CZ283601B6 - Inzulinu podobný růstový faktor vázající protein odvozený z lidské kosti - Google Patents

Abstract

Čištěné a izolované přípravky proteinu vázajícího inzulinu podobné růstové faktory (IGF)I a II. Vázající protein, známý jako IGF vázající protein odvozený z lidské kosti (hBD-IGFBP) potencuje proliferativní účinky IGF-II na kostní dřeň. Diagnostické studie pro hBD-IGFBP jakož i farmaceutické přípravky a jejich použití pro vrobu farmaceutických přípravků pro léčení chorob kostí, hojení ran, reparace kůže a způsoby modulace IGF aktivity v kosti.ŕ

Description

(57) Anotace:

Čištěný, z lidské kosu získaný, inzulinu podobný růstový faktor vázající protein, hBD-IGFBP, mající molekulovou hmotnost 29 kDa, který Je dále charakterizován tím, že má vyšší specifickou vazebnou afinitu pro IGF-Π než pro IGF-I a váže hydroxyapatit za přítomnosti 4 mol/1 guanidin.HCl, který má aminokyselinovou sekvenci identickou nebo v podstatě identickou se sekvencí LGSFVHCEPCDEKAL. Farmaceutický přípravek, obsahuje čištěný hBDIGFBP protein nebo jeho fragment a farmaceuticky přijatelný nosič. Výhodně je ve farmaceutickém přípravku IGF-I nebo IGF-II konjugován k hBD-IGFBP.

Čištěný a izolovaný z lidské kosti získaný, inzulínu podobný růstový faktor vázající protein a farmaceutický přípravek s jeho obsahem

Oblast techniky

Předložený vynález se týká kostního metabolismu a zejména procesů kostního metabolismu, které jsou mediovány novým vazebným proteinem pro inzulínu podobný růstový faktor (IGFBP), izolovaným z lidské kosti. Přesněji se vynález týká IGFBP, nazvaného IGFBP odvozený z lidské kosti (hBD-IGFBP), který potencuje vliv inzulínu podobného růstového faktoru-II (IGF-II) na proliferaci buněk kosti.

Dosavadní stav techniky

IGF-I a IGF-II, dva nejhojnější růstové faktory, přítomné v lidské plazmě, vytvářejí rodinu polypeptidů, které se podobají proinzulinu strukturně a mají jak anabolické, tak akutní inzulínu podobné aktivity v mnoha tkáních (Daughaday a spol., Endocrine Rev., 10: 68-91 (1989)). Všechny předešlé studie na myších a krysách zdůrazňovaly IGF I jako primární IGF, s IGF II jako fetálním hormonem; nedávné studie uvažovaly o důležité roli IGF II v metabolismu lidské kosti. IGF II byl shledán nejhojnějším růstovým faktorem v lidské kosti a nejhojnějším růstovým faktorem, produkovaným buňkami lidské kosti. Navíc IGF II je jedním z několika růstových faktorů, který je mitogenní pro buňky lidské kosti. Také v nedávné době čištěné inhibitory IGFBP, nazvané IGBFP, které inhibují bazální kostní buněčnou proliferaci asi o 40 % v nepřítomnosti séra, tak potvrzují, že endogenní produkce IGF zásadně přispívá k buněčné proliferaci v nepřítomnosti dalších růstových faktorů. A nakonec bylo zjištěno u IGF II receptor blokujících protilátek, že inhibují bazální proliferaci buněk kosti, což naznačuje, že IGF II je klíčovým růstovým faktorem kostních buněk (Mohan a spol., Growth, Genetics and Hormones, 6:1-9 (1990) a Mohan a spol., Clin. Orthopedics and Rel. Res., 263:30-48 (1990)).

Nedávno se také stalo zřejmým, že rodina strukturně podobných proteinů, které specificky váží IGF, je vyžadována pro modulaci akce IGF v různých tkáních. Čtyři třídy lidského IGFBP (označené hIGFBP-1, hIGFBP-2, hIGFBP-3, hIGFBP-4) byly izolovány a kompletní aminokyselinové sekvence určeny z nukleotidových sekvencí izolovaných cDNA klonů [viz Mohan a spol., Clin. Orthopedics and Rel. Res., 263:30-48 (1990); Baxter a spol., Prog. Growth Factor Res., 1: 49-68 (1989); Binkert a spol., EMBO J. 8:2497-2502 (1988); Brewer a spol., Biochem. Biophys. Res. Comm. 152:1289-1297 (1988); Brinkman a spol., EMBO J. 7:2417-2423 (1988); Lee a spol., Mol. Endocrinol, 2:404-411 (1988); Wood a spol., Mol. Endocrinol. 2:1176-1185 (1988); LaTour a spol., Mol. Endocrinol, 4:1806-1814 (1990) a Schimasaki a spol., Mol. Endocrinol. 4:1451-1458 (1990)].

IGFBP-1 byl izolován z různých zdrojů včetně amniotické tekutiny, placentálních membrán, decidua a HEP 62 buněk hepatomu. N-terminální aminokyselinové sekvence IGFBP-1 proteinů, izolovaných z těchto rozdílných zdrojů, byly shledány identickými. Klonování a kompletace sekvencí cDNA, kódující IGFBP-1 z HEP G2, lidské dělohy a lidské placenty, zcDNA knihoven byly popsány. IGFBP-2 byl čištěn z kondicionovaného média, získaného z buněk krysích jater BRL-3A) a z buněk Medin-Darby hovězích ledvin. Gen, kódující IGFBP 2, byl klonován z knihoven BRL-3A a lidských fetálních jater. IGFBP-3 byl nalezen v séru jako 150 kilodaltonový temámí komplex mezi IGF-I nebo IGF-II, acidolabilní glykoprotein asi 85 kilodaltonů, IGFBP-ΠΙ molekule, kterou je v kyselém prostředí stabilní glykoprotein 53 kolodaltonů. IGFBP-ΠΙ byl čištěn k homogenitě z lidského séra a je popsáno klonováni a sekvencování cDNA, kódující IGFBP-ΠΙ. IGFBP-IV byl původně purifikován z kondicionovaného média buněk lidské kosti jako inhibitor IGFBP, a z krysího séra. Klonování a sekvenování IGFB-IV cDNA klonu, izolovaného z knihovny lidských buněk kosti a z knihovny

- 1 CZ 283601 B6 cDNA jater, bylo popsáno nedávno. Navíc k těmto čtyřem třídám IGFBP, Martin a spol., J. Biol. Chem., 265:4124-4130 (1990), Roghabi a spol., FEBS Lett., 255:253-258 (1989) aZapf a spol., J. Biol. Chem., 265:14892-14898 (1990), popisují částečnou purifikaci IGFBP z lidského cerebrospinálního moku, z kultivačního kondicionovaného A6 2804 média transformovaných fibroblastů a z hypoglykemického séra, které vykazuje silnou afinitu pro IGF-II více než IGF-I.

Tak je v oboru popsáno více variant IGFBP, které jsou produkovány z různých zdrojů a které vykazují různorodé vazebné vlastnosti klGF, jakož i rozdílné biologické funkce. Například IGFBP-I. IGFBP-ΠΙ a IGFBP-IV vážou jak IGF I, tak IGF II s téměř stejnou afinitou, zatímco IGFBP-II a IGFBP, purifikovaný z amniotické tekutiny, z fibroblastů a lidského séra, vážou IGF-II s vyšší afinitou než IGF-I. Vzhledem k funkcím byl u IGFBP-I prokázán inhibiční i potenciační efekt na proliferační účinek IGFBP-1 na buňky chorikarcinomu a lidské fibroblasty (Elgin a spol., J. Biol. Chem., 84:3254-3258 (1987) a Ritvos a spol., Endocrinology, 122:2150— 2157 (1988)). U IGFBP-3 bylo zjištěno, že inhibuje nebo stimuluje vliv IGF-1 v závislosti na kultivačních podmínkách ve fibroblastech (De Mellow a spol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 156:199-204 (1988)). Oproti IGFBP-1 a IGFBP-3 byla u IGFBP-4 jako jediného prokázána inhibice IGF-I a IGF-II vlivu na kostní buňky (Mohan a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86:8338-8342 (1989)). Zkušenosti rovněž napovídají, že produkce rozdílných IGFBP je modulována rozdílně specifickým způsobem ve tkáních. Například produkce IGFBP-1 je modulována inzulínem, zatímco produkce IGFBP-3 je modulována růstovým hormonem (Baxter a spol., Prog. Growth Factor Res., 1:49-68 (1989)). Tato zjištění napovídají, že multiplicita různých IGFBP ve spojení s jejich unikátní regulací může způsobovat modulaci IGF aktivit lokálním, tkáňově specifickým způsobem.

V oboru zbývá potřeba stanovit vztah IGF-I a IGF-II funkcí v kostním metabolismu cestou IGFBP, a tak je zde potřeba identifikovat IGFBP, produkované kostními buňkami a přítomné v lidské kostní matrici. Takové IGFBP jsou pravděpodobně vyžadovány v regulaci kostního metabolismu a mohou být použity v klinických zkouškách k poskytnutí informací v diagnostice defektů kostního metabolismu. IGFBP, které potencují IGF-závislý růst kosti, by mohly být zejména užitečné v terapeutických aplikacích pro léčbu metabolických kostních chorob, jako je osteoporéza. Překvapivě předložený vynález doplňuje tyto a jiné potřeby.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje čištěný a izolovaný, z lidské kosti získaný, inzulínu podobný růstový faktor vázající protein, hBD-IGFBP, mající molekulovou hmotnost 29 kDa a mající N-terminální aminokyselinovou sekvenci, identickou nebo v podstatě identickou s aminokyselinovou sekvencí LGSFVHCEPCDEKAL, který je dále charakterizován tím, že má vyšší specifickou vazebnou afinitu pro IGF-II než pro IGF-I a váže hydroxyapatit za přítomnosti 4 mol/1 guanidin.HCl.

Výhodně vynález poskytuje výše definovaný čištěný hBD-IGFBP, který je konjugován k IGF-I nebo IGF-II.

Dalším aspektem vynálezu je farmaceutický přípravek, obsahující výše definovaný čištěný hBDIGFBP protein o 29 kDa nebo jeho fragment a farmaceuticky přijatelný nosič. Tento farmaceutický přípravek popřípadě dále obsahuje IgF-I nebo IGF-II. Výhodně je ve farmaceutickém přípravku IgF-I nebo IGF-II konjugován k hBD-IGFBP.

-2CZ 283601 B6

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 - Srovnání N-terminální aminokyselinové sekvence hBD-IGFBP s jinými známými IGFBP. Sekvence jsou seřazeny tak, aby byly maximálně identické.

Obr. 2 - Křivky kompetitivní vazby hBD-IGFBP. Vzorek byl zkoušen na vazebnou aktivitu proteinu použitím značeného IGF-II za přítomnosti či nepřítomnosti neznačeného IGF-I a IGF-II.

Obr. 3 - Proteinový profil (A) a IGFBP profil aktivity (B) lidského kostního extraktu v FPLC mono Q chromatografickém stupni. Tři 50 ml podíly HA vázaných spojených frakcí byly aplikovány na IGF-II afinitní kolonu. Výsledně tři afmitně navázané frakce byly spojeny a vloženy na Mono-Q-aniontovýměnnou kolonu. Proteinový profil je monitorován absorbancí při 280 nm. Dva ml, 2 min. frakce byly shromážděny. Podíly frakcí byly ředěny desetkrát a zkoušeny na vazebnou proteinovou aktivitu. IGFBP aktivita je vyjádřena v množství specificky navázaného značeného IGF-II.

Obr. 4 - Ligand-blot analýza hBD-IGFBP při rozdílném stupni purifikace. 50 μΐ vzorek byl podroben SDS-PAGE (3-27% gradient), transferován na nitrocelulózové membrány, překryt značeným IGF-II a podroben autoradiografii. Pruh a, HA vazebná funkce lidského kostního extraktu; pruh b, IGF-II afinitní vazebná frakce; pruh c, Mono Q IGFBP pík A; pruh d, Mono Q IGFBP pík B; pruh e, Mono Q IGFBP pík C a pruh f, Mono Q IGFBP pík D.

Vynález poskytuje purifikovaný a izolovaný IGFBP, odvozený z lidské kosti, který váže specificky IGF-II s vyšší afinitou než IGF-I. Protein může být purifikován v požadované homogenitě z proteinového extraktu například z preparátů lidské kosti, kondicionovaného média lidských kostních buněk nebo lidského séra. Preferován je v podstatě čistý hBD-IGFBP z alespoň asi 50 %, preferovanější z alespoň asi 70 až 80% a nej preferovanější 95-99% nebo s vyšší homogenitou, zejména pro farmaceutické použití. Jednou purifikovaný, částečně nebo až homogenní, jak je požadováno, může být pak hBD-IGFBP použit diagnosticky jako imunogen, terapeuticky atd.

hBD-IGFBP, produkovaný v souladu s předloženým vynálezem, může být purifikován hydroxyapatit apatitovou chromatografii, následovanou afinitní chromatografii na koloně s IGFII a nakonec pro větší čistotu Mono Q aniontovýměnnou chromatografii za použití FPLC systému. Vyjádřená homogenita purifikovaného proteinu je demonstrována například jeho migrací v podobě jednoho pruhu na SDS-PAGE a produkcí jedné aminokyselinové sekvence při N-terminální sekvenční analýze. Afinitní chromatografie na protilátkové koloně užitím protilátek, specificky namířených proti hBD-IGFBP, může být také použita v purifikaČním schématu. Další purifikace může být dosaženo konvenčními chemickými purifikačními postupy, jako je kapalinová chromatografie, gradientově odstředění, gelová elektroforéza, které jsou zde uváděny jako příklad. Způsoby čištění proteinů jsou v oboru známé (viz obecně Scopes R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982), zahrnutý zde jako odkaz) a mohou být aplikovány při zde popsaném čištění hBD-IGFBP.

Specifická vazba hBD-IGFBP na IGF-II a IGF-I je demonstrována zkouškou polyethylenglykolového srážení. V tomto aspektu vynález poskytuje purifikovaný protein, který je užitečný ve studiích strukturní funkce determinant IGF, které dovolují vazbu na specifické receptory, jakož i na hBD-IGFBP. Další využití purifikovaného hBD-IGFBP podle vynálezu je popsáno v popisu dalších aspektů vynálezu.

Purifikovaný IGFBP podle vynálezu je unikátní a odlišný od všech předešlých identifikovaných IGFBP. Lidský IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3 a IGFBP-4 jsou charakterizovány aminokyselinovými sekvencemi, které byly publikovány a které jsou odlišné od aminokyselinové sekvence hBD-IGFBP. N-terminální aminokyselinová sekvence, popsaná pro IGFBD, purifikovaný z cerebrospinálního moku, kondicionovaného média fibroblastů a lidského séra je také odlišná od hBD-IGFBP.

Homogenní lidský IGFBP podle vynálezu (hBD-IGFBP) je charakterizován N-terminální aminokyselinovou sekvencí, identickou nebo významně identickou s tou, která je uvedena na obr. 1. Pro účely vynálezu je N-koncovou aminokyselinovou sekvencí, v podstatě identickou se sekvencí, uvedenou na obr. 1, míněna sekvence, identická se sekvencí na obr. 1 s výjimkou přítomnosti konzervativních aminokyselinových substituentů nebo jiných aminokyselinových substituentů, inzercí nebo delecí, které nenarušují vazbu v podstatě identického proteinu na IGFI nebo IGF-II, nebo jinak výrazně nemění jeho funkci v aplikacích, uvedených dále.

Při produkci hBD-IGFBP rekombinantní cestou je gen, který kóduje hBD-IGFBD podle vynálezu, klonován a exprimován inzercí do vhodného expresního vektoru, který je postupně použit ke transformaci nebo transfekci vhodných hostitelských buněk pro expresi rekombinantního hBD-IGFBP polypeptidu. Jedna nebo více syntetických oligonukleotidových sond, reflektujících alespoň část koncové aminosekvence purifikovaného hBD-IGFBP, typicky od asi 14 do asi 25 nukleotidů, je použito pro objasnění cDNA knihovny buněk lidské kosti. Pozitivní klon, obsahující nejdelší inzert, je sekvenován v souladu se standardními postupy. Vyvozená aminokyselinová sekvence je porovnána s N-terminální aminokyselinovou sekvencí purifikovaného proteinu a předpokládaná molekulová hmotnost a aminokyselinové složení, týkající se zjišťované aminokyselinové sekvence, jsou porovnány s těmito hodnotami, které jsou pozorovány pro purifikovaný hBD-IGFBP. Klon je pak využit pro produkci rekombinantního hBD-IGFBP použitím standardních postupů, jak obecně popisuje např. Sambrook a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 Cold Spring Harbor Press, NY, a tato práce je zde uváděna jako odkaz.

V dalším aspektu se vynález týká hBD-IGFBP polypeptidů a fragmentů. Polypeptidy a fragmenty hBD-IGFBP mohou být izolovány z rekombinantního expresního systému nebo mohou být syntetizovány metodou s pevnou fází, jak popisuje Merrifield, Fed. Proč., 21:412 (1962), Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963) nebo Barany a Merrifield, vThe Peptides, vol. 2, str. 1-284 (1979) Academie Press, NY. (tyto práce zde jsou uváděny jako odkazy), nebo za použití automatického peptidového syntetizátoru. „Polypeptidy“ jsou míněny sekvence s alespoň asi 3 aminokyselinami, typicky se 6 a více, až do 100 až 200 aminokyselin nebo více, včetně celých proteinů. Například část(i) hBD-IGFBP proteinu, které vážou hydroxyapaptit a/nebo IGF-II, mohou být identifikovány různými metodami, jako je působení proteázy nebo chemických činidel na hBD-IGFBP, k dosažení fragmentace a určení, který fragment je schopný vázat značený IGF-II nebo hydroxyapatit. Polypeptidy mohou pak být syntetizovány a použity jako antigeny k inhibici IGF-II nebo k hydroxyapatit-hBD-IGFBP interakci atd. Je třeba chápat, že jak je zde použito, jsou odkazy na hBD-IGFBP míněny proteiny, polypeptidy a jejich fragmenty, pokud z kontextu nevyplývá něco jiného.

V dalším aspektu vynález poskytuje znalosti pro regulační aspekty interakce hydroxyapatit (hBD-IGFBP) IGF-II a také léčení, terapeuticky a/nebo profylakticky, chorob, které mohou být spojeny přímo nebo nepřímo s hBD-IGFBP nebo sjeho ligandy, jako je IGF-II. Díky vazebnému proteinu podle vynálezu mohou být identifikovány agonisté nebo antagonisté, kteří stimulují nebo inhibují interakci IGF-II, hydroxyapatitu a jiných ligandů s hBD-IGFBP. Je kontrolován metabolismus a reaktivita buněk v odpovědi na hBP-IGFBP nebo IGF-II s agonisty nebo antagonisty, a jsou tak poskytnuty znalosti pro zmírnění nebo v některých případech zabránění chorob.

-4CZ 283601 B6

Vynález tak poskytuje screeningové postupy pro identifikaci agonistů nebo antagonistů příhod, mediovaných interakcí ligand/hBD-IGFBP. Takové screeningové zkoušky mohou využívat širokou škálu formátů v závislosti na rozsahu, ve kterém je zkoumána interakce ligand/vazebný protein. Například mohou být takové zkoušky zaměřeny na identifikaci sloučenin, které se vážou na vazebný protein a tak blokují nebo inhibují interakci s IGF-II nebo hydroxyapatitem. Další zkoušky mohou byt zaměřeny na identifikaci sloučenin, které mohou nahradit hBD-IGFBP. Ještě další zkoušky mohou být použity k identifikaci sloučenin, které inhibují nebo usnadňují asociaci IGF k hBD-IGFBP a tak zprostředkovávají buněčnou odpověď na IGF.

V dalším aspektu vynález poskytuje protein, který váže IGF-II s vyšší selektivní afinitou než IGF-I. Obr. 2 představuje křivku kompetitivní vazby hBD-IGFBP s ^l_*I/IFG—II jako ligandem a IGF-I a IGF-II jako kompetitory. K. vytěsnění 50 % /'²⁵I/IGF-II z IGFBP je třeba asi 10 pg/ml IGF-I a 1 pg/ml IGF-II, což znamená, že IGF-II byl 1 Okřát potentnější než IGF-I v nahrazení značeného indikátoru. Jestliže byl jako radioaktivně značený indikátor použit /¹²⁵I/IGF, byl IGFII stále více potentní (4krát), než IGF-I. Tyto výsledky napovídají, že IGFBP váže IGF-II s vyšší afinitou než IGF-I. Typicky vazebná afinita hBD-IGFBP pro IGF-II bude v rozsahu od 10'⁹M až do asi 10’¹² nebo více a pravděpodobně v rozsahu nejméně okolo 10'¹⁰ do 10’^uM, zatímco vazebná afinita hBD-IGFBP pro IGF-I bude asi 1 Okřát nižší, tj. asi od 1O‘^SM do asi 10‘^IOM. Selektivní afinita hBD-IGFBP pro IGF-II vyšší než pro IGF-I může vysvětlit, proč IGF-II je 10 až 15krát hojnější než IGF-I v lidské kosti.

Vynález poskytuje terapeutické a farmaceutické kompozice hBD-IGFBP, které využívají výhodu hBD-IGFBP vysoké vazebné afinity k hydroxyapatitu, která je alespoň asi 10'⁹M až 10^_llM nebo více. hBD-IGFBP podle vynálezu se váže na hydroxyapatit i za přítomnosti silně denaturujících agens, jako je 4M guanidin HC1, zatímco purifikovaný IGF-II se neváže na hydroxyapatit. hBDIGFBP tak poskytuje prostředek nebo vehikulum pro fixaci nebo cílení IGF-II do nebo ke kosti. IGF-II může být chemicky kopulován k hBD-IGFBP spojením, které bude snadno pochopitelné pro odborníky, ale které by nemělo podstatně snižovat požadovanou aktivitu vlastního proteinu.

Připojení hBD-IGFBP kjiné molekule, která má být směrována ke kostní tkáni nebo buňkám, jako jsou IGF nebo jiné zde dále uvedené molekuly, může být provedeno chemickým spojením za použití dobře známých laboratorních postupů. Chemickým spojením je míněno, že proteinové molekuly jsou vázány typicky jedna ke druhé, typicky kovalentními vazbami. Preferovanou metodou spojení je tvorba alespoň jedné kovalentní vazby mezi hBD-IGFBP/IGF-II molekulami. Vazba může být přímá, která zahrnuje vazby obsahující syntetické vazebné skupiny, nebo nepřímá, kterou je míněna vazba, mající vloženou skupinu, jako je protein nebo peptid, např. plazmový albumin nebo jiná spacerová molekula. Například vazba může být prostřednictvím heterobifunkčních nebo homobifunkčních zesíťovadel, např. karbodiimidu, glutaraldehydu, N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionátu (SPDP) a derivátů, bis-maleimidu, 4-(Nmaleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylátu (SMCC) zesítěním bez exogenních zesíťovadel pomocí skupin, reaktivních s jednotlivými molekulami, jako jsou karbohydrátové, disulfidové, karboxylové nebo aminoskupiny, oxidací nebo redukcí nativního proteinu, nebo zpracováním s enzymem nebo podobně. Způsoby chemického zesítění proteinových molekul jsou obecně v oboru známé a mnoho hetero- a homobifunkčních činidel je popsáno např. v US pat. č. 4355023, 4657853, 4676980, 4925921 a 4970156 a ImmunoTechnology Catalogue and Handbook, Pierce Chemical Co. (1989), které jsou zde zahrnuty jako citace. Obecně by takové zesítění nemělo podstatně ovlivňovat požadované funkce (i) IGF-II nebo hBD-IGFBP.

Hybridní, chimérická nebo fúzní proteinová molekula IGF-II a hBD-IGFBP nebo jejich části mohou být také připraveny rekombinantními DNA technikami, jak je popsáno např. v US patentu 489609 a v práci Sambroka a spol., supra, které jsou zde zahrnuty jako odkazy.

-5CZ 283601 B6

Ukládání komplexů IGF-II/hBD-IGFBP v kosti dovoluje během resorpce kosti a rozpouštění hydroxyapatitu uvolnění komplexů a iniciaci nové tvorby kosti stimulací proliferace osteoblastů v okolí resorpčního místa. Vzhledem k vysoké afinitě hBD-IGFBP jak k IGF-II, tak hydroxyapatitu, poskytuje vynález terapeutické agens a kompozice, které jsou vhodné inter alia k nasměrování IGF-II a/nebo IGF-I specificky do kosti.

Nový hBD-IGFBP, hBD-IGFBP/IGF-II a jiné konjugáty, protilátky proti hBD-IGFBP ajejich antagonisté a farmaceutické kompozice, které jsou z nich připravovány, jsou zejména využitelné pro podání při léčbě širokého rozsahu chorob, týkajících se hBD-IGFBP a IGF-II. Výhodně mohou být farmaceutické kompozice podávány parenterálně, tj. subkutánně, intramuskulámě nebo intravenózně, nebo topicky, orálně, prostřednictvím aerosolu, intranasálním doručením a podobně. Tak tento vynález poskytuje kompozice pro parenterální podání, které zahrnují roztoky hBD-IGFBP, hBD-IGFBP/ICF-II a jiné konjugáty, protilátky proti hBD-IGFBP a jejich antagonisty, nebo směs hBD-IGFBP a IGF-II, rozpuštěnou v přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči. Může být použito mnoho vodných nosičů, např. voda, pufrovaná voda, 0,4% salinický roztok, 0,3% glycin a podobně. Tyto přípravky mohou být sterilizovány běžnými, velmi dobře známými sterilizačními technikami. Přípravky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné substance, které jsou vyžadovány pro přibližné fyziologické podmínky, jako jsou pH upravující a pufrovací činidla, činidla, upravující toxicitu a podobné, například octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý atd. Koncentrace požadovaného hBD-IGFBP, hBD-IGFBP/IGF-II nebo protilátek k hBD-IGFBP nebo jejich jiných antagonistů v těchto přípravcích se může v širokém rozsahu měnit, tj. od méně než asi 0,00001 %, obvykle alespoň asi 0,001 % až do asi 0,05 až 0,1 % hmotnostního a bude volena v prvé řadě podle objemu kapaliny, viskozit atd., v souladu se zvoleným konkrétním způsobem podání, ošetřovaným stavem, např. reparace fraktur, osteoporóza, ošetřování chirurgických nebo traumatických ran, tumory, jako je osteosarkom nebo plicní karcinom atd., a léčeným subjektem, tj. dospělý, dítě nebo novorozenec.

Typická farmaceutická kompozice pro intravenózní infuzi k léčbě dospělých, trpících mírnou osteodegenerativní chorobou, může být vyrobena tak, že obsahuje 250 ml sterilního Ringerova roztoku a asi 50 mg až 5 gramů hBD-IGFBP nebo hBD-IGFBP/IGF-II. Nynější metody přípravy parenterálně nebo orálně podatelných sloučenin budou známé nebo zřejmé odborníkům v oboru a jsou detailně popsány např. v Remingtonů Pharmaceutical Science, 16. vyd., Mack Publishing Company, Easton, PA (1982), který je zde uveden jako odkaz.

Kompozice, obsahující hBEF-IGFBP nebo hBD-IGFBP/IGF-II nebo jejich kokteily, mohou být podávány při profylaktickém a/nebo terapeutickém ošetření. V terapeutických aplikacích jsou přípravky podávány pacientovi, který již trpí chorobou, odvozenou od hBD-IGFBP nebo IGF-II, v množství dostatečném k vyléčení nebo alespoň k částečnému zmírnění choroby a jejich komplikací. Adekvátní množství k dosažení tohoto účelu je definováno jako „terapeuticky účinná dávka“. Množství, účinné pro toto použití, bude záviset na chorobě, tj. kostní degeneraci, jako je osteroporóza, fraktura, zranění, tumor atd., a její vážnosti, věku pacienta a celkovém stavu pacientova zdraví. Obecně bude množství v rozsahu od 1,0 do 500 pg hBD-IGFBP nebo hBDIGFBP/IGF-II na kilogram tělesné hmotnosti a hodinu infuse, s dávkou od 10 do 50 pg hBDIGFBP nebo hBD-IGFBP/IGF-II na kilogram infuze, která je obecně více používána. Tak mohou být tyto materiály pole vynálezu použity u vážných chorobných stavů z hlediska minimalizace cizích substancí a absence odpovědí na cizí substance, a je možná a zdá se být žádoucí lékařská léčba podáním značně vyšších dávek těchto farmaceutických substancí.

V profylaktických aplikacích jsou kompozice, obsahující předložený hBD-IGFBP nebo hBDIGFBP/IGF-II nebo jejich kokteily, podávány pacientům ještě ne v chorobném stavu ke zvýšení pacientovy rezistence k chorobě. Takové množství je definováno jako „profylakticky účinná dávka“. V tomto použití je přesné množství opět závislé na pacientově zdravotním stavu atd., ale

-6CZ 283601 B6 obecně v rozsahu od 1 do 500 pg na kilogram a hodinu infuze, výhodně 10 až 50 pg na kilogram a hodinu. Výhodné profylaktické použití je pro léčbu pacientů, rizikových pro vážné osteodegenerativní choroby.

Jednotlivé nebo mnohonásobné podání může být provedeno s hladinou dávky a dávkovacím vzorem, vybraným ošetřujícím lékařem. V každém případě by farmaceutická kompozice měla poskytnout množství hBD-IGFBP nebo hBD-IGFBP/IGF-II, dostačující například pro léčbu pacienta.

V ještě dalším aspektu poskytuje vynález agens, které účinně stimuluje prolifenaci kostních buněk v odpovědi na IGF-II. Exogenní podání IGF-II do kostních buněk ze séra prostých podmínek zvyšuje jejich proliferaci. Tento proliferativní efekt IGF-II je potencován přidáním hBD-IGFBP v konjugaci s IGF-II. Toto synergické působení kombinace hBD-IGFBP a IGF-II, které je větší než aditivní účinek, dosažený kombinací výsledků, získaných s každým agens zvlášť, nebyl popsán pro jiné IGFBP vjakémkoliv buněčném typu. Tak vynález poskytuje terapeutické agens pro léčbu kostních chorob (např. osteoporózy) tam, kde je poškozena tvorba kosti. Farmaceutické kompozice budou obsahovat hBD-IGFBP a je-li to žádoucí, IGF, s fyziologicky přijatelnými nosiči a/nebo přísadami.

Tento vynález také poskytuje agens, které může být obecně použito u hojení ran a kožní reparace, ke zvýšení síly a poločasu IGF, protože hBD-IGFBP může zvyšovat poločas IGF jejich ochranou před proteázami, hrát úlohu v zaměření IGF specificky do kosti a/nebo potenciovat proliferativní působení IGF.

Komplexy hBD-IGFBP + IGF mohou být připraveny mnoha způsoby, např. inkubací koncentrátů purifikovaného hBD-IGFBP a IGF při neutrálním pH přes noc před podáním. Koncentrace hBD-IGFBP a IGF v kompozicích může být velmi široká, ale výhodně jsou tyto koncentrace přibližně ekvimolámí. Další formulace budou známé odborníkům v oboru v kontextu předkládaného popisu. Je-li formulována separátně, může být kompozice hBDIGFBP podána separátně nebo současně s kompozicí IGF-II. Je-li podána separátně, bude typicky podán jako první hBD-IGFBP a potom IGF-II. Takové kompozice mohou být podány ve specifických oblastech ke stimulování lokální formace kosti (tj. např. reparace zlomenin) nebo podány systémově, jako při léčbě kostních chorob, jako je osteoporóza, ke zvýšení obecné tvorby kostí.

V dalším využití poskytuje předkládaný vynález přípravu více potentních IGF molekul. Struktumě-ftinkční analýza IGF a hBD-IGFBP mohou identifikovat oblast (i) IGF, které jsou využity ve vazbě na hBD-IGFBP. Je možné produkovat IGF molekuly, modifikované aminokyselinovými substitucemi, inzercemi nebo delecemi tak, že se modifikované molekuly vážou na IGF receptory a hBD-IGFBP s vyšší afinitou, ale ne na inhibitory IGFBP, jako je IGFBP-4 a IGFBP-3. Takto modifikované IGF molekuly mohou sloužit jako potentní anabolická činidla ve spouštění obecného hojení ran a v kožní reparaci. V dalším využití jsou produkovány fragmenty hBD-IGFBP. Fragmenty budou typicky mít požadovanou funkci, jako je schopnost vázat se na IGF-Π nebo hydroxyapatit, zatímco jsou eliminovány další části molekul, které nejsou podstatné pro tuto funkci. Fragmenty mohou být použity jednotlivě nebo společně.

Navíc k IGF, hBD-IGFBP podle vynálezu jsou užitečné v zaměření jiných žádoucích molekul do kosti. Molekuly mohou ovlivňovat tvorbu nebo resorpci kosti přímo nebo nepřímo. Jak bude zřejmé odborníkům, může byt široký rozsah agens zaměřen do kostní tkáně tímto způsobem. Reprezentativní příklady zahrnují látky, které stimulují formaci kosti, jako je kostní morfogenní protein (BMP), TGF3, fibroblastový růstový faktor (FGF), od destiček odvozený růstový faktor (PDGF), činidla, která snižují formaci kosti, jak může být žádoucí u určitých nádorů, jako jsou glukokortikoid nebo 1,25-dihydroxyvitamin D₃, sloučeniny, které zvyšují resorpci kosti, jako je

-7CZ 283601 B6 kolonie makrofágů stimulující faktor (M-CSF) a interleukiny, a sloučeniny, které snižují kostní resorpci, jako je bis-fosfonát a kalcitonin, které jsou uváděny jako příklady. Sloučeniny mohou být navázány na hBD-IGFBP řadou způsobů, zahrnujících konjugaci, uvedenou výše, jakož i fůzní a chimérické proteiny, jak je to vhodné. Typická dávka výše uvedených zaměřených sloučenin, jako jsou růstové faktory, bude uvolněna na povrchu kostní tkáně v koncentraci v roztoku od 10 pg/ml do asi 50 ng/ml kostní tkáně.

V dalším aspektu vynález poskytuje diagnostický markér ke zhodnocení tvorby kosti v klinických vzorcích, odebraných pacientům, kteří mají metabolické kostní choroby nebo kostní neoplasie. Vzhledem ke zjištění, že hBD-IGFBP je významný modulátor účinku IGF-II a že IGF-II je důležitý růstový faktor lidské kosti, může být hladina hBD-IGFBP použita k monitorování chorob kostního metabolismu, kde aberantní hladiny hBD-IGFBP reprezentují přítomnost choroby. Vynález také tedy poskytuje činidla, obsahující markér pro klinickou diagnostiku tvorby kosti, pro monitorování tvorby kosti během léčby kostních chorob terapeutickými činidly. Kompozice hBD-IGFBP nebo protilátek může být použita pro detekci a kvantifikaci hBD-IGFBP v biologických tekutinách, jako je lidská plazma, sérum nebo moč.

Jak bude známo odborníkům, množství typů imunozkoušek je vhodné pro použití v tomto vynálezu. Například přímá a nepřímá vazebná zkouška, kompetitivní zkoušky „sandwich“ zkoušky a podobně, které jsou obecně popsány např. v US patentech č. 4642285, 4376110, 4016043, 3879262, 3852157, 3850752, 3839153, 3791932, a v práci Harlowa a Lanea, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N.Y. (1988), které jsou zde všechny citovány jako odkazy. V jedné zkoušce je formát hBD-IGFBP kvantifikován přímo měřením vazby protilátek na hBD-IGFBP a tyto protilátky jsou pak detekovány např. značenými anti-IgG, IgM a/nebo IgA lidskými protilátkami. V jiném provedení může být pacientův hBDIGFBP měřen kompeticí o vazbu se značeným nebo neznačeným hBD-IGFBP. Velké množství radioaktivně značených látek může být použito, jejich příklady jsou radionuklidy, částice (např. zlato, feritin, magnetické částice, červené krvinky), fluorované látky, enzymy, enzymové substráty, kofaktory enzymů, enzymové inhibitory, ligandy (zejména hapteny), chemiluniscenční látky atd., ale výhodně se užívají radionuklidy.

Také mohou být hBD-IGFBP nebo protilátky pro použití v takových zkouškách navázány na nerozpustný nebo pevný nosič, jako je ELISA mikrotitrační jamka, mikrokuličky, filtrová membrána, nerozpustný nebo vysrážitelný polymer atd. za účelem funkce afinitní pryskyřice. Antiséra nebo monoklonální protilátky k hBD-IGFBP jsou obyčejně nelidského původu, jako jsou antiséra králičí, kozí, myší atd.. Také mohou být poskytnuty kity pro použití pro detekci hBD-IGFBP, kde hBD-IGFBP a/nebo protilátky mohou být poskytnuty, obvykle v lyofilizované formě, v kontejneru, buď samostatně nebo ve spojení s dalšími činidly, značenými látkami a/nebo anti-protilátkami a podobně. hBD-IGFBP polypeptid a protilátky, které mohou být konjugovány na značnou látku, nebo být nekonjugovány, a jsou obsaženy v kitech s pufrem, jako je TRIS, fosfát, uhličitanový pufr, atd., stabilizátory, biocidy, inertními proteiny, např. sérem, albuminem, nebo podobně. Často je žádoucí, aby obsahovaly inertní excipiens nebo nastavovadlo pro zředění aktivních složek, kde přísada může být přítomna v množství od asi 1 až do asi 99 % celé kompozice.

Protilátky pro diagnostické nebo terapeutické použití mohou být produkovány mnoha způsoby. Příprava ne-lidských monoklonálních protilátek, např. myších, je dobře známa a může být například provedena imunizací zvířete rekombinantní nebo syntetickou hBD-IGFBP molekulou nebo její vybranou částí (např. peptidem). Například je možno selektovaným screeningem identifikovat oblast hBD-IGFBP molekuly, která je predominantně odpovědná za rozpoznání IGF, jestliže je to žádoucí. Protilátky produkující buňky, získané z imunizovaných zvířat, jsou imortalizovány a screenovány, nebo nejdříve screenovány na produkci protilátek, které vážou hBD-IGFBP, a pak imortalizovány.

-8CZ 283601 B6

Následující příklady slouží pro ilustraci vynálezu a v žádném případě jej nikterak neomezují.

Procenta, pokud není uvedeno jinak, jsou procenta hmotnostní (hmotn./hmotn.).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava lidského kostního extraktu pro purifikaci hBD-IGFBP

Hlavice lidského femoru. získané během operace celkové náhrady kyčle, byly uskladněny zmrazené při -20 °C do použití. Kosti byly rozřezány pásovou pilkou a rozemlety na konečné části ve Wiley mlýnku pro provedení extrakce hBD-IGFBP. Kostní proteiny byly extrahovány demineralizací prášku hlavic stehenní kosti 10% ethylendiamintetraacetátem (EDTA) za přítomnosti 4M guanidin HCI a inhibitorů proteázy (Guanidin EDTA extrakt) po počáteční extrakci vodou a 4M guanidin HCL, jak popisuje Mohan a spol., (Biochem. Biophys. Acta, 884:234-242 (1986)). Guanidin EDTA extrakt byl pak koncentrován v Amicon-u použitím YM5 (propustnost 5 kilodalton molekulová hmotnost) a použit pro čištění hBD-IGFBP.

Příklad 2

Čištění a charakterizace hBD-IGFBP z extraktu lidské kosti

Extrakt lidských kostí se zpracuje hydroxyapatitovou (HA) chromatografii ve 4M guanidin HCI, jak popsal Mohan a spol., ibid. IGF-II afinitní kolona se připraví navázáním 250 pg IGF-II, purifikovaného z lidských kostí, ke kuličkám bromkyanem aktivované Sepharosy 4B. Spojené HA navázané frakce se zahustí v Amicon buňce za použití YM5 membrány na asi 300 ml a dialyzují se proti 20násobnému objemu pufru fosforečnanu draselného (10 mM draselný fosforečnan, pH 6,0), obsahujícím inhibitory proteázy (100 mM epsilon kapronové kyseliny, 5 mM benzamidinu, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu). IGF-II afinitní kolona se ekvilibruje pufrem fosforečnanu draselného a pak se 50 ml podíl (přibližně 3 až 4 mg celkového proteinu/ml) dialyzované HA navázaná frakce spojeného kostního extraktu nanese na tuto kolonu. Kolona se pak intenzivně promyje pufrem fosforečnanu draselného pro úplné odstranění nenavázaných proteinů. Navázané proteiny se eluují 20 až 25 ml 30 mM tris-acetátu (pH 7,2)/4M guanidin-HCl. Afmitně navázaná frakce se zahustí v Amicon buňce za použití YM 5 membrány a pak se dialyzuje vůči 30 mM tris-HCl (pH 8,0) pufru. Dialyzovaná afinitně navázaná frakce se aplikuje na sloupec anexu Pharmacia FPLC Mono Q, předem ekvilibrovaný tris-HCl pufrem. Navázané proteiny se eluují lineárním gradientem 0-1 M NaCl ve 20 mM trisHCl pufru během 100 min.

hBD-IGFBP aktivita byla stanovena metodou srážení polyethylenglykolem. Stručně, 50 μΐ vzorku, který je zkoušen, se inkubuje se 2500 až 50000 cpm ¹²⁵I- značeného IGF-I nebo IGF-II 60 minut při teplotě místnosti ve 250 μΐ 0,1Μ HEPES/0,1% hovězí sérový albumin/0,1% Triton X100/44 mM Na₂C0₃/0,02 % NaN₃, pH 6. Ktéto směsi se přidá 100 μΐ 2% imunního sérového globulinu a 500 mikrolitrů 25% polyethylenglykolu a pak se odstředí. Za těchto podmínek polyethylenglykol sráží velký komplex mezi IGF-I nebo IGF-II a hBD-IGFBP, ale nesrazí nenavázaný IGF-I nebo IGF-II. Množství ^l2'I-IGF-II v PEG sraženině se pak spočte. Nespecifická vazba se pak stanoví provedením zkoušky za přítomnosti přebytku neznačeného IGF-I nebo IGF-II a množství ¹²⁵I—IGF—I nebo ¹²⁵I—IGF—II, které se vysráželo, se odečte od výše získané hodnoty.

-9CZ 283601 B6

Pro stanovení zdánlivé molekulové hmotnosti hBD-IGFBP byla provedena ligand-blot analýza za použití ¹²⁵I—IGF—II jako značkovače. V tomto postupu bylo 50 μΐ vzorku zpracováno elektroforézou za neredukujících podmínek na 3-27% SDS destičkách s polyakrylamidovým gelem. Po přenesení vzorků na nitrocelulózu elektroblottingem se nitrocelulózové membrány inkubují s radioaktivně značeným IGF—II. Po promytí nenavázaného radioaktivně značeného IGF—II se membrána podrobí autoradiografii, jak popsal Hossenloop a spol., (Anal. Biochem., 154:138-143 (1986)).

Složení aminokyselin ve vzorku bylo stanoveno analyzátorem Applied Biosystems model 420 a N-terminální sekvence byly stanoveny pomocí Applied Biosystems model 470A proteinovém sekvenátoru v parní fázi (Mohan a spol., Biochim. Biophys. Acta, 966:44—55 (1988)).

Obr. 3 představuje proteinový profil a IGFBP profil aktivity spojené afinitně navázané fáze ve stupni Mono Q chromatografie. Nebyl přítomen ani pík absorbance proteinu, ani pík aktivity IGFBP v oblasti, kde se eluuje autentický IGFBP-4 (frakce 9-15, 0,lM NaCl), toto potvrzuje, že z kosti získaný IGFBP není IGFBP-4. Nicméně zde byly nalezeny čtyři proteinové absorbanční píky, eluující při různých koncentracích NaCl. Ze čtyř proteinových píků obsahují první dva píky (A a B) významnou IGFBP aktivitu, zatímco poslední dva píky (C a D) mají malou IGFBP aktivitu.

Pro zkoušku zdánlivé molekulové hmotnosti IGFBP, přítomných v extraktu lidské kosti, byl použit ligandblotting a/'^2oI/IGF-II afinitní radioaktivní značení. Obr. 4 představuje ligand-bloty, ve kterých HA vazba, IGF-II vazba a Mono Q proteinové píky byly podrobeny elektroforéze na dodecylsulát sodný-polyakrylamidovém gelu, přeneseny na nitrocelulózu a zkoumány /¹²⁵I/IGFII značkovačem. Hlavní IGFBP, přítomný v HA navázaných a IGF-II navázaných frakcích, má zdánlivou molekulovou hmotnost 29 kDa. Dále tyto frakce také vykazují široký, málo intenzivní pruh mezi 68 a 43 kDa markéry molekulové hmotnosti. Hlavní 29 kDa IGFBP se oddělí od IGFBP s vyšší molekulovou hmotností Mono Q chromatografií. Mono Q pík A vykazuje hlavní pruh při 29 kDa a minoritní pruh při 24 kDa. Mono Q pík B vykazuje široký difúzní pruh mezi 68 a 43 kDa markéry a malý pruh při 29 kDa. Mono Q pík C (představuje pík absorbance hlavního proteinu) a D vykazuje pouze slabý pruh při 29 kDa. Tyto údaje potvrzují, že hlavním IGFBP v lidském kostním extraktu je 29 kDa IGFBP.

Jak složení aminokyselin, tak N-terminální aminoky selinová sekvence 29 kDa IGFBP v Mono Q píku A se jeví být jedinečné, mající omezenou podobnost k jiným známým IGFBP (tabulka 1,2, obr. 1).

Tabulka 1

Aminokyselinové složení hBD-IGFBP a známých IGFBP

	pík A	IGFBP-1	IGFBP-2	IGFBP-3	IGFBP-4
asx	8,1	6,8	6,6	6,8	8,0
glx	5,9	13,2	13,9	10,2	12,2
ser	9,3	9,0	3,5	10,2	5,9
gly	9,0	7,3	11,8	8,7	9,7
his	5,1	2.6	3,8	2,7	4,6
arg	6,3	4,3	6,9	7,2	8,0
thr	6,3	3,8	3,8	3,4	2,5
ala	7,9	11,1	7,3	6,8	6,8
pro	5,8	7,7	9,3	8,7	8,9

- 10CZ 283601 B6

Tabulka 1 (pokračování)

Aminokyselinové složení hBD-IGFBP a známých IGFBP

	pík A	IGFBP-1	IGFBP-2	IGFBP-3	IGFBP-4
tyr	3,7	2,6	1.7	3,4	1,3
val	6.6	3.8	5,5	5,3	3,8
met	3,5	1,3	3,1	0,8	1,7
cys	5,5	7,7	6,6	6,8	8,4
ile	3,3	3,8	1,4	2,3	2,5
leu	6,8	7,3	9,0	7,2	8,0
phe	2,9	1,7	1,0	1,9	2,1
lys	4,0	3,8	4,5	7,2	5,1
trp	2,1	0,3	0,4	0,4

100 mm v průměru řezy immobilonové membrány se smočí methanolem, umístí do Millipore filtrační jednotky a udržují na místě O-kroužky z kaučuku. Po promývání immobilonové membrány vodou se BP v píku A fixuje na membránu filtrací přes 1 ml píku A. Polovina membrány se použije pro studie složení aminokyselin.

Tabulka 2

Aminoterminální sekvence hBD-IGFBP v Mono Q píku A

Zbytek	aminokyselina (nmol)
1)	L =	59,4
2)	G =	50,1
3)	F =	34,8
4)	F =	48,0
5)	V =	49,1
6)	X
7)	v =	27,1
8)	E =	20,6
9)	P =	22,2
10)	D =	15,2
11)	D =	18,7
12)	K =	13,4
13)	A =	22,8
14)	A =	32,8
15)	L =	28,5

Pro analýzu N-terminální aminokyselinové sekvence bylo použito 50 pmol hBD-IGFBP. Průměr z opakovaných výsledků byl 86,3 %. X = není znám.

Takto byl 29 kDa IGFBP označen jako IGFBP, odvozený z lidské kosti (hBD-IGFBP). Dále ke hlavní sekvence (leu-Gly-Phe-Val-X-Val-Glu-Pro-Asp-Asp-Lys-Ala-Ala-Leu) zde byla evidentní přítomnost další sekvence v Mono Q píku, která postrádá jednu nebo dvě aminokyseliny na N-zakončení. Purifikovaný hBD-IGFBP se jeví být citlivý k proteolytickému štěpení, protože uchovávání čištěného 29 kDa IGFBP při 5 °C vede přes noc ke zmizení 29 kDa pruhu a objevení se hlavního pruhu při 24 kDa a pruhů o nízké molekulové hmotnosti, kterých je několik. Při N-terminální sekvenční analýze 24 kDa pruhu byla získaná sekvence (Leu-Gly

- 11 CZ 283601 B6

Phe-X-Val-X-X-Glu-Pro-X-X-Lys) podobná sekvenci 29 kDa IGFBP. Další skladování 24 kDa IGFBP vede k jeho zmizení a objevení se několika pruhů s nízkou molekulovou hmotností, které se jeví jako obsahující velmi málo IGFBP aktivity, jak bylo stanoveno ligand-blot analýzou. Ve shodě s těmito výsledky jsou dříve uváděné údaje o proteázách, spojených s IGFBP.

Mono Q pík B se jeví jako mající rozdílné složení aminokyselin a nepotencuje působení IGF-II v kostních buňkách. Pokusy sekvenovat pík B byly neúspěšné. Stanovení sekvence prvních několika málo cyklů majoritního proteinového píku (frakce 45, pík C), poskytlo mnoho aminokyselin s nečitelnou sekvencí. Proto Mono Q píky C a D, které obsahují velmi málo IGFBP aktivity, mohou představovat degradační produkty 29 kDa IGFBP.

Protože N-terminální sekvence Mono Q purifikovaného hBD-IGFBP píku poskytuje navíc ke hlavní sekvenci další sekvence, které postrádají jednu nebo dvě aminokyseliny (pravděpodobně díky ko-purifikaci IGFBP proteázy, která degraduje tento IGFBP) a protože cysteinový zbytek nebyl derivatizován, mohou být valin v poloze Ί předložené hBD-IGFBP sekvence a aspartová kyselina v poloze 10 cysteiny (cysteinové zbytky byly chráněny v mnoha různých členech IGFBP rodiny). Uchovávání Mono Q purifikovaného z lidské kosti odvozeného IGFBP při 5 °C vede ke zmizení 29 kDa IGFBP a objevení se menší molekulových hmotností IGFBP při SDSPAGE. Jestliže byly IGFBP o malé molekulové hmotnosti sekvenovány, nebyly nalezeny valin a aspartová kyselina v poloze 7 a 10, kde v těchto polohách nebyly žádné signály. Tato zjištění potvrzují, že tyto hBD-IGFBP mají sekvenci vjednom provedení L-G-F-F-V-X-C-E-P-CD-K-A-A-L. Alternativní sekvence pro hBD-IGFBP, která také spadá do výše uvedených zjištění je: L-G-S-F-V-H-C-E-P-C-D-E-K-A-L, a tato sekvence je podobná BP-5 sekvenci podle Kiefera a spol.. Biochem. Biophys. Res. Comm. 176:219-225 (1991). Shimasaki a spol., J. Biol. Chem. 266:10646-10653 (1991), ajakji popsal Drop, Endocrinol. 130:1736-1737 (1992). Sekvence může být podrobena různým variacím, založeným na nativní nebo zavedené substituci(ích), adicích nebo delecích, které mohou být variacemi allelickými nebo být produkovány zde zahrnutými technikami částečné sekvence. Je třeba uvést, že použitím zde popsaných metod může být protein izolován a purifíkován a sekvence stanovena různými známými metodami. Dále N-terminální sekvence umožňuje konstrukci degenerovaných oligonukleotidových sond pro klonování genu, který kóduje hBD-IGFBP podle vynálezu.

Příklad 3

Použití hBD-IGFBP ve studii proliferace kostních buněk

Studie IGF-mediované proliferace kostních buněk v séra prostém kultivačním médiu, která je popsána Mohanem a spol., (Biochem. Biophys, Acta, 884:234-242 (1986)). citováno jako odkaz, měří inkorporaci /³H/thymidinu do kyselinou trichloroctovou srážitelného materiálu. Tato zkouška byla provedena za použití myší osteoblastické buněčné linie MC3T3-E1. Přibližně 10000 buněk bylo umístěno na jamku v séru prostém Dulbecco-modifikovaném Eaglově médiu do 48-jamkových kultivačních misek a použito pro /³H/thymidin studii, jak obecně ji popsal Mohal a spol., ibid.

V této zkoušce hBD-IGFBP samotný má malou mitogenní aktivitu, jak je stanoveno inkorporaci /³H-thymidinu do makromolekul, nerozpustných v kyselině trifluoroctové (tabulka 3, dále). Nicméně jestliže hBD-IGFBP se přidá spolu se submaximálními koncentracemi IGF-II k séru prostým kulturám myších kostních buněk, potencuje hBD-IGFBP proliferativní působení IGFII. IGFBP-3 vykázal zvýšení působení IGF-I pouze, jestliže se přidá ke kulturám několik hodin před přídavkem IGF-I (Mohan a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86:8338-8342 (1989) a De Mellow a spol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 156:199-204 (1988)) a u žádných jiných IGFBP se neočekává že budou vykazovat potencování působení IGF za podmínek, kdy IGF a

- 12CZ 283601 B6

IGFBP jsou přidávány současně. Tyto údaje potvrzují, že hBD-IGFBP není více pasivním nosičem pro IGF, ale také pozitivně reguluje působení IGF. I když mechanismus(y) kterými hBD-IGFBP potencuje IGF-II stimulovanou /³H/thymidinovou inkorporaci, není znám, nejsou jakékoliv mechanismy možného vysvětlení omezujícími. Například hBD-IGFBP směruje IGF-Π do buněčné membrány pro snadnější přístup IGF-II kjeho receptorům (především přes RGD sekvenci jako v případě IGFBP-1). Nebo hBD-IGFBP může zvyšovat afinitu IGF-II kjeho receptorům díky svému navázání na IGF-II a/nebo zvyšuje životnost IGF-II jeho ochranou před proteázami.

Tabulka 3

Potenciující účinek hBD-IGFBP na IGF-II indukovanou proliferaci buněk /³H/thymidinová inkorporace (% kontroly) pokus 1 pokus 2 pokus 3 ošetření

BSA kontrola	100 ± 15	100 ±22	100 ± 12
hBD-IGFBP	128 ± 18	213±29	116 ± 9
IGF-II	138 ± 18	265 ± 43	214 ±24
hBD-IGFBP + IGF-II*	195 ±32	672 ± 74	320 ± 40

Séra prosté kultury myší osteoblastické buněčné linie MC3T3-E1 byly inkubovány 18 hodin s efektory před přídavkem /³H/-thymidinu. Konečné koncentrace IGF-II a hBD-IGFBP byly 3 a 10 ng/ml. Hodnoty představují průměr ± st. odch. 6 provedení vjamkách. /³H/thymidininkorporací v hovězím sérovém albuminu (BSA) ošetřené kontrolní kultury byly 1404 ±217, 237 ± 53 a 730 ±91 ve třech experimentech.

^xInterakce mezi hBD-IGFBP a IGF-II byla vysoce signifikantní (P 0,00001) třemi způsoby analýzy mezi pokusy hBD-IGFBP a IGF-II za použití CSS počítačového programu.

Příklad 4

Purifikace hBD-IGFBP z kondicionovaného média kostních buněk

Protože kostní buňky produkují hBD-IGFBP, séra prosté kondicionované médium, oddělené od kultur kostních buněk, může být také použito pro purifikaci hBD-IGFBP. Kondicionované médium kostních buněk se zahustí v Amicon-u za použití YM5 (5 kilodalton molekulovou hmotnost oddělující), okyselí se kyselinou octovou na konečnou koncentraci 1M a podrobí se gelové filtraci na Sephadexu G-100 pro oddělení IGF od IGFBP. Proteiny se eluují 1M kyselinou octovou. Frakce, obsahující IGFBP, se spojí, lyofilizují, rekonstituují fosfátem pufrovaným salinickým roztokem a zpracují na IGF-II afinitní koloně. Afinitně navázané proteiny se pak podrobí FPLC Mono Q aniontovýměnné chromatografií pro oddělení hBDIGFBP od jiných IGFBP.

- 13CZ 283601 B6

Příklad 5

Kvantitativní diagnostická studie pro hBD-IGFBP hBD-IGFBP z lidské kosti nebo exprimovaný rekombinantními způsoby se použije pro produkci polyklonálních a/nebo monoklonálních protilátek, a tyto protilátky se pak použijí ve kvantitativní zkoušce hBD-IGFBP. hBD-IGFBP se smísí s kompletním Freudovým adjuvans a injektuje králíkům, morčatům, krysám nebo myším podle standardních protokolů pro výrobu protilátek. Zvířatům se potom injikuje hBD-IGFBP smísený s nekompletním Freudovým adjuvans každé 3 až 4 týdny. U polyklonálního antiséra se zvířata vykrvácí po 3 až 4 injekcích a titr protilátky k hBD-IGFBP se stanoví radioimunozkouškou nebo podobnými způsoby. Monoklonální protilátky jsou produkovány imortalizující protilátky produkujícími buňkami, získanými z imunizovaných zvířat za použití dobře známých technik. Purifikovaný hBD-IGFBP je radioaktivně značen a použit jako signál produkující markér. Monoklonální protilátka nebo antisérum s vyšším titrem je pak použito pro vývoj hBD-IGFBP radioimunozkoušky pro měření hBD-IGFBP hladin v séru, moči nebo jiných biologických kapalinách.

Obecně se produkce hBD-IGFBP zvyšuje ošetřením kostních buněk činidly, která zvyšují proliferaci buněk kosti. Tak může být hBD-IGFBP použit jako diagnostický markér pro chorobné stavy, spojené s proliferaci kostních buněk, jako je osteoporóza. Podle toho nízký sérový hBD-IGFBP indikuje osteoporózu, spojenou s nízkou tvorbou kostí. Protože hBDIGFBP potencuje působení IGF-II, vysoký sérový hBD-IGFBP může být také spojen s některými rakovinami.

Příklad 6

Kvantitativní diagnostická zkouška IGF použitím hBD-IGFBP

Jak je popsáno v tomto příkladě, může být také použit rekombinantní nebo purifikovaný hBDIGFBP pro kvantifikaci hladin IGF v biologickém vzorku, jako je sérum. 2-5 ng purifikovaného hBD-IGFBP se inkubuje se 40000 cpm ^l25I-IGF za přítomnosti nebo nepřítomnosti neznačeného kompetitoru. IGF standardy nebo vzorky, obsahující neznámá množství IGF, se použijí jako kompetitory. Po 60 minutách inkubace při teplotě místnosti se hBD-IGFBP-IGF komplex vysráží přídavkem polyethylenglykolu za přítomnosti hovězího gamaglobulinu. Po 30 minutách odstřeďování při 1185 x g se podíl supematantu spočte v gamma čítači. Standardní křivka se provede při různých koncentracích neznačeného IGF a množství IGF v neznámém vzorku se spočte za použití standardní křivky. Množství biologicky aktivního volného IGF tak bylo stanoveno touto zkouškou za použití purifikovaného hBD-IGFBP, který má vysokou afinitu pro IGF.

Příklad 7 hBD-IGFBP fixace IGF-II v kosti

Lidská kost obsahuje relativně velké množství IGF-II. Nicméně jak je uvedeno v tabulce 4, ¹²⁵I značený IGF-II samotný neposkytuje specifickou vazbu k hydroxyapatitu (tabulka ukazuje pouze nespecifickou vazbu, která je menší než 10 % celkem přidaného čísla) nebo ke kolagenu. Na rozdíl od IGF-II, značený hBD-IGFBP vykazuje specifickou vazbu k hydroxyapatitu. Vazba hBD-IGFBP k hydroxyapatitu byla specifická, protože hlavní sérový vazný protein, tj. IGFBP-3, neměl žádnou podobnou aktivitu a protože hBD-IGFBP se neváže ke kolagenu, další hlavní složce kosti. Dále vazba hBD-IGFBP k hydroxyapatitu byla silná, takže hBD-IGFBP-hydroxyapatitový komplex nemohl být disociován 4M guanidin HC1 (4M guanidin HC1 prokázal

- 14CZ 283601 B6 disociační interakce mezi komplexem protilátka-antigen). Preinkubace značeného IGF-II s hBD-IGFBP před přídavkem k hydroxyapatitové koloně významně zvyšuje IGF-Π vazbu ke sloupci hydroxyapatitu. Tato aktivita hBD-IGFBP, usnadňující vazbu IGF-II na hydroxyapatit, byla specifická tím, že IGFBP-3 neměl žádnou takovou aktivitu. Tato zjištění jsou v souladu se závěrem, že za normálních podmínek IGF-II je fixován v kosti působením hDB-IGFBP.

Tabulka 4 hBD-IGFBP usnadnění vazby IGF-II k hydroxyapatitu

Ligand % značkovače, navázaného k hydroxyapatitu kolagenu typu I

/I25i/igf-ii	< 10	< 10
/,25I/hBD-IGFBP	60	< 10
/125I/1GF-II + hBD-IGFBP	45	< 10
/125I/IGFBP-3	< 10	< 10
/i25I/IGF—II + IGFBP-3	< 10	< 10

Příklad 8

Regulace IGFBP-5 produkce v buňkách lidské kosti in vitro

Pro stanovení, zda lidské kostní buňky produkují hBD-IGFBP in vitro, byly Northem-bloty všech RNA extrahovaných ze séra prostých kultur MG63, TE85, TE89, SaOs2 a U2 lidských osteosarkomových buněk hybridizovány za použití oligonukleotidové sondy vůči N-terminální sekvenci hBD-IGFBP a za použití lidské IGBP-5 cDNA sondy (Dr. Shimasaki, La Jolla, CA). Tyto studie potvrzují, že všechny buněčné linie, které byly testovány, exprimují hBD-IGFBP mRNA. Pole Westem-ligand-blot analýzy zvyšuje IGF-I a IGF-II produkci hBD-IGFBP několikrát v U2 buňkách. Biologická charakterizace hBD-IGFBP potvrzuje, že tento protein potencuje proliferativní působení IGF-II v kostních buňkách.

Proliferace lidských osteoblastů a produkce IGF-II stimulovaná progesteronem in vitro byla sledována. V tomto pokuse byl studován vliv progesteronu na jiné složky v IGF regulátorovém systému (IGF—I, IGFBP a IGF receptory) v lidské osteoblastům podobné osteosarkomové buněčné linii MG63. Ve všech pokusech byly MG63 buňky umístěny v hustotě 7500 buněk /cm* v DMEM, obsahujícím 1 % telecího séra. Po inkubaci přes noc bylo médium zaměněno za séra prosté před přídavkem progesteronu nebo vehikula (ethanolu). V době průběhu studie byly buňky inkubovány se 100 mM progesteronu po 0,5 hodiny, 2 hodiny, 4 hodiny a 6 hodin. Analýzy Northem-blot demonstrují zvýšení v hladinách mRNA pro IGF-II, IGF-I, hBD-IGFBP a typ—1 a typ-2 IGF receptoru po 30 minutách až 6 hodinách ve srovnání s případnými kontrolami. Hladiny mRNA inhibitoru IGFBP-4, nicméně, byly sníženy během 30 minut po přídavku progesteronu. Toto nebylo přiřčeno změnám v hladinách IGFBP-3 mRNA. Progesteron, steroidní hormon, který byl zjištěn jako stimulující proliferaci lidských kostních buněk, tak zvyšuje produkci IGFBP-5 v lidských kostních buňkách. Stimulační působení progesteronu na proliferaci kostních buněk by mělo být způsobeno nejen zvýšením produkce IGF, ale také zvýšením exprese IGF receptoru, zvýšením hBD-IGFBP (potencuje působení IGF) a snížením produkce inhibičního IGFBP—4.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Čištěný a izolovaný, z lidské kosti získaný, inzulínu podobný růstový faktor vázající protein, hBD-IGFBP, mající molekulovou hmotnost 29 kDa a mající N-terminální aminokyselinovou sekvenci, identickou nebo v podstatě identickou s aminokyselinovou sekvencí LGSFVHCEPCDEKAL, který je dále charakterizován tím, že má vyšší specifickou vazebnou ίο afinitu pro IGF-II než pro IGF-I a váže hydroxyapatit za přítomnosti 4 mol/1 guanidin.HCl.
2. 2. Čištěný hBD-IGFBP podle nároku 1, který je konjugován k IGF-I nebo IGF-II.
3. 3. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje čištěný hBD15 IGFBP protein podle nároku 1 o 29 kDal nebo jeho fragment a farmaceuticky přijatelný nosič.
4. 4. Farmaceutický přípravek podle nároku 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje IgF-I nebo IGF-II.