HUT70297A - Human bone derived insulin like growth factor binding protein - Google Patents

Description

Α találmány csontanyagcserére vonatkozik, pontosabban csontanyagcsere folyamatokra, melyek humán csontból izolált, új, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein (IGFBP) közvetítésével mennek végbe. Még pontosabban, a találmány humán csont-eredetű IGFBP-nek (hBD-IGFBP) nevezett IGFBP-re vonatkozik, mely lehetővé teszi az inzulinszerű növekedési faktor-II (IGF-II) hatását a csontsejt-proliferációban.

A humán plazmában az IGF-I és IGF-II a két legnagyobb mennyiségben előforduló növekedési faktor, melyek a proinzulinra strukturálisan hasonlító polipeptid családot alkotnak, s mindegyikük anabolikus és akut inzulinszerű aktivitással rendelkezik a különféle szövetekben (Daughaday és mtsi, Endocrine Rév., 10. 68-91 (1989)). Bár korábbi, patkányokkal és egerekkel végzett vizsgálatok az IGF-I-et emelték ki, mint elsődleges IGFet, az IGF-II-vel, mint magzati hormonnal végzett újabb kutatások az IGF-II egy fontos szerepét mutatták ki a felnőtt humán csont anyagcserében. Az IGF-II-t találták, mint a humán csontban legnagyobb mennyiségben előforduló, és a humán csontsejtekben legnagyobb mennyiségben termelődő növekedési faktor. Továbbá, az IGF-II azon kevés növekedési faktorok egyike, melyek mitogének a humán csontsejtekre. Az utóbbi időkben tisztított inhibitor IGFBP-vel (IGFBP-4) kapcsolatban azt tapasztalták, hogy szérummentes körülmények között kb. 40 %-ban gátolja a bazális csontsejtek proliferációját, ami azt sugallja, hogy hozzáadott növekedési faktorok hiányában az IGF-ek endogén termelődése nagymértékben hozzájárul a sejt proliferációhoz. Végül, az IGF-II receptort blokkoló antitestek azt mutatták, hogy gátolják a

Λ

• · · bazális csontsejtek proliferációját, jelezvén, hogy az IGF-II egy kulcsfontosságú csontsejt növekedési faktor (Mohán és mtsi, Growth, Genetics and Hormones, β, 1-9 (1990) és Mohán és mtsi, Clin. Orthopedics & Rel. Rés., 263. 30-48 (1990)).

Napjainkra az is világossá vált, hogy a különböző szövetekben az IGF-eket specifikusan kötő, szerkezetileg rokon proteinek családja működik közre az IGF működés modulálásában. A humán IGFBP-k négy osztályát (hIGFBP-1, hIGFBP-2, hIGFBP-3, hIGFBP-4) izolálták, és az izolált cDNS kiónok nukleotid szekvenciáinak segítségével meghatározták a teljes aminosav szekvenciákat (Mohán és mtsi, Clin. Orthopedics & Rel. Rés. 202, 30-48 (1990); Baxter és mtsi, Prog. Growth Factor Rés. 1, 49-68 (1989); Binkert és mtsi, EMBO J. fi, 2497-2502 (1988); Brewer és mtsi, Biochem. Biophys. Rés. Comm. Ifi2, 1289-1297 (1988); Brinkman és mtsi, EMBO J. Z, 2417-2423 (1988); Lee és mtsi, Mól. Endocrinol. 2, 404-411 (1988); Wood és mtsi, Mól. Endocrinol. 2, 1176-1185 (1988); LaTour és mtsi, Mól. Endocrinol. 4., 1806-1814 (1990); és Shimanski és mtsi, Mól. Endocrinol. 4, 1451-1458 (1990).

Az IGFBP-l-et különböző forrásokból izolálták, mint a magzatvíz, placenta membránok, peteburok és HEP G2 hepatoma sejtek. Ezen különböző forrásokból izolált IGFBP-1 proteinek Nterminális aminosav szekvenciái azonosnak bizonyultak. HEP G2, humán uterus és humán placenta cDNS könyvtárakból leírták az IGFBP-l-et kódoló cDNS klónozó és teljes szekvenciáját. Az IGFBP-2-t patkány máj sejtekből (BRL-3A) és Madin-Darby szarvasmarha vesesejtekböl készített kondicionált táptalajból • « ···

-3tisztították. Az IGFBP-2-t kódoló gént BRL-3A és humán magzati máj cDNS könyvtárakból klónozták. Az IGFBP-3 szérumban található, mint 150 kilodalton molekulatömegű, három egységből álló komplex, mely az IGF-I-ből vagy IGF-II-ből, egy 85 kilodaltonos savbomlékony glikoproteinből és az IGFBP-3 molekulából áll. Utóbbi egy 53 kilodaltonos saválló glikoprotein. Az IGFBP-3-at homogénné tisztították a humán szérumból, s leírták az IGFBP-3-at kódoló cDNS klónozását és szekvenálását. Az IGFBP-4-et eredetileg humán csontsejttel kondicionált táptalajból inhibitor IGFBP-ként, ill. patkány szérumból tisztították. Részletesen leírták a humán csontsejt cDNS könyvtárból és a máj cDNS könyvtárból izolált IGFBP-4 cDNS klón klónozását és szekvenálását. E négy IGFBP osztályon felül Martin és mtsi, J. Bioi. Chem., 265, 4124-4130 (1990); Roghani és mtsi, FEBS Lett., 255. 253-258 (1989); és Zapf és mtsi, J. Bioi. Chem., 265, 14892-14898 (1990), beszámoltak az IGFBP humán cerebrospinális folyadékból, AG 2804 transzformált fibroblasztokkal kondicionált táptalajból és hypoglikémiás szérumból történő részleges tisztításáról. Ezen IGFBP-k erős affinitást mutattak az IGF-I-hez és az IGF-II-höz.

A tudomány különböző IGFBP-ket ír le, melyeket különböző forrásokból készítettek, s melyek az IGF-ekhez eltérő kapcsolódási tulajdonságokat mutatnak, valamint eltérő biológiai funkciót töltenek be. Pl., az IGFBP-1, IGFBP-3 és IGFBP-4 közel egyenlő affinitással köti mind az IGF-I-et, mind az IGF-II-t, ezzel szemben az IGFBP-2 és a magzatvízből, fibroblaszt sejtekből és humán szérumból tisztított IGFBP nagyobb aktivitással köti az IGF-II-t, mint az IGF-I-et. Ami a funkciójukat illeti, az IGFBP-1

-4egyrészről gátolja, másrészről elősegíti az IGFBP-1 proliferatív működését a choriocarcinoma sejtekben és a humán fibroblasztokban (Elgin és mtsi, J. Bioi. Chem., 84. 3254-3258 (1987) és Ritvos és mtsi, Endocrinology, 122. 2150-2157 (1988)). Az IGFBP-3 a fibroblaszt tenyészfeltételeitől függően gátló és serkentő hatást gyakorolt az IGF-I működésére (De Mellow és mtsi, Biochem. Biophys. Rés. Comm., 156. 199-204 (1988)). Az IGFBP-I-gyel és IGFBP-3-mal szemben az IGFBP-4 kizárólag gátolta az IGF-I és IGFII működését a csontsejtekben (Mohán és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86. 8333-8342 (1989)). A tudomány továbbá felveti, hogy a különböző IGFBP-k termelésének szabályozása egymástól eltérő szövet-specifikus módon történik. Például, az IGFBP-1 termelését az inzulin, míg az IGFBP-3 termelését a növekedési hormon szabályozza (Baxter és mtsi, Prog. Growth Factor Rés., 1, 49-68 (1989)). Ezek a fekfedezések felvetik, hogy a különböző IGFBP-k sokfélesége egyedi szabályozottságukkal együtt az IGF aktivitás lokalizált, szövet-specifikus módon történő modulálását okozhatja.

A tudományban a továbbiakban szükség van arra, hogy leírjuk az IGF-I és IGF-II IGFBP-k útján megvalósuló csontanyagcsere funkcióit, illetve, hogy azonosítsuk a csontsejtek által termelt és a humán csont-mátrixban jelenlévő IGFBP-ket. Ezen IGFBP-k minden bizonnyal közreműködnek a csont anyagcsere szabályozásában, s klinikai vizsgálatok során felhasználhatók arra, hogy a csontanyagcsere-defektusok diagnózisaihoz információkat nyújtsanak. Az IGFBP-k, melyek lehetővé teszik a csont IGF-függő növekedését, különösen hasznosak lennének a

-5metabolikus csont betegségek - mint pl. az oszteoporózis terápiás kezeléséhez. Meglepő módon, a találmány alkalmas ezen és más, fentiekkel kapcsolatos szükségletek kielégítésére.

A találmány eljárásokat és készítményeket bocsát rendelkezésre, melyek felhasználhatók az IGF-közvetett csontképződéssel és sejt-proliferációval kapcsolatos metabolikus rendellenességek klinikai diagnosztizálásához és kezeléséhez. Még pontosabban, a találmány humán csont-eredetű IGF-kötő proteint (hBD-IGFBP) bocsát rendelkezésre. A hBD-IGFBP az IGF-II-vel együttműködve olyan körülmények között teszi lehetővé az IGF-IIközvetett sejt-proliferációt, ahol az IGF-II és a hBD-IGFBP együttesen irányított. A tisztított hBD-IGFBP hidroxiapatithoz is nagy affinitással kapcsolódik, ezáltal olyan reagenst biztosítva, mely specifikusan a csontba képes molekulákat irányítani, mint pl. az IGF-I-et és/vagy IGF-II-t, más növekedési faktorokat és gyógyszereket, melyek hatással vannak a csont-reszorpcióra v. képződésre, s ezáltal hasznosak a csonttörések és csont betegségek (pl. oszteoporózis, oszteosarkóma) kezelésében. A hBDIGFBP szintén eredményesen alkalmazható a seb- és bőrgyógyításban. A hBD-IGFBP a diagnosztizálásban is felhasználható, mint a csontképződési ráta márkere, pl. a csontrendellenességek terápiás kezelésében. A hBD-IGFBP továbbá reagensként használható a csontanyagcsere- v. más rendellenességekben szenvedő betegekből származó minták IGFszintjeinek értékelésében.

-6• ·

1. ábra: A hBD-IGFBP N-terminális aminosav-szekvenciájának összehasonlítása más ismert IGFBP-k szekvenciáival. A szekvenciákat úgy állítottuk sorba, hogy maximális azonosságot mutassanak.

2. ábra: A hBD-IGFBP kompetitív kötési grafikonja. A minta kötőprotein-aktivitását vizsgáltuk jelölt IGF-II-vel jelöletlen IGF-I és IGF-II jelenlétében vagy hiányában.

3. ábra:

Humán csont-kivonat FPLC Mono Q kromatográfiás protein-spektruma és IGFBP-aktivitás-spektruma (B). A HAkötött frakciók három ml-es aliquotját használtuk az IGF affinitás-oszlophoz. A kapott három affinitás-kötött frakciót összegyűjtöttük és Mono Q anioncserélő oszlopon engedtük át. A protein-spektrumot 280 nm-es abszorbanciánál vizsgáltuk. 2 ml-es, két perces frakciókat gyűjtöttünk össze. A frakciók aliq.uot.jait tízszeresére hígítottuk, s meghatároztuk a kötőproteinaktivitásukat. Az IGFBP-aktivitást a specifikusan kötött, jelölt

IGF-II mennyiségével fejeztük ki.

4. ábra: A különböző mértékben tisztított hBD-IGFBP-k ligandum biot analízise. A minta 50 μΐ-ét SDS-PAGE-en (3-27 %-os gradiens) futtattuk, nitrocellulóz membránra vittük, jelölt IGFII-vel biotokat készítettünk, majd autoradiográfiás vizsgálatot végeztünk. a: humán csont-kivonat HA-kötött frakciója; b : IGF-II affinitás-kötött frakció; c: Mono Q IGFBP A csúcs; d: Mono Q IGFBP B csúcs; “e: Mono Q IGFBP C csúcs; f: Mono Q IGFBP D csúcs.

« ·

A találmány olyan csont-eredetű IGFBP-t bocsát nagyobb affinitással kötődik tisztított és izolált, humán rendelkezésre, mely specifikusan az IGF-II-höz, mint az IGF-I-hez.

Ezen protein kívánt homogenitásig tisztítható pl. humán csont-preparátumokból, humán csont kondicionált táptalajból vagy humán szérumból kivont proteinek közül. Minimum 50 %-os tisztaságú hBD-IGFBP az előnyben részesített, a minimum 70-80 %-os még előnyösebb, s a 95-99 %-os, vagy még nagyobb homogenitású a legelőnyösebb, különösen gyógyászati célokra. A szükségleteknek megfelelően részlegesen vagy homogenitásig tisztított hBD-IGFBP felhasználható a diagnosztizálásban, vagy immunogén anyagként a terápiás kezelésekben, stb.

A találmány szerint előállított hBD-IGFBP tisztítható hidroxiapatit - apatit kromatografiát követő affinitáskromatográfiával (IGF-II-vel töltött oszlopon), s végül, további tisztítás érdekében, FPLC rendszerű Mono Q anioncserélő kromatográfiával. A tisztított protein kétségtelen tisztaságát bizonyítja pl., hogy szimpla sávként halad az SDS-PAGE-en, ill., hogy N-terminális szekvencia analízissel egyedi aminosavszekvencia készíthető. Specifikusan a hBD-IGFBP ellen irányított antitesteket felhasználó antitest-oszlopon végzett affinitáskromatográfia szintén alkalmazható tisztítási rendszerként. További tisztítás általános kémiai tisztítási módszerekkel végezhető, mint pl. a folyadékkromatográfia, a gradienscentrifugálás, gélelektroforézis, stb. A proteinek tisztítási módszerei ismeretesek a tudományban (általánosan ld. Scopes, R. , Protein Purification, Springer-Verlag, NY, (1982)), és alkalmazhatók a találmányban leírt hBD-IGFBP-k tisztításához.

-a• ♦··

A hBD-IGFBP IGF-I-hez és IGF-II-höz történő specifikus kapcsolódását polietilénglikol kicsapásos elemzéssel demonstráltuk.

tekintetben a találmány olyan tisztított proteint bocsát rendelkezésre mely a specifikus receptorokhoz és a hBD-IGFBP-hez való kötődést egyaránt lehetővé tevő IGF determinánsok struktúra-funkciós vizsgálataihoz alkalmazható. A találmány szerinti hBD-IGFBP-k további típusait a találmány alább leírt egyéb vonatkozásaiban adjuk közre.

A találmány szerinti IGFBP egyedi és jól elhatárolható a korábban azonosított IGFBP-ktől. A humán IGFBP-l-et, IGFBP-2-t, IGFBP-3-at, IGFBP-4-et a hBD-IGFBP aminosav-szekvenciától különböző, közölt aminosav-szekvenciákkal jellemeztük. A cerebrospinalis folyadékból, fibroblaszt sejttel kondicionált táptalajból és humán szérumból tisztított IGFBP leírt Nterminális aminosav-szekvenciája szintén különbözik a hBD-IGFBP szekvenciájától.

A találmány szerinti homogén, humán IGFBP-t (hBD-IGFBP) az 1. ábrán bemutatottal azonos, vagy lényegét tekintve azonos N terminális aminosav-szekvenciával jellemeztük. A találmányt illetően, az 1. ábrán szereplővel lényegileg azonos N-terminális aminosav-szekvencián olyan aminosav-szekvenciát kell érteni, mely azonos az 1. ábrán szereplővel, kivéve, ha konzervatív aminosavszubsztitúciók, vagy más aminosav-szubsztitúciók, inszerciók v. deléciók vannak jelen, melyek nem befolyásolják lényegesen az IGF-I-gyel v. IGF-II-vel azonos protein kötődését, vagy másképpen, jelentősen módosítják ezek funkcióját az alább leírt alkalmazásokban.

A hBD-IGFBP rekombináns úton történő előállításához a ···· 4»

-9•. Η :

* ·· « ··< 99* találmány szerinti hBD-IGFBP-t kódoló gént inszercióval megfelelő expressziós vektorba klónoztuk ill. abban expresszáltuk. Az expressziós vektor másfelől a rekombináns hBD-IGFBP polipeptidek expressziója végett alkalmas gazdasejtek transzformálásához vagy transzfektálásához használatos. A humán csontsejt cDNS-könyvtár screeneléséhez egy vagy több olyan - általában 14-25 nukleotidnyi - szintetikus oligonukleotid próbát használtunk, mely a tisztított hBD-IGFBP terminális aminosav-szekvenciájának legalább egy részletét tükrözték. A leghosszabb szakaszt tartalmazó pozitív kiónokat standard eljárásokkal szekvenáltuk. A leszármaztatott aminosav-szekvenciát összehasonlítottuk a tisztított protein N-terminális aminosav-szekvenciájával, és a leszármaztatott aminosav-szekvencia alapján meghatározott molekulatömeget és aminosav-összetételt összehasonlítottuk a tisztított hBD-IGFBP megfelelő jellemzőivel. A kiónt ezután rekombináns hBD-IGFBP előállítására használtuk, standard eljárások alkalmazásával, amint azt általánosan leírták, pl. Sambrook és mtsi, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Press, NY, (1989).

Más tekintetben a találmány hBD-IGFBP polipeptidekre és fragmensekre vonatkozik. A hBD-IGFBP polipeptidek és fragmensek rekombináns expressziós rendszerekből izolálhatok, vagy Merrifield-féle szilárd fázisú eljárással szintetizálhatok (Merrifield, Fed. Proc. 21, 412 (1962), Merrifield, J. Am. Chem.

Soc. 2149 (1963), vagy

1-284 Academic Press, szekvenciát értünk, mely több) - 100-200 (v. több)

Bárány és Merrifield, The Peptides, 2,

NY, (1979)). Polipeptiden olyan minimálisan három, általában 6 (vagy aminosavból áll, beleértve a teljes

-10proteineket is. Pl. a hBD-IGFBP protein hidroxiapatitot és/vagy IGF-II-t kötő részét (részeit) több módszerrel is azonosíthatjuk, mint pl. a tisztított hBD-IGFBP proteázzal vagy kémiai ágenssel történő kezelésével, melynek következtében fragmensek keletkeznek, s meghatározható, hogy melyik fragmens képes a jelölt IGF-II-höz vagy hidroxiapatithoz kötődni. Ezután polipeptideket szintetizálhatunk, melyek antigénként felhasználva gátolják az IGF-II- vagy hidroxiapatit - hBD-IGFBP interakciót, stb. Meg kell jegyezni, hogy a hBD-IGFBP, amint azt itt említettük, egyaránt jelenthet proteineket, polipeptideket vagy ezek fragmenseit, hacsak a szövegösszefüggés másként nem jelöli.

Egy más vonatkozásban, a találmány a hidroxiapatit/hBDIGFBP/IGF-II interakciót szabályozó eljárásokat biztosít, s ezáltal a hBD-IGFBP-vel vagy ligandumaival (mint pl. az IGF-II) közvetlenül vagy közvetve kapcsolatos rendellenességek terápiás és/vagy profilaktikus kezelését is magában foglalja. A találmány szerinti kötőprotein alapján azonosíthatók az agonisták ill. antagonisták, attól függően, hogy serkentik vagy gátolják az IGFII, hidroxiapatit vagy más ligandum interakcióját a hBD-IGFBPvel. A sejtek anyagcseréje és reaktivitása a hBD-IGFBP-nek és az IGF-II-nek megfelelő agonisták v. antagonisták valamelyikével kontrollált, s így lehetőség nyílik az ezekkel kapcsolatos betegségek gyógyítására, vagy némely esetben, megelőzésére.

Ily módon, a találmány a ligandum/hBD-IGFBP interakció közvetítette események agonistáinak vagy antagonistáinak azonosítására alkalmas vizsgálati eljárásokat biztosít. Ezen vizsgálati módszerek széles választéka alkalmazható attól függően, hogy a ligandum/kötőfehérje interakció mely szempontjait

-11helyezzük előtérbe. Pl. ilyen eljárások használhatók fel a kötőfehérjékhez kapcsolódó - s ezáltal az IGF-II-vel vagy a hidroxiapatittál történő interakciót blokkoló - vegyületek azonosításához. Más vizsgálatok a hBD-IGFBP-t helyettesítő vegyületek azonosításához alkalmazhatók, megint mások azon vegyületek azonosításához használhatók fel, melyek gátolják v. elősegítik az IGF hBD-IGFBP-hez történő kapcsolódását, közvetítve ezáltal az IGF celluláris hatását.

Egy másik vonatkozásában a találmány olyan proteint bocsát rendelkezésre, mely az IGF-II-t az IGF-I-gyel szemben szelektív affinitással köti. A 2. ábra a ligandumként ^12BI-IGF-et tartalmazó hBD-IGFBP kompetitív kötési diagramja, kompetitorként IGF-I-gyel és IGF-II-vel. A kötött i²⁵I-IGF-II-nek az IGFBP-ről történő 50 %-os eltávolításához hozzávetőleg 10 ng/ml IGF-I-re és 1 ng/ml IGF-II-re volt szükség, jelezve, hogy az IGF-II a jelölt molekula eltávolításában tízszer hatásosabb, mint az IGF-I. Amikor ^12SI-IGF-I-et használtunk jelzőként, az IGF-II a jelölt molekula eltávolítását illetően még mindig hatásosabb volt (négyszeresen). Ezen eredmények arra engednek következtetni, hogy az IGFBP sokkal nagyobb affinitással köti az IGF-II-t, mint az IGF-

I-et. Jellemzően, a hBD-IGFBP IGF-II-re vonatkozó kötési affinitása 10^-® M-tól 10^-12 M-ig, vagy még tovább terjed, leginkább 10~¹⁰ - 10-n « között, miközben a hBD-IGFBP IGF-I-re vonatkozó kötési affinitása tízszer kisebb, kb. 10^_s - 10^_1° M. A hBD-IGFBP-nek - az IGF-I-gyel szemben - az IGF-II-t érintő szelektív affinitása magyarázhatja azt a tényt, hogy humán csontban az IGF-II 10-15-ször nagyobb mennyiségben fordul elő.

« ·

A találmány terápiás és gyógyászati hBD-IGFBPkészítményeket bocsát rendelkezésre, melyek kihasználják a hBDIGFBP hidroxiapatithoz való nagy (10~® - 10^-11 M) kötési affinitását. A találmány szerinti hBD-IGFBP még erős denaturáló ágansek (pl. 4M guanidin-HCl) jelenlétében is köti a hidroxiapatitot, míg a tisztított IGF-II nem. Ezáltal a hBD-IGFBP olyan eszközöket ill. vivőanyagokat biztosít, melyek a csontban rögzítik ill. a csontba szállítják az IGF-II-t. Az IGF-II a tudományosan képzett egyének számára nyilvánvaló konjugációs kémiai módszerekkel kapcsolható a hBD-IGFBP-hez, anélkül, hogy bármely protein kívánt aktivitása csökkenne.

A hBD-IGFBP más, a csontszövetbe vagy -sejtekbe juttatni kívánt molekulához (pl. IGF-ek v. a következőkben leírt egyéb molekulák) történő kapcsolása megvalósítható jól ismert laboratóriumi eljárásokat felhasználó kémiai konjugációval, pl. keresztkötő reagensek alkalmazásával. Kémiai kötésen azt értjük, hogy a protein molekulák kovalens kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A konjugáció előnyben részesített módszere szerint a hBD-IGFBP/IGF-II molekulák között legalább egy kovalens kötést alakítunk ki. A kötés lehet direkt, mely szintetikus kötőcsoportokból álló kötést jelent, és lehet indirekt, mely egy közbenső résszel (fehérjével v. peptiddel, pl. plazma albuminnal v. más spacer-molekulával) rendelkező kötést jelent. Például a kötés létesülhet hetero- v. homo-bifunkcionális keresztkötő molekulákon keresztül, mint amilyen a karbodiimid, glutáraldehid, N-szukcinimidil-3-(2-piridin-ditio)-propionsav (SPDP) és származékai, bis-maleinimid, 4-(N-malein-imidometil)-ciklohexánkarboxilát (SMCC), illetve keresztkötések hozhatók létre exogén

*

-13• · · ·

keresztkötők nélkül, az egyedi molekulákkal reaktív csoportok, mint pl. karbohidrát-, diszulfid-, karboxil-, v. amino-csoportok felhasználásával a natív protein oxidációjával vagy redukciójával, enzimes kezeléssel, stb. A protein molekulák kémiai keresztkötésének módszerei általánosan ismertek a tudományban, ld. pl. a 4,355,023; 4,657,853; 4,676,980; 4,925,921 és 4.970,921 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokat ill. ImmunoTechnology Catalogue and Handbook, Pierce Chemical Co. (19S9). Általában az ilyen keresztkötések nem befolyásolják lényegesen az IGF-II v. a hBD-IGFBP kívánt funkcióját ill. funkcióit.

Az IGF-II v. a hBD-IGFBP hibrid, kiméra vagy fúziós protein molekulái vagy azok részletei szintén előállíthatok rekombináns DNS technikákkal, ld. pl. a 4,859,609 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást ill. Sambrook és mtsi, supra.

Az IGF-II/hBD-IGFBP komplex csontban történő lerakódása a csont-reszorpció és a hidroxiapatit feloldódás alatt lehetővé teszi a komplex felszabadulását, és - a reszorpciós hely környezetében lévő oszteoblasztok proliferációjának stimulálásával - új csontképződés megindulását. A hBD-IGFBP IGFΙΙ-re és hidroxiapatitra vonatkozó nagy affinitása alapján a találmány terápiás szereket és készítményeket bocsát közre, melyek - többek között - specifikusan a csontba irányítják az IGF-II-t és/vagy az IGF-I-et.

Az új hBD-IGFBP, hBD-IGFBP/IGF-II és más konjugánsok, hBD-IGFBP-antitestek és antagonisták, és az ezekből készített gyógyászati készítmények különösen hasznosak a hBD-IGFBP-vel és

-14az IGF-II-vel kapcsolatos betegségek kezelésében. A gyógyászati készítményeket elsősorban parenterálisan, úm. szubkután, intramuszkulárisan v. intravénásán, illetve helyileg, szájon át aeroszol útján, intranazálisan stb. kell alkalmazni. Ily módon, a találmány olyan parenterális alkalmazású készítményeket bocsát rendelkezésre, melyek hBD-IGFBP-t, hBD-IGFBP/IGF-II és más konjugánsokat, hBD-IGFBP-antitesteket és antagonistákat vagy megfelelő, lehetőleg vizes hordozóban oldott hBD-IGFBP és IGF-II elegyet tartalmaznak. A vizes hordozók széles skálája alkalmazható, mint pl. víz, puffereit víz, 0,4 %-os sóoldat, 0,3 %-os glicin és hasonlók. Ezen készítmények általánosan használt, jól ismert sterilizáló módszerekkel sterilezhetők. A készítmények tartalmazhatnak gyógyászatilag alkalmas kiegészítő anyagokat, amelyektől elvárható, hogy beállítják a fiziológiai feltételeket.

Ilyenek például a pH szabályozó és pufferező szerek, toxicitás

szabályozók és	hasonlók, pl. nátrium-acetát, nátrium-laktát.
nátrium-klorid,	kálium-klorid, kalcium-klorid, stb. Ezekben a
készítményekben	a szükséges hBD-IGFBP, hBD-IGFBP/IGF-II, hBD-

IGFBP-antitestek vagy ezek antagonistáinak koncentrációi nagyon széles intervallumon belül változtathatók, pl. 0,00001 (vagy még kevesebb) tömegszázaléktól - általában 0,001 tömegszázaléktól kb. 0,05-0,1 tömegszázalékig, melyeket elsősorban a folyadéktérfogat, a viszkozitás, stb. alapján választhatunk ki a választott kezelési módnak és a kezelési feltételeknek (pl. csonttörés gyógyítás, oszteoporózis, műtéti vagy traumás sebek gyógyítása, tumorok, mint az oszteoszarkóma v. a mellrák, stb), valamint a kezelt személynek (úm. felnőtt, gyermek, újszülött) megfelelően.

-15Ilyenformán, egy mérsékelt csontdegeneratív betegségben szenvedő felnőtt kezeléséhez alkalmas intravénás infúzió kiegészíthető 250 ml steril Ringer-oldattal és kb. 50 mg - 5 g hBD-IGFBP-vel vagy hBD-IGFBP/IGF-II-vel. A parenterálisan vagy orálisan alkalmazható vegyületek aktuális előállítási módjai a tudományban jártas személyek számára ismertek ill. nyilvánválóak, s nagyobb részletességgel megtalálhatók. pl. Remington's Pharmaceutical Science, 16. kiadás, Mack Publishing Company,

Easton, PA (1982).

A találmány szerinti hBD-IGFBP-t, hBD-IGFBP/IGF-II-t vagy ezek keverékét tartalmazó készítmények alkalmazhatók profilaktikus és/vagy terápiás kezelésekhez. Terápiás alkalmazásokban a készítményeket a hBD-IGFBP-vel vagy IGF-II-vel kapcsolatos betegségban szenvedő betegnek olyan mennyiségben kell adni, amely elégséges a betegség - és annak komplikációinak meggyógyításához, vagy legalább részleges megfékezéséhez. Ennek

megvalósításához	szükséges	mennyiséget terápiásán hatékony
dózisnak nevezzük.	Hogy	ez a mennyiség	mekkora, az a
betegségtől,	pl.	a	csont-degeneráció	milyenségétől
(oszteoporózis,	törés,	seb,	tumor) és annak	súlyosságától, a
beteg korától	ill.	általános egészségi állapotától függ.
Általában ez a	mennyiség kb.	1,0 ug - 500 ug hBD	-IGFBP vagy hBD-

IGFBP/IGF-II infúziós óránként, de testsúlykilogrammonként és többnyire

10-50

Mg hBD-IGFBP hBD-IGFBP/IGF-II testsúlykilogrammonként és infúziós óránként. Minthogy a találmány anyagai alkalmazhatók súlyos betegségek esetén, annak érdekében, hogy az idegen anyagok jelenlétét minimálisra lehessen csökkenteni, illetve, hogy az idegen anyagok hatásai

-16kiküszöbölhetők legyenek, a kezelőorvosnak lehetősége van arra, hogy ezen gyógyászati anyagokat kellő feleslegben alkalmazza.

Profilaktikus alkalmazásokban a találmány szerinti hBDIGFBP- t, hBD-IGFBP/IGF-II-t vagy ezek keverékét tartalmazó készítmények olyan személyek esetében, akik már nem szenvednek betegségben, felhasználhatók az adott személy betegséggel szembeni rezisztenciájának növelésére, olyan mennyiségben, amit profilaktikusan hatékony dózisnak” nevezünk. A pontos mennyiség ebben az esetben is függ a páciens egészségi állapotától, stb., de általában 1-500 230 pg/testsúlykilogramm infúziós óránként, leginkább 10-50 ug/testsúlykilogramm infúziós óránként. A profilaktikus alkalmazás előnyös a súlyos csontdegeneratív betegséggel veszélyeztetett páciens kezelésében.

A készítmények egyedüli vagy összetett alkalmazása a kezelőorvos által kiválasztott dózisoknak és módnak megfelelően vihető végbe. A gyógyászati készítménynek minden esetben a páciens kezeléséhez elegendő mennyiségben kell biztosítania a hBD-IGFBP-t vagy a hBD-IGFBP/IGF-II-t.

Egy következő vonatkozásában a találmány olyan szert bocsát rendelkezésre, mely hatásos a csontsejt-proliferáció IGFII-nek megfelelő stimulálására. Szérummentes körülmények között az IGF-II-nek csontsejtekbe történő exogén adagolása növeli azok proliferáciőját. Az IGF-II ezen proliferatív hatását a hBD-IGFBPnek IGF-II-vel együtt történő adagolása teszi lehetővé. A hBDIGFBP és IGF-II kombináció ezen szinergista működését - mely hatásosabb más szerek egyedüli alkalmazásából származó eredmények kombinációjával megvalósított összetett hatásoknál - semmilyen más sejttípusból származó IGFBP-ről nem írták le. így tehát a

-17találmány a csontképződés károsodásával járó csontrendellenességek (pl. oszteoporózis) kezeléséhez alkalmazható terápiás szereket bocsát rendelkezésre. A gyógyászati készítmények fiziológiailag alkalmas hordozókkal és/vagy kötőanyagokkal együtt tartalmazzák a hBD-IGFBP-t,s ha szükséges, az IGF-et.

A találmány továbbá olyan szert biztosít, mely általános sebek és bőrsérülések gyógyításában növeli az IGF-ek hatását és féléletidejét. A hBD-IGFBP olymódon növeli az IGF-ek féléletidejét, hogy megóvja azokat a proteázoktól, specifikusan a csontba irányítva az IGF-eket és/vagy elősegítve proliferatív működésüket.

A hBD-IGFBP + IGF komplexek többféle módon állíthatók elő, pl. tisztított hBD-IGFBP és IGF koncentrációknak az alkalmazás előtt egy éjszakával, neutrális pH-η történő inkubálásával. A készítményben a hBD-IGFBP és IGF koncentrációk széles skálán belül variálhatók, de lehetőség szerint megközelítően ekvimolárisak. A leírás alapján más készítmények is könnyen érthetőek lesznek a tudományban jártas személyek számára. Ha a készítményeket külön-külön készítjük el, a hBD-IGFBPkészímények az IGF-készítményekkel együtt vagy azoktól elválasztva alkalmazhatók. Különválasztott alkalmazás esetén jellemzően a hBD-IGFBP alkalmazható elsőként, melyet az IGF-II követ. Az ilyen készítmények felhasználhatók specifikus területeken a helyi csontképződés stimulálása érdekében (pl. csonttörés esetében), ill. rendszeres alkalmazással az általános csontképződés érdekében, mint pl. csont-rendellenességek (oszteoporózis) kezelésében.

-18····

Más megvalósításaiban a találmány hatékonyabb IGFmolekulák előállításáról gondoskodik. Az IGF-ek és a hBD-IGFBP struktúra-funkciós analízise az IGF-ek olyan régióját (régióit) azonosította, melyek résztvesznek a hBD-IGFBP-hez való kötődésben. Aminosav-szubsztitúciókkal, -inszerciókkal és -deléciókkal lehetőség nyílik olyan módosított IGF-molekulák előállítására, melyek az IGF receptorokat és a hBD-IGFBP-t nagy affinitással kötik, miközben az inhibitor IGFBP-khez (mint amilyen az IGFBP-4 és IGFBP-3) nem kapcsolódnak. Az ilyen módosított IGF-molekulák hatásos anabolikus szerekként szolgálnak az általános sebek és a bőrsérülések gyógyításában. A találmány más megvalósításaiban hBD-IGFBP-fragmenseket állítottunk elő. A fragmensek jellemzően a kívánt funkcióval rendelkeznek, mint pl. az IGF-II- vagy hidroxiapatit-kötő képesség, míg ezen funkciók tekintetében nem esszenciális egyéb részletek eltávolíthatók. A fragmensek egyedileg ill. egymáshoz kapcsoltan is felhasználhatók.

találmány szerinti hBD-IGFBP az IGF-ek mellett más, a csontok szamára fontos molekulák irányításában is hasznos szerepet tölt be. A molekulák a csontképződésre vagy

-reszorpcióra közvetlenül vagy közvetve hatnak. Amint az tudományban jártas személyek számára nyilvánvaló, e módszerrel molekulák sokfélesége irányítható a csontszövetbe. Ilyenek pl.

csontképződést serkentő vegyületek, mint a csont-morfogén protein (BMP), TGFp, fibroblaszt növekedési faktor (FGF), trombocita eredetű növekedési faktor (PDGF); ilyenek a csontképződést csökkentő szerek (melyek bizonyos rákos megbetegedések esetében szükségesek), pl. glükokortikoid, 1,25-dihidroxi-D3 vitamin;

-19csont-reszorpciót növelő vegyületek, mint a makrofág-stimuláló faktor (M-CSF) és az interleukinek; ill. csont-reszorpciót csökkentő vegyületek, mint a bisz-foszfonsav és a kalcitonin. E vegyületek különböző módokon kapcsolhatók a hBD-IGFBP-hez, többek között a fentebb leírt konjugációval, valamint fúzióval és alkalmas kiméra proteinekkel. A csontszövet felszínére szállítandó, fentebb említett irányított vegyületek, mint pl. a növekedési faktorok jellemző dózisai kb. 10 pg/csontszövet-ml-től 50 ng/csontszövet-ml-ig terjednek.

Más vonatkozásában a találmány diagnosztikai markereket bocsát rendelkezésre, melyek metabolikus csontbetegségben vagy csont-neopláziában szenvedő páciensektől vett klinikai mintákban a csontképződés kiértékelésére használhatók. Azok alapján, hogy a hBD-IGFBP az IGF működések egy fontos modulátora, s hogy az IGFII egy fontos humán növekedési faktor, a hBD-IGFBP-szint felhasználható a csontanyagcsere-rendellenességek megfigyelésére, ahol a hBD-IGFBP abnormális szintje a rendellenesség jelenlétét reprezentálja. Ilyenformán a találmány olyan klinikai diagnosztikai csontképződési markert is rendelkezésre bocsát, mely alkalmas a csont-rendellenességek terápiás szerekkel történő kezelése idején a csontképződés megfigyelésére és ellenőrzésére. A hBD-IGFBP-készitmények vagy -antitestek felhasználhatók a hBDIGFBP biológiai fluidumban, mint a humán plazma, szérum v. vizelet, történő kimutatására és mennyiségi elemzésére.

Amint	az	a tudományban	jártas	személyek	számára
észrevehető,	az	immunvizsgálati	módszerek	számos	típusa
felhasználható	a	találmányban. Ilyenek pl. a	direkt és	indirekt

kötési vizsgálatok, a kompetitív vizsgálatok, sandwich

-20vizsgálatok és hasonlók, melyek általános leírása megtalálható pl.: 4,642,285; 4,376,110; 4,016,043; 3,879,262; 3,852,157; 3,850,752; 3,839,153; 3,791,932 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás, ill. Harlow és Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NY, (1988). Egy vizsgálatban a hBD-IGFBP mennyiségi elemzését a hBD-IGFBP-hez való antitest-kapcsolódás mérésével végeztük, mely antitesteket később jelölt anti-IgG, IgM és/vagy IgA humán antitestekkel mutattunk ki. Egy másik változatban a páciens hBD-IGFBP-jét jelölt vagy jelöletlen hBD-IGFBP-vel végzett kötési kompetíciós vizsgálattal mértük. Sokféle jelölőanyag használható, többek között radioaktív nuklidok, partikulumok (pl. arany, ferritin, mágneses partikulumok, vörösvértestek), fluoritok, enzimek, enzim-szubsztrátok, enzim-kofaktorok, enzim-inhibitorok, ligandumok (elsősorban haptének), kemilumineszcens anyagok, stb., de mindenekelőtt a radiaktív nuklidok.

Fenti vizsgálatokban a hBD-IGFBP-t vagy a hBD-IGFBPantitesteket a felhasználáshoz oldhatatlan vagy szilárd hordozóhoz kell kapcsolni (pl. ELISA mikrotiter üreg (well) mikrogömbök, filtermembránok, oldhatatlan vagy kicsapható oldékony polimerek), melyek lehetővé teszik az affinitásgyantaként való működést. A hBD-IGFBP-ellenszérum vagy a monoklonális hBD-IGFBP-antitestek jellemzően nem humán eredetűek, többek között nyúlból, kecskéből, egérből, stb. származnak. A hBD-IGFBP kimutatására kitek is felhasználhatók, melyekban a hBDIGFBP és/vagy a hBD-IGFBP-antitestek rendszerint liofilizált formában, önmagukban vagy hozzáadott reagensekkel, jelzőkkel és/vagy ellen-antitestekkel kapcsolódva, konténerekben t

helyezkednek el. A hBD-IGFBP-polipeptidek és -antitestek, melyek állhatnak jelzőkkel kapcsolódva vagy azok nélkül, a kitekben pufferekkel (pl. Tris, foszfát-, karbonát-, stb.), stabilizátorokkal, biocidekkel, inért proteinekkel (pl. szérum, albumin v. hasonlók) együtt vannak jelen. Gyakran szükséges az aktív alkotórészeket hígító kötőanyag vagy töltőanyag jelenléte, ahol a kötőanyag a teljes készítmény 1-99 %-át teheti ki.

A találmány szerinti diagnosztikai felhasználásra módokon állíthatjuk elő. A hBD-IGFBP-t kötő, terápiás vagy alkalmas antitesteket különféle nem humán eredetű monoklonális antitestek (pl. murin) előállítása jól ismert, és végrehajtható pl. az állat rekombináns vagy szintetikus hBD-IGFBP-molekulával, vagy annak egy kiválasztott részletével (pl. pepiiddel) történő immunizálásával. Például, szelektált screeningel azonosítható a hBD-IGFBP-molekula egy olyan régiója, amely az IGF felismerési helyeként elsődleges fontosságú. Az immunizált állatokból nyert antitest-termelő sejteket tartósítottuk és sreeneltük, vagy pl. hBD-IGFBP-t kötő antitest előállításához először screeneltük és később tartósítottuk azokat.

A következő példákat szemléltetésként, s nem korlátozásként írjuk le.

1. példa

Humán csontkivonat előállítása hBD-IGFBP tisztításához

A totál csípőprotézis-műtét során nyert combcsont-fejeket a felhasználásig -20 ’C-on tároltuk. A csontokat szalagfűrésszel daraboltuk és - a hBD-IGFBP-extrakció érdekében - Wiley-malomban finomra őröltük. A csontproteineket a combcsont-fej porból demineralizációval vontuk ki vízzel és 4 M guanidin-HCl-dal végzett kezdő extrakciót követő - 4 M guanidin-HCl és proteázinhibitorok jelenléte mellett történő - 10 %-os etilén-diamintetraacetátos (EDTA) extrakcióval (Guanidin-EDTA extraktum), ld. Mohán és mtsi, Biochem. Biophys. Acta, 884. 234-242 (1986). A guanidin-EDTA extraktumot ezután YMö-ös membránnal (mely 5 kd-os molekulatömeg felett szűr), Amicon cellán koncentráltuk, majd ezt a hBD-IGFBP tisztításához használtuk.

2. példa

A hBD-IGFBP humán csont-extraktumból történő tisztítása és jellemzése

A humán csont-extraktumot hidroxiapatit (HA) kromatográfiának vetettük alá 4 M guanidin-HCl-ban, amint azt leírták, Mohán és mtsi, Biochem. Piophys. Acta, 234-242 (1986). IGF-II affinitás-oszlopot készítettünk 250 pg, humán csontból tisztított IGF-II-nek cián-bromid-aktivált Sepharose 4B

-23— gyöngyökhöz történő kapcsolásával. A HA-kötött frakció egy adagját YM5 membránnal Amicon cellában 300 ml-re koncentráltuk, és 20-szoros térfogatú, proteáz-inhibitorokat (100 mM epszilonaminokapronsavat, 5 mM benzamidint, 1 mM fenil-metil-szulfonilfluoridot) tartalmazó, kálium-foszfát pufferrel dializáltuk. Az IGF-II affinitás-oszlopot kálium-foszfát pufferrel egyensúlyba hoztuk, majd a humán csontkivonat dializált HA-kötött frakcióját az oszlopra vittük. Az oszlopot ezután - a nem kötött proteinek tökéletes eltávolítása érdekében - alaposan átmostuk káliumfoszfát pufferrel. A kötött proteineket 20-25 ml-nyi 30 mM Trisacetáttal (pH 7,2) és 4 M guanidin-HCl-dal eluáltuk. Az affinitás-kötött frakciót YM5 membránnal Amicon cellában koncentráltuk, majd 20 mM Tris-HCl pufferrel (pH 8,0) dializáltuk. A dializált affinitás-kötött frakciót előzetesen Tris-HCl pufferrel kiegyensúlyozott Pharmacia FPLC Mono Q anioncserélő oszlopra vittük. A kötött proteinek kimosását 100 perces elúcióval 20 mM tris-HCl pufferben, 0-1 M NaCl koncentráció-gradienssel végeztük.

A hBD-IGFBP-aktivitást polietilénglikolos csapadékképző eljárással határoztuk meg. A vizsgálandó minta 50 μΐ-ét szobahőmérsékleten 60 percen át 25000-50000 cpm ^12BI-dal jelölt IGF-I-gyel vagy IGF-II-vel inkubáltuk a következő, 250 μΐ-nyi elegyben: 0,1 M HEPES; 0,1 %-os szarvasmarha szérum-albumin; 0,1 %-os Triton X100; 44 mM NasCOs; 0,02 %-os NaNs; pH=6,0. Ehhez az elegyhez 100 μΐ 2 %-os szérum immunglobulint és 500 μΐ 25 %-os polietilénglikolt adtunk, majd az egészet centrifugáltuk. A fenti körülmények között a políetilénglikol kicsapta a nagyobb hBD-IGFBP/IGF-I vagy hBD-IGFBP/IGF-II komplexeket, nem így a

-24• · « kötetlen IGF-I-et v. IGF-II-t. Ezután kiszámítottuk a PEGcsapadékban lévő ^12eI-IGF-II mennyiségét. A nem-specifikus kötődést úgy határoztuk meg, hogy a vizsgálatot feleslegben lévő, jelöletlen IGF-I-gyel v. IGF-II-vel végeztük, és a kicsapott ^i2eI-IGF-I vagy ^12eI-IGF-II mennyiségét kivontuk a fentebb kapott értékből.

A hBD-IGFBP pontos molekulatömegének meghatározása végett ligandum biot analízist végeztünk, jelzőként ^12BI-IGF-II felhasználásával. Ebben az eljárásban előre kiöntött 3-27 %-os SDS poliakrilamid géllapon, nem redukáló körülmények között 50 μΐ-nyi mintát elektroforizáltunk. A minta elektroblotos módszerrel történő nitrocellulózra vitele után a nitrocellulóz membránt radioaktívan jelölt IGF-II-vel inkubáltuk. A kötetlen, radioaktívan jelölt IGF-II lemosása után a membránt autoradiográfiásan vizsgáltuk, ld. Hossenloop és mtsi, Anal. Biochem., 154. 338-143 (1986).

A minták aminosav-összetételét Applied Biosystems model 420 analizátorral vizsgáltuk, míg az N-terminális szekvenciákat Applied Biosystems model 470A gőzfázisú protein-szekvenálóval határoztuk meg (Mohán és mtsi, Biochem. Biophis. Acta, 966, 44-55 (1988)).

A 3. ábra az affinitás-kötött frakció Mono Q kromatográfiás protein-spektrumát és hBD-IGFBP-aktivitásspektrumát ábrázolja. Az eredeti IGFBP-4 elúciók helyén (9-15. frakciók, 0,1 M NaCl) sem protein abszorbancia-csúcs, sem IGFBPaktivitás-csúcs nem volt, ami azt jelenti, hogy a csont-eredetű IGFBP nem azonos az IGFBP-4-gyel. Különböző NaCl koncentrációs elúcióknál négy protein abszorbancia-csúcs található. A négy

-25protein-csúcs közül az első kettő (A és B) jelentős IGFBP aktivitással bír, míg az utolsó kettő (C és D) alacsony IGFBP aktivitással rendelkezik.

A humán csontkivonatban lévő IGFBP-k látszólagos molekulatömegének meghatározása céljából ligandum biot vizsgálatot és ^12SI-IGF-II affinitás-jelölést végeztünk. A 4. ábra a ligandum biotokat ábrázolja, melyekben a HA-kötött, IGFII-kötött és Mono Q protein-csúcsokat nátrium-dodecilszulfátpoliakrilamid gélelektroforézisnek vetettük alá, próbaként 1251-igf-II felhasználásával. A HA-kötött és IGF-II-kötött frakciókban jelenlévő fő IGFBP látszólagos molekulatömege 29 kD. Ezek a frakciók mutatnak egy széles, kevésbé intenzív sávot a 68 és 43 kD molekulátömegű markerek között is. A fő 29 kD-os IGFBP-t a nagyobb molekulatömegű IGFBP-től Mono Q kromatográfiával választottuk el. A Mono Q A csúcs 29 kD-nál egy erősebb sávot, 24 kD-nál egy gyengébb sávot mutat. A Mono Q B csúcs a 68 és 43 kDos markerek között egy széles, diffúz sávot, s a 29 kD-nál egy gyenge sávot mutat. A Mono Q C csúcs (mely a fő protein abszorbancia-csúcsát reprezentálja) és D csúcs 29 kD-nál csak egy vékony sávot mutat. Ezen adatok azt mutatják, hogy a humán csontkivonatban a 29 kD-os IGFBP a fő IGFBP.

A Mono Q A csúcsban a 29 kD-os IGFBP-nek mind az aminosav-összetétele, mind az N-terminális aminosav-szekvenciája egyedinek mutatkozott, más, ismert IGFBP-ket illetően korlátozott szekvencia-hasonlósággal.(1., 2. táblázat; 1. ábra).

-26• ·

1.	táblázat: ös	A hBD-IGFBP és az szetétele	ismert IGFBP-k	aminosav-
	A csúcs	IGFBP-1	IGFBP-	-2 IGFBP-3	IGFBP-4
Asx	8,1	6,8	6,6	6,8	8,0
Glx	5,9	13,2	13,9	10,2	12,2
Ser	9,3	9,0	3,5	10,2	5,9
Gly	9,0	7,3	11,8	8,7	9,7
His	5,1	2,6	3,8	2,7	4,6
Arg	6,3	4,3	6,9	7,2	8,0
Thr	6,3	3,8	3,8	3,4	2,5
Alá	7,9	11,1	7,3	6,8	6,8
Pro	5,8	7,7	9,3	8,7	8,9
Tyr	3,7	2,6	1,7	3,4	1,3
Val	6,6	3,8	5,5	5,3	3,8
Met	3,5	1,3	3,1	0,8	1,7
Cys	5,5	7,7	6,6	6,8	8,4
Ile	3,3	3,8	1,4	2,3	2,5
Leu	6,8	7,3	9,0	7,2	8,0
Phe	2,9	1,7	1,0	1,9	2,1
Lys	4,0	3,8	4,5	7,2	5,1
Trp	2,1	0,3	0,4	0,4

mm átmérőjű immobilon membrán-korongokat metanolban áztattunk, majd Millipore szűrőre helyeztük, és gumigyűrűkkel rögzítettük. Az immobilon membrán vízzel való leöblítése után az A csúcs 1 ml-ének szűrésével az A • ··

csúcs kötőproteinjét rögzítettük a membránon. A membrán egyik felét az aminosav-összetétel vizsgálatokhoz használtuk fel.

2. táblázat: A Mono Q A csúcs hBD-IGFBP-jének aminoterminális szekvenciája

Gyök	Aminosav (pmol)
1.	L=59,4
2.	G=50,l
3.	F=34,8
4.	F=48,0
5.	V=49,l
6.	X
7.	V=27,l
8.	E=20,6
9.	P=22,2
10.	D=15,2
11.	D=18,7
12.	K=13,4
13.	A=22,8
14.	A=32,8
15.	L=28,5

A hBD-IGFBP 50 pmolját használtuk az N-terminális aminosavszekvencia analízishez. A kombinált átlagos ismétlődés 86,3 % volt.

-28Ilyenformán, a 29 kD-os IGFBP-t jelöltük, mint humán csont-eredetű IGFBP (hBD-IGFBP). A fő szekvencián (Leu-Gly-PhePhe-Val-X-Val-Glu-Pro-Asp-Asp-Lys-Ala-Ala-Leu) felül a Mono Q csúcsban nyilvánvaló volt egy további szekvencia jelenléte, melynek az N-terminálisán egy vagy két aminosav hiányzott. A tisztított hBD-IGFBP érzékenynek mutatkozott a proteolitikus hasításra, mivel a tisztított 29 kD-os IGFBP 5 ^eC-on történő egy éjszakáig tartó tárolása a 29 kD-os sáv eltűnését, és 24 kD-nál egy fő, és néhány kisebb molekulatömegű mellék sáv megjelenését eredményezte. A 24 kD-os sáv N-terminális szekvencia-analízise alapján kapott szekvencia (Leu-Gly-Phe-X-Val-X-X-Glu-Pro-X-X-Lys) hasonló volt a 29 kD-os IGFBP szekvenciájához. A 24 kD-os IGFBP további tárolása annak eltűnését ill. számos kisebb molekulatömegű protein-sáv megjelenését eredményezte, mely utóbbiak nagyon alacsony IGFBP-aktivitással rendelkeztek - amint azt ligandum-blot analízissel meghatároztuk. Ezen eredményekkel összhangban, az utóbbi időben beszámoltak az IGFBP-k-kel asszociált proteázokról.

A Mono Q B csúcs eltérő aminosav-összetételt mutatott, s nem segítette elő az IGF-II működését a csontsejtekben. A B csúcs szekvenálására irányuló kísérleteink sikertelennek bizonyultak. A fő protein csúcs (45. frakció, C csúcs) első néhány szakaszának szekvencia-meghatározása multiple aminosavakat eredményezett leolvasható szekvencia nélkül. Ilyenformán a Mono Q C és D csúcsok, melyek alacsony IGFBP-aktivitással rendelkeznek, a 29 kD-os IGFBP lebontási termékeit reprezentálhatják.

Mivel a Mono Q tisztított hBD-IGFBP csúcsának Nterminális szekvenciájában a fő szekvencián felül egyéb

szekvenciákat is meghatároztunk (melyeknek egy vagy két aminosava hiányzott, talán annak köszönhetően, hogy ezen IGFBP-t bontó IGFBP-proteázzal együtt történt a tisztításuk); s mivel ciszteingyököket nem származtattunk, a hBD-IGFBP 7-es pozíciójában lévő valin, és a 10-es pozícióban lévő aszparaginsav lehet cisztein is (a cisztein-gyökök az IGFBP-család különböző tagjaiban megmaradtak). A Mono Q tisztított, humán csont-eredetű IGFBP 5^eCon történő tárolása a 29 kD-os IGFBP eltűnését és kisebb molekulatömegű IGFBP-k megjelenését eredményezte az SDS-PAGE-en. A kis molekulatömegű IGFBP szekvenálásakor a 7-es és 10-es helyen lévő valint ill. aszparaginsavat nem találtuk, s helyükön jel sem volt. Ez az eredmény azt veti fel, hogy a hBD-IGFBP rendelkezhet a következő szekvenciával is: L-G-F-F-V-X-C-E-P-C-D-K-A-A-L·. Egy másik lehetséges hBD-IGFBP-szekvencia, mely korábbi vizsgálatok alpján számításba jöhet, az L-G-S-F-V-H-C-E-P-C-D-E-K-A-L szekvencia, mely hasonlít a BP-5 szekvenciához, ld. Kiefer és mtsi, Biochem. Biophys. Rés. Comm., 176. 219-225 (1991);

Schimanski és mtsi, J. Bioi. Chem., 226,

10646-10653 (1991); és közzétéve:

Drop. Endocrinol., 13.0,

1736-1737 (1992). A szekvenciát lehetséges változtatásoknak vethetjük alá, melyek természetes vagy mesterséges szubsztitúciókon, addiciókon, deléciókon alapulnak, s a létrejövő változatok lehetnek alléliku sak, ill. előállíthatók az itt alkalmazott sajátos szekvenciatechnikák alpján. Meg kell jegyezni, hogy az itt leírt módszerek alkalmazásával a protein különböző, jól ismert módszerekkel izolálható és tisztítható, illetve szekvenálható. Továbbá, az Nterminális aminosav-szekvencia lehetővé teszi - a találmány szerinti hBD-IGFBP-t kódoló gének klónozásához használható -

-30degenerált oligonukleotid-próbák előállítását.

3. példa

A hBD-IGFBP felhasználása csontse.i£r.BrolíferáCÍás vizsgálatokban

A Mohán és mtsi, (Biochem. Biophys. Acta, 884. 234-242 (1986)) által leírt, az IGF-közvetett csontsejt-proliferáció szérummentes táptalajban történő vizsgálata a ³H-timidinnek triklór-ecetsawal kicsapható celluláris anyagba történő beépítését méri. Ezt a vizsgálatot MC3T3-E1 egér oszteoblasztsejtvonal felhasználásával végeztük. 48-lyukas tenyészcsészében lyukanként hozzávetőleg 10000 sejtet helyeztünk a szérummentes Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajra a ³H-timidines vizsgálathoz (általánosan ld. Biochem. Biophys. Acta, 884, 234-242 (1986)).

Amint azt a ³H-timidinnek triklór-ecetsawal oldhatatlan makromolekulákba történő beépítésével meghatároztuk (3. táblázat), a hBD-IGFBP-nek önmagában csekély mitogén aktivitása volt. Ha az hBD-IGFBP-t az IGF-II szubmaximális koncentrációjával együtt tovább adagoltuk a szérummentes egér csontsejt-kultúrához, a hBD-IGFBP elősegítette az IGF-II csontsejt-proliferatív működését. Az IGFBP-3 csak olyan esetben mutatott IGF-I működést növelő hatást, ha a tenyészethez az IGF-I hozzáadása előtt néhány órával adtuk (Mohán és mtsi, Procl. Natl. Acad. Sci., Usa, fifi, 8338-8342 (1989); De Mellow és mtsi, Biochem. Biophys. Rés.

-31Comm., 1SŰ, 199-204 (1988), és egyik más IGFBP-ről sem ismert, hogy az IGF és az IGFBP együttes adagolása esetében elősegítené az IGF-ek működését. Ezen adatok azt sugallják, hogy a hBD-IGFBP nem csupán passzív hordozója az IGF-eknek, hanem pozitívan szabályozza azok működését is. Bár az a mechanizmus, mellyel az IGFBP elősegíti az IGF-II-stimulálta ³H-timidin-beépülést, nem ismert, néhány mechanizmust megemlítünk, mint lehetséges magyarázatot, melyek nem jelentik azt, hogy a folyamat csak ezek alapján mehet végbe. Például, a hBD-IGFBP az IGF-II számára könnyen átjárható sejtmembránon keresztül az IGF-II receptorhoz irányítja az IGF-II-t (talán egy RGD-szekvencia által, mint az IGFBP-1 esetében). Vagy a hBD-IGFBP növelheti az IGF-II-nek a receptorához való affinitását utóbbinak IGF-II-höz való kötése folytán, és/vagy növelheti az IGF-II féléletidejét olymódon, hogy megóvja azt a proteázoktól.

··

-323. táblázat: A hBD-IGFBP-nek az IGF-II-indukált csontsejt-proliferációt elősegítő hatása

Kezelés	3H-timidin beépülés (a kontroll %-ában)
1. kísérlet	2. kísérlet	3. kísérlet
BSA kontroll	100 ± 15	100 ± 22	100 ± 12
hBD-IGFBP	128 ± 18	213 ± 29	116 ± 9
IGF-II	138 ± 18	265 ± 43	214 ± 24
hBD-IGFBP + IGF-II*	195 ± 32	672 ± 74	320 ± 40

A ³H-timidin hozzáadása előtt a szérummentes MC3T3 egér oszteoblaszt-sejtvonal - tenyészetet 18 órán keresztül az effektorokkal inkubáltuk. Az IGF-II és a hBD-IGFBP végső koncentrációja 3 illetve 10 ng/ml volt. Az értékek 6 replikalyuk (well) átlagát ± a szórást mutatják. A ³H-timidinbeépülés a szarvasmarha szérum-albuminnal (BSA) kezelt kontroll tenyészetekben - a három kísérlet sorrendjének megfelelően - 1404 ± 217, 237 ± 53 és 730 ± 91 volt.

* A hBD-IGFBP - IGF-II interakció erősen szignifikáns volt (P<0,00001), a kísérletek közben három-tényezős analízissel, CSS számítógép program felhasználásával.

4. példa

A hBD-IGFBP tisztítása csontssjt kondicionált táptalajból

Mivel tenyészetben a csontsejtek termelnek hBD-IGFBP-t, csontsejtek szérummentes kondicionált táptalaja szintén felhasználható az hBD-IGFBP tisztításához. A csontsejt kondicionált táptalajt Amicon cellában molekulatömegig enged át) koncentráltuk, 1

YM5 membránnal (5 kD

M végső koncentrációig ecetsavval savanyítottuk, s az IGF-ek hBD-IGFBP-k-től való elválasztása végett Sephadex G-100 gélszűrőre vittük. A proteineket

M ecetsavval eluáltuk. Az hBD-IGFBP-ket tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, liofolizáltuk, foszfát-pufferelt sóoldattal rekonstituáltuk, majd

IGF-II affinitás-oszlopra vittük. Ezután az affinitás-kötött anioncserélő kromatográfiának vetettük proteineket FPLC Mono Q alá, annak érdekében, hogy az hBD-IGFBP-t elválasszuk az egyéb IGFBP-k-től.

5. példa

A hBD-IGFBP kvantitatív diagnosztikai vizsgálata

A humán csontból tisztított és rekombináns módokon expresszált hBD-IGFBP-t poliklonális és/vagy monoklonális antitest-termelésre használtuk, mely antitesteket később a hBDIGFBP kvantitatív vizsgálatához használtuk fel.

-34A hBD-IGFBP-t komplett Freund-féle adjuvánssal keverve nyulakba. tengerimalacokba, patkányokba vagy egerekbe oltottuk, kialakítva az antitest-termelő alanyokat. Ezután az állatokat 3-4 hetenként inkomplett Freund-féle adjuvánssal kevert hBD-IGFBP-vel oltottuk. Poliklonális antiszérum nyeréséhez az állatoktól 3-4 oltást követően vért vettünk, és a hBD-IGFBP-antitest titert radioimmunvagy más vizsgálattal meghatároztuk. A monoklonális antitesteket az immunizált állatokból jól ismert módszerekkel nyert antitesttermelő sejtek immortalizálásával állítottuk elő. A tisztított hBD-IGFBP-t radioaktívan megjelöltük és Jelző molekulaként használtuk. A magas titerrel rendelkező monoklonális antitestet vagy antiszérumot rádióimmun-vizsgálathoz használtuk, szérum, vizelet és más biolgiai folyadék hBD-IGFBP-szintjének méréséhez.

Általában, a hBD-IGFBP-termelést növelte a csontsejtek csontsejt-proliferációt növelő szerekkel történő kezelése. így a hBD-IGFBP felhasználható, mint diagnosztikai marker a csontsejtproliferációval kapcsolatos betegségek, pl. az oszteoporózis esetén. Eszerint az alacsony szérum hBD-IGFBP szint csökkent csontképződéssel járó oszteoporózist jelez. Mivel a hBD-IGFBP elősegíti az IGF-II működését, a magas szérum hBD-IGFBP szint kapcsolatban lehet bizonyos rákos megbetegedésekkel is.

6. példa

Az ,IGF-ek...hBD-IGFBP felhasználásával történő kvantitatív diagnosztikai vizsgálata

-35Rekombináns vagy tisztított hBD-IGFBP szintén alkalmas az IGF-ek szintjének biológiai mintában, pl. szérumban történő meghatározására. A tisztított hBD-IGFBP 2-5 ng-ját 40000 cpm ^12eI-IGF-vel inkubáltuk, jelöletlen kompetitor jelenlétében vagy hiányában. Kompétitorként IGF-standardokat vagy az IGF ismeretlen mennyiségeit tartalmazó mintákat használtunk. 60 perces, szobahőmérsékleten történő inkubáció után a hBD-IGFBP-IGF komplexet polietilénglikol hozzáadásával, szarvasmarha gammaglobulin jelenlétében kicsaptuk. 30 perces, 1185 g-vel történő centrifugálás után a felülúszó egy aliquotját gammaszámlálóban mértük. A jelöletlen IGF különböző koncentrációival kalibrációs egyenest készítettünk, és az ismeretlen mintában lévő IGF mennyiségét annak felhasználásával számítottuk ki. így a biológiailag aktív, szabad IGF-ek mennyiségét e vizsgálattal az IGF-ekhez nagy affinitással rendelkező tsztított hBD-IGFBP felhasználásával határoztuk meg.

7. példa

Az IGF-II csontban történő rögzítése hBD-IGFBP.által

A humán csont az IGF-II viszonylag nagy mennyiségét tartalmazza. Amint azt a 4. táblázat mutatja, a ^12BI-vel jelölt IGF-II önmagában nem kötődik specifikusan a hidroxiapatithoz (a táblázat csak a nem-specifikus kötődést mutatja, mely kevesebb, mint az összeadott teljes érték 10 %-a), ill. a kollagénhez. Az IGF-II-vel ellentétben, a jelölt hBD-IGFBP specifikus kötődést

-36mutatott a hidroxiapatithoz. Az hBD-IGFBP hidroxiapatithoz való kötődése specifikus, mivel a szérum fő kötőproteinje, úgymint az IGFBP-3, nem mutatott hasonló aktivitást, s mivel a hBD-IGFBP nem köti a csont másik fő alkotóelemét, a kollagént. Sőt, a hBD-IGFBP hidroxiapatithoz való kötődése erősnek bizonyult, minthogy a hBDIGFBP-hidroxiapatit komplexet a 4 M guanidin-hidroklorid nem disszociálta, (a 4 M guanidin-HCl disszociálja az antitestantigén komplexeket). A hidroxiapatit-oszlopra vitelét megelőzően, a jelölt IGF-II hBD-IGFBP-vel történő preinkubációja jelentősen növelte az IGF-II hidroxiapatit-oszlophoz való kötődését. A hBD-IGFBP ezen, a hidroxiapatit oszlophoz való IGFII kötődést elősegítő aktivitása specifikus, mivel az IGFBP-3 nem rendelkezett hasonló aktivitással. Ezen kutatási eredmények összhangban vannak azzal a tapasztalattal, hogy normál körülmények között az IGF-II a csontban a hBD-IGFBP által rögzítődik.

• ·

-374. táblázat: A hBD-IGFBP-nek az IGF-II hidroxiapatithoz való • ·

kötődését elősegítő hatása
Ligandum	hidroxiapatithoz kötött jelző·	kollagén-I-hez -molekula (%)
	<10	<10
1251-hBD-IGFBP	60	<10
1251-igF-II + hBD-IGFBP	45	<10
125I-IQFBP-3	<10	<10
1251-igf-II + IGFBP-3	<10	<10

8. példa

Az IGFBP-5 humán csontsejtekben történő in vitro szabályozása

Annak érdekében, hogy meghatározhassuk, vajon a humán csontsejtek termelnek-e in vitro hBD-IGFBP-t, az MG63, TE85, TE89, Sa0s2 és U2 szérummentes humán oszteoszarkóma sejtkultúrákból kivont teljes RNS Northern-blotokat

-38oligonukleotid-próba és humán IGFBP-5 cDNS-próba felhasználásával a hBD-IGFBP N-terminális szekvenciájával szemben hibridizáltuk (Dr. Schimanski, La Jolla, CA). Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy valamennyi tesztelt sejtvonal expresszálta a hBD-IGFBP-mRNSt. Western ligandum-blot analízis alapján, az IGF-I és az IGF-II az U2 sejtekben növelte a hBD-IGFBP termelését. A hBD-IGFBP biológiai jellemzése kimutatta, hogy ez a protein elősegíti az

IGF-II működését a csontsejtekben.

Korábban proliferációját és stimulálja. Ebben leírták, hogy a humán oszteoblasztok az IGF-II termelését in vitro a progeszteron a kísérletben a progeszteronnak az IGFszabályozórendszer egyéb komponenseire gyakorolt hatását vizsgáltuk

MG63 humán oszteoblaszt-szerű oszteoszarkóma sejtvonalban. Valamennyi kísérletben az MG63 sejteket 7500 sejt/cm² sűrűségben helyeztük az 1 %-os borjúszérumot tartalamazó

DMEM-be. Egy éjszakáig tartó inkubáció után a tápközeget szérummentesre cseréltük, mielőtt progeszteront vagy oldószert (etanolt) adtunk volna hozzá. Vizsgálat közben a sejteket 100 nM progeszteronnal 1/2, 2, 4 és 6 óra hosszat inkubáltuk. A Northern biot analízisek azt mutatták, hogy a megfelelő kontrollokhoz képest az IGF-II, IGF-I, hBD-IGFBP, 1. és 2. típusú receptorok mRNS-szintjei növekedtek a 30 perctől 6 óráig terjedő időtartam alatt. Az inhibitor IGFBP-4 mRNS-szintje a progeszteron hozzáadása után 30 perccel már csökkent. Az IGFBP-3 mRNS szintjeiben nem tapasztaltunk kifejezett változást. így megállapítható, hogy a humán csontsejt-proliferációt stimuláló szteroid hormon, a progeszteron, a humán csontsejtekben növeli az IGFBP-5 termelését. A progeszteron csontsejt-proliferációt

-39stimuláló hatása nemcsak megnövekedett IGF-termeléssel közvetítődhet, hanem megnövekedett IGF-receptor expresszióval, hBD-IGFBP-szint növekedéssel és az inhibitor IGFBP-4 csökkentett termelődésével is.

Claims (22)

1. Szabadalmi ieényppontok

   1. Tisztított és izolált, humán csont-eredetű növekedési faktor-kötő protein.
2. 2. 29 kD molekulatömegű humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein, azzal jellemezve, hogy humán csontból vagy csontsejt kondicionált tápközegből nyertük, és hogy ezen humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein köti az inzulinszerű növekedési faktor-II-t és a hidroxiapatitot.
3. 3. A 2. igénypont szerinti tisztított humán csonteredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein, azzal jellemezve, hogy elősegíti az inzulinszerű növekedési faktor-II csontsejt-proliferációt stimuláló képességét.
4. 4. A 2. igénypont szerinti humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein, azzal jellemezve, hogy az inzulinszerű növekedési faktor-II-höz nagyobb specifikus kötődési affinitást mutat, mint az inzulinszerű növekedési faktor-I-hez.
5. 5. A 2. igénypont szerinti humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein, azzal jellemezve, hogy a hidroxiapatitot minimálisan 10~⁹ M kötési affinitással köti.
6. 6. A 2. igénypont szerinti tisztított, humán csonteredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein, azzal

   4»

   -41jellemezve, hogy csontképződésre ható vegyülethez kapcsoltuk.
7. 7. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy 29 kD molekulatömegű, teljesen tiszta, humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő proteinből vagy ennek fragmenséből, illetve gyógyászati szempontból alkalmas hordozóból áll.
8. 8. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy tartalmaz még inzulinszerű növekedési faktor-let vagy inzulinszerű növekedési faktor-II-t is.
9. 9. A 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az inzulinszerű növekedési faktor-I-et vagy az inzulinszerű növekedési faktor-II-t a humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő proteinhez kapcsoltuk.
10. 10. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a páciens számára helyi alkalmazásra alakítottuk ki.
11. 11. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a páciens számára parenterális alkalmazásra alakítottuk ki.
12. 12. Eljárás az inzulinszerű növekedési faktor hatásának a betegben történő modulálására, azzal jellemezve, hogy a beteget teljesen tiszta humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein-t és gyógyászati szempontból alkalmas • 4 «

    -42···· hordozót az inzulinszerű növekedési faktor hatásának modulálásához szükséges mennyiségben tartalmazó - gyógyászati készítménnyel kezeljük.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inzulinszerű növekedési faktor itt inzulinszerű növekedési faktor-II.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein-t az inzulinszerű növekedési faktor-II-höz kapcsoltuk.
15. 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beteg degeneratív csont-rendellenességben szenved vagy arra érzékeny.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a csontrendellenesség itt oszteoporózis.
17. 17. Eljárás sebek vagy törések gyógyítására, azzal jellemezve, hogy a beteget - teljesen tiszta, humán csonteredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein-t és gyógyászati szempontból alkalmas hordozót az említett seb vagy törés gyógyításához szükséges mennyiségben tartalmazó gyógyászati készítménnyel kezeljük.
18. 18. Eljárás egy vegyületnek a betegben történő csontszövetbe juttatására, azzal jellemezve, hogy a beteget - a

    -43bejuttatni kívánt vegyülethez kapcsolt, teljesen tiszta, humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein-t vagy annak fragmensét, illetve gyógyászati szempontból alkalmas hordozót tartalmazó - gyógyászati készítménnyel kezeljük.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett vegyület hatással van a csontképződésre illetve a csontreszorpcióra.
20. 20.

    Eljárás a humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein biológiai mintában való jelenlétének meghatározására, azzal jellemezve, hogy (i) a biológiai mintát az immunkomplex kialakulását elősegítő körülmények között érintkezésbe hozzuk a humán csonteredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein-t specifikusan kötő antitesttel;

    (ii) az említett humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein és az említett antitest közötti komplex jelenlétét detektáljuk, s ezáltal meghatározzuk a humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein jelenlétét és/vagy mennyiségét a mintában.
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai minta itt vér, plazma, szérum vagy vizelet.
22. 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett detektáló eljárás itt enzimreakció, fluoreszcencia-, lumineszcencia- vagy radioaktivitás-vizsgálat.

    n b-4423. Eljárás humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein biológiai mintában való jelenlétének meghatározására, azzal jellemezve, hogy (i) a tisztított, jelölt humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein-vei és a humán csonteredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő proteinhez specifikusan kötődő antitesttel, mely antitestet egy oszlophoz kapcsoltuk;

    (ii) az említett, jelölt humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein és az említett antitest közötti immunkomplex kialakulását detektáljuk, s ezáltal meghatározzuk a humán csont-eredetű, inzulinszerű növekedési faktor-kötő protein jelenlétét és/vagy mennyiségét a mintában.