KR20230063006A - Cdk9의 활성을 억제하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Cdk9의 활성을 억제하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물; 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물; 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로서, 상기 조성물은 혈류 장애(blood flow disturbance) 부위에서 CDK9의 활성을 억제함으로써, 혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료 뿐만 아니라, 혈관 질환의 조기 진단 및 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides inhibiting activity of CDK9 and uses thereof}
본 발명은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물; 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물; 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
혈관 질환은 혈관계의 이상에 따른 질환인 것으로서, 심장질환, 대동맥과 같은 중심 혈관 및 하부 기관, 조직의 말초혈관의 질환을 포함한다. 세계보건기구 (WHO)의 통계에 의하면, 전 세계적으로 매년 심혈관계 질환으로 인한 사망자가 가파른 증가 추세에 있다. 이는 고령화, 식사 습관 등의 변화로 인한 위험 인자 등의 증가에 따른 것으로 추정되며, 이외 유전적 요인, 당뇨 합볍증 등에 의한 원인도 알려져 있다.
혈류 장애(blood flow disturbance)는 협착증과 같은 혈관 질환을 촉진하는 초기 증상 중 하나로서 (Physiol. Rev 91, 327-387 (2011); 및 Circ Res 124, 150-160 (2019)), 혈관에서 염증세포가 소집되기 위해 부착 분자가 발현되기 시작하면, 협착의 예방이나 치료가 매우 어려운 것으로 알려져 있다 (Nat Rev Immunol 7, 678-689 (2007); Circ Res 101, 234-247 (2007); Nature 473, 317-325 (2011); 및 Atherosclerosis 290, 140-205 (2019)). 현재 혈관 질환을 치료하기 위하여서는 스타틴, 아스피린, 클로피도그렐 등의 혈중 콜레스테롤 수치 제어제, 항혈전, 및 항혈소판제 등의 약물치료나 스텐팅 등의 혈관개통 시술, 수술에 의존하고 있다. 이에 혈관 질환의 근본적인 예방 또는 치료를 위해 혈류 장애를 조기에 진단하고 생물학적 발병 기전을 차단 할 수 있는 기술이 매우 필요한 실정이다.
CDK9(cyclin-dependent kinase 9)은 P-TEFb 복합체(positive transcription elongation factor b complex)를 구성하는 인자로서 (Mol. Cell 8, 327-337 (2001)), 죽상동맥경화증 환자에서는 CDK9의 발현이 높다고 알려져 있다 (Oncotarget 7, 1854-1862 (2016)). 또한, CDK9의 발현 및 활성을 억제하면 내막 과다 형성증(intimal hyperplasia)과 염증(inflammation)을 억제함으로써, 항-협착 효과와 관련된다고 보고된 바 있다 (Mol Ther Nucleic Acids 22, 84-98 (2020); Toxicol Appl Pharmacol 416, 115465 (2021); Sci Rep 6, 31441 (2016).Leukemia 17, 390-400 (2003); 및 Arterioscler Thromb Vasc Biol 31, 280-288 (2011)).
이에 본 발명자들은 혈류 장애를 조기에 진단할 수 있고, 더불어 CDK9의 활성을 억제함으로써 혈관 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 펩타이드를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
1. Han, Y. et al. Oncotarget 7, 1854-1862 (2016). 2. He, X. et al. Mol Ther Nucleic Acids 22, 84-98 (2020). 3. Hellvard, A. et al. Sci Rep 6, 31441 (2016).
본 발명의 목적은 CDK9(cyclin-dependent kinase 9)의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 이용하여 CT 영상을 얻는 단계를 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 이용하여 CT 영상을 얻는 단계를 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 혈류 장애(blood flow disturbance) 부위에서 CDK9의 활성을 억제함으로써, 혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료 뿐만 아니라, 혈관 질환의 조기 진단 및 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 펩타이드가 전시된 나노소포체(Peptide nanovesicles, P. NV) 및 리포좀(Peptide liposomes, P. liposome)의 생산 방법을 도식화한 것이고, 1b는 TEM(transmission electron microscopy)분석을 통해 P. NV 및 P. liposome의 형태 및 크기를 측정한 결과이며(Scale bar = 200 nm), 1c는 웨스턴블럿을 통해 각 그룹에서의 엑소좀 마커(CD9, CD63) 및 MSC(mesenchymal stem cell) 마커(actin)의 발현을 측정한 결과이고, 1d는 FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy) 분석을 통해 펩타이드의 페길화(PEGylation)를 검증한 결과이며, 1e는 X-선 이미지를 통해 리포좀에 로딩되는 조영제의 양을 측정한 결과이다.
도 2a는 총경동맥의 동종이식 토끼 모델에서의 실험 일정을 나타낸 것이고, 2b는 동종이식 토끼 모델에 P. liposome을 주입한 후 0, 24, 48시간에 이식편(graft) 및 대조군(intact)에서의 CT 신호를 분석한 결과이며, 2c는 이식편과 대조군 사이의 최대 강도 차이(max intensity difference)를 정량 분석한 결과이고(HU: Hounsfield units), 2d는 예후가 좋은 경우(desirable prognosis)와 예후가 좋지 않은 경우(undesirable prognosis)에서의 최대 유속(maximum flow velocity) 및 이식편(graft)과 대조군(intact) 간의 CT 신호를 비교한 결과이며, 2e는 PCL(partial carotid ligation) 마우스 모델에 P. liposome을 주입한 후 0, 24, 48시간에 층류(intact-laminar flow) 및 와류(PCL-disturbed flow)에서의 CT 신호를 분석한 결과이며, 2f는 PCL과 대조군 사이의 최대 강도 차이(max intensity difference)를 정량 분석한 결과이다.
도 3a는 PCL(partial carotid ligation) 마우스 모델에서의 실험 일정을 나타낸 것이고, 3b는 부분 결찰 후 3일 째에 결찰 부위를 3D-reconstructed CT 영상을 통해 확인한 결과이며, 3c는 부분 결찰 후 3일 째에 초음파 분석을 수행한 결과이고, 3d는 P. NV 및 scramble P. NV을 PCL 마우스에 주입한 후, 와류 부위 타겟팅 여부를 확인한 결과이며, 3e는 형광 강도의 정량 분석 결과이다 (*p < 0.05).
도 4a는 PCL 마우스 모델에서 H&E staining을 통해 결찰된 혈관의 신생내막 형성 여부를 확인한 결과이고 (노란선: 신생내막 경계; 및 Scale bar = 200 μm), 4b는 VCAM1(vascular cell adhesion protein 1) 및 CD68의 단백질 발현량을 정량 분석한 결과이며, 4c는 간(liver)에서 H&E staining (white circle: lipid droplet), Oil Red O staining (red: lipid) 및 BODIPY staining (green: ROS/ blue: nucleus)을 수행한 결과이고 (Scale bar = 25 μm), 4d는 간에서의 지질 감소 인자(LDL receptor, PPARγSREBP1 및 SREBP2)의 유전자 발현량을 분석한 결과이며, 4e는 혈액(blood)에서 지방 성분(LDL, 총 콜레스테롤 및 중성지방)을 분석한 결과이고, 4f는 간에서 염증성 사이토카인 IL-6의 양과 CDK9 기능을 분석한 결과이며 (Scale bar = 25 μm), 4g는 대동맥(aorta)에서 Oil Red O staining을 수행한 결과이다 (Scale bar = 100 μm) (*p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001).
도 5a는 PCL 마우스 모델에서 H&E staining을 통해 결찰된 혈관의 신생내막 형성 여부를 확인한 결과이고 (Scale bar = 200 μm), 5b는 루멘(lumen)에 대한 신생내막(neointima)의 비율을 정량 분석한 결과이며 (**p < 0.01 및 ***p < 0.001), 5c는 면역형광 염색(nucleus-blue)을 통해 VCAM1(vascular cell adhesion protein 1, red) 및 CD68(green)의 단백질 발현량을 측정한 결과이다 (Scale bar = 200 μm).
도 6a는 동종이식 토끼 모델에 조영제가 포함된 P. liposome을 주입한 후 0, 24, 48시간에 간(liver: red), 혈관(circulation: orange) 및 비장(spleen: green)에서의 CT 신호를 분석한 결과이고, 6b는 간-혈관 및 비장-혈관 간의 최대 강도 차이(max intensity difference)를 정량 분석한 결과이며 (HU: Hounsfield units), 6c는 PCL 마우스 모델에 조영제가 포함된 P. liposome을 주입한 후 0, 24, 48시간에 간(liver: red), 혈관(circulation: orange) 및 비장(spleen: green)에서의 CT 신호를 분석한 결과이고, 6d는 간-혈관 및 비장-혈관 간의 최대 강도 차이(max intensity difference)를 정량 분석한 결과이며, 6e는 PCL 마우스 모델에 펩타이드가 전시되지 않은 NV 또는 liposome (No P.: white bar); 또는 P. NV 또는 P. liposome (gray bar)을 주입한 후, 48시간에 간(liver)에서의 IVIS 신호 및 이의 형광 강도(fluorescent intensity)를 분석한 결과이고 (**p < 0.01 및 ***p < 0.001), 6f는 비장(spleen)에서의 IVIS 신호 및 이의 형광 강도(fluorescent intensity)를 분석한 결과이며 (**p < 0.01), 6g는 PCL 마우스 모델에 scramble P. NV (blue box) 또는 P. NV (red box)를 주입한 후, 마우스 몸 전체에서 IVIS 신호를 분석한 결과이고, 6h는 수득된 장기(intestine; stm: stomach; liv: liver; spl: spleen; 및 kid: kidney)에서 IVIS 신호를 분석한 결과이다.
도 7a는 펩타이드(P.)와 CDK9의 복합체를 3D 컴퓨터 모델링으로 확인한 결과이고, 7b는 PCL 마우스 모델의 경동맥에서 면역형광염색을 통해 와류와 층류에서의 CDK9의 발현량을 분석한 결과이며 (Scale bar = 200 μm), 7c는 in vitro 유동 모델에서 면역침전(immunoprecipitation)을 통해 와류와 층류에서의 펩타이드(P.)와 CDK9의 결합 정도를 확인한 결과이고, 7d는 펩타이드(P.)의 농도에 따른 CDK9의 활성을 분석한 결과이며, 7e는 와류 및 층류에 노출된 hAECs(human aortic endothelial cells)에 P. NV 또는 scramble P. NV를 처리한 후 면역형광염색을 통해 CDK9 (red) 및 P. NV (cyan)의 위치(localization)을 확인한 결과이고 (Scale bar = 100 μm), 7f는 와류에 노출된 hAECs에 siRNA-CDK9 또는 scramble siRNA를 처리한 후 면역형광염색을 통해 CDK9 (red) 및 P. NV (cyan)의 위치(localization)을 확인한 결과이며 (Scale bar = 100 μm 또는 20 μm), 7g는 와류에 노출된 hAECs에 siRNA-CDK9 (10nM 또는 25nM) 또는 scramble siRNA를 처리한 후 웨스턴블럿을 통해 VCAM1 및 CD68의 단백질 발현량을 분석한 결과이고, 7h는 와류에 노출된 hAECs에 siRNA-CDK9와 함께 P. NV 또는 P. liposome; 또는 scramble siRNA를 처리한 후 웨스턴블럿을 통해 VCAM1 및 CD68의 단백질 발현량을 분석한 결과이며, 7i는 와류에 노출된 hAECs에 siRNA-CDK9와 함께 P. NV 또는 P. liposome; 또는 scramble siRNA를 처리한 후 웨스턴블럿을 통해 IL-8 및 IL-1β의 단백질 발현량을 분석한 결과이다.
도 8a는 PCL 마우스 모델의 경동맥에서 면역형광염색을 통해 와류와 층류에서의 CDK9의 발현량을 정량 분석한 결과이고, 8b는 PCL 마우스 모델의 대동맥에서 면역형광염색을 통해 와류와 층류에서의 CDK9의 발현량을 분석한 결과이며 (CDK9, red; nucleus, blue; 및 Scale bar = 50 μm), 8c는 PCL 마우스 모델의 대동맥에서 와류와 층류에서의 세포군(cell population, %)을 분석한 결과이고, 8d는 in vitro 유동 모델에서의 실험 일정을 나타낸 것이며, 8e는 in vitro 유동 모델에서 와류와 층류에서의 세포의 양(cell amount)을 측정한 결과이고, 8f는 in vitro 유동 모델에서 면역침전을 통해 와류와 층류에서 펩타이드(P.)에 결합된 CDK9의 양을 비교한 결과이며 (**p < 0.01), 8g는 in vitro 유동 모델에서 와류와 층류에서 CDK9 발현량을 비교한 결과이며 (***p < 0.001), 8h는 와류 및 층류에 노출된 hAECs에 P. NV 또는 scramble P. NV를 처리한 후 CDK9와 P. NV의 co-localization 정도를 확인한 결과이고 (**p < 0.01), 8i는 와류에 노출된 hAECs에 siRNA-CDK9 또는 scramble siRNA를 처리한 후 CDK9와 P. NV의 co-localization 정도를 확인한 결과이다 (***p < 0.001).
도 9a는 in vitro 유동 모델에 와류와 층류를 노출시킨 후, qRT-PCR을 통해 VCAM1, ICAM1 및 E-selectin의 유전자 발현량을 분석한 결과이고, 9b는 와류에 노출된 hAECs에 siRNA-CDK9 (10nM 또는 25nM) 또는 scramble siRNA를 처리한 후 VCAM1 및 CD68의 단백질 발현량을 정량 분석한 결과이고, 9c는 와류에 노출된 hAECs에 siRNA-CDK9와 함께 P. NV 또는 P. liposome; 또는 scramble siRNA를 처리한 후, qRT-PCR을 통해 VCAM1, ICAM1 및 E-selectin의 유전자 발현량을 분석한 결과이고, 9d는 와류에 노출된 hAECs에 siRNA-CDK9와 함께 P. NV 또는 P. liposome; 또는 scramble siRNA를 처리한 후 VCAM1, CD68, IL-8 및 IL-1β의 단백질 발현량을 정량 분석한 결과이다 (*p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 용어, "포함하는"은 언급되지 않은 추가적인 성분 또는 방법 단계 등을 배제하지 않으며, "구성하는 또는 이루어지는(consisting of)"은 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다.
본 발명은 CDK9(cyclin-dependent kinase 9)의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, CDK9(cyclin-dependent kinase 9)은 P-TEFb 복합체(positive transcription elongation factor b complex)를 구성하는 인자이다 (Mol. Cell 8, 327-337 (2001)).
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 혈류 장애(blood flow disturbance) 부위에서 CDK9의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "혈류 장애"는 비정상적이고 불규칙한 혈류 흐름을 의미하며, 본 발명에서 "와류(disturbed flow)"와 동일한 의미이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 나노입자 약물전달체 (nanoparticle based drug delivery systems)에 전시되는 것일 수 있고, 상기 나노입자 약물전달체는 지질막구조를 형성하여 내부 cargo를 외부와 분리하며 50 내지 200 nm의 입자크기를 가지는 리포좀(liposome), 세포외 소포체 (extracellular vesicles), 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로소포체(microvesicle) 및 나노소포체(nanovesicle)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "세포외 소포체(또는 세포밖 소포체)"는 세포로부터 자연적으로 방출되는 지질 이중막 구조의 소포체이며, 크기 및 합성 경로로부터 엑소좀, 마이크로소포체 등으로 분류될 수 있다.
본 발명의 용어, "리포좀"은 세포외 소포체의 일종으로서, 콜레스테롤로부터 형성되거나 인지질로부터 인지질 이중층이 형성되어 만들어지는 작은 구 형태의 미세한 물질이다.
본 발명의 용어, "엑소좀"은 세포 내부에서 생성되어 세포 외부로 방출되는 세포외 소포체의 일종으로서, 세포 간 정보 교환을 위해 분비하는 나노미터 크기의 물질을 말한다.
본 발명의 용어, "엑토좀(또는 마이크로소포체, 마이크로파티클)"은 세포 표면에서 직접 생성되는 세포외 소포체의 일종이다.
본 발명의 용어, "나노소포체(또는 나노베지클)"는 세포를 분쇄 또는 파쇄하여 자기조립에 의해 제조된 이중 지질막 구조의 소포체를 말한다. 바람직하게는, 상기 나노소포체는 줄기세포 유래 나노소포체인 것일 수 있다.
상기 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 역분화 줄기세포를 포함한다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있고, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질(stroma) 등에 존재하는 줄기세포를 의미한다.
본 발명에서, 상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 페길화(PEGylation)되어 나노입자 약물전달체에 전시된 것일 수 있다. 페길화 또는 페길레이션은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 부착된 것을 의미하며, 다만, 이에 한정되지 않고, 다음과 같은 중합체가 부착된 것일 수 있다: 비이온성 생체적합 고분자, 예컨대, 플루로닉 F127 및 플루로닉 F68; 폴리비닐 알코올; 다른 폴리(알킬렌 옥시드), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜) 등; 폴리(옥시에틸화 폴리올), 예컨대 폴리(옥시에틸화 글리세롤) 등; 카르복시메틸셀룰로오스; 덱스트란; 폴리비닐 푸롤리돈; 폴리-1,3-디옥솔란; 폴리-1,3,6-트리옥산; 에틸렌/말레산 무수물; 및 폴리아미노산.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 (ACTPSFS)의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 변이체인 것일 수 있다.
상기 변이체(variant)는 보존적 치환을 포함한다. "보존적 치환"이란 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 폴리펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 다음의 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 7 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드인 것일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드는 임의의 길이를 가질 수 있고, 바람직하게는 7 내지 20 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 혈관 질환은 고혈압, 고지혈증, 고중성지방혈증, 심혈관질환, 동맥경화증, 죽상경화증, 죽상동맥경화증, 관상동맥협착증, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색증, 뇌혈관질환, 신혈관질환, 말초혈관질환 및 대동맥질환으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 싸이코트리아 루브라 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 CDK9(cyclin-dependent kinase 9)의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
본 발명의 용어, "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러, 본 발명의 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물 및 이의 분획물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예:스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 CDK9(cyclin-dependent kinase 9)의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기 진단은 발병 여부 뿐만 아니라, 질환의 예후, 경과, 병기 등을 확인하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 상기 도구 또는 시약은 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제, 조영제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체는 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다
또한, CDK9(cyclin-dependent kinase 9)의 활성을 억제하는 펩타이드를 이용하여 CT 영상을 얻는 단계를 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 CT 영상을 대조군과 비교하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 CT 영상의 신호가 대조군에 비해 증가되면 혈류 장애 또는 와류가 있는 것으로 판단하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CT 영상의 신호가 대조군에 비해 증가하면 혈관 질환의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 CT 영상은 24 시간 내지 72 시간 이내에 얻는 것일 수 있고, 바람직하게는 24 시간 내지 60 시간 이내에 얻는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 36 시간 내지 60 시간 이내에 얻는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 42 시간 내지 54 시간 이내에 얻는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 46 시간 내지 50 시간 이내에 얻는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 48 시간 이내에 얻는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드가 전시된 나노소포체 및 리포좀의 생산
1.1. 리포좀(liposome) 생산
리포좀은 급속주입법으로 생산되었다 (도 1a). 구체적으로, DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 850355P, Sigma-Aldrich, MO, USA), 콜레스테롤 (C8667, Sigma-Aldrich), 및 DSPE-mPEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], 880120P, Sigma-Aldrich)은 55:40:5의 몰비(molar ratio)로 72 ℃에서 에탄올(E7023, Sigma-Aldrich)에 녹여 최종 농도가 200 mmol/L가 되도록 하였다. 이후, 혼합물은 72 ℃, 500 rpm의 격렬한 교반 하에 동량의 이오딕사놀(iodixanol, CT 조영제, 320 mg iodide/mL, GE Healthcare, IL, USA)로 급속 주입되었다. 급속 주입은 주사기(plastic syringe, Resteck, PA, USA)에 연결된 20-게이지 니들(Koreavaccine, Seoul, Republic of Korea)을 사용하였고, 5분 동안 격렬하게 교반한 후, 4배 부피의 이오딕사놀을 첨가하였다. 상온에서 15분 이상 교반한 후, 혼합물은 압출기(extruder, GOE-1000 mL, Genizer, CA, USA) 및 연동펌프(peristaltic pump, BT100L, Lead Fluid Technology, Heibei, China)를 사용하여 25 mL/min로 drain disc (PETEDD9025, Sterlitech, WA, USA), 0.1 μm membrane filter (PCT019030, Sterlitech) 및 drain disc 순서의 3개의 필터를 통해 압출되었다. 압출은 7번 반복되었고, 전체 부피는 PBS (phosphate-buffered saline, LB004-02, Welgene, Seoul, Republic of Korea)에 대해 12-14 kDa MWCO(molecular weight cutoff) membrane (132678T, Repligen, MA, USA)을 사용하여 24시간 동안 투석되어, 남은 이오딕사놀이 제거되었다. 이오딕사놀이 포함된 리포좀은 14,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리되어 수득되었고, CT 이미징을 위해 사용되었다. 이오딕사놀이 없는 리포좀은 이오딕사놀 혼합 단계를 생략하고 생산하였다.
1.2. 나노소포체(NV, nanovesicle) 생산
본 실시예에서는 나노소포체 생산을 위하여 편도선 유래 중간엽 줄기세포(TMSCs, tonsil-derived mesenchymal stem cells)를 이용하였다. 편도선 유래 중간엽 줄기세포(TMSCs)는 편도선절제술을 받은 10세 미만 아동 기증자로부터 분리되었다. 편도선 조직을 세 번 세척한 후 기계적으로 자르고, 콜라게네이즈 타입 I (210 U/mL, 17100-017, Thermo Fisher), DNase I (10 μg/mL, D4263, Sigma-Aldrich) 및 페니실린-스트렙토마이신 (1 % w/v, 15140-122, Thermo Fisher)이 포함된 50 mL의 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium-low glucose, 11885-084, Thermo Fisher, MA, USA)에 37 ℃에서 2시간 동안 교반하여 효소적으로 해리시켰다. TMSCs는 70 μm pore diameter를 가진 cell strainer (93070, SPL, Seoul, Republic of Korea)로 여과되어 수득되었고, FBS (fetal bovine serum, 10 % w/v, 16000-044, Thermo Fisher) 및 페니실린-스트렙토마이신 (1% w/v)이 첨가된 DMEM 배지에서 2일마다 배지를 교환하여 배양되었다.
TMSC-유래 나노소포체는 80-90% confluence에 도달된 TMSCs (passage 3-10)로부터 생산되었다. TMSCs는 0.25 % trypsin-EDTA (25200-072, Thermo Fisher)로 3분 동안 처리한 후 PBS로 세척하였고, 1,300 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. 이후, 세포현탁액은 압출기와 연동펌프를 사용하여 25 mL/min로 drain disc, 10 μm membrane filters (PTU1009010, Sterlitech), 5 μm membrane filters (PCT509030, Sterlitech), 0.1 μm membrane filters 및 drain disc 순서로 압출하였다 (도 1a). 이후, 잔재물은 14,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 제거하였고, 나노소포체의 단백질 농도는 BCA protein assay kit (23227, Thermo Fisher)를 이용하여 측정하였다.
1.3. 리포좀 및 나노소포체의 펩타이드 전시
폴리에틸렌글리콜이 부착된 페길화된 펩타이드(PEGylated Peptide)는 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (E7750, Sigma-Aldrich)을 사용하여 DSPE-PEG2000-COOH 및 펩타이드의 NH2를 1:1의 몰비로 하여 상온에서 24시간 동안 약하게 교반하여 생산하였다. 반응하지 않은 DSPE-PEG2000-COOH 또는 펩타이드는 tubing dialysis (MWCO = 3.5 kDa, G235003, Spectrum Lab, Piraeus, Greece)를 이용하여 제거하였다. 이후, 페길화된 펩타이드 (10 % w/w)는 2개의 펄스로 1,400 V에서 2 ms 동안 Neon electroporation system (MPK5000, Thermo Fisher)로 나노소포체 또는 리포좀의 막에 전시되도록 하였다 (도 1a). 반응하지 않은 페길화된 펩타이드는 tubing dialysis (MWCO = 20 kDa, G235057, Spectrum Lab)로 제거하였고, 이후 14,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 본 실시예에서 사용된 펩타이드 서열(P. sequence)은 ACTPSFSKIC (서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하고, 스크램블 펩타이드 서열(scramble P. sequence)은 KFTISPSACC (서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 펩타이드들은 LugenSci (Seoul, Republic of Korea)에서 합성하였다.
1.4. 펩타이드가 전시된 나노소포체 및 리포좀의 특성
TMSC 유래 나노소포체(이하, "TMNV"), 펩타이드가 전시된 나노소포체(Peptide nanovesicles, 이하, "P. NV") 및 펩타이드가 전시된 리포좀(Peptide liposomes, "P. liposome")의 형태 및 크기는 TEM (transmission electron microscopy, Jem2100, JEOL, Tokyo, Japan)으로 확인하였다. 그 결과, P. NV는 106.84 ± 4.38 nm의 평균 직경을 가지며, P. liposome은 117.34 ± 4.59 nm의 평균 직경을 가짐으로써, 원형 형태 및 100~150 nm의 크기 분포를 나타내고 있음을 확인하였다 (도 1b).
이후, TMNV 및 P. NV에서 엑소좀 마커인 CD9 및 CD63의 발현을 확인하기 위해 웨스턴블럿을 수행하였다. 간단히, 샘플에 Rabbit anti-CD9 (1:1,000, ab92726, Abcam, MA, USA), rabbit anti-CD63 (1: 1,000, ab231975, Abcam) 및 mouse anti-actin (1: 1,000, sc-47778, Santa Cruz, TX, USA)의 1차 항체를 넣고 4 ℃에서 밤새 반응시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)-conjugated secondary goat anti-rabbit IgG(H+L) antibodies (1:5,000, 31460, Thermo Fisher) 또는 goat anti-mouse IgG(H+L) antibodies (1:5,000, 31430, Thermo Fisher)의 2차 항체로 반응시켰다.
그 결과, 나노소포체는 펩타이드 전시 전(NV)과 펩타이드 전시 후(P. NV, scramble P. NV)에도 엑소좀 마커인 CD9 및 CD63의 발현을 유지하고, TMSC 마커인 액틴의 발현도 유지하였다 (도 1c). 이로써, TMSC 유래 나노소포체는 엑소좀과 유사하게 TMSC 유래 물질을 전달할 수 있음을 확인하였다.
펩타이드의 페길화의 확인은 FT-IR(Fourier transform infrared) spectroscopy (Nicolet 6700, Thermo Fisher)를 이용하여 주요 신호로 1,765 cm-1 (C=O strong stretching vibration)에서 확인하였고, 이후 페길화된 펩타이드로 전시된 나노소포체 또는 리포좀은 1,765 cm-1 및 1,600 cm-1 (C=O 및 N-H stretching vibration)에서 정확한 밴드로 확인하였다 (도 1d).
또한, 이오딕사놀이 포함된 리포좀의 X-선 상쇄는 DEXA (InAlyzer, Medikors, Gyeonggi, Republic of Korea)를 이용하여 다양한 농도의 이오딕사놀 표준 및 백그라운드 컨트롤(air, water)의 단위로 비교하여 HU (Hounsfield units)로 결정하였다. 그 결과, X-선 이미지에서 결정된 바와 같이, 리포좀에 로딩되는 조영제의 양은 80 mg iodide/mL인 것을 확인하였다 (도 1e).
실시예 2. 동물 모델
2.1. 동종이식(allograft transplantation)의 토끼 모델에서의 이미지 분석
토끼(male, 3 kg; New Zealand White, Doo Yeol Biotech, Seoul, Republic of Korea)에서는 총 경동맥(common carotid artery)의 동종이식을 수행하였다. 우선, 각 공여 토끼는 귀 정맥을 통해 KCl (10 mEq, Daihan Pharm, Seoul, Republic of Korea)의 정맥 내 주입으로 희생되었다. 공여자의 총 경동맥(~ 3 cm 길이)을 교차 고정시키고, 이식을 위해 절제하였다. PBS로 세척한 후, 공여 혈관의 탈세포화를 위해 SDS (sodium dodecyl sulfate, 1 % w/v in PBS, L3771, Sigma-Aldrich)의 박동성 관류(pulsatile perfusion)를 48시간 동안 수행하였다. 남은 SDS는 96시간 동안 PBS를 사용하여 완전히 세척하였고, 탈세포화된 이식편은 동결건조기(7960041, Labconco, KS, USA)에서 보관하였다.
각 수여 토끼는 이식을 위해 zoletil (10 mg/kg, Virbac, Seoul, Republic of Korea)의 피하 주입으로 마취하였고, 지속적인 튜브 공급 장치에서 isoflurane (Hana Pharm, Gyeonggi, Republic of Korea)의 기관 내 흡입을 유지하였다. 동맥의 클램핑 전에는 각 수여 토끼에 Heparin (100 IU/kg, JW Pharmaceutical, Seoul, Republic of Korea)을 정맥 내로 투여하였다. 이후, 기관(trachea) 앞에 있는 목 앞의 중앙을 절개(4 cm)하고, 피하조직과 목 근육을 절개하였다. 총 경동맥이 노출되면, 근위 및 원위측 모두를 클램프시키고, 클램프 사이의 동맥을 절제하였다. 공여자의 탈세포화된 동맥(1-2 cm 길이)은 9-0 ethilon (2829G, Ethicon, NJ, USA) suture를 이용하여 end-to-end 문합(anastomosis)을 통해 삽입하였고, 이후 5-0 vicryl suture(W9982, Ethicon)를 이용하여 목을 봉합하였다. 이식편 혈전증을 방지하기 위해 5 mg/kg의 Aspirin (Bayer, Leverkusen, Germany)을 7일 동안 투여하였다.
이식 수술 직후(day 0), 동종이식의 각 사례에서의 혈류 프로파일은 초음파검사(ultrasonography, iU22 xMatrix DS, Philips, Amsterdam, Netherlands)로 확인하였다. 수술 후 2일째에는 조영제가 포함된 P. liposome(500mg)을 귀 정맥을 통해 각 토끼로 주입하였고, 주입 전 및 주입 후 0, 24, 48시간에 CT를 촬영하였다. CT 스캔은 AquariusNet Viewer (V4.4.13. P6, TeraRecon, NC, USA)로 이미지 분석과 함께 Somatom Sensation 64 channel (Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)을 사용하여 수행하였다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 이오딕사놀이 포함된 P. liposome은 혈류 장애 부위로부터 CT 신호의 초기 진단 분석을 통해 협착 정도를 예측하는데 사용되었다. 토끼 경동맥의 동종이식(day 0) 직후 혈류 방향 및 속도에 대한 초음파 분석을 수행하였고, 이후, P. liposome (+ 조영제)을 주입하여 CT 분석을 수행하였다 (day 2-4). 또한, P. liposome에 의한 진단능을 검증하기 위해, 초음파 분석 및 조직학적 분석으로 수행되었다 (week 2-6).
그 결과, P. liposome 주입 후 48시간 동안, 경동맥 이식편(graft)의 CT 신호는 대조군(intact)에 비해 현저히 증가한 것을 확인하였다 (도 2b 및 2c). 이는 P. liposome이 이식편 주변의 와류 부위로 타겟팅된 것을 의미한다. 대부분의 CT 조영제가 24 시간 내에 몸 밖으로 배출된 것을 감안하면, 본 발명에서는 48시간 동안 CT 신호가 증가하였다는 사실로부터 펩타이드(P.)에 의해 효율적인 타겟팅이 가능함을 확인하였다.
이후, 이식 수술 후 P. liposome에 의한 CT 신호를 통해 협착증의 예후 예측이 가능한지 여부를 조사하였다. 우선, 예후가 좋은 경우(desirable prognosis)와 예후가 좋지 않은 경우(undesirable prognosis)에는 이식 직후(Day 0)의 최대 유속(maximum flow velocity)이 유사하게 나타났다. 그러나, 예후가 좋은 경우에는 이식 후 최대 유속이 6주 동안 유지되는 반면, 예후가 좋지 않은 경우에는 수술 후 2주 후에 최대 유속이 5배 이상 감소한 것으로 나타났다 (도 2d). 그런데, P. liposome에 의한 CT 신호 결과, 예후가 좋지 않은 경우에는 예후가 좋은 경우에 비해 CT 신호가 2배 이상 증가한 것으로 나타났다 (day 2-4).
상기 결과로부터, P. liposome에 의한 CT 신호를 분석하여 협착증의 예후 예측이 가능함을 확인하였다.
2.2. PCL (partial carotid ligation)의 마우스 모델에서의 이미지 분석
P. liposome 또는 P. NV에 의한 협착증의 예후 예측이 가능한지 여부를 추가로 검증하기 위해, PCL 마우스 모델에서도 실험을 수행하였다. PCL은 ApoE KO(apolipoprotein E knockout) 마우스 (male, 7 weeks old, SLC, Shizuoka, Japan) 또는 Balb/c 누드 마우스 (male, 7 weeks old, Orient Bio, Seoul, Republic of Korea)를 이용하여 기존에 보고된 방법대로 수행하였다 (Small 16, 2000012, 2020). 마우스는 zoletil (50 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg, Rompun, Bayer)의 복강 내 주입으로 마취시켰다. 면도 및 포비돈-요오드(povidone-iodine, Green Pharmaceutical, Jincheon, Republic of Korea)로 소독한 후, 목의 정중선을 절개하여 좌측 총경동맥(LCCA, left common carotid artery)을 노출시켰다. 이후, 상갑상동맥(superior thyroid artery)을 제외한 LCCA의 3개의 원위 분지(internal, external, and occipital artery)를 10-0 ethilon suture (W2814, Ethicon)로 봉합하였고, 6-0 Vicryl suture (J510G, Ethicon)로 상처를 봉합하였다.
LCCA에서의 혈류 장애를 확인하기 위하여, 결찰 후 3일 째에 isoflurane의 마취 하에 Doppler ultrasound (Vevo2100, VisualSonics, ON, Canada)를 수행하였다. 또한, ApoE KO 마우스는 고지방식이(D12079B, Research Diets, NJ, USA)를 섭취시켰고, 수술 후 30일 째에는 조영제가 포함된 P. liposome (200 mg)를 각 마우스의 꼬리 정맥으로 주입하였고, 주입 직전 및 주입 후 0, 24, 48시간에 CT를 촬영하였다. 이후, 30일 후(Day 60)에 협착 정도를 분석하였다. 구체적인 실험 일정은 도 3a와 같다.
CT 스캔은 AquariusNet Viewer를 사용한 이미지 분석과 함께 Quantum GX2 (Perkin Elmer, MA, USA)로 수행하였다. PCL 마우스 모델에서 P. liposome의 타겟팅 및 기관 분포는 DiD (V22887, Thermo Fisher)로 리포좀을 라벨링하고, PCL 후 3일 째에 꼬리 정맥으로 주입한 후, IVIS(124262, Perkin Elmer)로 검사하였다. 마우스는 isoflurane 마취 하에 IVIS images (excitation/emission: 644/665 nm wavelength)를 얻었고, Living Image Software (V4.5.5, Perkin Elmer)로 이미지를 분석하였다.
PCL 마우스 모델에서 혈류 장애를 확인하기 위해, 부분 결찰 후 3일 째에 3D-reconstructed CT 영상을 통해 분석한 결과, PCL 모델에서는 구조적 중단(cessation)이 확인되었고, 대조군(intact)에서는 중단이 없음을 확인하였다 (도 3b). 또한, 초음파 분석을 수행한 결과, 대조군(intact)에서는 단일방향의 높은 최대 속도가 나타나는 반면, PCL의 혈류 장애 모델에서는 역방향 및 순방향의 감소된 최대 속도가 나타났다 (도 3c). 이로써, PCL 마우스 모델은 혈류 장애가 나타남을 확인하였다.
이후, 조영제가 포함된 P. liposome을 마우스에 주입한 후 0, 24, 48시간에 CT 분석을 수행한 결과, 48시간에 PCL에 의한 혈류 장애 부위의 CT 신호가 대조군에 비해 현저히 증가되었음을 확인하였다 (도2e 및 2f). 이로써, P. liposome이 혈류 장애 부위에 타겟팅되어 혈류 장애를 진단할 수 있음을 확인하였다.
추가로, P. NV 및 scramble P. NV을 마우스에 주입한 후, 혈류 장애 부위를 타겟팅할 수 있는지 확인한 결과, P. NV를 주입한 마우스에서는 혈류 장애 부위(와류 부위)를 정확히 타겟팅할 수 있음을 확인하였다 (도 3d 및 3e). 반면, scramble P. NV를 주입한 마우스에서는 층류와 와류 간의 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이로써, P. liposome 뿐만 아니라 P. NV에 의해서도 와류 부위를 정확히 타겟팅할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 펩타이드가 전시된 나노소포체 및 리포좀에 의한 항-협착 및 지질 감소 효과
3.1. 실험 방법
PCL 마우스 모델에서 PCL 수술 후 30일째부터 각 실험군에 P. NV 또는 P. liposome을 투여하여 항-협착 및 지질 감소 효과 여부를 확인하였다. 100 μg의 scramble P. NV 또는 P. NV을 꼬리 정맥으로 주입하였고, 양성 대조군인 25 μg의 pitavastatin (JW Pharmaceutical)이 매일 경구 투여하였으며, 60일 째에 희생시켰다. 각 마우스의 경동맥, 간 및 대동맥은 zoletil (50 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 혼합물을 복강 내 주입하여 마취시킨 후 수득하였다. 각 마우스의 내부 대정맥을 절개하여 전혈을 배출시키고, 장기를 수득한 후, 좌심실을 통해 10% 헤파린이 포함된 차가운 생리식염수(10 mL, Daihan Pharm)를 관류시켰다.
파라핀 절편의 경우, 샘플을 10 % neutral buffered formalin (F2013, Biosesang, Gyeonggi, Republic of Korea) solution으로 24시간 동안 고정하고, H&E(hematoxylin and eosin) staining을 수행하였다. 면역형광 염색은 조직 절편을 탈파라핀화 및 재수화시킨 후, mouse anti-VCAM1 (1:100, c45432, LS Bio, WA, USA), rabbit anti-ICAM1 (1:200, ab179707, Abcam), rabbit anti-CD68 (1:200, ab125212, Abcam) 및 rabbit anti-CDK9 (1:200, 2316, Cell Signaling, MA, USA)의 1차 항체로 4 ℃에서 밤새 처리하였다. 이후, 샘플에 Alexa Fluor 488 anti-rabbit (1:150, 115-545-003, Jackson Lab, ME, USA) 및 Alexa Fluor 594 anti-mouse (1:150, 115-585-003, Jackson Lab)의 2차 항체를 처리하였다.
동결 절편의 경우, 조직 샘플을 OCT(optimal cutting temperature) compound (3801480, Leica Biosystems, IL, USA)로 포매하였고, 4 % paraformaldehyde (PFA; CNP015-0500, CellNest, Gyeonggi, Republic of Korea)로 15분 동안 고정하였으며, 0.05 % Triton X-100 (in PBS; 93443, Sigma-Aldrich) 및 1 % bovine serum albumin (BSA; 82-100-6, Merck Millipore, MA, USA)이 포함된 블러킹 용액으로 상온에서 30분 동안 침투시켰다. 이후, rabbit anti-IL-6 (1:200, NB600-1131, Novus, CO, USA), rabbit anti-CDK9 (1:200), rabbit anti-BODIPY ROS 581/591 (1:200, D3861, Thermo Fisher)ㅇ,; 1차 항체가 포함된 1 % BSA buffer로 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, PBS로 3회 세척한 후, 샘플을 Alexa Fluor 594 anti-rabbit antibodies (1:200)의 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 모든 샘플은 DAPI(H1200, Vectashield, Darmstadt, Germany)로 대조 염색한 후 confocal imaging (LSM980, Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany)을 수행하였다.
마우스 장기 조직의 지방 축적은 제조자의 지시에 따라 Oil Red O staining (O0625, Sigma-Aldrich)으로 검사하였다. 마우스 간 조직 절편을 10 % neutral buffered formalin으로 30분 동안 고정하였고, propylene glycol (57-55-6, Duksan, Gyeonggi, Republic of Korea)로 탈수시켰으며, 60 ℃에서 Mayer's hematoxylin (MHS16, Merck Millipore)의 대조 염색과 함께 0.7 % Oil Red O solution으로 염색하였다. 이후, 마우스 대동맥 샘플은 37 ℃에서 30분 동안 Oil Red O staining을 수행하였고, 60 % isopropyl alcohol solution (67-63-0, Duksan)에 담근 후 증류수로 세척하였다. 간 절편 및 대동맥의 Oil Red O staining은 optical imaging (DMi8, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 분석하였다. 마우스 대동맥 샘플은 CDK9 (cyclin-dependent kinase 9) 발현을 확인하기 위해 4 % PFA으로 40분 동안 고정하였고, PBS로 세척한 후, 0.1 % Triton X-100으로 10분 동안 침투시켰으며, 10 % normal goat serum (50197Z, Thermo Fisher)으로 블러킹한 후 염색하였다. 샘플은 rabbit anti-CDK9 (1:200)로 4 ℃에서 밤새 처리하였고, Alexa Fluor 594 anti-mouse (1:150)의 2차 항체 및 DAPI로 염색하였다. 이후, 샘플은 ImageJ (National Institutes of Health, MD, USA)로 정량 이미지 분석과 함께 confocal imaging을 수행하였다.
3.2. 항-협착 효과
PCL 마우스 모델에 P. NV 또는 P. liposome을 투여한 후 H&E (hematoxylin and eosin) 염색을 수행하여 결찰된 혈관에 신생내막(neointima)이 형성되었는지 여부를 확인하였다. 그 결과, P. NV 또는 P. liposome을 투여한 군에서는 혈관 신생내막(vascular neointima)이 형성되지 않은 반면, 식염수(saline, vehicle control) 또는 scramble P. NV가 투여된 대조군에서는 신생내막이 형성되어 완전한 폐색(occlusion)이 일어났음을 확인하였다 (도 4a). 특히, P. NV 또는 P. liposome을 투여한 군에서는 pitavastatin을 매일 구강 투여된 군에서와 유사하게 신생내막 형성이 현저히 감소하였다 (도 5a 및 5b).
이후, 혈관 신생내막 형성과 관련하여, 염증세포의 부착 및 단핵구 침범을 확인하기 위해 면역형광 염색을 통해 VCAM1(vascular cell adhesion protein 1) 및 CD68의 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과, P. NV를 투여한 군에서는 대조군(saline 및 scramble P. NV)에 비해 VCAM1 및 CD68의 단백질 발현량이 현저히 감소하였고, P. liposome을 투여한 군에서는 CD68의 단백질 발현량만이 현저히 감소하였다 (도 4b 및 도 5c). 이러한 차이는 나노소포체 내부에 포함된 miRNA에 기인된 것으로 볼 수 있다.
상기 결과로부터, P. NV 또는 P. liposome은 염증세포의 부착 감소 또는 단핵구의 침범 감소와 같은 항-염증 효과에 의해 신생내막 형성을 감소시킴으로써, 혈관 협착의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
3.3. 지질 축적 감소 효과
PCL 마우스 모델에 P. NV 또는 P. liposome을 투여한 후 간, 혈액 및 대동맥에서 지질 감소 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 우선, 간(liver)의 경우, P. NV 또는 P. liposome을 투여한 군에서는 대조군(saline)에 비해 지방 축적(lipid accumulation) 및 산화적 지방독성(oxidative lipotoxicity)이 현저히 감소하였다 (도 4c). 또한, P. NV 또는 P. liposome을 투여한 군에서는 대조군에 비해 LDL(low density lipoprotein) 감소 마커인 LDL receptor, PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ 및 SREBP1/2 (sterol regulatory element-binding protein 1/2)의 유전자 발현량이 현저히 증가하였다 (도 4d). 추가로, P. NV 또는 P. liposome을 투여한 군에서는 대조군(saline)에 비해 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현이 감소하였고, 더불어 CDK9의 발현량이 감소함으로써 (도 4f), P. NV 또는 P. liposome이 항-염증 효과도 있음을 확인하였다.
이후, 혈액(blood)에서 P. NV 또는 P. liposome에 의한 지질 감소 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 마우스 혈액은 헤파린 코팅된 튜브(365967, BD, NJ, USA)에 채혈되었고, 혈장은 4℃, 3,000 × g 에서 15분 동안 원심분리기로 분리되었다. LDL(low-density lipoprotein), 총 혈장 콜레스테롤 및 중성지방(triglyceride)의 수치는 automated clinical chemistry analyzer (FUJI DRI-CHEM NX500i, Fuji Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정되고 계산되었다. 그 결과, P. NV 또는 P. liposome을 투여한 군에서는 대조군(saline)에 비해 LDL, 총콜레스테롤 및 중성지방(triglyceride)의 수치가 모두 감소하였다 (도 4e).
또한, 대동맥(aorta)에서도 P. NV 또는 P. liposome에 의한 지질 감소 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, P. NV 또는 P. liposome를 투여한 군에서는 대조군(saline)에 비해 대동맥에서의 지질 축적이 현저하게 감소한 것을 확인하였다 (도 4g).
상기 결과로부터, P. NV 또는 P. liposome은 지질 감소 효과를 가짐으로써 혈관 협착 감소에 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 리포좀과 달리, 나노소포체 내에는 다수의 miRNA를 포함하고 있어, 지질 감소 효과 및 혈관 협착 감소에 더욱 현저한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
3.4. 펩타이드의 기관 분포(organ distribution)
총경동맥의 동종이식 토끼 모델에 조영제가 포함된 P. liposome을 주입하여 CT 이미지를 분석한 결과, 초기(0 h)에는 P. liposome이 혈관으로 타겟팅되었고, 이후 24-48시간에는 간(liver) 및 비장(spleen)에 축적되는 것을 확인하였다 (도 6a 및 6b). 이는 PCL 마우스 모델에서도 유사하게 나타났다 (도 6c 및 6d).
이후, PCL 마우스 모델에 P. NV 또는 P. liposome을 주입한 후, IVIS 신호를 분석하였다. 간단히, PCL 마우스 모델에서 P. liposome의 타겟팅 및 기관 분포는 DiD (V22887, Thermo Fisher)로 리포좀을 라벨링하고, PCL 후 3일 째에 꼬리 정맥으로 주입한 후, IVIS(124262, Perkin Elmer)로 검사하였다. 마우스는 isoflurane 마취 하에 IVIS images (excitation/emission: 644/665 nm wavelength)를 얻었고, Living Image Software (V4.5.5, Perkin Elmer)로 이미지를 분석하였다. 그 결과, P. NV 및 P. liposome을 주입한 경우에는 48시간 후에도 대조군(펩타이드가 전시되지 않은 NV 또는 liposome)에 비해 간(liver) 및/또는 비장(spleen)을 타겟팅할 수 있음을 확인하였다 (도 6e 및 6f). 다만, P. liposome이 비장을 타겟팅하는지 여부는 유의하지 않았다. 더불어, P. NV와 달리, scramble P. NV는 혈류 장애의 혈관 지점으로 타겟팅을 유도하지 않았다. 대신, 마우스 몸 전체 및 수득된 장기에서의 IVIS 신호를 분석한 결과, scramble P. NV는 비장(spleen)보다 간(liver)에 지속적으로 축적되었음을 확인하였다 (도 6g 및 6h).
상기 결과는 체순환을 통해 단일 분자 타겟팅을 이용한 다기관(multi-organ) 치료법의 가능성을 제시한다. 질환은 신체의 장기 간의 잘못된 신호 전달이나 비정상적인 협업에 의해 발생하므로, 본 발명은 혈관 질환의 부위-특이적 예방을 위한 다기관 협업을 고려한 획기적인 전략의 기반이 될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. CDK9에 대한 펩타이드(P.) 결합의 컴퓨터 모델링
펩타이드(P.)와 CDK9의 복합체인 P-TEFb(positive transcription elongation factor b) 복합체의 결합 상태는 Schrodinger software suite (Schrodinger Release 2021-1: Maestro. Schrodinger, NY, USA)로 도킹 효율을 계산하여 컴퓨터 모델링하였다. P-TEFb protein의 3차 구조는 RCSB Protein Data Bank (PDB; ID of P-TEFb: 3BLQ)에서 검색하였다 (Nucleic Acids Res 28, 235-242, 2000). P-TEFb PDB 파일을 Protein Preparation Wizard module (J Chem Inf Model 53, 1689-1699, 2013)로 전처리한 후, Schrodinger software 제품군의 펩타이드 도킹 모듈로 도킹 점수를 분석하였다.
그 결과, P-TEF에 대한 펩타이드(P.)의 결합은 3D 컴퓨터 모델링에서 최고의 도킹 점수로 확인되었고 (도 7a), 이로써, 펩타이드(P.)가 CDK9을 타겟팅할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. PCL 마우스 모델에서 CDK9 발현량 분석 결과
PCL 마우스 모델의 와류(disturbed flow)와 층류(larminar flow: intact)에서 CDK9의 발현량에 차이가 나는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 경동맥의 와류에서는 층류에 비해 CDK9의 발현량이 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 7b 및 8a). 또한, 대동맥에서도 정렬된 층류와 정렬되지 않은 와류의 세포군을 비교함으로써, 대동맥의 와류 하의 곡선 아치 부위에서도 층류 하의 선형 부위에 비해 CDK9의 발현량이 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 8b 및 8c).
실시예 6. in vitro 유동 모델(Flow Model)
6.1. CDK9에 대한 펩타이드(P.)의 타겟팅 효율
in vitro 유동 모델에서 펩타이드(P.)가 CDK9을 타겟하는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 인간 대동맥 내피 세포 (hAECs, human aortic endothelial cells, passage 3-9, Lonza, Basel, Switzerland)는 표준 배양 조건 하에 EGM-2 Bullet Kit (CC-3162, Lonza)이 첨가된 EGM-2 (endothelial cell growth medium 2)를 이용하여 0.1 % gelatin(G1890, Sigma-Aldrich)이 코팅된 배양 접시에서 배양하였다. 이후, 제작된 원추형 플레이트(cone-in-plate)에 5 × 106 cells/mL의 hAECs를 분주하였고 (Day 0), 층류(laminar flow) 및 와류(disturbed flow)에 노출시켰다 (Day 2). 24시간 후, 유동 모델에서 와류 부위를 타겟팅하는 펩타이드의 효율은 DiD fluorescent dye로 라벨링된 나노소포체 및 리포좀으로 결정하였다 (Day 3). hAECs는 P. NV-DiD 또는 P. liposome-DiD (25 μg/mL)로 처리하였고, 추가 24시간 동안 유동 조건에 지속적으로 노출시킨 후, 배지를 제거하고, 결합되지 않은 펩타이드를 PBS로 세척하여 제거하였다. 이후, 샘플은 4 % PFA로 고정하였고, 0.2 % Triton X-100 (in PBS)로 침투시켰으며, 5 % BSA로 블러킹하였다. CDK9은 rabbit anti-CDK9 (1:200)로 면역블럿을 수행하였고, 액틴 세포골격은 Alexa Fluor 488 Phalloidin (A12379, Thermo Fisher)로 염색하였으며, 핵은 DAPI로 염색하였다. 샘플은 confocal imaging로 분석하였다 (Day 4). 구체적인 일정은 도 8d와 같다.
6.2. 면역침전(Immunoprecipitation)
CDK9에 대한 펩타이드(P.)의 결합은 24시간 동안 층류 및 와류에 노출된 후 hAECs로부터 lysis buffer (ab206996, Abcam)에 의한 단백질을 추출한 후 면역침전법에 의해 결정하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit를 이용하여 측정하였고, 면역침전된 단백질의 양은 추출된 단백질 25 μg을 이용하여 웨스턴블럿으로 결정하였다. 추출된 단백질 1 mg은 펩타이드와 CDK9 사이의 결합을 위해 37 ℃에서 24시간 동안 비오틴화된 펩타이드(20 μM, LugenSci)와 함께 배양하였다. 비오틴화된 펩타이드-CDK9은 Accunano-streptavidin magnetic beads (2 mg, TA-1015-1, Bioneer, Seoul, Republic of Korea)로 4 ℃에서 밤새 반응되어 포획되었다. 펩타이드-CDK9가 포함된 자성 비드는 Maglisto-Magnetic separation rack (TM-1000, Bioneer)로 풀다운되고, 상층액을 제거하였다. 비드는 magnetic rack으로 분리하였고, PBS (0.5 mL)로 2회 세척하였다. 이후, 단백질은 2X Laemmli sample buffer (3161-0747, Bio-Rad Laboratories, CA, USA)로 10분 동안 처리하고, 95 ℃에서 10분 동안 열처리하여 자성 비드로부터 용출시킨 후, CDK9 antibodies (sc-484, Santa Cruz)를 이용하여 웨스턴블럿을 수행하였다.
6.3. in vitro CDK9 활성 측정
펩타이드(P.)의 농도가 증가하여 결합에 따른 CDK9의 감소되는 카이네이즈 활성은 CDK9 assay kit (79628, BPS Bioscience, CA, USA)으로 제조사의 지시에 따라 확인하였다. ATP의 인산염은 CDK9/Cyclin T1 kinase의 활성화에 의한 기질의 인산화로 인해 소모되기 때문에, ATP 축적은 펩타이드(P.) 결합 시 감소된 카이네이즈 활성을 나타낸다. 따라서, 펩타이드(P.)는 37 ℃에서 2시간 동안 5X kinase buffer에 있는 ATP (500 μM), CDK substrate peptide (5X) 및 CDK9/Cyclin T1 (5 ng/μL)과 반응하였고, 암실의 상온에서 15분 동안 Kinase-Glo max reagent (50 μL, V6071, Promega, WI, USA)가 첨가되었다. ATP 양은 luminescent microplate reader (46970, Berthold Technologies, Baden-W
Figure pat00001
rttemberg, Germany)에서 발광 강도를 읽으면서 Kinase-Glo Plus reagent를 첨가한 후, 0 μg의 펩타이드 반응에 대한 강도로 정규화하여 정량화하였다.
6.4. siRNA 넉다운(knock-down)
펩타이드의 타겟팅 및 항-협착에 대한 중요한 역할을 검증하기 위해 siRNA를 이용하여 CDK9의 넉다운을 유도하였다. hAECs는 24시간 동안 와류에 노출된 후, 와류 하에 24시간 동안 siRNA-CDK9 (sc-29268, Santa Cruz) 또는 siRNA-scramble (sc-37007, Santa Cruz)로 처리되었다. 제조사의 지시에 따라 작동 조건을 결정하기 위해, 증가하는 siRNA 농도에 따라 Lipofectamine®RNAiMAX reagent (13778030, Thermo Fisher)이 사용되었다.
6.5. qRT PCR
총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol reagent (15596018, Thermo Fisher)로 추출하였고, RNA 농도는 Nanodrop™ 2000 Spectrophotometer(ND2000, Thermo Fisher)로 측정하였다. cDNA는 AccuPower®CycleScript RT premix (K2044, Bioneer)로 1 μg의 RNA로 합성하였다. real-time PCR system (StepOne V2.3, Applied Biosystems, MA, USA)은 하기 표 1의 프라이머 세트와 함께 SYBR green을 이용하여, 95℃에서 10분, 95℃에서 1분 변성, 60℃에서 1분 어닐링으로 40 싸이클의 타겟 유전자 증폭을 통해 실행하였다. 각 타겟 유전자의 상대적 발현량은 2 -Δvalues로 계산하였고, GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)을 내부 정규화 대조군으로 사용하였다.
Gene Forward (5' -> 3') Reverse (5' -> 3')
hGAPDH TGCCATCAATGACCCCTTCAT GGAATTTGCCATGGGTGGAAT
hVCAM1 CATTGACTTGCAGCACCACA AGATGTGGTCCCCTCATTCG
hICAM1 CACAAGCCACGCCTCCCTGAA CCTA TGTGGGCCTTTGTGTTTTGAT GCTA
hEselectin CCGAGCGAGGCTACATGAAT GCCACATTGGAGCCTTTTGG
hCDK9 CCATTACAGCCTTGGGGAGAT CAGCAAGGTCATGCTCGCAGAA
mGAPDH TGCCATCAATGACCCCTTCAT GGAATTTGCCATGGGTGGAAT
mLDLR AGTGGCCCCGAATCATTGAC CTAACTAAACACCAGACAGAGC
mPPARγ TCGCTGATGCACTGCCTATG GAGAGGTCCACAGAGCTGATT
SREBP1 TGGTTGTTGATGAGCTGGAG GGCTCTGGAACAGACACTGG
SREBP2 GCAGCA ACGGGACCATTCT CCCCATGACTAAGTCCTTCAACT
6.6. 웨스턴블럿(Western blot)
총 단백질은 얼음에서 RIPA buffer (R0278, Sigma-Aldrich)를 샘플에 처리하여 추출하였고, 13,200 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. BCA protein assay kit으로 단백질 농도를 측정한 후, 25 μg의 단백질을 10 % SDS-polyacrylamide Mini-Protein TGX gels (456-1094, Bio-Rad Laboratories)로 분리하였고, iBlot 2 NC gel regular stacks (2NR 111018-01, Thermo Fisher)을 이용하여 NC 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 멤브레인은 0.1 % tween-20 (P9416, Sigma-Aldrich)가 포함된 1X Tris-buffered saline buffer (TBST; BTT-9110, T&L, Seoul, Republic of Korea)에 5 % non-fat dry skim milk (1706404, Bio-Rad Laboratories)로 상온에서 1시간 동안 블러킹하였다. 이후, 멤브레인에 5 % skim milk TBST로 희석한 mouse anti-VCAM1 (1:1,000), rabbit anti-CD68 (1:200), rabbit anti-CDK9 (1: 1,000), rabbit anti-IL-8 (1:100, NBP2-33819, Novus), rabbit anti-IL-1β(1:100, NB600-633, Novus), rabbit anti-CD9 (1:100), rabbit anti-CD63 (1:1000) 및 mouse anti-actin (1: 1,000)의 1차 항체를 넣고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 멤브레인을 1X TBST로 각각 15분씩 3회 세척하고, goat anti-rabbit IgG(H+L)-HRP conjugated (1: 5,000) 또는 goat anti-mouse IgG(H+L)-HRP conjugated (1: 5,000)의 2차 항체로 1시간 동안 배양하였다. 1X TBST로 3회 세척한 후, 블럿 신호는 western ECL substrate (170-5060, Bio-Rad Laboratories)로 가시화하였고, LAS-3000 (Fuji Film)으로 분석하였으며, 액틴의 강도로 정규화하여 정량 분석하였다.
6.7. 통계 분석
모든 통계적 분석은 Excel 및 SigmaPlot (V12.0, Systat Software, CA, USA)으로 수행하였다. 데이터는 3개 이상의 독립적인 실험을 기반으로 평균 ± SEM(standard error of the mean)로 표시하였다. 두 그룹 간의 유의성은 two-tailed Student’s t-test로 결정하였다. 실험군에서의 다중 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 post-hoc Bonferroni’s analysis로 수행하였다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 설정하였다. 그룹당 생물학적으로 독립적인 샘플의 크기 및/또는 독립적인 실험의 수는 각 그림과 범례에 표시하였다.
6.8. 펩타이드(P.)에 의한 CDK 발현 억제 결과
in vitro 유동 모델에서 액틴 정렬(actin alignment)에 의해 유동 효과를 간접적으로 확인한 결과, 층류에서는 정렬된 세포군이 확인되었고, 와류에서는 정렬되지 않은 세포군이 확인되었다 (도 8e). 또한, 층류 또는 와류에 노출된 hAECs로부터 단백질을 추출하여 면역침전을 통해 CDK9의 양을 확인한 결과, 와류에서는 층류에 비해 CDK9의 양이 현저히 높은 것으로 나타났고 (도 8f), CDK의 발현 역시 현저하게 높은 것을 확인하였다 (도 8g). 이로써, 와류에서는 층류에 비해 CDK의 발현량이 높고, 이로부터 펩타이드(P.)와 CDK9의 결합이 높아질 수 있음을 확인하였다.
특히, CDK9의 활성을 측정한 결과에서도 CDK9의 활성이 펩타이드(P.)의 결합에 의해 농도-의존적으로 억제되었고 (도 7d), 와류에서 CDK9와 펩타이드(P.)의 co-localization을 확인하였다 (도 7e 및 8h). 이후, CDK9에 대한 펩타이드(P.)의 타겟팅을 검증하기 위해, 와류에 노출된 hAECs에 siRNA- CDK9를 처리하여 CDK9을 넉다운시킨 후, CDK9의 발현 및 펩타이드(P.)의 결합 여부를 확인하였다. 그 결과, siRNA-CDK9를 처리한 군에서는 대조군(siRNA-scramble)에 비해 CDK9과 펩타이드(P.)의 co-localization이 현저하게 감소하였음을 확인하였다 (도 7f 및 8i). 이로써, 와류에서 펩타이드(P.)가 CDK9에 결합됨을 확인하였다.
이후, qRT-PCR을 통해, 와류가 염증세포 소집 관련 마커인 VCAM1, ICAM1 및 E-selectin의 유전자 발현량에 영향을 주는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 와류에서는 층류에 비해 VCAM1, ICAM1 및 E-selectin의 유전자 발현량이 현저히 증가하였다 (도 9a). 그런데, siRNA에 의해 CDK9이 넉다운된 경우에는 대조군(siRNA-scramble)에 비해 VCAM1 및 CD68의 단백질 발현이 농도-의존적으로 현저하게 감소되었음을 확인하였다 (도 7g 및 도 9b). 또한, siRNA에 의해 CDK9이 넉다운된 세포에 P. NV 또는 P. liposome이 처리된 경우에는 대조군에 비해 VCAM1 및 CD68의 단백질 발현이 현저하게 감소하였고 (도 7h 및 도 9d), 이와 일치하게, siRNA에 의해 CDK9이 넉다운된 세포에 P. NV 또는 P. liposome이 처리된 경우에는 대조군에 비해 VCAM1, ICAM1 및 E-selectin의 유전자 발현량도 유의하게 감소하였음을 확인하였다 (도 9c). 더불어, siRNA에 의해 CDK9이 넉다운된 세포에 P. NV 또는 P. liposome이 처리된 경우에는 대조군에 비해 IL-8 및/또는 IL-1β의 사이토카인 생산이 현저하게 감소하였다 (도 7i 및 도 9d). 다만, P. liposome이 처리된 경우에는 IL-8의 단백질 발현에 유의한 차이가 없었는데, 이는 P. NV에 포함된 miRNA의 차이로 기인된 것으로 볼 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명의 펩타이드(P.)는 CDK9을 타겟팅하여 CDK9의 활성을 억제하고, 이로부터 염증세포 소집 인자의 억제 및 염증성 사이토카인의 억제를 통해 염증반응을 억제함으로써, 혈관 질환의 예방 또는 치료에 현저한 효과가 있음을 확인하였다.
<110> NUMAIS CO., LTD. <120> Peptides inhibiting activity of CDK9 and uses thereof <130> 1069821 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide inhibiting activity of CDK9 <400> 1 Ala Cys Thr Pro Ser Phe Ser 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide inhibiting activity of CDK9 <400> 2 Ala Cys Thr Pro Ser Phe Ser Lys Ile Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scramble peptide <400> 3 Lys Phe Thr Ile Ser Pro Ser Ala Cys Cys 1 5 10

Claims (14)

  1. CDK9(cyclin-dependent kinase 9)의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 혈류 장애(blood flow disturbance) 부위에서 CDK9의 활성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 나노입자 약물전달체(nanoparticle based drug delivery systems)에 전시되는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 나노입자 약물전달체는 리포좀(liposome), 세포외 소포체(extracellular vesicle), 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로소포체(microvesicle) 및 나노소포체(nanovesicle)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 페길화(PEGylation)되어 나노입자 약물전달체에 전시되는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 7 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드인 것인, 약학적 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 혈관 질환은 고혈압, 고지혈증, 고중성지방혈증, 심혈관질환, 동맥경화증, 죽상경화증, 죽상동맥경화증, 관상동맥협착증, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색증, 뇌혈관질환, 신혈관질환, 말초혈관질환 및 대동맥질환으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것인, 약학적 조성물.
  9. CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  11. CDK9의 활성을 억제하는 펩타이드를 이용하여 CT 영상을 얻는 단계를 포함하는 혈관 질환의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 CT 영상을 대조군과 비교하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 정보 제공 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 CT 영상의 신호가 대조군에 비해 증가되면 혈류 장애가 있는 것으로 판단하는 것인, 정보 제공 방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 CT 영상의 신호가 대조군에 비해 증가하면 혈관 질환의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 것인, 정보 제공 방법.
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