JP2011207889A - 脳および他の組織への治療化合物の送達 - Google Patents

脳および他の組織への治療化合物の送達 Download PDF

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Abstract

【課題】受容体介在性薬物送達（特に血液脳関門を横切る送達）を行なうための方法および組成物の提供。
【解決手段】治療剤、診断剤、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患のマーカー、ＣＮＳ障害のマーカーに結合する標識モノクローナル抗体等の薬剤にコンジュゲートされた、トランスサイトーシスによって血液脳関門を横切って送達される受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）等のメガリン結合部分を含む化合物。および、メガリン結合部分にコンジュゲートされた前記薬剤を投与するステップを含む、薬剤の中枢神経系送達方法。
【選択図】なし

Description

本発明は概して治療剤および／または診断／治験剤の送達を達成するための組成物およ
び方法に向けられる。
脳は潜在的に有害な物質から血液脳関門（ＢＢＢ:blood-brain barrier）によって防護
されている。血液と脳の間の微小血管関門は、基底膜および強固に会合したアクセサリー
細胞（周皮細胞、アストロサイト）によって取り囲まれた毛細管内皮層で構成されている
。脳毛細管内皮は、隣り合った細胞の膜間に存在する強固に会合した頂端部バンド（タイ
トジャンクションという）により、低分子量溶質に対する透過性が他の毛細管内皮よりも
はるかに低い。受動拡散が減少しているだけでなく、脳毛細管内皮が示す液相ピノサイト
ーシスも、他の内皮細胞より少ない。脳毛細管は、他の器官の毛細管と比較して、窓が少
なく、エンドサイトーシス小胞も少ない(Pardridge,J.Neurovirol.5:556-569,1999参照)
。受容体介在性エンドサイトーシスによって取り込まれるトランスフェリン、ラクトフェ
リンおよび低密度リポタンパク質などの一部のタンパク質を除くと、大きい親水性分子が
ＢＢＢを横切ることはほとんどない(Pardridge,J.Neurovirol.5:556-569,1999、Tsujiお
よびTamai,Adv.Drug Deliv.Rev.36:277-290(1999)、KusuharaおよびSugiyama,Drug Disco
v.Today 6:150-156(2001)、Dehouck et al.,J.Cell.Biol.138:877-889(1997)、Fillebeen
et al.,J.Biol.Chem.274:7011-7017,1999参照)。
血液脳関門（ＢＢＢ）は、有益な活性剤(active agent)（例えば治療薬および診断剤）
の中枢神経系（ＣＮＳ:central nervous system）組織へのアクセスも妨害するので、そ
れらを通過させるには担体の使用が必要になる。血液脳関門の透過性は、ＣＮＳへの薬物
またはペプチドの浸透にとって、しばしば律速因子になる(Pardridge,J.Neurovirol.5:55
6-569,1999、Bickel et al.,Adv.Drug Deliv.Rev.46:247-279,2001参照)。例えばリソソ
ーム蓄積症（ＬＳＤ）の神経症状発現の管理は、治療酵素が脳細胞リソソームにアクセス
できないことによって、かなり妨害される。ＬＳＤは、細胞リソソーム内の特定酵素の活
性が存在しないか、低下していて、その結果、分解されない「蓄積物質」が細胞内リソソ
ーム中に蓄積し、リソソームの膨張および機能不全が起こり、最終的には細胞損傷および
組織損傷が起こることを特徴とする。静脈内酵素補充療法（ＥＲＴ:enzyme replacement
therapy）はＬＳＤ（例えばＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ）にとって有益である。しかし、
ＢＢＢは血液から脳への多くの薬剤の自由な移動を阻止し、重大な神経学的続発症（例え
ばＭＰＳ ＩＩＩ、ＭＬＤ、およびＧＭ１）を呈するＬＳＤが、静脈内ＥＲＴに応答する
とは思えない。そのような疾患には、ＢＢＢを横切って患部細胞のリソソーム中に補充酵
素を送達する方法が、きわめて望ましいだろう。
投与された活性剤の脳への送達を増進するためにＢＢＢを回避する３つの方法として、
直接的頭蓋内注射、ＢＢＢの一時的な透過化(permeabilization)、および活性剤の修飾に
よる組織分布の改変が挙げられる。脳組織への活性剤の直接注射は血管系を完全に迂回す
るものであるが、主として、頭蓋内注射が招く合併症（感染、組織損傷）の危険および投
与部位からの活性剤の不十分な拡散という欠点がある。ＢＢＢの透過化は静脈内活性剤の
注射と同時にＢＢＢを非特異的に損なう必要があり、これは高浸透圧ショック（例えば静
脈内マンニトール）でタイトジャンクションを緩めることによって達成される。高血漿オ
スモル濃度は、タイトジャンクションの部分的崩壊を伴う毛細管内皮の脱水、これらの条
件下で脳にアクセスする血液媒介物質のタイプに関する選択性の低下、および生涯にわた
る処置レジメンによる損傷をもたらす。
脳への活性剤の分布は、一定のタンパク質をＢＢＢの管内腔（血液側）から管外腔（脳
側）に輸送する能動輸送であるトランスサイトーシスによっても増加しうる。トランスサ
イトーシス経路は、毛細管内皮細胞における他の小胞輸送とは異なり、通過は、輸送され
る物質の改変を伴わずに起こりうる。トランスサイトーシスは、ＢＢＢ内皮表面上の受容
体によって媒介される細胞タイプ特異的過程である。トランスサイトーシスされるタンパ
ク質（ベクターまたは担体）に活性剤を取り付けると、脳への活性物質の分布が増加する
と予想される。トランスサイトーシスにおいて、ベクターは、接合されたペアの分布に対
して、優勢な影響を持つと推定される。ベクタータンパク質としては、脳毛細管内皮上の
受容体に対する抗体(Pardridge,J.Neurovirol.5:556-569,1999)およびそのような受容体
に対するリガンド(Fukuta et al.,Pharm Res.,11(12):1681-8;1994、Broadwell et al.,E
xp Neurol.,142(1):47-65 1996)が挙げられる。抗体ベクターは吸着性エンドサイトーシ
ス（非特異的膜相エンドサイトーシス）の過程によって毛細管内皮越しに輸送され、飽和
可能なエネルギー依存的機序によってＢＢＢを横切る現実の受容体リガンドと比べると、
その輸送効率ははるかに低い(Broadwell et al.,Exp Neurol.,142(1):47-65 1996)。
リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）受容体ファミリーは、ＬＤＬ受容体に
対して相同性を有する一群の膜貫通エンドサイトーシスタンパク質である。リポタンパク
質代謝において重要な役割を果たすと特徴づけられたＬＲＰは、その後、血中に存在する
様々なリガンドを結合することが示されている(HerzおよびStrickland,J Clin Invest.,1
08(6):779-84,2001)。ＬＲＰリガンドとしては、リポタンパク質関連タンパク質であるＡ
ｐｏＥ、ＡｐｏＪおよびリポタンパク質リパーゼ；プロテイナーゼであるｔＰＡ、ｕＰＡ
、第ＩＸ因子およびＭＭＰ−９；プロテイナーゼ阻害物質であるＰＡＩ−１、アンチトロ
ンビンＩＩＩ、アルファ−２−マクログロブリンおよびアルファ−アンチトリプシン；抗
細菌タンパク質であるラクトフェリン；シャペロンである受容体関連タンパク質（ＲＡＰ
）、ホルモンであるチロトロピン、補因子であるコバラミン、ならびにリソソームタンパ
ク質であるサポシンおよびスフィンゴ脂質活性化タンパク質が挙げられる。これらのリガ
ンドのうちの４つ、すなわちＡｐｏＪ(Zlokovic et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.,USA 93(9
):4229-34 1996、Zlokovic,Life Sci.,59(18):1483-97,1996)、チロトロピン(Marino et
al.,J.Biol.Chem.,275(10):7125-37 2000、Marino et al.,J.Biol.Chem.,274(18):12898-
904,1999)、リポタンパク質リパーゼ(Obunike et al.,J.Biol.Chem.,276(12):8934-41,20
01)およびコバラミン(Ramanujam et al.,Arch Biochem Biophys.,315(1):8-15,1994)は、
ＬＲＰファミリーメンバーにより、インビトロおよびインビボで、毛細管内皮細胞を横切
ってトランスサイトーシスされることが示されている。
総合すると、ＬＲＰ受容体ファミリーは、毛細管内皮、ニューロンおよびアストロサイ
トを含む様々な組織において様々なレベルで発現される構成的および機能的に関連する受
容体のプールを含む。ＬＲＰファミリーメンバーは、極性上皮を横切ってリガンドをトラ
ンスサイトーシスすることも示されているプロフェッショナルエンドサイトーシス受容体
である。
ユニークなＬＲＰリガンドは、小胞体およびゴルジに局在化している３９ｋＤシャペロ
ン、受容体関連タンパク質ＲＡＰである(BuおよびSchwartz,Trends Cell.Biol.8(7):272-
6,1998)。ＲＡＰはこれらのコンパートメントにおいてＬＲＰに強固に結合し、受容体が
同時発現したリガンドと時期尚早に会合するのを防止する(HerzおよびWillnow,Atheroscl
erosis 118 Suppl:S37-41,1995)。ＲＡＰは、ＬＲＰ受容体ファミリーの全てのメンバー
に対して高い親和性を持ち（約２ｎＭ）、あらゆる既知ＬＲＰリガンドに打ち勝つことが
できるので、ＬＲＰ用の魅力的なターゲティング配列として役立つ。ＲＡＰは分泌されな
いので、血中の内因性レベルは低い。ＬＲＰによるＲＡＰのエンドサイトーシスは、リソ
ソームへの局在化と、タンパク質の完全な分解をもたらす。構造機能研究がＲＡＰで行な
われて、ターゲティング機能を実現させるために必要な配列の極小化に関するいくつかの
指針が得られている(Melman et al.,J.Biol.Chem.276(31):29338-46,2001)。ＲＡＰがト
ランスサイトーシスされるかどうかはわからないが、メガリン−ＲＡＰ複合体は後期エン
ドソームまでは完全なままであることが示されている(Czekay et al.,Mol.Biol.Cell.8(3
):517-32,1997)。メガリン−ＲＡＰ複合体がＣＵＲＬ(Compartmant of Uncoupling Ligan
d from Receptor)を経てこの後期エンドソームコンパートメントまで完全であることは、
初期エンドソームで観察される他のＬＲＰ−リガンド複合体の不安定性とは対照的である
。したがってＬＲＰ−ＲＡＰ複合体は、トランスサイトーシス適性の潜在的指標である酸
依存的な解離に対する耐性が高まっているようである。ＲＡＰは、ＬＲＰファミリーの特
定のメンバーに対する特異性が増すように操作することができるだろう。そのような修飾
によって、当該組織での様々なＬＲＰファミリーメンバーの発現によって決定される特定
組織へのＲＡＰ融合物のターゲティングを、より選択的にすることができるだろう。
さらにＲＡＰは、リソソーム酵素上のマンノース−６−リン酸ターゲティングシグナル
の好適な代替物になりうる。ＬＲＰ−ＲＡＰ系はマンノース−６−リン酸受容体（ＭＰＲ
）−マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）系と多くの特徴を共有している。すなわち、受容
体−リガンド複合体ＬＲＰ−ＲＡＰおよびＭＰＲ−Ｍ６Ｐはどちらも１〜２ｎＭ領域の解
離定数を示し、ＣＵＲＬ中で安定である。ＬＲＰおよびＭＰＲはどちらも、様々な組織上
に広く発現され、結合したリガンドを効率よくリソソームに輸送する。どちらのリガンド
タイプも、リソソームに到達すると分解される。Ｍ６Ｐターゲティングに対するＲＡＰタ
ーゲティングの利点は、それが修飾糖質よりもタンパク質配列に依存することである。生
合成の処理量および品質管理はアミノ酸配列の方が修飾オリゴ糖よりもはるかに高度であ
り、より良い薬物収量、効力および安全性が可能である。ＬＲＰ−ＲＡＰ系は、他の組織
を効率よくターゲティングする方法にもなりうる。例えば、ＬＲＰファミリーのメンバー
である超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）ならびにＬＲＰ１が筋細胞上に高密
度に存在することは、ＲＡＰ融合物がＬＲＰ受容体依存的エンドサイトーシスによって筋
肉にかなり取り込まれうることを暗示している(Takahashi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
.S.A.89(19):9252-6,1992)。
しかし、脳および他の生物学的コンパートメントに活性剤をより効果的に送達すること
ができる新規化合物、薬学的組成物、ならびにそのような化合物および組成物の投与方法
は、今なお必要とされている。特に、タイトジャンクションによって密封された毛細管内
皮細胞によって血液コンパートメントから仕切られている脳および組織または器官に活性
剤を送達する、そのような新規化合物、薬学的組成物、および投与方法が必要とされてい
る。特に、多種多様な組織への活性剤の送達を効率よくターゲティングする、そのような
新規化合物、薬学的組成物、および投与方法が必要とされている。特に、上記組織内の細
胞のリソソームコンパートメントへの活性剤の送達をターゲティングする、そのような新
規化合物、薬学的組成物、および投与方法が必要とされている。本発明は、そのような化
合物、薬学的組成物およびそれらの使用方法を提供する。
本発明は、トランスサイトーシスによって活性剤を送達するための担体またはベクター
としてメガリンリガンドを使用することができるという発見に関する。そのようなリガン
ドの典型例はＲＡＰであり、これは、血液脳関門を横切る治療剤および／または診断／治
験剤の輸送を増加させ、かつ／またはＣＮＳ内およびＣＮＳ外の細胞のリソソームに薬剤
を送達するのに役立つ。
一態様として、本発明は、治療剤および／または診断／治験剤にコンジュゲートされた
メガリンリガンドまたはメガリンリガンドのメガリン結合性断片を含む化合物、ならびに
そのような化合物の薬学的組成物を提供する。一部の実施形態では、メガリンリガンドま
たはそのようなリガンドのメガリン結合性断片を、その安定性または薬物動態特性を高め
る目的で、要望どおりに修飾することができる（例えばコンジュゲートのＲＡＰ部分のＰ
ＥＧ化、コンジュゲートのＲＡＰ部分の突然変異誘発）。
本願では、特に、関心対象の薬剤にコンジュゲートされたメガリン結合部分を含む化合
物が考えられる。薬剤は、通例、治療剤、診断剤、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患のマーカー
、ＣＮＳ障害のマーカーを結合する標識モノクローナル抗体からなる群より選択すること
ができる。ここで考えられる化合物に役立つ治療剤には、例えばタンパク質、細胞毒性化
学療法剤、タンパク質核酸、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、および関心対象の治療
タンパク質をコードする核酸を含む発現コンストラクトなどがあるが、これらに限定され
るわけではない。メガリン結合部分と関心対象の薬剤は互いに直接連結するか、あるいは
例えばペプチドリンカーなどのリンカーを介して連結することができる。好ましくは、メ
ガリン結合部分は、インビボでトランスサイトーシスされる部分である。そのような部分
の典型例には、例えばＲＡＰ、チログロブリン、リポタンパク質リパーゼ、ラクトフェリ
ン、アポリポタンパク質Ｊ／クラスタリン、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質
Ｅ、組織型プラスミノゲン活性化因子、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ビタミンＤ結合タンパク質
、ビタミンＡ／レチノール結合タンパク質、β２−ミクログロビン、α１−ミクログロブ
リン、ビタミンＢ１２／コバラミン血漿担体タンパク質、トランスコバラミン（ＴＣ）−
Ｂ１２、ＰＴＨ、インスリン、ＥＧＦ、プロラクチン、アルブミン、ａｐｏＨ、トランス
サイレチン、リゾチーム、シトクロム−ｃ、α−アミラーゼ、およびＣａ２＋、およびア
プロチニンなどがあるが、これらに限定されるわけではない。化合物は、任意選択的に、
ＡｐｏＪを除外してもよい。
本発明では、血液脳関門を横切って脳内に経細胞的(transcytotic)に送達するためのキ
メラ分子であって、トランスサイトーシスによって血液脳関門を横切って送達されるべき
活性剤にコンジュゲートされたメガリンリガンドを含み、そのメガリンリガンドが血液脳
関門を横切るキメラ分子の輸送を容易にする、キメラ分子が考えられる。また、血液脳関
門を横切るトランスサイトーシスによって脳内に送達するためのキメラ分子であって、ト
ランスサイトーシスによって血液脳関門を横切って送達されるべき活性剤にコンジュゲー
トされたＬＲＰリガンドを含み、そのメガリンリガンドが、ＬＲＰ１と比較してメガリン
に優先的に結合する、キメラ分子も考えられる。ここで考えられる化合物またはキメラ分
子はいずれも、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤中に当該化合物またはキメ
ラ分子を含む薬学的組成物として製造することができる。
特定の実施形態では、薬剤が、メガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片に共有
結合された生物活性タンパク質またはペプチドである。そのようなコンジュゲートまたは
キメラ分子は、合成化学反応によって形成させるか、リンカー基によって接合することが
できる。好ましい実施形態では、活性剤がタンパク質または酵素である場合に、そのタン
パク質または酵素は、ヒトタンパク質もしくはヒト酵素、ネイティブタンパク質もしくは
ネイティブ酵素の生物学的活性を持つヒトタンパク質もしくはヒト酵素の断片、またはヒ
トタンパク質もしくはヒト酵素と実質的なアミノ酸配列相同性を持つポリペプチドである
。一部の実施形態では、薬剤が、ヒトもしくは哺乳類配列、ヒトもしくは哺乳類起源、ま
たはヒトもしくは哺乳類由来のタンパク質であり、一定の態様では、そのタンパク質がメ
ガリンリガンドまたはそのようなリガンドのメガリン結合性断片と融合タンパク質を形成
する。融合タンパク質の活性剤ポリペプチド部分は、成長因子、リンホカインまたはペプ
チド薬物などの治療活性を持つ物質であることができる。薬剤は、酵素または他の生物活
性タンパク質もしくは生物活性ポリペプチドであることができる。他の実施形態では、薬
剤は、その欠乏がポンペ病などのヒト疾患を引き起こす酵素またはタンパク質（例えばア
ルファ−グルコシダーゼ）である。他の実施形態では、酵素が、その薬効によって選択さ
れる。他の実施形態では、担体と、活性剤を取り付けた抗体との間の非共有結合によって
、コンジュゲートが形成される。
メガリンリガンドも、ヒトもしくは哺乳類配列、ヒトもしくは哺乳類起源、またはヒト
もしくは哺乳類由来のものであることができる。好ましい実施形態では、メガリンリガン
ドが、ＲＡＰ、チログロブリン、リポタンパク質リパーゼ、ラクトフェリン、アポリポタ
ンパク質Ｊ／クラスタリン、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅ、組織型プラ
スミノゲン活性化因子、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＡ／
レチノール結合タンパク質、β２−ミクログロビン、α１−ミクログロブリン、ビタミン
Ｂ１２／コバラミン血漿担体タンパク質、トランスコバラミン（ＴＣ）−Ｂ１２、ＰＴＨ
、インスリン、ＥＧＦ、プロラクチン、アルブミン、ａｐｏＨ、トランスサイレチン、リ
ゾチーム、シトクロム−ｃ、α−アミラーゼ、およびアプロチニンからなる群より選択さ
れる。
本発明のさらに別の実施形態では、その態様のそれぞれにおいて、上記メガリンリガン
ドがいずれも、ヒトまたは哺乳類供給源から得られる与えられたリガンドのアミノ酸配列
と同一である。別の実施形態では、メガリンリガンドがヒトまたは哺乳動物から得られる
ネイティブタンパク質である。別の実施形態では、ＲＡＰまたはＲＡＰポリペプチドが、
ネイティブタンパク質に対して、少なくとも２５、５０、１００、１５０、もしくは２０
０アミノ酸の長さにわたって、またはメガリンリガンドの全長にわたって、実質的に相同
（すなわち、アミノ酸配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、また
は９９％同一）である。
好ましい実施形態では、メガリンリガンドがＲＡＰまたはＲＡＰのメガリン結合性断片
である。別の実施形態では、コンジュゲートを投与されるべき対象がヒトである。
さらにもう一つの態様として、本発明は、治療剤および／または診断／治験剤を中枢神
経系に送達する方法であって、タイトジャンクションによって密封された毛細管内皮細胞
によって形成されるＢＢＢを横切ってそのような薬剤を輸送するために、メガリンリガン
ド／メガリン受容体担体系を使用する方法を提供する。これにより、本発明は、中枢神経
系内に作用部位を持つ薬剤を投与する新規経路を提供する。さらにもう一つの実施形態で
は、メガリンの調整物質が、そのようなコンジュゲートの治療作用または有害作用を調整
するために同時投与される。
本発明では、薬剤を動物の中枢神経系に送達する方法であって、メガリン結合部分にコ
ンジュゲートされた薬剤を動物に投与することを含み、動物の血液脳関門を横切って起こ
るメガリン結合部分にコンジュゲートされた薬剤の輸送が、メガリン結合部分へのコンジ
ュゲーションが存在しない場合の薬剤の輸送よりも多い方法が考えられる。薬剤のトラン
スサイトーシスを増加させる方法であって、薬剤をメガリン結合部分にコンジュゲートす
ることを含み、メガリン結合部分にコンジュゲートした場合に、薬剤のトランスサイトー
シスが、コンジュゲーションが存在しない場合の薬剤のトランスサイトーシスよりも多い
方法も考えられる。また本発明では、哺乳動物における障害を処置する方法であって、そ
の動物に、メガリン結合部分にコンジュゲートされた治療剤を投与することを含む方法も
考えられる。本発明の方法では、メガリン結合部分が、通例、送達される治療剤のトラン
スサイトーシスを改善する。本発明のもう一つの方法は、治療酵素を、メガリンを発現さ
せる細胞中のリソソームコンパートメントに送達する方法であって、細胞を、メガリン結
合部分にコンジュゲートされた治療酵素を含む組成物と接触させることを含み、その細胞
のリソソームコンパートメントへの治療酵素の取り込みは、その細胞の表面上に存在する
メガリンによって媒介される。
一部の実施形態では、メガリンリガンドと活性剤とを含むコンジュゲートキメラ分子が
、単一のメガリンリガンドに連結された、１個を越える、同じ状態または障害を処置する
のに有用な治療活性剤を含む。一部の実施形態では、約１〜約５分子または約２〜１０分
子の活性剤が、その疾患、状態または障害を持つ患者に投与される１つのメガリンリガン
ド分子に取り付けられる。
もう一つの態様として、本発明は、疾患、障害、または状態の処置においてメガリン受
容体に基づく送達を用いる方法を提供する。一群の実施形態では、活性剤とメガリンリガ
ンドとのコンジュゲートを使って、ＣＮＳの状態または障害を処置することができる。特
に好ましい実施形態の一群では、処置すべきＣＮＳの状態または障害が、脳腫瘍または他
の新形成（例えば膠芽腫などのＣＮＳ腫瘍）である。そのような腫瘍および新形成は原発
腫瘍であってもよいし、転移巣であってもよい。これらの実施形態では、本発明の化合物
は、癌化学療法剤にコンジュゲートされたメガリンリガンドまたはそのようなリガンドの
メガリン結合性断片を含みうる。好ましい化合物は、各メガリンリガンド部分に共有結合
された約１〜約２０分子の化学療法剤を持つ。そのような化合物は、脳腫瘍および脳内ま
たは脳周辺に局在化した他の新形成への化学療法剤の送達を増進するための、そしてその
ような腫瘍および新形成の処置を改善するための、優れたビヒクルである。一部の実施形
態では、１つのメガリンリガンドポリペプチドにコンジュゲートされている癌化学療法剤
が、同じであっても、異なっていてもよい。例えば１〜３個の異なる化学療法剤を、その
ようなキメラ化合物のメガリンリガンドまたはメガリン結合性断片に対して、同じまたは
異なる活性剤１モルあたりのメガリンリガンドポリペプチドモル数の比（例えば１：１、
１：２、１：３、１：４、および１：５〜１：１０）で、取り付けることができる。
そのようなコンジュゲートにとって好ましい化学療法剤は細胞毒性化学療法剤であり、
例えばアドリアマイシン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、カンプトテシン、およ
びパクリタキセルなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。もう一つの実
施形態として、本発明は、脳腫瘍またはＣＮＳ腫瘍または膠芽腫を持つ患者を、その患者
に治療有効量の、化学療法剤にコンジュゲートされたメガリンリガンドを投与することに
よって処置する方法を提供する。もう一つの実施形態として、本発明は、関心対象の化合
物を対象の血液脳関門越しに脳実質中に送達する方法であって、化合物が腫瘍細胞の分裂
を妨害する能力を持つ化学療法剤であり、分裂細胞にとって毒性である方法を提供する。
これらの化合物は、ベクターの分解後にリソソーム内で遊離し、リソソーム膜越しに拡散
して、核に入ることができる。
別の一群の実施形態では、本発明は、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、多発
性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症など（ただしこれらに限定されるわけではない）の
神経および精神疾患ならびにＣＮＳの疾患、障害および状態を処置するための化合物、薬
学的組成物、および方法を提供する。一部の実施形態では、本発明の化合物は、そのよう
な疾患、障害および状態を処置するための治療剤にコンジュゲートされたメガリンリガン
ドポリペプチドを含む。好ましい一群の実施形態では、治療剤が、例えば神経成長因子、
他のペプチドホルモンもしくは成長因子、およびペプチド神経伝達物質など（ただしこれ
らに限定されるわけではない）のペプチドである。もう一つの実施形態では、本発明は、
対象の血液脳関門越しに脳実質中に活性剤を送達する方法であって、活性剤が例えば神経
成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４／５
、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＣＮＴＦ、白血病阻害因子、カルジオトロフィン−１、ＴＧＦｂ
、ＢＭＰ類、ＧＤＦ類、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＥＧＦ、ＴＧＦａ
、ニューレグリン類、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＡＤＮＦおよびＰＤＧＦ類など（ただし
これらに限定されるわけではない）の神経栄養因子である方法を提供する。カスパーゼ阻
害剤などの他の因子も、化合物の活性剤構成要素としてコンジュゲートすることができる
。他の実施形態では、活性剤が、ＣＮＳの構成成分に対する治療抗体である。別の実施形
態では、活性剤が、ＣＮＳ感染を処置もしくは防止するための抗微生物剤またはリンホカ
インなどの免疫調整物質である。
一部の実施形態では、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、および
てんかんなどの状態；神経膠腫、髄膜腫、神経鞘腫、下垂体腺腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、
血管腫、類表皮腫、肉腫および他の腫瘍源からの頭蓋内転移を含む原発性脳腫瘍などの神
経癌、ならびに神経感染症または神経炎症状態からなる群より選択される疾患または状態
を処置するために、メガリンリガンド（またはそのメガリン結合性断片、例えばＲＡＰま
たはＲＡＰのメガリン結合性断片）と活性剤とのコンジュゲートであるキメラ分子を投与
する。
脳の他の疾患も処置することができる。脳の疾患は２つのカテゴリーに大別される。す
なわち（ａ）感染、外傷および新生物などの病的過程と、（ｂ）ミエリンの疾患およびニ
ューロンの変性を含む、神経系に特有の疾患である。ニューロン生存の減少によって生じ
る脳関連変性疾患には、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、虚
血関連疾患および脳卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症、小脳変性症
などがある。脱髄性疾患には多発性硬化症（ＭＳ）およびその変形ならびに静脈周囲脳炎
が包含される。主要病変は原発性脱髄であるが、通常は他のカテゴリーに分類される他の
疾患としては、白質ジストロフィー、例えばアリールスルファターゼＡの欠乏による異染
性白質ジストロフィー、ガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼの欠乏によるクラッ
ベ病、副腎白質ジストロフィーおよび副腎脊髄神経障害、ならびに進行性多巣性白質脳症
、急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎などのウイルス感染後疾患が挙げられ
る。また、ミトコンドリア脳筋症もある。本発明のコンジュゲートはそのような疾患の処
置に使用することができると考えられる。
さらに別の態様として、本発明のメガリンリガンドコンジュゲートは、非ＣＮＳ（すな
わちＢＢＢで分界されていない疾患、例えば非ＣＮＳ器官の癌、疾患および状態）を処置
するために使用することができる。例えば、コンジュゲート薬剤は、患者の筋肉を冒す状
態を処置するために使用することができる。
別の態様として、本発明は、他の組織または器官と比較して比率的に多量の、好ましく
は２倍を超える量のメガリン受容体をその細胞上に有する組織または器官を処置する方法
を提供する。さらに別の態様として、本発明は、他の組織または器官と比較して比率的に
多量の、好ましくは２倍を超える量のＬＲＰ受容体をその細胞上に有する組織または器官
を処置する方法を提供する。メガリンリガンドコンジュゲート活性剤の選択的生体内分布
は、そのようなコンジュゲート薬剤の特定器官への選択的ターゲティングを増進すること
ができる。
さらなる一態様として、本発明は、疾患、障害、または状態の診断にＲＡＰ／メガリン
担体系を使用する方法を提供する。本明細書ではメガリンが好ましいＲＡＰ結合受容体で
あることを教示するが、他の受容体、例えばＬＲＰも使用することができ、ＲＡＰ／ＬＲ
Ｐ担体系は疾患、障害または状態の診断に使用しうると考えられる。本発明は、ＣＮＳの
疾患または障害を防止、改善、または処置することができるメガリンリガンド（例えばＲ
ＡＰ）のコンジュゲートを、そのような薬剤のトランスサイトーシスをインビトロモデル
で測定することによって、またはそのようなコンジュゲートの脳実質に到達もしくは結合
する能力をインビボで測定することによって、同定または選択するためのスクリーニング
アッセイを提供する。トランスサイトーシスまたは送達は、コンジュゲートを標識した後
、そのラベルの位置または輸送を、インビトロ法の場合は試験チャンバで、インビボ法で
は組織コンパートメントにおいて、監視または検出することによって、評価することがで
きる。また、コンジュゲートの治療作用または他の生物学的作用を使って、中枢神経系の
実質へのコンジュゲートの通過について監視することもできる。好ましい実施形態では、
ＣＮＳの状態が脳腫瘍である。
もう一つの態様として、本発明は、治療酵素を対象の脳細胞中のリソソームに送達する
方法であって、（ｉ）治療酵素にコンジュゲートされたメガリンリガンド（またはそのメ
ガリン結合性断片）を含む化合物を投与すること、（ｉｉ）毛細管内皮を横切って前記化
合物を輸送すること、（ｉｉｉ）前記化合物と、細胞上のメガリン受容体との接触により
、エンドサイトーシスによる前記細胞への前記化合物の進入を容易にすること、および（
ｉｖ）細胞内のリソソームへの送達、を含む方法を提供する。一定の他の態様では、本発
明は、細胞のリソソームに治療剤または診断剤を送達するための、上述のような化合物、
組成物、および方法を提供する。
さらにもう一つの態様として、本発明は、治療酵素にコンジュゲートされたメガリンリ
ガンド（またはそのメガリン結合性断片）、およびそのようなコンジュゲートを投与する
ことによって、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、リガンド−酵素複合体がメガ
リン受容体に結合し、細胞膜を横切って輸送され、細胞に進入し、細胞内のリソソームに
送達される方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、患者のリソソーム蓄積症を
処置する方法であって、そのような疾患を持つ対象のリソソーム中で欠乏しているタンパ
ク質または酵素である治療剤にコンジュゲートされたメガリンリガンド（またはそのメガ
リン結合性断片）を投与すること（例えば酵素補充療法）による方法も提供する。そのよ
うなコンジュゲートは、例えば、リソソームタンパク質欠乏がその疾患状態の一因になっ
ているＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、ＭＰＳ ＩＩＩ Ｂ、異染性白
質ジストロフィー、ゴーシェ病、クラッベ病、ポンペ病、ＣＬＮ２、ニーマン・ピック病
およびテイ・サックス病などのリソソーム蓄積症の処置には、特に有用である。さらに別
の実施形態では、本発明は、リソソーム蓄積症において欠乏しているタンパク質または酵
素に共有結合されたメガリンリガンド（例えばＲＡＰ）を含む薬学的組成物も提供する。
したがって本発明では、対象のリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法であって、
ＬＳＤの処置に使用される治療剤にコンジュゲートされたメガリン結合部分を含む組成物
を、ＬＳＤの症状を改善するのに有効な量で、対象に投与することを含む方法が考えられ
る。通例、そのような方法では、組成物は薬学的組成物であり、哺乳動物の脳組織中に存
在する蓄積顆粒の量を減少させるのに有効な量で投与される。投与は、哺乳動物の中枢神
経系への髄腔内投与であることができる。好ましくは、哺乳動物の髄膜組織中に存在する
蓄積顆粒の量を減少させるのに有効な量で、組成物を投与する。ＬＳＤの症状は当業者に
知られた技術を使って監視され、通例、病歴、理学的検査、心エコー法、心電図検査、磁
気共鳴画像、睡眠ポリグラフ、骨格調査、一連の運動計測、角膜写真、および皮膚生検の
定型的評価によって監視される。
一部の実施形態では、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症
／ウォルマン病、シスチノーシス、ダノン病、ファブリ病、ファーバー脂肪肉芽腫症／フ
ァーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ
ＩＩＩ型ゴーシェ病、グロボイド細胞型白質ジストロフィー／クラッベ病、グリコーゲン
蓄積症ＩＩ／ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガ
ングリオシドーシスＩ型／テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型サン
ドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、アルファ−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、ア
ルファ−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピドーシスＩ型／シアリ
ドーシスＩ／ＩＩ型ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩ
Ｃ型偽ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型ハンター症候群
、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型サンフィリポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型サンフィリポ症候群
、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型サンフィリポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型サンフィリポ症候群
、ムコ多糖症ＩＶＡ型モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型モルキオ症候群、ムコ多糖症
ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型スライ症侯群、ムコ多糖症ＩＸ型、多発性スルファターゼ欠
損症、ポンペ病、神経性セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ１バッテン病、神経性セロ
イドリポフスチノーシス、ＣＬＮ２バッテン病、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ型ニーマン・
ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ１型ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ２型ニ
ーマン・ピック病、ピクノディスオストーシス、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型シンドラー病、
およびシアル酸蓄積症などのリソソーム蓄積症を処置するために、本発明の化合物、組成
物、および方法を使用することができる。特に好ましい実施形態では、リソソーム蓄積症
がＭＰＳ ＩＩＩ、ＭＬＤ、またはＧＭ１である。
さらにもう一つの実施形態として、本発明は、酵素補充治療を必要とする対象に治療有
効量のコンジュゲートを投与することによる酵素補充治療の方法であって、コンジュゲー
トがリンカーを介して酵素に連結されたメガリンリガンド（またはそのメガリン結合性断
片）を含み、患者の細胞が細胞に対する損傷を防止または軽減するには不十分な量の酵素
を含有するリソソームを持っており、本方法によって、細胞に対する損傷を防止または軽
減するのに十分な量の酵素がリソソームに進入する方法を提供する。細胞はＣＮＳ内の細
胞でもＣＮＳ外の細胞でもよく、タイトジャンクションによって活性剤の拡散に対して密
封された内皮細胞を持つ毛細管壁によって血液から仕切られていてもよいが、その必要が
あるわけではない。
一部の実施形態では、活性剤とのメガリンリガンドコンジュゲートが、単一のメガリン
リガンドに連結された、１個を越える、リソソーム蓄積症を処置するための活性剤を含む
。一部の実施形態では、関心対象の活性剤約１〜約５分子または約２〜１０分子が、単一
のメガリンリガンド分子に結合される。好ましい実施形態では、メガリンリガンドがＲＡ
ＰまたはＲＡＰポリペプチドのメガリン結合性断片である。
ある特定の実施形態では、本発明は、当該化合物を投与する対象の標的リソソーム内で
減少しているか、欠乏しているか、または欠失している生物学的活性を持つ活性剤に結合
されたメガリンリガンドを含む化合物を提供する。好ましい実施形態では、メガリンリガ
ンド（またはそのメガリン結合性断片）が、活性剤に共有結合される。好ましい活性剤に
は、例えばアルパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイン輸送体、Ｌａｍ
ｐ−２、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダー
ゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−活性化因子欠乏症、アルファ−Ｄ−マンノ
シダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイ
ラミニダーゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、
ホスホトランスフェラーゼγサブユニット、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸
−２−スルファターゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコ
サミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、アルファ−ガラクトシダ
ーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ
、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフ
ィンゴミエリナーゼ、コレステロール輸送、カテプシンＫ、ベータ−ガラクトシダーゼＢ
、α−グリコシダーゼ、およびシアル酸輸送体などがあるが、これらに限定されるわけで
はない。好ましい一実施形態では、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、α−グリコシダーゼ
またはＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼが上記酵素である。
特定の実施形態では、ここに提供する方法によって処置される疾患が、ムコ多糖症、よ
り具体的にはムコ多糖症Ｉである。特定の実施形態では、ＬＳＤを持つ哺乳動物が、正常
値の約５０％以下のα−Ｌ−イズロニダーゼ活性を示す。通例、薬学的組成物は、ヒトα
−Ｌ−イズロニダーゼとして週に約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の
用量で、その欠乏症を患っている対象に投与される。これらは単なる例示であって、当業
者は治療的に有効な結果を得るために他の用量を使用することができる。また、本明細書
では剤形をｍｇ／ｋｇ体重の形で記載するが、代わりに使用することができる投薬量計量
法は当業者にはわかるだろう。一部の実施形態では、薬学的組成物が、ヒトα−Ｌ−イズ
ロニダーゼとして週に約０．０１ｍｇ／当該哺乳動物のＣＳＦ １５ｃｃ〜約５．０ｍｇ
／当該哺乳動物のＣＳＦ １５ｃｃの用量で、その欠乏症を患っている対象に投与される
。ＬＳＤの処置では、治療剤にコンジュゲートされたメガリン結合部分の投与が、好まし
くは、対象における発育遅延および退行の正常化、高圧水頭症の軽減、対象における脊髄
圧迫の軽減、対象の脳血管周辺の血管周囲嚢胞の数および／または大きさの減少をもたら
す。投与が髄腔内投与である場合、そのような投与は、脳室中に薬学的組成物を導入する
ことを含みうる。本方法は、腰部または大槽中に薬学的組成物を導入する髄腔内投与を含
みうる。髄腔内投与は、例えば注入ポンプを使って達成することができる。期間は、通例
、少なくとも数日間でありうる。処置される哺乳動物は好ましくはヒトである。
リソソーム蓄積症を持つ対象の脳細胞におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の破壊
を促進する方法であって、メガリン結合部分にコンジュゲートされた当該リソソーム蓄積
症で欠乏している酵素を含む薬学的組成物を、脳細胞中に存在するＧＡＧの量を投与前に
細胞中に存在するＧＡＧの量と比較して減少させるのに有効な量で、対象に投与すること
を含む方法も考えられる。好ましくは、脳細胞はニューロン、膠細胞、小膠細胞、アスト
ロサイト、乏突起膠細胞、血管周囲細胞、血管外皮細胞、髄膜細胞、上衣細胞、くも膜顆
粒細胞、くも膜、硬膜、軟膜および脈絡叢細胞である。これらの方法において、対象は高
圧水頭症の症状を示すことができ、上記の投与により、対象の髄膜組織中のＣＳＦ液の量
が減少する。別の態様では、細胞中のリソソーム蓄積顆粒の数が、コンジュゲートの投与
を行なわない場合に同様の細胞中に存在するリソソーム蓄積顆粒の数と比べて減少する。
別の実施形態では、細胞中のリソソーム蓄積顆粒の数が、メガリン結合部分にコンジュゲ
ートされていない酵素のみで処置した同様の細胞中に存在するリソソーム蓄積顆粒の数と
比べて減少する。
もう一つの態様として、本発明は、リソソーム蓄積症を防止、改善、または処置するこ
とができる活性剤にコンジュゲートされたメガリンリガンド（またはそのメガリン結合性
断片）を、そのコンジュゲートをリソソームを含有する細胞と接触させ、かつそのコンジ
ュゲートが薬剤をリソソームに送達するかどうかを決定することによって同定するための
スクリーニングアッセイを提供する。送達は、コンジュゲートを標識した後、そのラベル
の位置を監視もしくは検出することによって、またはリソソーム中に見いだされる蓄積物
質の量に対するコンジュゲートの影響を決定することによって、評価することができる。
好ましい一実施形態では、薬剤が、当該リソソーム蓄積症で欠乏しているタンパク質また
は酵素である。もう一つの実施形態では、細胞には、メガリンリガンドにコンジュゲート
される薬剤が不足している。
もう一つの実施形態として、本発明は、リソソーム蓄積症を防止、改善、または処置す
ることができる薬剤を同定する方法であって、細胞にメガリンリガンド（またはそのメガ
リン結合性断片）コンジュゲート酵素（この酵素の不在は当該リソソーム蓄積症を引き起
こす）を投与し、かつその薬剤が、細胞に対する損傷を、その細胞にコンジュゲート薬剤
を投与しなかった場合の細胞に対する損傷と比較して減少させるかどうかを決定すること
による方法を提供する。一定の実施形態では、本方法はハイスループットアッセイである
。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし詳
細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、単なる例示
にすぎない。なぜなら、本発明の精神および範囲に包含される様々な改変および変更は、
この詳細な説明から当業者には明らかになるだろうからである。
添付の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の諸態様を詳しく例示するために含める
ものである。本発明は、これらの図面を、本明細書に提示する特定実施形態の詳細な説明
と組み合わせて参照することにより、より良く理解することができる。
ＢＢＣＥＣ単層を横切る［125Ｉ］−ｐ９７トランスサイトーシスに対するＲＡＰの作用。 ヒトＲＡＰと、ヒトガラクトシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）および膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）との融合物をコードする発現コンストラクトの製造。（ＲＡＰＦプライマー：配列番号１２；ＲＡＰＲプライマー配列番号１３；ＧＡＡフォワードプライマー配列番号１４；ＧＡＡリバースプライマー配列番号１５；ＩＤＵフォワードプライマー配列番号１６；ＩＤＵリバースプライマー配列番号１７；ＧＤＮＦフォワードプライマー配列番号１８；ＧＤＮＦリバースプライマー配列番号１９；ＲＡＰＢＡＣＦプライマー配列番号２０）。 ＲＡＰ−ＧＡＡ融合物のヌクレオチド配列およびタンパク質配列（ヌクレオチド配列：配列番号６；タンパク質配列：配列番号７）。 ＲＡＰ−ＩＤＵ融合物のヌクレオチド配列およびタンパク質配列（ヌクレオチド配列：配列番号８；タンパク質配列：配列番号９）。 ＲＡＰ−ＧＤＮＦ融合物のヌクレオチド配列およびタンパク質配列（ヌクレオチド配列：配列番号１０；タンパク質配列：配列番号１１）。 ＲＡＰ−ＧＡＡ融合物の特徴づけ。 ＲＡＰ−ＧＡＡ上の複合型オリゴ糖に関するアッセイ。 ＲＡＰ−ＧＡＡ上の高マンノース型オリゴ糖に関するアッセイ。 ＲＡＰ−ＩＤＵ融合物の特徴づけ。 ＲＡＰおよびＲＡＰ−リソソーム酵素融合物のＬＲＰへの結合。 １５分でのヨウ素化ＲＡＰおよびトランスフェリンの補正Ｖｄ対灌流時間。 脳毛細管内皮と脳実質(brain parenchyma)との間のＲＡＰの分布。 ヒトポンペ線維芽細胞によるＲＡＰ−アルファ−グリコシダーゼの取り込み。 様々な種に由来するＲＡＰのアミノ酸配列の多重アライメント：ヒト（配列番号２１）；マウス（配列番号２２）；ラット（配列番号２３）；ニワトリ（配列番号２４）；ゼブラフィッシュ（配列番号２５）；ミバエ（配列番号２６）；カ（配列番号２７）；扁形動物（配列番号２８）。 配列番号１、ヒトＲＡＰのアミノ酸配列。 配列番号２、２８ｋＤ ＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列。 ウシ脳毛細管内皮細胞におけるトランスサイトーシス。 側底側から頂端側へのフラックスを示すＭＤＣＫ細胞における125Ｉ−ＲＡＰの輸送。 ＲＡＰ融合物のゲルおよびブロット解析。Ａ：ＲＡＰ−ＩＤＵ。Ｂ：ＲＡＰ−ＧＡＡ。レーン１：クーマシーブルー染色。レーン２：抗ＲＡＰ抗体。レーン３：抗ＩＤＵまたは抗ＧＡＡ抗体。 ｒｈＩＤＵおよびＲＡＰ−ＩＤＵの速度論的解析。タンパク質（１ｎＭ）を、様々な濃度の４−ＭＵＩ中、室温で５分間インキュベートした。得られたＶmaxおよびＫm値を表Ａに列挙する。 ＲＡＰ融合物のインビトロタンパク質分解。融合物をカテプシン類の混合物で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分割し、クーマシーブルーで染色した。レーン１：未消化ＲＡＰ−ＧＡＡ融合物。レーン２：タンパク質分解したＲＡＰ−ＧＡＡ融合物。レーン３：ｒｈＧＡＡ。レーン４：未消化ＲＡＰ−ＩＤＵ融合物。レーン５：タンパク質分解したＲＡＰ−ＩＤＵ融合物。レーン６：ｒｈＩＤＵ。レーン７：ＲＡＰ。レーン８：分子量マーカー。 ｒｈＧＡＡ（Ａ）、ＲＡＰ−ＧＡＡ（Ａ）、ｒｈＩＤＵ（Ｂ）およびＲＡＰ−ＩＤＵ（Ｂ）の蛍光ラベル糖鎖電気泳動（ＦＡＣＥ）。Ｎ結合型オリゴ糖を遊離させ、還元末端を蛍光標識し、電気泳動した。蛍光バンドをＦＡＣＥイメージャーシステムで解析した。バンド強度は、存在する特定オリゴ糖のモル量に比例する。レーン１：重合度（ＤＰ）単位で目盛りづけしたオリゴグルコースラダー。レーン２：ｒｈＧＡＡ（Ａ）またはｒｈＩＤＵ（Ｂ）。レーン３：ＲＡＰ−ＧＡＡ（Ａ）またはＲＡＰ−ＩＤＵ（Ｂ）。ＡでもＢでもレーン２の底部付近にある矢印を付けた顕著なバンドはビス−７である。 複合型オリゴ糖に関するＲＡＰ−ＧＡＡの等電点電気泳動。タンパク質をクロストリジウム・パーフリンジェンスノイラミニダーゼで処理し、ＰｈａｓｔＧｅｌで分割し、銀染色した。レーン１：未処理ｒｈＩＤＵ（陽性対照）。レーン２：ノイラミニダーゼで処理したｒｈＩＤＵ。レーン３：未処理ＲＡＰ−ＧＡＡ。レーン４：ノイラミニダーゼで処理したＲＡＰ−ＧＡＡ。レーン５：ｐＩ標準。 タンパク質分解したＲＡＰ−ＧＡＡおよびＲＡＰ−ＩＤＵのＥｎｄｏ ＨおよびＮ−グリカナーゼ消化。融合物をカテプシン類の混合物でタンパク質分解し、Ｅｎｄｏ ＨまたはＮ−グリカナーゼで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分割し、クーマシーブルーで染色した。レーン１および１０：分子量標準。レーン２：ＲＡＰ−ＧＡＡ。レーン３：タンパク質分解したＲＡＰ−ＧＡＡ。レーン４：タンパク質分解しｅｎｄｏ Ｈ消化したＲＡＰ−ＧＡＡ。レーン５：タンパク質分解しＮ−グリカナーゼ消化したＲＡＰ−ＧＡＡ。レーン６：ＲＡＰ−ＩＤＵ。レーン７：タンパク質分解したＲＡＰ−ＩＤＵ。レーン８：タンパク質分解しｅｎｄｏ Ｈ消化したＲＡＰ−ＩＤＵ。レーン９：タンパク質分解しＮ−グリカナーゼ消化したＲＡＰ−ＩＤＵ。内挿した分子量を各バンドの下に印刷する。 ｓＬＲＰ２リガンドブロット。ＬＲＰ１の第２リガンド結合ドメインをナイロンメンブレンにブロットし、過剰のＲＡＰの存在下または非存在下に、リガンドでプローブした。結合したリガンドを表示した抗体によるウェスタンブロット法で検出した。リガンドは次のとおりである。列Ａ：緩衝液のみ。列Ｂ：ＲＡＰ。列Ｃ：ＲＡＰ−ＩＤＵ。列Ｄ：ｒｈＩＤＵ。 ＧＭ１３９１線維芽細胞へのＲＡＰ−ＩＤＵおよびｒＨＩＤＵの取り込み。様々な濃度のタンパク質を線維芽細胞と共に２時間インキュベートした。洗浄後、線維芽細胞を溶解し、取り込み量を酵素アッセイによって測定した。曲線の当てはめを行なって、記載の定数を得た。挿入図：ｒｈＩＤＵデータのみのプロット。 ＧＭ２４４線維芽細胞へのＲＡＰ−ＧＡＡおよびｒｈＧＡＡの取り込み。様々な濃度のタンパク質を線維芽細胞と共に２時間インキュベートした。洗浄後、線維芽細胞を溶解し、取り込み量を酵素アッセイによって測定した。曲線の当てはめを行なって、記載の定数を得た。挿入図：ｒｈＧＡＡデータのみのプロット。 ＧＭ１３９１線維芽細胞へのＲＡＰ−ＩＤＵ取り込みの阻害。ＲＡＰ−ＩＤＵ（３ｎＭ）を様々な濃度のＲＡＰの存在下で線維芽細胞と共に２時間インキュベートした。洗浄後、線維芽細胞を溶解し、取り込み量をイズロニダーゼ酵素アッセイによって測定した。 ＧＭ２４４線維芽細胞へのＲＡＰ−ＧＡＡ取り込みの阻害。ＲＡＰ−ＧＡＡ（５ｎＭ）を様々な阻害剤の存在下で線維芽細胞と共に２時間インキュベートした。洗浄後、線維芽細胞を溶解し、取り込み量を酵素アッセイによって測定した。 Ｃ６神経膠腫細胞へのＲＡＰ−ＧＡＡ（灰色）およびｒｈＧＡＡ（黒）取り込みの阻害。タンパク質（５ｎＭ）を阻害剤の存在下でＣ６神経膠腫細胞と共に２時間インキュベートした。洗浄後、線維芽細胞を溶解し、取り込み量を酵素アッセイによって測定した。ＮＤ：未検。 Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞へのＲＡＰ−ＧＡＡ取り込み（灰色）およびｒｈＧＡＡ取り込み（黒色）の阻害。ＲＡＰ−ＧＡＡおよびｒｈＧＡＡ（どちらも５ｎＭ）を阻害剤の存在下で細胞と共に２時間インキュベートした。洗浄後、線維芽細胞を溶解し、取り込み量を酵素アッセイによって測定した。 様々なＬＲＰ受容体によって媒介されるＲＡＰ−ＧＡＡ取り込み。値は過剰量の非放射性ＲＡＰの存在下および非存在下での取り込みの差を表す（受容体特異的取り込み）。可溶化125Ｉのフェムトモル数を各試料中の総タンパク質量に対して標準化した。 ＧＭ２４４線維芽細胞におけるＲＡＰ−ＧＡＡおよびｒｈＧＡＡの細胞内半減期。タンパク質を線維芽細胞と共に２４時間インキュベートした。培地を換え、細胞を２〜１４日間にわたって成長させた後、溶解して、アルファ−グルコシダーゼ酵素アッセイを行なった。 ｒｈＩＤＵおよびＲＡＰ−ＩＤＵによる、ハーラー線維芽細胞中に蓄積されたグリコサミノグリカンのクリアランス。細胞を３つ一組にしてｒｈＩＤＵまたはＲＡＰ−ＩＤＵの存在下に35Ｓ−サルフェートで４８時間標識した。次に標識された細胞を洗浄し、溶解し、放射能および総タンパク質量についてアッセイした。 実験に使用したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。クーマシーブルーで染色したもの。レーン１：ＲＡＰ−ＩＤＵ。レーン２：ｒｈＩＤＵ。
血液脳関門を横切る治療剤の設計および送達にはかなりの進歩があったという事実にも
かかわらず、治療剤のトランスサイトーシスを媒介することができるさらなる化合物を生
み出しうる新しい薬剤が、今なお必要とされている。
本発明は、ＲＡＰおよびＲＡＰポリペプチドがメガリン受容体に選択的に結合するとい
う発見に関する。別の実施形態は、ＲＡＰまたはＲＡＰポリペプチドがＬＲＰ受容体を結
合するという発見を利用しようとするものである。ＲＡＰは、それにコンジュゲートされ
た活性剤を、血液脳関門を横切って細胞内のリソソームに、そしてメガリン受容体を持つ
細胞の細胞内コンパートメントに送達するのに、とりわけ有効なメガリンリガンドである
。本明細書では、そのような送達を媒介するのに有効であるものとして、他のメガリンリ
ガンドも例示する。活性剤にコンジュゲートされたメガリンリガンド（またはそのメガリ
ン結合性断片）を含む化合物は、例えば癌およびリソソーム蓄積症（ただしこれらに限定
されるわけではない）などの様々なＣＮＳおよび非ＣＮＳ疾患、状態、および障害の診断
および処置に役立つ。これらの発見を利用するための方法および組成物を以下に詳述する
。
［Ｉ．定義］
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本
発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。当業者は、
以下の参考文献により、本明細書で用いられる用語の多くについて、その一般的定義を知
ることができる：Singletonら「DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY」(
第2版,1994)、「THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY」(Walker編,198
8)、「THE GLOSSARY OF GENETICS」第5版,R.Rieger,et al.(eds.)Springer Verlag(1991)
、ならびにHaleおよびMarham「THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY」(1991)。
本明細書で引用する各刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示に矛盾
しない限りにおいて、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
本明細書および特許請求の範囲においては、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈａ」は
、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の意味も包含することに留意されたい。
本明細書で使用される以下の用語は、別段の指定がない限り、それらが持つとされてい
る意味を持つ。
本明細書にいう「脳腫瘍および脳内または脳周辺の他の新形成」は、脳内または脳周辺
に発生する原発腫瘍および／または転移巣の両方を包含する。またこれは、体内のどこか
に移動しているが、ＲＡＰまたはＲＡＰポリペプチドと化学療法剤とのコンジュゲートに
対する応答性をまだ持っている、脳腫瘍の転移巣も意味しうる。様々なタイプのそのよう
な腫瘍および新形成が知られている。原発性脳腫瘍には、神経膠腫、髄膜腫、神経鞘腫、
下垂体腺腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、血管腫、類表皮腫、肉腫、その他が包含される。全頭
蓋内腫瘍の５０％は頭蓋内転移である。本明細書にいう腫瘍および新形成は、脳および神
経組織に関係するか、または髄膜、頭蓋、頭頸部の脈管構造もしくは他の組織に関係しう
る。そのような腫瘍は一般に固形腫瘍であるか、頭部に限局的に蓄積する散在性腫瘍であ
る。本発明の処置を受ける腫瘍または新形成は悪性でも良性でもよく、過去に化学療法、
放射線および／または他の処置によって処置されていてもよい。
「有効量」という用語は、対象の健康状態、病態、および疾患に望ましい結果をもたら
すのに十分な投薬量、または診断目的にとって十分な投薬量を意味する。望ましい結果は
、その投薬量の受容者における主観的または客観的改善を含みうる。「治療有効量」は、
健康に対して意図した薬効を生じるのに有効な薬剤の量を指す。
「小有機分子」は、医薬品によく使用される有機分子と同等な大きさを持つ有機分子を
指す。この用語は有機生体ポリマー（例えばタンパク質、核酸など）を除外する。好まし
い小有機分子は、約５０００Ｄａまで、約２０００Ｄａまで、または約１０００Ｄａまで
の大きさをとる。
診断または処置の「対象」は、哺乳動物または霊長類を含むヒトまたは非ヒト動物であ
る。
「処置」は予防的処置または治療的処置または診断的処置を指す。
「予防的」処置は、疾患の徴候を示さない対象または初期徴候しか示さない対象に病態
が発生する危険を減少させる目的で投与される処置である。本発明のコンジュゲート化合
物は、ある病態が発生する可能性を低下させるために、またはその病態が発生した場合の
重症度を最小にするために、予防的処置として与えることができる。
「治療的」処置は、ある病態の徴候または症状を示す対象に、その徴候または症状を軽
減または排除する目的で投与される処置である。徴候または症状は、生化学的、細胞的、
組織学的、機能的、主観的または客観的なものであることができる。本発明のコンジュゲ
ート化合物は、治療的処置として、または診断を目的として、与えることができる。
「診断」とは、病的状態の存在または性質を同定することを意味する。診断方法はその
特異性および選択性が様々である。ある診断方法ではある状態の確定診断は得られないか
もしれないが、その方法が診断を助ける明確な指標を与えるなら、それで十分である。
「薬学的組成物」は、ヒトおよび哺乳動物を含む対象動物における薬学的使用に適した
組成物を指す。薬学的組成物は、薬理学的に有効な量の、活性剤にコンジュゲートされた
ＲＡＰポリペプチド（または他のメガリンリガンド）を含み、薬学的に許容できる担体も
含む。薬学的組成物は、活性成分および担体を構成する不活性成分を含む組成物、ならび
に任意の２以上の成分の組合せ、複合体化もしくは凝集によって、直接的もしくは間接的
にもたらされる任意の物品、または１以上の成分の解離によってもたらされる任意の物品
、または１以上の成分の他のタイプの反応もしくは相互作用によってもたらされる任意の
物品を包含する。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明のコンジュゲートと薬学
的に許容される担体とを混合することによって製造される任意の組成物を包含する。
「薬学的に許容できる担体」は、任意の標準的な担体、緩衝剤、および賦形剤、例えば
リン酸緩衝食塩水、５％デキストロース水溶液、ならびにエマルション、例えば油／水型
または水／油型エマルション、ならびに様々なタイプの湿潤剤および／または佐剤を指す
。好適な薬学的担体および製剤は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第19版(Ma
ck Publishing Co.,イーストン,1995)に記載されている。好ましい薬学的担体は、意図し
ている活性剤の投与様式に依存する。典型的な投与様式には、経腸（例えば経口）投与ま
たは非経口投与（例えば皮下、筋肉内、静脈内もしくは腹腔内注射、または局所、経皮、
または経粘膜投与）が包含される。「薬学的に許容できる塩」は、薬学的使用のために製
剤化することができる塩であり、例えば金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、
カルシウムなど）およびアンモニアまたは有機アミンの塩などがある。
本明細書で使用する「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象への単位投薬量と
して適した物理的に不連続な単離を指し、各単位は、所望の作用をもたらすのに十分な量
の、計算された本発明化合物の所定量を、薬学的に許容できる希釈剤、担体またはビヒク
ルと共に含有している。本発明の新規単位剤形の仕様は、使用する特定コンジュゲートお
よび達成されるべき作用、ならびにホストにおける各化合物に関する薬力学に依存する。
本明細書にいう「調整する」とは、増加または減少によって変化させる能力（例えばア
ンタゴニストもしくはアゴニストとして作用する能力）を指す。
本明細書にいう「相対的送達を増加する」とは、意図する送達部位（例えば脳、リソソ
ーム）におけるＲＡＰ−コンジュゲート活性剤の蓄積が、非コンジュゲート活性剤の蓄積
と比較して増加するような作用を指す。
「治療係数」は、最小治療量より高く、かつ許容できない中毒量より低い、用量範囲（
量および／またはタイミング）を指す。
「等価用量」は、同じ量の活性剤を含有する用量を指す。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位から構成されるポリマーを指す。ポリヌク
レオチドには、天然核酸、例えばデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「Ｒ
ＮＡ」）、ならびに核酸類似体が包含される。核酸類似体には、非天然塩基、天然のリン
酸ジエステル結合以外の結合様式で他のヌクレオチドと結合しているヌクレオチドを含む
もの、またはリン酸ジエステル結合以外の結合様式で取り付けられ塩基を含むものが包含
される。したがって核酸類似体には、例えばホスホロチオエート類、ホスホロジチオエー
ト類、ホスホロトリエステル類、ホスホロアミデート類、ボラノホスフェート類、メチル
ホスホネート類、キラル−メチルホスホネート類、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド類、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが包含されるが、これらに限定されるわけではない。そのよ
うなポリヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置などを使って合成することができる
。「核酸」という用語は、通例、大きなポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド
」という用語は、通例、短いポリヌクレオチドを指し、一般的には約５０ヌクレオチドを
越えない。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表される
場合、これが、「Ｔ」を「Ｕ」で置き換えたＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も包
含することは、理解されるだろう。
「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的または同一な、一本鎖型または二本鎖型のＤＮＡを
指す。
本明細書ではポリヌクレオチド配列の記述に通常の表記法を用いる。すなわち、一本鎖
ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を
５’方向という。新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’→３’付加の方向を転写方向
という。ｍＲＮＡと同じ配列を持つＤＮＡ鎖を「コード鎖」という。また、当該ＤＮＡか
ら転写されるｍＲＮＡと同じ配列を持つＤＮＡ鎖上の配列であって、ＲＮＡ転写物の５’
末端に対して５’側に位置する配列を、「上流配列」という。また、ＲＮＡと同じ配列を
持つＤＮＡ鎖上の配列であって、コードＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にある配
列を、「下流配列」という。
「相補的」とは、２つのポリヌクレオチドの相互作用する面の位相幾何学的適合性また
は一致を指す。したがって、それら２つの分子は相補的であると記述することができ、接
触面の特徴は互いに相補的である。第１ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第２ポ
リヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一であるなら
、第１ポリヌクレオチドは第２ポリヌクレオチドに相補的である。例えば、５’−ＴＡＴ
ＡＣ−３’という配列を持つポリヌクレオチドは、５’−ＧＴＡＴＡ−３’という配列を
持つポリヌクレオチドに相補的である。
問題のヌクレオチド配列に相補的な配列が基準ヌクレオチド配列と実質的に同一である
ならば、その配列は基準ヌクレオチド配列に「実質的に相補的」である。
「コードする」とは、所定のヌクレオチド配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍ
ＲＮＡ）または所定のアミノ酸配列を持つ他のポリマーおよび高分子ならびにそこから得
られる生物学的性質を生物学的過程において合成するためのテンプレートとして役立つと
いう、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特
定配列が持つ固有の特性を指す。したがって、ある遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの
転写および翻訳が細胞または他の生物学的系でタンパク質をもたらすのであれば、その遺
伝子はタンパク質をコードしている。ある遺伝子またはｃＤＮＡのうち、ｍＲＮＡ配列と
同じヌクレオチド配列を持ち、通常、配列表に記載されるコード鎖と、転写のテンプレー
トとして使用される非コード鎖は、どちらも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質ま
たは他の産物をコードするということができる。別段の指定がない限り、「アミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であって同じアミノ酸配列をコード
している、全てのヌクレオチド配列が包含される。タンパク質およびＲＮＡをコードする
核酸配列はイントロンを含みうる。
「組換えポリヌクレオチド」は、自然界では互いに接合されていない配列を持つポリヌ
クレオチドを指す。増幅されたまたは組み立てられた組換えポリヌクレオチドは、適切な
ベクターに含まれていてもよく、そのベクターは適切な宿主細胞の形質転換に使用するこ
とができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を「組換え宿主細胞」という。次に
、遺伝子は組換え宿主細胞中で発現されて、例えば「組換えポリペプチド」を産生する。
組換えポリヌクレオチドは非コード機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム結
合部位など）も果たしうる。
「発現制御配列」は、それに作動的に連結されたヌクレオチド配列の発現（転写および
／または翻訳）を調節する、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列を指す。「作動的に
連結」とは、一方の部分の活性（例えば転写を調節する能力）が他方の部分（例えば配列
の転写）に対する作用をもたらすような２つの部分間の機能的関係を指す。発現制御配列
には、例えばプロモーター（例えば誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター）、エ
ンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのスプラ
イシングシグナル、および停止コドンの配列などがあるが、これらに限定されるわけでは
ない。
「発現ベクター」は、発現させるべきヌクレオチド配列に作動的に連結された発現制御
配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは十分なシス作
用性発現要素を含む。他の発現要素は宿主細胞細胞によって供給されるか、インビトロ発
現系に供給されうる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド
、プラスミド（例えば裸のプラスミドまたはリポソームに含まれているもの）およびウイ
ルスなど、当業者に知られている全ての発現ベクターが包含される。
「増幅」は、例えば逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、およびリガーゼ連鎖反応などによ
り、ポリヌクレオチド配列がコピーされ、その結果として、大量のポリヌクレオチド分子
に拡大されるような、任意の手段を指す。
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイ
ズして、相補的ポリヌクレオチドの合成の開始点を与える能力を持つポリヌクレオチドを
指す。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーを、合成が誘導される条件下に置
いた場合、すなわちヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチドテンプレート、およびＤＮＡ
ポリメラーゼなどの重合用薬剤の存在下に置いた場合に起こる。プライマーは通例、一本
鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは通例、デオキシリボ核酸であるが、多
種多様な合成プライマーおよび天然プライマーが、多くの用途に有用である。プライマー
は、それがハイブリダイズすることによって合成の開始部位として役立つように設計され
たテンプレートに相補的であるが、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。そ
のような場合、テンプレートに対するプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハ
イブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば発色
性部分、放射性部分、または蛍光部分などで標識して、検出可能部分として使用すること
ができる。
ポリヌクレオチドに関して「プローブ」という場合、これは別のポリヌクレオチドの指
定された配列に特異的にハイブリダイズする能力を持つポリヌクレオチドを指す。プロー
ブは標的相補配列に特異的にハイブリダイズするが、テンプレートの正確な相補配列を反
映する必要はない。そのような場合、標的に対するプローブの特異的ハイブリダイゼーシ
ョンは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例
えば発色性部分、放射性部分、または蛍光部分などで標識して、検出可能部分として使用
することができる。
第１配列である配列を持つポリヌクレオチドが、第２配列である配列を持つポリヌクレ
オチドと、特異的にハイブリダイズする場合、その第１配列は第２配列に関して「アンチ
センス配列」である。
「特異的にハイブリダイズする」または「特異的ハイブリダイゼーション」または「〜
に選択的にハイブリダイズする」とは、ある核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、
特定のヌクレオチド配列に、その配列が複雑な混合（例えば全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ
中に存在する場合に、優先的に結合、二重鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的配列に優先的にハイブ
リダイズし、他の配列にはそれほどハイブリダイズしないか、全くハイブリダイズしない
ような条件を指す。サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーショ
ンなどの核酸配列ハイブリダイゼーション実験における「ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依
存的であり、異なる環境パラメータ下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関す
る詳細な指針は、Tijssen(1993)「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecul
ar Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I」の第2章「Overview of
principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」(Else
vier,ニューヨーク)に記載されている。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特異的配列の熱融解温度（
Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致す
るプローブにハイブリダイズするような（所定のイオン強度およびｐＨ下での）温度であ
る。極めてストリンジェントな条件は、特定プローブのＴｍと等しくなるように選択され
る。
サザンブロットまたはノーザンブロットにおいて、フィルター上で、１００個を越える
相補残基を持つ相補的核酸のハイブリダイゼーションを行なう場合、ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件の一例は、１ｍｇのヘパリンを含む４２℃の５０％ホルマリ
ンであり、ハイブリダイゼーションは終夜行なわれる。高度にストリンジェントな洗浄条
件の一例は、７２℃の０．１５Ｍ ＮａＣｌで約１５分間である。ストリンジェントな洗
浄条件の一例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明に
ついてはSambrookらを参照のこと）。バックグラウンドプローブシグナルを除去するため
に、高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄が、しばしば行なわれる
。例えば１００ヌクレオチドより大きい二重鎖の場合、中ストリンジェンシー洗浄の一例
は、４５℃の１×ＳＳＣで１５分である。例えば１００ヌクレオチドより大きい二重鎖の
場合、低ストリンジェンシー洗浄の一例は、４０℃の４〜６×ＳＳＣで１５分である。一
般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブで観察される信
号対雑音比の２倍（以上）の信号対雑音比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示
す。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合、その関連天然構造変異体、および合成非天然類似
体によって連結されたアミノ酸残基、その関連天然構造変異体、および合成非天然類似体
から構成されるポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成装置
などを使って合成することができる。「タンパク質」という用語は、通例、大きいポリペ
プチドを指す。「ペプチド」という用語は、通例、短いポリペプチドを指す。
本明細書ではポリペプチド配列の表現に通常の表記法を用いる。すなわち、ポリペプチ
ド配列の左端はアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端はカルボキシル末端である。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ））、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
「対立遺伝子変異体」は、同じ遺伝子座を占有する遺伝子の２以上の多型のいずれかを
指す。対立遺伝子変異体は突然変異によって自然に生じ、集団内に表現型多型をもたらし
うる。遺伝子突然変異はサイレントである（コードされるポリペプチドに変化がない）場
合もあるし、変化したアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードすることもできる。「対
立遺伝子変異体」は、対立遺伝子変異体遺伝子のｍＲＮＡ転写物から得られるｃＤＮＡ、
ならびにそれらがコードするタンパク質も指す。
２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「同一」または「一致」率
という用語は、下記の配列比較アルゴリズムの一つを使った測定で、または目視検査によ
る測定で、両者を比較し最大限の対応が得られるように整列した場合に、同じであるか、
または指定したパーセンテージの同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を持つ、２以上
の配列または部分配列を指す。
２つの核酸またはポリペプチドに関する「実質的に相同」または「実質的に同一」とい
う表現は、一般に、下記の配列比較アルゴリズムの一つを使った測定で、または目視検査
による測定で、両者を比較し最大限の対応が得られるように整列した場合に、少なくとも
４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９８％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基一
致率を持つ、２以上の配列または部分配列を指す。好ましくは、実質的一致は、少なくと
も約５０残基長である配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の
領域にわたって存在し、最も好ましくは、それらの配列は、少なくとも約１５０残基にわ
たって実質的に同一である。最も好ましい実施形態では、配列は、比較する生体ポリマー
の一方または両方の全長にわたって、実質的に同一である。
配列を比較するには、通例、ある配列を基準配列にして、試験配列をその基準配列と比
較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験配列および基準配列をコンピュー
タに入力し、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータ
を指定する。そうすると、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに
基づいて、基準配列に対する試験配列の配列一致率を計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman,Adv.Appl.M
ath.2:482(1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、またはNeedlemanおよびWunsch,J
.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、またはPearson
およびLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似性検索法によって、または
これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって(Wisconsin Genetics Software Packa
ge(Genetics Computrer Group、ウィスコンシン州マジソン・サイエンスドライブ575)のG
AP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または目視検査によって行なうことができる。
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペ
アワイズアラインメントを使って一群の関連配列から多重配列アラインメントを作成して
、関係および配列一致率を示す。また、アラインメントを作成するために使用したクラス
ター化関係を示すツリーまたは系統樹もプロットする。ＰＩＬＥＵＰでは、FengおよびDo
olittle,J.Mol.Evol.35:351-360(1987)のプログレッシブアラインメント法の簡略化を使
用する。使用される方法は、HigginsおよびSharp,CABIOS 5:151-153(1989)に記載されて
いる方法と類似している。このプログラムは、それぞれ最大５０００ヌクレオチドまたは
５０００アミノ酸の長さを持つ３００配列までを整列させることができる。多重アライン
メント法は、最も類似している２つの配列のペアワイズアラインメントにより、整列され
た２配列のクラスターを作成することから開始する。次に、このクラスターを、次の最も
関連する配列または整列された配列のクラスターと整列させる。２つの配列クラスターは
、２つの個々の配列のペアワイズアラインメントの単純な拡張によって整列される。最終
アラインメントは一連のプログレッシブペアワイズアラインメントによって達成される。
このプラグラムは、特定配列と、配列比較領域についてそれらのアミノ酸座標またはヌク
レオチド座標とを指定すること、そしてプログラムパラメータを指定することによって実
行される。例えば、以下のパラメータを使って、基準配列を他の試験配列と比較すること
により、配列一致率関係を決定することができる：デフォルトのギャップ重み(gap weigh
t)（３．００）、デフォルトのギャップ長重み(gap length weight)（０．１０）、およ
び重みつき末端ギャップ(weighted end gaps)。配列の多重アラインメントの作成に有用
なもう一つのアルゴリズムはClustal W(Thompson et al.,Nucleic Acids Research 22:46
73-4680,1994)である。
配列一致率および配列類似率を決定するのに適したアルゴリズムのもう一つの例は、Al
tschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズム
である。ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、National Center for Biotechn
ology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から、公に入手することができる。
このアルゴリズムでは、まず、クエリ配列中の長さＷの短いワードであって、データベー
ス配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、一致するか、または何らかの正の値の
閾スコアＴを満足するものを同定することによって、ＨＳＰ(high scoring sequence pai
rs)を同定する。Ｔを隣接ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)という
。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するさらに長いＨＳＰを見いだすため
の検索を開始するための種になる。次に、それらのワードヒットを各配列に沿って、累積
アラインメントスコアを増加させることができる限り、両方向に延長する。累積スコアは
、ヌクレオチド配列の場合は、パラメータＭ（一致残基対に対する得点、常に＞０）およ
びＮ（ミスマッチ残基に対する減点、常に＜０）を使って計算される。アミノ酸配列の場
合は、スコアリング行列を使って、累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの延
長は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ低下した場合、または
累積スコアが０以下になった場合、または一方の配列の末端に到達した場合に停止する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速
さを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトとして
、ワード長(wordlength:W)１１、期待値(expectation:E)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および
両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列には、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およ
びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する(HenikoffおよびHenikoff,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 89:10915,1989参照)。
配列一致率の計算だけでなく、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計
解析も行なう(例えばKarlinおよびAltschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,199
3参照)。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが与える類似性の尺度の一つは、最小和確率(smallest
sum probability)（Ｐ（Ｎ））である。これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸
配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を与える。例えば試験核酸と基準核酸との比較
における最低和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約
０．００１未満であるなら、その核酸は基準配列に類似しているとみなされる。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらにもう一つの指標
は、後述するように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが第２の核酸によっ
てコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば
あるポリペプチドと第２のポリペプチドとの相違点が保存的置換だけである場合、それら
２つのポリペプチドは、通例、実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であ
ることのもう一つの指標は、後述するように、２つの分子がストリンジェントな条件下で
互いにハイブリダイズすることである。
「実質的に純粋」または「単離された」は、目的の種が、存在する主要な（すなわち、
モルベースで、その組成物に含まれる他の個々の高分子のどれよりも豊富な）種であるこ
とを意味し、実質的に精製された画分とは、目的の種が存在する全高分子の少なくとも約
５０％を（モルベースで）占めている組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物とは
、組成物中に存在する高分子種の約８０〜９０％以上が精製された関心対象の種であるこ
とを意味する。組成物が本質的に単一の高分子種からなっているのであれば、目的の種は
本質的に均一に精製されている（夾雑種は通常の検出方法では組成物中に検出することが
できない）。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定剤（例えばＢＳＡ）、および元
素イオン種は、この定義においては高分子種とみなされない。一部の実施形態では、本発
明のコンジュゲートは、実質的に純粋であるか、単離されている。一部の実施形態では、
本発明のコンジュゲートは、それらの合成に使用される高分子出発物質に関して、実質的
に純粋であるか、単離されている。一部の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、実質
的に純粋なまたは単離された、ＲＡＰポリペプチドと活性剤とのコンジュゲートが、１以
上の薬学的に許容できる賦形剤と混合されてなる。
物体に適用される「天然」という用語は、その物体を自然界に見いだすことができると
いう事実を指している。例えば、自然界にある由来源から単離することができる生物（ウ
イルスを含む）中に存在し、人間が実験室が意図的に改変していないポリペプチドまたは
ポリヌクレオチド配列は、天然である。
「検出」は、試料中の分析物の存在、不在、または量を決定することを指し、これには
、試料中の分析物の量または試料中の１細胞あたりの分析物の量を定量することも含まれ
うる。
「検出可能部分」または「ラベル」は、分光法的手段、光化学的手段、生化学的手段、
免疫化学的手段、または化学的手段によって検出することができる組成物を指す。例えば
有用なラベルには、32Ｐ、35Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで
よく使用されるもの）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン(dioxigenin)、
対応する抗血清またはモノクローナル抗体を入手することができるハプテンおよびタンパ
ク質、または標的に相補的な配列をもつ核酸分子などがある。検出可能部分は、多くの場
合、試料中の結合された検出可能部分の量を定量するために使用することができる測定可
能シグナル、例えば放射能シグナル、発色シグナル、または蛍光シグナルなどを生成する
。検出可能部分は、共有結合によって、またはイオン結合、ファンデルワールス結合もし
くは水素結合によって、プライマーまたはプローブに組み込むか、取り付けることができ
る（例えば放射性核種またはストレプトアビジンによって認識されるビオチン化ヌクレオ
チドの組み込み）。検出可能部分は直接的に検出可能であっても、間接的に検出可能であ
ってもよい。間接的検出は、その検出可能部分への第２の直接的または間接的に検出可能
な部分の結合を伴いうる。例えば、検出可能部分は、結合パートナーのリガンド、例えば
ストレプトアビジンの結合パートナーであるビオチン、またはヌクレオチド配列（これは
、それが特異的にハイブリダイズすることのできる相補的配列の結合パートナーである）
であることができる。結合パートナーはそれ自体が直接的に検出可能であることができる
。例えば抗体はそれ自体を蛍光分子で標識することができる。結合パートナーは間接的に
検出可能であってもよい。例えば、相補的ヌクレオチド配列を持つ核酸を分岐ＤＮＡ分子
の一部にして、それを他の標識核酸分子とのハイブリダイゼーションによって検出するこ
とができる(例えばPD.FahrlanderおよびA.Klausner,Bio/Technology(1988)6:1165参照)。
シグナルの定量は、例えばシンチレーション計数、デンシトメトリー、またはフローサイ
トメトリーなどによって達成される。
「リンカー」は、他の２つの分子を共有結合によって、またはイオン結合、ファンデル
ワールス結合もしくは水素結合によって、接合する分子を指す（例えば、５’末端で、あ
る相補的配列にハイブリダイズし、３’末端で、もう一つの相補的配列にハイブリダイズ
することにより、２つの非相補的配列を接合する核酸分子）。
［ＩＩ．メガリン］
メガリンはＬＲＰ２とも呼ばれ、ＬＲＰ受容体ファミリーの大きい（６００ｋＤａ）メ
ンバーである(Hussain et al.,Annu Rev Nutr.,19:141-72 1999、ChristensenおよびBirn
Am.J.Physiol.Renal.Physiol.,280:F562-573,2001)。ＬＲＰファミリーの全てのメンバ
ーと同様に、メガリンはＲＡＰを高い親和性で結合する(Czekay et al.,Mol.Biol.Cell.8
(3):517-32,1997)。しかし、メガリンが、腎臓近位尿細管、甲状腺、精巣上体、肺胞およ
び眼の毛様体中のものを含む限られた一組の上皮細胞層の頂端面でしか発現されない点は
、ＬＲＰファミリーの中でユニークである(Zheng et al.,J Histochem Cytochem.,42(4):
531-42,1994)。メガリンは、古典的扁平上皮細胞層である脳毛細管内皮の管腔表面でも発
現される(Chun et al.,Exp Neurol.,157(1):194-201,1999)。脳毛細管内皮上のメガリン
は、インビトロで、血液脳関門を横切って、そのリガンドの１つであるａｐｏＪのトラン
スサイトーシスを媒介することが、先に証明されている(Zlokovic et al.,Proc.Nat'l Ac
ad.Sci.,USA 93(9):4229-34 1996、Zlokovic Life Sci.,59(18):1483-97,1996)。メガリ
ンによるリガンドの頂端側から側底側へのトランスサイトーシスは、腎臓および甲状腺で
も詳述されている(Marino et al.,J Am Soc Nephrol.,12(4):637-48,2001、Marino et al
.,Thyroid,11(1):47-56,2001)。
本願では、メガリンが強固なＭＤＣＫ細胞層を横切るＲＡＰのトランスサイトーシスを
媒介することを示す。本願は、ＬＲＰ１ではなくメガリンが、上述のような細胞層を横切
るＲＡＰおよび他のリガンドのトランスサイトーシスを媒介することを、初めて示すもの
である。この発見からすると、ありとあらゆるメガリンリガンドの使用は、腎臓、甲状腺
、精巣上体、眼および脳細胞において標的送達による活性剤の送達を媒介するための優れ
た候補になると考えられる。したがって、特定の実施形態では、ＢＢＢを横切る活性剤の
トランスサイトーシスを媒介するために他のＬＲＰファミリーメンバーを使用することは
依然として望ましいが、特に好ましい実施形態では、そのようなトランスサイトーシスが
メガリンリガンドへの活性剤のコンジュゲーションによって媒介される。
したがって本願では、メガリンに対する特異性がＬＲＰ１に対する特異性よりも強いリ
ガンドは、血液から脳にタンパク質および小分子を輸送するためのベクターとして特に有
用であるだろうと考えられる。一定の実施形態では、リガンドは、任意選択的に、Ａｐｏ
Ｊを除外する。この利点は、ＬＲＰ１が媒介する肝臓でのクリアランスを避け、血清滞留
時間を増加させ、その結果として脳インフラックスを増加させることによって生じる。
［ＩＩＩ．他のＬＲＰ受容体］
メガリンは、それを介して活性剤トランスサイトーシスを達成するのに好ましい受容体
であるが、それでもなお、他のＬＲＰ受容体はそのようなトランスサイトーシスを達成す
るのに有用だろうと考えられる。「ＬＲＰ」は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパ
ク質１（ＬＲＰ１）を含む低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーを指す。Ｌ
ＲＰ１は４５２５アミノ酸（６００ｋＤａ）の大きいタンパク質であり、フリンによって
切断されて、非共有結合したままの５１５（アルファ）ｋＤと８５（β）ｋＤａの２つの
サブユニットを生じる。ＬＲＰはほとんどの組織タイプで発現される。低密度リポタンパ
ク質（ＬＤＬ）受容体ファミリーの他のメンバーには、ＬＤＬ−Ｒ（１３２ｋＤａ）、Ｌ
ＲＰ／ＬＲＰ１およびＬＲＰ１Ｂ（６００ｋＤａ）、メガリン（（ＬＲＰ２），６００ｋ
Ｄａ）、ＶＬＤＬ−Ｒ（１３０ｋＤａ）、ＥＲ−２（ＬＲＰ−８，１３０ｋＤａ）、モザ
イクＬＤＬ−Ｒ（ＬＲ１１，２５０ＫＤａ）、ならびに他のメンバー、例えばＬＲＰ３、
ＬＲＰ６、およびＬＲＰ−７などがある。このファミリーに特有の特徴としては、細胞表
面発現、細胞外リガンド結合ドメインリピート（ＤｘＳＤＥ）、リガンド結合にＣａ＋＋
が必要、ＲＡＰおよびＡｐｏＥの認識、ＥＧＦ前駆体相同ドメインリピート（ＹＷＴＤ）
、一回膜貫通領域、細胞質ドメイン中の内在化シグナル（ＦＤＮＰＸＹ）、および様々な
リガンドの受容体介在性エンドサイトーシスが挙げられる。このファミリーの一部のメン
バー、例えばＬＲＰ１およびＶＬＤＬＲなどは、シグナル伝達系路に関与する。
ＬＲＰリガンドとは、ＬＲＰを結合することが知られている数多くの分子を指す。これ
らの分子には、例えばラクトフェリン、ＲＡＰ、リポタンパク質リパーゼ、ＡｐｏＥ、第
ＶＩＩＩ因子、ベータ−アミロイド前駆体、アルファ−２−マクログロブリン、トロンボ
スポンジン２ ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ−２）、ＭＰＰ−９−Ｔ
ＩＭＰ−１（マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織阻害因子）、ｕＰＡ（ウロキナ
ーゼプラスミノゲン活性化因子）：ＰＡＩ−Ｉ（プラスミノゲン活性化因子阻害因子１）
：ｕＰＡＲ（ｕＰＡ受容体）、およびｔＰＡ（組織プラスミノゲン活性化因子）：ＰＡＩ
−Ｉ：ｕＰＡＲなどがある。
ＬＲＰ１は、システインリッチ型リピートがクラスター化している多機能受容体である
と考えられる。ＬＤＬ受容体に見いだされるものに類似している結合リピートは、以前は
無関係であると考えられていた様々なリガンドを結合するという能力の分子的原理である
。これらには、シュードモナス外毒素Ａ、ヒトライノウイルス、ラクトフェリンおよびい
わゆる受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）の他に、先の段落に記載したリガンドが含まれる
。Meilinger et al.,FEBS Lett,360:70-74(1995)参照。ＬＲＰ１はＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号Ｘ１３９１６およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔプライマリーアクセッション番号Ｑ
０７９５４である。ＬＲＰ１遺伝子／タンパク質の別名として、低密度リポタンパク質受
容体関連タンパク質１［前駆体］、ＬＲＰ、アルファ−２−マクログロブリン受容体、Ａ
２ＭＲ、アポリポタンパク質Ｅ受容体、ＡｐｏＥＲ、ＣＤ９１、ＬＲＰ１またはＡ２ＭＲ
が挙げられる。
ＬＲＰファミリーのメンバーは毛細管内皮上ならびにニューロンおよびアストロサイト
を含むＣＮＳ細胞タイプ上によく発現される（例：ＬＤＬ受容体、メガリン、ＬＲＰ）。
ＬＲＰ受容体は結合したリガンドをエンドサイトーシスし、腎臓、甲状腺の極性上皮細胞
を横切って、また脳内の毛細管内皮細胞を横切って、リガンドをトランスサイトーシスす
る。したがってＬＲＰは、様々な組織において様々なレベルで発現される構成的および機
能的に関連する受容体のプールを含む。一部の実施形態では、本発明はＲＡＰを使用する
。ＲＡＰはこの関連受容体プールのメンバー（そして特にこのプールのメンバーを発現さ
せる細胞、組織、および器官）を結合し、その結果、それらを標的とする。例として、筋
組織上のＶＬＤＬＲ、ニューロン組織上のＬＲＰ１Ｂ、腎臓およびニューロン組織上のメ
ガリン、ならびに血管平滑筋組織上のＬＲＰ１が挙げられる。
［ＩＶ．ＲＡＰおよび他のメガリンリガンド］
本発明の特定の実施形態では、メガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片である
第１部分と、メガリンへのメガリンリガンド（またはその断片）の結合によってその送達
が媒介される活性剤である第２部分とを含むキメラ分子を製造する。好ましい実施形態で
は、これらのキメラ分子の一部を形成させるために選択されるリガンドは、インビボでト
ランスサイトーシスされるものだろう。「ＲＡＰ」は約３９ｋＤａおよび３２３アミノ酸
の周知のタンパク質であり、ＬＲＰファミリーのメンバーに特化したシャペロンである。
これはインビボでトランスサイトーシスされる。ＲＡＰは、ＬＲＰなどのＬＤＬ受容体フ
ァミリーのメンバーへのリガンドの結合を阻害する(BuおよびRennke,J.Biol.Chem.271:22
218-2224(1996)、Willnow et al.,J.Biol.Chem.267:26172-26180(1992)、BuおよびSchwar
tz,Trends Cell Biol.8:272-276(1998)、ならびにHerzおよびStrickland,J.Clin.Invest.
108:779-784(2001)参照)。また、BuおよびSchwartz,Trends Cell Biol.8:272-276(1998)
も参照されたい。ＲＡＰのさらなる特徴づけは、ヒトＲＡＰの全アミノ酸配列（図１５）
を含めて、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる米国特許第5,474,766号に記載
があり、ＲＡＰアミノ酸配列および断片についてもそこに詳しく開示されている。２８ｋ
ＤａヒトＣ末端断片（図１６）は極めて活性なＲＡＰポリペプチドであり、本発明の好ま
しい実施形態においては、コンジュゲートが活性剤の担体としてこの断片を含む。
ＲＡＰポリペプチドには、例えばＲＡＰ、可溶型のＲＡＰ、切断されたＲＡＰ、ＲＡＰ
ポリペプチド断片、ＲＡＰの相同体および類似体などがあるが、これらに限定されるわけ
ではない。ＬＲＰ受容体結合の調整、トランスサイトーシス、またはエンドサイトーシス
に関してＲＡＰの機能的等価物であるＲＡＰポリペプチドは、そのＲＡＰポリペプチドの
ＬＲＰに結合する能力についてスクリーニングすることによって、容易に同定することが
できる。好ましい実施形態では、ＲＡＰポリペプチドが、同様の長さを持つ天然、ネイテ
ィブまたは野生型哺乳類ＲＡＰアミノ酸配列に対して、またはＲＡＰポリペプチドの少な
くとも１０アミノ酸、２５アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、もしくは２００ア
ミノ酸、３００アミノ酸のドメインまたは全長にわたって、例えば８０％、９０％、９５
％、９８％、または９９％を越える配列一致率を持つＲＡＰの相同体である。ＲＡＰポリ
ペプチドには、ＲＡＰの対立遺伝子変異体、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフ
ィッシュ、ブタ、ミバエ、カ、および扁形動物ネイティブＲＡＰにおけるパラログおよび
オルソログ、ならびにその誘導体、部分、または断片が包含される（Ｇｅｎｂａｎｋアク
セッション番号：Ｐ３０５３３（ヒト）、ＸＰ１３２０２９（マウス）、Ｑ９９０６８（
ラット）、ＣＡＡ０５０８５（ニワトリ）、ＡＡＨ４９５１７（ゼブラフィッシュ）、Ａ
ＡＭ９０３０１（ブタ）、ＮＰ６４９９５０（ミバエ）、ＸＰ３１３２６１（カ）、ＮＰ
５０６１８７（扁形動物））。マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ミバエ、
カ、および扁形動物由来のアミノ酸配列の多重アラインメントならびにコンセンサス配列
を図１４に示す。
ＲＡＰポリペプチドは酸性塩もしくは塩基性塩の形態をとるか、その中性型であること
ができる。また、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元などによって修飾することがで
きる。さらに、ＲＡＰの望ましい生物学的活性が保持されるか改善されるという正味の作
用を持つような様々な置換、欠失、または付加を、アミノ酸配列または核酸配列に施すこ
ともできる。ＲＡＰのさらなる特徴づけは、ＲＡＰの全アミノ酸配列を含めて、参照によ
りそのまま本明細書に組み入れられる米国特許第5,474,766号に記載があり、ＲＡＰアミ
ノ酸配列および断片についてもそこに詳しく開示されている。例えば、コードの縮重によ
り、当業者には、同じアミノ酸配列をコードする多数のヌクレオチド配列変種が知られて
いる。
好ましいＲＡＰポリペプチドは、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）のネイティブアミノ
酸配列、特にネイティブヒト配列（配列番号１）との間に実質的な相同性を持つ。好まし
い実施形態では、ＲＡＰポリペプチドが、同様の長さを持つネイティブまたは野生型哺乳
類ＲＡＰアミノ酸配列に対して、または少なくとも１０アミノ酸、２５アミノ酸、５０ア
ミノ酸、１００アミノ酸、もしくは２００アミノ酸、または３００アミノ酸以上のドメイ
ンまたは比較ウインドウにわたって、例えば８０％、９０％、９５％、９８％、または９
９％を越える配列一致率を持つＲＡＰの相同体である。
特に好ましいヒトまたは哺乳類ＲＡＰは、単離されたＲＡＰ、またはＲＡＰのＬＲＰ結
合部位を少なくとも１つは含有するその断片、例えばＲＡＰの可溶性ポリペプチド断片で
ある。ＲＡＰのどの部分がそのＬＲＰ結合および調節活性にとって重要であり、どの部分
なら結合活性を失わずに突然変異、改変、または欠失させることができるかについては、
かなりの指針が当分野には存在する(Nielsen et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 94:7521(19
97)、およびRall et al.,J.Biol.Chem.273(37):24152,1998参照)。例えばＲＡＰのＬＲＰ
結合機能は、オーバーラップしたＲＡＰドメインに相当する融合タンパク質で直接結合研
究を行なうことによって、マッピングされている(Willnow et al.,J.Biol.Chem.267(36):
26172-80,1992参照)。また、ＲＡＰ結合モチーフは、切断型および指定部位ＲＡＰ突然変
異体の使用によっても、特徴づけられている(Melman et al.,J.Biol.Chem.276(31):29338
-29346,2001参照)。本発明での使用に適した具体的なＲＡＰポリペプチド断片としては、
断片（ＲＡＰ Ｎ末端アミノ酸位置からＲＡＰ Ｃ末端アミノ酸位置に向かって定義）：
１−３２３（ＲＡＰ）、１−３１９、１−２５０、１−１１０、９１−２１０、１９１−
３２３、２２１−３２３、１−１９０、１−２００、および１−２１０が挙げられる。好
ましいＲＡＰ ポリペプチドとしては、断片１−３２３（ＲＡＰ）、１−３１９、１９１
−３２３、および１−２１０が挙げられる。Ｃ末端の４アミノ酸の配列が配列ＫＤＥＬで
置換されている改変ＲＡＰポリペプチドも好適である。Ｃ末端の４アミノ酸の配列（ＨＮ
ＥＬ）が欠失している改変ＲＡＰポリペプチドも好適である。また、ＲＡＰのネイティブ
配列をアミノ酸２０１から２１０まで含むＲＡＰポリペプチド断片も好ましい。
別の好ましい実施形態は、位置２８２〜２８９、２０１〜２１０、および３１１〜３１
９にわたってＲＡＰのネイティブアミノ酸配列を含む、ヒトまたは哺乳類ＲＡＰポリペプ
チドを含む。ＲＡＰの突然変異型およびＮ末端またはＣ末端切断型変異体であってＬＲＰ
受容体に結合するものはMelmanら(J.Biol.Chem.276(31):29338-46,2001)に開示されてお
り、この文献は参照によりそのまま、特にこれらのＲＡＰ突然変異型および切断型変異体
に関して、本明細書に組み入れられる。別の好ましいＲＡＰポリペプチドは、アミノ酸８
５〜１４８および１７８〜２４８間のＲＡＰのネイティブ配列を含む(Farquhar et al.,P
roc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3161-3162(1994)参照)。
このように多くの文献が、ＬＲＰ受容体に対するＲＡＰおよびＲＡＰ断片の結合に関し
て、結合部位および構造活性相関を開示している。当業者は、ＬＲＰ結合部位を含有し本
発明のＲＡＰポリペプチドとしての使用に適したＲＡＰポリペプチドを得るために、当分
野で周知の様々な技術を容易に適合させることができる。ＲＡＰの好ましい断片は生理学
的条件下で可溶である。これらのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は、ＬＲＰ粒子に対
する結合能が影響を受けずに残っている限り、望みどおりに短縮することができる。ＲＡ
Ｐの好ましいアミノ酸配列はヒトタンパク質に相当する。ＲＡＰポリペプチドの好適な配
列は、他の哺乳動物または動物界のメンバーから単離されたＲＡＰのアミノ酸配列に由来
することもできる。
ＬＲＰ結合部位を含有するＲＡＰの断片を生成させるために、単離されたネイティブタ
ンパク質を酵素的および／または化学的切断で変換することによって、例えばＲＡＰをパ
パインもしくはトリプシンなどの酵素または臭化シアンなどの化学薬品と反応させること
によって、タンパク質全体の断片を生成させることができる。好ましくは、細胞外受容体
領域が遊離するように、タンパク質分解活性を持つ酵素または化学薬品を選択する。次に
、ＬＲＰ結合部位を含有する断片、特に生理学的条件下で可溶性である断片を、既知の方
法を使って単離することができる。
あるいは、例えばWilliams et al.,J.Biol.Chem.267:9035-9040(1992)、Wurshawsky et
al.,J.Biol.Chem.269:3325-3330(1994)、Melman et al.,J.Biol.Chem.276(31):29338-46
(2001)などに記載されているように、ＲＡＰまたはＲＡＰの断片を組換え細菌中で発現さ
せることもできる。
ＲＡＰは酸性塩もしくは塩基性塩の形態をとるか、中性型であることができる。また、
個々のアミノ酸残基は、酸化または還元などによって修飾することもできる。さらに、Ｒ
ＡＰの望ましい生物学的活性が保持されるか改善されるという正味の作用を持つような様
々な置換、欠失、または付加を施すこともできる。例えば、コードの縮重により、同じア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列には、かなりの変種が存在しうる。
本明細書で用いられるＲＡＰ断片には、ＲＡＰまたはその生物学的に等価な類似体であ
って、それがＬＲＰに結合し、血液脳関門を横切ってトランスサイトーシスされ、輸送さ
れるのを可能にするのに十分であるようなそのリガンドの部分を含有している任意の部分
、またはそのリガンドの望ましいＬＲＰ媒介性担体活性を他の形で保持または改善する任
意の部分が包含されるが、これらに限定されるわけではない。図１５にヒトＲＡＰのアミ
ノ酸配列を示す。図１６に２８ｋｄ ＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
ＲＡＰの他に、他のメガリンリガンドも、トランスサイトーシスによる活性剤の輸送を
促進するために使用することができる。ＲＡＰ以外のメガリンリガンドには、例えばチロ
グロブリン(Zheng et al.,Endocrinol.,139:1462-1465,1998;例示的配列については、例
えばGenBankアクセッション番号NP#003226およびCollins et al.,J.Clin.Endocrinol.Met
ab.88(10),5039-5042,2003参照)、リポタンパク質リパーゼ(Kounnas et al.,J.Biol.Chem
.,268:14176-14181,1993;例示的配列については、例えばGenBankアクセッション番号AAP3
5372参照)、ラクトフェリン(Willnow et al.,J.Biol.Chem.,267:26172-26180,1992;例示
的配列については、例えばVelliyagounder et al.,Infect.Immun.71(11),6141-6147,2003
によるGenBankアクセッション番号AAN1130参照)、アポリポタンパク質Ｊ／クラスタリン(
Kounnas et al.,J.Biol.Chem.,270:13070-13075,1995;例示的配列については、例えばGen
Bankアクセッション番号NP#001822およびNP#976084ならびにOta et al.,Nat.Genet.,Nat.
Genet.36(1),40-45(2004)、Ota et al.,Int.J.Cancer 108(1),23-30,2004参照)、アポリ
ポタンパク質Ｂ(Stefansson et al.,J.Biol.Chem.,270:19417-19421,1995;例示的配列に
ついては、例えばGenBankアクセッション番号AAP72970参照)、アポリポタンパク質Ｅ(Wil
lnow et al.,J.Biol.Chem.,267:26172-26180,1992;例示的配列については、例えばGenBan
kアクセッション番号NP#000032およびHirono et al.,J Neuropsychiatry Clin Neurosci
15(3),354-358,2003参照)、組織型プラスミノゲン活性化因子(Willnow et al.,J.Biol.Ch
em.,267:26172-26180,1992;例示的配列については、例えばGenBankアクセッション番号P0
0750およびPennica et al.,Nature 301(5897),214-221(1983)参照)、ｕＰＡ(Moestrup et
al.,J.Clin.Invest.,102:902-909,1998;例示的配列については、例えばGenBankアクセッ
ション番号NP#002649およびTran et al.,Mol.Cell.Biol.23(20),7177-7188(2003)参照)、
ＰＡＩ−１(Stefansson et al.,J.Cell.Sci.,108:2361-2368,1995;例示的配列については
、例えばGenBankアクセッション番号NP#000593およびHe et al.,Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.310(3),878-883,2003参照)、ビタミンＤ結合タンパク質(DBP;Nykjaer et al.,Cell
96:507-515,1999;例示的配列については、例えばGenBankアクセッション番号AAA19662お
よびYang et al.,Gene 54(2-3),285-290,1987参照)、ビタミンＡ／レチノール結合タンパ
ク質(RBP;Christensen et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,10:685-695,1999;例示的配列について
は、例えばGenBankアクセッション番号AAA59188参照)、β２―ミクログロビン(Orlando e
t al.,J.Am.Soc.Nephrol.,9:1759-1766,1998;AAA51811およびAAH64910)、α１−ミクログ
ロブリン(Orlando et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,9:1759-1766,1998;AAH41593およびCAA3858
5)、ビタミンＢ１２／コバラミン血漿担体タンパク質、トランスコバラミン（ＴＣ）−Ｂ
１２、ＰＴＨ、インスリン(Orlando et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,9:1759-1766,1998)、Ｅ
ＧＦ(Orlando et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,9:1759-1766,1998)、プロラクチン(Orlando et
al.,J.Am.Soc.Nephrol.,9:1759-1766,1998)、アルブミン、ａｐｏＨ(例示的配列につい
ては、例えばGenBankアクセッション番号P02749およびGene 108(2),293-298,1991参照)、
トランスサイレチン(例示的配列については、例えばGenBankアクセッション番号NP#00036
2参照)、リゾチーム(Orlando et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,9:1759-1766,1998;例えばCAA00
878およびEP 0222366-A参照)、シトクロム−ｃ(Orlando et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,9:17
59-1766,1998)、α−アミラーゼ、およびＣａ２＋、ならびにアプロチニンなどがあるが
、これらに限定されるわけではない。メガリンの構造、機能および発現パターンの詳細な
総説については、ChristensenおよびBirn(Am.J.Physiol.Renal.Physiol.,280:F562-573,2
001)を参照されたい。上記GenBankアクセッション番号は、当業者に知られているこれら
タンパク質の例示的配列であることに留意すべきである。同様に当業者に知られていて、
野生型配列としてまたは修飾配列として（例えば断片、保存的変異体など）として本願の
コンジュゲートに使用することができる配列は、他にも数多く存在する。
上記メガリンリガンドはいずれも、トランスサイトーシスによる活性剤の送達に使用す
ることができる。そのような実施形態では、メガリンリガンドが当業者に知られる技術を
使って関心対象の活性剤にコンジュゲートされる。好ましい実施形態では、メガリンに対
する結合親和性を高めるために、そのようなリガンドをさらに修飾することができると考
えられる。そのような修飾リガンドは、メガリン受容体を発現させる任意の細胞を横切る
トランスサイトーシスにとって、とりわけ有用な送達ビヒクルになるだろう。別の好まし
い実施形態では、リガンドがＬＲＰ１よりもメガリンに対して高い結合親和性を持つよう
にメガリンリガンドを修飾することができると考えられる。そのようなリガンドは、血液
脳関門を横切ってタンパク質および小分子を輸送するためのベクターとして、とりわけ有
用だろう。この利点は、肝臓内で肝細胞上のＬＲＰ１受容体によって媒介される活性剤の
ＬＲＰ１媒介性クリアランスを回避することによって血清滞留時間を増加させ、その結果
として活性剤の脳インフラックスを増加させることによって生じる。
［Ｖ．メガリン結合部分と活性剤とのコンジュゲーション］
本明細書の全体を通して、出願人はメガリン結合部分に言及する。通例、そのような部
分は、上述したリガンドなどの天然メガリン結合リガンドである。別の実施形態では、前
記部分が、修飾された、そのようなリガンドである。さらなる実施形態として、メガリン
結合部分は、メガリンと免疫反応しそれゆえにメガリンを認識する抗体の全部または一部
であることもできる。本発明では、メガリン結合部分が、所定の標的（例えば脳）に送達
されるべき薬剤にコンジュゲートされる。本明細書では、メガリンリガンド−活性剤コン
ジュゲートに言及する。メガリンリガンドには任意の上記メガリン結合実体が包含されう
ると理解すべきである。
「メガリンリガンドコンジュゲート」「リガンドポリペプチドコンジュゲート」「活性
剤にコンジュゲートされたメガリンリガンドを含むキメラ分子」は、それぞれ、活性剤に
取り付けられたメガリンのリガンドまたはそのメガリン結合性断片を含む化合物を指す。
本明細書で使用する「コンジュゲートされた」という用語は、治療剤とメガリンポリペプ
チドとが、例えば共有化学結合、ファンデルワールス相互作用または疎水相互作用などの
物理力、封入、包埋、またはそれらの組合せなどによって、物理的に連結されることを意
味する。好ましい実施形態では、治療剤とメガリンリガンドポリペプチドとが、共有化学
結合によって物理的に連結される。したがって好ましい化学療法剤は、メガリンリガンド
またはその断片とのコンジュゲーションに使用されるアルコール、酸、カルボニル、チオ
ールまたはアミン基などの官能基を含有する。好ましい実施形態では、メガリンリガンド
がＲＡＰまたはＲＡＰポリペプチドである。アドリアマイシンはアミンクラスに属し、カ
ルボニルを介して連結することも可能である。パクリタキセルはアルコールクラスに属す
る。適切なコンジュゲーション基を持たない化学療法剤は、そのような基が付加されるよ
うにさらに修飾することができる。これらの化合物は全て本発明において考えられる。治
療剤が複数である場合は、様々なコンジュゲーションの組合せを使用することができる。
一部の実施形態では、直接的な（介在原子なし）または間接的な（リンカー、例えば共
有結合した原子の鎖を介した）共有化学結合が、メガリンリガンドと活性剤とを接合する
。好ましい実施形態では、コンジュゲートのメガリンリガンドと活性剤部分とが、メガリ
ンリガンドの原子と活性剤の原子との共有結合によって直接的に連結される。一部の好ま
しい実施形態では、メガリン結合部分が、メガリンリガンドもしくはそのメガリン結合性
断片を活性剤に結びつけることができる共有結合または事実上任意のアミノ酸配列のペプ
チドまたは任意の分子もしくは原子を含むリンカーによって、本発明化合物の活性剤部分
に結びつけられる。
一部の実施形態では、リンカーが１〜約３０原子以上、２〜５原子、２〜１０原子、５
〜１０原子、または１０〜２０原子長の原子の鎖を含む。一部の実施形態では、鎖原子が
全て炭素原子である。一部の実施形態では、鎖原子がＣ、Ｏ、Ｎ、およびＳからなる群よ
り選択される。鎖原子およびリンカーは、可溶性の高いコンジュゲートが得られるように
、それらの予想溶解度（親水性）に従って選択することができる。一部の実施形態では、
リンカーは、リソソーム内で酵素の攻撃を受ける官能基を与える。一部の実施形態では、
リンカーは、標的組織または標的器官内に見いだされる酵素による攻撃を受け、攻撃また
は加水分解を受けると、活性剤とメガリンリガンドとの間の連結を切り離す官能基を与え
る。一部の実施形態では、リンカーは標的部位に見いだされる条件下（例えばリソソーム
の低いｐＨ）で加水分解を受ける官能基を与える。リンカーは、１以上のそのような官能
基を含有しうる。一部の実施形態では、リンカーの長さが、メガリンリガンド結合部位お
よび活性剤活性結合部位の一方または両方との間の立体障害（活性剤が大きい場合）の可
能性を減少させるのに十分な長さである。
リンカーが共有結合またはペプチドであり、活性剤がポリペプチドである場合、コンジ
ュゲート全体は融合タンパク質であることができる。そのような融合タンパク質は、当業
者に知られる組換え遺伝子操作法によって製造することができる。一部の実施形態では、
コンジュゲートのメガリンリガンド部分は、迅速に分解して活性化合物を遊離するように
製剤化される。別の実施形態では、リンカーは細胞内環境条件下で、より好ましくはリソ
ソーム環境条件下で切断されて、活性剤部分をメガリンリガンドポリペプチド部分から遊
離または分離する。
コンジュゲートは、同じメガリンリガンドに連結された１以上の活性剤を含むことがで
きる。例えばコンジュゲーション反応は、メガリンリガンドポリペプチドに対して１〜５
、約５、約１〜１０、約５〜１０、約１０〜２０、約２０〜３０、または３０分子以上の
活性剤をコンジュゲートしうる。これらの製剤は混合物として使用するか、特定の化学量
論を持つ製剤に精製することができる。当業者は、どの形式およびどの化学量論比が好ま
しいかを決定することができる。さらに、１タイプを越える薬剤を標的部位または標的コ
ンパートメントに送達することが望まれる場合は、１タイプを越える活性剤をメガリンリ
ガンドポリペプチドに連結することもできる。例えばアドリアマイシン−シスプラチナム
ＲＡＰポリペプチド（または他のメガリンリガンド）コンジュゲートなど、複数の活性剤
種を同じメガリンリガンドポリペプチドに取り付けることができる。したがってコンジュ
ゲートは、ある範囲の化学量論比からなることができ、１タイプを越える活性剤を組み込
むことができる。これらもまた、精製された混合物に分離するか、または集合体として使
用することができる。
本発明のメガリンリガンドまたはその断片のコンジュゲートは、その安定性または薬物
動態特性が向上するように、望みどおりに修飾することができる（例えばＰＥＧ化）。メ
ガリンリガンドポリペプチドと活性剤とをコンジュゲートするのに好適なリンカー、およ
びそれらの製造に容易に適合させることができる合成化学法は、本願と同じ譲受人に譲渡
された米国特許出願第60/395,762号（参照によりそのまま本明細書に組み入れられる）に
記載されている。
これらのコンジュゲートの合成は効率がよく、便利であり、高い収率と水溶性の向上し
た薬物とをもたらす。
［ＶＩ．活性剤］
本発明の活性剤には、生物学的過程に影響を及ぼすことができる薬剤が包含される。本
発明の化合物、組成物および方法における使用にとりわけ好ましい活性剤は、薬物および
診断剤を含む治療剤である。「薬物」または「治療剤」という用語は、治療有効量で投与
した場合に、薬理学的活性または薬理学的利益を持つ活性剤を指す。特に好ましい薬剤は
天然の生物学的薬剤（例えば酵素、タンパク質、ポリヌクレオチド、抗体、ポリペプチド
）である。一部の実施形態では、メガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片（例え
ば一定の好ましい実施形態ではＲＡＰまたはＲＡＰポリペプチド）にコンジュゲートされ
る活性剤は、生きている宿主内の生物学的過程を調整する能力を持つ分子ならびにその任
意の結合部分もしくは断片である。薬物または治療剤の例には、疾患または状態の防止、
診断、改善、処置または治療に用いられる物質が包含される。特に、本薬剤は疾患を引き
起こす薬剤ではないと考えられる。具体的には、本薬剤はアミロイドβタンパク質ではな
い。
〔Ａ．タンパク質活性剤〕
活性剤は非タンパク質またはタンパク質であることができる。活性剤はタンパク質もし
くは酵素、またはそれらタンパク質もしくは酵素の治療活性もしくは生物学的活性の一部
、実質的に全て、もしくは全てをまだ保持しているそれらの任意の断片であることができ
る。一部の実施形態では、前記タンパク質または酵素は、それが発現または産生されない
か、またはその発現量または産生量が実質的に減少すると、リソソーム蓄積症を含む（た
だしこれに限定されるわけではない）疾患を生じるであろうものである。好ましくは、前
記タンパク質または酵素は、ヒトまたはマウスに由来するかヒトまたはマウスから得られ
るものである。
本発明の好ましい実施形態では、ＲＡＰまたはＲＡＰポリペプチドにコンジュゲートさ
れた活性剤がタンパク質もしくは酵素または前記タンパク質もしくは酵素の生物学的活性
を持つその断片である場合に、活性剤はヒトまたは哺乳類タンパク質または酵素の対応す
る部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を持つ。別の実施形態では、コンジュゲート
の活性剤部分は、ヒトまたは哺乳動物の種にネイティブなタンパク質または酵素である。
別の実施形態では、上記タンパク質もしくは酵素、またはその断片は、対応するヒトまた
は哺乳類タンパク質または酵素のネイティブ配列に対して実質的に相同（すなわち、活性
剤の少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０もしくは２００アミノ酸長にわたって
、または活性剤の全長にわたって、アミノ酸配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、
９５％、より好ましくは９８％、もしくは最も好ましくは９９％同一）である。
化合物がタンパク質である場合、化合物は酵素、または酵素活性の一部、実質的に全て
、もしくは全てをまだ保持している酵素の任意の断片であることができる。好ましくは、
リソソーム蓄積症の処置においては、酵素は、細胞中に見いだされる酵素であって、それ
が発現または産生されないか、発現量または産生量が実質的に低下すると、リソソーム蓄
積症を生じるであろう酵素である。好ましくは、酵素はヒトまたはマウスに由来するか、
ヒトまたはマウスから得られる。好ましくは、酵素はリソソーム蓄積酵素、例えばα−Ｌ
−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ガラクトシルセラミダ
ーゼ、酸性−アルファ−グリコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、ヘキソサミニダ
ーゼ・アルファ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または他の任意
のリソソーム蓄積酵素などである。
したがって一部の実施形態では、ヒトリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の処置で、メガリン
リガンド−活性剤コンジュゲートが、処置される対象または患者のリソソームにおいて欠
乏している活性剤タンパク質または酵素を含む。そのような酵素には、例えばアルファ−
Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、
アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ガラクトシル
セラミダーゼ、酸性−アルファ−グリコシダーゼ、チオエステラーゼ、ヘキソサミニダー
ゼＡ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、または他の任意のリ
ソソーム蓄積酵素が包含される。リソソーム蓄積症と、そこで欠乏している、活性剤とし
て有用なタンパク質の一覧表を、以下に記載する。
Figure 2011207889
したがって、本発明の方法を使って処置または防止することができるリソソーム蓄積症
には、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ Ｉ）、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩ
Ｂ、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、クラッベ病、ポンペ病、セロイドリポフスチ
ノーシス、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病ＡおよびＢ、ならびに他のリソソーム
疾患が包含されるが、これらに限定されるわけではない。
したがって上記の表に示すように、各疾患について、コンジュゲート薬剤は、好ましく
は、その疾患で欠乏している特定の活性剤酵素を含むだろう。例えばＭＰＳ Ｉに関わる
方法では、好ましい化合物または酵素はα−Ｌ−イズロニダーゼである。ＭＰＳ ＩＩに
関わる方法では、好ましい化合物または酵素はイズロン酸−２−スルファターゼである。
ＭＰＳ ＩＩＩＡに関わる方法では、好ましい化合物または酵素はヘパランＮ−スルファ
ターゼである。ＭＰＳ ＩＩＩＢに関わる方法では、好ましい化合物または酵素はα−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼである。異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）に関わる方
法では、好ましい化合物または酵素はアリールスルファターゼＡである。クラッベ病に関
わる方法では、好ましい化合物または酵素はガラクトシルセラミダーゼである。ポンペ病
に関わる方法では、好ましい化合物または酵素は酸性α−グリコシダーゼである。ＣＬＮ
に関わる方法では、好ましい化合物または酵素はトリペプチジルペプチダーゼである。テ
イ・サックス病に関わる方法では、好ましい化合物または酵素はヘキソサミニダーゼ・ア
ルファである。ニーマン・ピック病ＡおよびＢに関わる方法では、好ましい化合物または
酵素は酸性スフィンゴミエリナーゼである。
メガリンリガンド−活性剤コンジュゲートは、メガリンリガンドまたはそのメガリン結
合性断片に連結された１以上の活性剤部分（例えば１〜１０個、または１〜４個、または
２〜３個の部分）を含むことができる。例えばコンジュゲーション反応は、ＲＡＰポリペ
プチド分子などの単一のメガリンリガンドに対して、１〜４分子以上のアルファ−Ｌ−イ
ズロニダーゼをコンジュゲートすることができる。これらの製剤は混合物として使用する
か、特定のメガリンリガンドポリペプチド−薬剤化学量論製剤に精製することができる。
当業者は、どの形式およびどの化学量論比が好ましいかを決定することができる。さらに
、蓄積された基質のより完全な分解が容易になるように、１以上の異なる活性剤を、メガ
リンリガンドまたはメガリンリガンドのメガリン結合性断片の与えられた任意の分子に連
結することもできる。これらのメガリンリガンドコンジュゲート薬剤は、ある範囲の化学
量論比からなることができる。これらもまた、精製された混合物に分離するか、集合体と
して使用することができる。融合物におけるメガリン結合部分とＬＳＤの順序は、メガリ
ン結合部分のメガリン結合能にとって重要であるかもしれない。したがって好ましい実施
形態では、メガリン結合部分がＬＳＤ酵素コード配列のＮ末端側に位置する。特定の実施
形態では、本発明のコンジュゲートが、ＬＳＤ酵素コード配列のＮ末端側に位置するＲＡ
Ｐコード配列を含むことが考えられる。
メガリンリガンドコンジュゲート活性剤は、ＣＮＳ内またはＣＮＳ外の細胞のリソソー
ム中に進入するか、それらリソソーム中に輸送されるか、それらリソソーム中に存在する
結果に至ることができる。コンジュゲート薬剤の通過速度は、メガリン結合活性を調整す
ることができる任意の化合物またはタンパク質によって調整することができる。好ましい
実施形態では、コンジュゲートのメガリン結合親和性がＬＲＰ１結合親和性よりも高い。
細胞はリソソーム蓄積症に冒された任意の組織または器官系に由来することができる。細
胞は、例えば内皮、上皮、筋、心臓、骨、肺、脂肪、腎臓、または肝臓の細胞であること
ができる。一部の実施形態では、細胞は、好ましくは、ＢＢＢ内に見いだされる細胞であ
る。一部の実施形態では、細胞はニューロンまたは脳細胞である。別の実施形態では、細
胞は末梢の細胞であるか、ＢＢＢなどの内皮によって体循環から隔離されない細胞である
。
〔Ｂ．薬物活性剤〕
一般に、薬物活性剤は任意の大きさを持ちうる。好ましい薬物は、関心対象の標的に結
合する能力を持つ小さい有機分子である。コンジュゲートの薬物部分は、それが小分子で
ある場合には、一般に少なくとも約５０Ｄ、通常は少なくとも約１００Ｄの分子量を持ち
、その分子量は５００Ｄ以上であってもよいが、通常は約２０００Ｄを越えないだろう。
薬物部分は、本方法の実施に際してそのコンジュゲートが投与される宿主内の標的と相
互作用する能力を持つ。標的は、多種多様な天然構造であることができ、関心対象の標的
には細胞内標的および細胞外標的の両方が包含され、そのような標的はタンパク質、リン
脂質、核酸などであることができ、タンパク質は特に興味深い。関心対象である特定のタ
ンパク質標的には、例えばキナーゼ、ホスファターゼ、レダクターゼ、シクロオキシゲナ
ーゼ、プロテアーゼなどの酵素、例えばＳＨ２、ＳＨ３、ＰＴＢおよびＰＤＺドメインな
どのタンパク質−タンパク質相互作用に関与するドメインを含む標的、例えばアクチン、
チューブリンなどの構造タンパク質、膜受容体、例えばＩｇＥなどの免疫グロブリン、例
えばインテグリンなどの細胞接着受容体、イオンチャネル、膜貫通ポンプ、転写因子、シ
グナル伝達タンパク質などが包含される。
一部の実施形態では、活性剤または薬物が、イソシアネート試薬と反応させるためのヒ
ドロキシル基またはアミノ基を持つか、イソシアネート試薬と反応させるためのヒドロキ
シル基またはアミノ基が導入されるように、活性剤が化学修飾される。
一部の実施形態では、活性剤または薬物が、好ましくはその活性剤の望ましい生物学的
活性を喪失させずに修飾することができそして／または共有結合に関与することができる
領域を含む。薬物部分はしばしば、１以上の上記官能基で置換された環状炭素構造または
複素環構造および／または芳香族構造または多環芳香族構造を含む。ペプチド、糖類、脂
肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類、誘導体、その構造類似体または組合せを含
む生体分子、タンパク質、酵素、多糖、およびポリ核酸に見いだされる構造も、薬物部分
として興味深い。
好適な活性剤には、精神薬理剤、例えば（１）中枢神経系抑制剤、例えば全身麻酔薬（
バルビツレート類、ベンゾジアゼピン類、ステロイド類、シクロヘキサノン誘導体、およ
びその他の薬剤）、鎮静催眠薬（ベンゾジアゼピン類、バルビツレート類、ピペリジンジ
オン類およびトリオン類、キナゾリン誘導体、カルバメート、アルデヒド類および誘導体
、アミド類、非環式ウレイド類、ベンゾアゼピン類および関連薬物、フェノチアジン類な
ど）、中枢随意筋緊張調整薬（抗痙攣薬、例えばヒダントイン類、バルビツレート類、オ
キサゾリジンジオン類、スクシンイミド類、アシルウレイド類、グルタルイミド類、ベン
ゾジアゼピン類、２級および３級アルコール類、ジベンゾアゼピン誘導体、バルプロ酸お
よび誘導体、ＧＡＢＡ類似体など）、鎮痛薬（モルヒネおよび誘導体、オリパビン誘導体
、モルフィナン誘導体、フェニルピペリジン類、２，６−メタン−３−ベンザゾカイン(b
enzazocaine)誘導体、ジフェニルプロピルアミン類および同配体、サリチレート、ｐ−ア
ミノフェノール誘導体、５−ピラゾロン誘導体、アリール酢酸誘導体、フェナメートおよ
び同配体など）、および制吐薬（抗コリン作用薬、抗ヒスタミン薬、抗ドーパミン薬など
）、（２）中枢神経刺激物質、例えば興奮薬（呼吸刺激薬、痙攣刺激薬、精神運動刺激薬
）、麻薬拮抗薬（モルヒネ誘導体、オリパビン誘導体、２，６−メタン−３−ベンゾキサ
シン(benzoxacine)誘導体、モルフィナン誘導体）、向知性薬、（３）精神薬物、例えば
抗不安鎮静剤（ベンゾジアゼピン類、プロパンジオールカルバメート類）、抗精神病薬（
フェノチアジン誘導体、チオキサンチン誘導体、他の三環式化合物、ブチロフェノン誘導
体および同配体、ジフェニルブチルアミン誘導体、置換ベンズアミド類、アリールピペラ
ジン誘導体、インドール誘導体など）、抗うつ薬（三環式化合物、ＭＡＯ阻害剤など）、
（４）気道薬、例えば中枢性鎮咳薬（アヘンアルカロイドおよびそれらの誘導体）；薬力
学剤、例えば（１）末梢神経系薬、例えば局所麻酔薬（エステル誘導体、アミド誘導体）
、（２）シナプス接合部または神経効果器接合部に作用する薬物、例えばコリン作用剤、
コリン遮断剤、神経筋遮断剤、アドレナリン作用剤、抗アドレナリン作用剤、（３）平滑
筋活性薬、例えば鎮痙薬（抗コリン作用薬、向筋性鎮痙薬）、血管拡張薬、平滑筋刺激薬
、（４）ヒスタミン類および抗ヒスタミン薬、例えばヒスタミンおよびその誘導体（ベタ
ゾール）、抗ヒスタミン薬（Ｈ１アンタゴニスト、Ｈ２アンタゴニスト）、ヒスタミン代
謝薬、（５）心血管薬、例えば強心薬（植物抽出物、ブテノリド類、ペンタジエノリド類
(pentadienolids)、エリスロフレウム(erythrophleum)属由来のアルカロイド類、イオノ
フォア類、アドレノセプター刺激薬など）、抗不整脈薬、血圧降下薬、抗高脂血剤（クロ
フィブリン酸誘導体、ニコチン酸誘導体、ホルモンおよび類似体、抗生物質、サリチル酸
および誘導体）、抗静脈瘤薬、止血薬、（６）血液および造血系薬、例えば抗貧血薬、血
液凝固薬（止血剤、抗凝固剤、抗血栓剤、血栓溶解剤、血液タンパク質およびそれらの画
分）（７）消化管薬、例えば消化剤（健胃剤、利胆薬）、抗潰瘍薬、止痢剤、（８）局所
作用薬；化学療法剤、例えば（１）抗感染症剤、例えば外部寄生生物撲滅薬（塩素化炭化
水素、ピレチン類(pyrethins)、硫酸化化合物）、駆虫薬、抗原虫薬、抗マラリア薬、抗
アメーバ剤、抗リーシュマニア薬、抗トリコモナス剤、抗トリパノソーマ剤、スルホンア
ミド類、抗マイコバクテリア薬、抗ウイルス化学療法剤など、および（２）細胞分裂抑制
剤、すなわち抗新生物剤または細胞毒性薬、例えばアルキル化剤、例えば塩酸メクロルエ
タミン（ナイトロジェンマスタード、マスタージェン(Mustargen)、ＨＮ２）、シクロホ
スファミド（サイトバン(Cytovan)、エンドキサナ(Endoxana)）、イホスファミド（ＩＦ
ＥＸ）、クロラムブシル（リューケラン）、メルファラン（フェニルアラニンマスタード
、Ｌ−サルコリシン、アルケラン、Ｌ−ＰＡＭ）、ブスルファン（ミレラン）、チオテパ
（トリエチレンチオホスホルアミド）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ、ＢＣＮＵ）、ロムス
チン（ＣｅｅＮＵ、ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン（ザノサール）など；植物アルカロイ
ド、例えばビンクリスチン（オンコビン）、ビンブラスチン（ベルバン、ベルベ（Ｖｅｌ
ｂｅ））、パクリタキセル（タキソール）など；代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート
（ＭＴＸ）、メルカプトプリン（プリネトール、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−ＴＧ）
、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（サイトサール(Cytosar)−Ｕ、Ａｒａ−
Ｃ）、アザシチジン（ミロサール(Mylosar)、５−ＡＺＡ）など；抗生物質、例えばダク
チノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメゲン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン
）、ダウノルビシン（ダウノマイシン(duanomycin)、セルビジン(Cerubidine)）、イダル
ビシン（イダマイシン）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ピカマイシン(Picamycin)
（ミトラマイシン、ミトラシン(Mithracin)）、マイトマイシン（ムタマイシン(Mutamyci
n)）など、および他の抗細胞増殖剤、例えばヒドロキシ尿素（ハイドレア）、プロカルバ
ジン（ムタラン(Mutalane)）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）、シスプラチン（プ
ラチノール）、カルボプラチン（パラプラチン）、アスパラギナーゼ（エルスパール(Els
par)）、エトポシド（ベペシド(VePesid)、ＶＰ−１６−２１３）、アムサクリン(Amsarc
rine)（ＡＭＳＡ、ｍ−ＡＭＳＡ）、ミトタン（リソドレン(Lysodren)）、ミトキサント
ロン（ノバトロン(Novatrone)）などが包含されるが、これらに限定されるわけではない
。好ましい化学療法剤は、遊離型では望ましい用量で、許容できない全身毒性を示すもの
である。治療レベルのそれら薬物に伴う一般的全身毒性は、それらをＲＡＰもしくはＲＡ
Ｐポリペプチドまたは他のメガリンリガンドに連結することによって低下させることがで
きる。有用な治療剤であるが心毒性による用量制限を受ける心毒性化合物は、特に好まし
い。古典的な例はアドリアマイシン（ドキソルビシンとも呼ばれる）およびその類似体、
例えばダウノルビシンである。そのような薬物にＲＡＰもしくはＲＡＰポリペプチドまた
は他のメガリンリガンドもしくはそのようなリガンドのメガリン結合性断片を連結するこ
とにより、活性剤の心臓における蓄積およびそれに伴う心毒性を防止することができる。
好適な活性剤には、抗生物質、例えばアミノグリコシド類、例えばアミカシン、アプラ
マイシン、アルベカシン、バンベルマイシン類(bambermycins)、ブチロシン、ジベカシン
、ジヒドロストレプトマイシン、ホルチマイシン(fortimicin)、ゲンタマイシン、イセパ
マイシン、カナマイシン、ミクロノムシン(micronomcin)、ネオマイシン、ネチルマイシ
ン、パロマイシン(paromycin)、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン
、ストレプトマイシン、トブラマイシン、トロスペクトマイシン(trospectomycin)；アム
フェニコール類、例えばアジダムフェニコール(azidamfenicol)、クロラムフェニコール
、フロルフェニコール、およびテイマフェニコール(theimaphenicol)；アンサマイシン類
、例えばリファミド(rifamide)、リファンピン、リファマイシン、リファペンチン、リフ
ァキシミン；ベータ−ラクタム類、例えばカルバセフェム類、カルバペネム類、セファロ
スポリン類、セファマイシン(cehpamycin)類、モノバクタム類、オキサフェム(oxaphem)
類、ペニシリン類；リンコサミド類、例えばクリナマイシン(clinamycin)、リンコマイシ
ン；マクロライド類、例えばクラリスロマイシン、ジルスロマイシン(dirthromycin)、エ
リスロマイシンなど；ポリペプチド類、例えばアンホマイシン、バシトラシン、カプレオ
マイシンなど；テトラサイクリン類、例えばアピサイクリン(apicycline)、クロルテトラ
サイクリン、クロモサイクリン(clomocycline)など；合成抗細菌剤、例えば２，４−ジア
ミノピリミジン類、ニトロフラン類、キノロン類およびそれらの類似体、スルホンアミド
類、スルホン類などが包含されるが、これらに限定されるわけではない。
好適な活性剤には、抗真菌剤、例えばポリエン類、例えばアンホテリシンＢ、カンジシ
ジン、デルモスタチン(dermostatin)、フィリピン、フンギクロミン、ハチマイシン、ハ
マイシン(hamycin)、ルセンソマイシン、メパルトリシン、ナタマイシン、ニスタチン、
ペシロシン(pecilocin)、ペリマイシン(perimycin)；合成抗真菌剤、例えばアリルアミン
類、例えばブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン；イミダゾール類、例えばビホ
ナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン、クロルミダゾールなど、チオカルバメー
ト類、例えばトルシクレート、トリアゾール類、例えばフルコナゾール、イトラコナゾー
ル、テルコナゾールなどが包含されるが、これらに限定されるわけではない。
好適な活性剤には、駆虫薬、例えばアレコリン、アスピジン、アスピジノール、ジクロ
ロフェン、エンベリン、コシン(kosin)、ナフタレン(napthalene)、ニクロスアミド、ペ
レチエリン、キナクリン、アラントラクトン、アモカルジン、アモスカネート、アスカリ
ドール、ベフェニウム、ビトスカネート、四塩化炭素、カルバクロール、シクロベンダゾ
ール、ジエチルカルバマジンなどが包含されるが、これらに限定されるわけではない。
好適な活性剤には、抗マラリア薬、例えばアセダプソン、アモジアキン、アルテエーテ
ル(areteether)、アルテンエーテル(artemether)、アルテミシニン、アルテスネート、ア
トバクオン、ベベリン、ベルベリン、チラタ(chirata)、クロルグアニド、クロロキン、
クロルプログアニル、キナ皮、シンコニジン、シンコニン、シクログアニル、ゲンチオピ
クリン、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、塩酸メフロキン、３−メチルアルサ
セチン、パマキン、プラスモシド(plasmocid)、プリマキン、プリメタミン、キナクリン
、キニジン、キニン、キノシド、キノリン、ヒ酸水素二ナトリウムなどが包含されるが、
これらに限定されるわけではない。
好適な活性剤には、抗原虫薬、例えばアクラニル(acranil)、チニダゾール、イプロニ
ダゾール、エチルスチバミン、ペンタミジン、アセタルゾン、アミニトロゾール、アニソ
マイシン、ニフラテル、チニダゾール、ベンジダゾール(benzidazole)、スラミンなどが
包含されるが、これらに限定されるわけではない。
活性剤としての使用に好適な薬物は「Goodman and Gilman's,The Pharmacological Bas
is of Therapeutics(9th Ed)」(Goodman et al.eds)(McGraw-Hill)(1996)および「1999 P
hysician’s Desk Reference」(1998)にも列挙されている。
好適な活性剤には、米国特許第5,880,161号、第5,877,206号、第5,786,344号、第5,760
,041号、第5,753,668号、第5,698,529号、第5,684,004号、第5,665,715号、第5,654,484
号、第5,624,924号、第5,618,813号、第5,610,292号、第5,597,831号、第5,530,026号、
第5,525,633号、第5,525,606号、第5,512,678号、第5,508,277号、第5,463,181号、第5,4
09,893号、第5,358,952号、第5,318,965号、第5,223,503号、第5,214,068号、第5,196,42
4号、第5,109,024号、第5,106,996号、第5,101,072号、第5,077,404号、第5,071,848号、
第5,066,493号、第5,019,390号、第4,996,229号、第4,996,206号、第4,970,318号、第4,9
68,800号、第4,962,114号、第4,927,828号、第4,892,887号、第4,889,859号、第4,886,79
0号、第4,882,334号、第4,882,333号、第4,871,746号、第4,863,955号、第4,849,563号、
第4,845,216号、第4,833,145号、第4,824,955号、第4,785,085号、第4,684,747号、第4,6
18,685号、第4,611,066号、第4,550,187号、第4,550,186号、第4,544,501号、第4,541,95
6号、第4,532,327号、第4,490,540号、第4,399,283号、第4,391,982号、第4,383,994号、
第4,294,763号、第4,283,394号、第4,246,411号、第4,214,089号、第4,150,231号、第4,1
47,798号、第4,056,673号、第4,029,661号、第4,012,448号に開示されている抗新生物剤
；
米国特許第5,192,799号、第5,036,070号、第4,778,800号、第4,753,951号、第4,590,18
0号、第4,690,930号、第4,645,773号、第4,427,694号、第4,424,202号、第4,440,781号、
第5,686,482号、第5,478,828号、第5,461,062号、第5,387,593号、第5,387,586号、第5,2
56,664号、第5,192,799号、第5,120,733号、第5,036,070号、第4,977,167号、第4,904,66
3号、第4,788,188号、第4,778,800号、第4,753,951号、第4,690,930号、第4,645,773号、
第4,631,285号、第4,617,314号、第4,613,600号、第4,590,180号、第4,560,684号、第4,5
48,938号、第4,529,727号、第4,459,306号、第4,443,451号、第4,440,781号、第4,427,69
4号、第4,424,202号、第4,397,853号、第4,358,451号、第4,324,787号、第4,314,081号、
第4,313,896号、第4,294,828号、第4,277,476号、第4,267,328号、第4,264,499号、第4,2
31,930号、第4,194,009号、第4,188,388号、第4,148,796号、第4,128,717号、第4,062,85
8号、第4,031,226号、第4,020,072号、第4,018,895号、第4,018,779号、第4,013,672号、
第3,994,898号、第3,968,125号、第3,939,152号、第3,928,356号、第3,880,834号、第3,6
68,210号に開示されている精神薬理／向精神剤；
米国特許第4,966,967号、第5,661,129号、第5,552,411号、第5,332,737号、第5,389,67
5号、第5,198,449号、第5,079,247号、第4,966,967号、第4,874,760号、第4,954,526号、
第5,051,423号、第4,888,335号、第4,853,391号、第4,906,634号、第4,775,757号、第4,7
27,072号、第4,542,160号、第4,522,949号、第4,524,151号、第4,525,479号、第4,474,80
4号、第4,520,026号、第4,520,026号、第5,869,478号、第5,859,239号、第5,837,702号、
第5,807,889号、第5,731,322号、第5,726,171号、第5,723,457号、第5,705,523号、第5,6
96,111号、第5,691,332号、第5,679,672号、第5,661,129号、第5,654,294号、第5,646,27
6号、第5,637,586号、第5,631,251号、第5,612,370号、第5,612,323号、第5,574,037号、
第5,563,170号、第5,552,411号、第5,552,397号、第5,547,966号、第5,482,925号、第5,4
57,118号、第5,414,017号、第5,414,013号、第5,401,758号、第5,393,771号、第5,362,90
2号、第5,332,737号、第5,310,731号、第5,260,444号、第5,223,516号、第5,217,958号、
第5,208,245号、第5,202,330号、第5,198,449号、第5,189,036号、第5,185,362号、第5,1
40,031号、第5,128,349号、第5,116,861号、第5,079,247号、第5,070,099号、第5,061,81
3号、第5,055,466号、第5,051,423号、第5,036,065号、第5,026,712号、第5,011,931号、
第5,006,542号、第4,981,843号、第4,977,144号、第4,971,984号、第4,966,967号、第4,9
59,383号、第4,954,526号、第4,952,692号、第4,939,137号、第4,906,634号、第4,889,86
6号、第4,888,335号、第4,883,872号、第4,883,811号、第4,847,379号、第4,835,157号、
第4,824,831号、第4,780,538号、第4,775,757号、第4,774,239号、第4,771,047号、第4,7
69,371号、第4,767,756号、第4,762,837号、第4,753,946号、第4,752,616号、第4,749,71
5号、第4,738,978号、第4,735,962号、第4,734,426号、第4,734,425号、第4,734,424号、
第4,730,052号、第4,727,072号、第4,721,796号、第4,707,550号、第4,704,382号、第4,7
03,120号、第4,681,970号、第4,681,882号、第4,670,560号、第4,670,453号、第4,668,78
7号、第4,663,337号、第4,663,336号、第4,661,506号、第4,656,267号、第4,656,185号、
第4,654,357号、第4,654,356号、第4,654,355号、第4,654,335号、第4,652,578号、第4,6
52,576号、第4,650,874号、第4,650,797号、第4,649,139号、第4,647,585号、第4,647,57
3号、第4,647,565号、第4,647,561号、第4,645,836号、第4,639,461号、第4,638,012号、
第4,638,011号、第4,632,931号、第4,631,283号、第4,628,095号、第4,626,548号、第4,6
14,825号、第4,611,007号、第4,611,006号、第4,611,005号、第4,609,671号、第4,608,38
6号、第4,607,049号、第4,607,048号、第4,595,692号、第4,593,042号、第4,593,029号、
第4,591,603号、第4,588,743号、第4,588,742号、第4,588,741号、第4,582,854号、第4,5
75,512号、第4,568,762号、第4,560,698号、第4,556,739号、第4,556,675号、第4,555,57
1号、第4,555,570号、第4,555,523号、第4,550,120号、第4,542,160号、第4,542,157号、
第4,542,156号、第4,542,155号、第4,542,151号、第4,537,981号、第4,537,904号、第4,5
36,514号、第4,536,513号、第4,533,673号、第4,526,901号、第4,526,900号、第4,525,47
9号、第4,524,151号、第4,522,949号、第4,521,539号、第4,520,026号、第4,517,188号、
第4,482,562号、第4,474,804号、第4,474,803号、第4,472,411号、第4,466,979号、第4,4
63,015号、第4,456,617号、第4,456,616号、第4,456,615号、第4,418,076号、第4,416,89
6号、第4,252,815号、第4,220,594号、第4,190,587号、第4,177,280号、第4,164,586号、
第4,151,297号、第4,145,443号、第4,143,054号、第4,123,550号、第4,083,968号、第4,0
76,834号、第4,064,259号、第4,064,258号、第4,064,257号、第4,058,620号、第4,001,42
1号、第3,993,639号、第3,991,057号、第3,982,010号、第3,980,652号、第3,968,117号、
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開示されている心血管剤；
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物剤；
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81,879号、第4,670,541号、第4,667,039号、第4,658,037号、第4,634,708号、第4,623,64
8号、第4,622,326号、第4,608,374号、第4,595,686号、第4,594,188号、第4,569,942号、
第4,556,672号、第4,552,866号、第4,539,312号、第4,536,512号、第4,533,671号、第4,5
11,724号、第4,440,779号、第4,434,175号、第4,400,534号、第4,395,402号、第4,391,82
7号、第4,374,139号、第4,361,583号、第4,322,420号、第4,306,097号、第4,252,816号、
第4,251,530号、第4,244,955号、第4,232,018号、第4,209,520号、第4,164,514号、第4,1
47,872号、第4,133,819号、第4,124,713号、第4,117,012号、第4,064,272号、第4,022,83
6号、第3,966,944号に開示されている鎮痛薬；
米国特許第5,219,872号、第5,219,873号、第5,073,560号、第5,073,560号、第5,346,91
1号、第5,424,301号、第5,073,560号、第5,219,872号、第4,900,748号、第4,786,648号、
第4,798,841号、第4,782,071号、第4,710,508号、第5,482,938号、第5,464,842号、第5,3
78,723号、第5,346,911号、第5,318,978号、第5,219,873号、第5,219,872号、第5,084,28
1号、第5,073,560号、第5,002,955号、第4,988,710号、第4,900,748号、第4,798,841号、
第4,786,648号、第4,782,071号、第4,745,123号、第4,710,508号に開示されているコリン
作用剤；
米国特許第5,091,528号、第5,091,528号、第4,835,157号、第5,708,015号、第5,594,02
7号、第5,580,892号、第5,576,332号、第5,510,376号、第5,482,961号、第5,334,601号、
第5,202,347号、第5,135,926号、第5,116,867号、第5,091,528号、第5,017,618号、第4,8
35,157号、第4,829,086号、第4,579,867号、第4,568,679号、第4,469,690号、第4,395,55
9号、第4,381,309号、第4,363,808号、第4,343,800号、第4,329,289号、第4,314,943号、
第4,311,708号、第4,304,721号、第4,296,117号、第4,285,873号、第4,281,189号、第4,2
78,608号、第4,247,710号、第4,145,550号、第4,145,425号、第4,139,535号、第4,082,84
3号、第4,011,321号、第4,001,421号、第3,982,010号、第3,940,407号、第3,852,468号、
第3,832,470号に開示されているアドレナリン作用剤；
米国特許第5,874,479号、第5,863,938号、第5,856,364号、第5,770,612号、第5,702,68
8号、第5,674,912号、第5,663,208号、第5,658,957号、第5,652,274号、第5,648,380号、
第5,646,190号、第5,641,814号、第5,633,285号、第5,614,561号、第5,602,183号、第4,9
23,892号、第4,782,058号、第4,393,210号、第4,180,583号、第3,965,257号、第3,946,02
2号、第3,931,197号に開示されている抗ヒスタミン剤；
米国特許第5,863,538号、第5,855,907号、第5,855,866号、第5,780,592号、第5,776,42
7号、第5,651,987号、第5,346,887号、第5,256,408号、第5,252,319号、第5,209,926号、
第4,996,335号、第4,927,807号、第4,910,192号、第4,710,495号、第4,049,805号、第4,0
04,005号、第3,670,079号、第3,608,076号、第5,892,028号、第5,888,995号、第5,883,08
7号、第5,880,115号、第5,869,475号、第5,866,558号、第5,861,390号、第5,861,388号、
第5,854,235号、第5,837,698号、第5,834,452号、第5,830,886号、第5,792,758号、第5,7
92,757号、第5,763,361号、第5,744,462号、第5,741,787号、第5,741,786号、第5,733,89
9号、第5,731,345号、第5,723,638号、第5,721,226号、第5,712,264号、第5,712,263号、
第5,710,144号、第5,707,984号、第5,705,494号、第5,700,793号、第5,698,720号、第5,6
98,545号、第5,696,106号、第5,677,293号、第5,674,861号、第5,661,141号、第5,656,62
1号、第5,646,136号、第5,637,691号、第5,616,574号、第5,614,514号、第5,604,215号、
第5,604,213号、第5,599,807号、第5,585,482号、第5,565,588号、第5,563,259号、第5,5
63,131号、第5,561,124号、第5,556,845号、第5,547,949号、第5,536,714号、第5,527,80
6号、第5,506,354号、第5,506,221号、第5,494,907号、第5,491,136号、第5,478,956号、
第5,426,179号、第5,422,262号、第5,391,776号、第5,382,661号、第5,380,841号、第5,3
80,840号、第5,380,839号、第5,373,095号、第5,371,078号、第5,352,809号、第5,344,82
7号、第5,344,826号、第5,338,837号、第5,336,686号、第5,292,906号、第5,292,878号、
第5,281,587号、第5,272,140号、第5,244,886号、第5,236,912号、第5,232,915号、第5,2
19,879号、第5,218,109号、第5,215,972号、第5,212,166号、第5,206,415号、第5,194,60
2号、第5,166,201号、第5,166,055号、第5,126,488号、第5,116,829号、第5,108,996号、
第5,099,037号、第5,096,892号、第5,093,502号、第5,086,047号、第5,084,450号、第5,0
82,835号、第5,081,114号、第5,053,404号、第5,041,433号、第5,041,432号、第5,034,54
8号、第5,032,586号、第5,026,882号、第4,996,335号、第4,975,537号、第4,970,205号、
第4,954,446号、第4,950,428号、第4,946,834号、第4,937,237号、第4,921,846号、第4,9
20,099号、第4,910,226号、第4,900,725号、第4,892,867号、第4,888,336号、第4,885,28
0号、第4,882,322号、第4,882,319号、第4,882,315号、第4,874,855号、第4,868,167号、
第4,865,767号、第4,861,875号、第4,861,765号、第4,861,763号、第4,847,014号、第4,7
74,236号、第4,753,932号、第4,711,856号、第4,710,495号、第4,701,450号、第4,701,44
9号、第4,689,410号、第4,680,290号、第4,670,551号、第4,664,850号、第4,659,516号、
第4,647,410号、第4,634,695号、第4,634,693号、第4,588,530号、第4,567,000号、第4,5
60,557号、第4,558,041号、第4,552,871号、第4,552,868号、第4,541,956号、第4,519,94
6号、第4,515,787号、第4,512,986号、第4,502,989号、第4,495,102号に開示されている
ステロイド剤が包含されるが、これらに限定されるわけではない（上記特許文献の開示内
容は全て参照により本明細書に組み入れられる）。
コンジュゲートの薬物部分は薬物全体であるか、あるいはベクタータンパク質リガンド
またはリンカーに共有結合するための連結部位を持つと共に関心対象の標的に対する親和
性および特異性を保持しているその結合性断片または結合部分であることができる。その
ような薬物のコンジュゲートは、その薬物自体と同じ障害、疾患および適応に使用するこ
とができる。
〔Ｃ．好ましい癌化学療法活性剤〕
本発明のメガリンリガンドに基づくコンジュゲートにおける使用に好ましい癌化学療法
剤には、脳腫瘍または脳内もしくは脳周辺の他の新形成の処置に、遊離型として役立ちう
る、またはそのような腫瘍に遊離型で有用でないなら、メガリンリガンドもしくはそのメ
ガリン結合性断片に連結した場合に役立ちうる、あらゆる薬物が包含される。そのような
化学療法剤は、好ましくは、例えばアドリアマイシン（ドキソルビシンとも呼ばれる）、
シスプラチン、パクリタキセル、その類似体を含む細胞毒性化学療法剤、ならびにエクス
ビボおよびインビボで腫瘍に対して活性を示す他の化学療法剤である。そのような化学療
法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗物質、天然物（ビンカアルカロイド類、エピドフィロ
トキシン(epidophyllotoxin)類、抗生物質、酵素および生物学的応答調整剤）、トポイソ
メラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、紡錘体毒、ホルモンおよびアンタゴニスト、ならびにそ
の他の薬剤、例えば白金配位錯体、アントラセンジオン類、置換尿素類なども包含される
。当業者には他の化学療法剤もわかるだろう。
好ましい化学療法剤は、遊離型では望ましい用量で、許容できない全身毒性を示すもの
である。治療レベルのそれら薬物に伴う一般的全身毒性は、それらをメガリンリガンドま
たはメガリンリガンドのメガリン結合性断片に連結することによって低下する。有用な治
療剤であるが心毒性による用量制限を受ける心毒性化合物は、特に好ましい。古典的な例
はアドリアマイシン（ドキソルビシンとも呼ばれる）およびその類似体、例えばダウノル
ビシンである。そのような薬物にメガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片を連結
すると、心臓における蓄積およびそれに伴う心毒性が低下する。
［ＶＩＩ．コンジュゲートの製造方法］
本発明は概して、活性剤に連結されたメガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片
を含む方法および組成物を提供する。
一般に、メガリンリガンド−活性剤コンジュゲートは、当分野で知られる技術を使って
製造することができる。化合物をタンパク質にコンジュゲートまたは化学架橋するための
アプローチは数多くあり、当業者は、コンジュゲートすべき活性剤にどの方法が適してい
るかを決定することができる。使用する方法は、メガリンリガンド／断片のメガリン結合
能を損なわずに、また好ましくは、化合物が送達されたらその化合物の望ましい活性を変
化させずに、活性剤をメガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片に接合することが
できなければならない。リガンドを種々の化合物にコンジュゲートする好ましい方法につ
いては実施例の項で後述する。ＲＡＰなどのメガリンリガンドに複雑な分子を連結する場
合、ＳＡＴＡ／スルホ−ＳＭＣＣ架橋反応(Pierce,イリノイ州ロックフォード)は特に好
ましい。メガリンリガンドに金属を連結する場合、好ましい反応には、例えばクロラミン
Ｔ法によるチロシン残基への結合や、ヨードビーズ(Pierce)を使ったヨウ素化反応などが
あるが、これらに限定されるわけではない。
メガリンリガンドを上述の代表的なラベルとコンジュゲートする方法は、当業者であれ
ば容易に達成することができる(「Trichothecene Antibody Conjugate(トリコセシン抗体
コンジュゲート)」米国特許第4,744,981号;「Antibody Conjugate(抗体コンシ゛ュゲート
)」米国特許第5,106,951号;「Fluorogenic Materials and Labeling Techniques(蛍光原
材料および標識技術)」米国特許第4,018,884号;「Metal Radionuclide Labeled Proteins
for Diagnosis and Therapy(診断および治療用金属放射性核種標識タンパク質)」米国特
許第4,897,255号;および「Metal Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chel
ation Kinetics(キレート速度を改善するための金属放射性核種キレート化合物)」米国特
許第4,988,496号参照;また、Inman,Methods In Enzymology,Vol.34「Affinity Technique
s,Enzyme Purification:Part B(アフィニティー技術、酵素精製:パートB)」Jakobyおよび
Wichek編,Academic Press,ニューヨーク,30頁,1974も参照されたい;さらに、Wilchekお
よびBayer「The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications(生体分析用途
におけるアビジン−ビオチン複合体)」Anal.Biochem.171:1-32,1988も参照されたい;これ
らは全て参照によりあらゆる目的でそのまま本明細書に組み入れられる)。
活性剤がタンパク質またはペプチドである場合、活性剤をメガリンリガンドまたはその
メガリン結合性断片とコンジュゲートするために利用することができる架橋剤は数多くあ
る。(例えば「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」1991,Shans Wong,
CRC Press,アナーバーを参照されたい)。架橋剤は一般に、治療化合物上の利用可能な反
応性官能基または治療化合物上に挿入された反応性官能基に基づいて選択される。また、
反応性基がない場合は、光活性化可能な架橋剤を使用することもできる。場合によっては
、メガリンリガンドと活性剤との間にスペーサーを含めることが望ましいこともある。一
例として、メガリンリガンド上にスルフヒドリル基を導入し、タンパク質化合物上にカル
ボキシル基を介して反応性チオール基を含有する架橋剤を導入することによって、メガリ
ンリガンドとタンパク質治療化合物とをコンジュゲートすることができる(例えばC.W.Vog
el編「Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer
」(Oxford University Press,1987)の28-55頁(著者WawizynczakおよびThorpe)ならびにBl
airおよびGhose,J.Immunol.Methods 59:129,1983参照)。
リガンド−化学療法剤は、メガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片に連結され
た１以上の化合物部分を含むことができる。例えばコンジュゲーション反応は、単一のメ
ガリンリガンド分子に対して１〜１０分子以上のアドリアマイシンをコンジュゲートしう
る。数個の金原子またはヨウ素原子を単一のメガリンリガンドまたはそのメガリン結合性
断片にコンジュゲートすることができる。これらの製剤は混合物として使用するか、特定
のメガリンリガンド−活性化合物化学量論製剤に精製することができる。当業者は、どの
形式およびどの化学量論比が好ましいかを決定することができる。さらに、実施例に記載
するＲＡＰ−アドリアマイシン−シスプラチナム組成物のように、活性化合物の混合物を
メガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片に連結することもできる。これらのメガ
リンリガンド−活性剤コンジュゲートは、ある範囲のリガンド対活性剤化学量論比（例え
ば１：１〜１：４、１：５〜１：１０、または１：１０〜１：２０のＲＡＰ：活性剤比）
からなりうる。任意選択的に、複数の異なる活性剤（例えば２、３、または４個のそれら
薬剤）を、それぞれの化学量論比で、メガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片対
それら追加活性剤の合計比が活性剤２０個あたり１個のメガリンリガンドまたはそのメガ
リン結合性断片より少なくならないように、メガリンリガンドまたはそのメガリン結合性
断片にそれぞれコンジュゲートすることもできる。これらもまた、精製された混合物に分
離するか、集合体として使用することができる。
リンカーは、好ましくは、アルキル、アリールおよび／またはアミノ酸主鎖を含有する
ように構築された有機部分であって、アミド、エーテル、エステル、ヒドラゾン、ジスル
フィド結合またはそれらの任意の組合せを含有するだろう。アミノ酸、エーテルおよびア
ミド結合した成分を含有する結合は、生理的ｐＨ条件（通常、血清中では７．４であり、
細胞（エンドソーム）内に取り込まれると４〜５である）では安定であるだろう。好まし
い結合は、血清ｐＨでは安定であるが細胞内ｐＨにばく露されると加水分解して薬物を遊
離させるエステル含有結合またはヒドラゾン含有結合である。ジスルフィド結合は還元的
切断に対して感受性を持つので好ましい。アミノ酸リンカーは望ましい標的器官における
特異的酵素による切断に対して感受性を持つように設計することができる。例示的なリン
カーはBlattler et al.,Biochem.24:1517-1524,1985、King et al.,Biochem.25:5774-577
9,1986、SrinivasacharおよびNevill,Biochem.28:2501-2509,1989に記載されている。
薬物−リンカー中間体は上述したものに似ているが、メガリンリガンドまたはそのメガ
リン結合性断片上の遊離アミノ基と反応するための活性エステルを持つか、当業者がメガ
リンリガンドまたはそのメガリン結合性断片に他の基を取り付けることができる場合には
それら他の基によってメガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片上に生じさせた遊
離チオールと反応するためのマレイミドを持つ。
タンパク質およびペプチドを架橋する方法は当業者によく知られている。関心対象の化
合物を、例えばメガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片などのポリペプチドとコ
ンジュゲートするか、そのようなリガンドを結合する物質とコンジュゲートするには、何
百もの架橋剤を利用することができる(例えば、参照によりそのまま本明細書に組み入れ
られる「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」Shans Wong,CRC Press,
アナーバー(1991)ならびに米国特許第5,981,194号およびPCT特許公開番号WO02/13843およ
びWO01/59459を参照されたい)。活性剤とメガリンリガンド、例えばＲＡＰ分子とのコン
ジュゲートを製造するために、多くの試薬および架橋剤を使用することができる(例えばH
ermansonら「Bioconjugate Techniques」Academic Press(1996))。架橋剤は一般に、治療
化合物上の利用可能な反応性官能基または治療化合物上に挿入された反応性官能基に基づ
いて選択される。また、反応性基がない場合は、光活性化可能な架橋剤を使用することも
できる。場合によっては、メガリンリガンドと活性剤との間にスペーサーを含めることが
望ましいこともある。一例として、メガリンリガンド上にスルフヒドリル基を導入し、タ
ンパク質化合物上にカルボキシル基を介して反応性チオール基を含有する架橋剤を導入す
ることによって、メガリンリガンドとタンパク質治療化合物とをコンジュゲートすること
ができる(例えばC.W.Vogel編「Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimaging
and Therapy of Cancer」(Oxford University Press,1987)の28-55頁(著者Wawizynczak
およびThorpe)ならびにBlairおよびGhose,J.Immunol.Methods 59:129,1983参照)。一部の
実施形態では、薬剤がリンカーから解放されるように、リンカーがリソソームの酸性ｐＨ
での加水分解を受けやすい。
リンカーを使用する場合、リンカーは、好ましくは、アルキル、アリールおよび／また
はアミノ酸主鎖を含有するように構築された有機部分であって、アミド、エーテル、エス
テル、ヒドラゾン、ジスルフィド結合またはそれらの任意の組合せを含有するだろう。ア
ミノ酸、エーテルおよびアミド結合した成分を含有する結合は、生理的ｐＨ条件（通常、
血清中では７．４）では安定である。好ましい結合は、血清ｐＨでは安定であるがリソソ
ームｐＨにばく露されると加水分解して薬物を遊離させるエステル含有結合またはヒドラ
ゾン含有結合である。ジスルフィド結合は還元的切断に対して感受性を持つので好ましい
。また、アミノ酸リンカーは、望ましい標的器官（より好ましくはリソソームそのもの）
における特異的酵素による切断に対して感受性を持つように設計することができる。例示
的なリンカーはBlattlerら(1985)Biochem.24:1517-1524、Kingら(1986)Biochem.25:5774-
5779、SrinivasacharおよびNevill(1989)Biochem.28:2501-2509に記載されている。
一部の実施形態では、リンカーがポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコ
ールである。別の実施形態では、リンカーが４〜２０原子長である。別の実施形態では、
リンカーが１〜３０原子長であり、Ｏ、ＮまたはＳからなる群より独立して選択されるヘ
テロ原子で置換されていてもよい炭素鎖原子を持つ。一部の実施形態では、１〜４個のＣ
原子またはＣ原子の３分の１までが、Ｏ、Ｎ、Ｓから独立して選択されるヘテロ原子で置
換される。別の実施形態では、リンカーが、リソソーム環境に送達されると加水分解を受
ける部分（例えばリソソームｐＨで加水分解を受けやすいか、リソソーム酵素に接触した
場合に加水分解を受けやすい部分）を含有する。一部の実施形態では、体液へのコンジュ
ゲートの溶解度が高まるように、リンカー基が好ましくは親水性である。一部の実施形態
では、リンカーが、他のリソソーム酵素（例えば標的リソソームにおいて欠乏していない
酵素またはメガリンリガンド担体にコンジュゲートされていないリソソーム酵素）による
攻撃の対象となる官能基を含有するか、またはそのような官能基によってメガリンリガン
ド分子もしくはタンパク質薬剤に取り付けられる。一部の実施形態では、アミノ酸もしく
はペプチド、脂質、または糖残基を含むリンカーによって、メガリンリガンドと薬剤とが
接合される。一部の実施形態では、合成的に導入された基または翻訳後修飾によって導入
された基で、メガリンリガンドと薬剤とが接合される。
一部の実施形態では、薬剤−リンカー中間体は既に記載したものに似ているが、例えば
、メガリンリガンド上の遊離アミノ基と反応することができる活性エステル、またはＳＡ
ＴＡ反応もしくは活性剤を取り付けることができる他の基を介してメガリンリガンド上に
生じさせた遊離チオールと反応することができるマレイミドなどを含む。
〔Ａ．メガリンリガンドポリペプチドをタンパク質または酵素にコンジュゲートする方法
〕
活性剤をタンパク質またはペプチドにコンジュゲートする方法は、当業者にはわかるだ
ろう。例えば米国特許第5,981,194号を参照されたい。活性剤と生体ポリマーとのバイオ
コンジュゲートの製造には、多くの試薬および架橋剤を使用することができる。例えばHe
rmanson et al.,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996)を参照されたい。
本発明の一部の実施形態では、メガリンリガンドおよび活性剤がどちらもポリペプチド
であり、メガリンリガンド−活性剤コンジュゲートは融合タンパク質である。融合タンパ
ク質は当分野で知られる標準的技術を使って製造することができる。通例、メガリンリガ
ンドまたはその一部をコードするＤＮＡ分子が、タンパク質化合物をコードするＤＮＡ分
子に連結される。そのキメラＤＮＡコンストラクトを発現ベクター中にクローニングし、
適切な宿主中で発現させることができる。その結果得られる融合タンパク質は、選択した
タンパク質化合物に融合したメガリンリガンドまたはその一部を含有する。特にメガリン
リガンド−ＬＳＤ酵素タンパク質が考えられ、そのようなコンジュゲートの典型例として
は、実施例ＶＩＩならびに図３および４に記載のＲＡＰ−ヒトアルファグルコシダーゼお
よびＲＡＰ−イズロニダーゼコンジュゲート／融合タンパク質が挙げられる。これらの融
合タンパク質は、当分野で知られる標準的技術を使って製造された。
本発明のキメラタンパク質は、キメラタンパク質全体をコードする単一の核酸を発現さ
せる宿主細胞を使って、またはそれぞれがキメラタンパク質のドメインと、任意選択的に
それらのドメインを連結する役割を果たす１以上のアミノ酸とをコードする２以上の核酸
配列を発現させる宿主細胞を使って、製造することができる。キメラタンパク質は化学合
成によって製造することもできる。
（宿主細胞）
キメラタンパク質を製造するために使用される宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、非哺乳
類脊椎動物、または哺乳類細胞であり、哺乳類細胞には、例えばハムスター、サル、チン
パンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヒト細胞が
包含されるが、これらに限定されるわけではない。宿主細胞は不死化細胞（細胞株）また
は非不死化（初代または二次）細胞であることができ、多種多様な細胞タイプ、例えば線
維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（
例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、すなわちＣＨＯ細胞）、内皮細胞、膠細胞、神
経細胞、血液の固形成分（例えばリンパ球、骨髄細胞）、筋細胞、肝細胞およびこれら体
細胞タイプの前駆体のいずれであってもよい。宿主細胞には、ＬＲＰを発現しないＣＨＯ
細胞の突然変異体、例えばＣＨＯ１３−５−１などを含めることができる(FitzGerald et
al.,J.Biol.Chem.,129(6):1533-41,1995)。
キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有し発現させる細胞を、本明細
書では遺伝子改変細胞という。キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有
し発現させる哺乳類細胞を、遺伝子改変哺乳類細胞という。細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡ
の導入は、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジ
ェクタイルボンバードメント、リン酸カルシウム沈殿法、改変リン酸カルシウム沈殿法、
陽イオン脂質処理、フォトポレーション、融合法、受容体媒介導入法、またはポリブレン
沈殿法などの既知のトランスフェクション法によって行なわれる。あるいは、ウイルスベ
クターへの感染によってＤＮＡまたはＲＮＡを導入することもできる。キメラタンパク質
をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを発現させる細胞（哺乳類細胞を含む）を作製する方法
は、Richard F Selden、Douglas A.TrecoおよびMichael W.Heartleinによる「In Vivo Pr
otein Production and Delivery System for Gene Therapy(遺伝子治療のためのインビボ
タンパク質産生および送達システム)」と題する同時係属中の米国特許出願第08/334,797
号(1994年11月4日出願)、Richard F Selden、Douglas A.TrecoおよびMichael W.Heartlei
nによる「In Vivo Production and Delivery of Erythropoietin or Insulinotropin for
Gene Therapy(遺伝子治療のためのエリスロポエチンまたはインスリノトロピンのインビ
ボ産生および送達)」と題する米国特許出願第08/334,455号(1994年11月4日出願)、ならび
にDouglas A.Treco、Michael W.HeartleinおよびRichard F Seldenによる「Targeted Int
roduction of DNA Into Primary or Secondary Cells and Their Use for Gene Therapy(
初代細胞または二次細胞へのDNAの標的導入および遺伝子治療へのそれらの使用)」と題す
る米国特許出願第08/231,439号(1994年4月20日出願)に記載されている。これらの出願の
それぞれが教示する内容は特に、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
（核酸コンストラクト）
キメラタンパク質を発現させるために用いられる核酸コンストラクトは、トランスフェ
クトされた哺乳類細胞において染色体外で（エピソームとして）発現されるものであるか
、受容細胞のゲノム中にランダムに、または前もって選択された標的部位に相同組換えに
よって、組み込まれるものであることができる。染色体外で発現されるコンストラクトは
、キメラタンパク質コード配列の他に、細胞内でのタンパク質の発現に十分な配列と、任
意選択的に、そのコンストラクトの複製に十分な配列とを含む。通例、これは、プロモー
ター、キメラタンパク質コードＤＮＡおよびポリアデニル化部位を含む。キメラタンパク
質をコードするＤＮＡは、その発現がプロモーターの制御を受けるような形で、コンスト
ラクト中に配置される。任意選択的に、コンストラクトは追加成分、例えば以下の成分の
１以上を含有してもよい：スプライス部位、エンハンサー配列、適当なプロモーターの制
御を受ける選択可能マーカー、および適当なプロモーターの制御を受ける増幅可能マーカ
ー遺伝子。
ＤＮＡコンストラクトが細胞のゲノムに組み込まれる実施形態では、コンストラクトが
含む必要があるのは、キメラタンパク質コード核酸配列だけである。任意選択的に、コン
ストラクトはプロモーターおよびエンハンサー配列、１以上のポリアデニル化部位、１以
上のスプライス部位、１以上の選択可能マーカーをコードする核酸配列、増幅可能マーカ
ーをコードする核酸核酸および／またはＤＮＡの組み込みをゲノム内の選択した部位にタ
ーゲティングするための、受容細胞中のゲノムＤＮＡと相同なＤＮＡ（ターゲティングＤ
ＮＡまたはＤＮＡ配列）を含むこともできる。
（細胞培養法）
キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する哺乳類細胞は、細胞の成
長および当該ＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適した条件下で培養される。キメラタンパク質
を発現させる細胞は既知の方法および本明細書に記載されている方法を使って同定するこ
とができ、キメラタンパク質産生の増幅を行なって、または行なわずに、既知の方法およ
び同様に本明細書に記載されている方法を使ってキメラタンパク質を単離し精製すること
ができる。同定は、例えば、キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を
示唆する表現型を示す遺伝子改変哺乳類細胞をスクリーニングすることによって、例えば
ＰＣＲスクリーニング、サザンブロット解析によるスクリーニング、またはキメラタンパ
ク質の発現に関するスクリーニングなどによって、実行することができる。キメラタンパ
ク質コードＤＮＡが組み込まれている細胞の選択は、ＤＮＡコンストラクト中に選択可能
マーカーを含め、選択可能マーカー遺伝子を含有するトランスフェクト細胞または感染細
胞を、その選択可能マーカー遺伝子を発現させる細胞だけの生き残りに適した条件下で培
養することによって、行なうことができる。導入されたＤＮＡコンストラクトのさらなる
増幅は、増幅に適した条件下で遺伝子改変哺乳類細胞を培養することによって（例えば、
増幅可能マーカー遺伝子を含有する遺伝子改変哺乳類細胞を、その増幅可能マーカー遺伝
子のコピーを複数含有する細胞だけが生き残りうるような濃度の薬物の存在下で培養する
ことによって）、達成することができる。
キメラタンパク質を発現させる遺伝子改変哺乳類細胞は、本明細書に記載するとおり、
発現産物の検出によって同定することができる。例えば、担体がメガリンリガンドである
キメラタンパク質を発現させる哺乳類細胞は、サンドイッチ酵素免疫アッセイによって同
定することができる。抗体は、コンジュゲートのメガリン結合部分または活性剤部分に対
する抗体であることができる。
［ＶＩＩＩ．ラベル］
一部の実施形態では、メガリンリガンドに基づく活性剤コンジュゲートを、その検出が
容易になるように、標識する。「ラベル」または「検出可能部分」とは、分光法的手段、
光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によ
って検出することができる組成物である。例えば、本発明での使用に適したラベルには、
放射性ラベル（例えば３２Ｐ）、蛍光物質（例えばフルオレセイン）、高電子密度試薬、
酵素（例えばＥＬＩＳＡでよく使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、または例
えば放射性ラベルを当該ハプテンもしくはペプチドに組み込むことなどによって検出可能
にすることができるハプテンおよびタンパク質、または当該ハプテンもしくはペプチドと
特異的に反応する抗体を検出するために用いることができるハプテンおよびタンパク質な
どがあるが、これらに限定されるわけではない。
上述のように、使用するスクリーニングアッセイに依存して、コンジュゲートの活性剤
、リンカーまたはメガリンリガンドポリペプチド部分を標識することができる。使用され
る個々のラベルまたは検出可能基は、それがコンジュゲートの生物学的活性を著しく妨害
しない限り、本発明の決定的な側面ではない。検出可能基は、検出可能な物理的または化
学的性質を持つ任意の物質であることができる。したがってラベルは、分光法的手段、光
化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段
によって検出することができる任意の組成物である。
本発明での使用に適したラベルの例には、例えば蛍光染料（例えばフルオレセインイソ
チオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性ラベル（例えば3Ｈ、125Ｉ
、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐ）、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、その他ＥＬＩＳＡでよく使用されるもの）、および比色用ラベル、例え
ばコロイド金または有色のガラスもしくはプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポ
リプロピレン、ラテックスなど）があるが、これらに限定されるわけではない。
ラベルは、当分野で周知の方法に従って、所望のアッセイ成分に直接または間接的にカ
ップリングすることができる。好ましくは、一実施形態として、本発明の活性剤をコンジ
ュゲートするために、イソシアネート試薬を使って生体ポリマーにラベルを共有結合する
。本発明の一態様では、本発明の二官能性イソシアネート試薬を使って、生体ポリマーに
ラベルをコンジュゲートすることにより、活性剤が取り付けられていないラベル生体ポリ
マーコンジュゲートを形成させることができる。そのラベル生体ポリマーコンジュゲート
は、本発明の標識コンジュゲートを合成するための中間体として使用するか、生体ポリマ
ーコンジュゲートを検出するために使用することができる。上述のように、多種多様なラ
ベルを使用することができ、ラベルの選択は要求される感受性、所望するアッセイ成分と
のコンジュゲーションの容易さ、安定性の要件、利用できる計器装備、および廃棄規定に
依存する。非放射性ラベルはしばしば間接的手段によって取り付けられる。一般に、リガ
ンド分子（例えばビオチン）が分子に共有結合される。次に、そのリガンドが、生得的に
検出可能であるもう一つの分子、または検出可能酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合
物などのシグナル系に共有結合されたもう一つの分子（例えばストレプトアビジン）に結
合する。
コンジュゲートは、シグナル生成化合物に、例えば酵素または蛍光物質とのコンジュゲ
ーションによって、直接コンジュゲートすることもできる。ラベルとしての使用に適した
酵素には、例えばヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダー
ゼ、またはオキシダーゼ類(oxidotases)、特にペルオキシダーゼなどがあるが、これらに
限定されるわけではない。ラベルとしての使用に適した蛍光化合物、すなわち蛍光物質に
は、例えばフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、
ウンベリフェロンなどがあるが、これらに限定されるわけではない。好適な蛍光物質のさ
らなる例には、例えばエオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニン、フルオレセインＷ、アク
リジンイエロー、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、エリスロセイン(erythrosc
ein)、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドなどがあるが、これらに限定される
わけではない。ラベルとしての使用に適した化学発光化合物には、例えばルシフェリンお
よび２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、例えばルミノールがあるが、これらに限定さ
れるわけではない。本発明の方法で使用することができる様々な標識およびシグナル生成
システムの概要については、米国特許第4,391,904号を参照されたい。
ラベルを検出する手段は当業者にはよく知られている。例えば、ラベルが放射性ラベル
である場合、検出手段にはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーで
の写真フィルムなどが包含される。ラベルが蛍光ラベルである場合は、適当な波長の光で
蛍光色素を励起させ、その結果生じた蛍光を検出することによって検出することができる
。蛍光は視覚的に、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子倍増管などの電子検出器を使っ
て検出することができる。同様に酵素ラベルも、適当な酵素基質を与えて、その結果生じ
る反応生成物を検出することによって、検出することができる。比色用ラベルまたは化学
発光ラベルは、単にラベルに付随する色を観察するだけで検出することができる。本発明
の方法での使用に適した他の標識および検出系は、当業者には直ぐにわかるだろう。その
ような標識された調整物質およびリガンドは、疾患または健康状態の診断に使用すること
ができる。
［ＶＩＩＩ．メガリンリガンド−活性剤コンジュゲートおよびそれらの送達の調整物質に
関するスクリーニングアッセイ］
本発明は、メガリンリガンドポリペプチド−活性剤コンジュゲートに関するスクリーニ
ングアッセイを提供する。この場合、コンジュゲートは、メガリン受容体（これは全細胞
中にあるか、細胞抽出物中にあるか、半精製状態、精製状態またはその活性の測定が可能
な他の任意の形式で存在することができる）の測定可能な活性に影響を及ぼすその能力に
ついて試験される。活性は、メガリンの発現、機能または分解における任意の活性である
ことができ、例えばそのような活性の量またはタイミングを含む。そのような活性には、
例えば、メガリン遺伝子配列またはｍＲＮＡ転写物の転写、転写物プロセシング、翻訳ま
たは転写物の安定性などが包含される。そのような活性には、例えば、新しいＬＲＰの合
成、メガリンの細胞内局在、およびメガリンの生物学的活性の活性化などが包含される。
そのような活性には、例えば、メガリンの物質結合能力、コンフォメーション採択能力、
反応触媒能力、既知リガンド結合能力などが包含される。そのような活性には、例えばメ
ガリンの量または安定性、メガリンのプロセシングおよび除去または分解などが包含され
る。好ましい実施形態では、使用されるメガリンリガンドが、改変されたものであるか、
元々、他のどのＬＲＰ受容体よりもメガリンに対して高い結合親和性を持つもの、特にＬ
ＲＰ１よりもメガリンに対して高い結合親和性を持つものである。メガリンに関して上述
したものと同様のスクリーニングアッセイは、他のＬＲＰ受容体と比較したメガリンに対
するメガリンリガンドの相対的結合親和性の比較が得られるように、他のどのＬＲＰ受容
体についても設定することができる。
本発明では多種多様なスクリーニング形式が考えられる。一部の設計はロースルプット
とみなされ、１個または数個の化合物が逐次的にまたは並行して試験されるに過ぎない。
ハイスループットスクリーニングアッセイは、何万または何十万という化合物を数週間ま
たは数ヶ月でスクリーニングするのに適している。「インシリコ」スクリーニング形式で
は、コンピュータ援用合理設計技術を利用して、メガリンの生物学的活性の潜在的調整物
質を同定する。
〔Ａ．メガリン受容体活性を調整することによるメガリンリガンドコンジュゲート活性剤
の取り込みの調整〕
例えば脳またはリソソーム（ただしこれらに限定されるわけではない）へのメガリンリ
ガンド−活性剤コンジュゲートの取り込みおよび送達を増加させることが、例えばコンジ
ュゲートが神経学的状態および／またはＬＳＤの処置に使用されていて、送達量の増加が
治療上の利益をもたらすなど（ただしこれらに限定されるわけではない）の状況では有用
であり、望ましいことは、当業者には理解されるだろう。例えばコンジュゲートがその潜
在的心臓保護作用のために用いられているか、または他の（非ＣＮＳ）器官で使用されて
いて、脳取り込みの副作用が回避されるべきである場合（ただしこれらに限定されるわけ
ではない）など、様々な理由により、血液脳関門を横切るコンジュゲートの取り込みおよ
び送達を減少させることが有用であり、望ましいことは、当業者には理解されるだろう。
好適なメガリンリガンド、そのメガリン結合性断片、メガリンリガンドまたはそのメガ
リン結合性断片の活性剤コンジュゲート、およびメガリンおよび／または他のＬＲＰ活性
の調整物質およびメガリンリガンドコンジュゲート送達の調整物質は、下記実施例１に記
載のトランズウェル(Transwell)装置の変法を使って容易に同定することもできる。この
変法では、化合物（例えばメガリンリガンド、メガリンリガンドと活性剤とのコンジュゲ
ートまたは調整物質）をトランズウェル装置内の細胞の管腔表面に加える。次に、その化
合物を、それがどの程度、ＢＢＣＥＣを横断して管外側に至ることができるか、あるいは
（調整物質であれば）それがどの程度、ＢＢＣＥＣを横切って管外側に至るメガリンリガ
ンドもしくはメガリンリガンドのメガリン結合性断片または他のＬＲＰリガンドの輸送を
増加または減少させるかについて、スコア化する。薬理学的に優れた調整物質を同定する
ために、化合物ライブラリーを容易にスクリーニングまたは試験することができる。
ここで用いられる例示的リガンドはＲＡＰである。メガリン受容体の他の既知リガンド
をスクリーニングして、コンジュゲートの送達の調整物質として、またはそのような調整
物質を設計するためのモデルとして使用することができる。これらのリガンドには、例え
ばＡｐｏＥ、キロミクロン残骸、β−ＶＬＤＬ、活性化α２−マクログロブリン、ｔＰＡ
、組織因子阻害剤、プロ−ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、サポシン、ゲンタマイシン、チログロブ
リン、ポリミキシンＢ、精嚢分泌タンパク質Ａ、トロンボスポンジン−１、ラクトフェリ
ン、およびβ−ＡＰＰなどがあるが、これらに限定されるわけではない。これらのリガン
ドはメガリンに対するそれらの結合親和性が増加するように修飾することができる。ＬＲ
Ｐ１と比較してメガリンに対して高い結合親和性を持つリガンドは特に好ましい。
［ＩＸ．使用方法、薬学的組成物、およびそれらの投与］
コンジュゲートおよび調整物質は、様々な経路で投与することができる。経口製剤の場
合、コンジュゲートは単独で使用するか、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を製造す
るために適当な添加剤と組合せて、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデ
ンプンまたはバレイショデンプンなどの通常の添加剤と組合せて、結晶性セルロース、セ
ルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤と組
合せて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と組み合わせて、そして所
望であれば、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、保存剤および着香剤と組み合わせて、使用する
ことができる。
コンジュゲートおよび調整物質は、それらを、水性溶媒または非水性溶媒、例えば植物
油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレ
ングリコールなど（所望であれば、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および
保存剤を含むもの）に溶解、懸濁または乳化することによって、注射用の製剤に製剤化す
ることができる。
コンジュゲート、調整物質、およびＬＲＰリガンドは、吸入によって投与されるエアロ
ゾル製剤に利用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロ
パン、窒素などの加圧された許容できる噴射剤中に製剤化することができる。
さらに、コンジュゲートおよび調整物質は、乳化基剤または水溶性基剤などの種々の基
剤と混合することによって、坐剤にすることもできる。本発明の化合物は、坐剤により直
腸投与することができる。坐剤は、体温で溶解するが室温では固化するカカオ脂、カーボ
ワックスおよびポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができる。
シロップ剤、エリキシル剤および懸濁剤などの経口投与用または直腸投与用のコンジュ
ゲート、調整物質、およびＬＲＰリガンドの単位剤形を提供することができ、例えば茶さ
じ一杯、食匙一杯、錠剤または坐剤などの各投与単位は、所定の量の活性剤含有組成物を
含有する。同様に、注射用または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または
他の薬学的に許容できる担体中の溶液として、組成物中にコンジュゲートを含むことがで
きる。
実際の使用にあたって、本発明のコンジュゲート、調整物質、およびＬＲＰリガンドは
、活性成分として、通常の薬学的配合技術に従って薬学的担体と十分に混和することがで
きる。担体は、投与、例えば経口投与または非経口投与（静脈内投与を含む）に望まれる
製剤の形態に依存して、多種多様な形態をとりうる。経口剤形用の組成物を製造する際に
は、通常の薬学的媒質、例えば懸濁剤、エリキシル剤および溶液剤などの経口液状製剤の
場合であれば、例えば水、グリセロール、油、アルコール、着香剤、保存剤、着色剤など
を、また例えば散剤、硬および軟カプセル剤ならびに錠剤などの経口固形製剤の場合であ
れば、担体、例えばデンプン、糖類、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合
剤、分散剤などを、どれでも使用することができ、固形経口製剤は液状経口製剤よりも好
ましい。
経皮投与経路については、薬物の経皮投与法が「Remington's Pharmaceutical Science
s」第17版(Gennaro et al.Eds,Mack Publishing Co.,1985)に記載されている。皮膚貼付
剤は、本発明のコンジュゲート、調整物質、およびＬＲＰリガンドの好ましい経皮送達手
段である。貼付剤は、好ましくは、化合物の吸収量が増加するように、ＤＭＳＯなどの吸
収促進剤を供給する。他の経皮薬物送達法は、米国特許第5,962,012号、第6,261,595号、
および第6,261,595号に開示されている。これらの特許はそれぞれ参照によりそのまま本
明細書に組み入れられる。
具体的実施形態では、本明細書に記載するコンジュゲートの治療的投与が、ＣＳＦへの
髄腔内投与によって行なわれるだろうと考えられる。本発明の髄腔内投与は、薬学的組成
物を脳室中に導入することを含みうる。もう一つの選択肢として、髄腔内投与は、薬学的
組成物を腰部に導入することを含みうる。さらにもう一つの選択肢として、髄腔内投与は
大槽中に薬学的組成物を導入することを含む。そのような投与はいずれも、好ましくは、
ボーラス注射によって行なわれる。症状の重症度およびその治療に対する対象の応答性に
応じて、そのようなボーラス注射は週に１回、月に１回、６週間毎に１回、または年に１
回投与することができる。別の実施形態では、髄腔内投与が注入ポンプを使って達成され
る。医薬品は、もちろん、少なくとも数日間にわたって持続的に髄腔内投与することがで
きるだろう。あるいは、髄腔内投与は少なくとも４週間にわたって持続的に行なわれる。
もちろん、投与が持続注入によって行なわれる場合は、その酵素補充療法の投薬速度は、
ボーラス注射投与と比較して著しく低下させることができる。好ましい実施形態では、コ
ンジュゲートの活性剤がイズロニダーゼであり、ＭＰＳの処置を受ける哺乳動物の体重２
０ｋｇにつき約１ｍｇのイズロニダーゼを含む量で送達される。特定実施形態では、上記
の用量が１５ｃｃのＣＳＦに送達される。そのような濃度では、酵素濃度がＣＳＦ１ｍｌ
あたり１８，０００単位になると考えられる。上述の投薬量は単なる例示的投薬量である
と理解すべきであり、この投薬量を変更できることは、当業者には理解されるだろう。
本発明の方法および組成物は、酵素補充療法に先だって抗原特異的寛容を誘導する方法
および組成物と併用することができる。そのような方法には、抗原特異的寛容の誘導であ
って、例えばシクロスポリンＡなどの免疫抑制剤の投与を含み、さらに例えばヌクレオチ
ド類似体または代謝拮抗物質など（ただしこれらに限定されるわけではない）の抗増殖剤
の投与を含んでもよいものが包含される。抗増殖剤はアザチオプリンであることができる
。さらなる方法は、例えば米国特許公開第20030211113号として公開された米国特許出願
第10/141,668号、および米国特許公開第20040009906号として公開された米国特許出願第1
0/429,314号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる
。
薬学的に許容できる賦形剤、例えばビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、市
販されている。さらに、薬学的に許容できる補助物質、例えばｐＨ調節および緩衝剤、張
性調節剤、安定剤、湿潤剤なども市販されている。
用量レベルが具体的化合物、症状の重症度および副作用に対する対象の感受性の関数と
して変動しうることは、当業者には容易に理解されるだろう。当業者は、例えば患者、試
験動物およびインビトロで行なわれる用量応答評価および薬物動態評価など（ただしこれ
らに限定されるわけではない）の様々な手段により、与えられた化合物に関する好ましい
投薬量を容易に決定することができる。
これらの各態様において、組成物には、経口投与、直腸投与、局所投与、非経口投与（
皮下、筋肉内および静脈内投与を含む）、肺投与（鼻または口腔吸入）、または鼻投与に
適した組成物（ただしこれらに限定されない）が包含されるが、どの場合でも、最も適切
な経路は、一つには、処置される状態の性質および重症度と、活性成分の性質とに依存す
るだろう。例示的な投与経路は経口経路および静脈内経路である。組成物は単位剤形で便
利に提供することができ、薬学分野で周知の方法のいずれかによって製造することができ
る。
実際の使用にあたって、本発明の調整物質は、活性成分として、通常の薬学的配合技術
に従って薬学的担体と十分に混和することができる。担体は、投与、例えば経口投与また
は非経口投与（静脈内投与を含む）に望まれる製剤の形態に依存して、多種多様な形態を
とりうる。経口剤形用の組成物を製造する際には、通常の薬学的媒質、例えば懸濁剤、エ
リキシル剤および溶液剤などの経口液状製剤の場合であれば、例えば水、グリセロール、
油、アルコール、着香剤、保存剤、着色剤などを、また例えば散剤、硬および軟カプセル
剤ならびに錠剤などの経口固形製剤の場合であれば、担体、例えばデンプン、糖類、微結
晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、分散剤などを、どれでも使用すること
ができ、固形経口製剤は液状経口製剤よりも好ましい。
錠剤およびカプセル剤は投与が容易なので、これらは最も有利な単位剤形に相当し、こ
の場合は明らかに固形の薬学的担体が使用される。所望であれば、錠剤は標準的な水性技
術または非水性技術によって被覆してもよい。これらの組成物における活性化合物のパー
センテージはもちろん変動することができ、当該単位の重量の約２パーセント〜約６０パ
ーセントが好都合であるだろう。
本発明のコンジュゲート、調整物質、およびリガンドは、動物（特にヒト）における治
療的介入、予防的介入および診断的介入に役立つ。本明細書に記載するように、本コンジ
ュゲートは、使用する生体ポリマーに依存して、任意の標的器官、コンパートメント、ま
たは部位で活性剤の優先的な蓄積および／または放出を示す。
本発明の組成物は、ウイルスエンベロープまたは小胞に封入するか取り付けて、または
細胞中に組み込んで、投与することができる。小胞は、通常は球状でしばしば脂質性のミ
セル粒子である。リポソームは二分子膜で形成される小胞である。好適な小胞には、例え
ばユニラメラ小胞およびマルチラメラ脂質小胞またはリポソームが包含されるが、これら
に限定されるわけではない。そのような小胞およびリポソームは多種多様な脂質またはリ
ン脂質化合物、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン
、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、糖脂質、ガングリオシドなど
から、標準的な方法、例えば米国特許第4,394,448号に記載の方法などを使って製造する
ことができる。そのような小胞およびリポソームは、化合物の細胞内に投与するため、お
よび標的器官に化合物を送達するために、使用することができる。ｐ９７−関心対象組成
物の制御放出も、封入を使って達成することができる（例えば米国特許第5,186,941号参
照）。
メガリンリガンドに基づく活性剤コンジュゲートまたは調整物質組成物を血流中に、ま
たは好ましくは少なくとも血液脳関門の外側に送達する任意の投与経路を使用することが
できる。組成物は好ましくは末梢に、最も好ましくは静脈内に投与されるか、心臓カテー
テルによって投与される。頚静脈内注射および頚動脈内注射も有用である。組成物は局所
的または局部的に、例えば腹腔内または皮下または筋肉内に、投与することができる。あ
る態様では、組成物を適切な薬学的希釈剤または担体と共に投与する。
投与すべき投薬量は個々の必要、所望する作用、使用する活性剤、生体ポリマーおよび
選択した投与経路に依存するだろう。コンジュゲートの好ましい投薬量は約０．２ｐｍｏ
ｌ／ｋｇ〜約２５ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、特に好ましい投薬量は２〜２５０ｐｍｏ
ｌ／ｋｇの範囲である。あるいは、コンジュゲートの好ましい用量は０．０２〜２０００
ｍｇ／ｋｇの範囲内にあるだろう。これらの投薬量は生体ポリマーに付随する活性剤部分
または薬物部分の数による影響を受けるだろう。もう一つの選択肢として、投薬量は投与
される活性剤に基づいて計算することもできる。
好ましい実施形態ではコンジュゲートがヒトＲＡＰを含む。例えば、０．００５〜１０
０ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシンを含むＲＡＰ−アドリアマイシンの用量も、インビボで
有用である。アドリアマイシンとして０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇのＲＡＰ−ア
ドリアマイシンの投薬量は、特に好ましい。当業者は、メガリンリガンドに連結された化
合物の好ましい用量を、一つには、遊離型の当該化合物に用いられている推奨投薬量に基
づいて決定することができる。ＲＡＰなどのメガリンリガンドに対する活性剤のコンジュ
ゲーションは、一般的には、同じ作用を得るのに必要な薬物の量を低下させる。
本発明のコンジュゲートおよび調整物質は、動物（特にヒト）における治療的介入、予
防的介入および診断的介入に役立つ。メガリンリガンド化合物は特定の組織における優先
的蓄積を示しうる。診断用途に関する好ましい医学的適応には、例えば関心対象の標的器
官（例えば肺、肝臓、腎臓、脾臓）に関係する任意の状態が包含される。特に好ましい実
施形態では、関心対象の標的器官は脳である。
本方法は多種多様な疾患状態の処置に利用することができる。一定の実施形態では、所
望の活性を持つ活性剤または薬物は既に同定されているが、その活性剤または薬物が標的
部位、標的領域または標的コンパートメントに、完全に満足できる治療結果をもたらすほ
ど十分には送達されないような疾患状態における本方法の使用が、特に興味深い。そのよ
うな活性剤または薬物と共に、メガリンリガンドまたはそのメガリン結合性断片に活性剤
をコンジュゲートする本方法を使用することにより、活性剤または薬物の治療効力および
治療係数を高めることができる。
本コンジュゲートを使って処置することができる具体的な疾患状態は、そのコンジュゲ
ート中に存在することができる薬物部分のタイプと同じように多様である。したがって、
疾患状態には、細胞増殖性疾患、例えば新生物疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、ホルモ
ン異常疾患、変性疾患、加齢疾患、中枢神経系の疾患（例えばアルツハイマー病、てんか
ん、高脂血症）、精神疾患および精神医学的状態（例えば統合失調症、うつおよび不安な
どの気分障害）、感染性疾患、酵素欠乏疾患、上述したようなリソソーム蓄積症などが包
含される。
処置は、コンジュゲートの投与に伴って対象にもたらされる任意の有益な結果、例えば
疾患に冒される可能性の低下、疾患の防止、宿主を患わせる疾患の進行の鈍化、停止もし
くは逆転、またはその疾患状態に伴う症状の改善などを包含するものとし、ここに改善ま
たは有益という用語は、パラメータの強さの、例えば処置される病的状態に伴う症状（炎
症およびそれに伴う疼痛など）の、少なくとも減少を指すべく、広い意味で用いられる。
したがって処置には、病的状態が、または少なくともそれに伴う症状が、完全に阻害され
る状況、例えばその発生が妨げられるか、停止されて、例えば終結されて、宿主がもはや
その病的状態に、または少なくともその病的状態を特徴づける症状に、患わされない状況
も包含される。
特定の実施形態では、処置される障害がリソソーム蓄積症であり、コンジュゲートが薬
学的組成物として、前記哺乳動物の脳組織中に存在する蓄積顆粒の量を減少させるのに有
効な量で投与される。通例、そのような障害の症状は、病歴、理学的検査、心エコー法、
心電図検査、磁気共鳴画像、睡眠ポリグラフ、骨格調査、一連の運動計測、角膜写真、お
よび皮膚生検の定型的評価によって監視される。そのような障害において、治療剤にコン
ジュゲートされたメガリン結合部分を投与すると、前記対象における発育遅延および退行
の正常化、高圧水頭症の軽減、前記対象における脊髄圧迫の軽減、ならびに前記対象の脳
血管周辺の血管周囲嚢胞の数および／または大きさの減少が起こる。そのような続発症を
監視し評価する方法は当業者には知られている。そのような続発症のさらなる説明につい
て、当業者は、米国特許第6,585,971号、米国特許第6,569,661号および米国特許第6,426,
208号ならびに米国特許公開第20040009906号を参照されたい。
一部の態様では、送達される治療に対する動物の耐性を増加させることが有用であるだ
ろう。そのような方法は、2003年5月5日に出願され20040009906として公開された米国特
許出願第10/429,314号に記載されている（この文献は参照によりそのまま本明細書に組み
入れられる）。
好ましい実施形態では、動物がムコ多糖症Ｉを患っていて、そのα−Ｌ−イズロニダー
ゼ活性は正常値の約５０％以下である。そのような実施形態では、例えば週に約０．００
１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の有効量のヒトα−Ｌ−イズロニダーゼを、そ
の欠乏症を患っている対象に、コンジュゲートの一部として、投与することが望ましいだ
ろう。別の実施形態では、対象に、週に約０．０１ｍｇ／当該哺乳動物のＣＳＦ １５ｃ
ｃ〜約５．０ｍｇ／当該哺乳動物のＣＳＦ １５ｃｃの用量の前記ヒトα−Ｌ−イズロニ
ダーゼを投与する。ここで考えられる治療法は、リソソーム蓄積症を持つ対象の脳細胞に
おけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の破壊を促進する。脳細胞は、ニューロン、神経
膠細胞、上衣細胞であることができる。通例、顆粒蓄積が起こる脳細胞であって、本発明
のコンジュゲートを投与することによって改善すべきであるものには、ニューロン、膠細
胞、小膠細胞、アストロサイト、乏突起膠細胞、血管周囲細胞、血管外皮細胞、髄膜細胞
、上衣細胞、くも膜顆粒細胞、くも膜、硬膜、軟膜および脈絡叢細胞が包含される。好ま
しい実施形態における治療は、髄膜細胞中の蓄積顆粒を、前記コンジュゲートの投与を行
なっていない同様の細胞中に存在するリソソーム蓄積顆粒の数と比較して、減少させる。
これにより、一部の対象における高圧水頭症の症状が緩和されるという治療効果が得られ
、前記投与は前記対象の髄膜組織中のＣＳＦ液の量を減少させる。
種々の宿主または対象を本方法で処置することができる。一般的に、そのような宿主は
「哺乳動物」または「哺乳類」であり、この場合これらの用語は、食肉目（例えばイヌお
よびネコ）、齧歯目（例えばマウス、モルモットおよびラット）、および霊長目（例えば
ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳綱に属する生物を記述するために広く用い
られる。多くの実施形態では、宿主はヒトであるだろう。
［ＸＩ．メガリンリガンドポリペプチドの製造］
本発明では、与えられた活性剤のトランスサイトーシスを容易にするために、数多くの
メガリンリガンドを使用することができる。そのようなリガンドの典型例の一つはＲＡＰ
である。本発明で使用されるＲＡＰおよびＲＡＰポリペプチドには、米国特許第5,474,76
6号に開示されているものが包含され、この特許はそのようなペプチドを開示すると共に
本発明の化合物および組成物で使用するためにそれらを取得する方法を開示する目的で、
参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。ＲＡＰおよびＲＡＰポリペプチドならび
に他のメガリンリガンドは、当業者に知られる任意のタンパク質製造および精製法を使っ
て製造することができる。
リガンドは天然のタンパク質源から精製するか、そのリガンドを発現させる組換え宿主
から単離するか、タンパク質合成分野で周知の技術を使って合成することができる。当業
者は、メガリン結合部位を含有するメガリンリガンドを得るために、種々のそのような技
術を容易に適合させることができる。そのようなメガリンリガンドは、例えば、ＲＡＰ上
に見いだされるメガリンドッキング／結合部位を持ちうる。例えばMelman et al.,J.Biol
.Chem.276(31):29338-29346(2001)、Savonen et al.,J Biol Chem.274(36):25877-25882(
1999)、Nielsen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7521-7525(1997)、Medved et al.,J
.Biol.Chem.274(2):717-727(1999)、Rall et al.,J.Biol.Chem.273(37):24152-24157(199
8)、Orlando et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 3161-3163(1994)を参照されたい。
ネイティブＲＡＰタンパク質の単離は、Ashcom et al.,J.Cell.Biol.110:1041-1048(19
90)およびJensen et al.,FEBS Lett.255:275-280(1989)に記載されている。メガリン結合
部位を含有するメガリンリガンド断片は、単離されたネイティブタンパク質から、タンパ
ク質全体の断片が生成するように酵素的および／または化学的切断で変換することによっ
て、作製することができる。そのような方法の典型例が米国特許第6,447,775号に教示さ
れており、この特許は参照により、特にそのようなＲＡＰポリペプチド取得法に関して、
本明細書に組み入れられる。
また、Williams et al.,J.Biol.Chem.267:9035-9040(1992)およびWurshawsky et al.,J
.Biol.Chem.269:3325-3330(1994)に記載されているように、メガリンリガンドまたはその
ようなリガンドのメガリン結合性断片を、組換え細菌中で発現させることもできる。
本明細書の至るところに示すように、ＲＡＰは好ましいメガリンリガンドである。組換
え大腸菌株から３９ｋＤａ ＲＡＰタンパク質を精製する手順は既にHerz et al.,J.Biol
.Chem.266,21232-21238(1991)によって記述されている。その手順の変法を、米国特許第5
,474,766号および以下に記述するように使用することができる。
発現プラスミドｐＧＥＸ−３９ｋＤａを保持する大腸菌株ＤＨ５アルファの培養物を、
１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地中、３７℃で、対数増殖期中期まで生育さ
せることができる。次に、培養物を３０℃まで冷まし、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ−３９ｋＤａ融合タンパク質の発現を誘導するために、０．０１％イソプロピルチ
オ−ベータ−Ｄ−ガラクトシドを添加することができる。３０℃で４〜６時間インキュベ
ートした後、培養物を氷で冷却し、遠心分離によって回収することができる。
これ以降の工程は全て４℃で行なうべきである。１％トリトンＸ１００、１μＭペプス
タシン、２．５μｇ／ｍｌロイペプチン、０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（
ＰＭＳＦ）および１μＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳ中で、細胞ペ
レットを溶解する。この溶解物をBranson Model 450 Sonifierで超音波処理し、得られた
膜および他の細胞残渣を１５，０００ｇで１５分間の遠心分離によって分離した後、上清
を回収する。この工程で得た上清をアガロース固定化グルタチオンビーズ(Sigma Chemica
l Co.)と共にＰＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウム中で終夜インキュベートする。次に
、ビーズを洗浄することができ、融合タンパク質の溶出は、５ｍＭ還元型グルタチオン(S
igma Chemical Co.)との競合によって行なうことができる。透析に続いて、融合タンパク
質５０μｇにつき１００ｎｇの活性化ヒトトロンビンと共に終夜インキュベートすること
により、融合タンパク質を切断することができる。次いで、アガロース固定化グルタチオ
ンビーズと共にさらにインキュベートすることにより、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼエピトープを除去することができる。
本発明の３９ｋＤａタンパク質の２８ｋＤａタンパク質断片（「２８ｋＤａタンパク質
」）は、配列表に配列番号２として後述するアミノ酸配列（図１６）を持つ。
この２８ｋＤａタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で２８，０００ダルトンの分子量を
持ち、酸加水分解に対して比較的安定であり、１％トリトンＸ１００に溶解し、肝受容体
へのｔ−ＰＡ結合に対して３９ｋＤａタンパク質とほぼ同じ阻害活性（Ｋｉ）を持つ。こ
の２８ｋＤａタンパク質は、米国特許第5,474,766号にさらに例示されているように、ク
ローニングし、精製することができ、この特許はそのようなクローニング法に関して特に
参照により本明細書に組み入れられる。
上記の方法は上述のようにＲＡＰの製造および精製について説明しているが、他のメガ
リンリガンドおよびメガリン結合性断片も、同様の技術を使って製造することができる。
そのようなリガンドの総説は、ChristensenおよびBirn(Am.J.Physiol.Renal Physiol.,28
0:F562-F573,2001、特に表1およびそこに引用されている文献を参照されたい)に見いだす
ことができる。そのようなリガンドを製造および精製する技術は当業者にはよく知られて
いる。
［ＸＩＩＩ．実施例］
本発明の好ましい実施形態を実証するために以下の実施例を記載する。以下の実施例に
開示する技術は、本発明の実施に際してうまく機能することを本発明者らが発見した技術
を表し、それゆえにその実施の好ましい形態を構成するとみなしうることを、当業者は理
解すべきである。しかし当業者は、本明細書の開示に照らして、ここに開示する特定の実
施形態には数多くの改変を施すことができ、そうしてもなお、本発明の精神および範囲か
ら逸脱することなくよく似たまたは同様の結果が得られることを理解すべきである。以下
の実施例は、インビトロでトランスサイトーシスを評価するためのプロトコールならびに
ＲＡＰなどのメガリンリガンドとメガリンおよび他の受容体との相互作用を特徴づけるた
めのプロトコールの典型例を提供する。
［実施例１］
〔ｐ９７のトランスサイトーシス〕
トランスサイトーシス実験は以下のように行なった。ウシ脳毛細管内皮細胞（ＢＢＣＥ
Ｃ）で覆われた１個のインサートを、２ｍｌのリンゲル／ヘペスが入った６穴マイクロプ
レートを含有するトランズウェル装置に入れ、３７℃で２時間プレインキュベートした。
［125Ｉ］−ｐ９７（２５０ｎＭ）を細胞で覆われたフィルターの上側に加えた。ＢＢＣ
ＥＣの管外側によるｐ９７の再エンドサイトーシスを避けるために、様々な時点で、イン
サートを移動させた。実験の終了時に、ＴＣＡ沈殿を行なってから、［125Ｉ］−ｐ９７
を測定した。図１７にトランスサイトーシスを図示する。
125Ｉ−ｐ９７のトランスサイトーシスに対するＲＡＰの作用を評価した。図１では、
ＬＲＰファミリーの既知ポリペプチド阻害剤であるＲＡＰを細胞に適用した（２５マイク
ログラム／ｍｌ）。ＲＡＰはｐ９７のトランスサイトーシスを有意に阻害したことから、
ＬＲＰファミリーがトランスサイトーシスに関連づけられた。
［実施例２］
〔ＲＡＰ融合物の構築、発現、精製および特徴づけ〕
ヒト受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）とヒトアルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ア
ルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）または膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）との
融合物をコードする発現コンストラクトを作製した。この目的のために、ＲＡＰをコード
する配列を、様々な融合パートナーをコードする配列の５’末端に融合した。配列は全て
、図２に示す後述のプライマーを使ったヒトｃＤＮＡの高忠実度ＰＣＲ増幅によって取得
した。ＧＤＮＦ融合物は細菌での発現用に設計した。そのために、このコンストラクトの
ＲＡＰ増幅では、プライマーＲＡＰＦの代わりにプライマーＲＡＰＢＡＣＦを使用した（
図２ｂ）。
シグナルペプチド配列を除去するためにＲＡＰの５’末端を切断した。その代わりに、
哺乳類発現コンストラクトには、ジペプチドＧＳをコードするインフレームＢａｍＨＩ部
位を付加した。細菌発現コンストラクトには、５’末端にＮｃｏＩ部位を持つテトラペプ
チドＭＧＧＳをコードする配列を付加した。テトラペプチドＨＮＥＬ小胞体保持シグナル
を除去するためにＲＡＰの３’末端を切断した。その代わりに、６アミノ酸スペーサー（
ＡＥＡＥＴＧ）のコード配列を付け加えた。このスペーサーの最後の２コドンはＡｇｅＩ
制限部位を指定する。シグナルペプチドおよびプロペプチド配列を除去するためにＧＡＡ
の５’末端を切断した(Wisselaar et al.,J.Biol.Chem.268(3):2223-31,1993)。その代わ
りに、融合物のＲＡＰ−スペーサー部分への融合が可能なように、ＡｇｅＩ部位を付加し
た。ＩＤＵの５’末端も、シグナルペプチドを除去して制限部位を導入するために、同様
に切断した。ＧＤＮＦの５’末端は、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方を
除去するために切断した(Lin et al.,Science,260(5111):1130-2,1993)。
ＧＡＡおよびＩＤＵ融合物をコードするオープンリーディングフレームを、発現ベクタ
ーｐＣＩＮｍｔ中に、隣接するＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位を使ってライゲートした。
このベクターは、３’末端にインフレームＢａｍＨＩ部位を持つヒトメラノトランスフェ
リンシグナルペプチドを含有している。結果として得られた融合タンパク質の配列を図３
および４に示す。ｐＣＩＮｍｔ（InvitrogenベクターｐｃＤＮＡ３．１由来）制御配列は
、ヒトＣＭＶプロモーターと、それに続くウサギＩＶＳ２およびラットプレプロインスリ
ンＲＮＡリーダー配列とからなる。ウシ成長ホルモンターミネーター配列は発現カセット
の３’に位置する。このベクターは、弱いＨＳＶ−ｔｋプロモーターによって駆動される
減弱化ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子から構成される選択可能マーカーを
含んでいる(Yenofsky et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.,USA 87(9):3435-9,1990)。ＲＡＰ−
ＧＡＡおよびＲＡＰ−ＩＤＵをＬｒｐ欠損ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ１３−５−１）にトラン
スフェクトし、８００μｇ／ｍＬのＧ４１８で組換え体を選択した。
ＲＡＰＧＤＮＦ融合物（図５）を、細菌発現ベクターｐＢＤｈｉｓＡ(Invitrogen)に、
隣接するＮｃｏＩおよびＸｂａＩ部位を使ってクローニングした。その結果得られた発現
ベクターをＢＬ２１細胞にトランスフェクトし、組換え体をカルベニシリンで選択した。
発現させ精製したＲＡＰ−ＧＤＮＦ融合物を、ドーパミン作動性ニューロンを保護する能
力または既に記載されている他の活性(Kilic et al.,Stroke 34(5):1304-10,2003)につい
てアッセイすることができる。
〔ＲＡＰ融合物の発現〕
培地は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ゲンタマイシン、アンホテリシン、８００μｇ／ｍ
Ｌ Ｇ４１８および２．５％ウシ胎仔血清を添加したＪＲＨ３０２とした。組換えクロー
ンをＴ２２５フラスコ中で生育してから、血清の存在下で、１Ｌ Ｃｏｒｎｉｎｇスピナ
ーフラスコのＣｙｔｏｐｏｒｅ １ビーズ(Amersham)上に播種した。３７℃および５％Ｃ
Ｏ2に設定した組織培養インキュベーター中にスピナーフラスコを維持した。培地を２日
毎に血清レベルが検出されなくなるまで無血清培地で置き換えた。次に、収穫物を２日毎
に収集し、培地を交換した。
〔取り込みアッセイ用のＲＡＰ−ＧＡＡの精製〕
スピナーフラスコから培地中に収集したＲＡＰ−ＧＡＡを、中性ｐＨの低塩緩衝液中の
ブルーセファロースカラム(Amersham)にかけた。直線的塩勾配で画分を溶出させ、融合物
含有画分をヘパリンセファロースカラム(Amersham)に負荷し、再び直線的塩勾配で溶出さ
せた。溶出した活性含有画分をプールし、フェニルセファロースカラム(Amersham)にかけ
た。そのフェニルセファロースカラムから、塩濃度が低下するステップ勾配を使って、Ｒ
ＡＰ−ＧＡＡを溶出させた。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、染色するこ
とによって、相対的パーセント純度を決定した。ゲル解析によれば、ピーク活性画分は約
７０％純粋だった。画分をプールし、３０ｋＤ ＭＷＣＯメンブレン(Millipore)を使っ
て濃縮し、中性ｐＨのリン酸緩衝食塩水に交換した。
融合物中のリソソーム酵素の活性は、ＲＡＰへの融合による影響を受けないことを確認
した。精製ヒトＬＲＰ（１μｇ、組み換え体、結合ドメイン２）を、９６穴ドットブロッ
ト装置中のＰＶＤＦフィルター上にスポットした。５ｍＭ ＣａＣｌ2および３％脱脂粉
乳を含むｐＨ７．５のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ／Ｃａ／ＢＬＯＴＴＯ）中の精製ＲＡＰ
−リソソーム酵素融合物（ＲＡＰ−ＬＥ）を、固定化ＬＲＰに重層した。ＲＡＰ−ＬＥを
含有する調整培地、緩衝液のみおよびＲＡＰのみを、同様に固定化ＬＲＰと共にインキュ
ベートした。結合していないタンパク質を除去するためにフィルターを３回洗浄した。２
枚一組のフィルターを抗ＬＥ抗体または抗ＲＡＰ抗体でプローブした。ブロットを化学発
光検出によって呈色させた。蛍光基質を使ってリソソーム酵素の活性を測定した。図１０
に示すように、ＲＡＰに対する抗体またはリソソーム酵素に対する抗体はＬＲＰに結合し
たＲＡＰ−ＬＥを検出することが観察され、ウェスタンブロット上の融合タンパク質に結
合することがわかったので、融合タンパク質は完全であり、折りたたまれていることが示
された。シグナル強度を比較することにより、融合タンパク質は、ＲＡＰのみの場合とよ
く似た程度に、固定化ＬＲＰによって結合されることも観察される。
〔ＲＡＰ−ＧＡＡ融合物の特徴づけ〕
アイデンティティ、純度および糖質含量を決定するために、精製ＲＡＰ−ＧＡＡを調べ
た。アイデンティティ試験では、融合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分割し、ＰＶＤＦにブロ
ットし、抗ＧＡＡ抗体および抗ＲＡＰ抗体でプローブした。約１５０ｋＤの単一バンドが
両方の抗体と交差反応した（図６）。融合物純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー
ブルー染色によって決定し、＞９５％と推定された。ノイラミニダーゼで消化し、ＩＥＦ
ゲルで未消化の試料と比較することにより、複合型オリゴ糖の存在を測定した。ノイラミ
ニダーゼ消化により、複合型オリゴ糖の存在に合致する塩基性ｐＩ側への移動度の定量的
シフトが起こった（図７）。Ｅｎｄｏ Ｈ消化を使って高マンノース型オリゴ糖の存在に
ついて調べた。対照タンパク質とは異なり、Ｅｎｄｏ Ｈ消化後もＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
上で融合物の分子量の変化は観察されなかった。これは融合物上に高マンノース型オリゴ
糖が存在しないことを示唆している（図８）。
〔ＲＡＰ−ＩＤＵ融合物の精製〕
第１精製工程にはブルーセファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂を使用する。収穫し
た液体をｐＨ７．０に調節し、７０ｍＬ／ｍＬ樹脂の割合でブルーセファロースカラムに
負荷した。カラムを７５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）で平衡
化した。ＲＡＰ−ＩＤＵは１．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）
でカラムの外に溶出した。次に、溶出したＲＡＰ−ＩＤＵ含有画分（イズロニダーゼ活性
アッセイで決定）を、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｎａ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）に溶媒
交換し、ヘパリンＣＬ ６Ｂ樹脂に負荷した。そのヘパリンカラムから０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ（ｐＨ７．０）でＲＡＰ−ＩＤＵを溶出させた。次に、溶出した画分を２Ｍ ＮａＣｌ
、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）に調節し、フェニルセファロースカラムに直接
負荷した。最終工程として、ＲＡＰ−ＩＤＵをこのカラムから０．３〜０．５Ｍ ＮａＣ
ｌで溶出させた。融合物純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで＞８０％と見積られた（図９）。
［実施例３］
〔非コンジュゲートＲＡＰの脳へ取り込みおよび分布〕
マウスインサイチュー灌流モデルを使って脳へのＲＡＰの分布を測定した。ＲＡＰ、陽
性対照トランスフェリンおよび陰性対照アルブミンの分布容積（Ｖd）を５分間の灌流期
間で決定した。また、灌流した脳の血管画分および実質画分における試験タンパク質の相
対量を、毛細管消耗技術(capillary depletion technique;Gutierrez et al.,J.Neuroimm
unol.,47(2):169-76,1993)を使って決定した。図１１に示す結果には、トランスフェリン
について１μＬ／ｇ／分という観測補正Ｋinfluxが含まれている。ＲＡＰは、２．２μＬ
／ｇ／分という観測補正Ｋinfluxを持っていた。ＲＡＰは脳内に取り込まれる。
ＲＡＰが脳脈管構造を横切って実質に進入することができるかどうかを決定するために
、単一の５分時点で、別個の実験を行なった。脳は前と同様に収集したが、血管空間およ
び実質空間内のＲＡＰおよびアルブミンのレベルを決定するために、毛細管消耗処置を施
した。収集後に、単離された皮質を計量し、氷上のダウンスホモジナイザーに入れた。皮
質を、０．７ｍｌの毛細管緩衝液（１０ｍＭヘペス、１４１ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、２．８ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、１０ｍＭグ
ルコース、ｐＨ７．４）中、１０回のストロークで直ちにホモジナイズした後、１．７ｍ
ｌの２６％デキストランを加え、その混合物を、氷上でさらに３回のストロークで、さら
にホモジナイズした。様々な組織画分を分離するために、１．３ｍｌのホモジネートを超
遠心管に充填した。ホモジネートを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬＶ−１００スイングバケット
ローター中、４℃、９０００ｒｐｍ（５４００×ｇ）で、１５分間遠心分離した。次に、
実質部分（上清）および毛細管部分（ペレット）を、デュアルチャンネルガンマカウンタ
ーで個別にカウントした。Ｖd計算のために、ポストＣＮＳ灌流液の試料もカウントした
。場合によっては、脳組織への取り込みが飽和しうるかどうかを決定するために、競合剤
として非標識ＲＡＰを含めた（マウス１匹につき５μｇの非標識ＲＡＰ、標識ＲＡＰに対
して約８０倍過剰）。結果を補正Ｖdとしてプロットした（図１１）。各データポイント
は、５〜６匹のマウスから得た平均値である。図１２に、脳毛細管内皮と脳実質の間のＲ
ＡＰの分布を示す。これらの結果は、ＲＡＰが血液脳関門を横切って脳実質に進入するこ
と、そして取り込みの過程が飽和しうることを示している。
［実施例４］
〔酵素欠乏患者の線維芽細胞へのＲＡＰ−ＧＡＡの特異的取り込みの測定〕
ＧＡＡが欠乏している細胞へのＲＡＧＡの取り込みを特徴づけた。使用した細胞株はＧ
Ｍ２４４(Coriell Cell Repository)である。これはグリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ
病）を持つ患者から単離された初代細胞株である。これらの線維芽細胞はリン酸化組換え
ＧＡＡをマンノース−６−リン酸受容体によって取り込むが、ＲＡＰを結合するＬＲＰ１
受容体も持っている。様々な試験リガンドの取り込みに関与する受容体を同定するために
、過剰量の遊離ＲＡＰまたはマンノース−６−リン酸を含有する試料を調製した。
ＲＡＰ−ＧＡＡの希釈液を取り込み培地（２５ｍＭヘペス（ｐＨ７．０）、２ｍＭ Ｌ
−グルタミンおよび２５０μｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを添加したダルベッコ変法イー
グル培地）中に調製することにより、３３、１１、３．７、１．２、０．４および０．１
ｎＭの融合タンパク質濃度を得た。３ｍＭマンノース−６−リン酸、５００ｎＭ ＲＡＰ
およびこれらの２つの組合せが、５ｎＭ ＲＡＰ−ＧＡＡの取り込みに及ぼす作用もアッ
セイした。ＧＭ２４４線維芽細胞を１２穴プレートに播種し、３日間生育してから、取り
込み実験を行なった。
取り込みを開始するために、成長培地をウェルから吸引し、各試料を２つ一組のウェル
に各ウェル１ｍｌずつ分注した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベート
した。次に、試料を各ウェルから吸引し、ウェルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し
、予め温めておいた０．２５％トリプシン／０．１％ＥＤＴＡを各ウェルに３７℃で５分
間加えて、付着細胞を遊離させた。遊離した細胞をペレット化し、冷却したＰＢＳで濯い
だ。次に、予め冷却しておいた溶解緩衝液（０．１５％トリトンＸ１００を含むリン酸−
クエン酸緩衝液、ｐＨ４．０）を加え、穏やかにボルテックスすることにより、ペレット
を再懸濁した。溶解した細胞は−８０℃で保存することができた。
溶解細胞中のＧＡＡ活性のレベルを測定するために、凍結した溶解物を室温で融解した
。溶解物（５０μｌ）を、９６穴不透明マイクロタイターウェル中の２つ一組のウェルに
、直接加えた。反応を開始させるために、予め温めておいたＧＡＡ蛍光基質（４−メチル
ウンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド、１００μＬ）を各ウェルに加えた。プレ
ートを３７℃で３０分間インキュベートし、１５０μｌのグリシン／炭酸緩衝液（ｐＨ１
０）を添加することによって、反応を停止させた。蛍光を、プレートリーダーにて、励起
波長３６６ｎｍおよび放射波長４４６ｎｍで測定した。
図１３の結果は、ＲＡＰ−ＧＡＡがＧＭ２４４線維芽細胞によって取り込まれることを
示している。ＧｒａＦｉｔソフトウェアプログラムに記載されている非線形フィット酵素
アルゴリズム(SandoおよびNeufeld,Cell,12(3):619-27,1977)で決定したＫuptakeは約１
９ｎＭだった。組換えＧＡＡより約６０倍多いＲＡＰ−ＧＡＡが線維芽細胞に入り（Ｖma
x比）、１０ｎＭでは２５倍多い。加えて、ＲＡＰ−ＧＡＡ融合物取り込みの９０％は５
０ｎＭ ＲＡＰによって阻害されるが、３ｍＭマンノース−６−リン酸では取り込みの２
０％しか阻害されない。ネイティブＧＡＡの取り込みはマンノース−６−リン酸によって
ほとんど完全に阻害されることから、ＲＡＰ−ＧＡＡおよび組換えＧＡＡの代替受容体経
路が示唆される。
［実施例５］
〔様々なＬＲＰ受容体ファミリーメンバー（ＬＲＰ１Ｂ、ＬＤＬＲ、ＶＬＤＬＲ）を発現
させるＬＲＰｎｕｌｌ ＣＨＯ細胞およびＬＲＰ２（メガリン、ｇｐ３３０）だけを発現
させるＢＮ細胞へのＲＡＰ−ＧＡＡの取り込みおよびリソソーム局在の測定〕
ヨウ素標識：ヨードジェン（ＩＯＤＯ−ＧＥＮ）試薬を使って、ＲＡＰ−ＧＡＡおよび
組換えＧＡＡを125Ｉで放射標識した。
細胞を１２穴プレートに２００，０００細胞／ウェルの密度で播種し、終夜培養後に使
用した。実験当日に細胞を氷冷リガンド結合緩衝液（０．６％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含有する最少イーグル培地）中で２回濯ぎ、次に同じ緩衝液で125Ｉ−ＲＡＰ−Ｇ
ＡＡまたはＧＡＡのみを加えた（０．５ｍｌ／ウェル）。試験した初期リガンド濃度は１
０ｎＭである。結合は、受容体結合の特異性を確認するために、非標識５００ｎＭ ＲＡ
Ｐまたは１０ｍＭマンノース６−リン酸の存在下または不在下で、穏やかに揺動しながら
４℃で３０分間行なった。次に、細胞単層を氷冷結合緩衝液で３回洗浄することによって
未結合リガンドを除去した。次に、氷冷停止／ストリップ溶液（０．２Ｍ酢酸、ｐＨ２．
６、０．１Ｍ ＮａＣｌ）を温めずに一組のプレートに加え、氷上に保ってからカウント
した。得られた結合データから受容体−リガンド複合体の解離定数を決定した。次に、残
りのプレートを３７℃の水浴に入れ、内在化を開始させるために、３７℃に予め温めてお
いた０．５ｍｌのリガンド結合緩衝液をウェル単層に加えた。各時点（２分間は３０秒ご
と、その後は３分ごと）で、ウェルを氷上に置き、リガンド結合緩衝液を氷冷停止／スト
リップ溶液に置き換えた。２０分間（０．７５ｍｌで１０分間を２回）インキュベートす
ることによって細胞表面に留まっているリガンドをはぎ取り、カウントした。このデータ
から内在化速度を決定した。次に、細胞単層をＳＤＳ溶解緩衝液（６２．５ｍＭトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．２％ＳＤＳ、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中で可溶
化し、カウントした。各アッセイ後に内在化したリガンドを細胞表面に留まっているリガ
ンドに加えた和を、最大潜在内在化量として使用した。各時点後に内在化したリガンドの
割合を計算し、プロットした。
〔リガンド分解効率（内在化後のリソソームへの輸送）の測定〕
アッセイの１日前に、１２穴プレートに、細胞を２００，０００細胞／ウェルの密度で
播種した。実験当日に、ＲＡＰ−ＧＡＡまたはＧＡＡのみを含有する予め温めておいたア
ッセイ緩衝液を、非標識５００ｎＭ ＲＡＰまたは１０ｎＭマンノース−６−リン酸の存
在下または不在下で、細胞単層に加え、次に３７℃で４時間インキュベートした。インキ
ュベーション後に、細胞単層を覆っている培地を取り出し、ＢＳＡを１０ｍｇ／ｍｌにな
るように、そしてトリクロロ酢酸を最終濃度２０％になるように添加することによって、
タンパク質を沈殿させた。リガンドのリソソーム分解を、２０％トリクロロ酢酸中に可溶
な放射性断片の培地への出現と定義した。各細胞溶解物のタンパク質濃度は、ＬＲＰリガ
ンドを含有していない並行ディッシュで測定した。ＲＡＰ−ＧＡＡおよびＧＡＡ分解効率
は、分解した放射性物質（可溶性ｃｐｍ／ｍｇ細胞タンパク質）を細胞表面ＬＲＰファミ
リー受容体の数（先にフローサイトメトリーによって決定したもの、非掲載データ）で割
った値として計算した。
［実施例６］
〔酵素欠乏患者の線維芽細胞におけるＲＡＰ−ＬＥの特異的取り込みおよびそれに伴う蓄
積グリコサミノグリカンのクリアランスの測定〕
患者線維芽細胞を１２穴プレートに播種し、コンフルエントまで生育する。実験当日に
、ＭｇＳＯ4を欠き４μＣｉ／ｍＬのＮａ2 35ＳＯ4を含有する新鮮な培地を、細胞に供給
する。細胞には、５００ｎＭ ＲＡＰまたは１０ｍＭマンノース−６−リン酸の存在下ま
たは不在下で、ＲＡＰ−ＬＥ融合物またはＬＥのみも添加する。細胞を４日間毎日収集す
る。ＰＢＳで濯いだ後、細胞を凍結融解法で溶解する。蓄積ＧＡＧを８０％エタノールに
よる沈殿でアッセイし、シンチレーション計数によって定量する。蓄積ＧＡＧ値を細胞溶
解物のタンパク質含量に対して標準化する。
［実施例７］
〔ＧＡＡ欠損マウスにおける静脈内投与されたＲＡＰ−ＧＡＡのリソソーム分布および蓄
積物クリアランスの測定〕
ＧＡＡノックアウトマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６バックグランド）を４つの処置群にランダ
ムに割り当て、静脈内尾静脈注射により、２日ごとに１００μｌのリン酸緩衝食塩水、１
．３ｍｇ／ｋｇまたは０．３３ｍｇ／ｋｇ ＲＡＰ−ＧＡＡ融合タンパク質で４回処置し
た。４回目の注射の４８時間後にマウスを二酸化炭素吸入によって安楽死させ、脳、心臓
、横隔膜、上半身および下半身骨格筋ならびに肝臓を直ちに収集し、急速冷凍した。３匹
の年齢一致野生型マウスも安楽死させ、組織を収集し、凍結した。各組織を、ＯＣＴブロ
ックに包埋することによってＧＡＡ免疫組織化学染色用に調製し、グルタルアルデヒドで
固定しパラフィンに包埋することによってグリコーゲン染色用に調製した。残りの組織は
、実施例４に記載の蛍光基質アッセイを使って、ＧＡＡ活性について試験した。屠殺時に
血清を集め、ＧＡＡ抗体について調べた。
（投与計画）
Figure 2011207889
［実施例８］
〔ＭＰＳ−Ｉ障害を持つ患者の処置〕
ＲＡＰに連結された治療酵素を含むコンジュゲート薬剤を含んでいる薬学的組成物を静
脈内投与する。その液体の最終剤形はコンジュゲート薬剤、生理食塩水、ｐＨ５．８のリ
ン酸緩衝液および１ｍｇ／ｍｌのヒトアルブミンを含む。これらは生理食塩水バッグ中で
調製される。
好ましい組成物は、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬまたは１ｍＬあたり１２，５００〜５
０，０００単位の量のコンジュゲート薬剤（ＲＡＰに連結された治療酵素）、塩化ナトリ
ウム溶液１５０ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液１０〜５０ｍＭ（ｐＨ５．８）、ヒトアル
ブミン１ｍｇ／ｍＬを含む。この組成物は５０〜２５０ｍｌの静注バッグ内に存在しうる
。
この研究には、リソソーム酵素の欠乏という臨床表現型を呈するヒト患者、例えば白血
球および線維芽細胞中のアルファ−Ｌ−イズロニダーゼレベルが正常値の１％未満である
ＭＰＳ Ｉ患者などを含める。全ての患者はグリコサミノグリカンの内臓および軟組織蓄
積を示す何らかの臨床的証拠を呈し、様々な機能障害度を持つ。効力は、経時的な尿中Ｇ
ＡＧ排泄の減少率を測定することによって決定される。ＭＰＳ−Ｉ患者における尿中ＧＡ
Ｇレベルを正常排泄値と比較する。無処置ＭＰＳ−Ｉ患者では尿中ＧＡＧ値が広範囲にわ
たる。コンジュゲート薬剤による治療に続いて起こる非分解ＧＡＧの排泄の５０％を越え
る減少は、治療に対する個体の応答を判定する妥当な手段である。例えばＭＰＳ Ｉ患者
において治療前および治療後に白血球イズロニダーゼ活性および口腔イズロニダーゼ活性
を測定することにより、データを収集する。肝臓サイズおよび脾臓サイズの臨床的評価を
行なう。なぜなら、これがＭＰＳ−Ｉ患者の骨髄移植処置の成功を評価するための最も広
く受け入れられている手段だからである(Hoogerbrugge et al.,Lancet 345:1398,1995)。
［実施例９］
〔対応するＲＡＰ−ＬＥコンジュゲートで処置することできるリソソーム蓄積症〕
本発明の方法を使って処置または防止することができる疾患は：ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ
Ｉ）、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、異染性白質ジストロフィ
ー（ＭＬＤ）、クラッベ病、ポンペ病、セロイドリポフスチノーシス、テイ・サックス病
、ニーマン・ピック病ＡおよびＢ、ならびに他のリソソーム疾患である。各疾患について
、コンジュゲート薬剤は特定の化合物または酵素を含むだろう。ＭＰＳ Ｉに関わる方法
では、好ましい化合物または酵素はα−Ｌ−イズロニダーゼである。ＭＰＳ ＩＩに関わ
る方法では、好ましい化合物または酵素はイズロン酸−２−スルファターゼである。ＭＰ
Ｓ ＩＩＩＡに関わる方法では、好ましい化合物または酵素はヘパランＮ−スルファター
ゼである。ＭＰＳ ＩＩＩＢに関わる方法では、好ましい化合物または酵素はα−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼである。異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）に関わる方法で
は、好ましい化合物または酵素はアリールスルファターゼＡである。クラッベ病に関わる
方法では、好ましい化合物または酵素はガラクトシルセラミダーゼである。ポンペ病に関
わる方法では、好ましい化合物または酵素は酸性α−グリコシダーゼである。ＣＬＮに関
わる方法では、好ましい化合物または酵素はトリペプチジルペプチダーゼである。テイ・
サックス病に関わる方法では、好ましい化合物または酵素はヘキソサミニダーゼ・アルフ
ァである。ニーマン・ピック病ＡおよびＢに関わる方法では、好ましい化合物または酵素
は酸性スフィンゴミエリナーゼである。
［実施例１０］
〔ＲＡＰとα−Ｌ−イズロニダーゼまたは酸性αグルコシダーゼとの融合物の受容体結合
、細胞取り込みおよびリソソーム送達のさらなる例証〕
本実施例では、ＲＡＰを送達ビヒクルとして使用することによる治療酵素の効率的なＬ
ＲＰ受容体結合、細胞取り込みおよびリソソーム送達を実証する追加データを提供する。
（融合物発現コンストラクト）
アミノ酸３５〜３５３を含むヒトＲＡＰコード配列を、ヒト肝臓ｃＤＮＡから、Ｐｆｕ
Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ(Stratagene)ならびにプライマーＲＡＰＦ ５’−ＧＣＧＡＴＡ
ＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＣＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＣＣ
ＣＧＡ−３’（配列番号１２）およびＲＡＰＲ ５’−ＧＣＧＡＴＡＡＡＣＣＧＧＴＴＴ
ＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＴＣ
ＣＴ−３’（配列番号１３）を使って増幅した。この断片はシグナルペプチドまたはＨＮ
ＥＬ ＥＲ保持シグナルをコードする配列を含まない。５’−ＲＡＰプライマーにはイン
フレームＢａｍＨＩ部位が５’末端に組み込まれている。３’−ＲＡＰプライマーは、イ
ンフレームＡｇｅＩ部位を３’末端に含んでいる６アミノ酸スペーサー（ＡＥＡＥＴＧ；
配列番号２９）をコードする配列を付加する。この改変ＲＡＰ配列を、ヒトα−Ｌ−イズ
ロニダーゼ（アミノ酸２７〜６５２）またはヒトアルファ−グルコシダーゼ（アミノ酸７
０〜９５２）とのインフレーム融合物としてベクターｐＣ３Ｂ中にクローニングした。ど
ちらのリソソーム酵素配列も、シグナルペプチドを除去し、インフレームＡｇｅＩ部位を
付加するために、５’部分を改変した。この発現ベクターはｐＣＤＮＡ３．１（＋）(Inv
itrogen)に由来し、ウサギベータ−アクチンＩＶＳ２、ラットプレプロインスリン転写物
リーダー配列、およびインフレームＢａｍＨＩで終わるヒトメラノトランスフェリンの最
初の１８アミノ酸（シグナルペプチド）を含んでいる。
プラスミドベクターをＡｃｌＩで直線化し、標準的なプロトコールを使ってＣＨＯ−Ｋ
１ ＬＲＰ-（ＣＨＯｄＬ）にトランスフェクトした。８００μＬ／ｍＬ Ｇ４１８を含
有する培地での限界希釈によってクローンを選択した。各リソソーム酵素の蛍光単糖基質
を使って、発現についてクローンをスクリーニングした。ＲＡＰ−ＩＤＵを発現するクロ
ーン（ＣＨＯｄＬ−ＲＩ７）およびＲＡＰ−ＧＡＡを発現するクローン（ＣＨＯｄＬ−Ｒ
Ｇ２０）を、さらなる研究のために選択した。
（融合物の発現）
ＣＨＯｄＬ−ＲＩ７およびＣＨＯｄＬ−ＲＧ２０を、Ｔフラスコ中、２．５％ウシ胎仔
血清を添加した無タンパク質培地で培養した。産生は、ｐＨ、酸素および温度制御した３
Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中、血清の不在下で行なった。産生期は細胞をＣ
ｙｔｏｐｏｒｅ １ビーズ(Amersham)上で生育した。灌流中は内部セトラー(Biotechnolo
gy Solutions)を使ってマイクロキャリアを保持した。バイオリアクター灌流速度は、残
存グルコースを監視することによって決定した。
（ＲＡＰ融合物の精製および特異的活性）
ＳａｒｔｏＰｏｒｅ １．２デプスフィルターに通し、次に滅菌のために０．２μｍＰ
ＥＳメンブレンフィルターを通すことによって、ＲＡＰ−ＩＤＵ細胞培養培地を清澄化し
た。その滅菌清澄化培地をｐＨ調節した後、ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ(Amersham)
、フェニルセファロースＨＰ(Amersham)およびＳＰセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ(Ame
rsham)で順次、分割した。酵素活性画分をプールし、濃縮し、必要な場合は、次の工程の
ために５０ｋＤａミニＴＦＦメンブレン(Vivascience)を使って緩衝液交換した。最終緩
衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）、１５０ｍＭ塩化ナトリウムとした。Ｄ
ＥＡＥ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ(Amersham)の非結合通過を行なって、または行なわずに、Ｒ
ＡＰ−ＧＡＡを精製した。次に、ＲＡＰ−ＧＡＡ融合物をヘパリンセファロースＣＬ−６
Ｂ(Amersham)およびフェニルセファロースＨＰ(Amersham)で順次、分割した。工程内溶出
物および最終溶出物を、ＲＡＰ−ＩＤＵについて説明したように処理した。
（酵素活性アッセイ）
公表された方法を９６穴プレートに適合させたものを使って、小さい蛍光原単糖基質の
加水分解により、酵素活性を測定した。ＲＡＰ−ＩＤＵ活性の場合は、基質４−メチルウ
ンベリフェリルイズロニド（４−ＭＵＩ）を２．５ｍＭの濃度で使用した。ＲＡＰ−ＧＡ
Ａ活性の場合は、基質４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシドを５．４
ｍＭの濃度で使用した。活性単位は３７℃で１分あたりに加水分解される基質のマイクロ
モル数と定義する。
（ＦＡＣＥによるオリゴ糖の特徴づけ）
ＦＡＣＥ解析は、基本的に既に記述されているとおりに行なった(Starr et al.,J.Chro
matogr.A.,720(1-2):295-321,1996、Hague et al.,Electrophoresis,19(15):2612-20)。
簡単に述べると、タンパク質を変性させ、Ｎ結合型オリゴ糖を遊離させるために、Ｎ−グ
リカナーゼで処理した。次に、単離したオリゴ糖を、還元的アミノ化により、アミノナフ
タレン−６−スルホンで蛍光標識し、ポリアクリアミドゲルで分割し、蛍光検出した。バ
ンドのアイデンティティは、移動度を既知標準品と比較して測定することによって推断し
た。必要な場合は、オリゴ糖のアイデンティティを、特異的エキソグリコシダーゼによる
消化後の追加ＦＡＣＥ解析によって確認した。
（ＩＥＦによるシアリル化の特徴づけ）
精製融合物を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中、３７℃で１時間、クロス
トリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)ノイラミニダーゼ(Sigma)で
処理した。処理した試料および未処理の対照をｐＨ３〜９勾配ゲルでのＩＥＦによって解
析した(Amersham Phastgel System)。
（インビトロでのリソソームプロテアーゼによる融合物の分解）
リソソームプロテアーゼカテプシンＢ、ＤおよびＬをCalbiochemから購入し、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ５）に再懸濁し、凍結保存した。消化には、各融合物０．５μｇ
を上記カテプシンの等モル混合物（それぞれ最終濃度約３００μＭ）１０ｎｇと共に、１
００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ４．５
中、３７℃で１時間インキュベートした。２％ＳＤＳを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料ロ
ーディング緩衝液で反応を停止させ、９５℃で５分間加熱した。試料をＮｕ−ＰＡＧＥ
４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分割し、クーマシーブルーで染色した。
（ｓＬＲＰ２の発現および精製）
先に記述されているとおり(BuおよびRennke,J.Biol.Chem.,271(36):22218-24 1996)。
（ヒトリソソーム酵素の発現）
ヒトアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（アルドラザイム）はBioMarin Pharmaceuticalお
よびGenzyme Therapeuticsの厚意で譲り受けた。ヒトリソソームアルファ−グルコシダー
ゼは、独自の方法を使って発現させ、精製した。精製酵素は純度が９５％より高く、タン
パク質１分子につき少なくとも１つのビスリン酸化オリゴマンノース構造を持っている（
ＦＡＣＥ解析およびマンノース−６−リン酸受容体カラムでの保持に基づく、未公表結果
）。
（リガンドブロット）
ＰＶＤＦメンブレン(Millipore)をメタノールで予め湿らせておき、ＰＢＳ（１１．９
ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ７．
４）中で平衡化した。次に、メンブレンをＢｉｏ−Ｒａｄドットブロット装置にマウント
した。ＬＲＰ１の第２リガンド結合ドメイン（ｓＬＲＰ２、１μｇ／ウェル）を真空濾過
によってメンブレンに適用した。次に、そのメンブレンを細断し、それらを２４穴プレー
トの別々のウェルに入れた。メンブレンを、ＴＢＳ（２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１
５０ｍＭ塩化ナトリウム）中、５ｍＭ塩化カルシウムおよび３％脱脂粉乳で３０分間ブロ
ックした。リガンドを各メンブレンスポットと共に室温で２時間インキュベートした。個
々のブロットをブロッキング緩衝液で２回、それぞれ５分間洗浄した後、結合を検出する
ために、ブロック緩衝液中の様々な抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。
（細胞への取り込み）
ヒト線維芽細胞はCoriel Cell Repositoryから入手した。ラットＣ６膠芽腫細胞および
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞はAmerican Type Culture Collectionから入手した。通例、取
り込みは、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．０）および０．５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを
含有する無血清培地中で行なった。適当な試験タンパク質および阻害剤を同じ培地に希釈
し、細胞と共に様々な期間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで濯ぎ、トリプシン処
理した。低速遠心分離によってペレットを収集し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％トリトンＸ
１００の存在下に−８０℃で凍結することによって溶解した。溶解物を遠心分離によって
清澄化した。可溶性溶解物画分を酵素活性についてアッセイすると共に、ビシンコン酸(b
icinchonic acid)法を使って総タンパク質量についてアッセイした。
（ＲＡＰ−ｉｄｕ融合物によって媒介されるヒトハーラー線維芽細胞におけるグリコサミ
ノグリカンクリアランス）
ヒトＧＭ−０１３９１ハーラー線維芽細胞をCoriell Cell Repositoryから入手し、Ｄ
ＭＥＭ １０％ウシ胎仔血清および２ｍＭグルタミン中で生育した。クリアランス実験の
４日前に、６穴プレートに１ウェルあたり２５０，０００細胞の割合で細胞を播種した。
実験当日に細胞に硫酸非含有培地（Ｓ−ＭＥＭ、Irvine Scientific）、１５％透析ウシ
胎仔血清、５ｍＭ塩化カルシウム、１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸ナトリウムを１時間供給し
た後、４μＣｉ／ｍＬ ３５Ｓ−硫酸ナトリウムおよび５ｎＭのＲＡＰ−ｉｄｕまたはイ
ズロニダーゼのみを含む同じものを供給した。細胞を、５％ＣＯ2／９５％空気の湿潤細
胞培養インキュベーター中、３７℃で４８時間にわたって、この培地でインキュベートし
た。トリプシン処理の前後に細胞層をＰＢＳで３回濯いだ。ペレットを０．５Ｎ水酸化ナ
トリウム中で溶解し、１Ｈ塩酸で中和した。タンパク質濃度はＢｉｏＲａｄプロテインア
ッセイにより９６穴プレートで決定した。溶解物をBeckman Ready Capsでカウントした。
〔結果〕
（融合物の発現および特徴づけ）
ＲＡＰコード配列がリソソーム酵素コード配列のＮ末端側に位置するように、ＲＡＰ融
合物を構成した。この配列の順序は、ＲＡＰがＧＳＴのＣ末端側に位置するＧＳＴ−ＲＡ
Ｐ融合物が、ＲＡＰのみの場合と比較して、ＬＲＰに対して１０分の１までの低い親和性
を持つことを示す、先に公表された研究に基づいた(Warshawsky et al.,J Clin Invest 9
2,937-944,1993)。ＲＡＰ融合物の製造にはＣＨＯ−Ｋ１突然変異体（ＣＨＯｄＬ）を選
択した(FitzGerald et al.,J.Biol.Chem.,129,1533-1541,1995)。ＣＨＯｄＬはＬＲＰ受
容体を何も発現させず、過剰発現細胞株による分泌タンパク質の再取り込みおよび分解を
防ぐ。ＲＡＰとＩＤＵ（ＲＡＰ−ＩＤＵ）およびＧＡＡ（ＲＡＰ−ＧＡＡ）との融合物を
、この系で発現させた。各融合物のクローンを細胞培養培地中の酵素活性に基づいて選択
し、バイオリアクターでの製造にスケールアップした。容積生産性値を精製ｒｈＩＤＵま
たはｒｈＧＡＡの活性濃度（Ｕ／Ｌ）および比活性（Ｕ／ｍｇ）から計算した。この方法
で計算したところ、平均一日リアクター生産性は、ＲＡＰ−ＩＤＵの場合で１〜２ｍｇ／
Ｌ−日、ＲＡＰ−ＧＡＡの場合で１０〜１５ｍｇ／Ｌ−日だった。
（融合物の精製および特徴づけ）
融合物を通常の樹脂を使って＞９５％に精製した（図１９Ａ、レーン１）。抗ＲＡＰ抗
体（図１９Ａ、レーン２）および抗ＩＤＵまたは抗ＧＡＡ抗体（図１９Ａ、レーン３）は
、調整細胞培養培地のウェスタンブロットで、各融合物の分子量と合致するバンドを同時
染色した。融合物は、調整培地中では安定であるが、精製中はタンパク質分解切断事象に
対して感受性であり、それが両融合タンパク質のＮ末端からのＲＡＰの除去をもたらすこ
とが観察された。タンパク質分解は精製に先だって調整培地にプロテアーゼ阻害剤を添加
することによって軽減された。
精製融合物のモル比活性は、酵素活性濃度（Ｕ／ｍＬ）を融合物のタンパク質濃度（ｎ
ｍｏｌ／ｍＬ）で割ることによって計算した。融合物濃度はＡ280測定と理論吸光係数か
ら計算した（表Ａ）。
Figure 2011207889
ＲＡＰ−ＩＤＵは５．７Ｕ／ｎｍｏｌのモル比活性を持っていたが、ｒｈＩＤＵは１２
．５Ｕ／ｎｍｏｌのモル比活性を持っていた。ＲＡＰ−ＩＤＵとｒｈＩＤＵのモル比活性
がかなり相違することから、融合物ではＲＡＰが何らかの形でＩＤＵの触媒活性を妨害し
ていることが示唆される。融合タンパク質における活性の減少には、活性部位へのアクセ
スの制限、ＩＤＵのフォールディングの変化、または触媒に関与するタンパク質の運動に
影響を及ぼす他のコンフォメーション上の制約が関わりうる。ｒｈＩＤＵとＲＡＰ−ＩＤ
Ｕとの触媒的相違に関してさらなる洞察を得るために、４−ＭＵＩの切断の速度論的パラ
メータを測定した（図１９Ｂ）。これら２つのタンパク質のＫm値は区別できなかったが
、ｒｈＩＤＵのＶmaxはＲＡＰ−ＩＤＵを２５％上回っていた。この差は、融合物では、
活性部位へのアクセスの制限ではなく、ＩＤＵの運動に何らかの制約が課せられることと
一致する。ＲＡＰ−ＧＡＡおよびｒｈＧＡＡはほぼ同じモル比活性を持つことがわかった
。
（リソソームプロテアーゼによるＲＡＰ融合物の消化）
リソソームにおける融合物の挙動をシミュレートするために、ＲＡＰ−ＩＤＵおよびＲ
ＡＰ−ＧＡＡの調製物をカテプシンＤ、ＢおよびＬの混合物と共に、ｐＨ４．５、３７℃
で１時間インキュベートした。消化されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。Ｒ
ＡＰはこれらの条件下で分解されて、完全なリソソーム酵素を残した（図１９Ｃ、レーン
２および５）。上記２つの融合タンパク質のそれぞれについて、残っている主要バンドは
、ｒｈＩＤＵおよびｒｈＧＡＡよりもわずかに大きかった。追加質量は一部のＲＡＰまた
はリンカー配列が処理後に残ることを示している可能性がある。Ｎ末端配列決定およびペ
プチドマッピングにより、切断はＲＡＰおよびリンカー配列の最後の２０アミノ酸内にあ
る複数部位で起こることが示される。消化物の単位容積あたりのＧＡＡ活性は、インビト
ロタンパク質分解によって有意な影響を受けなかった。この結果は、ＲＡＰ−ＧＡＡおよ
びｒｈＧＡＡのモル比活性が類似していることと合致する。消化物の単位容積あたりのＩ
ＤＵ活性は、融合物のインビトロ加水分解後に２６％増加したことから、ｒｈＩＤＵとの
比較で、遊離したＩＤＵ部分の酵素活性の部分的な回復が示唆された。リソソームに送達
された後の融合物由来のＩＤＵの比活性は決定していない。
（ＲＡＰ融合オリゴ糖の特徴づけ）
オリゴ糖受容体がリソソーム酵素の取り込みにインビボで果たす重要な役割を考慮して
、ＲＡＰ融合物上に存在するオリゴ糖のアイデンティティおよびタイプを決定した。まず
、精製融合物をＦＡＣＥ解析にかけて、リン酸化オリゴ糖のレベルをネイティブリソソー
ム酵素と比較して測定した（図２０Ａ）。リン酸化オリゴ糖は、ＦＡＣＥゲルでのそれら
の特徴的な移動度によって、容易に同定される。ｒｈＩＤＵとｒｈＧＡＡはどちらも、か
なりの量のビスリン酸化オリゴマンノース７（ビス−７（Ｂｉｓ−７））（これはＭＰＲ
によって強固に結合される構造である）を持っている(Zhao et al.,J Biol Chem 272,227
58-22765,1997;図20A、レーン2、矢印)。各オリゴ糖バンドを蛍光強度によって定量した
。ビス−７はｒｈＩＤＵおよびｒｈＧＡＡ上の全オリゴヌクレオチドのそれぞれ３０％お
よび２０％を占めていた。どちらの場合も、これらのパーセンテージは、各酵素分子に対
して１〜２分子のビス−７に合致する。ｒｈＩＤＵおよびＲＡＰ−ＩＤＵのオリゴ糖プロ
ファイルはその他の点では類似しているが、融合物は酵素のみの場合と比較してＢｉｓ−
７保持量が６０％少ない（図２０Ｂ、レーン３）。この値はＲＡＰ−ＩＤＵ融合物３分子
につきおよそ１分子のＢｉｓ−７に相当する。ｒｈＧＡＡおよびＲＡＰ−ＧＡＡのオリゴ
糖プロファイルも類似しているが（図２０Ａ、レーン２および３を比較されたい）、ＲＡ
Ｐ−ＩＤＵとは異なり、リン酸化オリゴ糖はＲＡＰ−ＧＡＡ融合物上に有意な量では見い
だされなかった。
シアル酸を末端に持つ複合型オリゴ糖について調べるために、ＲＡＰ−ＧＡＡ融合物を
ノイラミニダーゼによる処理後にＩＥＦ解析にかけた。融合物はより塩基性の等電点にシ
フトしたことから、ＲＡＰ−ＧＡＡがシアリル化された複合型オリゴ糖を含有することを
示す証拠が得られた（図２０Ｂ、レーン１および２を比較されたい）。陽性対照ｒｈＩＤ
Ｕをノイラミニダーゼで処理すると、同様のシフトを起こした（図２０Ｂレーン３および
４を比較されたい）。
融合物はサイズが大きいので、オリゴ糖の質量および含量をグリコシダーゼによる消化
で解析することは難しかった。タンパク質成分のサイズを小さくするために、ＲＡＰ−Ｉ
ＤＵおよびＲＡＰ−ＧＡＡの試料をカテプシンで消化した。次に、タンパク質分解した融
合物をさらにＥｎｄｏ ＨまたはＮ−グリカナーゼで消化することにより、それぞれ高マ
ンノース型オリゴ糖および全オリゴ糖を遊離させた。この実験は融合物のＲＡＰ部分のオ
リゴ糖含量を扱うものではない。というのも、これはカテプシンタンパク質分解時に失わ
れるからである。ＲＡＰは糖鎖付加部位を１つ持っている。タンパク質分解されたＲＡＰ
−ＧＡＡのＥｎｄｏ Ｈ消化は、バンド移動度にほとんど影響を持たなかったことから、
融合物のＧＡＡ部分上の高マンノース型または混成型オリゴ糖はごくわずかであることが
示された（図２０Ｃ、レーン３および４を比較されたい）。タンパク質分解したＲＡＰ−
ＧＡＡをＮ−グリカナーゼで消化すると、１７ｋＤのバンドシフトが起こった。この結果
と等電点電気泳動実験とは、両者がＲＡＰ−ＧＡＡ融合物上の高レベルの複合型オリゴ糖
を示す点で合致している。ＲＡＰ−ＧＡＡとは対照的に、タンパク質分解したＲＡＰ−Ｉ
ＤＵのＥｎｄｏ Ｈ消化は著しいバンドシフトをもたらした。これは、融合物由来のＩＤ
Ｕ上に高マンノース型または混成型オリゴ糖が存在することと合致する（図２０Ｃレーン
７および８を比較されたい）。この実験に使用したＲＡＰ−ＩＤＵ試料は、精製時に既に
部分的にタンパク質分解されていた。質量でいうと、ｅｎｄｏ ＨによるＩＤＵの消化時
に起こる損失は、Ｎ−グリカナーゼによる消化時に観察される全損失量の大半を占める（
図２０Ｃレーン９）。
（リガンドブロッティング）
ヒトＬＲＰ１の第２リガンド結合ドメイン全体である組換え体ｓＬＲＰ２をナイロンメ
ンブレンフィルター上にスポットした（図２１）。ブロッキング後に、個々のフィルター
を結合緩衝液中でＲＡＰ（列Ｂ）、ＲＡＰ−ＩＤＵ（列Ｃ）またはｒｈＩＤＵ（列Ｄ）と
共にインキュベートした。フィルターを洗浄し、抗ＲＡＰ（行１）または抗ＩＤＵ抗体（
行２）でプローブした。シグナル強度から判断して、これらの条件下でＲＡＰ−ＩＤＵは
ＲＡＰのみの場合と同様に受容体断片に結合した（列ＢおよびＣ、行１）。ＲＡＰおよび
ＲＡＰ−ＩＤＵの結合は、過剰の非放射性ＲＡＰによってブロックすることができた（列
Ｃ、行３）。組換えヒトＩＤＵはｓＬＲＰ２に結合しなかった（列Ｄ）。これらの結果は
、ＲＡＰ−ＩＤＵ融合物内のＲＡＰ部分がＬＲＰに特異的に結合する能力を保っているこ
とを実証している。
（患者線維芽細胞へのＲＡＰ融合物の取り込み）
ＲＡＰ融合物が培養細胞に取り込まれうるかどうかを決定するために、ハーラー病患者
（ＩＤＵ欠損性、ＧＭ１３９１）またはポンペ病患者（ＧＡＡ欠損性、ＧＭ２４４）から
単離した初代ヒト線維芽細胞にＲＡＰ−ＩＤＵ、ＲＡＰ−ＧＡＡ、ｒｈＩＤＵまたはｒｈ
ＧＡＡを加えた。取り込み実験用の試験タンパク質濃度をＡ280測定および理論吸光係数
から計算した。取り込ませるための１〜２時間の期間後に、細胞を収集し、溶解し、リソ
ソーム酵素活性についてアッセイした。取り込みシグナルは、溶解物の単位容積あたりの
切断された蛍光基質の単位数として報告する。各ウェルで同数の細胞を使用した。そして
各試料中の総タンパク質量に対する活性データの標準化は結果を変化させなかった。曲線
を双曲線関数に当てはめ、GraphFit(Erithacus Software)を使って取り込みパラメータを
求めた。双曲線漸近値をここでは最大取り込み能と定義する。半最大取り込みをもたらす
融合物または酵素の濃度を、以前と同様に、Ｋuptakeと定義する(SandoおよびNeufeld,Ce
ll,12(3):619-27,1977)。
培養線維芽細胞が取り込む量は、酵素のみの場合よりもＲＡＰ融合物の方が有意に多い
ことがわかった（図２２Ａ、Ｂおよび表Ｂ）。この相違は、融合物および酵素の濃度が高
くなると、より一層顕著になった。特に、ハーラー線維芽細胞では、ｒｈＩＤＵの方が２
５倍有利なＫuptakeを持つにもかかわらず、融合物に関する最大取り込み能は、ＲＡＰ−
ＩＤＵの場合、遊離の酵素のそれを４３倍上回った。ＲＡＰ−ＩＤＵ融合物の比活性はｒ
ｈＩＤＵの約半分なので、この実験では融合物の取り込みを過小評価しているといえる。
ポンペ線維芽細胞では、ｒｈＧＡＡの方が２５倍有利なＫuptakeを持つにもかかわらず、
ＲＡＰ−ＧＡＡに関する最大取り込み能は、ｒｈＧＡＡのそれを７０倍上回った（図２２
Ｂ）。
Figure 2011207889
ＲＡＰ−ＩＤＵおよびＲＡＰ−ＧＡＡの線維芽細胞への取り込みが受容体特異的である
かどうかを決定するために、ＬＲＰ（ＲＡＰ）およびＭＰＲ（マンノース６リン酸）系の
阻害剤を培養培地に含めた。過剰量のＲＡＰは線維細胞におけるＲＡＰ−ＩＤＵおよびＲ
ＡＰ−ＧＡＡの取り込みを有意に阻害した（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）。逆に過剰量のマ
ンノース６リン酸は同じ細胞へのＲＡＰ−ＧＡＡの取り込みに対してごくわずかな作用し
かもたなかった（図２２Ｄ）。
次に、脳細胞株ラットＣ６神経膠腫細胞（図２２Ｅ）および筋細胞株マウスＣ２Ｃ１２
筋芽細胞（図２２Ｆ）を使って同様の実験を行なった。５ｎＭ濃度では、Ｃ６神経膠腫細
胞へのＲＡＰ−ＧＡＡの取り込みはｒｈＧＡＡよりも７倍を越えて高効率だった。同じ条
件下で、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞では、ＲＡＰ−ＧＡＡの取り込みがｒｈＧＡＡよりも１８倍
を超えて高効率だった。線維芽細胞の場合と同様に、どちらの細胞株へのＲＡＰ−ＧＡＡ
の取り込みも、ＲＡＰによって阻害されたが、マンノース６−リン酸では阻害されなかっ
た。これらの結果は、融合物が培養細胞によって効率よくエンドサイトーシスされたこと
、そしてエンドサイトーシスがＬＲＰによって起こったことを示している。ＭＰＲ系およ
びＬＲＰ系の相対的取り込み効率は、各特定細胞タイプ上の各受容体の相対密度に依存す
るだろう。
様々なＬＲＰ受容体によるＲＡＰ−ＧＡＡの取り込み−取り込みが特異的ＬＲＰ受容体
によって媒介されうるかどうかを決定するために、ＲＡＰ−ＧＡＡを放射性ヨウ素化し、
様々なＬＤＬＲファミリーメンバーを発現させる一群の組換えＣＨＯｄＬ株と共にインキ
ュベートした。ブラウンノルウェイラット卵黄嚢細胞（ＢＮ）をメガリン用の試験株とし
て使用した。ＬＲＰ１およびＬＲＰ１Ｂは、完全長タンパク質のＣ末端側３分の１ぐらい
を含むミニ受容体によって表した。これはＲＡＰの高親和性結合を媒介する能力を持つ第
４リガンド結合ドメインを含んでいる。また、これらのミニ受容体は、完全な細胞質テー
ルも持ち、完全長受容体の輸送挙動を忠実に再現することが、既に示されている(Li et a
l.,J.Biol.Chem.,276,18000-18006,2001、Obermoeller-McCormick et al.,J Cell Sci 11
4,899-908,2001)。融合物の取り込みは、細胞培養培地における可溶性カウントの出現を
測定することによって決定した。可溶性カウントは取り込み、リソソーム送達、分解およ
び細胞からの標識アミノ酸の放出を反映することは、既に実証されている(Iadonato et a
l.,Biochem J 296(Pt 3),867-875,1993)。ＬＲＰ受容体特異的な取り込みは、過剰量の非
放射性ＲＡＰ競合剤の存在下で得られるシグナルを差し引くことによって計算した（図２
３）。ＲＡＰ−ＧＡＡは、メガリン、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＶＬＤＬＲおよびａｐｏＥ
Ｒ２を発現させる細胞によって特異的に取り込まれ、分解されたが、ＬＤＬＲを発現させ
る細胞または空ベクターを含有する細胞では、これが起こらなかった。これらの知見は、
ＬＤＬＲがＬＤＬＲファミリーの他のメンバーと比較するとかなり低い親和性でＲＡＰに
結合する(Kd≒250nM、Medh et al.,J Biol Chem 270,536-540)という事実と合致している
。この実験は、ＲＡＰの結合挙動がＲＡＰ融合物の結合挙動の予言に役立つことを裏付け
ている。同様に、ＲＡＰによる阻害が可能な可溶性カウントの生成は、ＲＡＰ−ＧＡＡが
様々なＬＲＰ受容体によってエンドサイトーシスされ、リソソームにターゲティングされ
ることを示している。
（ＲＡＰ−ＧＡＡの細胞内半減期）
ＲＡＰ送達されたリソソーム酵素のリソソームにおける安定性を調べるために、ＲＡＰ
−ＧＡＡまたはｒｈＧＡＡをポンペ病患者線維芽細胞（ＧＭ２４４）と共に多穴プレート
中で２４時間インキュベートし、試験タンパク質を欠く成長培地に移した後、２週間にわ
たって細胞を収集した。次に、細胞溶解物をＧＡＡ活性についてアッセイした。融合物由
来のＧＡＡおよびｒｈＧＡＡは、それぞれ約１２日および１０日という、ほぼ同一の細胞
内半減期を持っていた（図２４）。ＧＡＡは中性ｐＨでは時間単位で測定される半減期を
持つので、ｒｈＧＡＡおよび融合物ＧＡＡの複数日という半減期は、両者がエンドサイト
ーシス後に酸性コンパートメントに、おそらくはリソソームに送達されることを暗示して
いる。リソソームへのリン酸化ｒｈＧＡＡの送達は文献に詳述されており、ｒｈＧＡＡに
よるＥＲＴの根拠になっている(Van der Ploeg et al.,J Clin Invest 87,513-518,1991
、Yang et al.,Pediatr Res 43,374-380,1998)。ＲＡＰへの融合の結果としてＧＡＡに課
せられた変化はいずれも、リソソームにおけるこの酵素の安定性には影響しないようであ
る。
ＲＡＰ−ＩＤＵによるリソソーム蓄積物のクリアランス−融合物由来のＩＤＵがインビ
トロで持つ減弱化した酵素活性を考慮して、ＲＡＰ−ＩＤＵが患者線維芽細胞におけるグ
リコサミノグリカンの蓄積を防止できるかどうかを決定するための実験を行なった。ハー
ラー線維芽細胞を硫酸非含有培地（Ｓ−ＭＥＭ）中、35Ｓ−硫酸塩の存在下で生育した(B
artonおよびNeufeld,J Biol Chem 246,7773-7779,1971)。ＲＡＰ−ＩＤＵ、ｒｈＩＤＵま
たは緩衝液を５ｎＭの濃度で成長培地に含めた。ＲＡＰ−ＩＤＵおよびｒｈＩＤＵ試験材
料の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図２５Ｂ（挿入図））。蓄積された35Ｓ−グ
リコサミノグリカンを４８時間後に測定し、総タンパク質濃度に対して標準化した。試料
あたりの総放射能は４，０００〜２０，０００ｃｐｍの範囲にあり、総タンパク質濃度は
試料間で著しくは異ならなかった。ＲＡＰ−ＩＤＵおよびＩＤＵはどちらも35Ｓ−ＧＡＧ
蓄積を同じ程度に防止したことから、融合物由来のＩＤＵは天然基質を消化する能力を持
つことが示された。
［実施例１１］
〔メガリンは血液脳関門を横切るトランスサイトーシスを媒介する〕
本実施例では、トランスサイトーシスのモデル系としてトランズウェルプレート中の強
固なＭＤＣＫ細胞単層を使って行なった実験を説明する。このモデルは、ＬＲＰ１ではな
くメガリンがＲＡＰのトランスサイトーシスを媒介することを実証するために用いた。Ｍ
ＤＣＫ細胞には、ＬＲＰ１の第４リガンド結合ドメインおよび膜貫通ドメインとＬＲＰ１
（ｍＬＲＰ／ＬＲＰＴｍＴ＝ＬＲＰｔ）またはメガリン（ｍＬＲＰ／ＬＲＰＴｍＭｅｇＴ
＝ＭＥＧｔ）のＣ末端細胞質テールとからなるミニ受容体をトランスフェクトしておいた
。この系は、これらのミニ受容体の優れた発現レベルおよび様々なＬＲＰ受容体ドメイン
のモジュール性を利用している。この系の前提は、ＬＲＰ１エクトドメインおよびメガリ
ンエクトドメインがＲＡＰを同様に結合すること、ならびにＭＤＣＫ中でメガリンテール
によって媒介される輸送が、脳毛細管内皮を含む他の上皮細胞層におけるものと類似して
いることである。
（インビトロ輸送アッセイ）
安定にトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞および親ＭＤＣＫ株をMaria-Paz Marzolo
博士（チリ・サンチアゴ）から入手した。抗ＨＡ抗体を使った間接免疫蛍光法で示される
ように、ＬＲＰｔは側底側に分布し、ＭＥＧｔはトランスフェクトＭＤＣＫ細胞の頂端側
表面に局在化している(Marzolo et al.,Traffic,4(4):273-88,2003)。０．４μｍの均一
な孔径を持つトランズウェルシステムのポリアセテートメンブレンインサート（Costar，
マサチューセッツ州ケンブリッジ）の表面に、細胞をプレーティングした。細胞を２×１
０5細胞／ｍｌの密度で播種し、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で、３日ごとに培地
を交換しながら培養した。細胞を５％ＣＯ2インキュベーター中に３７℃で維持した。ト
ランスサイトーシス研究は、３つ一組のトランズウェル６群で、頂端側から側底側への輸
送または側底側から頂端側への輸送について、２μｇ／ｍｌの過剰非標識ＲＡＰを含めて
または過剰非標識ＲＡＰを含めずに行なった。
輸送アッセイの２０分前に、トランズウェルインサートおよびその支持内皮細胞単層を
輸送緩衝液（２５ｍＭヘペスおよび０．１％アルブミンを含むハンクス平衡塩類溶液）中
、３７℃で平衡化した。時刻０で、125Ｉ−ＲＡＰ（１μＣｉ／ｍｌ）および99mＴｃ−ア
ルブミン（２μＣｉ／ｍｌ）を上チャンバまたは下チャンバに添加することによって、輸
送を開始させた。プレートは全工程にわたって約１３０ｒｐｍで穏やかに混合しながら３
７℃に保った。５、１０、１５、２０、３０、４０、５０および６０分時に、各ウェルの
下チャンバで、１０μｌの試料を収集した。６０分時に、上チャンバおよび下チャンバ中
の溶液を、４℃の独立した試験管に移した。125Ｉ−ＲＡＰおよび99mＴｃ−アルブミンの
放射能をデュアルチャンネルプログラムを持つガンマカウンターで測定した。輸送後の完
全な125Ｉ−ＲＡＰおよび99mＴｃ−アルブミンの量を酸沈殿によって測定した。選択した
試料に対して、１０〜９０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸の４０分間にわ
たる直線的勾配でＨＰＬＣ分析を行い、１ｍｌずつの画分を集めた。
試験時に、関門の強固さを示すパラメータであるコンフルエント単層のＴＥＥＲは、ネ
イティブＭＤＣＫで７５７Ω／ｃｍ２、ＬＲＰｔトランスフェクトＭＤＣＫで３６４Ω／
ｃｍ２、およびＭＥＧｔトランスフェクトＭＤＣＫで３７０Ω／ｃｈｍ２だった。
時刻０で、125Ｉ−ＲＡＰおよび傍細胞透過性マーカー99mＴｃ−アルブミンを同時に添
加することによって、トランスサイトーシスアッセイを開始した。試験終了時点（６０分
）で、125Ｉ−ＲＡＰは、供与チャンバ中の酸沈殿可能な放射能の９９％を占め、受容チ
ャンバ中の酸沈殿可能な放射能の９１％を占めた。これは、測定された放射能の大半が完
全な125Ｉ−ＲＡＰを表すことを示している。試験期間を１２０分に延長しても、完全な1
25Ｉ−ＲＡＰのパーセンテージやフラックス速度は変化しなかった。
頂端側から側底側へのフラックスに関して、非トランスフェクトＭＤＣＫ細胞では、６
０分間の輸送後の125Ｉ−ＲＡＰの透過係数は５．１±０．８×１０-6ｃｍ／秒だった。
これに対して、ＭＥＧｔをトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞では、125Ｉ−ＲＡＰの透
過係数は１８．１±１．２×１０-6ｃｍ／秒だった。驚いたことに、ＬＲＰｔをトランス
フェクトしたＭＤＣＫでは、有意なフラックスがなかった。全ての群で、99mＴｃ−アル
ブミンも、有意なフラックスを持たなかった。
２μｇ／ｍｌの過剰な非標識ＲＡＰを添加すると、ＭＥＧｔトランスフェクト細胞にお
ける125Ｉ−ＲＡＰの透過係数が有意に減少した（６．３±０．４×１０-6ｃｍ／秒）［
Ｆ（１，１２）＝８６．１，ｐ＜０．０００１］。非トランスフェクト細胞が過剰なＲＡ
Ｐの添加後に有意なフラックスを持たなかったことから、過剰のＲＡＰを含む群と含まな
い群との差は統計的に有意だった［Ｆ（１，１１）＝２４，ｐ＜０．０００５］。したが
って、これらの結果は、頂端側ＲＡＰの飽和可能な輸送系の存在および輸送過程における
メガリンの極めて重要な役割を裏付けている。
側底側から頂端側へのフラックスに関して、125Ｉ−ＲＡＰの輸送は３つの群の全てで
、傍細胞透過性のマーカーである99mＴｃ−アルブミンの輸送よりも有意に高くなかった
（図１８）。ＭＥＧｔを安定にトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞の場合、125Ｉ−Ｒ
ＡＰの頂端側から側底側への透過係数は、側底側から頂端側への透過係数より４６０倍高
かった。これらの結果は全体として、ＲＡＰのメガリンテール媒介性トランスサイトーシ
スを裏付けている。
本明細書に開示しクレームする全ての組成物および／または方法は、本明細書の開示に
照らせば、甚だしい実験を行なわずに製造し、実行することができる。本発明の組成物お
よび方法を好ましい実施形態に関して説明したが、本明細書に記載した組成物および／ま
たは方法ならびに方法の工程または工程の順序に、本発明の概念、精神および範囲から逸
脱することなく変更を加えうることは、当業者には明白だろう。より具体的に述べると、
化学的にも物理的にも関連する一定の薬剤を、本明細書に記載した薬剤の代わりに使用す
ることができ、そのようにしても同じ結果または類似する結果が達成されるだろうことは
、明白だろう。当業者にとって明白なそのような類似の置換および変更はいずれも、本願
特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念に包含されるとみなさ
れる。
本明細書を通して引用した文献は、それらが本明細書の記載を補足する例示的な手法上
の詳細または他の詳細を提供する限りにおいて、全て参照により特に本明細書に組み込ま
れる。

Claims (59)

  1. 関心対象の薬剤にコンジュゲートされたメガリン結合部分を含む化合物。
  2. 前記薬剤が、治療剤、診断剤、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患のマーカー、ＣＮＳ障害のマ
    ーカーに結合する標識モノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の
    化合物。
  3. 前記治療剤が、タンパク質、細胞毒性化学療法剤、タンパク質核酸、ｓｉＲＮＡ分子、
    アンチセンス分子、および関心対象の治療タンパク質をコードする核酸を含む発現コンス
    トラクトからなる群より選択される、請求項２に記載の化合物。
  4. 前記メガリン結合部分および前記関心対象の薬剤が互いに直接連結されている、請求項
    １に記載の化合物。
  5. 前記メガリン結合部分および前記関心対象の薬剤がリンカーを介して連結されている、
    請求項１に記載の化合物。
  6. リンカーがペプチドリンカーである、請求項５に記載の化合物。
  7. 前記メガリン結合部分がインビボでトランスサイトーシスされる部分である、請求項１
    に記載の化合物。
  8. 前記メガリン結合部分が、ＲＡＰ、チログロブリン、リポタンパク質リパーゼ、ラクト
    フェリン、アポリポタンパク質Ｊ／クラスタリン、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタン
    パク質Ｅ、組織型プラスミノゲン活性化因子、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ビタミンＤ結合タン
    パク質、ビタミンＡ／レチノール結合タンパク質、β２−ミクログロビン、α１−ミクロ
    グロブリン、ビタミンＢ１２／コバラミン血漿担体タンパク質、トランスコバラミン（Ｔ
    Ｃ）−Ｂ１２、ＰＴＨ、インスリン、ＥＧＦ、プロラクチン、アルブミン、ａｐｏＨ、ト
    ランスサイレチン、リゾチーム、シトクロム−ｃ、α−アミラーゼ、およびＣａ２＋、お
    よびアプロチニンからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
  9. 前記メガリン結合部分が受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）である、請求項８に記載の化
    合物。
  10. 血液脳関門を横切って脳内に経細胞的に送達するためのキメラ分子であって、トランス
    サイトーシスによって血液脳関門を横切って送達されるべき活性剤にコンジュゲートされ
    たメガリンリガンドを含み、前記メガリンリガンドが血液脳関門を横切る前記キメラ分子
    の輸送を容易にする、キメラ分子。
  11. 血液脳関門を横切るトランスサイトーシスによって脳内に送達するためのキメラ分子で
    あって、トランスサイトーシスによって血液脳関門を横切って送達されるべき活性剤にコ
    ンジュゲートされたＬＲＰリガンドを含み、前記ＬＲＰリガンドが、ＬＲＰ１と比較して
    メガリンに優先的に結合する、キメラ分子。
  12. 前記関心対象の薬剤がメガリン結合部分のＣ末端に結合されている、請求項１〜８のい
    ずれかに記載の化合物、または請求項１０もしくは１１のいずれかに記載のキメラ分子。
  13. 前記メガリン結合部分および前記関心対象の薬剤がそれぞれタンパク質であり、メガリ
    ン結合部分が関心対象の薬剤のＮ末端に結合されている、請求項１〜８のいずれかに記載
    の化合物、または請求項１０もしくは１１のいずれかに記載のキメラ分子。
  14. 薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤中に、請求項１〜８のいずれかに記載の
    化合物、または請求項１０もしくは１１のいずれかに記載のキメラ分子を含む薬学的組成
    物。
  15. 薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤中に、請求項１２に記載の化合物を含む
    薬学的組成物。
  16. 薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤中に、請求項１３に記載の化合物を含む
    薬学的組成物。
  17. 薬剤を動物の中枢神経系に送達する方法であって、メガリン結合部分にコンジュゲート
    された前記薬剤を前記動物に投与するステップを含み、前記動物の血液脳関門を横切って
    起こる前記メガリン結合部分にコンジュゲートされた前記薬剤の輸送が、前記メガリン結
    合部分へのコンジュゲーションが存在しない場合の前記薬剤の輸送よりも多い、方法。
  18. 薬剤のトランスサイトーシスを増加させる方法であって、前記薬剤をメガリン結合部分
    にコンジュゲートするステップを含み、前記メガリン結合部分にコンジュゲートした場合
    に、前記薬剤のトランスサイトーシスが、前記コンジュゲーションが存在しない場合の前
    記薬剤のトランスサイトーシスよりも多い、方法。
  19. 哺乳動物における障害を処置する方法であって、前記動物に、メガリン結合部分にコン
    ジュゲートされた治療剤を投与するステップを含む方法。
  20. 前記障害がＣＮＳの障害である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症
    、および中枢神経系癌からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記障害が中枢神経系癌であり、前記薬剤が癌化学療法剤である、請求項２１に記載の
    方法。
  23. 治療酵素を、メガリンを発現する細胞中のリソソームコンパートメントに送達する方法
    であって、前記細胞を、メガリン結合部分にコンジュゲートされた前記治療酵素を含む組
    成物と接触させるステップを含み、前記細胞のリソソームコンパートメントへの前記治療
    酵素の取り込みが、前記細胞の表面上に存在するメガリンによって媒介される、方法。
  24. 対象のリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法であって、前記ＬＳＤの処置に使用
    される治療剤にコンジュゲートされたメガリン結合部分を含む組成物を、前記ＬＳＤの症
    状を改善するのに有効な量で、前記対象に投与するステップを含む方法。
  25. 前記メガリン結合部分がＲＡＰである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記治療剤が前記ＬＳＤにおいて欠乏している酵素である、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記ＬＳＤが、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォ
    ルマン病、シスチノーシス、ダノン病、ファブリ病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバ
    ー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩ
    Ｉ型、ゴーシェ病、グロボイド細胞型白質ジストロフィー、クラッベ病、グリコーゲン蓄
    積症ＩＩ、ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガン
    グリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、サン
    ドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、β−マン
    ノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ／
    ＩＩ型ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽ハーラ
    ーポリジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖
    症ＩＩＩＡ型、サンフィリポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ム
    コ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型モルキ
    オ症候群、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症侯群、ムコ多糖症ＩＸ型、
    多発性スルファターゼ欠損症、神経性セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ１バッテン病
    、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニー
    マン・ピック病Ｃ２型、ピクノディスオストーシス、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型、シンドラ
    ー病、およびシアル酸蓄積症からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記薬剤が、アルパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイン輸送体、Ｌ
    ａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−
    ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−活性化因子欠乏症、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−
    マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−
    アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγサ
    ブユニット、Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ヘパラン−Ｎ−ス
    ルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルト
    ランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−ス
    ルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ
    、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、複数のスルファターゼ、パルミトイルタンパク質チオ
    エステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、コレステ
    ロール輸送、カテプシンＫ、α−ガラクトシダーゼＢ、およびシアル酸輸送体からなる群
    より選択される、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記組成物が薬学的組成物であり、前記哺乳動物の脳組織中に存在する蓄積顆粒の量を
    減少させるのに有効な量で投与される、請求項２４に記載の方法。
  30. 前記投与が、哺乳動物の中枢神経系への髄腔内投与を含む、請求項２４に記載の方法。
  31. 前記組成物が、前記哺乳動物の髄膜組織中に存在する蓄積顆粒の量を減少させるのに有
    効な量で投与される、請求項２４に記載の方法。
  32. 前記症状が、病歴、理学的検査、心エコー法、心電図検査、磁気共鳴画像、睡眠ポリグ
    ラフ、骨格調査、一連の運動計測、角膜写真、および皮膚生検の定型的評価によって監視
    される、請求項２４に記載の方法。
  33. 疾患がムコ多糖症である、請求項２７に記載の方法。
  34. 疾患がムコ多糖症Ｉである、請求項３３に記載の方法。
  35. リソソーム蓄積症を持つ前記哺乳動物が、正常α−Ｌ−イズロニダーゼの約５０％以下
    の活性を示す、請求項２４に記載の方法。
  36. 前記薬学的組成物が、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼとして週に約０．００１ｍｇ／ｋｇ
    体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、その欠乏症を患っている対象に投与される、請求
    項２９に記載の方法。
  37. 前記薬学的組成物が、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼとして週に約０．０１ｍｇ／当該哺
    乳動物のＣＳＦ １５ｃｃ〜約５．０ｍｇ／当該哺乳動物のＣＳＦ １５ｃｃの用量で、
    その欠乏症を患っている対象に投与される、請求項２９に記載の方法。
  38. 治療剤にコンジュゲートされたメガリン結合部分の前記投与が、前記対象における発育
    遅延および退行の正常化、高圧水頭症の軽減、前記対象における脊髄圧迫の軽減、ならび
    に、前記対象の脳血管周辺の血管周囲嚢胞の数および／または大きさの減少をもたらす、
    請求項２４に記載の方法。
  39. 前記髄腔内投与が、脳室内に前記薬学的組成物を導入することを含む、請求項３０に記
    載の方法。
  40. 前記髄腔内投与が、腰部または大槽内に前記薬学的組成物を導入することを含む、請求
    項３９に記載の方法。
  41. 前記髄腔内投与が、注入ポンプを使って達成される、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記薬学的組成物が、少なくとも数日間にわたって持続的に髄腔内投与される、請求項
    ２４に記載の方法。
  43. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２４に記載の方法。
  44. 酵素補充療法に先だって抗原特異的寛容を誘導するステップをさらに含む、請求項２６
    に記載の方法。
  45. 前記抗原特異的寛容が、免疫抑制剤の投与を含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記抗原特異的寛容が、抗増殖剤の投与をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  48. 抗増殖剤が、ヌクレオチド類似体または代謝拮抗物質からなる群より選択される、請求
    項４７に記載の方法。
  49. 抗増殖剤がアザチオプリンである、請求項４７に記載の方法。
  50. リソソーム蓄積症を有する対象の脳細胞におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分
    解を促進する方法であって、メガリン結合部分にコンジュゲートされた前記リソソーム蓄
    積症で欠乏している酵素を含む薬学的組成物を、前記脳細胞中に存在するＧＡＧの量を投
    与前に前記細胞中に存在するＧＡＧの量と比較して減少させるのに有効な量で、前記対象
    に投与するステップを含む方法。
  51. 前記脳細胞がニューロンである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記脳細胞が神経膠細胞である、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記脳細胞が上衣細胞である、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記脳細胞が、ニューロン、膠細胞、小膠細胞、アストロサイト、乏突起膠細胞、血管
    周囲細胞、血管外皮細胞、髄膜細胞、上衣細胞、くも膜顆粒細胞、くも膜、硬膜、軟膜お
    よび脈絡叢細胞からなる群の少なくとも一つから選択される脳細胞である、請求項５０に
    記載の方法。
  55. 前記細胞が髄膜細胞である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記対象が高圧水頭症を有し、前記投与が前記対象の髄膜組織中のＣＳＦ液の量を減少
    させる、請求項５０に記載の方法。
  57. 前記細胞中のリソソーム蓄積顆粒の数が、前記コンジュゲートの投与を行なわない場合
    の同様の細胞中に存在するリソソーム蓄積顆粒の数と比べて減少する、請求項５０に記載
    の方法。
  58. 前記細胞中のリソソーム蓄積顆粒の数が、前記メガリン結合部分にコンジュゲートされ
    ていない酵素のみで処置された同様の細胞中に存在するリソソーム蓄積顆粒の数と比べて
    減少する、請求項５０に記載の方法。
  59. 治療酵素を対象の細胞中のリソソームに送達する方法であって、
    （ｉ）治療剤または診断剤にコンジュゲートされたＲＡＰまたはＲＡＰポリペプチドを含
    む化合物を前記対象に投与するステップと、
    （ｉｉ）細胞膜を横切って前記化合物を輸送するステップと、
    （ｉｉｉ）前記化合物と、前記細胞上のＬＲＰ受容体とを接触させるステップと、
    （ｉｖ）前記細胞への前記化合物の進入を容易にするステップと、
    （ｖ）前記細胞中の前記リソソームに前記化合物を送達するステップと
    を含む方法。
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