CN1958572A - 二氢喹啉类化合物、其制备方法及药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的2－氧代－3－取代氨烷基－1，2－二氢喹啉衍生物的制备及其药理用途，其结构通式如式(I)所示，其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆和n的定义如说明书中所述。此类化合物可作为表皮生长因子受体(EGFR)的小分子抑制剂，主要阻断其蛋白酪氨酸激酶的磷酸化功能蛋白的效应环节，从而起到调控细胞的生长、增殖和分化等过程的作用。因此，有望开发成为新的抗肿瘤药物。

Description

二氢喹啉类化合物、其制备方法及药物组合物

技术领域

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物、其制备方法及含此类化合物的药物组合物。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的一大顽疾。全球每年患癌症的人有900万，死于癌症的患者为600万，我国癌症年发病人数在120万左右，每年死于癌症的人数高达90万以上，待治疗患者超过150万。攻克癌症难关是医药工作者的重大任务。

人们长时间以来所研究和应用的药物都是将癌细胞作为药物的作用靶，因此细胞毒性药物一直是治疗癌症的主要药物，但是始终不能解决的是此种抗癌药物的毒副作用问题。随着生物技术的提高，以及组合化学、高通量筛选等学科的发展，抗癌药物的寻找逐渐进入到对准特定的蛋白的阶段，其中，蛋白酪氨酸激酶在癌细胞增殖中的重要作用使它成为极具吸引力的癌症治疗靶标。蛋白酪氨酸激酶(PTKs)在肿瘤发生过程中起到十分重要的作用，已经知道有一半以上的原癌基因表达具备PTK活性的蛋白。蛋白酪氨酸激酶的作用是将ATP的磷酸基转移到功能蛋白特定酪氨酸残基上，而此酪氨酸磷酸化过程能调控细胞的生长、增殖和分化等过程。

蛋白酪氨酸激酶中研究最广泛的是表皮生长因子受体(EGFR)，EGFR是一个170KDa的跨膜糖蛋白，其结构包括膜外配体结合域、跨膜域、细胞内结构域(具备PTK活性)和一个C末端结构域。表皮生长因子受体家族包括四个成员：EGFR(ErbB-1)，ErbB-2(HER2)，ErbB-3(HER3)，ErbB-4(HER4)。

癌症临床研究表明该受体和它的配体与很多肿瘤都有重要联系，60％的癌症中出现EGFR的过量表达。这种异常表现有很多种形式，但每种异常都可导致过量的酪氨酸磷酸化信号传入细胞。在细胞系统里，EGF或其它ErbB家族配体经常引起不可控制的细胞繁殖，从而使细胞由正常形态转化为典型的异常形态。膜外配体和EGFR结合，导致EGFR受体形成二聚体(同型二聚体或异型二聚)，激活酪氨酸激酶，将增殖信号传入细胞。利用药物作用于EGFR，可以中止其所介导的增殖信号，从而阻止癌细胞的过量繁殖。有两类药物可起到这样的作用：一类是单克隆抗体，另一类是小分子药物。单克隆抗体药物的作用方式是占据EGFR的膜外配体，使EGF等内源配体无法与EGFR结合，从而阻止信号传入细胞。小分子药物则通过阻断EGFR胞内酪氨酸激酶催化区，阻止酪氨酸磷酸化，从而阻断了细胞增殖信号。

小分子EGFR抑制剂包括天然产物抑制剂和有机合成化合物。天然产物抑制剂的研究主要是通过对天然产物结构修饰寻找EGFR抑制剂(Alexander J.Bridges，Chem.Rev.2001，101，2541-2571)。天然产物抑制剂对EGFR有较好的抑制活性，但由于细胞毒性、酶选择性(尤其激酶选择性)和作用机理等方面的原因，目前尚未找到具有药物开发前途的天然产物母核。

有机合成类小分子抑制剂按照与EGFR的作用方式可分为可逆抑制剂和不可逆抑制剂，按照母核类型可分为4-苯氨基(杂)环并嘧啶类和4-苯氨基-3-氰基喹啉类。4-苯氨基(杂)环并嘧啶类是研究最为广泛的一类EGFR抑制剂，包括4-苯氨基喹唑啉类、4-苯氨基吡啶并嘧啶类和4-苯氨基吡咯并嘧啶类等，其中4-苯氨基喹唑啉类最具代表性。

截至2004年底，已经有一种EGFR合成类抑制剂Iressa作为治疗非小细胞癌的有效药物通过了FDA认证上市，另外还有十几种药物处于高级临床试验阶段。

EGFR抑制剂的开发仍存在很多问题，如引起人们关注的4-苯氨基喹唑啉类化合物未知毒性的问题，酶选择性的问题等。解决这些问题，开发新型的EGFR抑制剂是目前世界医药界的热门研究课题。

在多种肿瘤如鳞状细胞癌、神经胶质瘤及原代人乳腺癌种均有EGFR基因的扩增，其中，鳞状细胞癌系A431和人乳腺癌细胞系MDA-MB-468，由于其表达异常高水平的EGFR以及对EGF的异常反应而成为现今研究EGF作用以及EGFR功能的热点(Shimizu N et al；PNAS，1983，801：1337)。A431细胞中的异常高水平的EGFR与第7号染色体的易位有关，在第7号染色体的p13，q22区域含有c-erbB/EGFR基因。MDA-MB-468人乳腺癌细胞中也发现了R基因的扩增，并定位于第7号染色体的异常显代区域(7pABR)上(Filmus J et al.Somat Cell Mol Genet 1984，10-45)。因此，EGFR抑制剂对于抑制富含EGFR的鳞状细胞癌系A431和人乳腺癌细胞系MDA-MB-468的细胞繁殖亦能起到作用。

综上所述，以EGFR作为癌症靶标，设计并合成的EGFR抑制剂，必然对富含表皮生长因子受体(EGFR)的癌细胞生长具有抑制作用，亦可用于制备治疗过度或不正常细胞增生导致的疾病的药物，对抗癌药物的开发具有非凡的意义。

本发明所示化合物运用BIAcore实时测量其与EGFR的结合常数(K_D)，证明具有较强的结合，应证了其抗细胞增殖的作用机制。通过测定本发明化合物对SPCA1人肺癌细胞的抑制效果，揭示了其抗细胞增殖的作用。

发明内容

本发明的目的是提供了具有抗细胞增殖作用的新型的2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物。

本发明的另一个目的是提供以取代苯胺为原料合成新型的2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物的方法。

本发明的再一个目的是提供含2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物的抗细胞增殖方面的应用的药物组合物。

本发明又一个目的是提供该类药物的用途。

本发明所涉及的化合物可作为EGFR的小分子抑制剂，通过阻断其蛋白酪氨酸激酶的磷酸化功能蛋白的效应环节，从而起到调控细胞的生长、增殖和分化等过程的作用。因此，有望开发成为新的抗肿瘤药物。

本发明提供具有如下通式(I)结构的2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

n是1-3的整数。

R₁和R₂各自独立地选自氢，C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基，C₃-C₇环烃基，苄基，芳香基Ar，5-7元芳香杂环(含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子，可被苯基和芳香杂环并合，或被一个或多个选自卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基，芳香基Ar的基团所取代)。

R₃，R₄，R₅和R₆各自独立地选自氢，C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烷基及烷氧基，硝基，卤素，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基。

芳香基Ar可以是苯基，取代苯基(取代基可以是1-4个选自卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基的基团)，萘基，联苯基。

本说明书中所述的“药学上可接受的盐”具体地可列举与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。

本发明式(I)化合物的一个优选实施方案是如下2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，n是1

R₁，R₂，R₃，R₄，R₅和R₆的定义同权利要求1一致

本发明式(I)化合物的另一个优选实施方案是如下2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，n是1；R₄是甲基

R₁，R₂，R₃，R₅和R₆的定义同权利要求1一致

本发明式(I)化合物的又一个优选实施方案是如下2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，n是1；R₄是溴

R₁，R₂，R₃，R₅和R₆的定义同权利要求1一致

本发明提供式化合物I包含的(I_A)类化合物及其中间体II，III，IV和V的制备方法。其中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅和R₆的定义如上所述。

I_A类化合物的合成是以取代苯胺为原料，分别经乙酰化，环合，水解，N-烷基化和N-酰化制得。合成路线如下，

其中取代乙酰苯胺的制备用到的乙酰化试剂可以是乙酰氯、乙酸酐或各种乙酰混酐；用到的碱可以是无机碱NaCO₃、KCO₃、NaOH、KOH等，也可以是有机碱吡啶、三乙胺。反应温度为10-60℃，其中最适温度为室温。环合步骤(1)中所用POCl₃也可替换成PCI₅，反应温度为0-10℃；酸性水解步骤(2)中所用的盐酸可替换成硫酸、磷酸；酸的浓度为2-6M，反应温度为60-100℃，其中最适温度为100℃。N-烷基化步骤(3)中所用乙醇溶剂，也可替换成甲醇、THF、丙醇、异丙醇，反应温度为40-80℃，以回流为佳；还原步骤(4)中所用NaBH₄也可被其它还原试剂替代，如LiAlH₄、硼烷、钯/碳-H₂，反应温度为10-50℃，以室温为佳。N-酰化步骤(5)中所用溶剂可选自苯、甲苯、甲醇、THF、乙醇或混合溶剂。反应温度为10-50℃，以室温为佳。

本发明的另一个方面涉及预防和/或治疗肿瘤疾病的药物组合物，所述药物组合物含有式(I)所示2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体，其可用于体内治疗并具有生物相容性。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。本发明的药物组合物可以用于预防和/或治疗肿瘤疾病。

本发明所提供的药用组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉末、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。该药用组合物也可以包含气味剂、香味剂等，其理想的比例是，式(I)化合物作为活性成分占总重量比65％以上，其余部分为占总重量比0.5-40％，或更好为1-20％，或最好为1-10％的药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。

如上所述的结构式(I)的化合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最佳优选为口服。最佳优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性服用，或0.01-100mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。

式(I)化合物通过阻断EGFR蛋白酪氨酸激酶的磷酸化功能蛋白的效应环节，从而起到调控细胞的生长、增殖和分化等过程的作用。用于肿瘤疾病的治疗。

有益效果：

本发明的2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点。

本发明的2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物在计算机虚拟筛选以及与EGFR的结合常数(KD)，证明具有较强的结合，应证了抗肿瘤细胞增殖的作用机制。

本发明的化合物毒性很低。

因此，本发明的化合物可用于制备治疗肿瘤疾病的药物。

具体实施方式

在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量为说明依据的。

实施例1

2-氯-喹啉-3-甲醛(II-1)

将4.6克DMF加入到50毫升圆底烧瓶中，冰浴冷却搅拌下，缓慢滴加26.8克POCl₃。滴加完毕后，一次性加入3.4克N-乙酰苯胺，继续搅拌5分钟后，升温至75℃回流16小时。将反应液倾入150毫升冰水中，搅拌30分钟，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥得黄色固体产物2-氯-喹啉-3-甲醛3.1克，收率64.8％。Mp 144-146℃(lit.148-149℃)。

实施例2

2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-甲醛(III-1)

将3.1克2-氯-喹啉-3-甲醛(II-1)投入到55毫升4M盐酸中，搅拌回流1小时，冷至室温，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥得黄色固体产物2.6克，收率92.8％。Mp 300℃。MS-EI173(M)，144(100％)。

实施例3

3-[(吡啶-3-甲基亚氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮(IV-1)

将0.5克2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-甲醛和0.32克3-氨甲基吡啶溶于60毫升无水乙醇中，回流搅拌12小时，减压蒸除大部分溶剂，冷至室温，抽率，少量无水乙醇洗，得浅黄色固体0.6克，收率78.9％。Mp 180-182℃；¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：4.83(2H，s)，7.21(1H，t)，7.33(1H，d)，7.39(1H，m)，7.56(1H，t)，7.76(1H，d)，7.83(1H，d)，8.49(2H，m)，8.59(1H，d)，8.73(1H，t)。MS-EI 262(M-1，100％)。

实施例4

3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮(V-1)

将0.11克3-[(吡啶-3-甲基亚氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮(IV-1)溶于5毫升无水甲醇中，分批加入0.1克NaBH₄，室温搅拌1小时，将反应液倾入50毫升水中，氯仿提取(30ml×3)，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂得浅黄色固体0.095克，Mp 151-153℃，收率85.7％。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.80(1H，br)，3.46(2H，s)，3.85(2H，s)，7.17(1H，t)，7.36(2H，m)，7.46(1H，t)，7.64(1H，d)，7.79(1H，d)，7.86(1H，s)，8.44(1H，d)，8.56(1H，s)。MS-EI 265(M)，173(100％)。

实施例5

N’-(4-甲氧基苯基)-N-[(2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-1)

将55毫克3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，35毫克4-甲氧基苯基异硫氰酸酯投入到15毫升甲苯和1毫升无水甲醇得混合溶液中，室温搅拌12小时，析出大量固体，抽率，CH₂Cl₂洗得白色固体I_A-171毫克，Mp 179-181℃，收率80.0％。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.73(3H，s)，4.67(2H，s)，5.21(2H，s)，6.90(2H，m)，7.20-7.36(5H，m)，7.56(1H，t)，7.72(1H，d)，7.80(1H，d)，7.90(1H，s)，8.44(1H，s)，8.59(1H，s)。MS-ESI 431[M+H]⁺。

实施例6

N’-(4-甲氧基苯基)-N-[(7-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-2)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮替换成7-甲氧基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-2。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.73(3H，s)，3.82(3H，s)，4.62(2H，s)，5.21(2H，s)，6.86-6.91(4H，m)，7.29-7.36(3H，m)，7.66(1H，d)，7.81(1H，d)，7.89(1H，s)，8.45(1H，d)，8.60(1H，s)。MS-ESI 461[M+H]⁺。

实施例7

N’-(4-甲氧基苯基)-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-3)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-3。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.30(3H，s)，3.73(3H，s)，4.64(2H，s)，5.19(2H，s)，6.90(2H，m)，7.25-7.38(5H，m)，7.51(1H，s)，7.80(1H，d)，7.85(1H，s)，8.44(1H，d)，8.58(1H，s)。MS-ESI 445[M+H]⁺。

实施例8

N’-(4-甲氧基苯基)-N-[(7-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-4)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮替换成7-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-4。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.39(3H，s)，3.73(3H，s)，4.65(2H，s)，5.21(2H，s)，6.90(2H，m)，7.09(1H，d)，7.15(1H，s)，7.26-7.36(3H，m)，7.62(1H，d)，7.80(1H，d)，7.89(1H，s)，8.44(1H，d)，8.58(1H，s)。MS-ESI 445[M+H]⁺。

实施例9

N’-(4-甲氧基苯基)-N-[(6-溴-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-5)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮替换成6-溴-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-5。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.73(3H，s)，4.66(2H，s)，5.18(2H，s)，6.89(2H，m)，7.25-7.30(3H，m)，7.37(1H，m)，7.68(1H，d)，7.81(1H，d)，7.84(1H，s)，8.02(1H，d)，8.44(1H，d)，8.58(1H，s)。MS-ESI 509[M+H]⁺。

实施例10

N’-(3-氯苯基)-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-6)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，3-氯苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-6。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.37(3H，s)，4.67(2H，s)，5.19(2H，s)，7.20(1H，d)，7.29-7.44(4H，m)，7.49(1H，d)，7.51(1H，s)，7.65(1H，t)，7.83(1H，d)，8.00(1H，s)，8.47(1H，d)，8.61(1H，s)。MS-ESI 449[M+H]⁺。

实施例11

N’-(4-甲基苯基)-N-[(6-溴-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-7)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-溴-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲基苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-7。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.30(3H，s)，4.69(2H，s)，5.21(2H，s)，7.17(2H，d)，7.32-7.42(4H，m)，7.74(1H，d)，7.86(1H，d)，7.92(1H，s)，8.07(1H，s)，8.50(1H，d)，8.64(1H，s)。MS-ESI 493[M+H]⁺。

实施例12

N’-(4-甲硫基苯基)-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-8)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲硫基苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-8。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.38(3H，s)，2.45(3H，s)，4.67(2H，s)，5.21(2H，s)，7.25-7.46(7H，m)，7.55(1H，s)，7.84(1H，d)，7.94(1H，s)，8.47(1H，d)，8.61(1H，s)。MS-ESI 460[M+H]⁺。

实施例13

N’-(4-溴苯基)-N-[(6-溴-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-9)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-溴-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-溴苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-9。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：4.69(2H，s)，5.20(2H，s)，7.31-7.46(4H，m)，7.55(2H，d)，7.73(1H，d)，7.84(1H，d)，7.94(1H，s)，8.06(1H，d)，8.48(1H，d)，8.62(1H，s)。MS-ESI 557[M+H]⁺。

实施例14

N’-(2-甲氧酰基苯基)-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-10)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，2-甲氧酰基苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-10。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.37(3H，s)，3.74(3H，s)，4.70(2H，s)，5.19(2H，s)，7.33(2H，t)，7.37-7.60(5H，m)，7.77-7.88(3H，m)，8.49(1H，d)，8.62(1H，s)。MS-ESI 473[M+H]⁺。

实施例15

N’-(2，4-二氯苯基)-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-11)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，2，4-二氯苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-11。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.36(3H，s)，4.71(2H，s)，5.22(2H，s)，7.28(1H，d)，7.36-7.46(4H，m)，7.50(1H，d)，7.67(1H，d)，7.84(2H，d)，8.48(1H，d)，8.62(1H，s)。MS-ESI 483[M+H]⁺。

实施例16

N’-(4-三氟甲基苯基)-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-12)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-三氟甲基苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-12。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.37(3H，s)，4.70(2H，s)，5.21(2H，s)，7.31-7.45(3H，m)，7.56(1H，s)，7.70-7.83(5H，m)，8.02(1H，s)，8.47(1H，d)，8.62(1H，s)。MS-ESI 483[M+H]⁺。

实施例17

N’-萘基-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-13)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]1-1H-喹啉-2-酮，萘基-1-异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-13。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.39(3H，s)，4.84(2H，s)，5.30(2H，s)，7.31(1H，d)，7.39-7.59(7H，s)，7.83-7.97(5H，m)，8.50(1H，d)，8.66(1H，s)。MS-ESI 465[M+H]⁺。

实施例18

N’-(4-硝基苯基)-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-14)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-硝基苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-14。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.37(3H，s)，4.72(2H，s)，5.19(2H，s)，7.31-7.38(2H，m)，7.46(1H，d)，7.55(1H，s)，7.79-7.86(3H，m)，8.06(1H，s)，8.27(2H，d)，8.46(1H，d)，8.60(1H，s)。MS-ESI 460[M+H]⁺。

实施例19

N’-(2-氟苯基)-N-[(6-甲基-2-氧代-1，2-二氢-3-喹啉)-甲基]-N-(3-吡啶甲基)硫脲(I_A-15)

将3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，4-甲氧基苯基异硫氰酸酯分别替换成6-甲基-3-[(吡啶-3-甲氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮，2-氟苯基异硫氰酸酯，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得白色固体I_A-15。¹H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.37(3H，s)，4.71(2H，s)，5.22(2H，s)，7.16-7.29(4H，m)，7.34-7.40(3H，m)，7.50(1H，s)，7.83(2H，d)，8.47(1H，d)，8.61(1H，s)。MS-ESI 433[M+H]⁺。

实施例20

化合物与EGFR结合活性测定

表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)生物传感技术研究2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物与EGFR的相互作用。

1.实验方法：用pQE30作为载体，通过PCR的方法构建EGFR表达质粒，转化入大肠杆菌M15中，进行融合蛋白EGFR的表达和纯化。利用表面等离子共振原理研究化合物与EGFR的结合情况。

2.仪器和材料：

(1)表达载体pQE30、表达宿主菌M15为德国QIAGEN公司产品。

(2)各种限制性内切酶、T4DNA连接酶购于TaKara公司。

(3)纯化树脂Chelating Sepharose Fast Flow为Novagen公司产品。

(4)酪氨酸激酶活性检测试剂盒购自加拿大CHEMICON公司。

(5)TKI阳性化合物PD153035购自CALBIOCHEM公司。

(6)电泳纯的EGFR蛋白为本实验室分离纯化。

(7)HBS-EP缓冲液(10mM Hepes，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％(v/v)surfactantP20，pH 7.4)

(8)缓冲液EDC、NHS、Ethanolamine等，购自BIACOREAB公司(Uppsala，Sweden)

(9)BIAcore3000、CM5芯片购于BIACORE AB公司(Uppsala，Sweden)

3.操作步骤：

(1)EGFR质粒的构建：根据EGFR cDNA的序列设计引物，内含Hind III和Sph I酶切位点，以EGFR-pRK5质粒为模板，PCR扩增EGFR胞内酪氨酸激酶片段，将酶切后的PCR产物和表达载体pQE30连接并酶切鉴定正确后，转化入大肠杆菌M15。

(2)EGFR蛋白的表达及纯化：表达菌株M15(含构建好的EGFR质粒)37℃培养8小时后，转接至新鲜培养基LB中，继续培养3小时至对数生长期，加0.5mM IPTG诱导5小时。菌体经超声破碎后，4℃，14,000rmp离心，弃上清得到包涵体。包涵体用8M尿素溶解复性，通过Ni柱亲和层析纯化后得高纯度的EGFR胞内酪氨酸激酶。

(3)EGFR配体的筛选：用SPR(表面等离子共振)的方法测定蛋白EGFR和小分子化合物的结合活性。纯化的EGFR蛋白用氨基偶联的方式偶联到CM5芯片上，用阳性化合物PD153035验证蛋白的结合活性。然后，以1μM、10μM两个浓度初筛待测化合物，根据结果判断化合物是否具有结合活性。再对有活性的化合物进行详细的动力学实验。化合物母液浓度为10mM，用HBS-EP缓冲液按一定比例进行稀释，用Biacore 3000控制软件中的动力学分析Wizard进行动力学实验。得到的数据根据Biacore 3000分析软件中的1∶1(Langmuir)结合模型或稳态模型进行拟合，得到确切的动力学和热力学常数。

3.试验结果：

表1.2-氧代-3-取代氨烷基-1，2-二氢喹啉类化合物与EGFR结合的数据分析

序号	编号	解离常数KD(μM)
			12	IA-3IA-4	1.4680.7

实施例21

本发明化合物对SPCA1人肺癌细胞的增殖抑制效果实验(MTT法)

1、实验试剂与材料：

细胞：SPCA1人肺癌细胞

刺激因子：hEGF：人表皮生长因子(R and D Catalog：236-EG)

培养基：DMEM/F12 1∶1(GIBCO)

小牛血清(杭州四季青)

DMSO

MTT(5g/l)

待测化合物：根据实施例1-19制备的化合物I_A-1、I_A-2、I_A-3、I_A-4、I_A-5、I_A-6、I_A-7、I_A-8、I_A-9、I_A-10、I_A-11、I_A-12、I_A-13、I_A-14、I_A-15。

2、实验步骤：

根据分子量配成10mM/L的DMSO溶液；-20度保存；第一天，用含10％血清的DMEM/F12培养液接种细胞于96孔板中，细胞密度为1×104个/孔；第二天，用无血清的DMEM/F12同步化24小时；第三天，弃原来培养液，加药；各浓度各设3个复孔；每孔加100ul；药物干预48小时；取10mM/L的母液做1∶1000稀释(用无血清的DMEM/F12作为溶剂)，作为最高浓度，作倍比稀释，共设7个药物浓度；即：10um、5um、2.5um、1.25um、0.625um、0.3125um、0.156um、0um(阴性对照)；第五天，每孔加10ul MTT，4小时后酶标仪于492nm处测OD值。

3、结果分析：

以阴性对照组的增殖抑制率为0，其余各浓度与它相比，得出抑制率；计算抑制率公式为：

(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％

为了筛选出特异性针对EGFR酪氨酸激酶途径的新药，本实验设立了加hEGF刺激组，对粗筛后药物进行细筛选，找出抑制细胞增殖作用最强、作用浓度最低的、特异性强新型酪氨酸激酶抑制剂。实验方法同上，区别在于设置hEGF刺激组和无hEGF刺激组。

无hEGF刺激组：

取10mM/L的母液做1∶1000稀释(用无血清的DMEM/F12作为溶剂)，作为最高浓度，作倍比稀释，共设7个药物浓度；即：100uM、50uM、25uM、12.5uM、6.25uM、3.12uM、1.56uM、0uM(阴性对照)；

加hEGF刺激组：

同上，用无血清的DMEM/F12含10ng/ml hEGF的作为溶剂，对药物做如上稀释，阴性对照为含10ng/ml hEGF的无血清的DMEM/F12。

4、实验结果：

实验结果见表1-2

                       表1本发明化合物对SPCA1人肺癌细胞生长的抑制率(％)

化合物	100uM	50uM	25uM	12.5uM	6.25uM	3.12uM	1.56uM
								IA-1IA-2IA-3IA-4IA-5IA-6IA-7IA-8IA-9IA-10IA-11IA-12IA-13IA-14IA-15	23.315.655.3051.534.129.821.626.460.932.021.05.5213.853.1	11.98.445.8028.827.612.712.315.253.326.317.5014.251.6	0021.0017.219.12.410.613.031.220.116.2017.838.1	001.55010.912.408.6210.113.515.611.6012.325.7	00008.7410.706.738.55018.80010.77.67	00000003.210016.30001.18	00000000.91007.120000

                   表2I_A-3，5，10，15加hEGF刺激组(Y)与无hEGF刺激组(N)对SPCA1

                               人肺癌细胞生长的抑制率(％)比较

化合物		100uM	50uM	25uM	12.5uM	6.25uM	3.12uM	1.56uM
									IA-3IA-5	NYNY	55.460.739.246.0	36.554.833.035.4	30.050.924.021.7	23.741.223.718.3	22.732.411.414.8	7.2511.93.7310.2	2.877.134.887.87
化合物		50uM	25uM	12.5uM	6.25uM	3.12uM	1.56uM	0.75uM
									IA-10IA-15	NYNY	27.142.817.238.9	023.48.8037.6	07.704.0428.7	00.38010.8	00.40042.9	04.3003.87	03.4001.96

从表1中可以看出，本发明化合物对富含EGFR的SPCA1人肺癌细胞细胞生长有一定的抑制活性，其中化合物I_A-3、I_A-5、I_A-10和I_A-15表现为强效抑制；另外，从表1中可以看出，通过设置加与不加hEGF刺激对照，观察到化合物I_A-3、I_A-5、I_A-10和I_A-15都表现出一定的特异性针对EGFR酪氨酸激酶途径的增殖抑制作用。

Claims (14)

1.式(I)化合物，其对映异构体，非对映异构体，外消旋体和混合物，以及其与药用酸和碱所成的盐

其中：

n是1-3的整数；

R₁和R₂各自独立地选自氢，C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烃基，C₃-C₇环烃基，苄基，芳香基Ar，5-7元芳香杂环(含有1-3个选自氧、硫、氮的杂原子，可被苯基和芳香杂环并合，或被一个或多个选自卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基，芳香基Ar的基团所取代)；

R₃，R₄，R₅和R₆各自独立地选自氢，C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烷基及烷氧基，硝基，卤素，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基；

芳香基Ar可以是苯基，取代苯基(取代基可以是1-4个选自卤素，C₁-C₆直链或支链烃基，氰基，硝基，氨基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C₁-C₄烷氧基，巯基，C₁-C₄酰基的基团)，萘基，联苯基。

2.根据权利要求1所述的式(I)化合物，其对映异构体，非对映异构体，外消旋体和混合物，以及其与可药用酸和碱所成的盐，其特征在于：n是1，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅和R₆的定义同权利要求1一致。

3.根据权利要求2式(I)化合物，其对映异构体，非对映异构体，外消旋体和混合物，以及其与可药用酸和碱所成的盐，其特征在于：R₄为甲基，n是1，R₁，R₂，R₃，R₅和R₆的定义同权利要求1一致。

4.根据权利要求2式(I)化合物，其对映异构体，非对映异构体，外消旋体和混合物，以及其与可药用酸和碱所成的盐，其特征在于：R₄为溴，n是1，R₁，R₂，R₃，R₅和R₆的定义同权利要求1一致。

5.如权利要求1式(I)化合物，其对映异构体，非对映异构体，外消旋体和混合物，以及其与可药用酸和碱所成的盐，其特征在于所述药学上可接受的盐为丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、有机酸和天冬氨酸、谷氨酸酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸无机酸的盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸有机酸的盐。

6.如权利要求1式(I)化合物，其对映异构体，非对映异构体，外消旋体和混合物，以及其与可药用酸和碱所成的盐的制备，由下列步骤组成：

1)2-氯代喹啉-3-甲醛类化合物II的合成：

向DMF与POCl₃形成得活性中间体中加入取代的N-乙酰苯胺，回流搅拌12-48小时。将反应液倾入大量水中，搅拌30分钟，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥得产物II；

2)2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-甲醛类化合物III的合成：

2-氯代喹啉-3-甲醛类化合物II在4M的盐酸中回流1-5个小时，冷至室温，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥。得产物III；

3)3-[(取代亚氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮类化合物IV的合成：

将化合物III与过量的取代伯胺反应，乙醇中回流搅拌3-24小时，减压蒸除大部分溶剂，得到的溶液在冰箱中冷冻，抽滤，干燥。得产物IV；

4)3-[(取代氨基)甲基]-1H-喹啉-2-酮类化合物V的合成：

将化合物IV与过量的NaBH₄反应，室温搅拌搅拌1-5小时，将反应液倾入大量水中，有机溶剂萃取，干燥，过滤，减压蒸除溶剂得产物V；

5)N，N’-多取代硫脲类化合物I_A的合成：

将化合物V与过量的异硫氰酸酯反应，室温搅拌搅拌10-48小时，冷冻，抽滤，干燥得产物I_A。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于取代乙酰苯胺的制备用到的乙酰化试剂为乙酰氯、乙酸酐或各种乙酰混酐；用到的碱为无机碱NaCO₃、KCO₃、NaOH、KOH，或有机碱吡啶、三乙胺。反应温度为10-60C，其中最适温度为室温。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于环合步骤(1)中所用POCl₃也可替换成PCl₅，反应温度为0-10℃；酸性水解步骤(2)中所用的盐酸可替换成硫酸、磷酸；酸的浓度为2-6M，反应温度为60-100℃，其中最适温度为100℃。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于N-烷基化步骤(3)中所用乙醇溶剂，可替换成甲醇、THF、丙醇、异丙醇，反应温度为40-80℃，以回流为佳；还原步骤(4)中所用NaBH₄可被其它还原试剂替代，如LiAlH₄、硼烷、钯/碳-H₂，反应温度为10-50℃，以室温为佳。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于N-酰化步骤(5)中所用溶剂选自苯、甲苯、甲醇、THF、乙醇或混合溶剂，反应温度为10-50℃，以室温为佳。

11.一种含有0.05mg-200mg有效剂量的由权利要求1所述的化合物及赋形剂、载体或稀释剂组成的组合物。

12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于有效剂量的范围优选自0.1mg-100mg。

13.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于其给药途径包含口服、鼻腔吸入、透皮吸收、肺部给药以及非肠道的注射给药。

14.如权利要求1所述式(I)化合物，其对映异构体，非对映异构体，外消旋体和混合物，以及其与可药用酸和碱所成的盐的用途，在制备预防治疗肿瘤及相关疾病药物中应用。