JPH06501270A - ヒト骨由来インスリン様成長因子結合タンパク - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒト骨由来インスリン様成長因子結合タンパク発明の分野 本発明は、骨代謝に関しており、より詳しくは、ヒト骨から単離された新規イン スリン様成長因子結合タンパク（ＩＧＦＢＰ）によって媒介される骨代謝過程に 関する。さらに詳しくは、本発明は、骨細胞増殖に対するインスリン様成長因子 −ｎ　（ＩＧＦ−ＩＩ）の影響を可能にするヒト骨由来ＩＧＦＢＰ　（ｈＢＤ− ＩＧＦＢＰ）と称されるＩＧＦＢＰに関する。

発明の背景 ヒト血漿に存在する２つの最も豊富な成長因子、ＩＧＦ−ＩおよびＩ　ＧＦ−ｎ は、構造がプロインスリンに似ており、かつ多くの組織において、アナポリック な、および急性の両方のインスリン様活性を有するポリペプチド類から構成され る［ダウファグイ（Ｄ　ａｕｇｈａｄａｙ）ら、エンドタリン・リビュ（Ｅ　ｎ ｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ、）、１０：６８−９１　（１９８９）コ。ラットおよび マウスを使用する種々の研究は、胎児ホルモンであるＩＧＦ−ＩＩとともに、主 要なＩＧＦとしてＩＧＦ−Ｉを力説するが、最近の発見は、成人の骨代謝におけ るＩＧＦ−ＩＩの重要な役割を指摘した。ＩＧＦ−ｎは、ヒトの骨中に存在する 最も豊富な成長因子であることが見いだされ、ヒトの骨細胞によって生産される 最も豊富な成長因子である。

さらに、ＩＣＦ−ｎは、ヒトの骨細胞に対して分裂誘発性であるいくつかの成長 因子のうちの１つである。また、ＩＧＦＢＰ−４と称される、最近精製された抑 制性ＩＧＦＢＰが、無血清条件で約４０％まで基底骨細胞増殖を抑制することが 判明し、これによって、付加される成長因子の不在下、ｒＧＦの内因性生産が実 質的に細胞増殖に寄与することが示唆された。最後に、ＩＧＦ−ｎ受容体阻止抗 体が、基底骨細胞増殖を抑制することが判明し、これによって、ＩＧＦ−ｎが重 要な骨細胞成長因子であることが示唆された［モハン（Ｍｏｈａｎ）ら、プロウ ス・ジェネティクス・アンド・ホールモウンズ（Ｇｒｏｗｔｈ、　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ　ａｎｄ　Ｈｏｒｒｓｏｎｅｓ）、６　：１−９　（１９９０）およびモハ ン（Ｍｏｈａｎ）ら、クリニカル・オールソウビーディマウス・アンド・リレイ テッド・リサーチ（ＣＩｉｎ、　０ｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　＆　Ｒｅｌ。

Ｒ−ｅｓ、　）、２６３　：３Ｏ−４８（１９９０）］。

最近、ＩＧＦを特異的に結合する、構造的に関連するタンパク系が種々の組織に おけるＩＧＦ作用の変調に関係することも明らかになった。４種類のヒトＩＧＦ ＢＰ　（ｈＩＧＦＢＰ−１、ｈＩＧＦＢＰ−２、ｈＩＧＦＢＰ−３およびｈＩＧ ＦＢＰ−４と記す）が単離され、単離されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配 列から完全なアミノ酸配列が予想された〔モハン（Ｍｏｈａｎ）ら、クリニカル ・オールソウビーディマウス・アンド・リレイテッド・リサーチ（Ｃｌｉｎ。

０ｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　＆　Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、　）、２．６３　：３０−４ ８　（１９９０）；バクスター（Ｂ　ａｘｔｅｒ）　ら、Ｐｒｏｇ、Ｇｒｏｗｔ ｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｓ、１　：　４９−６８　（１９８９）：ビンカート（ Ｂ　１ｎｋｅｒｔ）ら、イー・エム・ビー・オー・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、） ８　：　２４９７−２５０２　（１９８８）；ブリュワー（Ｂ　ｒｅｖｅｒ）ら 、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション ズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｌ１．）　１５２　：１２８９−１２９７　（ １９８８）ニブリンクマン（Ｂ　ｒｉｎｋｍａｎ）ら、イー・エム・ビー・オー ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）７：２４１７−２４２３　（１９８８）：リー（ Ｌｅｅ）ら、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２　：４０４−４１１　（１９ ８８）＋ラブド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２　：　１ １７６−１１８５　（１９８８）；ラトウア＝（ＬａＴｏｕｒ）　ら、Ｍｏ１． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ。

４　：１８０６−１８１４　（１９９０）；およびシマサキ（Ｓ　ｈｉｍａｓａ ｋｉ）ら、Ｍｏｌ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、４　：１４５１−１４５８　（１９９０）を参照］。

ＩＧＦＢＰ−１は、羊水、胎盤膜、脱落膜およびＨＥＰ　Ｇ２肝細胞癌細胞を含 む種々の供給源から単離された。これらの種々の供給源から単離されたｒＧＦＢ Ｐ−１タンパクのＮ−末端アミノ酸配列は、同一であることが判明した。ＨＥＰ Ｇ２、ヒト子宮およびヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー由来のＩＧＦＢＰ−１をコ ードするｃＤＮＡのクローニングおよび完全な配列が報告された。Ｔ　ＧＦＢＰ −２は、ラット肝細胞（ＢＲＬ−３Ａ）およびマディンーダービイ（Ｍａｄｉｎ 　−Ｄａｒｂｙ）ウシ胃細胞から回収された調整培地から精製した。ＩＧＦＢＰ −２をコードする遺伝子は、ＢＲＬ−３Ａおよびヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラ リーからクローン化された。ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ 、約８５キロダルトンの酸不安定性糖タンパク、および５３キロダルトンの酸安 定性筒タンパクであるＩＧＦＢＰ−３分子間の１５０キロダルトンの３成分複合 体として血清中にある。ＩＧＦＢＰ−３は、ヒト血清から等質性に精製され、Ｉ ＧＦＢＰ−３をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定が報告されて いる。ＩＧＦＢＰ−４は、もともと、抑制性ＩＧＦＢＰとしてヒト骨細胞調整培 地から、およびラット血清から精製された。最近、ヒト骨細胞ｃＤＮＡライブラ リーおよび肝臓ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＩＧＦＢＰ−４ｃＤＮＡク ローンのクローニングおよび配列決定が報告された。これら４種類のＩＧＦＢＰ に加えて、マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｆｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）、２６５　：　４１２４ −４１３０　（１９９０）、ロガニ（Ｒｏｇｈａｎｉ）ら、エフ・イー・ビーー ｘス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）、２５５　：　２５３−２５８　（１ ９８９）およびザッフ（Ｚａｐｆ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ ミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）、２６５　＋１４８９２− １４８９８　（１９９０）には、各々、ヒト脳を髄液由来、Ａｏ　２８０４形質 転換線維芽細胞によって調整された培地由来、および低血糖血清由来のＩＧＦＢ Ｐの部分精製が報告されている。これは、ＩＧＦ−１にまさるＩＧＦ−ＩＩにつ いての強い親和性を示す。

か（して、当該技術文献には、種々の供給源によって生産され、かつＩＧＦへの 本質的に異なる結合特性および種々の生物学的機能を示す種々のＩＧＦＢＰが記 載されている。例えば、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−４ は、はぼ等しい親和性でＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方を結合するが、一 方、ＩＧＦＢＰ−２、ならびに羊水、線維芽細胞およびヒト血清から精製された ＩＧＦＢＰは、ＩＣＦ−Ｉよりも高い親和性でＩＧＦ−ＩＩを結合する。機能に 関しては、ＩＧＦＢＰ−１は、絨毛癌細胞中、およびヒト線維芽細胞中でＩ　Ｇ ＦＢＰ−１の増殖作用を抑制すること、および増強することの両方を示した［エ ルギン（Ｅ　Ｉｇｉｎ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー （Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈａ＋＊、）、８４　＋　３２５４−３２５８　（１９８７）およびリドボス （Ｒｉｔｖｃ）ｓ）ら、エンドクリノロジー（Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ） 、１２２：２１５０−２１５７　（１９８８）］。ＩＧＦＢＰ−３は、繊維芽細 胞中で培養条件に依存してＩＧＦ−Ｉ作用を抑制または刺激することを示した［ デ・メロウ（Ｄｅ　Ｍｅｌｌｏｗ）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジ カル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅ■。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ１．）、　１５６　：１９９−２０４　（１９ ８８）コ。　ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−３とは対照的に、ＩＧＦＢＰ− ４は、単に、骨細胞においてＩＧＦ−ＩおよびＩＣＦ−ＩＩ作用を抑制すること を示した［モハン（Ｍｏｈａｎ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）　、８６　：　８３３８−８３４２　（１９８９）　］。

該技術文献は、また、組織特異的方法で、種々のＩＧＦＢＰの生産が本質的に異 なって変えられることを示唆する。例えば、ＩＧＦＢＰ−１生産は、インスリン によって変えられるが、一方、ＩＧＦＢＰ−３生産は、成長ホルモンによって変 えられる［バクスター（Ｂ　ａｘｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｇ、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ ｃｔｏｒ　Ｒｅｓ、、１：４９−６８　（１９８９）］。これらの発見は、種々 のｒＧＦＥＰの固有の調節と関連してそれらの多様性によってＩＧＦ活性が局在 化された組織特異的方法で変えられることを示唆する。

当技術分野では、ＩＧＦＢＰを介する骨代謝においてｒＧＦ−ＩおよびＩＧＦ− ■機能を関係付けることがまだ必要であり、かくして、骨細胞によって生産され 、かつヒト骨基賀に存在するＩＧＦＢＰを同定することが必要である。かがるｒ ＧＦＢＰは、骨代謝をｔＪ１節することに関係すると思われ、臨床アッセイにお いて使用されて、骨代謝における欠損の診断において情報を提供することができ る。

骨のＩＧＦ依存性成長を増強するＩＧＦＢＰは、特に、骨粗セ症のような代謝性 骨疾患の治療のための治療用途において有用である。全く驚くべきことに、本発 明は、これらおよび他の関連する要求を満足する。

発明の概要 本発明は、ＩＧＦ媒介骨形成および細胞増殖に関係する代謝障害の臨床的診断お よび治療のための方法および組成物を提供する。さらに詳しくは、本発明は、ヒ ト骨由来ｒＧＦ結合タンパク（ｈＢＤ−、ＩＧＦＢＰ）を提供する。Ｉ　ＧＦ− ＩＩおよびＩＧＦＢＰを同時に投与するという条件下で、ｈＢＤ−ＩＧＦＥＰは 、１ＧＦ−Ｕと相乗効果的に作用して、ＩＧＦ−Ｉｆ媒介細胞増殖を増強する。

精製ｈＢＤ−ｒＧＦＢＰは、また、強い親和性でヒドロキシアパタイトに結合し 、かくして、骨に対して特異的に分子を指向させるための試薬、例えば、ＩＧＦ −ｎおよび／またはＩＧＦ−１，他の成長図子、または骨吸収もしくは形成に影 響を及ばす薬物を提供し、かくして、例えば、骨折および骨粗髭症または骨肉腫 のような骨疾患の治療に有用である。ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、創傷治癒の治療に おいて、および皮膚修復においても使用される。ｈＢＤ−４ＧＦＢＰは、例えば 、治療薬による骨障害の治療の間、骨形成速度のマーカーとして診断学的に使用 される。

ｈＢＤ−４ＧＦＢＰは、骨代謝および他の障害をもつ患者由来の試料におけるＩ ＣＦレベルの臨床学的評価用試薬としても使用される。

図面の簡単な説明 箪１図、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのＮ−末端アミノ酸配列と他の既知のＩＧＦＢＰの Ｎ−末端アミノ酸配列との比較。該配列は、最大同一性を与えるように並べる。

第２図、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの競合結合曲線。該試料は、非標識ＩＧＦ−Ｉおよ びｒＧＦ−ｎの存在または不在下で、標！１１０Ｆ−ＩＩを使用して結合タンパ ク活性についてアッセイした。

第３図、Ｆ　ＰＬＣＭｏｎｏ　Ｑクロマトグラフィ一工程におけるヒト骨抽出物 のタンパクプロフィール（Ａ）およびＩＧＦＢＰ活性プロフィール（Ｂ）。５０ 冨ｌずつのＨＡ結合画分プールのアリニット３つをＩＧＦ−ｎアフィニティカラ ムに適用した。得られた３つの親和性結合画分をプールし、Ｍｏｎｏ　Ｑ陰イオ ン交換カラムに付した。２８０ｎ■での吸光度によってタンパクのプロフィール をモニターした。２１／ずつ、２分ずつの画分を回収した。該両分のアリコツト を１０倍に希釈し、結合タンパク活性についてアッセイした。ＩＧＦＢＰ活性は 、特異的に結合した標識ＩＧＦ−ＩＩの量で表される。

第４図、精製の種々の段階でのｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのリガンドプロット分析。

試料５０μｌを５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（３〜２７％勾配液）に付し、ニトロセルロ ース膜に移し、標識ＩＧＦ−ｎでプロットし、オートラジオグラフに付した。レ ーンａ１ヒト骨抽出物のＨＡ結合画分：レーンｂ、ＩＣＦ−ＩＩ親和性結合画分 ；レーンｃＳＭｏｎｏ　Ｑ　ＩＧＦＢＰビークＡ；レーンｄ、Ｍｏｎｏ　Ｑ　Ｉ ＧＦＢＰビークＢ；レーンｅ、Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＩＧＦＢＰビークＣおよびレーン ｆ、　Ｍｏｎｏ　Ｑ　Ｉ　ＧＦＢＰビークＤ０ 詳細な具体例の説明 本発明は、ＩＧＦ−Ｉに対するよりも大きい親和性でＩＧＦ−ＩＩに特異的に結 合する、精製および単離したヒト骨由来ＩＧＦＢＰを提供するものである。該タ ンパクは、所望により、例えば、ヒト骨調製物、ヒト骨細胞調整培地、またはヒ ト血清から抽出されたタンパクから均質に精製される。特に、医薬用途のために 、少なくとも約５０％の実質的に純粋なｈＢＤ−ＩＧＦＢＦが好ましく、少なく とも約７０〜８０％がより好ましく、９５〜９９％以上の均質性が最も好ましい 。

部分的にまたは均質に精製した後、所望により、次に、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを、 例えば、診断用、免疫原として、治療用などに使用しでもよい。

本発明のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、ヒドロキシアパタイト・アパタイト・クロマト グラフィー、次いで、ＩＧＦ−ｎを有するカラム上でのアフィニティクロマトグ フィーに付して精製してもよく、最後に、ＦＰＬＣ系を使用してＭｏｎｏ　Ｑ陰 イオン交換クロマトグラフィーによってさらに純粋に精製してよい。精製したタ ンパクの見かけの均質性は、例えば、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の単一バンドとしてそ の移動によって、およびＮ−末端配列分析について単一アミノ酸配列の生産によ って示される。精製機構において、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに対して特異的に指向す る抗体を使用する抗体カラム上でのアフィニティクロマトグフィーを使用するこ ともできる。さらなる精製は、とりわけ、液体クロマトグラフィー、勾配遠心、 およびゲル電気泳動のような慣用の化学的精製手段によって行ってもよい。タン パク精製方法は、当該技術分野で知られており［一般に、本明細書中に引用記載 するスコウブス、アール（Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ，）、プロティン・ピューリフイケ ーション（Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ　Ｐ　ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、スブリンガーー バーラグ、ニューヨーク（１９８２）をｔ照］、本明細書に記載するｈＢＤ−Ｉ ＧＦＢＰの精製に用いることもできる。

ＩＧＦ−ｎおよびＩＧＦ−ＩへのｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの特異的結合は、ポリエチ レングリコール沈殿アッセイによって示される。この態様において、本発明は、 特異的受容体およびｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに結合させるＩＣＦの決定因子の構造− 機能研究において有用な精製タンパクを提供する。さらに、本発明の精製ｈＢＤ −ＩＧＦＢＰの有用性を、以下の本発明の他の態様の説明に記載する。

本発明の精製ＩＧＦＢＰは、固有のものであり、従来同定された全てのＩＧＦＢ Ｐとは異なっている。ヒトＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＦ−３お よびＩＧＦＢＰ−４は、刊行物に記載されているｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのアミノ酸 配列とは異なるアミノ酸配列によって特徴付けられる。脳を髄液、線維芽細胞調 整培地およびヒト血清から精製されたＩＧＦＢＰについて報告されたＮ−末端ア ミノ酸配列は、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのＮ−末端アミノ酸配列とは異なる。

本発明の均質なヒトｒＧＦＢＰ　（ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ）は、第１図に示すＮ− 末端アミノ酸配列と同一または実質的に同一のＮ−末端アミノ酸配列によって特 徴付けられる。本発明の目的で、第１図に示すＮ−末端アミノ酸配列と実質的に 同一のＮ−末端アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換もしくは他のアミノ酸置換 、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩへの実質的に同一のタンパクの結合に具体的 に影響を及ぼさないか、または以下に記載の用途においてその機能を具体的に変 化させない挿入もしくは欠失の存在を除いて、第１図のＮ−末端アミノ酸配列と 同一のアミノ酸配列を意味すると理解される。

組換え経路によってｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを産生するために、本発明のｈＢＤ−Ｉ ＧＦＢＰをコードする遺伝子は、好適な発現ベクターにおける挿入によってクロ ーン化および発現され、次いで、これを使用して組換えｈＢＤ−ＩＧＦＢＰポリ ペプチドの発現に適している宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする。

精製ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのアミノ末端配列の少なくとも一部分、典型的には約１ ４〜約２５ヌクレオチドを示す１個以上の合成オリゴヌクレオチドプローブを使 用して、ヒト骨細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。標準的な方法 に従って、最長挿入を含有するポジティブクローンを配列決定する。推定された アミノ酸配列を精製タンパクのＮ−末端アミノ酸配列と比較し、推定されたアミ ノ酸配列に基づいて予想された分子量およびアミノ酸組成物を、精製ｈＢＤ−Ｉ ＧＦＢＰについて認められたものと比較する。次いで、該クローンを使用して、 一般に、例えば、サムブルーフ（Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ）らのモレキュラー・クロ ーニング。

ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　 ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、１９８９　コールド・スプリング・ハー バ−・プレス、ニューヨーク（本明細書中に引用記載される）に記載されている ような、標準的な方法を使用することによって組換えｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを生産 する。

別の態様において、本発明は、ポリペプチドおよびｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの断片に 関する。ポリペプチドおよびｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの断片は、組換え発現系から単 離されるか、あるいは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）のフェデレー ション・プロシーディンゲス（Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、）２１　：　４１２　（１９ ６２）、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）のジャーナル・オブ・アメリ カン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、ＡｔＣｈｅｔＳｏｃ、）８５　：　２１４ ９　（１９６３）、またはバラニイ・アンド・メリフィールド（Ｂａｒａｎｙ　 ａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）のザ・ペブタイディス（ＴｈｅＰ　ｅｐｔｉｄ ｅｓ）、第２巻、第１〜２８４頁（１９７９）アカデミツク・プレス、ニューヨ ーク（各々、本明細書中に引用記載する）の固相法によって、または自動ペプチ ド合成器の使用によって合成されてもよい。「ポリペプチド」なる語は、少なく とも約３個、典型的には６個以上、１００〜２００個までまたはそれ以上のアミ ノ酸の配列を意味し、全タンパクを含む。例えば、ヒドロキシアパタイトおよび ／またはＩＧＦ−ｍを結合するｈＢＤ−ＩＧＦＢＰタンパクの部分は、種々の方 法によって、例えば、プロテアーゼまたは化学薬剤で精製ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを 処理してそれを断片化し、次いで、断片が標識ＩＧＦ−ｎまたはヒドロキシアパ タイトに結合することができるかを決定することによって、同定される。次いで 、ポリペプチドを合成し、抗原として使用して、ＩＧＦ−ＩＩまたはヒドロキシ アパタイト−ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ相互作用などを阻害する。本明細書で使用する 場合、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰなる語は、前後関係が他のことを示さない限り、タン パク、ポリペプチドおよびその断片を含むことを意味すると理解されるべきであ る。

別の態様では、本発明は、ヒドロキシアパタイト／ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ／ＩＧＦ −Ｉｆ相互作用を調節し、次いで、治療学的および／または予防学的に、ｈＢＤ −ＩＧＦＢＰまたはＩＧＦ−ｆｆのようなそのリガンドに直接または間接的に連 結させることができる障害を処置する手段を提供する。本発明の結合タンパクを 有することによって、ＩＧＦ−ｎ、ヒドロキシアパタイトまたは他のリガンドと ｈＢＤ−４ＧＦＢＰとの相互作用を刺激または阻害するアゴニストまたはアンタ ゴニストを同定する。アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかで、ｈＢＤ− ＩＧＦＢＰまたはＩＧＦ−ｎに応答する細胞の代謝および反応性は制御され、し たがって、問題の疾患を緩和させるか、または、ある場合には予防する手段を提 供する。

か（して、本発明は、リガンド／ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ相互作用によって媒介され る事象のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法 を提供する。かかるスクリーニングアッセイは、リガンド／結合タンパク相互作 用の態様が目的とされる程度に依存して、種々のフォーマットを使用し得る。

例えば、かかるアッセイは、結合タンパクに結合し、それによって、ＩＧＦ−Ｉ Ｉまたはヒドロキシアパタイトとの相互作用を遮断または阻害する化合物を同定 するように設計され得る。他のアッセイは、ｈＢＤ−ｒＧＦＢＰと置換できる化 合物を同定するように設計することができる。また、他のアッセイを使用して、 ｈＢＤ−ＪＧＦＢＰに対するＩＧＦの会合を阻害または促進し、それによって、 １ＧＦに対する細胞応答を媒介する化合物を同定することができる。

別の態様において、本発明は、ＩＧＦ−Ｉにまさる選択的親和性でＩ　ＧＦ−ｎ を結合するタンパクを提供する。第２図は、リガンドとしてのｈＢＤ−ＩＧＦＢ ｐ［１２５ｉコＩＧＦ−Ｔｌお、ｋＵ競合物とし−ＣＯ）ＩＧＦ−１よび１ＧＦ −１１の競合的結合曲線を示す。ＩＧＦＢＰから結合［１！ｊ　Ｉ］Ｉ　ＧＦ− Ｈの５０％を置換するためには、ＩＧＦ−Ｉ約Ｌｏｎｇ／ｍ／およびＩＧＦ−ｎ 　１ｒ＋ｇ／ｍｌが必要であり、これによって、トレーサーを置換する際に、Ｉ ＧＦ−ＩＩがＩＧＦ−Ｉよりも１０倍高く有効であることが判明した。［”’ｒ ］ＩＧＦ−ｒをトレーサーとして使用した場合でさえ、ＩＧＦ−Ｉｆは、まだ、 トレーサーを置換する際に、ＩＧＦ−１よりも（４倍）有効であった。これらの 結果から、ＩＧＦＢＰはＩＧＦ−１よりも大きい親和性でＩＧＦ−ｎを結合する ことが分かる。典型的には、Ｉ　０Ｆ−ＩＩに対するｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの結合 親和性は、約１０−９Ｍから約１０−１！Ｍまで、またはそれ以上の範囲であり 、おそらく、少な（とも約１Ｏ−Ｉ１１〜１０−１１Ｍの範囲であるが、一方、 ＩＧＦ−ｒに対するｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの結合親和性は、約１０倍低い、すなわ ち、約１０−ＩＭから約１０−１０Ｍの範囲である。ＩＧＦ−ＩにまさるＩＧＦ −ＩＩに対するｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの選択的親和性によって、ヒトの骨において ＩＧＦ−■がＩＧＦ−１よりも１０〜１５倍豊富である理由を説明することがで きた。

本発明は、少なくとも約１０″９Ｍから約１０−１１Ｍまで、またはそれ以上で ある、ヒドロキシアパタイトに対するｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの強い結合親和性を利 用するｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの治療的および医薬的組成物を提供する。本発明のｈ ＢＤ−ＩＧＦＢＰは、強い変性剤、例えば、４ＭグアニジンＨＣＩの存在下でさ え、ヒドロキシアパタイトに結合するが、一方、精製ＩＧＦ−ＩＩは、ヒドロキ シアパタイトに結合しない。かくして、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、骨の中で、また は骨に対して、ＩＧＦ−ＩＩを固着するか、または標的とする手段または媒体（ ｖｅｈｉｃｌｅ）を提供する。ＩＧＦ−ｎは、当業者に容易に明らかである結合 手段を介してｈＥＤ−ＩＧＦＢＰに化学的に結合することができるが、いずれの タンパクの望ましい活性も実質的に減少させるべきではない。

ＩＧＦまたは以下に記載する他の分子のような、骨組織または細胞を標的とする ことができる別の分子へのｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの結合は、架橋剤の使用によるよ うな、よ（知られている研究室的方法を使用して、化学結合によって製造するこ とができる。化学的に結合されるという語は、タンパク分子が、典型的にはお互 いに、典型的には共有結合によって、結合することを意味する。好ましい結合方 法は、ｈＢＤｉＧＦＢＰ／ＩＧＦ−■分子間の少なくとも１個の共有結合の形成 である。該結合は、直接的であってもよく、この結合としては、合成的結合基を 含む結合が挙げられるか、あるいは、間接的であってもよく、これは、例えば、 血漿アルブミンの如きタンパクもしくはペプチド、または他のスペーサー分子の ような介在部分を有する結合を意味する。例えば、該結合は、例えば、カルボン イミド、グルタルアルデヒド、３−（２−ビリジジチオ）プロピオン酸Ｎ−スク シンイミジル（ＳＰＤＰ）および誘導体、ビス−マレイミド、４−（Ｎ−マレイ ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のような異種 二官能価または同種二官能価架橋剤、天然タンパクの酸化もしくは還元または酵 素による処理などを介する炭水化物、ジスルフィド、カルボキシルまたはアミノ 基のような、個々の分子との反応性基による外因性架橋剤なしの架橋によるもの であってもよい。タンパク分子を化学的に架橋させる方法は、当該技術分野で一 般に知られており、米国特許第４．３５５．０２３号、第４．６５７．８５３号 、第４．６７６．９８０号、第４．９２５．９２１号および第４．９７０．１５ ６号、ならびにイムノテクノロジー・カタログ・アンド・ハンドブック（Ｉ　ｍ ｍｕｎ。

Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、ピ アス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅＩｌｉｃａｌ　Ｃｏ、）　 （１９８９）　（各々、本明細書中に引用記載する）には、多くの異種および同 種二官ｌＦｌ：価薬剤が開示されている。一般に、かかる架橋は、ＩＧＦ−ｆｆ またはｈＥＤ−ＩＧＦＢＰの所望の機能に実質的に影響を及ぼすべきではない。

ＩＧＦ−ＩＩおよびｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのハイブリッド、キメラもしくは融合タ ンパク分子またはその部分は、例えば、本明細書中に引用記載する米国特許第４ ゜８５９．６０９号およびサムブルーフら（前出）の記載に従って、組換えＤＮ Ａ技術によって調製することができる。

骨におけるＩＧＦ−ＩＩ／ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ複合体の付着によって、骨吸収お よびヒドロキシアパタイトの溶解の間、該複合体が放出され、吸収部位付近の骨 芽細胞の増殖を刺激することによって新しい骨形成が開始される。かくして、工 ＧＦ−ＩＩおよびヒドロキシアパタイトの両方に対するｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの高 い親和性に基づいて、本発明は、とりわけ、骨に対して特異的にＩＧＦ−ＩＩお よび／またはＩＧＦ−Ｉを指向させるのに有用な治療薬および組成物を提供する 。

新規ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰＳｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ／ＴＧＦ−Ｉｆおよび他のコンジ ュゲート、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに対する抗体およびそのアンタゴニスト、並びに それらから調製される医薬組成物は、特に、種々のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよびＩ ＧＦ−ＩＩ関連疾患の治療のための投与に有用である。好ましくは、該医薬組成 物は、例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内のように非経口的に、または局所的 に、経口的に、エアロゾル、鼻腔内デリバリ−などを介して投与することができ る。かくして、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解した。ｈ ＢＤ−ＩＧＦＢＰ、ｈＢＤ−４ＧＦＢＰ／ＩＧＦ−Ｕおよび他のコンジュゲート 、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに対する抗体およびそのアンタゴニストの溶液、あるいは 、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよびＩＧＦ−ＩＩのカクテルからなる非経口投与用組成 物を提供する。例えば、水、緩衝化水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなど のような種々の水性担体を使用することができる。これらの組成物は、慣用の、 よく知られている滅菌技術によって滅菌され得る。該組成物は、例えば、酢酸ナ トリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムな どの如き、ｐＨ調節および緩衝化剤、毒性調節剤などのような、生理的条件に近 づけるのに必要とされるような、医薬的に許容される補助剤を含有してもよい。

これらの製剤中の所ヱのｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ／ＩＧＦ−ｎ 、またはｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに対する抗体もしくは他のそのアンタゴニストの濃 度は、広範囲に、例えば、約０．００００１％未満から、一般に、約１００１％ もしくは少なくとも約０．００１％から、約０．０５〜０．１重量％まで、変化 することができ、主として、選択された個々の投与形態、処置される症状、例え ば、骨折修復、骨粗髭症、手術または外傷性創傷修復、骨肉腫または乳癌のよう な腫瘍など、および処理される被検者、すなわち、成人、子供または新生児に従 って、液体体積、粘度などによって選択される。

かくして、中等度の骨変性病に罹患している成人を処置するための、典型的な静 脈内輸液用医薬組成物は、無菌リンゲル溶液２５０　ｄ、およびｈＢＤ−ＩＧＦ ＢＦまたはｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ／ＩＧＦ−Ｉ＋約５０冨ｇ〜５ｇを含有するよう に調製される。実際の、非経口的または経口的に投与可能な化合物の製造方法は 、当業者に知られているか、または明白であり、例えば、レミントンズ・ファー マシューティカル・サイエンス（Ｒｅｔｉｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅ ｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）、第１６版、マッシ・パブリッシング・カンパ ニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州 イーストン（１９８２）（本明細書中に引用記載する）にさらに詳細に記載され ている。

本発明のｈＢＤ−４ＧＦＢＰもしくはｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ／ＩＣＦ−ＩＩを含有 する組成物またはそのカクテルは、予防的および／または治療的処置のために投 与することができる。治療的用途では、既にｈＢＤ＝ＩＧＦＢＰまたはＩＧＦ− ■関連疾患に罹患している患者に、該疾患およびその合併症を治療するか、また は少なくとも部分的に停止させるのに充分な量の組成物を投与する。これを行う のに充分な量は、「有効治療量」として定義される。この使用のための冑効量は 、疾患、すなわち、骨粗財症、骨折、創傷、腫瘍などにおける骨の変性、および その重篤度、患者の年齢、ならびに患者の全身の健康状態に左右される。一般に 、該投与量は、１時間の輸液につき体重１ｋｇ当たりｈＢＤ−ＩＧＦＢＰまたは ｈＢＤ〜ＩＧＦＢＰ／ＴＧＦ−ＩＩＩＩ、０〜約５００μ９の範囲であり、１時 間の輸液につきｌ＆ｇ当たりｈＢＤ−ＩＧＦＢＰまたはｈＢＤ−■ＧＦＢＰ／■ ＧＦ−■１０〜５０μすの投与量で使用されるのがより一般的である。本発明の 物質を重篤な疾患状態で使用する場合、外来物質の最小化および外来物質応答の 不在を考慮して、これらの医薬組成物を実質的に過剰に投与することは可能であ り、該投与は処置医によって望ましいと思われることもある。

予防的用途では、本発明のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰまたはｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ／ＩＧ Ｆ−ｆｆを含有する組成物またはそのカクテルを、まだ疾患状態ではない、＠者 に投与して、該疾患に対する患者の抵抗力を増大させる。かかる投与量は、「有 効予防量」と定義される。この使用では、正確な投与量は、患者の健康状態など に左右されるが、一般に、１時間の輸液につき１ｋｇ当たり１〜５００μ９の範 囲であり、特に、１時間につき１＆ｇ当たり１０〜５０μ９である。好ましい予 防的使用は、重篤な骨変性病の危険状態の患者の処置のためである。

当該組成物の単回または複数回投与は、処置医によって選択された投与量および 投与形態で行うことができる。いずれにしても、当該医薬製剤は、例えば、患者 を処１するのに充分な量のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰまたはｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ／ＩＧ Ｆ−Ｕを提供すべきである。

別の態様では、本発明は、ＩＧＦ−Ｔｌに応答する骨細胞増殖を刺激するのに有 効な薬物を提供する。無血清条件における骨細胞へのＩＧＦ−ｆｆの外因性添加 はそれらの増殖を増加させる。このＩＧＦ−Ｈの増殖効果は、ＩＧＦ−Ｉｒと共 働してｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの添加によって増強される。このｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ およびＩＧＦ−ｎの組合せの相乗作用、すなわち、いずれかの薬物で得られた結 果を個々に合わせことによって達成される付加効果よりも大きい相乗作用は、い ずれのタイプの細胞における他のＩＧＦＢＰについても報告されていない。かく して、本発明は、骨形成が悪化する骨障害（例えば、骨粗髭症）の処置用治療薬 を提供する。当該医薬組成物は、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ、および、所望により、Ｉ ＧＦ。

ならびに生理学的に許容される担体および／または賦形剤からなる。

本発明は、ｈＢＤ−４ＧＦＢＰがプロテアーゼからＩＧＦを保護することによっ てＩＧＦの半減期を増加させ、骨に対して特異的にＩＧＦを指向させ、および／ または、ＩＧＦの増殖作用を増強させるので、全身性創傷治癒および皮膚修復に おいて使用して、ＩＧＦの効力および半減期を増加させることができる薬物を提 供する。

種々の方法で、例えば、投与前に一晩、中性ｐＨで精製ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよ びＩＧＦの濃縮物をインキュベートすることによつて、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ十　 ＩＧＦの複合体を調製することができる。組成物中のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよび ＩＧＦの濃度は、広範囲に変化することができるが、はぼ等モルであるのが好ま しい。他の製剤は、本明細書の内容から当業者に明らかであろう。別々に製剤化 した場合、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの組成物とＩＧＦ−ＩＩ組成物とは、別々に、ま たは、同時に投与することができる。別々に投与する場合、典型的には、まず、 ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを投与し、次いで、ＩＧＦ−ＩＩを投与する。かかる組成物 は、局所骨形成（例えば、骨折修復）を刺激するために特定の領域で投与するか 、または骨粗鬆症のような骨障害の処置におけるように、全身性骨形成を増加さ せるために全身的に投与することができる。

別の具体例では、本発明は、より有効なＩＧＦ分子の製造方法を提供する。ＩＧ ＦおよびｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの構造機能分析は、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰへの結合に 関係するｒＧＦの領域を同定することができる。アミノ酸置換基、挿入または欠 失によって修飾されたＩＧＦ分子を製造することができ、その結果、修飾された 分子は、高い親和性でＩＧＦ受容体およびｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに結合するが、Ｉ ＧＦＢＰ−４およびＩＧＦＢＰ−３のような抑制性ＩＧＦＢＰには結合しない。

かかる修飾ＩＧＦ分子を、全身性創傷治癒および皮膚修復の促進において有効な 同化剤として供することができる。別の具体例では、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの断片 結合する能力のような所望の機能を持つが、一方、この機能について不可欠では ない分子の別の部分を消去する。断片は、個々に使用されるか、または、−緒に 合わせてもよい。

ＩＧＦに加えて、本発明のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、骨に対して、関心のある他の 分子を指向させるのに有用である。該分子は、直接的または間接的に、骨の形成 または吸収に影響を及ぼす。当業者に明らかであるように、この方法で、種々の 因子を骨組織に対して指向させることができる。代表的な例としては、例えば、 骨形態発生タンパク（ＢＭＰ）のような骨形成を刺激するもの、ＴＧＦ、、線維 芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、グルココルチコ イドまたは１．２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のような、ある種の癌において 望ましい場合に骨形成を低下させる因子、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ −ＣＳＦ）およびインターロイキンのような骨吸収を増大させる化合物、ならび にビスホスホネートおよびカルシトニンのような骨吸収を低下させる化合物が挙 げられる。該化合物は、前記の結合手段、ならびに、所望により、融合およびキ メラタンパクを含む、様々な方法で、本発明のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰと一緒にする ことができる。典型的には、成長因子のような前記の標的化合物は、骨組織約１ ０ｐｇ／ｍＡ〜約５０ｎｑ／ｘｉの範囲の濃度で骨組織の表面に送達される。

別の態様では、本発明は、代謝性骨疾患または骨折形成を持つ患者から採取した 臨床的試料における骨形成を評価するための診断マーカーを提供する。ｈＢＤ、 ＩＧＦＢＰがＩＧＦ−ＩＩ作用の重要な修飾物質であり、ＩＧＦ−ＩＩが重要な ヒトの骨成長因子であるという発見に基づいて、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのレベルは 、骨代謝の障害をモニターするのに使用することができる。ここで、異常レベル のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、障害の存在を示す。かくして、本発明は、治療薬によ る骨障害の処置の間、骨形成をモニターするための臨床診断用骨形成マーカーに 関する試薬を提供することでもある。ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰまたはその抗体の組成 物は、ヒトの血漿、血清または尿のような生体液中におけるｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ の検出および定量に使用することができる。

当業者によって認識されるように、多くのタイプのイムノアッセイが、本発明に ける使用のために利用可能である。例えば、直接的および間接的結合アッセイ、 競合アッセイ、サンドイッチアッセイなどは、一般に、例えば、米国特許第４゜ ６４２．２８５号、第４．３７６．１１０号、第４．０１６．０４３号、第３． ８７９゜２６２号、第３．８５２．１５７号、第３，８５０，７５２号、第３． ８３９，１５３号、第３．７９１．９３２号、バーロウ・アンド・レイン（Ｈａ ｒｌｏｔ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ）、アンチボディズ・ア・ラボラトリ−・マニュア ル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コー ルド・スプリング・ハーバ−・パブリケイションズ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ニューヨーク州（１９８８）に記 載されている（各々本明細書中に引用記載する）。１つのアッセイフォーマット では、ｈＢＤ−ｒＧＦＢＰへの抗体の結合を測定し、次いで、抗体を、例えば、 標識抗１ｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡヒト抗体によって検出することによ って、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを直接的に定量化する。別のフォーマットでは、結合 について標識または非標識ｂＢＤ−ＩＧＦＢＰと競合させることによって、患者 のｈＢＤ−ｒＧＦＢＰを測定することができる。例えば、放射性核種、粒子（例 えば、金、鉄、磁性粒子、赤血球）、フルオー（ｆｌｕｏｒｓ）、酵素、酵素基 質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド（特に、ハブテン）、化学発光体などの 種々の標識を使用することができるが、好ましくは、放射性核種である。

かくして、かかるアッセイにおいて有用なｈＢＤ−ＩＧＦＢＰまたはその抗体は 、ＥＬＩ　ＳＡ微量滴定ウェル、マイクロビーズ、濾過膜のような不溶性または 固体支持体、不溶性または沈殿可能な可溶性ポリマーなどに付着させて親和性樹 脂として機能することができる。ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに対する抗血清またはモノ クローナル抗体は、典型的には、ウサギ、ヤギ、マウスなどのような非ヒト起源 である。ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの検出に有用なキットも提供することができる。こ こで、ｈＢＤ−ＪＧＦＢＰおよび／またはその抗体は、一般に、単独で、または 、さらなる試薬、標識、および／または抗抗体などと一緒に、容器中で、凍結乾 燥形態で提供される。ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰポリペプチドおよび抗体は、標識に結 合されていても、または結合されていなくてもよく、トリス（Ｔｒｆｓ）、リン 酸塩、炭酸塩などの緩衝剤、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク、例えば、血清、 アルブミンなどと一緒にキットに含まれる。しばしば、有効成分を希釈するため に不活性増量剤または賦形剤を含むのが望ましい。ここで、賦形剤は、全組成物 の約１〜９９％存在していてもよい。

本発明のｈＢＤ−ＩＧＦＢＦポリペプチドを結合する、診断用または治療用抗体 は、様々な手段によって生産することができる。非ヒト、例えばマウスのモノク ローナル抗体の生産は、よく知られており、例えば、組換え体または合成ｈＢＤ −ＩＧＦＢＰ分子またはその選択された部分（例えば、ペプチド）で該動物を免 疫化することによって行われる。例えば、所望により、選択されたスクリーニン グによって、主にＩＧＦによる認識の原因となるようなｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ分子 の領域を同定することができる。免疫化動物から得られた抗体生産細胞を固定化 し、スクリーニングするか、あるいは、まず、例えばｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを結合 する抗体の生産についてスクリーニングし、次いで、固定化する。

以下の実施例は、説明のために提供するものであって、限定するものではない。

実施例１ ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの精製のためのヒト骨抽出物の調製全股関節部置換手術の間 に得られたヒトの大腿頭を、使用するまで一２０℃で冷凍貯蔵した。帯ノコギリ を使用して骨を切断し、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ抽出のためにウイリイ・ミル（Ｗｉ ｌｅｙ　ｍ１ｌｌ）中で微粒子に粉砕した。モハン（Ｍｏｈａｎ）ら［ビオンミ 力・エト・ビオフィジ力・アクタ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　 Ａ　ｅｔａ）、８８４　：　２３４〜２４２　（１９８６）コの記載に従って、 最初に水および４ＭグアニジンＨＣＩで抽出した後、４ＭグアニジンＨＣＡ’お よびプロテアーゼ阻害剤の存在下、１０％エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ ）による大腿頭骨粉末の脱塩によって骨タンパクを抽出した（グアニジンＥＤＴ Ａ抽出物）。次いで、該グアニジンＥＤＴＡ抽出物を、ＹＭ５　（５キロダルト ン分子量遮断器）膜を使用してアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）中で濃縮し、ｈＢＤ− ＩＧＦＢＰの精製のために使用した。

実施例２ ヒトの骨細出物由来のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの精製および特徴付はモハン（Ｍｏｈ ａｎ）ら（同書）の記載に従って、４ＭグアニジンｄｃＩ中で、ヒトの骨細出物 をヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーに付した。臭化シアノーゲ ン活性化セファロース４Ｂビーズに、ヒトの骨から精製したＩＧＦ−４２５０μ すを結合させることによって、Ｉ　ＧＦ−Ｉ［アフィニテイカラムを構築した。

ＹＭ５膜を使用して、アミコンセル中でＨＡ結合フラクシ珊ンのプールを約３０ ０ｍ１に濃縮し、２０倍量の、プロテアーゼ阻害剤（１００曹Ｍεアミノカプロ ン酸、５ｍＭベンズアミジン、］）Ｍ塩化フェニルメチルスルホニル）を含有す るリン酸カリウム緩衝液（１０ｆｆｉＭリン酸カリウム、ｐＨ６，０）に対して 透析した。ＩＧＦ−ｎアフィニティカラムをリン酸カリウム緩衝液で平衡化し、 その後、ヒトの骨抽出物の透析ＨＡ結結合シラクシコンブールアリコツト５Ｑｚ ｌ（全タンパク約３〜４Ｋｇ／■ｌ）をカラムに付加した。次いで、該カラムを リン酸カリウムで広範囲に洗浄して、未結合タンパクを完全に除去した。結合タ ンパクを３０１Ｍトリス−酢酸塩（ｐＨ７，２）／４ＭグアニジンーＨ（Ｊ２０ 〜２５冨ｌで溶離した。ＹＭ５膜を使用してアミコンセル中で親和性結合フラク ションを濃縮し、次いで、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，０）に対し て透析した。該透析した親和性結合フラクションを、予めトリス−ＨＣｌ緩衝液 で平衡化させた７フルマシ７　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　Ｆ　Ｐ　Ｌ　ＣＭｏｎ ｏ　Ｑ陰イオン交換カラムに付加した。

２０ＩＩＭトリスーＨ（Ｊ緩衝液中Ｏ〜ＩＭＮａＣ／の直線勾配液で結合タンパ クを１００分間のうちに溶離した。

ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ活性は、ポリエチレングリコール沈殿法によって測定した。

すなわち、室温で６０分間、Ｏ，ＬＭ　ＨＥＰＥＳｌｏ、１％ウシ血清アルブミ ン１０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘｌ　００／４４ｍＭ　Ｎａ２ＣＯｓ１ ０．０２％ＮａＨ３ＣｐＨ６，０）２５Ｏａｌ中、”ＳＩｍＷｉｌＧＦ−ｒ＊ｔ は１ＧＦ−Ｔｌ　２５．０００〜５０．０００ｃｐｍと一緒に、アッセイされる べき試料５０μｌをインキュベートした。この混合物に２％免疫血清グロブリン １００μｌおよび２５％ポリエチレングリコール５００μｌを添加し、次いで、 遠心した。これらの条件下、ポリエチレングリコールは、ＩＣＦ−ＩまたはＩＧ Ｆ−ＩＩおよびｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ間の大きい複合体を沈殿するが、未結合ＩＧ Ｆ−１またはＩＧＦ−ＩＩは沈殿しなかった。次いで、ＰＥＧ沈殿物中の”５Ｉ −ＩＧＦ−ｎの量を計数した。過剰の非標識ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−］１の存 在下で該アッセイを行うことによって、非特異的結合を測定し、前記で得られた 値から、沈殿した”Ｉ−ＩＧＦ−Ｉまたは宜”Ｉ−ＩＧＦ−Ｈの量を差し引いた 。

ｈＢＤ−１ＧＦＢＰの見かけの分子量を測定するために、トレーサーとして１！ ３Ｉ−ＩＧＦ−ｎを使用して、リガンドブロフト分析を行った。この方法では、 プレキャスト３〜２フ 下、試料５０μｌを電気泳動に付した。エレクトロブロッティングによるニトロ セルロースに対する試料の移動の後、該ニトロセルロース膜を放射性標識ＩＧＦ −■と一緒にインキュベートした。未結合放射性標識ＩＧＦ−ＩＩを洗浄した後 １、ホーセンループ（　Ｈｏ５ｓｅｎｌｏｏｐ）らＥアナリティカル・バイオケ ミストリー（Ａｎａｌ．　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ．　）、１５４　：１３８−１４３ 　（１９８６）］の記載に従って、該膜をオートラジオグラフィに付した。

アプライド・バイオシステムズ・モデル（Ａｐｐｌ．ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｓｓ　ｍｏｄｅｌ）　４　２０分析器で試料のアミノ酸組成物を分析し、アプラ イド・バイオシステムズ・モデル（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　ｍ ｏｄｅｌ）　４　７　０　Ａ気相タンパクシークエンサーでＮ−末端配列を決定 した［モハン（Ｍｏｈａｎ）ら、ビオシミ力・エト・ビオフィジ力・アクタ（　 Ｂ　ｉｏｃｈｉｍ．　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ．　Ａ　ｅｔａ）、９６６　：　４４− ５５　（１９８８）］。

第３図は、Ｍｏｎｏ　Ｑクロマトグラフィ一工程における親和性結合フラクショ ンブールのタンパクプロフィールおよびＩＧＦＢＰ活性プロフィールを示す。真 のＩＧＦＢＰ−４が溶出する領域（フラクション９〜１５、Ｏ．ＬＭ　ＮａＣｊ りにはタンパク吸光度ピークもＩＧＦＢＰ活性ピークもなく、かくして、これに よりて、骨由来ＩＧＦＢＰがＩＧＦＢＰ−４でないことが示唆された。しかしな がら、種々のＮａＣ１濃度で溶出する４つのタンパク吸光度ピークがあった。こ の４つのタンパクピークのうち、最初の２つのピーク（ＡおよびＢ）は、有意な ｒＧＦＢＰ活性を含有するが、一方、最後の２つのタンパクピーク（ＣおよびＤ ）は、ＩＧＦＢＰ活性をあまり有しなかった。

ヒトの前抽出物中に存在するＩＧＦＢＰの見かけの分子量を測定するために、リ ガンドブロッティングおよび［”Ｉ］ＩＧＦ−ｎ親和性標識を使用した。第４図 は、ＨΔ結合、ｒＧＦ−４結合およびＭｏｎｏ　Ｑタンパクビークをドデシル硫 酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースに対 して移動させ、次いで、［”ＳＩ］ＩＧＦ−１１　トレーサーでプローブしたり ガンドブロットを示す。ＨＡ結合およびＩＧＦ−ＩＩ結合フラクション中に存在 する主たるＩＧＦＢＰは、見かけの分子量２９ｋＤａを有した。さらに、これら のフラクションは、６８および４３ｋＤａ分子量マーカー間で幅広く、強度の低 いバンドも示した。Ｍｏｎｏ　Ｑクロマトグラフィーによって、主たる２９ｋＤ ａ　ＩＧＦＢＰを、より高分子量のＩＧＦＢＰから分離した。Ｍｏｎｏ　Ｑピー クＡは、２９ｋＤａで主バンドおよび２４ｋＤａで副バンドを示した。Ｍｏｎｏ 　ＱピークＢは、６８および４３ｋＤａマ一カー間で広く拡散したバンドおよび ２９ｋＤａで副バンドを示した。

Ｍｏｎｏ　ＱピークＣ（王たるタンパク吸光度ピークを示す）およびＤは、２９ ｋＤａに弱バンドを示しただけであった。これらのデータは、ヒトの前抽出物中 の生たるＩＧＦＢＰが２９ｋＤａ　ＩＧＦＢＰであることを示唆している。

Ｍｏｎｏ　Ｑピーク膜中の２９ｋＤａ　ＩＧＦＢＰのアミノ酸組成およびＮ−末 端アミノ酸配列は、共に、固有であると思われ、他の公知のＩＧＦＢＰに対して 限定された配列類似性を持っている（第１表、第２表：第１図）。

第１表：ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよび公知のＩＧＦＢＰのアミノ酸組成ピークＡ　 ＩＧＦＢＰ−１　１ＧＦＢＰ−２　１ＧＦＢＰ−３　１ＧＦＢＰ−４ａｓｘ　８ ．１　６．８　６．６　６．８　８．０ｇ１ｘ　５．９　１３，２　１３．９　 １０．２　１２．２ｓｅｒ　９．３　９．０　３．５　１０．２　５．９ｇ１ｙ 　９．０　７．３　１１．８　８．７　９．７ｈｉｓ　５．１　２．６　３．８ 　２．７　４．６ａｒｇ　６．３　４．３　６．９　７．２　８．０ｔｈｒ　６ ．３　３．８　３．８　３．４　２．５ａｌａ　７．９　１１．１　７．３　６ ．８　６．８ｐｒｏ　５．８　７．７　９．３　８．７　８．９ｔｙｒ　３．７ 　２．６　１．７　３．４　１．３ｖａｌ　６．６　３．８　５．５　５．３　 ３．８ｍｅｔ　３．５　１．３　３．１　０．８　１．７ｃｙｓ　５。５　７． ７　６．６　６．８　８．４ｉ１ｅ　３．３　３．８　１．４　２．３　２．５ Ｉｅｕ　６．８　７．３　９．０　７．２　８．０ｐｈｅ　２．９　１．７　１ ．０　１．９　２．１１ｙｓ　４．０　３．８　４、５　７．２　５．１ｔｒｐ 　２．１　０．３　０．４　０．４直径１０諺諺のイモピロン（ｉｍｍｏｂｉｌ ｏｎ）腹違断器をメタノールに浸漬し、ミリボア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）濾過ユニ ット中に！き、ゴムＯーリングを用いて空間に保持した。イモピロン膜を水で洗 浄し、ピークＡｌｘ１を介して濾過することによって、ピークＡにおけるＢＰを 膜中に固定した。アミノ酸組成研究のために腹の半分を使用した。

第２表＋　Ｍｏｎｏ　ＱビークＡにおけるｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのアミノ末端配列 残基　アミノ酸（ｐ■０１） １）　Ｌ＝５９．４ ２）　Ｇ＝５０．１ ３）　Ｆ＝３４．８ ４）Ｆ＝４８．０ ８）　Ｅ＝２０．６ ９）　Ｐ＝２２．２ １０）　Ｄ＝１５．２ １３）　Ａ＝２２．８ １４）　Ａ＝３２．８ １５）　Ｌ＝２８．５ Ｎ−末端アミノ酸配列分析のためにｈ　ＢＤ−Ｉ　ＧＦ　Ｂ　Ｐ　５０ｐｍｏｌ を使用した。

合わせた平均反復収率は、８６．３％であった。Ｘ＝未知。

したがって、２９ｋＤａ　ＩＧＦＢＰをヒトの骨由来ＩＧＦＢＰ　（ｈＢＤ−Ｉ ＧＦＢＰ）と称した。主たる配列（Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｔ− Ｘ−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ　−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｌｅｕ）に加えて、Ｎ−末端で１個または２個のアミノ酸を欠失しているＭｏｎ ｏ　ＱビークＡにおけるさらなる配列の存在に関する証拠があった。精製２９ｋ Ｄａ　ＩＧＦＢＰの５℃で一夜の貯蔵によって、２９ｋＤａバンドが消失し、２ ４ｋＤａに主バンドおよびいくつかの低分子量の副バンドが出現するので、精製 ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、タンパク分解的切断に敏感であると思われる。２４ｋＤ ａバンドのＮ−末端配列分析の後、得られた配列（Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｘ −Ｖａｌ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ）は、２９ｋＤａ　ＩＧＦ ＢＰの配列と類似していた。さらに、２４ｋＤａ　ＩＧＦＢＰの貯蔵によって、 リガンドブロフト分析による測定の結果、それが消失し、非常に小さいＩＧＦＢ Ｐ活性しか含有しないと思われるいくつかの低分子量タンパクバンドが出現した 。これらの結果と一致する、ＩＧＦＢＰに関連するプロテアーゼが、最近報告さ れた。

Ｍｏｎｏ　ＱビークＢは、異なるアミノ酸組成を持つと思われ、骨細胞に対する ＩＧＦ−ｎの作用を増強しなかった。ビークＢを配列決定する本発明者らの試み が不成功であることが示された。生たるタンパクビーク（フラクション４５、ビ ークＣ）の最初の数サイクルの配列決定から、読み取り可能な配列を持たない多 数のアミノ酸が得られた。か（して、非常に小さいＩＧＦＢＰ活性しか含有しな いＭｏｎｏ　ＱビークＣおよびＤは、２９ｋＤａ　ＩＧＦＢＰの分解生成物を表 す。

Ｍｏｎｏ　Ｑ精製ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰビークのＮ−末端配列から、主たる配列に 加えて（おそらく、このＩＧＦＢＰを分解するＩＧＦＢＰプロテアーゼの同時精 製によって）１個または２個のアミノ酸を欠失したさらなる配列が得られるので 、ならびに、システィン残基が誘導されないので、本発明のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ 配列の７位のバリンおよび１０位のアスパラギン酸は、システィンであってもよ い（システィン残基はＩＧＦＢＰ系の種々のメンバーの間に保存された）。Ｍｏ ｎ。

Ｑ精製ヒト骨由来ＩＧＦＢＰの５℃での貯蔵によって、５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ て、２９ｋＤａ　ＩＧＦＢＰが消失し、より低分子量のＩＧＦＢＰが出現した。

低分子量のＩＧＦＢＰを配列決定したが、７位および１０位にシグナルがなかっ たので、これらの位置に、各々、バリンおよびアスパラギン酸は見られなかった 。

これらの発見によって、１つの具体例でｈＢＤ−ＩＧＦＢＰがＬ−Ｇ−Ｆ−Ｆ− Ｖ−Ｘ−Ｃ−Ｅ−Ｐ−Ｃ−Ｄ−に−Ａ−Ａ−Ｌの配列を持つことが示唆される。

前記考察も考慮に入れるｈＢＤ−ＩＧＦＢＰについての別の配列は、Ｌ−Ｇ−５ −Ｆ−Ｖ−Ｈ−Ｃ−Ｅ−Ｐ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−に−Ａ−Ｌであり、この配列は、キエ ファー（Ｋ　１ｅｆｅｒ）ら［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ サーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ 、　Ｃｏａｔ）　１７６　：　２１９−２２５　（１９９１）、シマサキ（Ｓ　 ｈｉｍａｓａｋｉ）ら、ジャーナル・オブ・ノ＜イオロシカルーケミストリー（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、）２６６　：１０６４６−１０６５３　（１９９１ ）、およびドｏ−７プ（Ｄｒｏｐ）、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ、）　１３０　：１７３６−１７３７　（１９９２）］のＢＰ−５配列と類似 している。該配列は、天然または導入した置換、付加または欠失に基づく可能な 変異を課せられており、この変異は、対立変異体であってもよく、あるいは、本 明細書で使用される個々の配列決定技術を介して生産されてもよい。本明細書に 記載の方法を使用して、タンパクを単離し、精製し、よく知られている種々の方 法によって配列を決定したことが認識されるであろう。さらに、Ｎ−末端配列は 、本発明のｂＢＤ−ＴＧＦＢＰをコードする遺伝子のクローニングのために変性 オリゴヌクレオチドプローブを構築させる。

実施例３ 骨細胞増殖アッセイにおけるｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの使用本明細書中に引用記載す るモ／Ｘン（Ｍｏｈａｎ）ら［ビオシミ力・ニド・ビオフイジ力・アクタ（Ｂ　 ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、８８４：２３４−２４２　 （１９８６）］に記載されている、無血清培地における骨細胞のＩＧＦ媒介増殖 についてのアッセイによって、トリクロロ酢酸沈殿可能細胞性物質中への［３Ｈ ］チミジンの組込みを測定する。このアッセイは、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３ −Ｅｌを使用して行われた。４８ウ工ル培養皿中の無血清ダルベツコ修飾イーグ ル培地において、ウェル当たり約１０．０００個の細胞を平板培養し、モ／＼ン （Ｍｏｈａｎ）ら（同書）に概略記載されているとおり、［’Ｈ］チミジンアッ セイのために使用した。

このアッセイでは、トリクロロ酢酸不溶性巨大分子中への［３Ｈ］チミジンの組 込みによって測定したとおり、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ自体は、あまり分裂誘発活性 を持っていなかった（下記第３表）。しかしながら、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを、最 大下濃度のＩＧＦ−ｎと一緒にマウス骨細胞の無血清培養物に添加すると、ｈＢ Ｄ−ＩＧＦＢＰはＩＧＦ−Ｉｆの増殖作用を増強した。ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧ Ｆ−Ｉの添加の数時間前に培養物に添加した場合だけ、ＩＧＦ−７作用を増加さ せることを示し［モハン（Ｍｏｈａｎ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８６　：　８３３８−８３４２　（１９８９）およびデ・メ ロウ（Ｄｅ　Ｍｅｌｌｏｗ）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・ リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、Ｒ ｅｓ、　Ｃｏａｎ、　）、１５６　：　１９９−２０４　（１９８８）］、他の ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰを同時に添加したという条件下でＩＧＦ の作用を増強することを示したとは思われない。これらのデータは、ｈＢＤ−Ｉ ＧＦＢＰが単にＩＧＦに対する受動性担体であるだけではなく、ＩＧＦの作用を 有効に調節していることを示唆している。ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰがＩＧＦ−ｍ刺激 ［”Ｈ］チミジン組込みを増強するメカニズムは知られていないが、可能な説明 によって、いくつかのメカニズムが提供されている（限定されない）。例えば、 ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、（おそらく、ＩＧＦＢＰ−１の場合と同様にＲＧＤ配列 を介して）ＩＧＦ−ＩＩの、その受容体への接近の容易さのために、細胞膜に対 してｒＧＦ−ＩＩを指向させる。あるいは、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、そのＩＧＦ −ｎへの結合のために、ＩＧＦ−Ｉｔの、その受容体に対する親和性を増大させ 、および／または、プロテアーゼからＩＧＦ−ＩＩを保護することによって、該 ＩＧＦ−ｎの半減期を増加させる。

第３表 骨細胞増殖を誘発するＩＧＦ−ｎに対するｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの増強効果ＢＳＡ 対照　１００＋１５　１００＋２２　１００＋１２ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ　１２８ ±１８　２１３±２９　１１６±９１ＧＦ−ｎ　１３８±１８　２６５±４３　 ２１４±２４ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ ＋　ＩＣＦ−ｆｒ”　１９５＋３２　６７２＋７４　３２０±４゜［’Ｈ］チミ ジンの添加前にマウス骨芽細胞株、ＭＣ３Ｔ３−Ｅｌの無血清培養物を、エフェ クターと一緒に１８時間インキュベートした。ＩＧＦ−ＩＩおよびｈＢＤ−ＩＧ ＦＢＰの最終濃度は、各々、３および１００ｇ／菖ｌであった。値は、６反復ウ ェルの平均±ＳＤである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）処理対照培養物中の［ ”Ｈ］チミ’）　ンＮｍ込すは、３＋ｅｌ：ｒ実験テ、各々、１４０４＋２１７ ．２３７±５３および７３０±９１であった。

”　ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよび１ＧＦ−ＩＩ間の相互作用期間は、ｃｓｓコンピ ュータープログラムを使用して、実験、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよびＩＧＦ−１間 の三元分析によって、非常に有意であった（Ｐ＜０．００００１）。

実施例４ 骨細胞調整培地からのｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの精製培養物中の骨細胞はｈＢＤ−Ｉ ＧＦＢＰを生産するので、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの精製のために、骨細胞培養物か ら回収した無血清調整培地を使用することもできる。すなわち、骨細胞調整培地 を、ＹＭ５　（５キロダルトン分子量遮断）を使用してアミコン中で濃縮し、酢 酸で酸性化し、最終濃度ＩＭにし、セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ −１００ゲル濾過に付してＩＧＦＢＰからＩＧＦを分離する。

タンパクを１Ｍ酢酸で溶離する。ＩＧＦＢＰを含有するフラクションをプールし 、凍結乾燥し、リン酸塩緩衝化生理食塩水で再構成し、Ｉ　Ｃ；Ｆ＝Ｉｒアフィ ニティヵラムに付す。次いで、親和性結合タンパクをＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｑ陰イ オン交換クロマトグラフィーに付してｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを他のＩＧＦＢＰから 分離する。

実施例５ ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰについての定量的診断アッセイヒト骨から精製したか、また は組換え手段によって発現したｈＢＤ−ＩＧＦＢＰをポリクローナルおよび／ま たはモノクローナル抗体生産に使用し、次いで、この抗体をｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ についての定量的アッセイに使用する。すなわち、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰをフロイ ント完全アジュバントと混合し、抗体生産についての確立されたプロトコールに 従うて、ウサギ、モルモット、ラットまたはマウスに注射した。次いで、動物に 、フロイント不完全アジュバントと混合したｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを３〜４週間ご とに注射した。ポリクローナル抗血清について、３〜４回注射した後、動物から 採血し、ラジオイムノアッセイまたは他の手段を使用して、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ に対する抗体力価を測定した。よく知られている技術を使用して、免疫化動物か ら得られた抗体生産細胞を永存させることによってモノクローナル抗体を生産す る。精製したｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを放射性標識し、シグナル生産トレーサーとし て使用する。次いで、血清、尿および他の生体液中のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰレベル の測定のためのｈＢＤ−ＩＧＦＢＰラジオイムノアッセイの展開のために、高い 力価を有するモノクローナル抗体または抗血清を使用する。

一般に、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの生産は、骨細胞増殖を増大させる因子で骨細胞を 処理することによって増大させられる。かくして、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、骨粗 髭症のような骨細胞増殖に関連する疾患状態に対する診断的マーカーとして使用 することができる。したがって、低血清ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、低い骨形成に関 連する骨粗髭症を示す。ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦ−ＩＩ作用を増強するの で、高血清ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰは、ある種の癌にも関連する。

実施例に の実施例に記載のとおり、組換え体または精製ｈＢＤ−ｒＧＦＢＰを使用して、 血清のような生物試料中のＩＧＦのレベルを定量化することができる。非標識競 合相手の存在または不在下、精製ｈＢＤ−４ＧＦＢＰ　２〜５ｎｇを１２５１（ ＧＦ　４０．０ＯＯＣＩ）ｌと一緒にインキュベートした。競合相手として、Ｉ ＧＦ標準または未知量のｒＧＦを含有する試料を使用した。室温で６０分間イン キュポートした後、ウメγグロブリンの存在下、ポリエチレングリコールの添加 によって、ｈＢＤ（ＧＦＢＰ複合体を沈殿させた。１１８５Ｘｇで３０分間遠心 した後、ガンマ−カウンター中で上清のアリコツトを計数した。種々の濃度の非 標識ＩＧＦを用いて標準曲線を作成し、標準曲線を使用して未知の試料中のＩＧ Ｆの量を計算した。かくして、ＩＧＦに対して高い親和性を有する精製ｈ　ＢＤ −Ｉ　ＧＦＢＰを利用するこのアッセイによって、生物学的に活性なａ離ＩＧＦ の量を測定した。

実施ＰＩ７ ｈＢＤ−ｒＧＦＢＰは骨の中でＩＧＦ−ＩＩを固定化するヒト骨は、比較的多量 のＩＧＦ−ＩＩを含有する。しかしながら、第４表に示すように、１２５１標識 ＩＧＦ−ＩＩ自体は、ヒドロキシアパタイト（当該表は、添加した合計数の１０ ％未満の非特異的結合だけを示す）またはコラーゲンに特異的に結合しない。Ｉ ＧＦ−ＩＩと対照的に、標識ｈＢＤ＝ＩＧＦＢＰはヒドロキシアパタイトへの特 異的結合を示した。生たる血清結合タンパク、すなわち、ＩＧＦＢＰ−３が同様 の活性を持っていなかったので、および、ｈＢＤｉＧＦＢＰが骨の他の生成分で あるコラーゲンに結合しなかったので、ヒドロキシアパタイトへのｈＢＤ−ＩＧ ＦＢＰの結合は、特異的であった。さらにまた、ヒドロキシアパタイトへのｈＢ Ｄ−ＩＧＦＢＰの結合は、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ−ヒドロキシアパタイト複合体が ４ＭグアニジンＨＣ１で解離することができなかったという点で強かった（４Ｍ グアニジノＨＣＩは、抗体−抗原複合体間の相互作用を解離することを示した） 。ヒドロキシアパタイトカラムへの添加前の、標識Ｉ　ＧＦ−ｎのｈＢＤ−ＩＧ ＦＢＰとの予備インキュベーションは、ヒドロキシアパタイトカラムへのｒＧＦ −ｆｆ結合を有意に増大させた。このＩＧＦ−１１のヒドロキシアパタイトへの 結合を促進させるｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの活性は、ＩＧＦＢＰ−３がかかる活性を 持っていなかったという点で特異的であった。これらの発見は、通常の条件下で ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰによってＩＧＦ−ＩＩが骨の中で固定化されるという結果と 一致する。

第４表：　ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰはヒドロキシアパタイトへのＩＧＦ−ＩＩの結合 を実施例８ ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒト骨細胞におけるＩＧＦＢＰ−５生産の調節ヒト骨細胞 がｉｌ　ｖｉｔｒｏでｈＢＤ−ＩＧＦＢＰを生産するかを測定するために、ＭＧ ６３、ＴＥ８５、ＴＥ８９．５ａＯｓｚおよびＵ２ヒト骨肉腫細胞ノ無血清培養 物から抽出した全ＲＮＡのノーザンプロットを、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰのＮ−末端 配列に対するオリゴヌクレオチドプローブを使用して、およびヒトＩＧＦＢＰ− ５ｃＤＮＡプローブを使用して、ハイブリダイズした（ドクター・シマサキ（Ｄ 　ｒ、　Ｓ　ｈｉＩＩａｓａｋｉ）、う・ジョーラ、カリフォルニア州）。これ らの研究によって、試験された全ての細胞株がｈＢＤ−４ＧＦＢＰ　ｍＲＮＡを 発現したことが明らかになった。ウェスタンリガンドプロット分析によると、Ｉ ＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、Ｕ２細胞中でｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの生産を数倍 増加させた。ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの生物学的特徴によって、このタンパクが骨細 胞におけるＩＧＦ−ＩＩの増殖作用を増強したことが明らかになった。

ヒトの骨芽細胞の増殖およびｉｎ　ｖｉｔｒｏでプロゲステロンによって刺激さ れたＩＧＦ−ＩＩの生産が報告された。この実験において、ＩＧＦ調節システム における他の成分（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰおよびＩＧＦ受容体）に対するプロ ゲステロンの効果は、ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞株ＭＧ６３において研究された 。全ての実験において、ＭＧ６３細胞を、１％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中、 細胞７５００個／ｃ、２の密度で平板培養した。−晩インキュベートした後、培 地を無血清に交換した後、プロゲステロンまたは賦形剤（エタノール）を添加し た。経時研究では、細胞を、１１００ｎプロゲステロンと一緒に０．５時間、２ 時間、４時間および６時間インキュベートした。ノーザンプロット分析によって 、各対照と比較して、３０分〜６時間、Ｉ　ＧＦ−Ｉｆ、ＩＧＦ−Ｉ、ｈＢＤ− ＩＧＦＢＰならびに１型および２型ＩＧＦ受容体についてのｍＲＮＡレベルの増 加が示された。しかしながら、阻害因子ＩＧＦＢＰ−４のｍＲＮＡレベルは、プ ロゲステロン添加後、３０分程度で減少した。ＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡレベルの 明確な変化はなかった。か（して、ヒト骨細胞増殖を刺激することを示したステ ロイドホルモンであるプロゲステロンは、ヒト骨細胞におけるＩＧＦＢＰ−５の 生産を増加させる。骨細胞増殖に対するプロゲステロンの刺激効果は、増大した ＩＧＦ生産によって媒介されただけではなく、ＩＧＦ受容体発現の増加、ｈＢＤ −ＩＧＦＢＰの増加（ｒＧＦ作用を増強する）、および阻害因子ＩＧＦＢＰ−４ の減少した生産によっても媒介された。

ＬＧＦＦＶＸＶＥＰＤＤＫＡＡＬ　ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰＡＰＷＱＣＡＰＣ５ＡＥ ＫＬＡ　ｈｌＧＦＢＰ−ＩＥＶＬＦＲＣＰＰＣＴＰＥＲＬＡ　ｈｌＧＦＢＰ−２ ＡＡＰＧ　ＸＧＱＧＶＱＡＧＣＰＧ　ヒト血清Ｆ／Ｇｌ Ｂ／ＢＯＸ　１００ Ｆｌ（ｉ　３Ａ。

ＦＩＧ、３θ ａ　ｂ　Ｃｄ　ｅｆ ＦＩＧ　４ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　 ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、 ＮＩＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．精製および単離したヒト骨由来イスリン様成長因子結合タンパク、ｈＢＤ− ＩＧＦＢＰ。
2. ２．ヒト骨または骨細胞調整培地から得られ、ＩＧＦ−ＩＩおよびヒドロキシア パタイトを結合する、約２９ｋＤａｌ分子量の精製ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ。
3. ３．骨細胞の増殖を刺激するＩＧＦ−ＩＩの能力限増強する請求項２記載の精製 ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ。
4. ４．ＩＧＦ−Ｉに対してよりもＩＧＦ−ＩＩに対して高い特異的結合親和性を有 する請求項２記載のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ。
5. ５．少なくとも１０−９Ｍの結合親和性でヒドロキシアパタイトを結合する請求 項２記載のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰ。
6. ６．骨形成に影響を及ぼす化合物に結合される請求項２記載の精製ｈＢＤ−ＩＧ ＦＢＰ。
7. ７．約２９ｋＤａｌの実質的に純粋なｈＢＤ−ＩＧＦＢＰタンパクまたはその断 片および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。
8. ８．さらに、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩからなる請求項７記載の医薬組成物 。
9. ９．ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩがｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに結合される請求項８ 記載の医薬組成物。
10. １０．患者への局所投与のために製剤化される請求項７記載の医薬組成物。
11. １１．患者への非径口投与のために製剤化される請求項７記載の医薬組成物。
12. １２．ＩＧＦの影響を変調させるのに充分な量の実質的に純粋なｈＢＤ−ＩＧＦ ＢＰおよび医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を患者に投与することか らなる、患者におけるＩＧＦの影響の変調方法。
13. １３．ＩＧＦがＩＧＦ−ＩＩである請求項１２記載の方法。
14. １４．ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰがＩＧＦ−ＩＩに結合される請求項１３記載の方法。
15. １５．患者が変性性骨障害に罹患しているか、または変性性骨障害に対して敏感 である請求項１２記載の方法。
16. １６．骨障害が骨粗鬆症である請求項１５記載の方法。
17. １７．創傷または骨折の修復を促進するのに充分な量の実質的に純粋なｈＢＤ− ＩＧＦＢＰおよび医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を患者に投与する ことからなる、患者における創傷または骨折修復の促進方法。
18. １８．送達されるべき化合物に結合した実質的に純粋なｈＢＤ−ＩＧＦＢＰまた はその断片および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を患者に投与する ことからなる、患者における骨組織への化合物の送達方法。
19. １９．化合物が骨形成または吸収に影響を及ぼす請求項１８記載の方法。
20. ２０．免疫的複合体形成に対して伝導的な条件下で、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに特異 的に結合する抗体と生物試料を接触させ、次いで、ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよび抗 体の間で免疫的複合体形成の存在を検出し、試料中のｈＢＤ−ＩＧＦＢＰの存在 および／または量を測定することからなる、生物試料におけるｈＢＤ−ＩＧＦＢ Ｐの存在の測定方法。
21. ２１．生物試料が血液、血漿、血清または尿である請求項２０記載の方法。
22. ２２．検出工程が酵素反応、蛍光、発光、または放射能によるものである請求項 ２０記載の方法。
23. ２３．免疫的複合体形成に伝導的な条件下、生物試料を、精製した標識ｈＢＤ− ＩＧＦＢＰおよびｈＢＤ−ＩＧＦＢＰに特異的に結合する抗体と接触させ、ここ で、該抗体は支持体に結合されており、次いで、標識ｈＢＤ−ＩＧＦＢＰおよび 抗体間の免疫的複合体形成の存在を検出し、次いで、試料中のｈＢＤ−ＩＧＦＢ Ｐの存在および／または量を測定することからなる、生物試料におけるｈＢＤ− ＩＧＦＢＰの存在の測定方法。