CN102905716B - 以受体相关蛋白(rap)肽-岩藻糖苷酶抑制剂偶联物治疗肝病症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及用于以与岩藻糖苷酶抑制剂偶联的受体相关蛋白(RAP)肽分子治疗例如肝细胞癌等肝病症和肝肿瘤的方法和组合物。

Description

以受体相关蛋白(RAP)肽-岩藻糖苷酶抑制剂偶联物治疗肝病症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年1月28日提交的美国临时专利申请No.61/299,177的优先权益，所述申请以全文引用的方式并入本文。

技术领域

本发明大体涉及用于以包含受体相关蛋白(RAP)肽分子和岩藻糖苷酶抑制剂的偶联物治疗例如肝细胞癌等肝病症和肝肿瘤的方法和组合物。

背景技术

已注意到正常细胞与肿瘤细胞之间蛋白质糖基化的差异且所述差异已成为研发肿瘤选择性抗体的基础[1]。已观察到相对于正常肝细胞，肝细胞癌(HCC)细胞显著且不适当地使其糖蛋白岩藻糖基化[2；3；4；5；6]。大部分所述糖蛋白在肿瘤溶酶体中终其一生，其在所述肿瘤溶酶体中降解。一个报导提出溶酶体α-L-岩藻糖苷酶的血清含量增加预示HCC，表明此酶可能由癌前肝细胞上调以适应生物合成路径中糖蛋白岩藻糖基化的程度增加[7]。

溶酶体α-L-岩藻糖苷酶(FUCA1)的去活(例如由于基因的遗传突变)导致溶酶体储积症(lysosomalstoragedisease，LSD)，称为岩藻糖代谢病(fucosidosis)[8；9]。呈现岩藻糖代谢病的患者由于其溶酶体不能降解末端和核心岩藻糖基化寡糖而显示未降解物质的溶酶体积累，且很少再活过六年[10]。

美国专利No.5,240,707公开据推测适用作免疫调节剂和抗转移剂的α-甘露糖苷酶和岩藻糖苷酶抑制剂。其它已知岩藻糖苷酶抑制剂包括L-脱氧岩藻糖野尻霉素(L-deoxyfuconojirimycin，DFJ)[11]，其基于典型野尻霉素(nojirimycin)亚氨基糖结构且对溶酶体岩藻糖苷酶的抑制常数为10nM。还参见美国专利5,100,797，其公开基于脱氧岩藻糖野尻霉素(DFJ或DNJ)的其它抑制剂，例如β-L-高岩藻糖野尻霉素和1-β-C-取代的脱氧甘露糖野尻霉素(deoxymannojirimycin)。另一有效岩藻糖苷酶抑制剂为七元氮杂类别的成员((3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羟基氮杂-3-甲酸，也称为“Faz”)。尽管具有艾杜糖醛酸(iduronate)糖的羟基构型和羧基官能团，但此新型分子也以低纳摩尔浓度范围内的效能抑制岩藻糖苷酶[12]。如同大多数亚氨基糖抑制剂，预期胺的烷基修饰不会显著影响抑制剂效能[13；14]，而允许抑制剂与大生物聚合物(例如肽)容易且稳定地偶联。岩藻糖苷酶抑制剂另外描述于美国专利No.5,382,709、5,240,707、5,153,325、5,100,797、5,096,909和5,017,704中。

发明内容

本发明大体涉及用于治疗例如肝细胞癌等肝病症的组合物和方法。所涵盖的组合物包含来源于人受体相关蛋白(RAP)的肽与岩藻糖苷酶抑制剂偶联。RAP肽结合肝细胞上的LRP1受体，由此使岩藻糖苷酶抑制剂靶向肝脏。

在一个方面中，本发明提供一种包含连接于岩藻糖苷酶抑制剂的受体相关蛋白(RAP)肽的肽偶联物，所述RAP肽包含与SEQIDNO:1的RAP多肽至少80%同源的多肽序列。在又一方面中，本发明提供一种包含连接于岩藻糖苷酶抑制剂的受体相关蛋白(RAP)肽的肽偶联物，所述RAP肽包含与SEQIDNO:1的RAP的氨基酸210-319至少80%同源的多肽序列。在一个实施方案中，RAP肽从SEQIDNO:1的N端缺失至少200个且至多245个氨基酸。在一相关实施方案中，RAP肽从SEQIDNO:1的N端缺失245个氨基酸。

在某些实施方案中，RAP肽进一步从SEQIDNO:1的C端缺失至少4个且至多11个氨基酸。在另一实施方案中，RAP肽进一步从SEQIDNO:1的C端缺失11个氨基酸。在另一实施方案中，RAP肽缺少SEQIDNO:1的成熟RAP的氨基酸1-245和320-323。

在其它实施方案中，本发明所涵盖的RAP肽可由天然RAP序列构成或可包括所述天然序列的突变。在示例性实施方案中，本发明的RAP肽包含与如本文所述来源于SEQIDNO:1的任何RAP肽至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的RAP肽包含与SEQIDNO:1所示的RAP的氨基酸210-319、243-313、246-313、249-303或251-303至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的氨基酸序列。

在另一实施方案中，RAP肽包含与SEQIDNO:2所示的序列至少80%同源的多肽序列。在一相关实施方案中，RAP肽包含SEQIDNO:2所示的多肽序列。

在一些实施方案中，岩藻糖苷酶抑制剂是选自由野尻霉素亚氨基糖、七元氮杂取代的(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羟基-5-(羟基甲基)环戊胺和2,6-亚氨基-2,6,7-三脱氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇组成的组。

示例性岩藻糖苷酶抑制剂包括(但不限于)野尻霉素亚氨基糖，例如L-脱氧岩藻糖野尻霉素(DFJ或DNJ)、β-L-高岩藻糖野尻霉素和1-β-C-取代的脱氧甘露糖野尻霉素(β-1-C-甲基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-乙基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-苯基脱氧甘露糖野尻霉素)；和七元氮杂例如(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羟基氮杂3-甲酸(“Faz”)。预期用于本发明中的其它岩藻糖苷酶抑制剂包括(但不限于)取代的(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羟基-5-(羟基甲基)环戊胺和2,6-亚氨基-2,6,7-三脱氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇。

在另一实施方案中，岩藻糖苷酶抑制剂是选自由L-脱氧岩藻糖野尻霉素(DFJ或DNJ)、β-1-C-甲基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-乙基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-苯基脱氧甘露糖野尻霉素和(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羟基氮杂3-甲酸(Faz)组成的组。

在某些实施方案中，岩藻糖苷酶抑制剂在体外以1pM-100nM范围或1-100nM范围抑制α-L-岩藻糖苷酶。

在另一实施方案中，预期岩藻糖苷酶抑制剂通过肽连接子偶联。

在一些实施方案中，肽连接子为五肽连接子或树枝状聚合物。示例性树枝状聚合物包括(但不限于)赖氨酸树枝状聚合物、PAMAM树枝状聚合物、POPAM树枝状聚合物、三嗪树枝状聚合物和二氨基丁烷(DAB)树枝状聚合物。

在另一实施方案中，肽连接子为赖氨酸树枝状聚合物。赖氨酸树枝状聚合物包括(但不限于)第1、第2、第3、第4、第5或第6代赖氨酸树枝状聚合物，例如K4K2K赖氨酸树枝状聚合物和KG6赖氨酸树枝状聚合物。在一相关实施方案中，肽连接子为K4K2K赖氨酸树枝状聚合物。

在某些实施方案中，每一个RAP肽分子偶联一个或多个岩藻糖苷酶抑制剂。在一相关实施方案中，本发明涵盖RAP肽偶联物包含一个或多个抑制剂连接于同一个或多个RAP肽。在一个实施方案中，RAP肽可包含约1至5个、约1至10个、约5至10个、约10至20个、约20至30个、或30个或30个以上抑制剂分子连接于RAP肽。在一些实施方案中，预期RAP偶联物包含每一个RAP肽分子连接至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或12个以上抑制剂分子。在一相关实施方案中，偶联物包含1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1的抑制剂与RAP肽的化学计量比。岩藻糖苷酶抑制剂与RAP肽的其它化学计量比包括1:2、1:3、3:2、5:2、7:2、9:2、11:2、4:3、5:3、7:3、8:3、10:3、11:3。在一些实施方案中，抑制剂分子与RAP肽分子的比率介于1:1与12:1之间或介于1.5:1与10:1之间。

在另一实施方案中，RAP肽偶联物包含每一个RAP肽分子连接至少4个岩藻糖苷酶抑制剂。在另一实施方案中，RAP肽偶联物包含每一个RAP肽分子连接至少8个岩藻糖苷酶抑制剂。

在另一方面中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的肝肿瘤的方法，其包括施用治疗有效量的本文所述的RAP肽偶联物。

在一个实施方案中，肝肿瘤为肝细胞癌、肝炎病毒感染、肝硬化、中毒性肝损伤和遗传性血色沉着病的结果。

在一相关实施方案中，肝肿瘤为肝细胞癌的结果。

在另一实施方案中，治疗使得受试者的肝肿瘤尺寸减小。在另一实施方案中，治疗使得受试者血液中的甲胎蛋白含量与治疗前的含量相比降低。

在某些实施方案中，肽偶联物是静脉内施用。在一相关实施方案中，肽偶联物通过肝动脉施用。

在又一实施方案中，肽偶联物是与第二药剂联合施用。在某些实施方案中，第二药剂选自由化学治疗剂、细胞毒性剂、放射性同位素、抗病毒剂、抗真菌剂和消炎剂组成的组。在一相关实施方案中，化学治疗剂选自由阿霉素(doxorubicin)和5-氟尿嘧啶组成的组。

在另一实施方案中，第二药剂为细胞毒性剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂是选自由盐酸氮芥、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、白消安(busulfan)、塞替派(thiotepa)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、氮烯唑胺(dacarbazine)和链脲菌素(streptozocin)组成的组。

在另一实施方案中，第二药剂为放射性同位素。在一些实施方案中，放射性同位素是选自由¹³¹I、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、¹²⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²⁵⁵Fm、¹⁴⁹Tb、²²³Rd、²¹³Pb、²¹²Pb、²¹¹At、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、²²⁵Ac、¹⁸⁶Re、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga和^99mTc组成的组。

在一个实施方案中，肝肿瘤与肝炎病毒感染有关，且第二药剂为抗病毒剂。

还涵盖本文所公开的任何上述偶联物用于制备用以治疗本文所述的任何肝病症的药剂的用途。还涵盖用于治疗肝病症的包含如本文所述的RAP-肽岩藻糖苷酶偶联物的组合物。还涵盖任选地连同适合使用说明书包含任何上述偶联物的注射器(例如单用途或预填充注射器)、无菌密封容器(例如小瓶、瓶、容器)和/或试剂盒或包装。

本文所述的任何上述偶联物可与适用于作为辅助疗法治疗本领域中已知或本文所述的肝病症的任何药剂同时施用。还涵盖包含任何上述偶联物以及其它肝治疗剂的组合物。

应了解本文所述的各特征或实施方案或组合为本发明任何方面的非限制性、说明性实例，且因此意图可与本文所述的任何其它特征或实施方案或组合进行组合。举例来说，当以例如“一个实施方案”、“一些实施方案”、“其它实施方案”、“特定示例性实施方案”和/或“另一实施方案”等措辞描述特征时，所述类型的实施方案各自为意图与本文所述的任何其它特征或特征组合进行组合的特征的非限制性实例，而不必列出每一种可能组合。所述特征或特征组合适用于本发明的任何方面。当公开属于一定范围内的值的实例时，涵盖任何所述实例作为范围的可能端点，涵盖所述端点之间的任何和所有数值，且预见上端点与下端点的任何和所有组合。

附图说明

图1描绘经过连接子修饰的N-羧基戊基-(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羟基氮杂3-甲酸(Faz)。

图2说明经过连接子修饰的N-5-羧基戊基-脱氧岩藻糖野尻霉素(DNJ)。

图3为包含K4K2K赖氨酸树枝状聚合物和偶联抑制剂(=“X”)的RAP肽偶联物的图。

图4显示在体外在HepG2肝细胞癌细胞中脱氧岩藻糖野尻霉素(DNJ)对岩藻糖苷酶活性的作用。使用缓冲液作为对照组。

具体实施方式

本发明涉及一种包含连接于岩藻糖苷酶抑制剂的受体相关蛋白(RAP)或其片段或RAP或RAP片段的变体的偶联物。本发明还涉及所述偶联物用于治疗肝肿瘤、尤其肝细胞癌的用途。偶联物的RAP部分使岩藻糖苷酶抑制剂靶向肝细胞，且使得岩藻糖苷酶抑制剂选择性运输至肝细胞，并摄取至溶酶体中。不受本发明的理论束缚，岩藻糖苷酶抑制剂诱导来源于糖蛋白的寡糖积累于溶酶体中，此与肝细胞中溶酶体储积症的作用类似，由此在细胞中诱导细胞毒性事件。

定义

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。以下参考文献向本领域普通技术人员提供本发明中所用的许多术语的通用定义：Singleton等,DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY(第2版1994)；THECAMBRIDGEDICTIONARYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY(Walker编著,1988)；THEGLOSSARYOFGENETICS,第5版,R.Rieger等(编著),SpringerVerlag(1991)；和，Hale和Marham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY(1991)。

本文中引用的各公布、专利申请、专利和其它参考文献在不会与本发明不一致的程度上以全文引用的方式并入本文。

此处应注意，除非上下文另外明确指示，否则如本说明书和随附权利要求书中所使用，单数形式“一”和“所述”包括复数个指示物。

除非另有规定，否则如本文中所使用，以下术语具有归属于其的含义。

如本文中所使用，“岩藻糖苷酶抑制剂”是指抑制α-L-岩藻糖苷酶从糖蛋白裂解岩藻糖残基的活性的药剂，例如小分子。示例性岩藻糖苷酶抑制剂包括(但不限于)野尻霉素亚氨基糖，例如脱氧岩藻糖野尻霉素(DFJ或DNJ)、脱氧甘露糖野尻霉素(DMJ)和其衍生物。特定衍生物包括β-L-高岩藻糖野尻霉素和1-β-C-取代的脱氧甘露糖野尻霉素(β-1-C-甲基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-乙基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-苯基脱氧甘露糖野尻霉素)。示例性岩藻糖苷酶抑制剂还包括七元氮杂分子，例如(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羟基氮杂-3-甲酸(“Faz”)。预期用于本发明中的其它岩藻糖苷酶抑制剂包括美国专利5,382,709、5,240,707、5,153,325、5,100,797、5,096,909和5,017,704中所公开的抑制剂，包括(但不限于)取代的(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羟基-5-(羟基甲基)环戊胺和2,6-亚氨基-2,6,7-三脱氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇。术语“岩藻糖苷酶抑制剂”具体来说包括以下名称为“α-L-岩藻糖苷酶和岩藻糖苷酶抑制剂”的章节中所述的任何抑制剂和其衍生物。

如本文中所使用，“肝肿瘤”包括在肝脏内或肝脏上形成或与肝脏实体相关的原发性肿瘤和/或瘤形成和/或转移。其还包括迁移至身体内别处但仍对RAP肽与岩藻糖苷酶抑制剂的偶联物保持有反应的肝肿瘤转移。已知许多类型的所述肿瘤和瘤形成。原发性肝肿瘤包括肝细胞癌和本领域中已知的其它肿瘤。所述肿瘤一般为实体肿瘤，或其为积累定位于肝脏的弥漫性肿瘤。对于本发明的治疗来说，肿瘤或瘤形成可为恶性或良性的，且可能先前已经过化学疗法、辐射和/或其它治疗进行了治疗。

术语“有效量”意思是足以对受试者的健康状况、病理学和疾病产生期望结果或足以达成诊断目的的剂量。期望结果可包含剂量接受者的主观或客观改良。“治疗有效量”是指可对健康有效产生预定有益作用的药剂量。举例来说，有效量可包括有效减缓实体肿瘤生长或减小其尺寸的量。有效量可减少肿瘤转移。有效量可为有效减缓癌细胞增殖速率、停止癌细胞增殖或杀死癌细胞的量。

“小有机分子”是指大小与一般用于药物中的那些有机分子相当的有机分子。所述术语不包括有机生物聚合物(例如蛋白质、核酸等)。优选小有机分子的大小范围为至多约5,000Da、至多约2,000Da或至多约1,000Da。

诊断或治疗的“受试者”为人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类动物。

“治疗”是指预防性处理或治疗性处理或诊断性处理。

“预防性”处理为出于降低发展病理学的风险的目的而向未显示疾病征象或仅显示早期征象的受试者施用的治疗。本发明的偶联化合物可作为预防性处理给与以降低发展病理学的可能性或使病理学(如果已发展)的严重程度降至最低。

“治疗性”处理为出于减弱或消除病理学征象或症状的目的而向显示所述病理学征象或症状的受试者施用的治疗。所述征象或症状可为生物化学、细胞、组织学、功能性、主观或客观征象或症状。本发明的偶联化合物可作为治疗性处理给与或给与用于诊断。

“诊断”意思是确定病理学病状的存在或性质。诊断方法的特异性和选择性可不同。尽管特定诊断方法可能不提供对病状的确定性诊断，但如果所述方法提供有助于诊断的积极指示，那么其即足矣。

“药用组合物”是指适于在目标动物(包括人和哺乳动物)中进行药学应用的组合物。药用组合物包含药理学有效量的RAP肽与活性剂的偶联物，且还包含药学上可接受的载剂。药用组合物涵盖如下组合物，其包含活性成分和构成载剂的惰性成分，以及由任何两种或两种以上成分组合、复合或聚集或由一种或多种成分解离或由一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接得到的任何产物。因此，本发明的药用组合物涵盖通过混合本发明的偶联化合物与药学上可接受的载剂所制备的任何组合物。意图用于肠胃外施用的药用组合物须无菌。

“药学上可接受的载剂”是指任何标准药用载剂、缓冲液和赋形剂，例如磷酸盐缓冲生理食盐水溶液、5%右旋糖水溶液和乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种类型的湿润剂和/或佐剂。适合药用载剂和制剂描述于Remington'sPharmaceuticalSciences,第19版(MackPublishingCo.,Easton,1995)中。优选药用载剂视活性剂的预定施用模式而定。典型施用模式包括经肠(例如口部)或肠胃外(例如皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射；或局部、透皮或经粘膜施用)。“药学上可接受的盐”为可配制成用于药学用途的化合物的盐，包括例如金属盐(钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等)和氨或有机胺的盐。

如本文中所使用，术语“单位剂型”是指适合作为单位剂量用于人和动物受试者的物理个别单元，各单元含有经过计算足以产生期望作用的量的预定量的本发明化合物与药学上可接受的稀释剂、载剂或媒介物的结合。本发明的新型单位剂型的规格视以下而定：所用特定偶联物和欲达成的作用，和宿主中与各化合物有关的药效学。举例来说，用于口部施用的单位剂型可为锭剂、胶囊或丸剂或其组群。用于肠胃外施用的单位剂型可为含有设定毫克数剂量的小瓶或填充注射器或袋子。

如本文中所使用，“调节”是指通过增加或减少而变化的能力(例如充当拮抗剂或促效剂)。

如本文中所使用，“增加相对递送”是指借以使得包含RAP肽和岩藻糖苷酶抑制剂的偶联物在预定递送部位(例如肝脏)的积累相对于未偶联抑制剂的积累有所增加的作用。

“治疗指数”是指高于最小治疗量但低于不可接受的毒性量的剂量范围(量和/或时序)。

“等同剂量”是指含有相同量的活性剂的剂量。

“多核苷酸”是指由核苷酸单元构成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)，以及核酸类似物。核酸类似物包含包括非天然存在的碱基、参与除天然存在的磷酸二酯键以外的与其它核苷酸的键联的核苷酸或包括通过除磷酸二酯键以外的键联连接的碱基的核苷酸的核酸类似物。因此，核苷酸类似物包括例如(但不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。所述多核苷酸例如可使用自动DNA合成器来合成。术语“核酸”通常指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常指短的多核苷酸，一般不超过约50个核苷酸。应了解，当以DNA序列(即A、T、G、C)表示核苷酸序列时，此还包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”替代“T”。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

“cDNA”是指呈单链或双链形式的与mRNA互补或一致的DNA。

“互补”是指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑兼容性或所述表面匹配在一起。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合搭配物的核苷酸序列一致，那么第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列为5'-TATAC-3'的多核苷酸与序列为5'-GTATA-3'的多核苷酸互补。多核苷酸序列可完全互补(即100%匹配)或部分互补。

用于在DNA或RNA印迹(Southernornorthernblot)中在过滤器上使具有超过100个互补残基的互补核酸杂交的严格杂交条件的一实例为：在42℃下，含1mg肝素(heparin)的50%福尔马林(formalin)，进行杂交过夜。高严格度洗涤条件的一实例为0.15MNaCl，72℃下洗涤约15分钟。严格洗涤条件的一实例为：在65℃下0.2×SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述请参见Sambrook等)。

“重组多核苷酸”是指具有在天然状况下并不连接在一起的序列的多核苷酸。可将扩增或组装的重组多核苷酸包括于适合载体中，且所述载体可用于转化适合宿主细胞。包含重组多核苷酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。基因在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”。重组多核苷酸还可提供非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。

“表达控制序列”是指多核苷酸中调节可操作地连接的核苷酸序列的表达(转录和/或翻译)的核苷酸序列。“可操作地连接”是指两个部分之间的功能关系，其中一个部分的活性(例如调节转录的能力)对另一个部分产生作用(例如序列的转录)。表达控制序列可包括例如(但不限于)启动子(例如诱导性或组成性)、强化子、转录终止子、起始密码子(即ATG)、内含子拼接信号和终止密码子的序列。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接于待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞或体外表达系统供应。表达载体包括本领域中已知的所有表达载体，例如粘粒、质粒(例如裸质粒或含于脂质体中的质粒)和并有重组多核苷酸的病毒。

“多肽”是指由氨基酸残基构成的聚合物、其天然存在的相关结构变体和其通过肽键连接的非天然存在的合成类似物、其天然存在的相关结构变体和非天然存在的合成类似物。合成多肽例如可使用自动多肽合成器来合成。术语“蛋白质”通常指大的多肽。术语“肽”通常指短的多肽。

“RAP肽”或“RAP多肽”是指SEQIDNO:1的α-2-巨球蛋白／低密度脂蛋白受体相关蛋白关联的蛋白1(RAP)的片段或变体或其另一种天然存在的多形形式、Uniprot保藏编号P30533、Pfam保藏编号PF06400和PF06401。基于涉及插入一个或多个氨基酸、一个或多个氨基酸取代其它氨基酸或缺失一个或多个氨基酸的一个或多个突变，与亲本或参考多肽相比较，多肽变体的氨基酸序列组成不同。基于所置换的氨基酸与置换其的氨基酸的物理化学或功能相关性，取代可为保守性或非保守性取代。如本文中所使用，术语“RAP肽”应理解为表示SEQIDNO:1的RAP的片段，和所述片段的保留对于肝脏的相对选择性的大致上同源的变体。优选RAP肽的长度小于约200个氨基酸，或长度小于约175、150、125或100个氨基酸，且与RAP的至少50、60、70、80、90或100个氨基酸至少75%、80%、85%、90%或95%一致。优选RAP肽与RAP的结构域3大致上同源。所述肽保留对于肝脏的相对选择性，例如以10-5M或更好(即10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-9M以下)的亲和力结合LRP1。术语“RAP肽”具体来说包括以下名称为“RAP肽”的章节中所述的任何肽。

在两个或两个以上多核苷酸或多肽序列的情形中，术语“一致”或“一致性百分比”是指当出于最大对应性进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法中的一者或通过目测所测量，两个或两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。

在两个核酸或多肽的情形中，短语“大致上同源”或“大致上一致”一般指当出于最大对应性进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法中的一者或通过目测来测量，两个或两个以上序列或子序列具有至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或氨基酸残基一致性。优选地，实质一致性存在于序列中长度为至少约50、60、70、80或90个残基的区域上，或至少约100个残基的区域上，或至少约150个残基的区域上。在所述参考生物聚合物的整个长度范围内，所述序列大致上一致。在一些实施方案中，在两个比较生物聚合物的整个长度范围内，所述序列大致上一致。

为进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。序列比较算法根据指定程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

用于比较的序列的最佳对准例如可通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜寻法，通过所述算法的计算机化实施(威斯康辛遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage),GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过目测来进行。适于测定序列一致性和序列相似性百分比的算法的另一实例为BLAST算法，其描述于Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。

“大致上纯”或“经过分离”意思是目标物质为存在的主要物质(即，以摩尔计，在组合物中比任何其它个别大分子物质更丰富)，且大致上纯化的部分为目标物质占所有存在的大分子物质的至少约50%(以摩尔计)的组合物。一般来说，大致上纯的组合物意思是约80%至90%或90%以上存在于组合物中的大分子物质为目标的经过纯化的物质。如果组合物基本上由单一大分子物质组成，那么目标物质被纯化至基本上均质(通过常规检测方法不能在组合物中检测出污染物质)。出于此定义的目的，溶剂物质、小分子(<500道尔顿(Dalton))、稳定剂(例如BSA)和元素离子物质不视为大分子物质。在一些实施方案中，本发明的偶联物为大致上纯或经过分离的。在一些实施方案中，适用于本发明方法中的偶联物相对于其合成中所用的大分子起始物质为大致上纯或经过分离的。在一些实施方案中，本发明的药用组合物包含大致上纯化或分离的RAP肽与活性剂的偶联物与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂的混合物。

“天然存在”当应用于一对象时是指所述对象可见于自然界中。举例来说，存在于可从自然界来源分离的生物体(包括病毒)中且未经人在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。

“连接子”是指以共价方式或通过离子键、范德华力(vanderWaals)或氢键来联接两个其它分子的分子，例如在5'端与一个互补序列杂交且在3'端与另一个互补序列杂交，由此联接两个非互补序列的核酸分子。在某些实施方案中，预期连接子为通过肽键联接于分子的肽连接子。

如本文中所使用，“肿瘤”或“瘤形成”或“癌症”包括原发性肿瘤和/或转移。肿瘤包括例如卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、结肠癌或胃癌和其向肝脏的转移。

RAP肽

RAP分子最初产生为357个氨基酸的蛋白质(Uniprot保藏编号P30533)，所述蛋白质具有35个氨基酸的信号序列，所述信号序列裂解形成为323个氨基酸的肽的成熟RAP。成熟RAP的323个氨基酸的序列如SEQIDNO:1所示。成熟RAP还保留4个氨基酸的C端内质网滞留信号。

RAP在功能上为双牙的，其中第一与第三结构域(d1与d3)皆以低纳摩尔浓度亲和力结合LDLR内的一串特定互补型重复(CR)对(Andersen等,Biochemistry40,15408-15417,2001)。由约110个氨基酸组成的结构域3(d3)对应于SEQIDNO:1的氨基酸210至319。使用片段倾向于使免疫原性降至最低，使生产效率达到最大和改良效能。然而，经过分离的d3与受体的结合不如全长RAP情形中的d3紧密。d3的N端区域和d2的C端区域中所存在的其它序列为确保稳定折叠和高亲和力受体结合所必需。(Lazic等,Biochemistry42,14913-14920,2003)。由RAPd3与LDLRCR34之间的复合物获得的结构数据(Fisher等,MolCell22,277-283,2006)指示RAPd3的受体结合序列存在于由柔性环联接的长度近似相等的两个反平行α螺旋中。

包含非天然二硫键的环化RAP已进行了工程改造，从而连接构成RAPd3的受体结合单元的两个反平行螺旋的末端。[参见共同拥有的专利申请No.PCT／US2008/057863(WO2008/116171)和PCT/US2007/78792(WO2008/036682)，其公开内容以全文引用的方式并入本文]。在一些实施方案中，环化肽的长度为约75个氨基酸，但与未环化肽相比结合亲和力提高且亲和力与110个氨基酸的RAPd3相当。一个示例性肽是来源于人RAP的氨基酸246至313，具有如下氨基酸取代：E246C、L247G、G280A、L311A和S312C。此肽的序列如SEQIDNO:2所示。其它示例性肽例如与SEQIDNO:1的氨基酸247-311至少约80%一致或与SEQIDNO:1的氨基酸251-303至少约80%一致，且在N和C端处或附近(例如在距离末端约5个氨基酸以内)由Cys-Cys键连接。

SEQIDNO:2的表征显示此环状肽以约3.5nM的亲和力结合LRP1(参见WO2008/116171)。WO2008/116171公开结合LRP1的其它环状RAP肽。举例来说，mRAP-8c肽(RAP的氨基酸246至312，具有如下氨基酸取代：E246C、L247G和L311G和S312C)(SEQIDNO:3)以约4至6nM的亲和力结合LRP1(丛集II)受体。mRAPc肽(具有以下修饰的RAPd3：A242G、R314G、E241C和I315C)(SEQIDNO:4)以约10nM的亲和力结合LRP1，而mRAP14c肽(包含具有以下氨基酸取代的RAP残基250-309：F250C、L308G和Q309C)显示对LRP1的亲和力为约21nM。预期任何所述RAP肽均用于本发明。

所述肽的偶联还公开于WO2008/116171中。所述偶联物可包括五肽连接子，GGSGG(SEQIDNO:5)。在示例性实施方案中，通过使部分与RAP肽自身或五肽连接子的N端甘氨酸偶联来产生偶联物。或者，一个或多个赖氨酸可添加至肽或连接子的N端，且使化学(例如治疗性)部分与所述赖氨酸偶联。举例来说，一个肽偶联物包含通过添加另外连接于两个赖氨酸(K₂、K₃)(各自与两个化学部分偶联)的赖氨酸(K₁)而修饰的N端赖氨酸。第一赖氨酸(K₁)还连接至包含两个化学部分的鸟氨酸残基，且进一步连接至与两个化学部分偶联的最终赖氨酸残基(K₄)。

所述肽可容易地与多个岩藻糖苷酶抑制剂(包括岩藻糖苷酶抑制剂DFJ和Faz)偶联。多个抑制剂分子与肽偶联应通过向已较高的DFJ和Faz对酶的亲和力添加亲合性作用而使得溶酶体岩藻糖苷酶(具有多个活性位点的均四聚物[17])得到极其有效的抑制。预期每分子单体肽或多聚化肽偶联至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30个或30个以上抑制剂分子。在一些实施方案中，抑制剂分子与RAP肽分子的比率介于1:1与12:1之间或介于1.5:1与10:1之间。

预期RAP肽偶联物经历快速摄取且运输至肝细胞溶酶体，在肝细胞溶酶体中其应具有完全活性且偶联物进一步由溶酶体降解或不降解。不受理论束缚，提出通过此机制，在肝细胞中诱发类似LSD的岩藻糖代谢病，其中预期由于在肿瘤肝细胞中糖蛋白的过度岩藻糖基化而使所述细胞中的LSD作用明显增强。此方法代表治疗肝细胞癌而不伤害其它非肝脏组织和不伤害正常肝脏组织的新型方法。

用于本发明的RAP肽包括美国专利No.5,474,766和国际专利申请No.PCT／US2006/36453中所公开的那些RAP片段和变异型多肽，出于公开用于本发明的化合物和组合物中的所述肽和其制造的目的，所述专利各自以全文引用的方式并入本文。RAP肽是使用本领域技术人员已知的任何蛋白质制备和纯化方法制备。

在一个实施方案中，适用于本发明的RAP肽(包括环状RAP肽)的氨基酸序列从成熟RAP的N端缺失至少200个且至多248个氨基酸。因此，RAP肽可缺失成熟RAP的氨基酸1-209、1-220、1-225、1-230、1-235、1-240、1-241、1-242、1-243或者1-244、1-245、1-246、1-247或1-248。在一相关实施方案中，RAP肽氨基酸序列进一步从成熟RAP的C端缺失至少4个且至多11个氨基酸。因此，RAP肽可缺失成熟RAP的氨基酸314-323或313-323或者304-323、305-323、306-323、307-323、308-323、309-323、310-323、311-323或312-323。在一相关实施方案中，RAP肽氨基酸序列包含成熟RAP结构域3中具有以下特征的连续部分：(a)长度为至少50、55、60、65、70、75、80或85个氨基酸和(b)包含氨基酸256-270。RAP中可形成RAP肽(包括环状RAP肽)的基础的示例性部分包括成熟RAP(SEQIDNO:1)的氨基酸210-323、221-323、210-319、221-319、243-319、244-319、245-319、246-319、247-319、248-319、249-319、210-313、221-313、243-313、244-313、245-313、246-313、247-313、248-313、249-313、210-303、221-303、243-303、244-303、245-303、246-303、247-303、248-303或249-303。

所涵盖的其它RAP肽实施方案包含人或哺乳动物RAP多肽，其中所述多肽包含RAP中位置282-289、201-210和311-319上的天然氨基酸序列。RAP的结合LRP受体的突变型和N端或C端截短变体公开于Melman等(J.Biol.Chem.276(31):29338-46,2001)(其以全文引用的方式并入本文)中且尤其为所述RAP突变型和截短变体。其它所涵盖的RAP多肽包含RAP中氨基酸85-148和178-248之间的天然序列。(参见Farquhar等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3161-3162(1994))。

在另一实施方案中，本发明提供一种具有各种大小的RAP肽或环状RAP肽，包括长度为约103、约99、约95、约90、约85、约82、约80、约78、约76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57或56个氨基酸或56个氨基酸以下。在一些实施方案中，如果肽为环状RAP肽，那么在间隔约76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57或56个氨基酸的氨基酸之间形成共价键。应了解形成RAP肽的基础的所述片段可包括其它插入或取代，其限制条件为所述片段大致上与其同源。

如WO2008/116171中所述，可制备显示对于LRP1的亲和力和选择性与天然RAP类似(例如与天然RAP相比差异为约5倍或低于5倍)的环状RAP肽。还可制备与天然RAP相比显示改良的对LRP1的亲和力的环状RAP肽。在一个实施方案中，环状RAP肽显示对LRP1(P98157)的亲和力改良(相对于天然RAP)至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍或20倍。

本发明所涵盖的RAP肽可由天然RAP序列构成或可包括所述天然序列的突变。在示例性实施方案中，本发明的RAP肽包含与如本文所述来源于SEQIDNO:1的任何RAP肽至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的RAP肽包含与SEQIDNO:1所示的RAP的氨基酸210-319、243-313、246-313、249-303或251-303至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的氨基酸序列。

可制备相对于天然RAP序列含有保守性取代(例如至多5个、至多10个、至多15个、至多20个或至多25个)但仍保留对LRP1的结合亲和力的环状RAP肽。含有非保守性取代的RAP肽还可保留对LRP1的结合亲和力。举例来说，已显示成熟RAP的位置217、249或251中任一者上的非保守性突变不影响结合亲和力。也已产生位置241、242、247、250、308、309、311、314上的非保守性和保守性突变。

在任何先前实施方案中，RAP肽可在肽的N端处或附近含有半胱氨酸和在肽的C端处或附近含有半胱氨酸(例如距离末端3、4或5个氨基酸以内)，从而允许通过在两个半胱氨酸之间形成二硫键而使肽环化和使α螺旋稳定。任选地，甘氨酸或脯氨酸可插入半胱氨酸与α螺旋之间(例如在N端为Cys-Gly和在C端为Gly-Cys)。引入甘氨酸使得α螺旋被破坏，产生相邻非天然螺旋间二硫键。

另外预期本文所述的任何RAP肽多聚化为如本文所述的寡聚组合。如本文中所使用，“多聚化RAP肽”是指包含2个或2个以上RAP肽的多肽。术语“多聚物”和“寡聚物”在本文中可互换使用。在一个实施方案中，寡聚物或多聚物包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个环状RAP肽。在一个示例性实施方案中，环状RAP肽与生物素分子偶联以促进多聚化或寡聚化。生物素偶联的环状肽可随后通过结合于抗生蛋白链菌素(streptavidin)或通过结合于抗生物素抗体而多聚化。环状RAP肽寡聚物或多聚物还可通过本领域中熟知和下文描述的其它技术来制备。

形成肽的多聚物或寡聚物的许多技术为本领域中所已知。举例来说，肽可通过如本文所述的连接子或通过聚乙二醇连接。参见Zhang等,BioconjugChem.14:86-92,2003(通过聚(乙二醇)(PEG)间隔子或仅两个氨基酸连接的类淀粉原纤维结合肽对原纤维显示高达约100倍的亲和力，而将6个肽拷贝置于分支PEG上会使得亲和力达到高达10000倍)，所述文献以全文引用的方式并入本文。肽可在生物素化后通过偶合于抗生蛋白链菌素容易地多聚化。参见例如Guillaume等,J.Biol.Chem.,278:4500-4509,2003(肽多聚物可通过经抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物键联来制备，且可进行四聚物和八聚物的均质制备)，所述文献以全文引用的方式并入本文。具有受体结合能力的肽可移植于抗体或免疫球蛋白骨架的不同CDR区中。参见Frederickson等,ProcNatlAcadSciUSA.103:14307-12,2006，其描述含有两个移植mpl受体结合肽的抗体和片段以估计等效于天然配体的方式刺激mpl受体(所述文献以全文引用的方式并入本文)。肽可以串联或分支方式利用或不利用连接子连接于抗体Fc结构域。参见2000年5月4日公开的国际公布No.WO00/24782，所述文献以全文引用的方式并入本文。肽和其它蛋白质可展现于来源于多酶复合物的大分子骨架上。参见Domingo等,JMolBiol.305:259-67,2001，所述文献以全文引用的方式并入本文。关于适于展现肽的蛋白质骨架的综述，请参见Hosse等,ProteinScience15:14-27,2006(综述例如纤维结合蛋白III型结构域、脂钙蛋白(lipocalin)、扭结素(knottin)、细胞色素b562、孔尼兹(kunitz)型蛋白酶抑制剂、Z结构域和碳水化合物结合模块CBM4-2等骨架)，所述文献以全文引用的方式并入本文。

在一些示例性实施方案中，通过均二聚化包含环状RAP肽和抗体Fc区的多肽来制备二价寡聚组合。通过以环状RAP肽置换四聚免疫球蛋白(含有两个重链和两个轻链)中的抗体可变区来制备四价寡聚组合。在其它示例性实施方案中，通过使环状RAP肽与PEG分子偶联来制备二价、三价、四价或其它寡聚组合。本领域普通技术人员可设想其它寡聚组合。

树枝状聚合物还适于使RAP肽多聚化。树枝状聚合物为高度分支、通常呈球形的大分子聚合物。通过从具有多个反应性基团的核心分子开始按顺序反复反应来制备树枝状聚合物的三维寡聚结构。当使还具有多个反应性基团的单体单元与核心反应时，构成树枝状聚合物的外部边界的反应性基团的数目增加。可将连续数层单体分子添加至树枝状聚合物的表面，表面上分支和反应性基团的数目每添加一层则几何式地增加。树枝状聚合物中单体分子层的数目可称为树枝状聚合物的“代”。树枝状聚合物外表面上的反应性官能团的总数视核心所具有的反应性基团的数目、用于生长树枝状聚合物的单体所具有的反应性基团的数目和树枝状聚合物的代数而定。参见美国专利6,852,842。

本领域中已描述多种类型的树枝状聚合物，例如赖氨酸树枝状聚合物，包括(但不限于)第1、第2、第3、第4、第5或第6代赖氨酸树枝状聚合物，例如K4K2K赖氨酸树枝状聚合物和KG6赖氨酸树枝状聚合物(Okuda等,JControlledRelease116,330-336,2006)。其它树枝状聚合物包括PAMAM树枝状聚合物、POPAM树枝状聚合物、三嗪树枝状聚合物和二氨基丁烷(DAB)树枝状聚合物。参见例如Grayson和Frechet,ChemRev.2001,101,3819；Mintzer等,NewJChem.2009;33:1918-1925；美国专利6,852,842；美国公布No.20090287005、20090240028和20090182151。

RAP偶联物

“RAP偶联物”或“RAP肽偶联物”各指包含RAP肽连接于活性剂(例如岩藻糖苷酶抑制剂)的化合物。如本文中所使用，术语“偶联”意思是抑制剂和RAP肽通过例如共价化学键、物理力(例如范德华力)或疏水性相互作用、囊封、包埋或其组合而实体连接。在优选实施方案中，抑制剂和RAP肽通过共价化学键实体连接。在多个治疗剂的情况下，可使用各种偶联的组合。一些药剂含有将用于偶联于RAP肽的官能团，例如醇、酸、羰基、硫醇基或氨基。

在一些实施方案中，可为直接(无插入原子)或间接(通过连接子，例如共价连接的原子链)的共价化学键联接RAP肽和抑制剂。在优选实施方案中，偶联物的RAP肽和抑制剂部分通过RAP肽的原子与抑制剂的原子之间的共价键直接连接。在一些优选实施方案中，受体结合部分通过包含共价键或能够使RAP肽连接于抑制剂的几乎任何氨基酸序列的肽或任何分子或原子的连接子连接于本发明的化合物的抑制剂部分。

在一些实施方案中，连接子包含长度为1至约60个或1至30个原子或更长、2至5个原子、2至10个原子、5至10个原子、或10至20个原子的原子链。在一些实施方案中，链原子全部为碳原子。在一些实施方案中，链原子是选自由C、O、N和S组成的组。链原子和连接子可根据其预期溶解性(亲水性)进行选择以提供更可溶的偶联物。在一些实施方案中，连接子提供在溶酶体中经受酶攻击的官能团。在一些实施方案中，连接子提供经受靶组织或器官中所存在的酶攻击且在攻击或水解后切断抑制剂与RAP肽之间的键联的官能团。在一些实施方案中，连接子提供在靶部位所存在的条件(例如溶酶体的低pH值)下经受水解的官能团。连接子可含有一个或多个此类官能团。在一些实施方案中，连接子的长度足够长以降低RAP肽结合位点与活性剂活性结合位点中一者或两者之间的位阻(当活性剂较大时)的可能性。

如果连接子为共价键或肽且活性剂为多肽，那么整个偶联物可为融合蛋白。所述肽基连接子可为任何长度。示例性连接子的长度为约1至50个氨基酸，长度为5至50个或10至30个氨基酸。所述融合蛋白可通过本领域普通技术人员已知的重组遗传工程改造方法来产生。在一些实施方案中，偶联物的RAP肽部分经过配制以快速降解以便释放活性化合物。在其它实施方案中，连接子在细胞内或更优选溶酶体环境条件下经受裂解以使活性剂部分从RAP肽多肽部分释放或分离。

示例性肽连接子包括本领域中已知的任何树枝状聚合物，例如赖氨酸树枝状聚合物，包括(但不限于)第1、第2、第3、第4、第5或第6代赖氨酸树枝状聚合物，例如K4K2K赖氨酸树枝状聚合物或KG6赖氨酸树枝状聚合物(Okuda等,JControlledRelease116,330-336,2006)。其它树枝状聚合物包括PAMAM(聚(酰胺基胺))树枝状聚合物、POPAM(聚氨基亚丙基胺)树枝状聚合物、POPAM-PAMAM杂交树枝状聚合物、三嗪树枝状聚合物。参见例如Grayson和Frechet,ChemRev.101:3819,2001；Mintzer等,NewJChem.33:1918-1925,2009；Majoros等,Macromolecules,41:8372-8379,2008；和美国专利公布No.20090287005、20090240028和20090182151。

偶联物可包含一个或多个抑制剂连接于同一个或多个RAP肽。举例来说，偶联反应可使约1至5个、约1至10个、约5至10个、约10至20个、约20至30个、或30个或30个以上抑制剂分子与RAP肽偶联。在某些实施方案中，预期RAP偶联物主要(例如超过50%、70%、80%或90%)包含每一个RAP肽分子连接1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或12个以上抑制剂分子，例如化学计量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1。岩藻糖苷酶抑制剂与RAP肽的其它化学计量比包括1:2、1:3、3:2、5:2、7:2、9:2、11:2、4:3、5:3、7:3、8:3、10:3、11:3。在一些实施方案中，抑制剂分子与RAP肽分子的比率介于1:1与12:1之间或介于1.5:1与10:1之间。所述制剂可以混合物形式使用，或其可纯化为特定化学计量制剂。

本领域技术人员能够判定何种格式和何种化学计量比优选。此外，如果需要将一种以上类型的药剂递送至靶部位或代谢区，那么可将一种以上类型的抑制剂连接于RAP肽。多种抑制剂物质可连接于同一RAP肽，例如DFJ-FazRAP或其它偶联物。因此，偶联物可由多种化学计量比组成且并有一种以上类型的抑制剂。所述物质还可分离为经过纯化的混合物或其可以聚集体使用。

本文所述的RAP肽偶联物可如本领域中所已知进行修饰以增强其稳定性或药物动力学性质(例如聚乙二醇化或连接其它水溶性聚合物)。示例性水溶性聚合物包括(但不限于)聚(烷二醇)，例如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇与丙二醇的共聚物等；单甲氧基-PEG；聚(环氧乙烷)(PEO)；葡聚糖；聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)；脂肪酸；聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物；聚氧乙基化多元醇(例如甘油)；HPMA；FLEXIMAR^TM；和聚乙烯醇；单(C1-C10)烷氧基-PEG；芳氧基-PEG；三氟乙磺酸基单甲氧基PEG；PEG丙醛；双丁二酰亚胺基碳酸酯PEG；纤维素；其它基于碳水化合物的聚合物；和任何上述物质的组合。

在一些实施方案中，水溶性聚合物为线性(例如烷氧基PEG或双官能PEG)、分支或多臂(例如叉状PEG或连接于多元醇核心的PEG)、树枝状，或具有可降解键联。此外，聚合物分子的内部结构可以许多不同型态组织化且可选自由均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、无规三聚物和嵌段三聚物组成的组。

如本文中所使用，术语“聚乙二醇化”是指蛋白质、蛋白质偶联物或多肽结合于一个或多个PEG部分。如本文中所使用，术语“聚乙二醇化”是指一个或多个PEG结合于蛋白质的过程。在一个实施方案中，所述PEG的分子量在3至100kDa、5至60kDa、5至40kDa、5至25kDa、5至15kDa或5至10kDa的范围内。

适合连接子和其官能团和容易适用于制备其的合成化学方法描述于美国专利公布No.2003253890中，所述文献以全文引用的方式并入本文。

RAP偶联物的表征

i.标记

在一些实施方案中，基于RAP肽的偶联物经过标记以促进其检测。“标记”或“可检测部分”为可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理方法检测的组合物。

如上文所述，视所用筛选分析而定，可对偶联物的活性剂、连接子或RAP肽部分进行标记。所使用的特定标记或可检测基团并非本发明的关键方面，只要其不显著干扰偶联物的生物活性即可。可检测基团可为具有可检测物理或化学性质的任何物质。因此，标记为可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组合物。

适用于本发明中的标记的实例包括(但不限于)荧光染料(例如异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate)、得克萨斯红(Texasred)、罗丹明(rhodamine)等)、放射性标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、电子致密试剂、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和常用于ELISA中的其它酶)和比色标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料珠粒(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原和其它蛋白质例如可通过将标记并入半抗原或肽中而变得可检测。

标记可根据本领域中熟知的方法直接或间接偶合于分析的期望组分。在一个实施方案中，使用异氰酸酯试剂使标记共价结合于生物聚合物以偶联本发明的活性剂。在本发明的一个方面中，本发明的双官能异氰酸酯试剂可用于使标记与生物聚合物偶联以形成未连接活性剂的标记生物聚合物偶联物。标记生物聚合物偶联物可用作合成本发明的标记偶联物的中间物或可用于检测生物聚合物偶联物。如上文所指示，可使用多种标记，其中标记的选择视所需敏感性、与分析的期望组分偶联的容易性、稳定性要求、可用仪器和处置规定而定。非放射性标记常常通过间接方法来连接。配体分子(例如生物素)一般共价结合于分子。配体结合另一分子(例如抗生蛋白链菌素)，所述分子本身即可检测或共价结合于信号系统，例如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物。

偶联物还可直接与产生信号的化合物偶联，例如通过与酶或荧光团偶联。适用作标记的酶包括(但不限于)水解酶，尤其为磷酸酶、酯酶和糖苷酶(glycosidase)；或氧化酶，尤其为过氧化物酶。适用作标记的荧光化合物(即荧光团)包括(但不限于)荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、丹酰基(dansyl)、伞酮(umbelliferone)等。适合荧光团的其它实例包括(但不限于)伊红(eosin)、TRITC-胺、奎宁(quinine)、荧光素W、吖啶黄(acridineyellow)、丽丝胺罗丹明(lissaminerhodamine)、B磺酰氯红荧素(Bsulfonylchlorideerythroscein)、钌(tris，联吡锭)、得克萨斯红、烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸等。适用作标记的化学发光化合物包括(但不限于)虫荧光素(luciferin)和2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺(luminol)。关于可用于本发明方法中的各种标记或信号产生系统的综述，请参见美国专利No.4,391,904。

检测标记的方法为本领域技术人员所熟知。因此，举例来说，当标记为放射性标记时，检测方法包括闪烁计数器或如自动放射摄影术中的感光胶片。当标记为荧光标记时，其可通过以适当波长的光激发荧光染料且检测所产生的荧光来检测。可通过使用例如电荷耦合装置(CCD)或光电倍增器等电子检测器来视觉检测荧光。类似地，可通过提供酶的适当底物且检测所产生的反应产物来检测酶标记。可通过观察与标记相关的颜色来简单地检测比色或化学发光标记。适用于本发明的方法中的其它标记和检测系统对于本领域技术人员将显而易见。所述经过标记的调节剂和配体可用于诊断疾病或健康状况。

RAP受体LRP1

LRP1(低密度脂蛋白受体相关蛋白1)为低密度脂蛋白受体“LDLR”家族的成员。LRP1为具有4525个氨基酸的大型蛋白质(600kDa)，其由弗林蛋白酶(furin)裂解以产生保持非共价结合的515-(α)kD与85-(β)kDa的两个次单元。LRP表达于大多数组织类型上，但主要发现于肝脏中。低密度脂蛋白(LDL)受体家族的其它成员包括LDL-R(132kDa)；LRP2(阴离子蛋白(megalin)，gp330)；LRP／LRP1和LRP1B(600kDa)；VLDL-R(130kDa)；LRP5；LRP6；apoER-2(LRP-8，130kDa)；镶嵌LDL-R(MosaicLDL-R)(LR11，250kDa)；和其它成员，例如LRP3、LRP6和LRP-7。所述家族的特有特征包括细胞表面表达；细胞外配体结合结构域重复(DxSDE)；配体结合需要Ca++；RAP与apoE的结合；EGF前驱体同源结构域重复(YWTD)；单一跨膜区；细胞质结构域中的内化信号(FDNPXY)；和各种配体的受体介导的内饮作用。所述家族的一些成员(包括LRP1)参与信号转导路径。在一些实施方案中，与LDL-R家族的其它成员相比，本发明的RAP肽偶联物优先结合LRP1，例如对LRP1的亲和力为1.5、2、3、4、5、10倍或10倍以上。

LRP1具有GenBank保藏编号：X13916和SwissProt初级保藏编号：Q07954。LRP1基因/蛋白质的替代名称包括：低密度脂蛋白受体相关蛋白1[前驱体]、LRP、α-2-巨球蛋白受体、A2MR、脂蛋白元E受体、ApoER、CD91、LRP1或A2MR。表达于肝脏和血管平滑肌组织上的LRP1可将配体内饮至所述组织中。

α-L-岩藻糖苷酶和岩藻糖苷酶抑制剂

α-L-岩藻糖苷酶(Genbank保藏编号NP_000138)(以引用的方式并入本文)通常参与溶酶体中长糖链(寡糖)的裂解。当不存在所述酶时，糖链积累且最终导致岩藻糖代谢病的临床特征。岩藻糖代谢病为由α-L-岩藻糖苷酶缺陷和岩藻糖积累于组织中所引起的常染色体隐性溶酶体储积症。参见例如Johnson等,Biochem.Biophys.Res.Commun.133:90-7,1986。不同表型包括以下临床特征：例如神经退化、生长迟滞、内脏肥大和重度早期形式的疾病发作；粗糙脸部特征、弥漫性体血管角质瘤(angiokeratomacorporisdiffusum)、痉挛状态和较长存活形式的精神运动发育延迟。

岩藻糖代谢病可使用鉴别岩藻糖苷酶基因中的突变的遗传学测试来检测。岩藻糖苷酶也根据岩藻糖代谢病患者的尿中岩藻糖基化蛋白质的含量增加的存在来进行诊断(Michalski等,EurJBiochem.201:439-58,1991)。

已在肝细胞癌中检测到α-L-岩藻糖苷酶的含量增加且已提出其为HCC的标记(Giardina等,Cancer70:1044-48,1992)。

许多岩藻糖苷酶抑制剂为干扰碳水化合物键的岩藻糖苷酶水解的酶活性的小分子。一些岩藻糖苷酶抑制剂是基于野尻霉素亚氨基糖的结构(参见美国专利5,100,797)，所述糖为由于其结构类似于天然底物的糖部分而抑制糖苷酶的拟糖生物碱。亚氨基糖与细菌糖苷酶抑制剂类似。为制备亚氨基糖化合物，以含氮环(吡咯啶、哌啶)置换单糖的含氧环，产生亚氨基糖，其充当拟糖物(glycomimetic)。

L-脱氧岩藻糖野尻霉素(DFJ)为人肝脏α-L-岩藻糖苷酶的有效、特异性且竞争性的抑制剂(在10nM的范围内)。已显示脱氧岩藻糖野尻霉素的保留哌啶环碳原子2、3和4处羟基的构型的结构类似物保留岩藻糖苷酶抑制剂活性。举例来说，碳原子1(即1-α和1-β-高岩藻糖野尻霉素)和碳原子5处呈任一构型的不同取代基可改变效能，但不破坏活性。参见Winchester等,Biochem.J.265:277-282,1990。

其它岩藻糖苷酶抑制剂为氮杂糖，例如七元氮杂其为模拟碳水化合物结构的含氮环化合物且为糖基水解酶功能的有效抑制剂[12]。尽管具有艾杜糖醛酸糖的羟基构型和羧基官能团，但所述新型分子还以低纳摩尔浓度范围内的效能抑制岩藻糖苷酶[12]。如同大多数亚氨基糖抑制剂，预期胺的烷基修饰并不显著影响抑制剂效能[13；14]，从而允许抑制剂与大型生物聚合物(例如肽)容易且稳定地偶联。其它岩藻糖苷酶抑制剂为取代的环戊胺(美国专利5,382,709)。

示例性岩藻糖苷酶抑制剂包括(但不限于)野尻霉素亚氨基糖，例如L-脱氧岩藻糖野尻霉素(DFJ)、β-L-高岩藻糖野尻霉素和1-β-C-取代的脱氧甘露糖野尻霉素(β-1-C-甲基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-乙基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-苯基脱氧甘露糖野尻霉素)；和七元氮杂例如(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羟基氮杂3-甲酸(“Faz”)。预期用于本发明中的其它岩藻糖苷酶抑制剂包括(但不限于)取代的(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羟基-5-(羟基甲基)环戊胺和2,6-亚氨基-2,6,7-三脱氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇。其它岩藻糖苷酶抑制剂公开于美国专利5,382,709、5,240,707、5,153,325、5,100,797、5,096,909和5,017,704中。

预期在1pM-100nM范围或1-100nM范围内保留活性(即体外抑制α-L-岩藻糖苷酶的能力)的岩藻糖苷酶抑制剂用于如本文所述的偶联物中。

使用方法、药用组合物和其施用

可通过将偶联物溶解、混悬或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇)中和必要时连同常规添加剂(例如增溶剂、等渗剂、混悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)一起而将其配制为注射用制剂。

偶联物可用于待通过吸入施用的气雾剂制剂中。可将本发明的化合物配制于经过加压的可接受推进剂(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。

用于注射或静脉内施用的单位剂型可在呈无菌水、无菌生理食盐水或另一药学上可接受的无菌载剂中的溶液形式的组合物中包含偶联物。

在实际使用中，根据常规药学混配技术，本文所述的RAP肽偶联物可作为活性成分与药用载剂组合成均匀混合物。载剂可视施用(例如口部或肠胃外(包括静脉内))期望的制剂形式而采用多种形式。

关于透皮施用途径，透皮施用药物的方法公开于Remington'sPharmaceuticalSciences,第17版,(Gennaro等编著MackPublishingCo.,1985)中。真皮或皮肤贴片为一种透皮递送适用于本发明方法中的偶联物的手段。贴片优选提供吸收增强剂(例如DMSO)以增加化合物的吸收。其它透皮药物递送方法公开于美国专利No.5,962,012、6,261,595和6,261,595中。各专利均以全文引用的方式并入本文。

药学上可接受的赋形剂(例如媒介物、佐剂、载剂或稀释剂)可购得。此外，药学上可接受的辅助物质(例如pH值调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等)也可购得。

本领域技术人员将易于了解，剂量可随特定化合物、症状严重程度和受试者发生副作用的容易性而变化。指定化合物的优选剂量易于由本领域技术人员通过多种方法来确定，所述方法包括(但不限于)在患者、测试动物中和在体外进行剂量反应和药物动力学评定。

在所述方面中的每一方面中，组合物包括(但不限于)适于口部、经直肠、局部、肠胃外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、经肺(经鼻或经颊吸入)或经鼻施用的组合物，但在任何指定情况下，最适合的途径将部分视所治疗病状的性质和严重程度和活性成分的性质而定。示例性施用途径为口部和静脉内途径。组合物宜以单位剂型提供且可通过药剂学技术中熟知的任何方法制备。

本发明的组合物可以囊封于或附着于病毒被膜或微脂粒或并入细胞中的形式施用。微脂粒为微胞(micellular)颗粒，其通常呈球形且常常为脂类。脂质体为由双层膜形成的微脂粒。适合微脂粒包括(但不限于)单层微脂粒和多层脂质微脂粒或脂质体。所述微脂粒和脂质体可使用标准技术(例如美国专利No.4,394,448中所述的技术)，由多种脂质或磷脂化合物(例如磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、糖脂、神经节苷脂等)制成。所述微脂粒或脂质体可用于将化合物施用至细胞内和将化合物递送至靶器官。目标组合物的控制释放也可使用囊封来达成(例如参见美国专利No.5,186,941)。

可使用将RAP肽偶联物递送至血流中的任何施用途径。优选地，组合物是肠胃外施用，最优选为静脉内施用。在一些实施方案中，组合物通过门静脉施用。颈静脉内和颈动脉内注射也为适用的。组合物可局部或区域性施用，例如腹膜内或皮下或肌肉内施用。在一个方面中，组合物与适合药用稀释剂或载剂一起施用。

待施用的剂量将视受试者需要、期望效果、所用活性剂、生物聚合物和所选施用途径而定。偶联物的优选剂量在约0.2pmol／kg至约25nmol／kg的范围内，且尤其优选剂量在2-250pmol／kg的范围内；或者，偶联物的优选剂量可在0.02mg／kg至2000mg／kg或0.1mg／kg至100mg／kg的范围内。所述剂量将受与RAP偶联物相关的抑制剂部分的数目影响。或者，剂量可基于所施用的抑制剂的摩尔数来计算。

本领域技术人员可部分基于用于游离形式的偶联活性剂的推荐剂量来确定适于连接至RAP肽的化合物的剂量。

本发明的偶联物和调节剂适用于动物(例如哺乳动物，且尤其为人)的治疗性、预防性和诊断性介入。

本发明方法可用于治疗多种不同疾病病状。在某些实施方案中，尤其关注本发明方法在以下疾病病状中的用途：其中认定岩藻糖苷酶抑制剂有益，但所述抑制剂并未适当地递送至靶部位、区域或代谢区以产生完全令人满意的治疗效果。使用使抑制剂与RAP肽偶联的本发明方法以便增强岩藻糖苷酶抑制剂的治疗功效和治疗指数。

可以本发明偶联物治疗的特定疾病病状有多种。因此，影响肝脏且可由本发明的方法治疗的疾病病状包括细胞增殖性疾病(例如赘生性疾病)、自体免疫性疾病、激素异常疾病、退化性疾病、老化疾病和其可能会导致肝肿瘤生长的类似疾病。

治疗意图涵盖与施用偶联物相关的任何对受试者有益的结果，包括患病的可能性降低、预防疾病、减缓、阻止或逆转疾病的进展或改善与折磨宿主的疾病病状相关的症状，其中改善或益处是在广泛意义上用于指至少降低参数(例如与所治疗的病理学病状相关的症状，例如与其相关的炎症和疼痛)的量值。因此，治疗还包括完全抑制(例如防止发生或阻止，例如终止)病理学病状或至少与其相关的症状以使得宿主不再罹患所述病理学病状或至少不再罹患作为所述病理学病状特征的症状的情况。

将RAP肽偶联物递送至肝脏

肝脏的大部分主要由门静脉来灌注。肿瘤对动脉血的依赖(与首过捕捉(first-passcapture)的效率相关)将允许在静脉内施用RAP偶联物后不伤害大部分非癌性肝脏组织。

除由肝脏血管结构提供的潜在优点外，LRP1于HCC肿瘤细胞和周围组织上的相对表达量进一步有利于RAP偶联物的功效。研究已证明，在赘生性转化后LRP1于肝细胞上的表达增强至少10倍(Laithwaite等,Toxicon39,1283-1290,2001)。作为显著对比，其它研究已显示LRP1在非癌性但硬变的肝脏组织中显著表达不足(Hollestelle等,ThrombHaemost91,267-275,2004)。LRP1于肿瘤细胞上的表达增强而在患病肝脏别处的表达减弱应类似使用首过捕捉的动脉递送，导致RAP偶联物的不均一递送，其中对肿瘤组织存在偏好。不均一递送以及快速增殖肿瘤细胞对化学治疗剂的敏感性普遍增强可解决大多数HCC患者中因肝脏储备能力减弱所造成的治疗阻碍。

RAP显示在施用后快速扩散至肝脏。在静脉内快速注射30皮摩尔蛋白质后，在10分钟内超过70%的外源性RAP积累于肝脏中(Warshawsky等,JClinInvest92:937-944,1993)。所注射的RAP的循环半衰期小于1分钟。还在大鼠中在高达2.5mg／kg(60nmol／kg)的静脉内注射时观察到所述药物动力学(Warshawsky等,同上)。关于另一高亲和力LRP1配体，即蛋白酶活化的α-2-巨球蛋白(一种725kD四聚血清糖蛋白)，已报导类似药物动力学(Davidsen等,BiochimBiophysActa846:85-92,1985)。仅少量RAP(小于注射剂量的1%)积累于心脏、脑、肌肉或肾脏中，表明所述组织中结合RAP的LDLR的组织与血管表达对于此应用来说均可忽略不计。静脉内施用的RAP已显示在啮齿动物和猫类物种中无可测量的毒性。肝脏对RAP的捕捉效率通过肝细胞上的丰富细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖的初始低亲和力结合步骤，和随后LRP1的高亲和力结合和内饮作用来增强(Herz等,ProcNatlAcadSciUSA92:4611-4615,1995；Mahley等,JLipidRes40:1-16,1999)。

虽然许多因素有利于RAP偶联物选择性靶向肝肿瘤，但也提出所述药剂将对转移的HCC有效。转移的肿瘤细胞倾向于在迁移至异位部位后保留其特征，表明LRP1于肝外转移人HCC中的表达未减弱(Gao等,WorldJGastroenterol10:3107-3111,2004)。此因素可使得转移的HCC同样易受静脉内施用的包含岩藻糖苷酶抑制剂的RAP肽偶联物影响。

肝病症

本发明的一个方面涵盖岩藻糖苷酶抑制剂与RAP肽的偶联和所述偶联物的施用。

本发明所涵盖的肝病或肝病症包括(但不限于)以下所讨论的病症。肝细胞癌或肝细胞瘤为世界范围内第五种最常见的癌症且发病率已不断攀升。肿瘤形成性肝细胞保持高LRP1表达量。肝细胞癌对化学疗法反应并不好，因为肿瘤细胞显示高比率的抗药性和因为所用化学疗法因全身性(静脉内)施用而具有严重毒性，尤其对心脏和肾脏。

肝炎为肝脏炎症的通用术语。肝炎可为急性或慢性的且包括急性或慢性肝脏衰竭，例如归因于病毒(例如A、B、C、D或E或非ABCDE型肝炎，CMV，埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr))、真菌、立克次体(rickettsial)或寄生虫感染、酒精、化学毒素、药物(例如乙酰胺苯酚(acetaminophen)、乙胺碘呋酮(amiodarone)、异烟肼(isoniazid)、氟烷(halothane)、氯丙嗪(chlorpromazine)、红霉素(erythromycin))、代谢型肝病(例如威尔森氏症(Wilson'sdisease)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症)、癌症、特发性自体免疫性肝病、肝硬化(例如原发性胆汁性肝硬化)、胆道阻塞。A、B和/或C型肝炎病毒感染肝脏可导致缓慢发展的肝病，从而导致肝脏衰竭。急性肝炎感染最常由A型肝炎引起。B型肝炎与C型肝炎感染皆可在体内持久存留且变成长期感染(慢性)。C型肝炎可能会引起危急病状，包括肝硬化和癌症。

预期可使用岩藻糖苷酶抑制剂与RAP肽的偶联物治疗的其它肝病症包括与以下相关或由以下引起的肿瘤：肝脂肪组织炎、胆汁郁滞、肝硬化、中毒性肝损伤(例如归因于药物毒性或环境毒性，例如黄曲毒素B1(AflatoxinB1)相关癌症)和遗传性血色沉着病。

预期向具有肝肿瘤的受试者施用RAP-肽-岩藻糖苷酶抑制剂偶联物是与第二药剂组合进行，所述药剂包括(但不限于)化学治疗剂、细胞毒性剂、放射性同位素、抗病毒药、抗真菌药、消炎药、抗体和适用于治疗肝肿瘤或与肝肿瘤发展相关的其它肝病的其它疗法。

与RAP肽偶联物联合施用至HCC患者以治疗肝癌的候选药物包括(但不限于)：5-氟尿嘧啶、阿霉素(阿德力霉素(adriamycin))、丝裂霉素C(mitomycinC)、顺铂(cisplatin)、表柔比星(epirubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和表1中所示的其它化学治疗剂、阿德福韦(adefovir)、拉米夫定(lamivudine)、恩替卡韦(entecavir)、病毒唑(ribavirin)、干扰素α、聚乙二醇化干扰素α-2a、干扰素α-2b和其它抗病毒药、维生素E、熊脱氧胆酸和用于治疗肝病症的其它药剂。其它药剂展示于表1中。

表1

适用于治疗肿瘤的细胞毒性剂包括(但不限于)氮芥盐酸盐、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、白消安、塞替派、卡莫司汀、洛莫司汀、氮烯唑胺和链脲菌素。

适用于治疗肿瘤的放射性同位素包括(但不限于)¹³¹I、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、¹²⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²⁵⁵Fm、¹⁴⁹Tb、²²³Rd、²¹³Pb、²¹²Pb、²¹¹At、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、²²⁵Ac、¹⁸⁶Re、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga和^99mTc。

预期用于方法中的抗体包括用于治疗肝癌和其它肝病症的抗体，包括(但不限于)抗表皮生长因子受体(EGFR)(西妥昔单抗(cituximab)、帕尼单抗(panitumamab))、抗血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(anti-glypican3，GPC3)和适用于治疗肝癌或已转移至肝脏的癌症的其它抗体。

试剂盒

作为另一方面，本发明包括包含本文所述的一种或多种偶联物或组合物以促进其用于实施本发明方法的方式包装的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包括本文所述的偶联物或组合物(例如包含单独RAP肽-岩藻糖苷酶抑制剂偶联物或RAP肽-岩藻糖苷酶抑制剂偶联物与第二药剂的组合的组合物)包装于例如密封瓶或密封容器等容器中，其中所述容器上贴有或所述包装中包括描述所述偶联物或组合物在实施方法时的使用的标签。优选地，偶联物或组合物以单位剂型包装。试剂盒可进一步包括适于根据特定施用途径施用组合物的装置。优选地，试剂盒含有描述RAP肽偶联物组合物的使用的标签。

本发明的其它方面和细节将从以下实施例显而易见，所述实施例意图为说明性的而非具限制性。

实施例

实施例1

RAP肽-岩藻糖苷酶抑制剂偶联物的产生和表征

方法

制造肽偶联物：先前已公开产生两种岩藻糖苷酶抑制剂的合成途径[11；12]。先前已描述RAP肽的鉴别和制造[15；16]。为使8个岩藻糖苷酶抑制剂分子连接于RAP肽分子，以K4K2K赖氨酸树枝状聚合物修饰所述肽的N端。偶联物制备的最终步骤为在8个树枝状聚合物伯胺与8个含有羧酸酯连接子的岩藻糖苷酶抑制剂(N-5-羧基戊基-脱氧岩藻糖野尻霉素或N-5-羧基戊基-Faz)分子各自之间形成肽键。

HepG2细胞中的生物化学功效：最初来源于HCC肿瘤的HepG2细胞产生过度岩藻糖基化糖蛋白且通过LRP1将RAP内饮至溶酶体中。为评定RAP肽-抑制剂偶联物在肝细胞中的生物化学功效，使用标准条件培养HepG2细胞且在多孔培养板中与单独缓冲液、岩藻糖苷酶抑制剂、单独SEQIDNO:2或包含SEQIDNO:2和岩藻糖苷酶抑制剂的偶联物一起孵育。在一些孔中添加1μM全长RAP以阻断SEQIDNO:2或RAP肽偶联物的摄取。在孵育过夜后，用冷PBS冲洗细胞且通过冷冻-解冻溶解于50mM柠檬酸钠(pH4.8)中。通过离心使细胞溶胞物澄清且根据制造商方案，使用4-甲基香豆素-α-L-岩藻糖分析(可从Sigma-Aldrich获得，参考PMID2137330)来分析岩藻糖苷酶活性。也使用标准程序分析β-葡糖醛酸酶含量以针对细胞数和溶酶体功能进行校正。

HepG2细胞中的功能性功效研究：以每孔1×10⁵个细胞将HepG2细胞接种于12孔培养板中且允许其恢复24小时。随后将细胞与岩藻糖苷酶抑制剂、RAP肽偶联物或单独RAP肽一起孵育72小时。随后通过MTT增殖分析评定细胞状态。

预期抑制HepG2细胞中的岩藻糖苷酶活性将引起细胞中的岩藻糖基化蛋白质增加，从而导致细胞死亡或至少使细胞增殖减缓或停止。

正常和HCC细胞株中岩藻糖苷酶FUCA1缺失的显著性-siRNA：将多种初级人肝细胞(Lonza,Basel,Switzerland)和人肝细胞癌细胞株(可商购，MDSPharma，Hep3B、HepG2、HLE、HLF、HuCCT1、HUH-6克隆5、PLC／PRF/5、SNU-423)接种在适当培养基中且以靶向FUCA1的siRNA池(Invitrogen,Calsbad,CA)转染。随后孵育细胞72小时且对其进行多重作用机制高含量分析(MOA-HCA)。通过评定细胞核中的总DAPI荧光来分析细胞增殖和使用抗活化卡斯蛋白酶3分析来分析细胞凋亡(参见例如“AHigh-ContentAnalysisAssayandaFull-AutomationDesignSoleyUsingNoncontactLiquidDispensing,”Rodriguez等JournalofTheAssociationforLaboratoryAutomation,2007)。在BiomekFX(BeckmanCoulter)上进行所有流体转移。使用InCell分析仪10003.2获取12比特TIFF影像且用DeveloperToolbox1.6软件定量。使用非线性回归，以S形四点、四参数单位点剂量-反应模型计算EC50值。使用基于MathIQ的软件(AIM)进行曲线拟合和计算。细胞数目值计算为相对细胞计数(测试孔)／相对细胞计数(媒介物孔)×100。相对细胞计数EC50测量为产生一半最大有效反应的测试化合物浓度。使用活化卡斯蛋白酶-3来定量处于早期至晚期阶段细胞凋亡的细胞。此分析的输出为根据各孔中的相对细胞计数进行校正的测试孔中的凋亡细胞相较于媒介物孔的倍数增加。引起卡斯蛋白酶-3信号增加5倍的测试物质的浓度指示诱导显著细胞凋亡。

预期通过施用FUCA1siRNA来抑制岩藻糖苷酶活性将引起细胞中的岩藻糖基化蛋白质增加，从而导致与岩藻糖苷酶抑制剂一起培养的样品中的细胞死亡和卡斯蛋白酶-3活性增强。

正常和HCC细胞株中岩藻糖苷酶缺失的显著性-DNJ：将多种初级人肝细胞(可商购，Lonza)和人肝细胞癌细胞株(可商购，MDSPharma，Hep3B、HepG2、HLE、HLF、HuCCT1、HUH-6克隆5、PLC／PRF/5、SNU-423)接种在适当培养基中。在10μM脱氧岩藻糖野尻霉素中孵育细胞72小时且对其进行如上文所述的多重作用机制高含量分析(MOA-HCA)。

正位肿瘤异种移植模型中的功能性功效：如先前所述在正位肝内异种移植模型中分析与岩藻糖苷酶抑制剂偶联的RAP肽的功效[18；19]。简单地说，用适当麻醉剂(例如氯胺酮(ketamine)、安定(diazepam)或其组合)麻醉6-8周重度组合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficient，SCID)小鼠，且通过腹部中线切开进行上中线剖腹术以暴露小鼠的门静脉。随后使用30号针经过一分钟的时程将10⁶个HepG2细胞的混悬液注入门静脉中。随后紧密缝合切口且保持动物温暖直至完全清醒。

为测量RAP肽-岩藻糖苷酶抑制剂处理的功效，使用适当的经过放射性标记的药剂(例如2-脱氧-2-(F-18)-氟-D-葡萄糖(¹⁸F-FDG))进行正电子发射断层摄影术(PET)[18]以通过非侵入性方法追踪经过处理和对照小鼠中HepG2诱发的肿瘤的进展。岩藻糖苷酶抑制剂-RAP肽处理的功效也在体内通过对经过处理和对照动物中的肿瘤区域进行组织学分析来测量。

还在正位肿瘤模型中分析溶酶体储积症指标(包括溶酶体、尿和血液中的葡糖胺聚糖(GAG)含量)的测量结果。

预期与未接受岩藻糖苷酶抑制剂的受试者相比，施用RAP肽-岩藻糖苷酶抑制剂偶联物将减小肿瘤尺寸或减缓肿瘤生长进展。还预期施用肽-抑制剂偶联物将增加通过肽受体吸收抑制剂的细胞的溶酶体中岩藻糖基化蛋白质的含量，如通过GAG分析所测量。

实施例2

向HepG2细胞施用岩藻糖苷酶抑制剂可抑制溶酶体岩藻糖苷酶

为了测定岩藻糖苷酶抑制剂自身对肝细胞的影响，进行体外分析。

将HepG2人肝细胞癌细胞以每孔4×10⁵个接种于6孔组织培养板中。在24小时时，用新鲜培养基喂养细胞且用30μM脱氧岩藻糖野尻霉素(DNJ)或缓冲液处理72小时，一式两份。随后用冷PBS洗涤细胞，刮至微量离心管中，集结成粒并溶解。通过Bradford分析测定各样品的总蛋白质浓度且将溶胞物体积调整至0.3mg/mL。通过添加100μL0.5mM4-MU-岩藻糖哌喃糖苷，随后在37℃下孵育30分钟来测量20μL各溶胞物样品中的岩藻糖苷酶活性。用130μL600mM柠檬酸盐／碳酸盐缓冲液(pH9)淬灭反应。在荧光微板读取器中分析所释放的4-MU(参见上述实施例1)。结果说明于图4中。取双份样品活性值的平均值并制图。

所述结果显示在人肝细胞癌细胞株中岩藻糖苷酶抑制剂(未偶联的脱氧岩藻糖野尻霉素)抑制溶酶体岩藻糖苷酶达>50%，且表明与RAP偶联的岩藻糖苷酶抑制剂有效治疗肝癌。

实施例3

体内施用RAP肽偶联物

HCC为待确诊的第五种最常见恶性肿瘤，且全世界范围内每年有将近500,000例死亡。肿瘤组织的外科移除、移植和实体破坏为治疗首选，但仅5至10%存在肿瘤的患者适于所述方法(20-22)。此外，由于化学治疗剂的毒性与肿瘤细胞抗性，全身性化学疗法产生15-20%的低反应率(23-24)。

举例来说，阿霉素为对多种肿瘤具有高效率的癌症化学治疗剂，且尤其对快速生长的细胞(包括肿瘤细胞)具有毒性。然而，阿霉素在治疗肝细胞癌中的使用受到显著肝脏和心脏毒性和抑制血液细胞产生所限制(25)。另外，肝细胞癌细胞显示高比率转化为抗药型(26)。

替代治疗方法利用辐射。举例来说，目前所测试的新肝癌治疗涉及将已经过放射性物质(90Y)标记的微小玻璃珠注射至主肝动脉中，所述玻璃珠从肝动脉进入灌注肿瘤组织的小血管中。随后辐射破坏肿瘤组织。然而，血液从肝动脉显著分流至肺会阻碍在许多患者中使用玻璃珠。珠粒显著回流至供给胃肠道的动脉中还可能引起严重副作用。因此，将疗法有效递送至肿瘤组织需要一种不要依赖会截留于血管中的大物质且更具定向性的方法。

为了评定在体内RAP肽与肝细胞的受体结合，以及评定在体内分子将细胞毒性化合物递送至细胞的能力，使用人肝细胞癌的正位模型。

为了在动物体内产生正位肿瘤，将人肝癌细胞株植入裸小鼠、大鼠或其它适当动物体内，且允许肿瘤细胞在体内生长。适用于正位模型的HCC细胞株包括(但不限于)那些上述细胞株，例如Heb3B、HepG2和Huh-7。HCC的正位肿瘤模型为本领域中所已知且描述于例如Okubo等(JGastroenterolHepatol.200722:423-8)；Armengol等,(ClinCancerRes.200410:2150-7)；和Yao等,(ClinCancerRes.20039:2719-26)中。

为首先在体内确定施用偶联RAP肽和对照组的剂量范围，使用每组5只小鼠进行小剂量范围研究，所述小鼠接受偶联RAP肽(例如RAP肽-DMJ(每天至多200mg/kg)、RAP肽-Faz(每天至多200mg／kg)、单独RAP肽(每天至多200mg／kg)、单独DMJ或Faz。每日静脉内或腹膜内施用测试药剂，历时两周(QD×14)，且在研究终点时测试目标动物的体重变化、任何临床观测结果和临床病理学和组织病理学。

为进行功效研究，每组使用8至10只小鼠，且向接受人HCC细胞的动物和对照动物施用3个测试剂量范围的上述化合物。测试药剂是静脉内或腹膜内施用且以适当频率施用，例如每日施用历时4周(QD×28)、每日施用历时3周(QD×21)或每日施用历时2周(QD×14)。随后使用本领域中已知的技术评定目标动物的任何体重变化、临床观测结果和体内功效测量结果(例如肿瘤体积、肝脏组织病理学和全身临床病理学)。

偶联的RAP肽在体内使肝细胞癌细胞生长减少的能力说明肽结合肿瘤细胞表面上的细胞受体且为将药剂递送至肝细胞中从而产生生物学上可测量的作用的有效方式。在动物模型中证明有效肿瘤死亡表明偶联的RAP肽为将岩藻糖苷酶抑制剂递送至罹患肝癌或其它肝病状的人的肿瘤细胞的有效方法。

用于测试治疗剂的生物分布和功效的肝细胞癌(HCC)的另一相关动物模型为受土拨鼠肝炎病毒(WHV)感染的东方土拨鼠(27)。几乎所有新生期受病毒感染的土拨鼠均在24个月的中值时间间隔内发展HCC。中值预期寿命为30个月，但受WHV感染的土拨鼠未发展肝硬化，此为大多数HCC患者中存在的病状。土拨鼠肝炎病毒和人B型肝炎病毒在结构、遗传学、传播方法、感染过程和肝细胞癌发展方面类似。存在凸显此模型的重要性的显著相似性。类似于人，所有在出生后不久即暴露于肝炎病毒的土拨鼠中超过一半土拨鼠发展慢性感染且几乎所有长期感染的土拨鼠在暴露后约20至28个月均发展肝细胞癌。其余经过接种的新生土拨鼠常常发展急性肝炎，但将会产生针对病毒的抗体并恢复。17%至25%的所述“恢复”动物在暴露后29至56个月发展HCC。还在人中见到从肝炎感染明显恢复后发展HCC。

为测定RAP肽-岩藻糖苷酶抑制剂偶联物对药剂递送至肝脏和尤其肿瘤细胞的影响，在土拨鼠HCC模型中研究对照和RAP肽偶联物治疗剂的摄取和毒性。在一个实施方案中，使用6只长期感染的土拨鼠和4只未受感染的土拨鼠，约1.5-2岁。

适用递送化合物一般将显示以下特征：1)不会不利地影响已受损的肝脏功能；2)可测量的肝脏和恶性肝组织的摄取；3)和在摄取后，对肿瘤细胞具有毒性且引起肿瘤消退。

还在肿瘤模型中分析溶酶体储积症指标(包括溶酶体、尿和血液中的寡糖含量)的测量结果。

预期本领域技术人员能想到如以上说明性实施例中所阐述的本发明的许多修改和变化形式。因此，本发明应仅受例如随附权利要求书中所出现的限制。

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Claims (24)

1.一种肽偶联物，其包含连接于岩藻糖苷酶抑制剂的受体相关蛋白(RAP)肽，所述RAP肽包含与SEQIDNO:1的RAP的氨基酸210-319至少80％同源的多肽序列，其中该岩藻糖苷酶抑制剂抑制癌症细胞中岩藻糖苷酶之活性且诱导来源于糖蛋白的寡糖积累于溶酶体中,

其中所述岩藻糖苷酶抑制剂是选自由L-脱氧岩藻糖野尻霉素(DFJ)、β-1-C-甲基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-乙基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-苯基脱氧甘露糖野尻霉素、(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羟基氮杂-3-甲酸(Faz)、β-L-高岩藻糖野尻霉素、取代的(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羟基-5-(羟基甲基)环戊胺和2,6-亚氨基-2,6,7-三脱氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇组成的组。

2.一种肽偶联物，其包含连接于岩藻糖苷酶抑制剂的受体相关蛋白(RAP)肽，所述RAP肽包含与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列至少80％同源的多肽，其中该岩藻糖苷酶抑制剂抑制癌症细胞中岩藻糖苷酶之活性且诱导来源于糖蛋白的寡糖积累于溶酶体中,

其中所述岩藻糖苷酶抑制剂是选自由L-脱氧岩藻糖野尻霉素(DFJ)、β-1-C-甲基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-乙基脱氧甘露糖野尻霉素、β-1-C-苯基脱氧甘露糖野尻霉素、(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羟基氮杂-3-甲酸(Faz)、β-L-高岩藻糖野尻霉素、取代的(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羟基-5-(羟基甲基)环戊胺和2,6-亚氨基-2,6,7-三脱氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇组成的组。

3.根据权利要求2所述的肽偶联物，其中所述RAP肽包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的肽偶联物，其中所述岩藻糖苷酶抑制剂通过肽连接子偶联。

5.根据权利要求4所述的肽偶联物，其中所述肽连接子是赖氨酸树枝状聚合物。

6.根据权利要求5所述的肽偶联物，其中所述肽连接子为K4K2K赖氨酸树枝状聚合物。

7.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的肽偶联物，其中每一个RAP肽分子偶联至少4个岩藻糖苷酶抑制剂。

8.根据权利要求4所述的肽偶联物，其中每一个RAP肽分子偶联至少4个岩藻糖苷酶抑制剂。

9.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的肽偶联物，其中每一个RAP肽分子偶联至少8个岩藻糖苷酶抑制剂。

10.根据权利要求4所述的肽偶联物，其中每一个RAP肽分子偶联至少8个岩藻糖苷酶抑制剂。

11.一种根据权利要求1至10中任一权利要求所述的肽偶联物的用途，其用于制备治疗有需要的受试者的肝肿瘤的医药品。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述肝肿瘤为肝细胞癌、肝炎病毒感染、肝硬化、中毒性肝损伤和遗传性血色沉着病的结果。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述肝肿瘤为肝细胞癌的结果。

14.根据权利要求11至13中任一权利要求所述的用途，其中所述治疗使得所述受试者的肝肿瘤尺寸减小。

15.根据权利要求11至13中任一权利要求所述的用途，其中所述治疗使得所述受试者血液中的甲胎蛋白含量与治疗前的含量相比降低。

16.根据权利要求11至13中任一权利要求所述的用途，其中所述肽偶联物是静脉内施用。

17.根据权利要求11至13中任一权利要求所述的用途，其中所述肽偶联物是与第二药剂联合施用。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述第二药剂是选自由化学治疗剂、细胞毒性剂、放射性同位素、抗病毒剂、抗真菌剂、消炎剂和抗体组成的组。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述化学治疗剂是选自由阿霉素和5-氟尿嘧啶组成的组。

20.根据权利要求18所述的用途，其中所述第二药剂为细胞毒性剂。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述细胞毒性剂是选自由盐酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、白消安、塞替派(thiotepa)、卡莫司汀、洛莫司汀、氮烯唑胺和链脲菌素组成的组。

22.根据权利要求18所述的用途，其中所述第二药剂为放射性同位素。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述放射性同位素是选自由¹³¹I、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、¹²⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²⁵⁵Fm、¹⁴⁹Tb、²²³Rd、²¹³Pb、²¹²Pb、²¹¹At、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、²²⁵Ac、¹⁸⁶Re、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga和^99mTc组成的组。

24.根据权利要求18所述的用途，其中所述肝肿瘤与肝炎病毒感染有关，且所述第二药剂为抗病毒剂。