마다, 몇 주마다(즉 2, 3, 4주마다 등)도 있다.

본 명세서에서 사용하는 경우, 용어 "대상"은 모든 생물 개체를 의미하고, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간 개체이다. 본 발명에서 대상은 정상인이어도, 어떤 질환을 앓고 있어도 좋지만, 특정 질병의 처리가 도모되는 경우에는 일반적으로 걸리는 질환을 앓고 있는 병적 상태 위험을 갖는 대상을 의미한다.

또한, 용어 "처리"는 본 명세서에서, 질환의 치료, 일시적 경감 또는 예방 등을 목적으로 하는 의학적으로 허용되는 모든 종류의 예방 및/또는 치료적 개입을 포함하는 것으로 한다. 예를 들어, "처리"의 용어는 질환의 진행을 지연 또는 중단, 병변의 철회 또는 손실, 발병의 예방 또는 재발의 방지 등을 포함하는 다양한 목적의 의학적으로 허용되는 개입을 포함한다.

본 발명을 이하의 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 이들은 실시예에 불과하며, 본 발명을 결코 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: siRNA에 의한 GST-π 및 Akt의 녹다운

1 × 10⁶ 개의 PANC-1 세포를 10 cm 페트리 접시에 분주하여, 10% 소 태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) 및 5% L-글루타민(glutamine)을 첨가한 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute 1640, Sigma 사)에서 18시간 배양하였다. 배양 조건은 특별히 병기하지 않으면, 37℃, 5% CO₂로 수행하였다. 또한 1 × 10⁶ 개의 A549 세포를 10 cm 페트리 접시에 분주하여 10% FBS 및 10% L-글루타민 (glutamine)을 첨가한 DMEM배지(Dulbecco 's modified Eagle 's medium, Sigma 사)에서 18시간 배양하였다. 배지를 각각 교체하고 2시간 후, 20 내지 30 %의 농도의 PANC-1 또는 A549 세포에 Lipofectamine RNAiMAX(Life Technologies 사)를 이용하여 GST-π siRNA 및/또는 Akt siRNA를 형질주입(transfection)하였다.

형질주입(transfection)용 Lipofectamine/siRNA 혼합 용액은 하기와 같이 제작하였다. 먼저 35 ㎕의 Lipofectamine RNAiMAX와 965 ㎕의 OPTI-MEM(Sigma 사)를 혼합한 Lipofectamine 용액을 제조하였다. 그런 다음, 소정의 10 μM siRNA를 OPTI-MEM에서 1 ㎖에 만들어, siRNA 용액을 조제(예를 들어, 최종 농도 30nM 사용하는 siRNA 용액을 제조하는 경우, 36 ㎕의 10 μM siRNA와 964 ㎕의 OPTI-MEM을 혼합)하고, 이를 상기 lipofectamine 용액과 혼합하여 15분간 실온에서 방치하였다. 또한, siRNA는 하기의 것을 사용하였다.

GST-π siRNA:

센스 사슬: GGGAGGCAAGACCUUCAUUtt (서열 번호 1)

안티센스(Antisense) 체인: AAUGAAGGUCUUGCCUCCCtg (서열 번호 2)

(또한, 대문자는 RNA, 소문자는 DNA를 각각 의미한다)

Akt siRNA: Akt siRNA I(Cell Signaling Technology 사의 #6211)

Control siRNA: AllStars Neg. Control siRNA 1027281 QIAGEN 사)

siRNA의 농도를 최적화하기 위해, GST-π siRNA 또는 Akt siRNA를 10 내지 50 nM의 최종 농도에서 10 ㎖의 OPTI-MEM으로 대체한 PANC-1 세포 또는 A549 세포를 포함하는 페트리 접시에 첨가하고, 실온에서 5시간 배양 후 배지를 교체하고(PANC-1 세포는 5% FBS 첨가된 RPMI 1640, A549 세포는 10 % FBS 첨가된 DMEM), 2시간 배양하였다. 컨트롤로 Control siRNA를 30nM의 최종 농도로 첨가한 것을 사용하였다. 이러한 세포를 트립신(Trypsin) 처리하고, 10 cm 페트리 접시에서 분리, 채취하여 6 cm 페트리 접시에 1 × 10⁵ 개씩 다시 분주하였다. 그 후, 24시간마다 세포를 트립신(Trypsin) 처리하여, 샬레에서 분리, 채취하여 세포 수를 계산하였다. 형질주입(transfection) 4일 후의 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 이러한 결과에서 각 siRNA에 의한 세포 증식 저해 효과가 30nM의 최종 농도에서 거의 정체됨을 알 수 있다.

GST-π siRNA 및 Akt siRNA를 동시에 작용시킨 경우의 효과를 검증하기 위해 각 세포에 GST-π siRNA 및 Akt siRNA를 혼합한 Lipofectamine/siRNA 혼합 용액을 상기와 같이 첨가하여 세포 수를 계산하였다. 컨트롤로 Control siRNA를 30nM의 최종 농도로 첨가한 것을 사용하였다. 또한, 상기 Lipofectamine/siRNA 혼합 용액은 siRNA 용액으로 36 ㎕의 10 μM GST-π siRNA, 36 ㎕의 10 μM Akt siRNA 및 928 ㎕의 OPTI-MEM을 혼합한 것을 사용하여 상기와 같은 방법으로 제작하였다. 도 3 및 4에 결과에 나타난 바와 같이, GST-π와 Akt를 동시 녹다운하면, 어느 한쪽만 녹다운하였을 때보다 세포 증식 억제 효과가 커지는 것을 알 수 있다.

또한, 세포의 형태를 관찰하면 GST-π를 녹다운한 경우 비대해져 증식하지 않는 세포가 20 내지 30% 정도 보였다. 특히 PANC-1은 비대화와 함께 떠있는 세포(죽은 세포)도 많이 확인되었다. Akt를 녹다운한 경우 죽은 세포가 많이 관찰되었다. GST-π 및 Akt를 모두 녹다운한 경우, PANC-1, A549 모두, 둘 중 하나를 녹다운하였을 때보다 죽은 세포 수가 증가하였다. 이러한 연구 결과로, GST-π 또는 Akt의 녹다운에 의해 세포 사멸(apoptosis)이 유도되고, 양자를 녹다운하면 세포 사멸 (apoptosis)이 더 강하게 유도되는 것이 시사되었다.

실시예 2: GST-π siRNA 및 Akt 저해 약물 병용

Akt 저해제로 siRNA 이외의 물질을 사용하여도 같은 결과를 얻을 수 있음을 소분자인 Akt Inhibitor VIII(Merck # 124018,1,3-Dihydro-1- (1 - ((4- (6 -phenyl-1H-imidazo [4,5-g] quinoxalin-7-yl) phenyl) methyl) -4-piperidinyl) -2H-benzimidazol-2-one)를 사용하여 검토하였다. 또한, Akt Inhibitor VIII는 Akt의 Pleckstrin homology(PH) 영역에 결합하여 알로오스테리 저해를 주고, Akt3은 저해하지 않지만, Akt1 및 Akt2의 인산화 및 활성화를 선택적으로 차단하는 것으로 알려져 있다(Barnett, SF, et al. 2005. Biochem. J. 385 : 399-408, Lindsley, CW, et al. 2005. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 : 761-764, Zhao, Z. , et al. 2005. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 : 905-909).

1 × 10⁶ 개의 PANC-1 세포를 10 cm 페트리 접시에 분주하여 10% FBS와 5% L-글루타민(glutamine)을 첨가한 RPMI 1640배지에서 24시간 배양하였다. 배지를 10 ㎖의 OPTI-MEM으로 교체하여 실시예 1과 동일하게 제조한 GST-π siRNA를 50 nM의 최종 농도로 배양 접시에 첨가하고, 실온에서 5시간 배양 후, 배지를 5% FBS 첨가한 RPMI 1640배지로 교체하고, 2시간 배양하였다. 컨트롤로 Scramble siRNA를 같은 농도로 첨가한 것을 사용하였다. Scramble siRNA는 하기의 배열을 사용하였다(홋카이도 시스템 사이언스).

센스 사슬: CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG (서열 번호 3)

안티센스(Antisense) 체인: GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU (서열 번호 4)

이러한 세포를 트립신(Trypsin) 처리하여, 10 ㎝ 페트리 접시에서 분리, 채취하여 6 ㎝ 페트리 접시에 1 × 10⁵ 개씩 다시 분주하고, Akt Inhibitor VIII을 1 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 그 후, 24시간마다 세포를 트립신(Trypsin) 처리하여, 샬레에서 분리 채취하여 세포 수를 계산하였다. 검정방법은 Bonferroni/Dunn 방법을 사용하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 이 결과에서 Akt 저해제로 siRNA 이외의 물질을 사용하여도, GST-π 및 Akt 모두 저해하는 것이 GST-π 및 Akt 중 하나를 저해한 경우에 비해 세포 증식 억제 효과가 증대되는 것을 알 수 있다.

실시예 3: GST-π 및 Akt의 더블 녹다운에 의한 자가 소화 작용(autophagy)의 억제

GST-π 및 Akt의 더블 녹다운 통해 자가 소화 작용(autophagy)이 어떤 영향을 받는지를 검토하였다.

1 × 10⁶개의 PANC-1 세포를 10 ㎝ 페트리 접시에 분주하여 10% FBS와 5% L-글루타민(glutamine)을 첨가한 RPMI 1640배지에서 24시간 배양하였다. 배지를 10 ㎖의 OPTI-MEM으로 교체하여, 실시예 1과 동일하게 제조한 GST-π siRNA, Akt siRNA 또는 GST-π siRNA와 Akt siRNA의 혼합 용액을 각 siRNA가 10 nM의 최종 농도가 되도록 샬레에 첨가하고, 실온에서 5시간 배양 후 배지를 5% FBS를 첨가한 RPMI 1640배지로 교체하여 3 일간 배양하였다. 샬레의 세포를 차가운 PBS로 씻은 후 얼음처럼 차가운 Lysis buffer를 더해 세포를 분쇄하였다. Lysis buffer는 NP-40 Alternative, PROTEIN GRADE(R) Detergent 10% Solution, Sterile-Filtered (CALBIOCHEM 사) 100 ㎕, 1 M Tris-HCl(pH7.5) 500 ㎕, 5 M NaCl 300 ㎕, 0.5 M EDTA20 ㎕, 멸균증류수 9.08 ㎕을 혼합하여 제조하였다. 세포 파쇄액을 셀 스크래퍼로 모은 후, 30분 차게 두었다. 그동안 10분 간격으로 혼합하였다. 얻어진 용액을 15000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 채취하여 세포 추출액으로 사용하였다. 상기 세포 추출액을 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 1차 항체로서 항 LC3B 항체(Sigma 사)을 이용하여 전사막과 4℃, 16시간 반응시켰다. LC3 분자의 검출은 HRP표지 2차 항체와 반응시킨 후, 화학 발광 시약을 사용하여 진행하였다. 자가 소화 작용(autophagy)이 유도되어 있는지 여부는 LC3의 I형(18kDa)과 II형(16kDa)로 이행하여 평가하였다.

도 6의 결과에서 나타난 바와 같이. GST-π의 녹다운에 의해 유도된 자가 소화 작용(autophagy)이 Akt를 동시에 녹다운함으로써 거의 완전히 억제된 것으로 나타났다.

<110> Nitto Denko Corporation <120> Apoptosis-inducing agent <130> 15FPI-05-004 <150> JP JP 2012-278706 <151> 2012-12-20 <150> PCT/WO 2014/098210 A1 <151> 2013-12-20 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-p siRNA sense strand <400> 1 gggaggcaag accuucauut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-p siRNA antisense strand <400> 2 aaugaagguc uugccuccct g 21 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scramble siRNA sense strand <400> 3 cgauucgcua gaccggcuuc auugcag 27 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scramble siRNA antisense strand <400> 4 gcaaugaagc cggucuagcg aaucgau 27

Claims

GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 세포 사멸(apoptosis)을 유도하기 위한 약제.
GST-π를 억제하는 약물 및 Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, 세포 증식을 억제하기 위한 약제.
Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, GST-π가 억제된 세포에서 자가소화 작용(autophagy)을 억제하기 위한 약제.
Akt를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, GST-π를 억제하는 약물에 의한 세포사멸(apoptosis) 유도 및/또는 세포 증식 억제를 강화하기 위한 약제.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 RNAi 분자, 리보자임(ribozyme), 안티센스(Antisense) 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드(Chimeric polynucleotide) 및 이를 발현하는 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 세포의 이상 증식으로 인한 질환의 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 암 치료용 약학적 조성물.