JPH03504967A - 血液脳関門を介しての神経ペプチド運搬のためのキメラ性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血液能関門を介しての神経ペプチド運搬のためのキメラ性ペプチド 発明の背景 本発明は、血液脳関門を介してのトランスサイト−シスによる脳への抗神経薬剤 の注入に関する。特に本発明は、脳血液関門を介しての、受容体を媒介としたト ランスサイト−シスによる脳へ抗神経薬剤を運搬しうるキメラ性ペプチド（ｃｈ ｉｗ＋ｅｒｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ）に関する。

本発明は、認可第ＮＳ−１７７０１号の下に、米国国立衛生研究所の助成金を得 て完成され、米国政府は、本発明に一定の権利を椎動物の脳は、独特の毛管系を 持ち、体内の他のすべての器官とは似ていない、このような独特の毛管系は、血 液脳関門（ＢＯＢ）を作り上げる形態学的特徴を有している。血液脳関門は、血 液と脳とを隔てる細胞膜として作用する。

ＢＢＢを作り上げる脳毛細血管の独特の形態学的な性質は、次の通りである。

（ａ）脳毛細血管のすべての内皮を接着する上皮状高抵抗緊密な結合部。

（ｂ）周囲の器管の上皮には見られないわずかのピノサイト−シス、即ち上皮溝 。

血液脳関門の独特な性質のために１体内の他の組織に容易に出入りする親水性薬 剤のペプチドは、脳への侵入が阻止されるが、その侵入率は非常に小さくなる。

血液脳関門を横切らない方法で、脳へ薬剤を注入するために、いろいろな試みが なされて来た。

最も広範に行われて来た試みは、脳に直接薬剤を送る方法である。この中で最も 普通の方法は、血液脳関門の迅回して、薬剤を脳に直接に送るべく、脳室にカテ ーテルを据つけることである。この方法は、骨随膜の好発を伴う脳の病気の治療 、例えば脳の白瓜疾患の治療に使用されている。

脳室へ薬剤を直接に送るための注入法は、ある程度の成功を納めたが、薬剤は、 脳の深い領域ではなく、脳組織の残い領域にしか送れないので、この方法には欠 陥があった。またこの方法は、患者に有害でもあった。

血液脳関門を迅回する他の方法は、薬剤の潜伏を含む薬理学的方法、即ち親水性 薬剤の脂質溶解性薬剤への転化を含む方法である。

このような方法の大部分は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、第一アミン基を 薬剤上に封鎖し、薬剤をより脂質溶解性にして、血液脳関門を介して容易に運搬 されるようにすることである。

このような薬理学的方法は、ある程度成功したが１本発明者によるＢＢＢを介し てのミクロスポリン運搬の経験に基づく。

ＢＢＢを介してのペプチドの運搬については、完全成功を納めなかった。

ミクロスポリンは、ＢＢＢを緩慢に横切る高度に潜伏性（脂質溶解性）のペプチ ドである。

血液脳関門を迅回するもう１つの方法は、血液脳関門を瞬間的に開いて、高浸透 圧性物質を動脈に注入し、親水性薬剤の通路を形成することである。しかし、高 浸透性物質は、潜在的に毒性があり、血液脳関門を損傷するかも知れない。

現在、血液脳関門を横切り、脳内に、親水性薬剤とペプチドを送るための物質と 方法が必要とされている。このような物質と方法は、脳を介してのペプチド若し くは薬剤の均一な導入と、患者に対する危険性を最小限に抑えるものであること が望ましい。

発明の要約 本発明によれば、神経ペプチド及び他の薬剤を脳に均一に分布させるとともに、 従来の薬理学的薬剤導入法に特有の問題を解決した、新規な物質及び方法が提供 される。

本発明は、薬剤を、運搬可能なペプチドに結合することにより、親水性ペプチド を、血液脳関門を介して生理学的に運搬し、またこのペプチドが、受容体媒介ト ランスサイト−シスにより、血液脳関門を横切る能力があると云う、驚くべき発 見に基づいている。

この発見は、血液脳関門が、親水性薬剤やペプチドによっては通過出来ない受動 性の関門であると云う従来の知識に照らしてみると、特に驚くべきことである。

本発明は、血液脳関門を介してのトランスサイト−シスにより、脳に抗神経剤を 送ることの出来る新規なキメラ性ペプチドを提供するものである。

キメラ性ペプチドは、受容体媒介トランスサイト−シスにより、高率で血液脳関 門を通過しうる運搬可能ペプチドを含んでいる。運搬可能ペプチドは、抗神経剤 と結合して、キメラ性ペプチドを生成する。抗神経剤は、それ自身はＢＢＢと通 過しない親水性ペプチドである。

運搬可能ペプチドと、抗神経剤との結合によれば、驚くべきことに、血液脳関門 を通過しうるキメラ性ペプチドを生成することがわかった。

ヒストンは自然界で生成する蛋白質であり、本発明による運搬可能ペプチドとし て使用するのに好適であることがわかった。ヒストンは、自然界に生成する物質 であるので、有機的合成の必要性はなく、合成した物質に必要とされるような免 疫応答性の可能性と解消することが出来る。

キメラ性ペプチドは、血液脳関門内の受容体を介しての。

トランスサイト−シスの生理学的方法により、血液脳関門を通過して運搬される と信じられている。そこで、キメラ性ペプチドは、脳の全部分に均一に分配され る。

更に、生理学的通路により、脳にキメラ性ペプチドを導入することにより、有害 な副作用を減少させ、従来の侵入法及び薬理学的方法に固有の危険性を解消しう る。

本発明はまた。キメラ性ペプチドを皮下に、又は鼻内に投与する方法、及びこの ような治療に使用されるキメラ性ペプチド含有組成物を提供するものである。

本発明の上記及びその他の特徴、並びに利点について、添付図面に基づき、以下 に詳細に説明する。

図面の簡単な説明 第１図は、実施例２に述べた実験の結果を示すグラフ。

第２図は、脳毛細血管によるヒストンの摂取量を示した、実施例９による実験の 結果を示すグラフ。

第３ａ図及び第３ｂ目は、輸送機構に応じた温度と時間の関係を示した、実施例 ９によるヒストン摂取実験の結果を示すグラフ。

第４図は、毛細血管蛋白質の量に対するヒストンの量を示すグラフ。

第５図は、３７℃と４℃の培養温度において１時間に対し、〔１２Ｊ）ヒストン の全耐酸結合量を示したグラフ。

第６図は、培養容器における非分類、ヒストンの温度に対して、［１２ｉＩ］ヒ ストンの結合量（％ｂｏｕｎｄ／ｍｇｐ）を取り、またｂｏｕｎｄ（Ｂ）／ｆｒ ｅｅ（Ｆ）を、ウシの脳血細血管（ｎｍｏｌ／ｍｇＰ）に結合された（１ｆｆｉ ｓＩ）ヒストンに対して取ったグラフ。

第７図は１両方の同位体の１回の静脈注射の後に、時間に対し、血清〔３Ｈ〕− アルブミン及び（””Ｉｌ−ヒストン放射能、Ａ（ｔ）、　（ＤＢＭ／ａｎ／注 射％）を取ったグラフである。

又朋ｍ乳肌 本発明によるキメラ性ペプチドは、脳に多種の神経剤を送るのに有用である０本 発明は、特に親水性ペプチドよりなる抗神経剤を送るのに好適である。親水性ペ プチドは、一般に多量に血液脳関門を通らない。

親水性ペプチド抗神経剤の例としては、を髄障害及びルーゲリッグ（Ｌｏｕ　Ｇ ｅｈｒｉｇ）病を治療するためのチロトロピン解放ホルモン（ＴＲＨ）、　　健 忘症治療用ヴアソプレシン、多発性硬化症治療用　α−インターフェロン、アル ツハイマー病治療用ソマトスタチン、苦痛除去用エンドルフィン、てんがん治療 用Ｌ−メチオニル（スルフォン）−Ｌ−グルタミル−し−ヒスチジル−Ｌ−フェ ニルアラニル−Ｄ−リシル−Ｌ−フェニルアラニン（アドレノコルチロトロフィ ックホルモン（ＡＣＴ）ｌ）−４−９の類似物）、及び不眠症治療用ムラミルジ ペプチドがある。

これらのすべての抗神経ペプチドは市販されているが、公知の技術で自然界より 単離することが出来る。

次の説明は、抗神経剤が親水性ペプチド（神経ペプチド）であるキメラ性ペプチ ドに限定される。これは、本発明が、それ自体、血液脳関門を低率若しくはＯで 通過する抗神経剤に適用されるからである。

本発明は、抗神経剤が血液脳関門を介して輸送される率を増加させる使用法も含 んでいる。

キメラ性ペプチドは、運搬可能ペプチドに結合された親水性ペプチド薬剤を含ん でいる。この運搬可能ペプチドは、親水性神経ペプチドよりもはるかに高率で、 トランスサイト−シスにより、血液脳関門を通過することが可能である。

好適な運送可能ペプチドの例としては、ヒストン・インシュリン、トランスフェ リン、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ−１）、インシュリン類似成長因子Ｉ Ｉ　（ＩＧＦ−ＩＩ　）、塩基性アルブミン、プロラクチンがある。

トランスフェリンには、循環系の中で、主に鉄分を運搬する蛋白質である８０に 糖蛋白質がある。トランスフェリンには、また髄液（Ｃ３Ｆ）中で濃縮された蛋 白質がある。トランスフェリンは市販されており、公知の技術により、血液若し くはＣ３Ｆから単離される。

インシュリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩも又、普通に得られる。インシュリン は、広範囲に市販されているか、又は自然界より公知の技術で単離しえる。

ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−ＩＩは、アムゲン（Ａ■ｇｅｎ　）若しくはペニンシュ ラ・ラプス（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｓ）のような小売店、又はローゼンフ ェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）他による方法で、自然界から単離しえる（ジャー ナル・サブ・クリニカル・エンドクリノロジー・メタボリズム、ＣＪ、　Ｃ１１ ｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　５５．４３４゜１９８２）。

塩基性アルブミン、若しくは陽イオン化アルブミンは、天然アルブミンの３．９ の等電点（ｐＩ）に対して、８．５のＰＩを持っている。陽イオン化アルブミン は、天然アルブミンとは異なり、血液脳関門を介して急速に脳に入る。

陽イオン化アルブミン（ｐＩ＝８．５）は、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤ） をウシ血清アルブミン（ｐＩ＝３．５）と共有結合することにより調製するとよ い。この方法は、ベルブマン（ＢｅｒｇＩＩａｎｎ）他による「バラチロイドホ ルモンに対する培養された胎児ラットの長管の陽イオン化血清アルブミンの評価 応答」エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、ｏｇｙ）ｐ　１１６．１７ ２９〜１７３３（１９８５）に記載されている。その合成法の例は次の通りであ る。

１０％アルブミン水溶液１０ｍＡを、２．ＯＭ　ＨＭＤ　６（ｌｓｉｌに緩慢に 添加し、溶液のｐＨをＩ　ＮＨＣＱにより、６〜７に調整した。３０分後。

塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤ ＡＣ）　１　ｇを添加し、アルブミンのカルボキシル基を活性化し、１時間後に 別のＥＤＡＣｌ　ｇを添加した。このＰＨを０．２ＮＨＣ（１により、平均的に ６〜７に調整した。

均一に攪拌しながら、この溶液を一晩放置した０次の日。

この溶液を、蒸留水で広範囲に透析した０次にこの溶液を、ファーマシャ・ポリ バッファ交換体９４樹脂、及びポリバッファ９６溶離緩衝剤を使用し、クロマト フォーカス（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）により精製した・ヒストンは 、運搬可能ペプチドとして使用するのに好適である。と云うのは、塩基性アルブ ミンを調整するために、上記の方法のような有機合成を必要とせずに、自然界よ り生成しうる蛋白質であるからである。更に、天然のヒストンに対する抗体反応 がなくても、陽イオン化アルブミンのような合成物質に対する免疫反応は、その 実用性を限定しまうので。

ヒストンは好適である。

ヒストンは、リジンに富む、高度に陽イオン性の蛋白質のグループで、５つのク ラス（Ｈｌ、Ｈｚ、Ｌ−Ｈ４−）ＩＧ）に副分割される。５クラスのそれぞれに 、多種のサブタイプがある。これらの蛋白質は、すべての細胞の核にあり、染色 質の燐酸塩基と緊密に結合されている。

ヒストン分子は、染色質組織の生命体の役割をしている。

ヒストンは、カルフチムス、鶏の赤血球、他の出発物質から単離された核の酸溶 解性成分から単離される。

他のサブタイプは、等電性集末法若しくはイオン交換クロマトグラフィーのよう な多数の公知の技術より分離される。

結合化学にとって重要とされる、ヒストン分子の１つの特徴は、■、を除いて、 システィンチオール基を欠いていることである。

ヒストンは、通常の細胞内で、Ｎ−メチル化、０−メチル化、アセチル化、耐爆 酸反応、アデノシンニ燐酸リボシレージョン（ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）　、 遍在化反応（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）、特定のペプチド結合の酵素加水 分解のような広範な化学変化を受けることが知られている。

ヒストンは、広（市販されているが１次の文献に記載の方法によってむ単離しう る。

ウー、アール・ニス（Ｖｕ、　Ｒ，Ｓ、）、バヌーツ、エイチ・ティー（Ｐａｎ ｕｓｚ、　Ｈ，Ｔ、）、ハツチ、シー・エル（ｌ（ａｔｃｈ、　Ｃ，Ｌ、）、ボ ナー、ダブリュー・エム（Ｂｏｎｎｅｒ、　Ｗ、　Ｍ、）（１９８６）ｒヒスト ンとその変化」、シーアールシー・クリチカル・レビュー・サブ・バイオケミス トリー（ＣＲＣＣｒｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ量）２０．２０１〜２６３、 及びコルズ、エル・ニス（Ｃｏｌｅｓｗ　Ｌ、　Ｓ、）、ロビンス。

エイ・ジェイ（Ｒｏｂｉｎｓ、　Ａ、　Ｊ、）、マトリ−、エル・ケイ（Ｍａｄ ｌｅｙ、　Ｌ、　Ｋ、）、ウェルズ、ジエイ・アール・イー（Ｗａｌｌｓ。

Ｊ、　Ｒ，Ｅ、）（１９８７）　ｒ鶏ヒストン旧遺伝子補体」ジャーナル・サブ ・バイオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６２゜９６ ５６〜９６６３゜ 普通のどんなものから単離されたヒストンでも使用可能で、クラスやサブタイプ には特定の限界はない１人体を治療するのに使用されるキメラ性ペプチドを調製 するには、人体から単離されたヒストンを使用するとよい。

運搬可能ペプチドの別の好適例としてはプロラクチンがある。プロラクチンは、 下垂体前葉により分泌されたホルモンである。プロラクチンは広く市販されてお り、公知の方法で下垂体腺から単離しつる。

キメラ性ペプチドは、運搬可能ペプチドを、抗神経性ペプチドと共役することに より作られる。この共役は、各ペプチドと反応し、両者の間に橋を形成しうる二 官能性試薬を使用してなされる。

共役の好適な方法は、ペプチドのチオール化反応であり。

この反応において、２個のペプチドは、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ビリジル ージヂオ）プロピオナート（ＳＰＯＰ）のような試薬で処理して、キメラ性ペプ チドを生成する。

変性させずに、２個のペプチド、即ち親水性ペプチド薬剤と運搬可能ペプチドを 結合するならば、公知の他の共役剤を使用してもよい、この結合は、キメラ性ペ プチドが脳に入るや否や、容易に壊れるものであるとよい。

共役試薬の好適例は、ゲルタールアルデヒド、シスタミン、ＥＤＡＣである。

ゲルタールアルデヒドを使用したペプチドの共役は、ポズナンスキ−（Ｐｏｚｎ ａｎｓｋｙ）他による「インシュリン：酵素と薬剤療法のためのキャリヤー・ポ テンシャル」サイエンス、２２３：１３０４〜１３０６．１９８４に記載されて いる。

シスタミンとＥＤＡＣを使用したペプチドの共役は、イトウ（Ｉｔｏ）他による ［内細胞表面レセプタを迅回するポリペプチドホルモンの膜透過移送：インシュ リンと８２−マクログロブリン（ａ２Ｍ）レセプタを知覚するａ２Ｍとインシュ リンとの共役、並びにエンドシフチック通路に関する生体活性」モルセルエンド クリノール（Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）３６　：　１６５．１ ９８４に記載されている。

キメラ性ペプチドの好適例は、以下の一般式を有する。

式中、Ａは、ソマトスタチン、チロトロピン解放ホルモン（ＴＲＨ）、バソプレ ッシン、α−インターフェロン、エンドルフィンムラミルジペプチド若しくはＡ ＣＴ）１４−９相似体を示し、Ｂは、ヒストン、インシュリン、ＩＧＦ−Ｉ　、 　ＩＧＦ−ｕ、トランスフェリン、陽イオン化（塩基性）アルブミン若しくはプ ロラクチンを示している。

キメラ性ペプチドの他の好適例は、上記の化合物において。

ＡとＢとの間にジスルフィド共役ブリッヂを、次の式のブリッヂで置き換えたも のがある。

Ａ−ＮＨ（ＣＨ，）、Ｓ−３−Ｂ　（開裂結合）これは、シスタミンとＥＤＡＣ が次の橋かけ剤として使用される時に生成する。

Ａ−ＮＨ＝（ＣＨ，）、ＣＨ＝ＮＨ−Ｂ　　（非開裂結合）これはゲルタールア ルデヒドが橋かけ剤として使用されるときに生成する。

キメラ性ペプチドは、非経口的注射や鼻内吸入を含む従来の方法により体内に導 入される。

好ましくはキメラ性ペプチドは、適合しうる薬剤キャリアーと結合され、非経口 的に注射されたり若しくは所望により、適当なキャリアーと組合わされて、イン シュリンの鼻内投与法に使用される従来の公知の方法により、鼻内投与される。

好適なキャリアー溶液としては、普通のバクテリオスタティック（ｂａｃｔｅｒ ｉｏｓｔａｔｉｃ）剤、及びρ）１約５の無菌食塩のような注射用若しくは鼻内 吸入ホルモン剤内で使用されるものがある。

キャリアー内でのキメラ性ペプチドの濃度は、特定の運搬可能ペプチドと、特定 の抗神経ペプチドに応じて変わる。

キャリアー内でのキメラ性ペプチドの程度は、約０．００１重量％と、　０．０ １重量％の間であるのが好ましい。一般的には、注射液若しくは鼻内吸入液中に 含まれるキメラ性ペプチドの配合量と百分率は、特定の抗神経ペプチドと運搬可 能ペプチドの受は入れられ、確立された配合量に対応するべきである。

実施例は次の通りである。

実施例１ ソマトスタチン−インシュリンキメラの合成ソマトスタチンはアルツハイマー病 の脳に欠けたペプチドであり、血液脳関門を介して運搬されないペプチドである 。

反対に、インシュリンは、血液脳関門を通過するペプチドである。血液脳関門を 通過するインシュリンの運搬能力は１本発明者による「血液脳関門を通過するレ セプタ媒介ペプチド運搬」エンドサイト・レビューズ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒ ｅｖｊｅｗｓ）　７巻、３号１９８６年８月に記載され、その内容については参 考文献として参照するとよい。

ソマトスタチンとインシュリンは、カールソン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ）他による「 蛋白質チオール化及び可逆的蛋白質対蛋白質共役結合」バイオケミストリー・ジ ャーナル（１９７８）、　１７３，７２３〜７３７頁に記載の可逆的ペプチド・ ペプチド共投法を使用したペプチドチオール化により共役結合された。

Ｎ−スシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）のよ うな異二官能性剤を使用して、リジン若しくはインシュリンにおける遊離Ｎ末端 を、遊離リジン若しくはソマトスタチンにおけるアミノ末端と結合した。燐酸塩 緩衝食塩２＋ａＲ中にインシュリン約０．３ｍｇと１２５１−インシュリン２６ ｕＣｉを調製した。これの半分に、２０ｍＭの新鮮な５ＰＤＰの４ラムダを添加 し、室温で４５分間培養した。

別に、０．０ＩＮ）ｌ（ｊｌ　１８０ｕＬ中に、トリチェイテツド（ｔｒｉｔｉ ａｔｅｄ）ソマトスタチン１８０ｕＣｉを溶解し、０．２Ｍ燐酸塩緩衝食塩１８ ０ｕＬに添加した。この半分に、　２０ｍＭ５ＰＤＰ　４ｕＬを添加し、これを ４５分間培養し、０．７５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝４．５）２０ｕＬで酸性化 し、更に０．２５Ｍジチオトレイトール２０ｕＬで還元した。

これを、室温で３０分間培養し、簡単に透析して、未反応の小分子を除去した。

共役したインシュリンと共役したソマトスタチンを室温で一晩培養し、トリチウ ムと１２５Ｉ放射能を計測した。この結果、燐酸塩緩衝食塩２ｍｎ中において、 １２５■−インシュリンの５．３ｕＣｉに結合した３Ｈ−ソマトスタチン５３ｕ Ｃｉを生成した。

ソマトスタチン−インシュリンキメラの構造は、次の通りである。

ソマトスタチンは、次のようなアミノ酸配列を有してｂ）る。

Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙ８−ＡＳＩＩ−ＦＱｙＰｈｅ−ＴｒｙＬｙｓ−Ｔ ｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓインシュリン二本鎖蛋白質ホルモンで、 その構造は公知である。

ヌ１１１圀 分離した牛の脳の小血管、及び３Ｈ−ソマトスタチン−ＩＺＪ−インシュリンキ メラを使用した放射受容器分析ペニンシュラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕ ｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）よりソマトスタチンを得、３Ｈ−水化硼素ナ トリウム（Ｓｏｄｉｕ＋ａｂｏｒｏｈｙｄｒｉ、ｄｅ）を使用した。還元メチル 化によりトリチェイトとした。シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）よりインシュリンを得て、クロルアミンＴとＩ ＺＪ−ヨウ素を使用した。

酸化ヨウ素化により、ヨウ素付加をした。実施例１で記載した５ＰＤＰを使用し て、２つの化合物を結合した。

バルドリッジ（Ｐｏｒｄｒｉｄｇｅ）他による［分離した脳／Ｊ％血管番こよる 敏速な隔離とソマトスタチン相似体の減成」ジャーナル・サブ・ニューロケミス Ｉ−リー、４４巻、４号、１９８５年、　１１７８〜１１８４頁に記載した方法 により、牛の脳の小血管を分離した。

１組の小血管に、′Ｈ−ソマトスタチンを添加１．、室温で６０分間培養した。

別の１組の培養におし１て、３Ｈ−ソマトスタチン−１２５１−インシュリンキ メラを添加した。

第１図に示したように、キメラの摂取量は、遊離したソマトスタチンの２倍以上 であった。更に、キメラの摂取量は、時間とともに増加したが、遊離したソマト スタチンにおいては、かかる増加は見られなかった。

上記の文献（ジャーナル・サブ・ニューロケミストリー。

４４巻、４号、　１９８５年）の論文に記載のように、遊離ソマトスタチンの摂 取量にどんな特定の結合も見られなかった。

この実施例は、インシュリンレセプタを介してのソマトスタチン−インシュリン キメラにおいて、レセプタを媒介としたトランスサイト−シス若しくはエンドサ イト−シスを示している。

従来の研究によれば、分離した扇車血管において、ペプチドのレセプタ媒介エン ドサイト−シスが、インビボペプチドのインビボ血液脳関門レセプタ運搬能力の 信頼出来る証拠である。エンドクライン・レビューズにおける本発明者の前述の 論文（７巻、３号、　１９８６年８月」を参照されたい。

寒産匠１ インシュリンの代わりにトランスフェリンを用いる以外は、実施例１と同じよう にして、キメラ性ペプチドを調製した。

このキメラ性ペプチドを無菌食塩と結合して、キメラ性ペプチド０．０１重量％ を含む溶液を調製し、患者に対し非経口的に或いは鼻内に投与した。

ヌＪ［鍔Ａエ ソマトスタチンの代わりに、バゾプレツシンを用いる以外は、実施例１と同じよ うにしてキメラ性ペプチドを調製した。

調製したキメラ性ペプチドを無菌塩と結合して、　０．０１重波％のキメラ性ペ プチドを含む溶液を調製し、患者に非経口的に投与した。

寒産史旦 トランスフェリンを　α−インターフェロンと結合した以外は、実施例１と同じ ようにして、キメラ性ペプチドを調製した。

調製したキメラ性ペプチドを無菌塩と結合して、０．０１重量％のキメラ性ペプ チドを含む溶液を調製し、患者に対して。

非経口的若しくは鼻内に投与した。

実施例６ ＩＧＦ−ＩＩを　β−エンドルフィンに結合した以外は、実施例１と同じように して、キメラ性ペプチドを調製した。

このキメラ性ペプチドを無菌塩と結合して、　０．０１重量％のキメラ性ペプチ ドを含む溶液を調製し、これを、患者に対して非経口的若しくは鼻内に投与した 。

夫庭桝Ｊ インシュリンをＡＣＴＨ４−９相似体に結合する以外は、実施例１と同じように してキメラ性ペプチドを調製した。

このキメラ性ペプチドを無菌塩と結合して、０．０１重藍％のキメラ性ペプチド を含む溶液を調製し、非経口的若しくは鼻内において、患者に投与した。

叉産旌旦 カチオン化アルブミンをヘキソサミニダーゼＡに結合した以外は、実施例１と同 じようにして、キメラ性ペプチドを調製した。

このキメラ性ペプチドを、無菌塩と結合して、０．０１重量％のキメラ性ペプチ ドを含む溶液を調製し、患者に対して、非経口的若しくは鼻内に投与した。

大凰班主 インシュリンの代わりに市販されているウシのヒストンＶ型を用いた以外は、実 施例１と同じようにして、キメラ性ペプチドを調製した。

このキメラ性ペプチドを無菌塩と結合し、ｏ、ｏｉ重量％のキメラ性ペプチドを 含む溶液を調製し、非経口的若しくは鼻内において患者に投与した。

１庭（社）胆 ポリカチオン性運搬可能ペプチドとしてのヒストンの有用性を証明するために、 次の摂取実験を行った。

市販のウシのヒストンｖ型を、ソマトスタチンインシュリンキメラの代わり用い て、１２５Ｉ−ヨウ素及びクロラミンＴにより放射線ラベルを施した（ｒａｄｉ ｏｌａｂｅｌｅｄ）以外は、実施例２と同じようにして、ウシの脳の毛細管に対 する放射受容体分析を行った。

６０分間、脳に毛細血管とともにヒストンを培養し、ｍｇ脳毛細血管に対する摂 取量百分量を測定した。

この実験の結果は第２図に示され、ヒストンの摂取量１１ｇ蛋白質に対し、はぼ １１０％バウンド（ｂｏｕｎｄ）の高い値であることを示している。また第２図 には、ヒストンの摂取量は、ラベルのないヒストンの濃度の増大により敏速に飽 和しえ、また抑制点が３００１１ｇ／ｍＡ若しくはほぼ１４ｕＭの濃度に達する ことを示している。この飽和反応は、レセプタ媒介若しくは吸収媒介エンドサイ ト−シス機構の特徴を示すものである。

ヒストン■の摂取量は、２．１０．３０．６０分の間隔で測定した。第３図に示 すように、ヒストンの摂取量は時間とともに増加することがわかった。ヒストン ■の培養は、３７℃と４０℃でなされた。ヒストンの摂取量は、第３図に示すよ うに４０℃で抑制された。酸洗浄に対するヒストン摂取抑制効果を、ヒストンの 摂取が終了した後に、軽度の酸洗浄で、ウシの脳毛細血管を処理することにより 測定した。

この酸洗浄は、　０．０２８Ｍ冷却酢酸ナトリウムと、０．０２Ｍパルビタール ナトリウムと、０．１２Ｍ塩化ナトリウムを含む、約３．０のｐＨを有する溶液 で、脳毛細血管を洗うことによりなされた。

この実験の結果は、分離した脳毛細血管によるヒストンの摂取量が、軽度の酸洗 浄に対し部分的に抵抗を示すことを表わしている。

第３図には、酸に対して抵抗するヒストンの摂取量が示されている。この結果は 、摂取したヒストンの約１／３が、脳毛細血管に実際にエンドサイドースされる ことを示している。

４℃の培養で緩慢にされた結合とエンドサイト−シスの両方を示す上記の結果は 、血液脳関門を通過して運搬されるレセプタ媒介若しくは吸収媒介摂取機構の特 徴を示している。

ｘｉｓ　１−ヒストン■の１ナノモル濃度で、脳血細血管の存在下に、室温で１ ０分間培養した。

脳毛細血管により摂取されたラベル付加ヒストンの量を、次に測定した。この実 験の結果は、１２５Ｉ−ヒストン■の摂取量が、培養フラスコ中で、毛細血管蛋 白質の量に対し、直線をなすことを示している。

この実験の結果を、第４図に示した。

実施例１１ この実施例は、脳ミクロヴアスカルチａｔ　−（＋ａｉｃｒｏｖａｓｃｕｌｔｕ ｒｅ）により隔離されていると実験の結果証明されたヒストン／ホルセラディッ シュニペロキシダーゼ共役物の調製を示している。ヒストン／ホルセラディッシ ュニペロキシダーゼ共役物は、次のように調製する。

ジュー（Ｊｕｅ）他による「バイオケミストリー」１７．５３９９〜５４０５頁 、　１９７８年に記載された方法を修正した方法により、ヒストンに、チオール 基を導入した。

ヒストン１６ｍｇ（シグマ型ＩＩ−ＡＳ）を、密閉した反応容器内で、ｐＨ８， ２５の５０１１Ｍトリエタノールアミン緩衝液３．ＯｍＱに溶解した。

蛋白質溶液から気体を抜き、窒素で精製した。

これに、シリンジを介し０．５８２−イミノチオラン（ピアス）溶液０．０７４ ｍＱ添加した。この混合物を、２５℃で４５分間反応させた。すべてのチオール 基を還元するために、生成物を７５ｒｐ麗でゆっくりと攪拌しながら３７℃で３ ０分間、　０．１Ｍジヂオトレイトール（カルビオケム）　０．５ｍＱとともに 培養した。この変性蛋白質を、ガス抜きの窒素精製トリエタトルアミン緩衝液を 使用したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−２５（１，５Ｘ　３０ｃｍ ）上でクロマトグラフィーにより反応混合物から取り出した。溶出蛋白質を、エ ルマン（Ｅｌｌｍａｎ）によるｒ５−５’ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸） 」アルキ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジンクス（Ａｒｃｈ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ）８２．７０〜７３頁に記載のＵｖ吸収法の２ ８０旧ｍで追跡した。蛋白質１モルに付きチオール基１．１モルをこの条件で導 入した。

ホルセルダディッシュペロオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、ハジダ（Ｈａｓｈｉｄａ ）他により、１９８４年「ジャーナル・サブ・アプライド・バイオケミストリー 」６．５６〜６３頁に記載の方法でＮ−γマレイミドブチリルオキシスクシイミ ド（ＧＭＢＳ）を使用しマレイミド基とともに分離した。

ペロキシダーゼ２０ｍｇ（０，５ミリモル、ボエリンガーマンハイムＥＩＡグレ ード）に、ｐＨ７，０の０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液１．５■Ｑを添加した。

ＤＭＦ　０．２ｍＭに、ＧＭＢＳ　１６Ｂ（５７ミリモル）を溶解し。

ペロキシダーゼ溶液に添加した。

この混合物を、３０℃で３０分攪拌した。１（ＲＰを、溶出剤としてｐｔ＋ｅの ０．１Ｍ燐酸塩を使用するセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（１、 ５Ｘ　３０ｃ＋ｍ）で、反応混合物のクロマトグラフィーにより単離した。　４ ０３旧Ｍの吸光度で、ＨＦＩＰ溶出剤を追跡した。

チオール化ヒストン溶液のｐＨを、　ＩＮＩＩＣＱで６に調整した。

これを、マレイミド派生１（ＲＰに即座に添加した。この溶液からガスを抜き、 窒素で精製し、隔壁で密閉した。この成分を２５℃で４８時間反応させた。未反 応の蛋白質から、溶出剤としテ、　ｐＨ６（７）０．１ＭｇＩ＠塩を使用し、セ フ７デツクスＧ１００ＳＦ、：ＩＩラム（Ｌ５　ｘ　５４ｃｍ）で、共役物を分 離した。

第１の吸収溶出剤を、４℃で一晩貯蔵し、水に対して透析し、親液化した。ＰＢ Ｓ　２＋ａＲ中での再構成の次に、ペロキシダーゼ８０％（１６ｍｇ）を共役ピ ークで単離した。

８ｗ５４ＫＯと上記での共役値の表われた数バンドの５Ｄｓ−ページ分析によれ ば、どんな遊離ＨＲＰ又はヒストンも検知出来なかった。ロウツ−（Ｌｏｗｒｙ ）の方法により測定された全蛋白質は、全量の１／３で示され、ｂ／１ヒストン ＨＲＰ共役率で示されるＨＲＰにより、測定出来た。

この共役物は、１厘ｇ／ａｉｌ　（ロウグー法による全蛋白質）に調整され、イ ンビボ分析の前に４℃で保存した。

ヒストン／）ＩＲＰ共役物を１次のようにして実験した。

ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週、雌）に、燐酸緩衝塩（ＰＢＳ）内のヒストン／ＨＲ Ｐ共役物０．２ｉａＱを静脈注射した。１５分後に、クロロヒトレートによる注 射で動物を殺し、４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ　５ＩＩＱを散布し １次に脳を除去し、更に１５分間、定着液に置いた。

３０ミクロンの厚さの氷った部分を調製して、少くとも２０分間、ＰＢＳ内に浮 かべた。ＰＢＳからこの部分を除去し、２０分間培養液に置いたに の培養液は、２０■の酢酸ナトリウム、ＰＨ３，３，２，５％エタノール、　４ ＋ｏＭニトロプルジッド・ナトリウム、　２５０ｍＭ　３．３’、　５１５′テ トラアメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含んでいる。培養塩各１００ｍＡに０．３ ％Ｈ２０□１璽Ｑを添加して、反応を開始させた。

室温での１０分間反応を持続して、この部分を、　ｐＨ３，３の２０ｍＭ酢酸ナ トリウムに移した。５分間ずつ６回、この部分を洗浄した。ゼラチン被覆スライ ドに、組織部分を据え付け、室温で７時間乾燥させた。このスライドを、６０℃ で１時間加熱し、０．５％トルイジンブルーｐＨ４，５で３０秒間着色した。こ のスライドは、アルコールで脱水し、キシレンで洗浄しバーマウント（Ｐｅｒｖ ｏｕｎｔ）に取り付けた。

脳の毛細血管は、その輝く表面に付いたＴＭＢ反応生成物の存在下に、可視的に 確認された。

この生成物は、ヒストン／ＨＲＰ共役物を注射した動物に観察されたが、　）Ｉ ＲＰ単独若しくはＰＢＳのいずれかを注射した動物には観察されなかった。白と 灰色の物体は、　　ＴＭＢで識別された。脳の血管領域特定の局在化は見えなか った。

実施例１２ この実施例は、ヒストンがインビボ血液脳関門（ＢＢＢ）を貫通する能力がある ことを示している。

カルフチムスヒストンは、Ｃ”　Ｉ　］−ヨウ素でヨウ素され、時間温度関係機 構を介し、ＢＢＢのインビトロモデルシステムとして使用される１分離されたウ シの脳の車軸血管により、敏速に摂取されることがわかった。

この結合は、飽和しうるもので、結合データのスカツチャード（Ｓｃａｔｃｈａ ｒｄ）プロットは直線状で、ＫＤ＝１５．２±２．８μＮを生成し、（Ｂｍａｘ ）＝７．７±１．０ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白質（第５図）の最大結合を示している。

プロタミン若しくはポリリシンのような他のポリカチオンは、（”５１　］−ヒ ストンの摂取を明らかに阻止した。しかしカチオン化アルブミンは最小の抑制を 示し、カチオン化イミュノグロプリンは、　〔１２ｓ　ｔ　〕ヒストンのウシの 脳の毛細血管摂取量にはどんな抑制も示さなかった。

（１ｍ−ｔ　）−ヒストンの分布のインビボ脳体積は、〔３旧−アルブミンの１ ０分の体積と比較して、系頚動脈環流の１０分間迄に、１５９±７０　ｕ　Ｌ／ ｇに達した。この摂取量のほとんどは、血管系による隔離を示したが、脳に摂取 された全ヒストンのほぼ８％が（三塩化酢酸（ＴＣＡ）の沈殿に基づき）、脳の 間質に非代謝で運搬されることがわかった。

実験を、次のようにして行った。

［”Ｊ］−ヨウ素を、米国マサチューセッツ州ボストンのデュポン・二ニー・イ ングランド・ニュークリアー・コーポレイション（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃ：ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より得た。［’　Ｈ ｌ−ＮａＢＨ４は、米国イリノイ州シカゴのアメルシャム（Ａｍｅｎｓｈａｍ） コーポレイションより得た。ウシのアルブミン（ペンタックスフラクション■） は、米国インジアナ州エルクハートのマイルス（Ｍｉｌｅｓ）ラボラトリーズよ り得た。雄のスプラーグダウリーラット（２００〜３００　ｇ　）は、米国カリ フォルニア州フレモントのパンチン・アンド・キングマン（Ｂａｎｔｉｎａｎｄ 　Ｋｉｎｇｍａｎ）より得た。こむらタチジャコウソウヒストン■Ｓ（リジンに 富む）及び他のすべての試薬は、米国ミズリー州セントルイスのシグマ・ケミカ ル・カンパニーより得た。

ヒストンヨウ素化 ヒストンを、（”’　Ｉ　）ヨウ素とクロラミンＴを用し１て、１０〜２０μＣ ｉ／　ｔａｇの特定の活性を示すべくヨウ素化した。ヒストン（２，３旧ｍｏｌ ）の５０１Ｉｇを（”’　Ｉ　）−ヨウ素（１，２旧ｍｏｌ）の２．５ｍＣ１及 び２．１ｎｍｏｌのクロラミンＴと反応させて、次に室温で６０秒間培養した。

この混合物を、０．１ＮＨＣＱで酸性化し、セファデックスＧ−２５（ミーディ アム）の０，７　Ｘ　２８ｃｍコラムと０．０１Ｎ）ＩＣＩＩを使用した。

ヨウ素化したヒストンを空間に溶出し、三塩化酢酸（ＴＣＡ）により９８％の沈 殿を生成した。０．０ＩＮＩＩＣＩＩ中で４℃で、〔１２５■）−ヒストンを保 存し、１週間以上、急速な脱ヨウ素化を生じさせた。そこで、インビボ頚動脈環 流実験が２４時間のヨウ素化とともに行われ、単離された毛細血管実験は、ヨウ 素化の３．４日で行われた。

アルブミンのトリチぞイ！ヨン（Ｔｒｉｔｉａｔｉｏｎ）ウシのアルブミン（ベ ンテックスフラクションＶ）を、前に述べたバルドリッジ他１９８５ａによる方 法で、　（３Ｈ）−ＮａＢＨ，により、０．４μＣｉ／ｐｇの特別の活性にトリ チェイトした。この生成物の沈殿度は９９％以上だった。

庭玖夾廠１失簾 ウシの脳の小血管は、前述の方法で１機械的均一化技術により脳皮質より分離さ れた。この方法は、パルドリッジ他による「分離された脳小血管によるソマトス タンチン相似体の敏速な隔離と減成」ジャーナル・サブ・二ニーロケミスドリー 、４４．１１７８〜１１８４頁、１９８５年に記載されている。この脳皮質は、 地方の畜殺場で得られた新鮮なものである。

最終的な小血管ペレットは、液体窒素（−７０℃）中で、０．２８Ｈスクロース 、０．０２Ｍ１−リス（ｐＨ７，４）、及び２＋ａＭジチオトレイトールで調製 した。実験のその日に、小血管は溶かされ、遠心分離され、リンゲル−ＨＥＰＥ Ｓ緩衝液（Ｒ１１Ｂ）に再び懸濁された（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，４ ，１４１ｍＭ　ＮａＣＱ、４ｍＭ　ＫＣＱ、　Ｚ、８ｒｓＭ　ＣａＣＱ２．０． １ｇ／ｄΩウシ血清アルブミン）。

ウシの脳小血管による（１２Ｊ）−ヒストンの摂取は、前述の方法（パルトリッ ジ他［血液脳関門を介してのＩｇＧ送達の新規な方法としての、イミュノグロブ リンＧ（ＩｇＧ）のカチオン化」Ｃ１１ｎ、　Ｒｅｓ、　３７．１４ＯＡ）で、 毛細血管蛋白質はぼ１００．を、５秒から６０分の時間で、３７℃若しくは４℃ の温度で０．４５ｍ１２　ＲＨＢの最終体積でＣ”’　Ｉ　）−ヒスＩ□　ン（ ７）０．２μｃｉ／ｄテ培養シタ。

非標識ヒストン、カチオン化イミュノグロプリン、天然の若しくはカチオン化ウ シの血清アルブミン、プロタミン、若しくはポリリジン＜５９０００分子厘）の 種々の濃度を添加することにより、比較検討がなされた。

培養期の終りに、　１０，０００ｇで４５秒間、混合物を遠心分離し、毛細血管 ペレットを、ＩＮ　ＮａＯＨＯ，ＳｖＱ中で溶解し、ロウリー他「フォリンフェ ノール試剤による蛋白質分析」ジャーナル・サブ・バイオロジー・アンド・ケミ ストリー・２６２−２７５゜１９５１に記載の方法により、〔１２５Ｉ〕を計測 し、蛋白質を測定した。

分離されたウシの脳毛細血管により、札付きのヒストンの内部移行は、パルドリ ッジ他による前述の方法「分離された・・・減成Ｊジャーナル・サブ・二ニーロ ケミスドリー、４４巻１１７８〜１１８４頁１９８５年に記載の弱酸洗浄分析に より測定された。

酸洗浄溶液は、０．１２Ｍ　ＮａＣＱ、　０．０２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝３ ）、０．０２８Ｍのパルビタールナトリウムよりなっている。

インビボＢＢＢを、しての（１２Ｓ＋　　−ヒストン゛インビボＢＢＢを介して の（１２５１）−ヒストンのインビボ運搬の定量分析は、毛細血管欠乏法に関わ る内側頚動脈環流技術により測定された。

ラットを、ケタミン／キシラジン（ケタミン２００＋ｗｇ／ｋｂ、　ｉ。

ｐ、／キシラジン２　＋ｉｇ／ｋＬ　ｉ、　ｐ）で麻酔し、右頚動脈、後頭骨、 上部甲状腺をさらし、翼状口蓋動脈を電気凝固法により閉じた。右側の外側頚動 脈に、ポリエチレンカテーテル（ＰＥ−１０）を挿入した。環流が始まるすぐ前 に頚動脈を結んで、閉じた状態においた。

環流液は、ｐＨ７，４（１１８＋ａＭ　ＮａＣｌ１．４．７＋ｏＭ　ＫＣＱ、２ ．５ｄ　ＣａＣＱ、、１．２ｍＭ　Ｍｇ５Ｏイ１．２ａ＋Ｍ　Ｋｌ（２ＰＯ４， ２５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、１０＋ｎＭ　Ｄ−グルコース、３ｇ／ｄＩｌウシ血清 アルフミン）テ、（１２’　Ｉ　）−ｔ：　ストン２．５μＣｉ／＋ｎＱと〔３ Ｈ〕−アルブミン２５μＣｉ／ｍ１２を含むクレブスーヘンゼレイト（Ｋｒｅｂ ｓ−Ｈｅｎｓｌｅｉｔ）緩衝液よりなっている。

環流液は、３７℃に維持され、環流の間に連続的に酸化され。

１−１０分間、１−１．２ｍ１１／ｗｉｎの流量（ハーバードペリスタルティッ クポンプモデル１２１０）でなされる、２．５分以上の環流時間では、同じ流量 （バーバード・シリンジ・ポンプ・モデル９４０）で、大関動脈から（ヘパリン を満たしてＰＥ−５０カテーテルを介して）血を引き抜くことにより、ラットの 血液体積は一定に維持された。

環流の後に、動物を断頭し、同側の枚半球を除去した。

絨毛腹這を捨て、脳を計量し、　Ｐ）Ｉ　７．４の等張緩荷液（１０ｍＭＨＥＰ ＥＳ、　１４１＋＊Ｍ　　ＮａＣｆ１．　　ｌｈＭ　　ＫＣＱ、　　Ｚ、８ｍＭ 　　ＣａＣＱ２．　１ｍＭ　　ＭｇＳＯ４、１ｍＭ　Ｎａ）ｌ、ＰＯ，、１０Ｉ ＩＩＭ　Ｄ−グルコース）３．５−中で、均一化した。

２６％デクストラン溶液（分子量７９，０００）の４　ｍＮ１３％の最終デクス トラン濃縮液に添加し、３ストロークで、再び均一化した。均一化のすへては４ ℃で行った。

放射性同位体の計数のために、均等質の部分標本を除去した後に、残りを、揺動 パケットローター（ベックマンＪＡ−７．５０−ター、ベックマンＪＺ−２１遠 心分離機）中で、４℃で１５分間。

５．４００ｇで遠心分離した。

上澄液を、ペレットを注意深く分離した。ペレットの微細な観察によれば、ペレ ットは、脳の血管系と、赤い細胞と、脳核とよりなり、上澄液は、血管系を含ん でいない。

上澄液と環流液（上澄液に含まれるものと類似するデクストランの量を添加した ）の部分標本を、２．５％ＴＣＡの沈殿性のために取り上げた。均等質、ペレッ ト、上澄液、環流液を。

２ｍ１２ツルエン−３５０（パラカード・インストルメント・カンパニー、イリ ノイ州ドウナーズドライブ）中に溶解し、前述の［”ＳＩ　）、ｒ″Ｈ）二重同 位体液体シンチレーション分光法のために調製した（パルドッジ「血液脳関門を 介しての甲状腺ホルモンキャリアー媒介運搬、アルブミン結合ホルモンの主要な 役割」エンドクリノロジー１０５．６０５〜６１２．１９７９年）。

（１２−■）及び〔３Ｈ）標識付き蛋白質の両方の分布体積を均等質、ペレット 、後血管上澄液のために計算した。

ｏＰＭ−ｆ／ｇ組織 式中、ＤＰＭ−ｆは、各成分（均等質、ペレット後血管上澄液）中のＤＰＭであ る。

分布の上澄液体積は、次のように補正される。

上澄液ＶＤ＝（（”’Ｉ）Ｖｏｘ％ＴＣＡ沈Ｒ力）−（（３）１）ＶＤ）補正し た上澄液ＶＤは、ＢＢＢを介してのトランスサイト−シスに続く脳間質への蛋白 質分布の質量分析である。〔３Ｈ〕−アルブミンのＶＤの引算により、脳血管系 の管腔内に含まれる放射性蛋白質のために補正される。この脳血管系は、これら の血管の均一化と破裂に続いて血管から漏れる。

１回の静脈内注射に続＜　［”’　Ｉ　］−ヒストンと〔３Ｈ〕−アルブミンの 除去 〔１２ｓＩ〕−ヒストン５μＣｉト〔３Ｈ〕−天然アルフミン５０μＣｉヲ含む 等張緩荷液の０．５ｄ部分標本を、２７ゲージ針を介して。

大腿静脈に敏速に注射した。

注射後、０．２５．５．３０．６０，１２０．１８０分で、動物をすばやく開腹 し、動脈血液０．５ｍ９部分標木製、下降する大動脈から除去し１次に動物を断 頭し、脳と他の９つの器管（心臓、肝臓、牌、精巣、小腸、骨格筋、脂肪、腎臓 、肺）この組織をツルエン−３５０中に溶解し、二重同位体液体シンチレーショ ンカウントで分析した。血液［１日と［１２ＳＩ　］の放射能を、注射藍の百分 率即ちＡ（ｔ）として、　ＤＰＭ／ｍＱに標準化した。

これらのデータは、次の２倍数関数に適合している。

−に、ｔ　　　　−に、ｔ Ａ　（ｔ　）　＝Ａ　ｔ　ｅ　　　＋　Ａ　ｚ　ｅこれは、非導関数非線形回帰 分析（ＢＭ叶のＰＡＲ，ＵＣＬＡヘルス・サイエンス。コンピユーテイング・フ ァシリティで発展されたバイオメジカル・コンピュータ・Ｐ・シリーズ・プログ ム）。

この方法に荒く比例して、エラーが生じるので、データは、重量＝１７〔浄化値 〕。動脈放射能曲線の積分は、これらのデータから次の式で求めた。

式中、ｔは注射後の時間を示す。

脳と他の９つの器管内のヒストン、若しくはアルブミンの分布体積は、積分した ＤＰＭ／ｍＱ血液により割り算されたＤＰＭ／ｇｍ組織の率で決定された。血清 〔１旧−アルブミンのＴＣＡ沈殿能力は、すべての点で９８％以上だった。しか しく”ｓ！　）−ヒストンのＴＣＡ沈殿能力には減少が見られる。そこで１分布 の血液又は器管体積からヒストンの浄化値の計算には、動脈ＴＣ＾沈殿ｐ２ｓ　 ｔ　］のみを使用した。

ウシの脳の小血管による摂取 （”’　Ｉ　〕−ヒストンを１分離したウシの脳の毛細血管により３７℃で、す ばやく取り上げ、この摂取量のほぼ２５％は１弱酸洗浄に対し抵抗があり、第３ 図のような内部ヒストンを示すと考えられている。全結合と内部移行の両方共、 第３図のように、４℃の培養で緩慢になった。

分離されたウシの脳の毛細血管による［１２５　ｔ　］ヒストンの摂取量は、毛 細血管蛋白質の４７〜２１０ＩＩｇの範囲で培養容器に添加した毛細血管の量に 対し直線状である（データは図示されていない）。

分離された脳小血管に対する（”’１３−ヒストンの結合は、第２図のデータに 示すように、はぼ３００μＧ／ＭＬ（１４μＭ）のＨＤ、。

で飽和可能である。この飽和データはスカッチャード分析により分析され、第５ 図の点を与えた。

解離定数（ＫＯ）　＝　１５．２±２．８μ阿であり、最大結合値若しくはＢｍ ａｘ＝７．７±１．Ｏｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白質である。分離されたウシの脳小血管 に対する［１２’　Ｉ　）−ヒストンの結合は、プロタミン若しくはプリリジン のような他のポリカチオン性蛋白質で抑制されたが、カチオン化アルブミンによ っては最小に抑制され、カチオン化イミュノグロブリンＧ又は天然アルブミンに よっては抑制されなかった。（第１表参照）第１表 分　されたインビトロウシ脳毛　血管に対する１２５■　　−ヒストン結合の　 全 対照　　　　　　　　２２５±１０ ２．５ｍｇ／ｍｆｌカチオン化イミュノグロブリン　　２３２±２２．５ａ＋ｇ ／ｍｆｆ１天然アルブミン　　　　　　　　　２１１±９０．５ｍｇ／ｍｕカチ オン化アルブミン　　　　　　１７１±１３’０．５＋ｍｇ／ｍＱヒストン　　 　　　　　　　　　　　　１１３±４ｂ０．５ｍｇ／ｍＱプロタミン　　　　　 　　　　　　　９５±５ｈ２．５ｍｇ／ａｎポリリジン（５９，０００）　　　 　　　　　　４６±１ｂデータは平均値±Ｓ、　Ｅ、（ｎ　＝　３　）ａｐ＜０ ．０１　　　ｂｐ＜０．０００５インビボラツトＢＢＢを介しての１１作（１１ ％　ｔ　）−ヒストンのための均等質ＶＤは、時間とともに増大し、　１０分後 迄に１５９±７０μＬ　ｇ−１に達した。（第２表参照）しかし、脳に摂取され た（＋−２５ｔ　）−ヒストンのほとんどは、１０分間での（１２５１３−ヒス トンの後血管上澄液が１２±５μ＋、ｇ−１であり。

これは金蓋の８％を示すので、血管に隔離された。

ＴＣＡ沈殿である上澄液内の（Ｌ２ｓｔ）−ヒストンは、環流１０分で９０±３ ％であった。［１２５Ｉ］−ヒストンのための均等質ＶＤは。

〔３旧アルブミンのための均等質ＶＤのほぼ１０倍であった。（第２表参照）［ ３Ｈ］−のアルブミンのペレットＶＤは、　１０分の環流で０．７６±０．２０ μＬｇ〜１であり、これは、〔１ｔ−■）−ヒストンのためのベレットＶＤの１ ００倍以下であった（第２表参照）。

ｌじＬｌ インビボラット脳　の　：　１〜ｌＯ分後の（１２５ｒ　）−ヒストン若しくは ［３８−アルブミンの分　体積（Ｖ蛋白質　　　　　　脳成分　　　　　　　時 　間　（分）（１１−１）−ヒストン　均等質　５．１±３．５　２０±１０６ ４±１３　１５９±７０上澄液　１．６±０．５１．４±０．１１２±４　１２ ±５ベレツト　０．９±０．５　１０±８　３９±８１１８±５９〔３Ｈ〕−ア ルブミン　均等質　２．２±０．７　２．８±０．４　１８±７１７±７データ は平均値±Ｓ、　Ｅ、　（ｎ＝３〜７）　　ＶＤ・μＬ／ｇとして記１回の静脈 　注射に続く血　からの［”ＳＩ　）−ヒストン　び〔３Ｈ〕−アルブミンの浄 ヒ 崩壊は、ＴＣＡに沈殿可能なプラズマ〔１２ｓ■〕−ヒストンで、１回の静脈内 注射に続くプラズマ〔３Ｈ〕−アルブミンの崩壊は、第６図に示される。

〔３Ｈ〕−アルブミンデータは、２重指数関数には適合せず、単独指数関数に適 合した。［”Ｊ）−ヒストン血液データは、単独若しくは３重指数関数のいずれ にも適合せず、２重指数関数に適合した。２つの指数関数崩壊の中止と傾斜は第 ６図に示される。

血液から敏速な浄化値の次に（１″り一ヒストンは、２．０±０．５時間の半分 の時間で、単独指数関数的に解決され、その値は〔３Ｈ〕−アルブミン浄化値の ための半時間の約４０％、４．８±１．８時間であった（第６図参照）６ 脳と他の９つの器管のための（１２′Ｉ　）−ヒストンの６０分間脳ＶＤと６０ 分間（１２５Ｉ）−ヒストンＶＤ／　（’　Ｈ）−７）ＩｉブミンｖＤの割合を 第３表に示している。精巣と小腸を除いて、脳と他の器管は。

６０分間迄に最大器管分布に達しているので、６０分ＶＤデータ示した通りであ る。

精巣と小腸のために、それぞれ１８０分間ＶＤは６０分間よりも４１％と５３％ 高かった。脳、肺、牌にとって、１８０分ＶＤは６０分ＶＤよりも４０％低かっ た。肝臓、心臓、腎臓、筋肉又は脂肪では、６０分〜１８０分で、　ＶＤは変化 しなかった。

ｌぢ３５ 静脈注射に　＜６０ノでのヒストン及びアルブミンの　　体　（■腎臓　　７． ９±０．５　　　０．３６±０．０２　　　　　２２．３±１．４筋肉　　０． ７１±０．０１　　０．０３６±０．００２　　　　　１９．６±０．２牌　　 　　６．０±０．８　　　０．３５±０．０３　　　　　　１７．５±２．４小 腸　　２．０±０．７　　　０．１１±０．０１　　　　　１７．４±６．１肝 臓　　４．６±０．２　　　０．３４±０．０２　　　　　１３．７±０．７肺 　　　　５．１±０．３　　　０．３８±０．０３　　　　　　１３．３±０． ７脳　　　０．１７±０．０２　　０．０１７±ｏ、ｏｏｚ　　　　　　　ｉｏ 、ｏ±１．２精巣　　０．６８±０．０４　　０．０８６±０．０１１　　　　 　７．９±０．５脂肪　　０．３２±０．０２　　０．０４８±０．００６　　 　　　６．７±０．５心臓　　０．９４±０．１０　　０．２１±０．０３　　 　　　　４．５±０．５１回の静脈注射の後、６０分後に得られたデータはＶＤ を示している。データは、平均値±Ｓ、　Ｅ、（ｎ　＝　３）である。

この実施例は　［１２５１〕−ヒストンが、脳毛細血管のリュメナル（ｌｕｍｅ ｎａｌ）、及びアンチリュメナル（ａｎｔｉｌｕｍｅｎａｌ）側面の両方の結し ている。　（”Ｈ）−アルブミンに対するｐｕｓ　Ｉ）−ヒストンの非常に高度 の小血管のペレットＶＤを示す第２表のインビボ環流研究は　（１２５ｒ　）ヒ ストンが脳毛細血管のりュメナル膜により結合されていることを示している。

反対に、第３図のように分離されたウシの脳の小血管により、５秒以内の培養で 、急速な結合を説明するのに、アンチリュメナル膜への結合がなくてはならない 。

脳の小血管に対する〔１２５　ｒ　）−ヒストンの結合は第３図のように温度に 応じるか、第２図のように飽和しつる。１４μＨヒストンの飽和ＥＤ、、はヒス トン摂取システムの能力が非常に高いことを示している。

カチオン化アルブミンのための飽和ＥＤ、、は、０．０５ｍｇ／ｍＱ（０，７μ Ｍ）であった。（クマガイ（Ｋｕｍａｇａｉ）他、［分離した脳毛細血管による カチオン化アルブミンとβ−エンドルフィンカチオン化アルブミンキメラ性ペプ チドの吸収媒介エンドサイト−シス。血管脳関門運搬のモデルシステム、」ジャ ーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー２６２．１５２１４〜１５２１９ ゜１９８７年）カチオン化イミュノグロプリンのＥＤ、、はＩＩＩｇ／ｌＲ（６ μ約であった（トリグエロ（Ｔｒｉｇｕｅｒｏ）他「血液脳関門を介してのＩｇ Ｇ搬送のための新戦術としてのイミュノグロプリンＧＣＩｇＧ）のカチオン化」 クリニカル・レス（ＣＩｉｎ、　Ｒｅｓ、　３７　：　１４０Ａ）。

７．７±１．Ｏｎｍｏｌ／ｍｇのヒストンＢ＋＋＋ａｘは、カチオン化イミュノ グロブリンＧのＢｍａスのほぼ５倍で、カチオン化アルブミンの結合のためのＢ １１１ａ真の９０倍以上である６種々のポリカチオン蛋白質のための異なるＢｍ ａｘ値は、これらの分子が脳の毛細血管の内皮膜における負電荷に結合している ことを示している。

例えば、カチオン化アルブミンはヒストン摂取量を弱く抑制し、一方カチオン化 イミュノグロプリンは、ポリリジンのようにどんな作用も与えなる（第１表参照 ）。

第３図の弱酸洗浄に対する抵抗を示すように、ヒストンは毛細血管の表面に対す る結合に続いて、脳毛細血管内皮細胞質に吸収媒介エンドサイト−シスを生じる 。更に第２表のデータは、脳毛細血管により結合され、エンドサイト−シスされ た全ヒストンのほぼ８％が、インビボ脳間質にエンドサイトーシスを起こし、毛 細血管内皮を介してのトランスサイト−シスの全通路を形成する。

前記実施例のすべての引用文献は１本発明の参照文献となるものである。

以上のように本発明の内容について説明したが、これらの内容は単に例示のため だけであり、本発明の範囲を逸脱しない限り、当業者により種々の変更、修正が 可能である。従って本発明は、上記の実施例に限定されるものではなく、次の請 求の範囲にのみ限定されるものである。

ＤＰＭ　／　ＭＬ　／通入Ｚ ｐ　　　ｐ　　Ｐロー　　　　ω　ｌ／ＩＮ１〜　　　　　ａｈａ’ｔｓ 東 手続補正書坊幻 平成３年８月１６日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．血液脳関門を介してのトランスサイトーシスによる脳への抗神経剤を運搬す るためのキメラ性ペプチドであって、このペプチドが運搬可能ペプチドを含み、 この運搬可能ペプチドが前記抗神経剤と共役結合をして、トランスサイトーシス による脳血液関門を通過する能力のあるヒストンであることを特徴とするキメラ 性ペプチド。
2. ２．むヒストンが、人体源から隔離されている請求項１記載のキメラ性ペプチド 。
3. ３．ヒストンが、クラスＩ−Ｖ型のヒストンから選択される請求項１記載のキメ ラ性ペプチド。
4. ４．ヒストンがクラスＩ−Ｖ型のヒストンから選択される請求項２記載のキメラ 性ペプチド。
5. ５．抗神経剤が親水性ペプチドである請求項１記載のキメラ性ペプチド。
6. ６．抗神経剤がソマトスタチン、チロトロピン解放ホルモン、バソプレッシン、 α−インターフェロン、エンドルフィン、ムラミルジペプチド及びＬ−メチオニ ル（スルフォン）−Ｌ−グリタミル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−フェニルアラニル− Ｄ−リシル−Ｌ−フェニルアラニンよりなる群から選択される請求項５記載のキ メラ性ペプチド。
7. ７．運搬可能ペプチドと抗神経剤が共役剤により共役結合される請求項１記載の キメラ性ペプチド。
8. ８．共役剤が、グルタールアルデヒドを介してのべプチドチオール化若しくはリ ジン結合により抗神経剤に運搬可能ペプチドを共役結合する能力がある請求項１ 記載のキメラ性ペプチド。
9. ９．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａは抗神経剤、Ｂはヒストンを示す。）で示される請求項１記載のキメ ラ性ペプチド。
10. １０．Ａが、ソマトスタチン、チロトロピン解放ホルモン、バソプレッシン、α −インターフェロン、エンドルフィン、ムラミルジペプチド及びＬ−メチオニル （スルフォン）−Ｌ−グリタミル−Ｌ−ヒスヒジル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ −リシル−Ｌ−フェニルアラニンよりなる群から選択される請求項９記載のキメ ラ性ペプチド。
11. １１．請求項１のキメラ性ペプチドと、このキメラ性ペプチドのための製薬上許 容しうるキャリヤーを含む組成物。
12. １２．製薬上許容しうるキャリヤーが無菌塩である請求項１１記載の組成物。
13. １３．血液脳関門を介してのトランスサイトーシスにより動物の脳に抗神経剤を 送り込む方法であって、請求項１記載のキメラ性ペプチドを、血液脳関門を通過 するに十分な量で、動物の血液流に導入する段階を含む方法。
14. １４．キメラ性ペプチドを血液流中に鼻内より導入する請求項１記載の方法。
15. １５．血液脳関門を介して、脳に親水性神経ペプチドを導入する方法であって、 この神経ペプチドをヒストンと共役結合することにより、神経ペプチドが血液脳 関門を通過する割合を増加させることを特徴とする方法。
16. １６．ヒストンが人体から分離される請求項１５記載の方法。
17. １７．ヒストンが、ヒストンのクラスＩ−Ｖ型より選択される請求項１５記載の 方法。
18. １８．ヒストンが、ヒストンのクラスＩ−Ｖ型より選択される請求項１６記載の 方法。