JP5840655B2 - Ｃｒを含むタンパク質に対して特異的な受容体−結合タンパク質（ｒａｐ）変異体を含む組成物およびその使用 - Google Patents

Ｃｒを含むタンパク質に対して特異的な受容体−結合タンパク質（ｒａｐ）変異体を含む組成物およびその使用 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、低密度リポタンパク質受容体−結合タンパク質（ＲＡＰ）の受容体選択的な変異体及びその組成物、かかる変異体の作製方法及び、治療的目的のためにかかる受容体選択的なＲＡＰ変異体組成物を用いる方法に関する。本発明はまた、相補的な形式の繰り返し（ＣＲ）を含むタンパク質の１つまたは少数のサブセットと選択的に結合する抗体に関する。
（発明の背景）
低密度リポタンパク質受容体ドメインクラスＡ、又は相補的な形式の繰り返し（ＣＲ）は、保存的タンパク質配列の大きなファミリーを構成する。このファミリーのメンバーの構造的データは、ＣＲ配列が、特徴的な折り畳み構造、ＬＤＬ受容体様モジュール（タンパク質の構造的分類（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＳＣＯＰ）、用語）を採っていることを示す。ＣＲ配列は低密度リポタンパク質受容体ファミリー及びタイプＩＩ膜貫通セリンプロテアーゼ（マトリプターゼ）ファミリーを含む、様々な異なるタイプのタンパク質において見られる。ＬＤＬＲは広範な生理学的現象を仲介する細胞表面の膜貫通タンパク質のファミリーである。作用機序には、結合したリガンドの輸送及び細胞外空間からのシグナル伝達の両方が含まれる（１）。ＬＤＬＲは様々な細胞機能に関与し、例えば、限定するものではないが、リポタンパク質の代謝（２、３）、マトリックスメタロプロテアーゼ及び凝集因子の調節（４〜６）、細胞の運命の特定（３、７）、神経細胞移動の誘導（７、８）、腫瘍細胞増殖の誘発（９、１０）、ライノウイルスの結合（１１、１２）、神経伝達物質によるシグナル伝達（１３、１４）、抗原提示細胞による抗原の獲得（１５）、血液脳関門を通過するリガンドのトランスサイトーシス（１６〜１９）、糸球体濾過液からのタンパク質の回収（２０）、内分泌ホルモンの輸送（２１）、脳からのアミロイドβペプチドの流出（２２）、骨沈着の活性化（２３）及び内皮細胞増殖の制御（２４）等が挙げられる。それほど多くの役割において機能するＬＤＬＲの能力は、一部には、これらの受容体が結合し得るリガンドの多様な集合に由来する。この受容体ファミリーの他の特徴は、多様な、しばしば独特な、各ＬＤＬＲの組織分布である。タイプＩＩ膜貫通セリンプロテアーゼファミリーは、コリン（ｃｏｒｉｎ）及びマトリプターゼＳＴ１４、マトリプターゼ−２及びマトリプターゼ−３を含む。マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１、ＳＴ１４、ＴＡＤＧ−１５）は、様々な上皮性腫瘍（上皮性悪性腫瘍）において過剰発現されている（２５〜３３）。肝細胞アクチベーター阻害物質−１（ＨＡＩ−１）によって誘導される転写活性化後、マトリプターゼは、腫瘍増殖および、細胞外マトリックス成分の直接的分解によって、又はその他のプロテアーゼ、例えば、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）の活性化によって、転移を促進し、マトリックス分解的事象を生じる（２６、３４、３５）。ＬＤＬＲ及びマトリプターゼファミリーに加えて、様々なその他のタンパク質が、ＣＲドメインを有する。かかるタンパク質の１つであるＦＤＣ−８Ｄ６抗原（ＣＤ３２０）は、一対のかかるドメインを有し、リンパ小節におけるＢ細胞分化において重要な役割を果たしている（３６、３７）。
ＣＲ含有タンパク質が病態生理学的過程において担う重要な役割は、これらのファミリーのうちのあるメンバーの独自の組織分布プロファイルと共に、これらのタンパク質を有用な薬物標的としている。タンパク質選択的薬物は、標的タンパク質の機能に直接影響を与え得るし、特定の疾病状態に対してそのタンパク質が及ぼしている支持的効果を減少させ得る。又は、この薬物は標的タンパク質の組織分布を利用して、疾病の影響を受けている特定の組織に対してその他の治療的分子を効率的に送達し得る。哺乳動物の生理学及び病態生理学におけるＣＲ含有タンパク質の重要性についての無視できない証拠にもかかわらず、ＬＤＬＲ又はＣＲ含有タンパク質ファミリーの特定のメンバーに選択的に作用する薬物の例はほとんど存在しない。これらのファミリーの特定のメンバーに結合する分子を作製し得ることによって、かかる薬物を開発する手段を提供し得る。
したがって、選択的結合事象を通じて、これらのＣＲ含有タンパク質の挙動に直接影響を与えるか、又は、選択的結合事象を通じて、その作用部位に治療的物質の送達を促進するかのいずれかにより、限定するものではないが、ＬＤＬＲ及びタイプＩＩ膜貫通セリンプロテアーゼファミリーのメンバー等の特定の受容体と選択的に結合する能力が向上している薬剤に対する要求が存在する。
かかる受容体選択的分子が有用であり得る一つの例は、脳への治療的分子の送達においてである。米国においては約４５０万人のアルツハイマー病を罹患する人々がおり、さらに１００万人のパーキンソン病を罹患する人々がいる。両疾患に対するタンパク質治療薬は、前臨床試験において有望であることが示されているが、薬物送達に関する障害が、これらの薬物の開発を遅らせている（３８、３９）。血液脳関門（ＢＢＢ）は、末梢循環と中枢神経系（ＣＮＳ）とを隔てている物理的かつ代謝的バリアである。ＢＢＢは脳の微小環境を保護するために機能する一方で、治療的薬物をＣＮＳへ送達するという課題も提供している（４０、４１）。ビヒクルが介在する送達は、タンパク質に基づく薬物送達手段として広く研究されているが、今日までその進歩は限定的になっている。ＢＢＢではメガリンが発現されており、この受容体が脳へのリガンドの輸送を仲介し得ることを示唆する証拠が存在する。ＲＡＰ及び様々なリポタンパク質を含み、メガリンに対する、最も特徴付けられているリガンドはまた、その他のＬＤＬＲに対しても非特異的結合を示し得るし、又は、血液中において飽和レベルで存在して、治療薬との結合と競合する。メガリンに対する、より選択的なリガンドは、内因性のリガンドと有意な競合を示さず、バリアを通過するという、向上した輸送特性を示し得る。
同様に、ＶＬＤＬＲは、脳血管内皮において発現し、リポタンパク質リパーゼの大動脈の内皮を通過する輸送を仲介することが示されている（Ｗｙｎｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １６，４０７−４１５；Ｏｂｕｎｉｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，８９３４−８９４１）。ＶＬＤＬＲと選択的に結合する分子又はかかる分子と結合した薬物を含む融合体は、脳への分布を促進することが予想され得る。脳の外側へのＶＬＤＬＲ選択的薬剤の送達という潜在的用途が存在する。ＶＬＤＬＲはまた、血管内マクロファージへの過剰な遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の取り込みによって仲介される、泡沫細胞の形成に関与している（Ｈｉｌｔｕｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７，１０７９−１０８６；Ｑｕ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２４，１−４，８）。ＶＬＤＬＲと選択的に結合する分子は、リポタンパク質粒子のマクロファージとの会合を阻止し、泡沫細胞の形成を阻害するために開発され得る。かかる分子はさらに、循環リポタンパク質からのＦＦＡの脂肪細胞への運搬を制限し、罹病性を示す対象において肥満への進行を遅らせることが予想され得る（Ｇｏｕｄｒｉａａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ ２１，１４８８−１４９３；Ｇｏｕｄｒｉａａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４５，１４７５−１４８１；Ｔａｃｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ １２，２７５−２７９；Ｙａｇｙｕ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，１００３７−１００４３）。筋肉内皮の管腔表面におけるＶＬＤＬＲの高レベルの発現は、肝臓におけるＶＬＤＬＲの低レベルの発現に加えて、静脈内投与後において、ＶＬＤＬＲ選択的ＲＡＰ変異体の筋肉組織への分布を促進することが予想され得る。筋肉組織への治療的効果を有する分子は、筋肉へのかかる分子の分布を向上させるために、ＶＬＤＬＲ選択的薬剤と結合させ得る。
その他の疾病に対する処置法もまた、特定のＣＲドメイン又はＣＲドメインの組み合わせに対して増大された選択性を有するリガンドを用いて開発され得る。少なくとも２つのＬＤＬＲ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、及びマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＴ１、ＳＴ１４、ＴＡＤＧ−１５）の過剰発現は、罹患組織における発癌性の増大と関連している（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。これらのタンパク質と結合する分子は、特に、それらの機能を直接的に妨害することにより、又は、場合によっては、選択的分子に付着した抗腫瘍薬物を用いて、これらのタンパク質を過剰発現する組織を標的とすることによって潜在的にそれらの発癌性効果を減少させる手段を提供し得る。マトリプターゼは、Ｎ末端タイプＩＩ膜貫通ドメインを通じて、上皮細胞の外側膜又は側底膜に固定されている（非特許文献７）。膜に埋め込まれている配列は、当該タンパク質のＣ末端において、細胞外のＳＥＡドメイン、２つのＣＵＢドメイン、４つのＣＲドメイン及びトリプシンドメインと続く。マトリプターゼにおけるＣＲ配列の突然変異生成は、得られるプロテアーゼ変異体が活性化されるという結果をもたらさない（非特許文献８）。同様に、マトリプターゼの第３のＣＲドメインと結合する抗体は、酵素の活性化を阻害する（非特許文献９）。第３のＣＲドメインを含み、マトリプターゼの２つのＣＲ対のうちの一方に対して親和性を有するＲＡＰ変異体は、観察されるこの領域への抗体による阻害と同様に、タンパク分解活性を妨害することが予想され得る。かかる変異体は罹患組織におけるマトリプターゼの過剰発現の転移性及び発癌性効果を減少させることが予想され得る。
米国においては、約８００万人の骨粗鬆症を罹患する女性がいる。ＬＤＬＲ ＬＲＰ５によるＷｎｔシグナル伝達の増大は、骨芽細胞の分化を増大し、破骨細胞の活性を抑制し、骨沈着を促進することが示されている（Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ ３４１，１９−３９；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４，４６７７−４６８４； ｉｚｕｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ４９，８０−８６）。この機序は、ＤＫＫ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）−１及びスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）が介在する阻害に対して非感受性である骨芽細胞特異的ＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）ノックアウトマウス及びＬＲＰ５変異体によって検証されている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４，４６７７−４６８４；Ｈｏｌｍｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）。ＬＲＰ５と選択的に結合して、ＬＲＰ５と阻害物質が結合することを妨害するか、又はさもなければ、ＬＲＰ５を通じたＷｎｔシグナル伝達を促進する、静脈内に投与された分子は、骨粗鬆症の影響に対抗し得る。かかる分子は現在、利用可能でない。
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、Ｂ細胞と呼ばれる免疫細胞群の増殖及び節外への移動を伴う。ＮＨＬは２０歳〜３９歳の間の男性の癌における主要な死因である。ＦＤＣ−８Ｄ６抗原タンパク質（ＣＤ３２０）が腫瘍性Ｂ細胞の増殖を促進することが、研究によって示されている（非特許文献１０、非特許文献１１）。８Ｄ６抗原は一対のＣＲドメインを含む。その結果、８Ｄ６抗原と結合し、その機能を阻害する物質、例えば、ＲＡＰ変異体は、ヒトにおいて非ホジキンリンパ腫の進行を遅らせることが予想され得る。
哺乳動物の生理全般に亘る広範なＣＲ含有タンパク質の関与を考えると、特定のＣＲドメインに対して結合選択性を有するポリペプチドは、多くの医薬的用途の可能性を有する。
Ｌｉら、（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，９１２９−９１３５ Ｈｏａｎｇら、（２００４）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０９，１０６−１１１ Ｔａｎｉｍｏｔｏら、（２００５）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９２，２７８−２８３ Ｓａｎｔｉｎら、（２００４）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１２，１４−２５ Ｓａｎｔｉｎら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ ９８，１８９８−１９０４ Ｔａｎｉｍｏｔｏら、（２００１）Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ ２２，１０４−１１４ ＴＳＵＺＵＫＩ，Ｓ．、ＭＵＲＡＩ，Ｎ．、ＭＩＹＡＫＥ，Ｙ．、ＩＮＯＵＥ，Ｋ．、ＨＩＲＡＹＡＳＵ，Ｈ．、ＩＷＡＮＡＧＡ，Ｔ．およびＦＵＳＨＩＫＩ，Ｔ．（２００５） ＢＩＯＣＨＥＭ Ｊ ３８８、６７９−８７ ＯＢＥＲＳＴ，Ｍ．Ｄ．、ＷＩＬＬＩＡＭＳ，Ｃ．Ａ．、ＤＩＣＫＳＯＮ，Ｒ．Ｂ．、ＪＯＨＮＳＯＮ，Ｍ．Ｄ．およびＬＩＮ，Ｃ．Ｙ．（２００３） Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ ２７８、２６７７３−９ ＨＵＮＧ，Ｒ．Ｊ．、ＨＳＵＩＡ，Ｗ．、ＤＲＥＵＬＩＮＧ，Ｊ．Ｌ．、ＬＥＥ，Ｍ．Ｊ．、ＷＩＬＬＩＡＭＳ，Ｃ．Ａ．、ＯＢＥＲＳＴ，Ｍ．Ｄ．、ＤＩＣＫＳＯＮ，Ｒ．Ｂ．およびＬＩＮ，Ｃ．Ｙ．（２００４） ＡＭ Ｊ ＰＨＹＳＩＯＬ ＣＥＬＬ ＰＨＹＳＩＯＬ ２８６、Ｃ１１５９−６９ ＬＩ，Ｌ．、ＹＯＯＮ，Ｓ．Ｏ．、ＦＵ，Ｄ．Ｄ．、ＺＨＡＮＧ，Ｘ．およびＣＨＯＩ，Ｙ．Ｓ．（２００４） ＢＬＯＯＤ １０４、８１５−２１ ＬＩ，Ｌ．、ＺＨＡＮＧ，Ｘ．、ＫＯＶＡＣＩＣ，Ｓ．、ＬＯＮＧ，Ａ．Ｊ．、ＢＯＵＲＱＵＥ，Ｋ．、ＷＯＯＤ，Ｃ．Ｒ．およびＣＨＯＩ，Ｙ．Ｓ．（２０００） Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．１９１、１０７７−８４
（発明の要旨）
本発明は、特定の相補的な形式の繰り返しを含むタンパク質、又はＣＲ含有タンパク質の少数のサブセットと選択的に結合するＲＡＰ変異体及び誘導体；ならびに阻害剤又はかかるＣＲ含有タンパク質の促進剤としてのかかる変異体の使用、及び、かかるＣＲ含有タンパク質を発現する組織への診断的又は治療的物質の標的送達のための、かかる変異体の使用に関する。
一態様において、本発明は、相補的な形式の繰り返し（ＣＲ）を含む固有のタンパク質又はタンパク質のサブセットに対し選択的結合親和性を有する、α−２−マクログロブリン／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質結合タンパク質１（ＲＡＰ、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション Ｐ３０５３３、Ｐｆａｍ アクセッション番号 ＰＦ０６４００及びＰＦ０６４０１）の変異体である、受容体結合性ポリペプチド成分（本明細書においてＲＡＰ変異体とも称する）を提供する。本発明は、野生型のＲＡＰとは高い親和性で結合しないＣＲ対であって、一つの特定のＬＤＬＲ若しくはその他のＣＲ含有タンパク質のいずれか（すなわち、固有のもの）において見出されるか、又は、ＬＤＬＲ若しくはその他のＣＲ含有タンパク質のうち少数のサブセット内で見出される（例えば、プロテオーム中の出現率が１０％未満であって希少であるもの）ＣＲ対、に対して結合相補性を有する、ＲＡＰ配列変異体を意図する。一実施形態において、ＲＡＰ変異体は、ＬＲＰ２タンパク質に対して特異的でない。
ＲＡＰ変異体分子は、全長ヒトＲＡＰの一部から構成され得る。一実施形態において、ＲＡＰ変異体は、Ｎ末端から少なくとも２００個、最大２４３個のアミノ酸を欠失している。関連する実施形態において、さらなるＲＡＰ変異体は、Ｃ末端から最大１１個のアミノ酸を欠失しており、さらに、Ｃ末端から少なくとも４個のアミノ酸を欠失している場合もある。別の実施形態において、ＲＡＰ変異体は、（ａ）少なくとも７１アミノ酸長であり、かつ、（ｂ）アミノ酸２５６−２７０を含む成熟ＲＡＰの連続部分を含む。関連する実施形態において、ＲＡＰ変異体は、（ａ）少なくとも７１アミノ酸長であり、かつ、（ｂ）アミノ酸２５６−２７０を含むＲＡＰ ｄ３の連続部分を含む。
一実施形態において、ＲＡＰ変異体は、ＬＤＬＲ（Ｐ０１１３０）、ＬＲＰ１（Ｐ９８１５７）、ＬＲＰ１Ｂ（Ｑ９ＮＺＲ２）、ＬＲＰ２（Ｐ９８１６４）、ＬＲＰ３（Ｏ７５０７４）、ＬＲＰ４（Ｏ７５０９６）、ＬＲＰ５（Ｏ７５１９７）、ＬＲＰ６（Ｏ７５５８１）、ＬＲＰ８（Ｑ１４１１４）、ソルチリン（Ｑ９２６７３）、ＬＲＰ１０（Ｑ７Ｚ４Ｆ１）、ＬＲＰ１１（Ｑ８６ＶＺ４）、ＬＲＰ１２（Ｑ９Ｙ５６１）、ＦＤＣ−８Ｄ６（ＣＤ３２０）、ＶＬＤＬＲ（Ｐ９８１５５）、ＴＡＤＧ−１５（ＳＴ１４、Ｑ８ＷＶＣ１）、ＴＭＰＳ３（Ｐ５７７２７）、ＴＭＰＳ４（Ｑ９ＮＲＳ４）、ＴＭＰＳ６（Ｑ８ＩＵ８０）、Ｑ６ＩＣＣ２、Ｑ６ＰＪ７２、Ｑ７６Ｂ６１、Ｑ７ＲＴＹ８、Ｑ７Ｚ７Ｋ９、Ｑ８６ＹＤ５、Ｑ８ＮＡＮ７、Ｑ８ＮＢＪ０、Ｑ８ＷＷ８８、Ｑ９６ＮＴ６、Ｑ９ＢＹＥ１、Ｑ９ＢＹＥ２、Ｑ９ＮＰＦ０及びｃｏｒｉｎ（Ｑ８ＩＺＲ７）からなる群より選択されるタンパク質に対して結合親和性を示す（すなわち、その他のＣＲ含有タンパク質と比較して、特定のタンパク質に対して、より高い親和性で結合する）。特に、ＲＡＰ変異体は、ＲＡＰのものとは異なるタンパク質結合選択性を有する。本発明は、これらのＣＲ含有タンパク質又は受容体のいずれかに対して変化した親和性を示す、ＲＡＰ変異体の調製を意図する。特定のＣＲ含有タンパク質又は受容体に対して選択的なＲＡＰ変異体の使用は、ＣＲ含有タンパク質又は受容体の機能によって説明される。したがって、受容体選択的ＲＡＰ変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、特定のＬＤＬＲ、又はその他のＣＲ含有タンパク質を修飾及び利用する手段を提供する。
ＲＡＰ変異体は、そのポリペプチド配列における一ヶ所又はそれ以上の変異によって、ＲＡＰとは異なる。一実施形態において、ＲＡＰ変異体は、ＲＡＰの第３ドメイン（ｄ３）内に変異を有する。ＲＡＰ ｄ３は、成熟ＲＡＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３）のアミノ酸２００−３２３及び前駆ＲＡＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３）のアミノ酸２３４−３５７を含む。好ましい実施形態において、変異体は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３０５３３に示される配列セットの成熟形態ＲＡＰのアミノ酸２００−３１９、３００−３１９、又は２４７−２５７から選択される領域のいずれか一つの中の１ヶ所、２ヶ所、３ヶ所、４ヶ所、５ヶ所、若しくは６ヶ所又はそれ以上の位置に変異を含む受容体選択的な変異体である。より好ましい実施形態において、このポリペプチドは、成熟Ｐ３０５３３の１７５位、２０５位、２１３位、２１７位、２２６位、２３０位、２３２位、２３９位、２４６位、２４９位、２５１位、２５６位、２５７位、２６１位、２６６位、２６７位、２６８位、２７０位、２７３位、２８７位、２９０位、２９４位、２９６位、２９７位、２９８位、３０５位、３１２位、３１３位からなる群より選択される１ヶ所、２ヶ所、３ヶ所、４ヶ所、５ヶ所、６ヶ所又はそれ以上の位置に変異を含むＲＡＰ変異体を含む。さらに、さらなる実施形態において、ポリペプチドは、以下の位置：２０５位、２１７位、２４９位、２５１位、２５６位、２５７位、２６６位、２７０位、２９４位、２９６位、２９７位、３０５位のうちの３ヶ所又はそれ以上の位置に変異を含む。一実施形態において、ＲＡＰ変異体は、成熟ＲＡＰの２５１位、２５６位及び２７０位に少なくとも１つの変異を含む。
一態様において、ＲＡＰ変異体は、マトリプターゼタンパク質と選択的に結合する。マトリプターゼ特異的変異体は、ＲＡＰの２５１位、２５６位、２５７位、２６６位、２７０位又は２８０位のいずれか１ヶ所に変異を含むことが意図される。さらに、マトリプターゼ特異的ＲＡＰ変異体は、成熟ＲＡＰの２５１位、２５６位、２５７位、２６６位、２７０位及び２８０位に少なくとも１個、２個、３個、４個、５個又は６個の変異を含むことが意図される。
関連する態様において、ＲＡＰ変異体はＶＬＤＬＲタンパク質と選択的に結合する。ＶＬＤＬＲ特異的変異体は、ＲＡＰの２５１位、２５６位、２７０位又は２９６位のいずれか１ヶ所に変異を含むことが意図される。さらに、ＶＬＤＬＲ特異的ＲＡＰ変異体は、成熟ＲＡＰの２５１位、２５６位、２７０位及び２９６位に少なくとも１個、２個、３個又は４個の変異を含むことが意図される。
さらなる態様において、ＲＡＰ変異体はＦＤＣ−８Ｄ６（ＣＤ３２０）タンパク質と選択的に結合する。ＦＤＣ−８Ｄ６特異的変異体は、ＲＡＰの２５１位、２５６位、２７０位、２７９位又は３０５位のいずれか１ヶ所に変異を含むことが意図される。さらに、ＦＤＣ−８Ｄ６特異的ＲＡＰ変異体は、成熟ＲＡＰの２５１位、２５６位、２７０位、２７９位及び３０５位に少なくとも１個、２個、３個、４個又は５個の変異を含むことが意図される。
上記変異のいずれもが、酸性グループ（Ｄ、Ｅ）のアミノ酸と塩基性グループ（Ｋ、Ｒ）のアミノ酸との置換、又はその逆を含み得る。さらに上記変異のいずれもが、次のグループ（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ）のアミノ酸と次のグループ（Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ）のアミノ酸との置換を含み得る。さらなる実施形態において、当該ポリペプチドは、成熟形態のＲＡＰ（Ｐ３０５３３）と比較して、以下の変異：Ｖ１７５Ｌ、Ｒ２０５Ｓ、Ｓ２１３Ｔ、Ｅ２１７Ｋ、Ｌ２２６Ｍ、Ｈ２４９Ｙ、Ｅ２３０Ｖ、Ｓ２３２Ｐ、Ｅ２３９Ｇ、Ｅ２４６Ｇ、Ｅ２５１Ｌ、Ｅ２５１Ｋ、Ｅ２５１Ｔ、Ｅ２５１Ｇ、Ｅ２５１Ｐ、Ｅ２５１Ｎ、Ｅ２５１Ｒ、Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２５６Ｖ、Ｋ２５６Ａ、Ｋ２５６Ｉ、Ｋ２５６Ｐ、Ｋ２５６Ｌ、Ｉ２６６Ｆ、Ｉ２６６Ｔ、Ｋ２５７Ｙ、Ｑ２６１Ｒ、Ａ２６７Ｖ、Ｈ２６８Ｒ、Ｋ２７０Ｐ、Ｋ２７０Ｄ、Ｋ２７０Ｎ、Ｋ２７０Ｇ、Ｋ２７０Ｅ、Ｋ２７０Ｗ、Ｌ２７１Ｍ、Ｈ２７３Ｙ、Ｄ２７９Ｙ、Ｖ２８３Ｍ、Ｒ２８７Ｈ、Ｈ２９０Ｙ、Ｈ２９０Ｌ、Ｅ２９４Ｖ、Ｒ２９６Ｌ、Ｔ２９７Ｉ、Ｋ２９８Ｒ、Ｋ３０５Ｔ、Ｋ３０６Ｍ、Ｓ３１２Ｆ、Ｇ３１３Ｄのうちの３個、４個、５個、６個又はそれ以上を含む。
別の実施形態において、ポリペプチドが、成熟ＲＡＰ Ｐ３０５３３の少なくともアミノ酸１−１４３を欠失しているＲＡＰ変異体を含むことが意図される。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、成熟ＲＡＰ Ｐ３０５３３のＣ末端アミノ酸の最大４個を欠失している。
別の態様において、本発明は、これらのＣＲ含有タンパク質又は受容体のＣＲドメインに対して選択的結合親和性を示す抗体の調製物を提供する。ＣＲドメインは、好ましくは、固有である（すなわち、ＣＲ含有タンパク質ファミリーのその他のメンバーと比較して、そのＣＲ含有タンパク質においてのみ見出される）か、又は動物のプロテオームにおける全てのＣＲ由来のＣＲの１０％未満において見出される。ＣＲ含有タンパク質における、そのような固有の又は選択されたＣＲドメインの多くが、本明細書において記載されている。かかるＣＲドメインの１つと結合する抗体のサブセット（「ＣＲ特異的抗体」とも称される）は、特定のＣＲ含有タンパク質に対して、より高い選択性を示すことが予想される。特定のＣＲ含有タンパク質又は受容体に対して選択的な抗体の使用は、ＣＲ含有タンパク質又は受容体の機能によって説明される。したがって、ＣＲ特異的抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、特定のＬＤＬＲ、又はその他のＣＲ含有タンパク質を修飾し及び利用する手段を提供する。
本発明の抗体は、好ましくは、ＣＲ含有タンパク質ファミリーの別のメンバーと比較して、実質的に、より高い親和性で、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、２０倍又はそれより高い親和性で、１つのＣＲ含有タンパク質（又はＣＲ含有タンパク質のサブセット）と結合し、好ましくは、該ファミリーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８つのその他のメンバーと比較して、実質的に、より高い親和性でＣＲ含有タンパク質（又はサブセット）と結合する。関連する態様において、この抗体は、本明細書において記載されるＣＲ含有タンパク質内のＣＲドメインに対して特異的であり得る。本発明の当該ＣＲ特異的抗体は、好ましくは、ＣＲ含有タンパク質ファミリーの関連するメンバー内に見られる別のＣＲドメインに対してよりも、実質的に高い親和性で、ＣＲ含有タンパク質（又はＣＲ含有タンパク質のサブセット）内のＣＲドメインと結合する。一態様において、本発明の抗体は、配列番号：６９−９１に示されるＣＲドメインのうちの少なくとも１つに対して特異的である。本発明によって意図される抗体には、全長抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、抗原と結合し得る抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片）、及び、所望の生物学的活性を示す範囲で、前記のものを含む組み換えペプチドを含む。
ＲＡＰ変異体単独に加えて、本発明は、新規の結合機能及びエフェクター機能を含む、ＲＡＰドメイン又はＲＡＰドメイン変異体のオリゴマーの組み合わせ、又はＲＡＰ変異体及びＣＲ特異的抗体の組み合わせを意図する。同じ又は異なる受容体選択性を有するＲＡＰ ｄ３配列を単一のタンパク質中で組み合わせるために、融合系が作製された。ＲＡＰの内部三重構造、及びその三つの関連する各ドメインが独立してＣＲ対と結合する能力が、本用途において利用される。１ヶ所の天然の制限部位、及び、１ヶ所の設計された制限部位を用いて、ＲＡＰコード配列を、従前に記載した三つのドメインへと分割した。各ドメインは約１０ｋＤの分子量を有する、約１００個のアミノ酸を含む。ドメイン１（又はｄ１）は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号 Ｐ３０５３３の成熟配列のアミノ酸１−９４から構成され；ドメイン２（又はｄ２）は、アミノ酸９５−１９８から構成され；及びドメイン３（又はｄ３）は、アミノ酸１９９−３１９から構成される。この構造は、野生型及び変異型ドメイン配列の両方を用いて、新規のホモ三量体及びヘテロ三量体を作製するための、ドメインの簡便な交換を可能にする。野生型のＲＡＰ自体は、二機能性であり、リガンドの中で特にｕＰＡ−ＰＡＩ−Ｉ及びα−２−マクログロブリンに対する結合部位としてそれぞれ機能するＣＲ対を架橋し得る、ｄ１及びｄ３を有する。変異体ｄ３融合体は、ＣＲ対を含むタンパク質内及びその間の、各種のＣＲ対を架橋するように設計される。前者の場合、架橋は、より高い親和性の複合体をもたらし、その他のリガンドの結合をより大きく阻害し得る。後者の場合、架橋は、受容体間の架橋と、それに続くエンドサイトーシスによる、又は、その他のリガンドのためのリガンド結合ドメインへの接近拒否による下方制御をもたらし得る。ＣＲ配列とそれらのリガンドとの間の相互作用における多重結合価力は、各々が２つの隣接するＣＲモジュールと結合するＲＡＰドメインｄ１及びｄ３によって示され、及び、次第に長くなるＶＬＤＬＲ ＣＲ３コンカテマーと、より大きな親和性で結合するＨＲＶ２によっても示される。好ましい実施形態において、得られるオリゴマーの配列が固有の結合特性及び生物学的効果を有するように、操作されたＲＡＰ ｄ３変異体が組み合わせられる。したがって、本発明は、ＲＡＰ ｄ１の２つ又はそれ以上の変異体を含む、ＲＡＰ ｄ２の２つ又はそれ以上の変異体を含む、ＲＡＰ ｄ３の２つ又はそれ以上の変異体を含む、ＲＡＰ ｄ１の１つの変異体及びＲＡＰ ｄ２の変異体を含むがＲＡＰ ｄ３の変異体を含まない、ＲＡＰ ｄ１の２つ又はそれ以上の変異体と共にＲＡＰ ｄ２又はＲＡＰ ｄ３の２つ又はそれ以上の変異体を、様々な組み合わせ（例えば、ｄ１−ｄ３、ｄ１−ｄ３−ｄ３、ｄ１−ｄ１−ｄ３、ｄ１−ｄ１−ｄ３−ｄ３、ｄ１−ｄ３−ｄ１−ｄ３、ｄ１−ｄ３−ｄ１−ｄ３−ｄ１、ｄ３、ｄ１−ｄ２−ｄ１、ｄ２−ｄ２−ｄ３、ｄ３−ｄ２−ｄ３、ｄ２−ｄ３−ｄ２−ｄ３−ｄ２−ｄ３等）で含む、例えば、複数のＲＡＰ ｄ１及びＲＡＰ ｄ２の変異体を様々な組み合わせで含む、又は複数のＲＡＰ ｄ２及びＲＡＰ ｄ３の変異体を様々な組み合わせで含む、同じ配列又は交互する配列の連続的繰り返しを含むポリペプチドを含むことを意図する。各種の組み合わせは連続的であっても、又は三次元構造においてそのドメインを示すペプチドリンカーによって分離されていてもよく、この三次元構造は、そのドメインが同じＣＲ含有タンパク質の異なるＣＲ対と結合することを、又は、異なるＣＲ含有タンパク質のＣＲ対と結合することを、可能にする。
ＲＡＰ変異体、ＣＲ特異的抗体及びＲＡＰ変異体の組み合わせに加えて、本発明は、診断薬又は治療薬と複合体化させた、ポリペプチド受容体結合タンパク質（ＲＡＰ）変異体、又は変異体の組み合わせ、を含む複合体を意図する。一実施形態において、ポリペプチド及び診断薬又は治療薬は、リンカーによって連結している。さらなる実施形態において、当該リンカーはペプチドリンカーである。別の実施形態において、本発明のポリペプチドを含む複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてトランスサイトーシスされる。例示的実施形態において、本発明のポリペプチドと連結される治療薬は、膠細胞由来神経成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は当技術分野で公知のその他の神経成長因子、ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン１０［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］ＡＤＡＭ１０、ＭＥＳＤ（受容体の細胞表面への輸送に必要とされるＬＲＰ５／６に対するシャペロンタンパク質）、癌化学治療薬、プロテアーゼ阻害剤、プロアポトーシス分子、自己免疫抗原又はリソソーム酵素からなる群より選択される。
第２の態様において、本発明は、診断薬又は治療薬と結合させたＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体を必要とする対象に投与する工程を含む、対象の特定の組織に診断薬又は治療薬を送達する方法を意図する。一実施形態において、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体と結合させた診断薬又は治療薬は、上皮又は内皮のバリアを通過するトランスサイトーシスによって特定の組織に送達される。関連する実施形態において、この物質は血液脳関門を通過して送達される。さらなる実施形態において、対象は、限定するものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、その他の脱髄関連疾患、中枢神経系の癌、外傷性脳損傷、脊髄損傷、卒中又は脳虚血、プラーク硬化症、脳血管炎、てんかん、ハンチントン病、トゥレット症候群、ギラン・バレー症候群、ウィルソン病、ピック病、神経炎症性疾患、脳炎、脳脊髄炎又はウイルス、真菌若しくは細菌起源の髄膜炎、又はその他の中枢神経系感染症、プリオン病、小脳性運動失調症、小脳変性症、脊髄小脳変性症候群、フリードリッヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調症、脊髄筋栄養失調症（ｓｐｉｎａｌ ｄａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、進行性核上麻痺、ジストニア、筋痙縮、振戦、網膜色素変性症、老年性認知症、皮質下認知症、動脈硬化性認知症、ＡＩＤＳ関連性認知症、又はその他の認知症、線条体黒質変性症、ミトコンドリア脳筋症、神経セロイドリポフスチン症、中枢神経系が関与するリソソーム蓄積症、大脳白質萎縮症、尿素サイクル異常症、肝性脳症、腎性脳症、代謝性脳症、ポルフィリア、神経毒性化合物による中毒、放射線によって誘発された脳障害、又は精神疾患、例えば、精神病、不安症、鬱病、注意力欠陥、記憶障害、認知障害、食欲障害、肥満症、中毒、熱望症、又は薬物中毒等の神経疾患を罹患するヒトである。本発明はさらに、本発明のポリペプチドと複合体化した当該治療的酵素を含む有効量の組成物を当該細胞と接触させる工程を含む、治療的タンパク質を対象の特定組織内で細胞のリソソーム区画へと送達する方法を提供する。一実施形態において、対象はリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に罹患している。
関連する実施形態において、本発明は、発癌性ＣＲ含有タンパク質と選択的に結合するＲＡＰ、ＲＡＰ変異体、又はＣＲ特異的抗体を投与する工程を含む、ＣＲ含有タンパク質が関連する発癌性又は転移性効果を減少させる方法を意図する。かかる発癌性ＣＲ含有タンパク質には、限定するものではないが、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、マトリプターゼ及びＦＤＣ−８Ｄ６抗原を含む。かかるＣＲ選択的なＲＡＰ又はＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体は、例えば、結合又は活性部位を阻止することにより、又はＲＡＰ変異体のＲＡＰに付着させた抗腫瘍薬を用いてこれらのＣＲ含有タンパク質を過剰発現する組織を標的とすることにより、直接的にＣＲの機能を妨害することによって、標的であるＣＲ含有タンパク質に関連した発癌効果を減少させる。例えば、マトリプターゼを過剰表現する組織としては、例えば、卵巣、子宮頚部、前立腺、胸部、肺、結腸又は消化管上皮性悪性腫瘍等の上皮性悪性腫瘍が挙げられる。さらに別の実施形態において、本発明は、選択的にＬＲＰ５と選択的に結合して、それにより骨芽細胞の分化及び骨沈着に拮抗し、並びに破骨細胞の活性を促進する因子を阻害する、ＲＡＰ、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体を投与する工程を含む、骨粗鬆症、又は、低下した骨芽細胞活性及び／又は上昇した破骨細胞活性と関連するその他の疾患を処置する方法を意図する。
関連する態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤中に含まれる診断薬又は治療薬と結合したＲＡＰ変異体を含む医薬組成物を提供する。
第３の態様において、本発明は、かかるＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体及びＲＡＰ複合体を含む組成物を治療的に使用することを可能にする量で、ＲＡＰ変異体及び複合体を製造する方法を特徴とする。本発明はさらに、本発明のＲＡＰ変異体を含む前記ポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸を提供する。かかる核酸を含むベクター、かかる核酸又はベクターを含む宿主細胞、並びに、適切な培地中で宿主細胞を培養する工程及び前記宿主細胞又は培地からポリペプチドを分離する工程を含む、かかるポリペプチドの生産方法も提供される。
第４の態様において、本発明は、ＬＤＬＲ（Ｐ０１１３０）、ＬＲＰ１（Ｐ９８１５７）、ＬＲＰ１Ｂ（Ｑ９ＮＺＲ２）、ＬＲＰ２（Ｐ９８１６４）、ＬＲＰ３（Ｏ７５０７４）、ＬＲＰ４（Ｏ７５０９６）、ＬＲＰ５（Ｏ７５１９７）、ＬＲＰ６（Ｏ７５５８１）、ＬＲＰ８（Ｑ１４１１４）、ソルチリン（Ｑ９２６７３）、ＬＲＰ１０（Ｑ７Ｚ４Ｆ１）、ＬＲＰ１１（Ｑ８６ＶＺ４）、ＬＲＰ１２（Ｑ９Ｙ５６１）、ＦＤＣ−８Ｄ６（ＣＤ３２０）、ＶＬＤＬＲ（Ｐ９８１５５）、ＴＡＤＧ−１５（ＳＴ１４、Ｑ８ＷＶＣ１）、ＴＭＰＳ３（Ｐ５７７２７）、ＴＭＰＳ４（Ｑ９ＮＲＳ４）、ＴＭＰＳ６（Ｑ８ＩＵ８０）、Ｑ６ＩＣＣ２、Ｑ６ＰＪ７２、Ｑ７６Ｂ６１、Ｑ７ＲＴＹ８、Ｑ７Ｚ７Ｋ９、Ｑ８６ＹＤ５、Ｑ８ＮＡＮ７、Ｑ８ＮＢＪ０、Ｑ８ＷＷ８８、Ｑ９６ＮＴ６、Ｑ９ＢＹＥ１、Ｑ９ＢＹＥ２、Ｑ９ＮＰＦ０及びｃｏｒｉｎ（Ｑ８ＩＺＲ７）からなる群より選択される受容体又はタンパク質に対して相対的に高い結合親和性を有するＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体に対するスクリーニング方法を提供する。任意の特定の相補的な形式の繰り返し（ＣＲ）において、カルシウム結合ループのＡｘｃＢｘＣｘＤモチーフ内に特徴的な位置Ａ及び位置Ｃが存在する。ＣＲ対において、対のうちの第２のＣＲも、Ａ’及びＣ’と示される特徴的な位置Ａ及び位置Ｃを有する。図１〜２は、例示的なＣＲ対における位置Ａ及びＣの相対的位置を示す。図１〜２に記載された任意のＣＲ対を本スクリーニング方法に使用することができることが意図される。一実施形態において、本発明は、（ａ）候補となるＲＡＰ変異体を作製する工程と、（ｂ）ＣＲ含有タンパク質由来の少なくとも２つのＣＲ対に対する候補となるＲＡＰ変異体の結合を測定する工程であって、このＣＲ対が、別のＣＲ含有タンパク質の任意のその他のＣＲ対内には存在しない、各ＣＲ対内のＡｘｃＢｘＣｘＤモチーフのＡ、Ｃ、Ａ’、Ｃ’の位置のアミノ酸の組み合わせによって特定される工程を含む、任意のその他のタンパク質と比較して、対象とする特定の受容体又はタンパク質に対して相対的に高い親和性を有する、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体のスクリーニング方法を意図する。一実施形態において、ＣＲ対は、動物のプロテオーム中の全てのＣＲ対に由来するＣＲ対のうち１０％未満に見出される、Ａ、Ｃ、Ａ’、Ｃ’の位置でのアミノ酸の組み合わせを含む。
本発明のその他の特徴及び利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲において様々な変更及び修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかになるため、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、それらは説明の目的のみで示されることを理解すべきである。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
１．α−２−マクログロブリン／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質結合タンパク質１（ＲＡＰ）のアミノ酸配列変異体を含むポリペプチドであって、前記ＲＡＰ変異体が、タンパク質内部の相補的な形式の繰り返しの対に対し、同様な相補的な形式の繰り返しの対に対する野生型ＲＡＰの親和性よりも少なくとも３倍高い親和性で、選択的に結合する、ポリペプチド。
（項目２）
前記ＣＲ含有タンパク質が、ＬＤＬＲ（Ｐ０１１３０）、ＬＲＰ１（Ｐ９８１５７）、ＬＲＰ１Ｂ（Ｑ９ＮＺＲ２）、ＬＲＰ２（Ｐ９８１６４）、ＬＲＰ３（Ｏ７５０７４）、ＬＲＰ４（Ｏ７５０９６）、ＬＲＰ５（Ｏ７５１９７）、ＬＲＰ６（Ｏ７５５８１）、ＬＲＰ８（Ｑ１４１１４）、ソルチリン（Ｑ９２６７３）、ＬＲＰｌＯ（Ｑ７Ｚ４Ｆ１）、ＬＲＰＩｌ（Ｑ８６ＶＺ４）、ＬＲＰ１２（Ｑ９Ｙ５６１）、ＦＤＣ−Ｄ８６（ＣＤ３２０）、ＶＬＤＬＲ（Ｐ９８１５５）、ＴＡＤＧ−１５（ＳＴ１４、Ｑ８ＷＶＣ１）、ＴＭＰＳ３（Ｐ５７７２７）、ＴＭＰＳ４（Ｑ９ＮＲＳ４）、ＴＭＰＳ６（Ｑ８ＩＵ８０）、Ｑ６ＩＣＣ２、Ｑ６ＰＪ７２、Ｑ７６Ｂ６１、Ｑ７ＲＴＹ８、Ｑ７Ｚ７Ｋ９、Ｑ８６ＹＤ５、Ｑ８ＮＡＮ７、Ｑ８ＮＢＪ０、Ｑ８ＷＷ８８、Ｑ９６ＮＴ６、Ｑ９ＢＹＥ１、Ｑ９ＢＹＥ２、Ｑ９ＮＰＦ０及びコリン（ｃｏｒｉｎ）（Ｑ８ＩＺＲ７）からなる群より選択される、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記ＲＡＰ変異体が、成熟ＲＡＰのアミノ酸１〜１４３及び３２０〜３２３を欠失している、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４）
Ｎ末端から少なくとも２００個及び最大２４３個のアミノ酸を欠失している、項目１に記載のポリペプチド。
（項目５）
Ｃ末端から最大１１個のアミノ酸を欠失している、項目４に記載のＲＡＰ変異体。
（項目６）
Ｃ末端から少なくとも４アミノ酸を欠失している、項目５に記載のＲＡＰ変異体。
（項目７）
（ａ）少なくとも７１個のアミノ酸長であり、かつ、（ｂ）アミノ酸２５６〜２７０を含む、成熟ＲＡＰの連続部分を含むＲＡＰ変異体。
（項目８）
（ａ）少なくとも７１個のアミノ酸長であり、かつ、（ｂ）アミノ酸２５６〜２７０を含む、ＲＡＰ ｄ３の連続部分を含むＲＡＰ変異体。
（項目９）
前記変異体が、ＲＡＰの２５１位、２５６位、２５７位、２６６位、２７０位、２７９位、２８０位、２９６位又は３０５位のいずれか１ヶ所に変異を含む、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記変異体が、マトリプターゼタンパク質と選択的に結合する、項目１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記変異体が、ＲＡＰの２５１位、２５６位、２５７位、２６６位、２７０位、又は２８０位のいずれか１ヶ所に変異を含む、項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記変異体が、ＲＡＰの２５１位に変異を含む、項目１０〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記変異体が、ＲＡＰの２５６位に変異を含む、項目１０〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記変異体が、ＲＡＰの２５７位に変異を含む、項目１０〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記変異体が、ＲＡＰの２６６位に変異を含む、項目１０〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記変異体が、ＲＡＰの２７０位に変異を含む、項目１０〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記変異体が、ＲＡＰの２８０位に変異を含む、項目１０〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記変異体が、ＶＬＤＬＲタンパク質と選択的に結合する、項目１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記変異体が、ＲＡＰの２５１位、２５６位、２７０位又は２７９位のいずれか１ヶ所に変異を含む、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記変異体が、ＲＡＰの２５１位に変異を含む、項目１８〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記変異体が、ＲＡＰの２５６位に変異を含む、項目１８〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記変異体が、ＲＡＰの２７０位に変異を含む、項目１８〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記変異体が、ＲＡＰの２９６位に変異を含む、項目１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記変異体が、ＦＤＣ−８Ｄ６（ＣＤ３２０）タンパク質と選択的に結合する、項目１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記変異体が、ＲＡＰの２５１位、２５６位、２７０位、２７９位又は３０５位のいずれか１ヶ所に変異を含む、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記変異体が、ＲＡＰの２５１位に変異を含む、項目２４〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記変異体が、ＲＡＰの２５６位に変異を含む、項目２４〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記変異体が、ＲＡＰの２７０位に変異を含む、項目２４〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２９）
前記変異体が、ＲＡＰの２７９位に変異を含む、項目２４〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記変異体が、ＲＡＰの３０５位に変異を含む、項目２４〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記変異体が、ＲＡＰの２７１〜３１９位に少なくとも１つのさらなる変異を含む、項目１〜３０に記載のポリペプチド。
（項目３２）
前記変異体が、ＲＡＰの２０５〜２５０位に少なくとも１つの変異を含む、項目１〜３０に記載のポリペプチド。
（項目３３）
前記変異が、酸性アミノ酸の塩基性アミノ酸との置換である、項目９〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３４）
前記酸性アミノ酸が、Ｄ及びＥからなる群より選択される、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３５）
前記塩基性アミノ酸が、Ｋ及びＲからなる群より選択される、項目３３に記載のポリペプチド。
（項目３６）
前記変異が、塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸との置換である、項目９〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目３７）
前記塩基性アミノ酸が、Ｋ及びＲからなる群より選択される、項目３６に記載のポリペプチド。
（項目３８）
前記酸性アミノ酸が、Ｄ及びＥからなる群より選択される、項目３６に記載のポリペプチド。
（項目３９）
前記変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸の、Ｆ、Ｙ、Ｗ及びＨからなる群から選択されるアミノ酸への置換である、項目４−９−３２のいずれか１項に記載のポリペプチドポリペプチド。
（項目４０）
以下の位置：１７５、２０５、２１３、２１７、２２６、２３０、２３２、２３９、２４６、２４９、２５１、２５６、２５７、２６１、２６６、２６７、２６８、２７０、２７３、２８７、２９０、２９４、２９６、２９７、２９８、３０５、３１２、３１３のうちの３つ又はそれ以上の位置に変異を含む、項目１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目４１）
以下の位置：２０５、２１７、２４９、２５１、２５６、２５７、２６６、２７０、２９４、２９６、２９７、３０５のうちの３つ又はそれ以上の位置に変異を含む、項目１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目４２）
Ｒ２０５Ｓ、Ｓ２１３Ｔ、Ｅ２１７Ｋ、Ｌ２２６Ｍ、Ｈ２４９Ｙ、Ｅ２３０Ｖ、Ｓ２３２Ｐ、Ｅ２３９Ｇ、Ｅ２４６Ｇ、Ｅ２５１Ｌ、Ｅ２５１Ｋ、Ｅ２５１Ｔ、Ｅ２５１Ｇ、Ｅ２５１Ｐ、Ｅ２５１Ｎ、Ｅ２５１Ｒ、Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２５６Ｖ、Ｋ２５６Ａ、Ｋ２５６Ｉ、Ｋ２５６Ｐ、Ｋ２５６Ｌ、Ｉ２６６Ｆ、Ｉ２６６Ｔ、Ｋ２５７Ｙ、Ｑ２６１Ｒ、Ａ２６７Ｖ、Ｈ２６８Ｒ、Ｋ２７０Ｐ、Ｋ２７０Ｄ、Ｋ２７０Ｎ、Ｋ２７０Ｇ、Ｋ２７０Ｅ、Ｋ２７０Ｗ、Ｌ２７１Ｍ、Ｈ２７３Ｙ、Ｄ２７９Ｙ、Ｖ２８３Ｍ、Ｒ２８７Ｈ、Ｈ２９０Ｙ、Ｈ２９０Ｌ、Ｅ２９４Ｖ、Ｒ２９６Ｌ、Ｔ２９７Ｉ、Ｋ２９８Ｒ、Ｋ３０５Ｔ、Ｋ３０６Ｍ、Ｓ３１２Ｆ、Ｇ３１３Ｄの変異のうちの３つ又はそれ以上を含む、項目１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目４３）
項目１−４２に記載のポリペプチドのオリゴマー的な組み合わせからなり、前記組み合わせにおける各ポリペプチドによって規定される多価結合特性を伴う、ポリペプチド。
（項目４４）
項目１−４３に記載のポリペプチドを投与することによる疾患の処置方法であって、前記ポリペプチドが、前記疾患の病態生理学に関与するタンパク質と選択的に結合する、処置方法。
（項目４５）
診断的又は治療薬と結合している項目１〜４４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む化合物。
（項目４６）
前記ポリペプチドと診断的又は治療薬とがリンカーを通じて結合している、項目４５に記載の化合物。
（項目４７）
前記リンカーがペプチドリンカーである、項目４６に記載の化合物。
（項目４８）
前記治療薬が、膠細胞由来神経成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン１０（ＡＤＡＭ１０）、ＬＲＰ５／６に対するシャペロンタンパク質（ＭＥＳＤ）、癌化学治療薬、プロテアーゼ阻害剤、プロアポトーシス分子、自己免疫抗原、リソソーム酵素、ナノ粒子、複合糖質及び核酸からなる群より選択される、項目４５に記載の化合物。
（項目４９）
薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤中に項目１〜３９又は４５に記載の化合物を含む、医薬組成物。
（項目５０）
項目１〜４３又は４５に記載の医薬組成物を必要とする対象に対して投与する工程を含む、動物の中枢神経系に診断的又は治療薬を送達する、方法。
（項目５１）
前記対象が神経系疾患を罹患するヒト対象である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記神経系疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及び中枢神経系の癌からなる群より選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
項目４５に記載の医薬組成物を必要とする対象に対して投与する工程を含む、対象の特異的組織又は組織群に、診断的又は治療薬を送達する、方法。
（項目５４）
前記物質が血液脳関門を通過して送達される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
項目１〜４３又は４４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（項目５６）
（ａ） 候補となるＲＡＰ変異体を作製する工程と、
（ｂ） ＣＲ含有タンパク質由来の少なくとも２つのＣＲ対に対する、前記候補となるＲＡＰ変異体の結合を測定する工程であって、前記ＣＲ対が、全てのＣＲ含有タンパク質のうち任意のその他のＣＲ対の内部には存在しないカルシウム結合ループ内のアミノ酸の組み合わせによって特定される、測定する工程と、
を含む、項目１に記載のＲＡＰ変異体をスクリーニングする、方法。
（項目５７）
（ａ） 候補となるＲＡＰ変異体を作製する工程と、
（ｂ） ＣＲ含有タンパク質由来の少なくとも２つのＣＲ対に対する、前記候補となるＲＡＰ変異体の結合を測定する工程であって、前記ＣＲ対が、全てのＣＲ含有タンパク質のうち１０％未満のＣＲ対の内部に存在する、カルシウム結合ループ内のアミノ酸の組み合わせによって特定される、測定する工程と、
を含む、項目１に記載のＲＡＰ変異体をスクリーニングする、方法。
図１は、相補的な形式の繰り返しを表す図であって、Ｓｉｍｏｎｏｖｉｃら（４３）により決定されたような、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１ ＣＲ７、ＰＤＢ １Ｊ８Ｅ）の第７の相補的な形式の繰り返し配列に基づき、この図は、示されたＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの位置の残基によって形成されるカルシウム結合ループ面を示す。カルシウムは球で表されている。 図２は、結合分析のために選択されたＣＲ配列のアラインメント並びにＲＡＰ変異体又はＣＲ抗体選択を示す。使用する特定の対（ペア）及び三つ組（トリプレット）は左括弧により示される。パンニング基質（ＬＲＰ２ ＣＲ８９）は、赤色（より明るい色）の括弧により示される。アラインメントにおけるＡｘｃＢｘＣｘＤモチーフは、各ＣＲ配列の位置Ａ及びＣに下線を引いて示される。各ＣＲ対のＡ、Ｃ、Ａ’、及びＣにおけるアミノ酸のテキスト文字列の連なりを右に示す。陰影を付けて示されたアミノ酸は、整列された位置において優勢なアミノ酸と同一であり；太字で示されたアミノ酸は、整列された位置において優勢なアミノ酸と相同である。配列はＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（４４）を用いて整列され、ＢＯＸＳＨＡＤＥを用いてフォーマットされた。 図３は、ＣＲタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。精製され、リフォールディングされたタンパク質を、２ｍＭのＤＴＴの存在下又は非存在下で、ＳＤＳローディングバッファー中で変性させた。処理したサンプルを、方法の項に記載したように、１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル中に溶解させた。ゲルはクマシー・ブリリアント・ブルーを用いて染色した。各レーンのペアに、試験した関連ＣＲタンパク質名を下部に記載する。分子量マーカーの大きさを示す。典型的な結果を示す。略語：Ｌ１はＬＲＰ１であり；Ｌ２はＬＲＰ２であり；Ｌ６はＬＲＰ６であり；ＭはＭＡＴ（マトリプターゼ、ＳＴ１４）であり；ＶはＶＬＤＬＲであり；ＹＶＷＲ＝ＬＲＰ２ ＣＲ８９であり；ＹＶＷＤ＝ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｒ１０８８Ｄであり；ＹＤＷＲ＝ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｖ１０４７Ｄであり；ＹＤＷＤ＝ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｖ１０４７Ｄ Ｒ１０８８Ｄであり；ＷＶＷＲ＝ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗであり；ＷＤＷＲ＝ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｖ１０４７Ｄであり；ＷＶＷＤ＝ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｒ１０８８Ｄであり；ＷＤＷＤ＝ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｖ１０４７Ｄ Ｒ１０８８Ｄである。 図４は、１００〜１．２５ｎＭに調製されたＲＡＰ ｄ３の希釈系列を用いた、選択されたＣＲタンパク質に対するＲＡＰ ｄ３の結合を表す。 図５Ａ〜Ｂは、ＲＡＰ ｄ３、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３（ＲＡＰｖ２Ａ ｄ３）及び中間配列変異体のＬＲＰ２ ＣＲ８９及びＬＲＰ１ ＣＲ３−５に対する結合を表す。図５Ａは、ＲＡＰ ｄ３変異体及びＲＡＰｖ２Ａ ｄ３復帰突然変異体のＬＲＰ２ ＣＲ８９に対する結合を示す。図５Ｂは、ＲＡＰ ｄ３変異体及びＲＡＰｖ２Ａ ｄ３復帰突然変異体のＬＲＰ１ ＣＲ３−５に対する結合を示す。データをプロットし、単一の結合部位であるという条件で、非線形回帰によって適合させた（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。回帰分析から、標準偏差を伴うＫｄ値を導いた。 図５Ａ〜Ｂは、ＲＡＰ ｄ３、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３（ＲＡＰｖ２Ａ ｄ３）及び中間配列変異体のＬＲＰ２ ＣＲ８９及びＬＲＰ１ ＣＲ３−５に対する結合を表す。図５Ａは、ＲＡＰ ｄ３変異体及びＲＡＰｖ２Ａ ｄ３復帰突然変異体のＬＲＰ２ ＣＲ８９に対する結合を示す。図５Ｂは、ＲＡＰ ｄ３変異体及びＲＡＰｖ２Ａ ｄ３復帰突然変異体のＬＲＰ１ ＣＲ３−５に対する結合を示す。データをプロットし、単一の結合部位であるという条件で、非線形回帰によって適合させた（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。回帰分析から、標準偏差を伴うＫｄ値を導いた。 表１は、ＲＡＰ ｄ３及びＲＡＰ ｖ２（ＲＡＰ ｖ２Ａ）変異体のＬＲＰ１ＣＲ３−５及びＬＲＰ２ ＣＲ８９に対する結合のデータを示す。ＮＦは、結合を測定できなかったこと、又は、単一の結合部位であるという条件で非線形回帰を用いて適合させたデータが信頼し得るものではなかったことを示す。最大結合パーセントとは、各リガンドに対し試験した最高濃度におけるＯＤの、その濃度におけるかかる全てのリガンドに関して測定された最高のＯＤに対する割合である。 図６は、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３及びＲＡＰ ｄ３のＬＲＰ２ ＣＲ８９変異体に対する結合を示す。図中で使用される略語：ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ（ＷＶＷＲ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｖ１０４７Ｄ（ＹＤＷＲ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｒ１０８８Ｄ（ＹＶＷＤ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｖ１０４７Ｄ Ｒ１０８８Ｄ（ＹＤＷＤ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｖ１０４７Ｄ Ｒ１０８８Ｄ（ＷＤＷＤ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｖ１０４７Ｄ（ＷＤＷＲ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｒ１０８８Ｄ（ＷＶＷＤ）。 表２は、ＲＡＰ ｄ３及びＲＡＰ ｖ２Ａ ｄ３のＬＲＰ２ ＣＲ８９変異体に対する結合のデータを示す。ＮＦは、結合を測定できなかったこと、又は、単一の結合部位であるという条件で非線形回帰を用いて適合させたデータが信頼し得るものではなかったことを示す。最大結合パーセントとは、各リガンドに対し試験した最高濃度におけるＯＤの、その濃度におけるかかる全てのリガンドに関して測定された最高のＯＤに対する割合である。 表３は、様々なＣＲ対に対して変異ファージライブラリーをパンニングすることにより単離されたＲＡＰ ｄ３変異体の配列を示す。可変位置のみを示す。アミノ酸番号は成熟ＲＡＰに対応している。変異体名称（ｄ３）、親和性選択に用いたＣＲ対（ＣＲ）、（測定した場合には）変異体と標的ＣＲ対の複合体についての見かけの解離定数（Ｋｄ）、及び変動し得る位置におけるアミノ酸同一性を示す。 図７は、ＲＡＰ ｄ３変異体のＣＲ対への結合を示す。ＲＡＰ ｄ３、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３、ＶＲＡＰ２ ｄ３、ＭａｔＲＡＰ１ ｄ３及びＭａｔＲＡＰ２ ｄ３を、各々８０ｎｍの濃度で、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５、ＬＲＰ６ ＣＲ１２、ＬＲＰ６ ＣＲ２３、ＬＲＰ６ ＣＲ１−３、ＬＲＰ２ ＣＲ８９、ＬＲＰ２ ＣＲ２７２８、ＬＲＰ２ ＣＲ３０３１、ＬＲＰ２ ＣＲ３４３５、ＬＲＰ２ ＣＲ３４−３６、ＶＬＤＬＲ ＣＲ７８、ＶＬＤＬＲ ＣＲ６−８、ＭＡＴ ＣＲ１２、ＭＡＴ ＣＲ２３及びＭＡＴ ＣＲ３４とインキュベートした。サンプルは２回、２連で試験し、値を合わせた。次に、平均値及び標準偏差を計算した。リガンド非存在下でインキュベートしたウェルから得られたブランク値を用いて、吸光度データを補正した。試験したいかなる条件についても分散係数（ＣＶ）は２０％を超えず（平均値６％）、示してはいない。 図８は、本発明において単離されたＲＡＰ ｄ３変異体の完全なアミノ酸配列を示す。 図９は、Ｎ末端及びＣ末端の両方において、ＭａｔＲＡＰ１変異体の切断が結合親和性に対して及ぼす、正の効果を示す。切断型変異体は全長変異体について記載されたように作製した。 図１０は、３２０ＲＡＰ１及び相当する切断型変異体の、ＦＤＣ−８Ｄ６抗原由来の標的ＣＲ対に対する結合を示す。 図１１は、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ（より高い位置のバンド）及びＧＤＮＦ（より低い位置のバンド）の還元型（左）及び非還元型（右）ウェスタンブロットを示し、その融合体がジスルフィド結合したホモ二量体であることを表している。 図１２は、固相アッセイによる、ＲＡＰ−ＧＤＮＦのＧＦＲαに対する結合を示す。 図１３は、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ及びＧＦＲαによるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の処理後に、抗ホスホチロシン抗体によって検出したＲｅｔの免疫沈降を示す。 図１４は、抗ＲＡＰ−アガロースビーズを用いた、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ／ＧＦＲα／ホスホ−Ｒｅｔ複合体の免疫沈降を示す。免疫沈降物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で溶離させ、電気泳動により分離し、ＰＶＤＦにブロッティングして、記載された抗体を用いて調べた。 図１５Ａは、ＧＤＮＦ及びＲＡＰ−ＧＤＮＦの両方が、ＰＣ１２細胞における神経突起伸長を誘導することを示す。 図１５Ｂは、ＧＤＮＦ及びＲＡＰ−ＧＤＮＦ濃度による、ＰＣ１２の神経突起伸長の用量応答を示す。
補足資料として、本発明に有用なプライマー等、タンパク質及びその他の配列に対するポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列を示す。
（詳細な説明）
本発明は、ＬＤＬＲ及び膜貫通セリンプロテアーゼファミリー、並びにその他のンパク質のメンバーと選択的に結合するα−２−マクログロブリン／低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に関連するタンパク質結合タンパク質１（受容体結合タンパク質、ＲＡＰ、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション Ｐ３０５３３、Ｐｆａｍアクセッション番号 ＰＦ０６４００及びＰＦ０６４０１）の突然変異体を含む組成物に関する。本発明はさらに、対象となるタンパク質由来の固有の配列決定基に対するＲＡＰ変異体ライブラリーのスクリーニングに基づく、かかる変異体又は抗体を単離するための系を意図する。ＲＡＰ変異体は、標的受容体の２つの一般的特性に基づく潜在的な医薬用途を有している：第１に、多くの受容体は疾病状態の確立及び進行における役割を担う。かかる受容体と選択的に結合する試薬は、したがって、受容体の挙動及びそれらが支持する病態生理学的効果を変化させるために用いられ得る。第２に、多くの受容体は固有の組織分布を有している。したがって、かかる受容体と選択的に結合する試薬を、標的とされる受容体を優位に発現する組織へとその他の医薬物質を選択的に運ぶために用いることができる。本発明はさらに、限定するものではないが、腫瘍性疾患等の細胞増殖性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾患、ホルモン異常性疾患、変性疾患、加齢による疾患、中枢神経系の疾患（例えば、アルツハイマー病、てんかん、高脂血症）、精神性の疾患及び症状（例えば、統合失調症、鬱病及び不安症等の情緒障害）、感染症、自己免疫疾患、酵素欠損症、上記したようなリソソーム蓄積症等の疾患の予防、管理及び処置における、かかる組成物の使用を意図する。
（Ａ． 定義）
特に規定しない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ
ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及び、Ｈａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
本明細書において引用される刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、本開示と矛盾しない範囲で、その全体を参照として取り入れるものとする。
本明細書及び添付された特許請求の範囲中において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、複数形の指示を含むことがここで留意される。
本明細書において使用する場合、以下の用語は、特に他に指定しない限り、それらに属する意味を有する。
本明細書において使用する場合、「脳腫瘍及び脳内又は脳周辺におけるその他の新生物」には、原発性の腫瘍及び／又は脳内又は脳周辺で現れる転移の両方が含まれる。この語はまた、体内の他の場所に移動しているが、ＲＡＰ、ＣＲ特異的抗体又は化学治療薬と結合させたＲＡＰ変異体ポリペプチドに対する反応性は残存している脳腫瘍の転移をも意味し得る。多くのタイプのかかる腫瘍及び新生物が公知である。原発性の脳腫瘍には、グリオーマ、髄膜腫、神経鞘腫、下垂体腺腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、血管腫、扁平上皮癌、肉腫及びその他を含む。全ての頭蓋内腫瘍の５０％は、頭蓋内への転移である。本明細書において使用する場合、腫瘍及び新生物は、脳及び神経組織と結合している場合があり、又はそれらは、髄膜、頭蓋骨、血管又は頭部若しくは頸部の任意のその他の組織と結合している場合がある。かかる腫瘍は通常、固形癌であり、又はそれらは、頭部に局在して蓄積されている、びまん性腫瘍である。本発明による処置のための腫瘍又は新生物は、悪性又は良性であってもよく、従来、化学療法、放射線照射及び／又はその他の処置法によって処置されている。
用語「有効量」とは、対象の健康状態、病態、及び疾患に所望の結果をもたらすための、又は診断目的のための十分な用量を意味する。所望の結果には、投薬受容者における主観的又は客観的な改善が含まれ得る。「治療的に有効な量」とは、健康に対して意図される有利な効果をもたらすために有効な物質の量のことをいう。
「小有機分子」とは、医薬において通常使用される有機分子と同程度の大きさの有機分子のことをいう。この用語は有機バイオポリマー（例えば、タンパク質、核酸等）を除く。好ましい小有機分子は、最大約５，０００Ｄａ、最大約２，０００Ｄａ、又は最大約１，０００Ｄａの大きさの範囲である。
診断又は処置の「対象」は、ヒト又は非ヒト動物、例えば、哺乳動物又は霊長類等である。
「処置」とは予防的処置又は治療的処置又は診断的処置のことをいう。
「予防的」処置とは、病状が発症するリスクを低減する目的のために、疾患の徴候を示していないか、又は初期の徴候のみを示している対象に対して行われる処置のことである。病状を発症する可能性を低減するために、又は、発症した場合であれば、病状の重篤度を最小限にするために、予防的処置として本発明の複合体化合物を与えることができる。
「治療的」処置は、病気の兆候又は症状を示す対象に、それらの兆候又は症状を減少させる又は排除する目的のために行われる処置である。兆候又は症状は、生物化学的、細胞的、組織学的、機能的、主観的又は客観的であってもよい。本発明の複合体化合物を、治療的処置として又は診断のために与えることができる。
「診断的」とは、病的状態の存在又はその特徴を同定することを意味する。診断的方法は、それらの特異性及び選択性により異なる。ある特定の診断的方法は症状の確定的診断を提供しないかもしれないが、その方法が診断の助けとなる明確な表示を提供する場合には、それは十分なものである。
「医薬組成物」とは、ヒト及び哺乳動物等の対象動物における医薬的用途に適した組成物のことをいう。医薬組成物は、薬理学的に有効量の活性物質と結合したＲＡＰ変異体ポリペプチド、又は場合により活性物質と結合している、ＣＲ特異的抗体を含んでなり、薬学的に許容可能な担体をも含む。医薬組成物は、活性成分と、担体を構成する不活性成分と、任意の２つ若しくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体の形成又は凝集体の形成から、又は１つ若しくはそれ以上の成分の解離から、又はその他のタイプの反応から、又は１つ若しくはそれ以上の成分の相互作用から直截的又は間接的に得られる任意の生成物とを含む組成物を包含する。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の複合体化合物及び薬学的に許容可能な担体を混合することによって作製された組成物を包含する。
「薬学的に許容可能な担体」とは、任意の標準的な医薬担体、緩衝液、及び賦形剤、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、５％のデキストロース水溶液、及びエマルジョン、例えば、油／水又は水／油エマルジョン、及び様々なタイプの湿潤剤及び／又はアジュバントのことをいう。適当な医薬担体及び製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。好ましい医薬担体は、活性物質の意図される投与様式に依存する。典型的な投与様式には、経消化管（例えば、経口）又は非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内投与；又は局所、経皮、若しくは経粘膜投与）が挙げられる。「薬学的に許容可能な塩」とは、医薬的用途のために化合物中に製剤化し得る、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）及びアンモニア又は有機アミンの塩等の塩である。
本明細書において使用する場合、用語「単位投与形態」とは、ヒト及び動物対象のための単位用量として適当な物理的に個別の単位のことをいい、各単位は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体又はビヒクルと共同して所望の効果を生じるのに十分な量が計算された、所定量の本発明の化合物を含む。本発明の新規単位投与形態の特定は、使用される特定の複合体及び達成しようとする効果、並びに、宿主において各化合物に関連した薬物動態に依存する。
本明細書において使用する場合、「調節する」とは、（例えば、アンタゴニスト又はアゴニストとして作用するように）増大又は減少により変化させる能力のことをいう。
本明細書において使用する場合、「相対的送達の増大」とは、ＲＡＰ変異体と複合体化させた活性物質又はＣＲ特異的抗体の、意図された送達部位（例えば、脳、リソソーム）における蓄積が、複合体化されていない活性物質の蓄積と比較して増大している効果のことをいう。
「治療指数」とは、最小限の治療的な量より高く、許容し得ない毒性量よりは低い用量範囲（量及び／又は時期）のことをいう。
「等価用量」とは、同量の活性物質を含む用量のことをいう。
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単位から構成されるポリマーのことをいう。ポリヌクレオチドとしては、天然の核酸、例えば、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）及びリボ核酸（「ＲＮＡ」）並びに核酸アナログが挙げられる。核酸アナログとしては、天然には存在しない塩基、天然のホスホジエステル結合以外のその他のヌクレオチドとの結合に携わっているヌクレオチド、又はホスホジエステル結合以外のその他の結合によって結合している塩基を含むものが挙げられる。したがって、ヌクレオチドアナログには、例えば、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が含まれる。かかるポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成することができる。用語「核酸」は通常、大型のポリヌクレオチドのことをいう。用語「オリゴヌクレオチド」は通常、一般的に約５０ヌクレオチド長以下の短いポリヌクレオチドのことをいう。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表される場合、これには、「Ｕ」が「Ｔ」と置き換わった、ＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含まれることが理解されるであろう。
「ｃＤＮＡ」とは、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、ｍＲＮＡと相補的な又は同一のＤＮＡのことをいう。
ポリヌクレオチド配列を記載するために、本明細書においては従来の表記方法が使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と呼ばれる。ヌクレオチドの初期ＲＮＡ転写物への５’から３’への付加方向は転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と呼ばれ；そのＤＮＡから転写されるｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖における配列であって、ＲＮＡ転写物の５’から５’末端に位置しているものは「上流配列」と呼ばれ；そのＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖における配列であって、コードしているＲＮＡ転写物の３’から３’末端に位置しているものは「下流配列」と呼ばれる。
「相補性」とは、２つのポリヌクレオチドの位相的適合性又は相互作用する面の対合性のことをいう。したがって、２つの分子は相補的であると記載することができ、さらに、接触面の特徴は互いに相補的である。第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチドの相手と結合しているポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が同一である場合、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに対して相補的である。したがって、配列５’−ＴＡＴＡＣ−３’のポリヌクレオチドは、配列が５’−ＧＴＡＴＡ−３’であるポリヌクレオチドに対して相補的である。
「相補的な繰り返し」又は「ＣＲ」は、低密度リポタンパク質受容体クラスＡドメイン（ＬＤＬ−Ａ、Ｐｆａｍ）としても知られ、いくつかある特徴の中で特に、６個のシステイン及び一群の酸性アミノ酸とによって規定されるタンパク質ドメインファミリーのメンバーである。多くの相補的な繰り返しがＬＤＬ受容体様モジュール（タンパク質構造分類、ＳＣＯＰ）と呼ばれる規定の構造中に折り畳まれていることが見出される。ＣＲドメインは、ＬＤＬＲに属する受容体等の多くの受容体におけるリガンド結合決定基を構成する。ｃは保存的システインであり、ｘは任意のアミノ酸であり、Ｂ及びＤはアスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラギンのいずれかである、モチーフＡｘｃＢｘＣｘＤを有する各ＣＲにおける直鎖状のアミノ酸配列が、カルシウムとの結合及びリガンドの結合に関与することが示されている。特定のＣＲドメインにおける隣接する対はＲＡＰと結合することが示されている。ＲＡＰと結合するＣＲ対の２つのＣＲドメインのうち、両方のＡ及びＢの位置におけるアミノ酸（Ａ、Ｃ、Ａ’及びＣ’）はＲＡＰとの結合に関与することが示されている。
対象となるヌクレオチド配列に相補的な配列が参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、ヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列に対して「実質的に相補的」である。
「コードする」とは、規定された配列のヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は規定された配列のアミノ酸のいずれか及びそれから生じる生物学的特性を有するその他のポリマー及び巨大分子の生物学的工程において、合成のためのテンプレートとして機能するための、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡにおける特定の配列のヌクレオチドの固有の特性のことをいう。すなわち、遺伝子によって引き起こされるｍＲＮＡの転写及び翻訳によって、細胞又はその他の生物学的系の中にタンパク質が産生される場合に、遺伝子はタンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であって、配列リスト中に通常示されるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のためのテンプレーとして使用される非コード鎖の両方が、タンパク質又はその遺伝子もしくはｃＤＮＡのその他の産物をコードしていると称され得る。特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重版であって、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
「組み換えポリヌクレオチド」とは、天然においては共に連結されていない配列を有するポリヌクレオチドのことをいう。増幅された又は組み立てられた組み換えポリヌクレオチドは適切なベクター中に含まれ得、このベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換することができる。組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を「組み換え宿主細胞」と称する。組み換え宿主細胞中で遺伝子が発現されて、例えば「組み換えポリペプチド」が産生される。組み換えポリヌクレオチドは、同様に、非コード機能（例えば、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位等）を担い得る。
「発現調節配列」とは、機能可能にそれと連結しているヌクレオチド配列の発現（転写及び／又は翻訳）を制御するポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列のことをいう。「機能可能に連結されている」とは、一方の側の活性（例えば、転写を制御する能力）が、もう一方の側の作用（例えば、その配列の転写）をもたらす、２つの部分の間における機能的関係のことをいう。発現調節配列には、例えば、限定するものではないが、（例えば、誘導的又は構成的）プロモーター、エンハンサー、転写終止因子、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、及び終止コドンの配列が含まれ得る。
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列と機能可能に連結された発現調節配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターのことをいう。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含む；発現のためのその他のエレメントは、宿主細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給され得る。発現ベクターには、例えば、コスミド、（例えば、裸の又はリポソーム中に含まれた）プラスミド及び組み換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルス等の当技術分野において公知である全てのものが含まれる。
「増幅」とは、ポリヌクレオチド配列が、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、及びリガーゼ連鎖反応によってコピーされ、したがって、より多くの数のポリヌクレオチド分子へと拡大される任意の手段のことをいう。
「プライマー」とは、指定されたポリヌクレオチドテンプレートと特異的にハイブリダイズすることができ、かつ、相補的ポリヌクレオチドの合成開始点を提供することができるポリヌクレオチドのことをいう。ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチドテンプレート、及び重合のための物質、例えばＤＮＡポリメラーゼの存在下に置かれたときに、かかる合成が生じる。プライマーは通常、一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは通常、デオキシリボ核酸であるが、広範な合成及び天然のプライマーが多くの用途において有用である。プライマーは、合成開始のための部位として機能するためにハイブリダイズするように設計されたテンプレートに対して相補的であるが、必ずしもテンプレートの実際の配列を反映していなくてもよい。そのような場合、プライマーのテンプレートへの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件の厳密性に依存する。プライマーは、例えば、発色団、放射性成分、又は蛍光成分を用いて標識することができ、検出可能な成分として使用することができる。
ポリヌクレオチドに関して使用する場合、「プローブ」とは、別のポリヌクレオチドの指定された配列に対して特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドのことをいう。プローブは、標的とする相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするが、必ずしもテンプレートの実際の相補的な配列を反映していなくてもよい。そのような場合、プローブの標的への特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件の厳密性に依存する。プローブは、例えば、発色団、放射性成分、又は蛍光成分を用いて標識することができ、検出可能な成分として使用することができる。
その配列が第１の配列であるポリヌクレオチドと、その配列が第２の配列であるポリヌクレオチドとが、特異的にハイブリダイズする場合、第１の配列は第２の配列に対して「アンチセンス配列」である。
「〜に特異的にハイブリダイズする」又は「特異的ハイブリダイゼーション」又は「〜に選択的にハイブリダイズする」とは、その配列が複雑な混合物（例えば、全細胞の）中のＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列と優先的に核酸配列が結合すること、二本鎖を形成すること、又はハイブリダイズすることをいう。
用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブが、その標的とするサブ配列には優先的にハイブリダイズし得るが、その他の配列に対しては、より少ない程度でしかハイブリダイズしないか、又は全くハイブリダイズしない条件のことをいう。サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験の状況における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメーターの下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ-Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔＩ ｃｈａｐｔｅｒ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見られる。通常、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨの下、特定の配列に対する熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度及びｐＨの下で）標的配列の５０％が、完全に対合するプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴｍと同じになるように選択される。
サザン又はノーザンブロットのフィルター上に、１００個より多い相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％のホルマリン中、４２℃にて、一晩、ハイブリダイゼーションを行うものである。非常にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌ、７２℃にて、約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×のＳＳＣで、６５℃にて、１５分間の洗浄である（ＳＳＣバッファーの説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照されたい）。多くの場合、厳密性の高い洗浄は、背景のプローブシグナルを除去するために、厳密性の低い洗浄に先行される。例えば、１００個よりも多いヌクレオチドの二本鎖形成のための中程度な厳密性での洗浄の例は、１×ＳＳＣで、４５℃にて、１５分間である。例えば、１００個よりも多いヌクレオチドの二本鎖形成のための厳密性の低い洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣで、４０℃にて、１５分間である。一般的に、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいては、関連しないプローブについて観察される値と比較して、ノイズに対するシグナルの比は２倍（又はより高い）である。
「ポリペプチド」とは、アミノ酸、関連する天然の構造変異体、及びペプチド結合を介して連結している、合成の、天然には存在しないそのアナログから構成されるポリマーのことをいう。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。用語「タンパク質」とは通常、大きなポリペプチドのことをいう。用語「ペプチド」とは通常、短いポリペプチドのことをいう。
ポリペプチド配列を表すために、本明細書においては従来の表記が使用される：ポリペプチド配列の左端がアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右端がカルボキシ末端である。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
「アレル変異体」とは、同じ遺伝子座を占めている、任意の２つ又はそれ以上の多型の遺伝子のことをいう。アレル変異体は自然には突然変異により生じ、集団内において表現型の多型を生じ得る。遺伝子の変異はサイレント変異である場合もあり（コードされたポリペプチドにおける違いが存在しない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。「アレル変異体」とは、遺伝子のアレル変異体のｍＲＮＡ転写産物から誘導されたｃＤＮＡ、並びに、それによってコードされるタンパク質のことをも称する。
「ＲＡＰ変異体」とは、任意の２つ又はそれ以上の多型のα−２−マクログロブリン／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質結合タンパク質１（ＲＡＰ）、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション Ｐ３０５３３、Ｐｆａｍアクセッション番号 ＰＦ０６４００及びＰＦ０６４０１）のことをいう。変異体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸とその他のアミノ酸との置換を伴う１つ又はそれ以上の変異に基づき、それらのアミノ酸配列の組成が異なる。置換は、置換されるアミノ酸と置換するアミノ酸との物理化学的又は機能的関連性に基づき、保存的又は非保存的であり得る。
「選択性」、「結合選択性」又は「選択的に結合する」とは、異なる受容体へのリガンドの親和性の相違のことをいう。その他の受容体と比較して、リガンドが少なくとも３倍高い親和性でその受容体と結合する場合、リガンドはその特定の受容体に対して選択的である。例えば、ＲＡＰは、ほとんど同じ親和性でＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ソルチリン、ａｐｏＥＲ２及びＶＬＤＬＲと結合する。したがって、ＲＡＰはこれらの受容体のうちの１つに対し、別のものを超えて選択的ではない。しかしながら、ＲＡＰは、５ｎＭ未満の解離定数でＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ソルチリン、ａｐｏＥＲ２及びＶＬＤＬＲと強力に結合する一方で、ＬＲＰ１に対する場合と比較して少なくとも１０倍低い親和性を有して、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ５及びＬＲＰ６とは弱くしか結合しない。したがって、ＲＡＰは、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ５及びＬＲＰ６に対する場合と比較して、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ソルチリン、ａｐｏＥＲ２及びＶＬＤＬＲに対して選択的である。ＨＲＶ２コートタンパク質はＶＬＤＬＲと強力に結合するが、その他のＬＤＬＲとは結合しない。したがって、ＨＲＶ２コートタンパク質は、その他のＬＤＬＲと比較してＶＬＤＬＲに対して優先的に、その結合において選択性を示す。リーリンはａｐｏＥＲ２及びＶＬＤＬＲと結合するが、その他のＬＤＬＲとは結合しない。したがって、リーリンは、その他のＬＤＬＲと比較してａｐｏＥＲ２及びＶＬＤＬＲに対して選択的である。
２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列からなる状況において用語「同一である」又は「パーセント同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて又は目視により測定して、最大限に一致するように比較及び整列させた場合に、同じである、又は、同じである特定のパーセントのヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する、２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列のことをいう。
２つの核酸又はポリペプチドからなる状況において、語句「実質的に相同である」又は「実質的に同一である」とは、通常、以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、又は、目視により測定して、最大限に一致するように比較及び整列させた場合に、少なくとも４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９８％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列のことをいう。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基長である配列の領域にわたり、より好ましくは、少なくとも約１００残基からなる領域にわたり存在し、最も好ましくは、少なくとも約１５０残基にわたり配列が同一である。最も好ましい実施形態において、比較するバイオポリマーのいずれか又は両方の全長にわたり、実質的に同一である。
配列比較のために、通常は、１つの配列が、試験配列と比較する参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、サブ配列の配位を指定し、次に、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的ホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性のための検索方法により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のコンピューターによる実施により、又は目視により行うことができる。
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関係性及びパーセント配列同一性を示すために、連続的な対となるアラインメントを用いて、関連する配列群から複数の配列アラインメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを作成するために使用したクラスタリング関係を示す系図又は樹形図もプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の連続アラインメント方法の単純化したものを使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）に記載された方法と類似している。このプログラムは最大３００配列、それぞれ最長５，０００ヌクレオチド又はアミノ酸のアラインメントを行うことができる。複数のアラインメント手順は、２つの最も類似する配列の対となるアラインメントから開始され、これにより２つのアラインメントされた配列のクラスターが得られる。このクラスターを、次に最も関連する配列又はアラインメントされた配列のクラスターと共に整列させる。２つのクラスターの配列を、２つの別個の配列の対となるアラインメントの単純な延長によって整列させる。最終的なアラインメントは、一連の連続的な対とするアラインメントにより達成される。配列比較のための領域に対する特定の配列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチドの位置を指定することによって及びプログラムのパラメーターを指定することにより、プログラムが実行される。例えば、参照配列は、パーセント配列同一性との関連性を調べるために、以下のパラメーターを用いて、その他の試験配列と比較することができる：デフォルトのギャップ加重（３．００）、デフォルトのギャップ長加重（０．１０）、及び加重された末端ギャップ。配列の複数のアラインメントを作成するのに有用な別のアルゴリズムは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０，１９９４）である。
パーセント配列同一性及び配列類似性を測定するために適当なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの語句とアラインメントさせた場合に、対合するか又はある正の値の閾値スコアＴを満たすクエリー配列中の長さの短い語句Ｗを同定することにより、最初に高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を伴う。Ｔは近傍語スコア閾値と呼ばれる。これらの初期の近傍語のヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを探すための検索を開始する種として機能する。累積的なアラインメントスコアが増加し得る限り、語句のヒットは各配列に沿って両方向で拡大される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチングする残基対に対する報酬的スコア；通常＞０）及びＮ（ミスマッチングする残基に対するペナルティー的スコア；通常＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、採点マトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向における語句のヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘが下降した場合；１つ又はそれ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積により、累積スコアがゼロ又はそれ未満となった場合；より負のスコアの残基のアラインメントが行われた場合；又は各配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対する）は、デフォルトの語句の長さ（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方のヌクレオチド鎖の比較を利用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、語句の長さ（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ
Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９参照）を利用する。
パーセント配列同一性の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性についての統計的分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７，１９９３参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つは最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これによって２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の対合が偶然に起こる確率の指標が提供される。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した時の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合には、その核酸は参照配列と類似しているとみなされる。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドとの免疫交差反応性を有することである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみが異なる場合、ポリペプチドは通常、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、本明細書において記載されるようなストリンジェントな条件下で、２つの分子が互いにハイブリダイズすることである。
「実質的に純粋である」又は「単離されている」とは、目的とする種が優勢な種として存在し（すなわち、モル濃度を基準として、組成物中の任意のその他の個別の巨大分子種よりも多い）、実質的に精製された画分が、目的とする種が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル濃度を基準とする）を含む組成であることを意味する。通常、実質的に純粋な組成物とは、組成物中に存在する巨大分子種の約８０％〜９０％又はそれ以上が、精製された対象種であることを意味する。組成物が実質的に単一の巨大分子種から構成される場合には、目的とする種は実質的に均一に精製される（従来の検出方法によっては、汚染物質種は組成物中に検出することができない）。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定化剤（例えば、ＢＳＡ）、及び基本的なイオン種は、本定義の目的に対する巨大分子種とはみなされない。いくつかの実施形態において、本発明の複合体は実質的に純粋であるか、又は単離されている。いくつかの実施形態において、本発明の複合体又は本発明のＣＲ特異的抗体は、それらの合成に使用される巨大分子出発物質に対して、実質的に純粋であるか又は単離されている。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、実質的に精製された又は単離されたＲＡＰ変異体ポリペプチドの複合体及び活性物質、又は１つ若しくはそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と混合させた、実質的に精製され又は単離されたＣＲ特異的抗体を含む。
対象について適用する場合、「天然である」とは、その対象が天然において見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源から単離可能な生物（ウイルスを含む）中に存在し、実験室でヒトによる意図的に修飾を受けていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然である。
「検出」とは、サンプル中の分析対象の存在、非存在、又は量を調べる工程のことをいい、サンプル中の又はサンプル中の細胞あたりの分析対象の量を計ることを含み得る。
「検出可能成分」又は「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段により検出可能な組成物のことをいう。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるもの）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、抗血清又はモノクローナル抗体のために利用可能なハプテン及びタンパク質、又は標的に対して配列相補性を有する核酸分子等が挙げられる。検出可能成分は、サンプル中で結合した検出可能成分の量を計るために使用され得る測定可能なシグナル、例えば、放射性、発色性、又は蛍光性のシグナルを発生することが多い。検出可能成分は、例えば、放射性ヌクレオチドの取り込み、又はストレプトアビジンによって認識されるビオチン化ヌクレオチド等のように、プライマー又はプローブ中に取り込ませるか、又はそれらと共有結合によって、又はイオン結合、ファン・デル・ワールス結合若しくは水素結合によって結合させることができる。検出可能成分は、直接的又は間接的に検出可能であり得る。間接的な検出には、第２の直接的又は間接的に検出可能な成分の検出可能成分との結合を伴い得る。例えば、検出可能成分は、ストレプトアビジンの結合パートナーであるビオチン、又は特異的にハイブリダイズし得る相補的配列の結合パートナーであるヌクレオチド配列のように、結合パートナーのリガンドであり得る。結合パートナー自体は直接的に検出可能であってもよく、例えば、抗体自体が蛍光分子を用いて標識されていてもよい。結合パートナーは間接的に検出可能でもあり、例えば、相補的ヌクレオチド配列を有する核酸は、一方で、その他の標識された核酸分子とのハイブリダイゼーションにより検出可能な分枝鎖状ＤＮＡの一部であることができる。（例えば、ＰＤ．Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒ及びＡ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：１１６５を参照されたい。）シグナルの定量は、例えば、シンチレーション計数、デンシトメトリー、又はフローサイトメトリーによって達成される。
「リンカー」とは、２つのその他の分子を、共有結合によって、又はイオン結合、ファン・デル・ワールス結合若しくは水素結合によって連結する分子のことをいい、例えば、５’末端において１つの相補的配列にハイブリダイズし、３’末端において別の相補的配列にハイブリダイズする核酸分子は、すなわち、２つの非相補的配列を連結する。
（Ｂ． ＬＤＬＲ）
「ＬＤＬＲ」とは、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）を含む低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーのことをいう。ＬＲＰ１は４５２５アミノ酸（６００ｋＤａ）からなる大きなタンパク質であり、フリンによって切断されることにより、非共有結合的に結合している５１５−（α）ｋＤ及び８５−（β）ｋＤａの、２つのサブユニットを生成する。ＬＲＰは、ほとんどの組織タイプで発現されるが、主として肝臓で見られる。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ファミリーのその他のメンバーには、ＬＤＬ−Ｒ（１３２ｋＤａ）；ＬＲＰ２（メガリン、ｇｐ３３０）；ＬＲＰ／ＬＲＰ１及びＬＲＰ１Ｂ（６００ｋＤａ）；ＶＬＤＬ−Ｒ（１３０ｋＤａ）；ＬＲＰ５；ＬＲＰ６；ａｐｏＥＲ−２（ＬＲＰ−８、１３０ｋＤａ）；モザイクＬＤＬ−Ｒ（ＬＲ１１、２５０ＫＤａ）；並びに、ＬＲＰ３、ＬＲＰ６及びＬＲＰ−７の等のその他のメンバーが挙げられる。このファミリーの特性には、細胞表面での発現；細胞外のリガンド結合の繰り返し（ＤｘＳＤＥ）；リガンド結合のためのＣａ＋＋の要求；ＲＡＰ及びａｐｏＥの結合；ＥＧＦ前駆物質相同ドメインの繰り返し（ＹＷＴＤ）；単一膜のスパンニング領域；細胞質ドメイン中の内在性シグナル（ＦＤＮＰＸＹ）；及び、受容体に介在される、各種リガンドのエンドサイトーシスを含む。ＬＲＰ１、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ａｐｏＥＲ２及びＶＬＤＬＲを含むファミリーのうちいくつかのものは、シグナル伝達経路に関与する。
ＬＤＬＲリガンドとは、ＬＤＬＲと結合することが知られている多くの分子のことをいう。これらの分子には、例えば、ラクトフェリン、ＲＡＰ、リポプロテインリパーゼ、ａｐｏＥ、第ＶＩＩＩ因子、β―アミロイド前駆物質、α−２−マクログロブリン、トロンボスポンジン２、ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテアーゼ−２）、ＭＰＰ−９−ＴＩＭＰ−１（マトリックスメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤）；ｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター）：ＰＡＩ−Ｉ（プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１）：ｕＰＡＲ（ｕＰＡ受容体）；及び、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）：ＰＡＩ−１：ｕＰＡＲを含む。
ＬＲＰ１は多機能の受容体であると信じられている。ＬＤＬ受容体において見出されるものに類似した結合繰り返しが、以前は無関係であると考えられた様々なリガンドと結合し得るための重要な分子である。これらには、次のものに加えて、上記段落に記載されたリガンドが含まれる：シュードモナス外毒素Ａ、ヒトライノウイルス、ラクトフェリン及び受容体結合タンパク質（ＲＡＰ）。Ｍｅｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，３６０：７０−７４（１９９５）を参照されたい。ＬＲＰ１は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ１３９１６、及び、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰｒｉｍａｒｙアクセッション番号：Ｑ０７９５４を有する。ＬＲＰ１遺伝子／タンパク質の別の名前としては、次のものが挙げられる：低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１［前駆物質］、ＬＲＰ、α−２−マクログロブリン受容体、Ａ２ＭＲ、アポリポタンパク質、Ｅ受容体、ＡｐｏＥＲ、ＣＤ９１、ＬＲＰ１又はＡ２ＭＲ。
ＬＤＬＲは、各受容体のＮ末端の細胞外ドメイン（すなわち、エクトドメイン）内に保存されたタンパク質ドメインによって、様々の細胞外リガンドと結合する。これらのドメインには、相補的な形式の繰り返し（ＣＲ、又は低密度リポタンパク質受容体ドメインクラスＡ、ｌｄｌ−ａ）、ＥＧＦ様繰り返し及びＹＷＴＤ、又はベータプロペラ、ドメインが含まれる。各ドメインの発現及び配列は個々の特定のＬＤＬＲに応じて変化する。ＣＲドメインは、同定されている大部分のリガンドとの結合を担う。ＣＲ配列は、ＬＤＬ受容体様モジュール（ＳＣＯＰ用語）と名付けられた、保存されている折り畳み構造を特定する。約３６個のアミノ酸からなる各々のＣＲは、１−３、２−５、４−６配置において３つの分子内シスチンを形成する６個のシステイン、及び、二葉性ループの一葉内に結合しているカルシウムイオンを含む（図１）。ＬＤＬＲ（７つのＣＲドメインを有する）、ＬＲＰ１（ＣＲ３、７及び８）、ＶＬＤＬＲ（ＣＲ３、ヒトライノウイルス２と結合している）及びウズラＴＶＡ受容体（単一のＣＲ）の構造的研究によって示されるように、ＣＲの折り畳み構造は、明確でコンパクトな構造を表す。シスチンとは別に重要な構造的役割を担うＣＲ内のその他のアミノ酸には、カルシウムによるキレート化に関与する４つの酸性残基、及びカルシウム結合ループの一葉の下方及び後方に密集する１対の保存的疎水性残基（通常Ｆ及びＩ）を含む。共通するカルシウム結合ループ配列は、ループの１つの面を形成する位置Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤによって与えられる側鎖と、シスチンを形成するシステインのうちの１つ（番号４）を表わすｃとを有する、ＡｘｃＢｘＣｘＤ（図１）である。結晶構造において示されるように、位置Ｂ及びＤのアスパラギン酸塩（カルボン酸塩）、アスパラギン（カルボキシアミド）又はグルタミン酸塩（カルボン酸塩）は、側鎖を介してカルシウムによるキレート化に直接関与する（カルシウムによるキレート化に直接関与するその他２つの酸性側鎖は、位置Ｄに対するＣ末端の約６残基の位置によって与えられる）。位置Ａ及びＣにおける主鎖のカルボニルもカルシウムによるキレート化に関与するが、これらの残基の側鎖はループ面から溶媒中に突き出している（図１）。重要なことに、これまでに言及された構造データは、ＣＲの折り目構造がＡ及びＣを含む多くの位置でのアミノ酸置換に寛容であることを示す（図１及び２）。
ＬＤＬＲファミリーのメンバーは、毛細管内皮、並びにニューロン及び星状細胞（例えば、ＬＤＬ受容体、メガリン、ＬＲＰ１）を含むＣＮＳ細胞型で良好に発現される。ＬＤＬ受容体ファミリーは、結合したリガンドをエンドサイトーシスし、腎臓、甲状腺中の局在化された上皮細胞を通って、脳内の毛細管内皮細胞を通過して、リガンドをトランスサイトーシスすることが示されている。したがって、ＬＤＬＲは、異なる組織において異なるレベルで発現された、構成的及び機能的に関連する受容体のプールを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、このメンバー及びその他のタンパク質ファミリー（及び、特にこれらのファミリーのメンバーを発現している細胞、組織、及び器官）と優先的に結合し、それによってそれらを標的とする、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体を使用する。例には、筋肉組織におけるＶＬＤＬＲ、神経組織におけるＬＲＰ１Ｂ、腎臓及び神経組織の両方におけるメガリン並びに血管平滑滑筋組織におけるＬＲＰ１等を含む。
（Ｃ． 受容体結合タンパク質（ＲＡＰ））
小胞体シャペロンタンパク質である受容体結合タンパク質（ＲＡＰ）は、ほとんどのＬＤＬＲ内のＣＲ配列と結合する。ＲＡＰは、分泌経路におけるＬＤＬＲの折り畳みを補助し、ＬＤＬＲに対する全てのその他の公知のリガンドの結合に拮抗する（Ｂｕ，（２００１）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌ ２０９，７９−１１６）。ＲＡＰの詳細な構造情報が欠如しているにもかかわらず、ＣＲの折り畳み構造とＲＡＰとの結合は、受容体結合アッセイ、熱量計算及び突然変異生成の組み合わせによって、広範囲に特徴づけられている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０，１５４０８−１５４１７；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，２１０１７−２１０２４；Ｍｉｇｌｉｏｒｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，１７９８６−１７９９２；Ｎｅｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，３１３０５−３１３１１；Ｈｏｒｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，１３６０８−１３６１３））。ＲＡＰのポリヌクレオチドとポリペプチドの配列は、図面とともに提出された補足資料の項目に示されている。
ＲＡＰは、３個のわずかに相同である一連のドメインから構成されている（Ｏｂｅｒｍｏｅｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，１０７６１−１０７６８）。これらのドメイン（ｄ１、ｄ２及びｄ３）の各々は、ＬＤＬＲ細胞外ドメイン内の直接隣接したＣＲ配列の対と、異なる親和性で結合することが示されている。折り畳みを容易化すること、及び、多くのその他のリガンド（α−２−マクログロブリン以外）との結合を阻害すること等を含むＬＤＬＲに及ぼす全長ＲＡＰの各効果は、ＲＡＰｄ３単独によって概括される。ＲＡＰ ｄ３は、成熟Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３のアミノ酸２００−３２３及び前駆物質Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３のアミノ酸２３４−３５７を含む。さらに、ＣＲ対に対して最も高い親和性を示すＲＡＰｄ３、及び、より低い親和性のＲＡＰｄ１は、両方とも、カルシウム結合ループ内で、芳香族及び酸性残基がそれぞれに位置Ａ及びＣを占めるＣＲ配列に対して、強い優先性を示す。より具体的には、両方のＲＡＰドメインは、これらの部位でトリプトファンとアスパラギン酸塩を好む。ｄ１及びｄ３の結合熱力学における顕著な相違、言い換えれば、ＣＲ対と各ドメインの複合体形成における顕著な相違があるにもかかわらず、この共有の優先性が存在する（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０，１５４０８−１５４１７）。特定のＣＲ対（ＬＲＰ１ ＣＲ５及びＣＲ６、又はＬＲＰ１ＣＲ５６）の第２のＣＲ配列における位置Ａのセリンをトリプトファンと置換することは、ＲＡＰｄ３との親和性を少なくとも３桁低下させ；同じＣＲに対するＲＡＰｄ１の結合は、この置換後には検出できない。対照的に、カルシウム結合ループの面に寄与しない非保存的な位置での置換は、ＲＡＰ又はＲＡＰサブドメインの結合に対して効果を及ぼさないことが示された。
ヒトＬＲＰ１の第２のリガンド結合ドメインは、８個の連続するＣＲユニットから構成される。７つの可能性を有する隣接するＣＲ対の各々は、別個に発現され、ＲＡＰｄ３との結合に関してアッセイされる（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，２１０１７−２１０２４）。第２のＣＲのＡ及びＣの位置に好ましくない残基を含む、最後の対（ＣＲ９とＣＲ１０）を除き、全ての対は同様の親和性（１〜５ｎＭ）でＲＡＰと結合する。これらの対の配列比較を用いて、中立のＲＡＰに対する位置を特定することができる。高い親和性でＲＡＰと結合することも示されているＶＬＤＬＲ由来のＣＲ対を含むことにより、比較力は増大し得る（Ｍｉｋｈａｉｌｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１２（Ｐｔ １９），３２６９−３２８１）。全ての先に記載された保存的構造の残基、並びに位置Ａ及びＣを考慮から差し引いたところ、厳密ではないが、さらなる１つの位置のみが強度の保存性を示している。この部位は、カルシウム結合ループ中の位置ＢとＣを分離し、ループの最大屈曲点を表す。ペプチドが湾曲している位置での、このアミノ酸の出現率が高く、この残基により独特の主鎖の屈曲性がもたらされることに基づくと、ここでグリシンが優先されるということは、予測されないことではない。ＣＲの折り畳みを構造的に完全なものとするために要求される保存的位置とは別に、保存的でない位置Ａ及びＣが、ＲＡＰとの複合体形成において最大の役割を果たすことが、この分析によって示唆される。
低ｐＨにおいてそれ自体がベータプロペラ状に複合体化（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）化されているＬＤＬＲ ＣＲ配列、並びに、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）のキャプシドと複合体化されているＶＬＤＬＲ ＣＲ３の結晶構造は、ＣＲ対の主要な位置間の結合とＲＡＰ内の相補的位置の性質に関するいくつかの情報を提供する（１１、４７）。それは、あたかも、位置Ａのトリプトファンと位置Ｃの酸性アミノ酸とが協調してリガンド配列（ベータプロペラ又はＨＲＶ２キャプシドタンパク質）内の単一のリジンと結合しているかのように見える。トリプトファンはリジン側鎖の脂肪族部分に対して疎水的に集まる一方、カルボン酸塩は同じプロトン化されたアミンと塩橋を形成する。各ＣＲ対内の２つのＡ／Ｃ対及び各ＲＡＰ ｄ３内の２つの重要なリジンの存在によって、２つのかかる相互作用がＣＲ−ＲＡＰ複合体を規定し得ることが示唆される。複合体のさらなる安定化は、ｄ３内の２つの塩基性の「パッチ」及び各ＣＲの負に帯電したカルシウム結合部位の結合から生じ得る。このモデルは最近確認された（４８）。主要な相互作用の、その他のタイプの相互作用との置換は、第２の相互作用が同じまま残るか、わずかに変化することを可能にし得る。かかる置換は、Ａ及びＣがそれぞれトリプトファン及びアスパラギン酸／グルタミン酸以外のアミノ酸を有する、ＣＲ対と結合するＲＡＰ変異体の産生を可能にし得る。多くのそのような固有のＣＲ対が、全てのＬＤＬＲ及びその他のＣＲ含有タンパク質に見られることから、通常と異なるＡ／Ｃ優先性を有するＲＡＰ変異体は、特定の受容体と選択的に結合する可能性が高い。
Ｐｆａｍデータベース（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯによって維持されている）内の全ＣＲ対の比較によって、両方の主要な位置Ａ及びＣにおいて多様な置換が存在し、これらの位置（Ａ、Ｃ、Ａ’、Ｃ）においてアミノ酸の独特の組み合わせを有するＣＲ対が、ＬＤＬＲ（ＰＯ１１３０）、ＬＲＰ１（Ｐ９８１５７）、ＬＲＰ１Ｂ（Ｑ９ＮＺＲ２）、ＬＲＰ２（Ｐ９８１６４）、ＬＲＰ３（Ｏ７５０７４）、ＬＲＰ４（Ｏ７５０９６）、ＬＲＰ５（Ｏ７５１９７）、ＬＲＰ６（Ｏ７５５８１）、ＬＲＰ８（Ｏ１４１１４）、ソルチリン（Ｑ９２６７３）、ＬＲＰ１Ｏ（Ｑ７Ｚ４Ｆ１）、ＬＲＰ１１（Ｑ８６ＶＺ４）、ＬＲＰ１２（Ｑ９Ｙ５６１）、及びＶＬＤＬＲ（Ｐ９８１５５）等の全てのヒトＬＤＬＲ３において見られ得ることが示される。その他のＣＲ含有タンパク質には、ＴＡＤＧ−１５（ＳＴ１４／マトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰｌ）、Ｑ６ＩＣＣ２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号）、Ｑ６ＰＪ７２、Ｑ７６Ｂ６１、Ｑ７ＲＴＹ８、Ｑ７Ｚ７Ｋ９、Ｑ８６ＹＤ５、Ｑ８ＮＡＮ７、Ｑ８ＮＢＪ０、Ｑ８ＷＷ８８、Ｑ９６ＮＴ６、Ｑ９ＢＹＥ１、Ｑ９ＢＹＥ２、Ｑ９ＮＰＦ０及びｃｏｒｉｎ等の膜貫通セリンプロテアーゼファミリーを含む。このタンパク質の表示は、受容体のＵｎｉｐｒｏｔデータベースの表示を反映している。
従前の研究により、野生型ＲＡＰは、これらの非標準的なＣＲ対に対して生理学的に関連する親和性を有し得ないことが示唆されている。
（Ｄ． 抗体）
本発明は、本明細書において記載されるＣＲ含有タンパク質に対して特異的な抗体を意図する。本発明の抗体は、好ましくは一つのＣＲ含有タンパク質（又はＣＲ含有タンパク質のサブセット）と、ＣＲ含有タンパク質ファミリーの別のメンバーとよりも実質的に大きい親和性（例えば、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍又は２０倍以上の親和性）で結合し、好ましくは一つのＣＲ含有タンパク質（又はサブセット）と、ファミリーの全てのその他のメンバーとよりも実質的に大きい親和性で結合する抗原に対して「特異的」、「特異的に結合する」又は「選択的」である。本発明の抗体は、ＣＲ含有タンパク質を標的とするために、少なくとも１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、又は１０−１１Ｍ又はそれ以上の親和性（Ｋｄ）によって特徴付けられ得る。かかる親和性は、従来の技法、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置の使用によって、又は放射標識された標的抗原を使用するラジオイムノアッセイによって、容易に決定し得る。親和性のデータは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９）の方法によって分析し得る。
用語「抗体」は、最も広い意味において使用され、完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、抗原と結合し得る抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ））、及び、所望の生物学的活性を示す範囲で前記のものを含む組み換えペプチドが含まれる。化学的に誘導された抗体を含む、完全な分子及び／又は断片のマルチマー及び凝集体が意図される。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２等の任意のアイソタイプクラス又はサブクラスの抗体が意図される。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する；例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプは抗体依存性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。「免疫グロブリン」又は「天然の抗体」は、２つの同一のポリペプチド鎖（２つの「軽」鎖及び２つの「重」鎖）対から構成される四量体の糖タンパク質である。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う、約１００〜１１０個又はそれ以上のアミノ酸からなる「可変」（「Ｖ」）領域を含む。この可変領域内において、「超可変」領域又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ
Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されるような、軽鎖可変ドメインにおける残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインにおける３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２の（Ｈ３）及び／又は超可変ループ（すなわち、［Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］に記載されるような、軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１の（Ｈ３））由来の残基からなる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定している。
本明細書において使用する場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一の抗体の集合から得られた抗体、すなわち、ハイブリドーマから得られるにしろ、組み換えＤＮＡ技術から得られるにしろ、少量で存在し得る潜在的な天然の突然変異又はそれに代わる転写後修飾を除いて同一である集合を含む、個々の抗体のことをいう。モノクローナル抗体の非限定的な例は、マウス、キメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体、又はそれらの変異体もしくは誘導体を含む。抗体配列を、よりヒトに類似するようにヒト化又は修飾することについては、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ ５２５ （１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１ ６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５ ９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ １５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ． ２８：４８９ ４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９ ２１７（１９９４）；及び、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，ＣＡ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ４（７）：７７３ ８３（１９９１）；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５−８１４（１９９４）に記載されており、各々を参照として本明細書中に取り入れるものとする。ヒトモノクローナル抗体を単離する１つの方法は、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号、及びＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載されており、各々を参照として本明細書中に取り入れるものとする。ヒトモノクローナル抗体を単離する別の方法は、内因性の免疫グロブリンの生産を行っておらず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されているトランスジェニック動物を使用する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９６／３４０９６号、国際公開第９８／２４８９３号、又は米国特許出願第２００３０１９４４０４号、米国特許出願第２００３００３１６６７号又は米国特許出願第２００２０１９９２１３号を参照されたい。各々を参照として本明細書中に取り入れるものとする。
抗体断片は、組み換えＤＮＡ技術によって、又は完全な抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって生じ得る。「抗体断片」は、完全な全長抗体の一部分、好ましくは完全な抗体の抗原結合又は可変領域を含み、抗体断片から形成される多重特異性（二重特異性、三重特異性等）抗体を含む。抗体断片の非限定的例は、含んでいる、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ［可変領域］、ドメイン抗体（ｄＡｂ）［Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９］、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）［Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８，及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３，１９８８、場合によっては、ポリペプチドリンカーを含み；場合によっては、多重特異性のもの、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８（１９９４）］、一本鎖抗体断片、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）［欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）］、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）［Ｏｌａｆｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３］、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）［Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；キレート組み換え抗体［Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５］、三重特異性抗体（ｔｒｉｂｏｄｙ）又は二重特異性抗体（ｂｉｂｏｄｙ）［Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００；Ｗｉｌｌｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３］、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）［Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１，２００４］、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）［Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３−５７，２００４］、小モジュール性免疫医薬（ＳＭＩＰ）［国際公開第０３／０４１６００号、米国特許公開第２００３０１３３９３９号及び米国特許公開第２００３０１１８５９２号］、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体［Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１；Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３６２８−３６，２００２；米国特許公開第２００５０１３６０４９号及び同第２００５００３７４２１号］、ＶＨＨ含有抗体、又はそれらの変異体又は誘導体、並びに、抗体が所望の生物学的活性を保持しながら、ＣＤＲ配列等のポリペプチドに対して特異的な抗原が結合するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも１部分を含むポリペプチド抗体を含む。
抗体に関連して使用する場合、用語「変異体」とは、その変異体が所望の結合親和性又は生物学的活性を保持するという条件で、可変領域又は可変領域に相当する部分に少なくとも１個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む抗体のポリペプチド配列のことをいう。さらに、本発明の抗体は、半減期又はクリアランス、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性等の抗体のエフェクター機能を修飾するために、定常領域中にアミノ酸修飾を有し得る。かかる修飾は、例えば、癌を処置する場合に、薬物動態を促進させ得、又は、抗体の有効性を増大させ得る。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。この文献は参照としてその全体を本明細書中に取り入れられるものとする。ＩｇＧ１の場合、定常領域（特に、ヒンジ部又はＣＨ２領域）に対する修飾は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性等のエフェクター機能を増加又は減少させ得る。その他の実施形態において、ＩｇＧ２定常領域は、抗体−抗原凝集体の形成を減少させるために修飾される。ＩｇＧ４の場合、定常領域（特にヒンジ領域）に対する修飾が、半抗体の形成を減少させ得る。
抗体に関連して使用する場合、用語「誘導体」とは、治療又は診断薬との複合体化、標識化（例えば、放射性核種又は各種酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）等の共有結合性ポリマーの結合及び非天然のアミノ酸の化学的合成による挿入又は置換によって共有結合的に修飾されている抗体のことをいう。本発明の誘導体は、本発明の誘導体化されていない分子の結合特性を保持し得る。癌標的抗体と、細胞毒性物質、例えば、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、又は毒素との複合体化は、癌細胞の破壊を増大し得る。
（Ｅ． ＲＡＰ変異体）
本発明は、ＬＤＬファミリー受容体、膜貫通セリンプロテアーゼ受容体及びその他のタンパク質に対して示差的な結合親和性を有するＲＡＰ変異体を意図する。ＲＡＰのランダム及び部位特異的突然変異誘発は、ＣＲ対とリガンド複合体との親和性に不釣り合いに寄与する少数の残基が存在し得ることを示唆する（Ｍｉｇｌｉｏｒｉｎｉ， ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，１７９８６−１７９９２）。特に、ＲＡＰｄ３の位置２５６及び２７０におけるリジンは、このドメインのＬＲＰ１に対する結合に重要であることが分かった。さらに、位置２０５及び２８５をそれぞれ中心とする、２つの別個の１０アミノ酸からなる塩基性領域も重要である（Ｍｅｌｍａｎ， ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６、２９３３８−２９３４６）。これらの知見は、ＲＡＰとＣＲ対との間の大部分の結合エネルギーに寄与し、その他のタンパク質−タンパク質接合部分で観察されている現象である、「ホットスポット」と呼ばれる限られた数の残基の組が存在することと一致している（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）１３，２９７−３０７；Ｈａｌｐｅｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）１２，１０２７−１０３８；Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｏｄｅｌ（Ｏｎｌｉｎｅ）１０，４４−５４；Ｄｗｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０，１３４９１−１３５００；ＤｅＬａｎｏ，（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １２，１４−２０；Ｂｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８０，１−９；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６７，３８３−３８６）。
（ｉ． ＬＲＰ２選択的ＲＡＰ変異体）
ＬＲＰ２は、脳血管内皮で発現され、ａｐｏＪの脳実質への輸送を仲介することが示されている（Ｌｕｎｄｇｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４５，３８３−３９２；Ｚｌｏｋｏｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，４２２９−４２３４；Ｓｈａｙｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６０，ＰＬ１１５−１１８）。その他のＬＤＬＲに対してよりも大きな親和性でＬＲＰ２に選択的に結合する、ＲＡＰ変異体及び抗ＣＲ抗体は、脳への分布が促進されることが予想される。これらの理由のために、ＬＲＰ２と選択的に結合するＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体、及びかかるＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体と複合体化された薬物を含む融合体は、脳への分布が促進されることが予想される。例えば、ＧＤＮＦは、パーキンソン病を患う対象における黒質線条体神経細胞の生存及び成長を促進することが示されている（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０，１１３０−１１３２）。ＧＤＮＦは血管系から脳へと通過しない。ＬＲＰ２選択的ＲＡＰ変異体のＧＤＮＦとの融合体は、ＧＤＮＦの脳への分布を増大させることが予想され得る。
（ｉｉ． ＶＬＤＬＲ選択的ＲＡＰ変異体）
同様に、ＶＬＤＬＲは、脳血管内皮で発現され、大動脈内皮を通過するリポプロテインリパーゼの輸送を仲介することが示されている（Ｗｙｎｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ １６，４０７−４１５；Ｏｂｕｎｉｋｅ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，８９３４−８９４１）。ＶＬＤＬＲと選択的に結合するＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体、及びかかるＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体と複合体化された薬物を含む融合体は、脳への分布が促進されることが予想される。ＶＬＤＬＲはまた、過剰な遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の血管マクロファージへの取り込みを介することにより、泡沫細胞形成に関与している（Ｈｉｌｔｕｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７，１０７９−１０８６；Ｑｕ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２４，１−４，８）。ＶＬＤＬＲと選択的に結合するＲＡＰ変異体及びＣＲ特異的抗体は、リポプロテイン粒子のマクロファージとの会合を阻止し、泡末細胞の形成を阻害するものと思われる。かかる変異体及び抗体は、循環リポプロテインから脂肪細胞へのＦＦＡの移送を制限し、罹病性対象において肥満症への進行を遅らせることも予想され得る（Ｇｏｕｄｒｉａａｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２１，１４８８−１４９３；Ｇｏｕｄｒｉａａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４５，１４７５−１４８１；Ｔａｃｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ １２，２７５−２７９；Ｙａｇｙｕ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，１００３７−１００４３）。筋肉内皮の管腔表面でのＶＬＤＬＲの高レベルの発現は、肝臓でのＶＬＤＬＲの低レベルの発現と同調して、静脈内投与後におけるＶＬＤＬＲ選択的ＲＡＰ変異体及びＣＲ特異的抗体の分布を駆動することが予想され得る。筋肉組織に対して治療的効果を有する分子は、かかる分子の筋肉への分布を向上させるために、ＶＬＤＬＲ選択的ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体と結合され得る。
（ｉｉｉ． その他の受容体に対して選択的なＲＡＰ変異体）
少なくとも３つのＣＲ含有タンパク質、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６及びＳＴ１４（ＴＡＤＧ−１５）の過剰発現は、腫瘍原性又は発癌性の増大と独立的に関連している（。Ｌｉ，ｅｔ
ａｌ．，（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，９１２９−９１３５；Ｈｏａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０９，１０６−１１１；Ｔａｎｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９２，２７８−２８３；Ｓａｎｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１２，１４−２５；Ｓａｎｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ ９８，１８９８−１９０４；Ｔａｎｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ ２２，１０４−１１４）。これらのタンパク質と結合するＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体は、これらのタンパク質の機能を直接妨害することにより、又は、ＲＡＰ変異体もしくは抗ＣＲ特異的抗体に付着した薬物によって、これらのタンパク質を過剰発現する組織を標的とすることにより、それらの腫瘍原性効果を減少させる手段を提供することが予想され得る。例えば、マトリプターゼ（ＳＴ１４）の細胞外ドメイン中のＣＲ配列に隣接するプロテアーゼ領域は、マトリプターゼ（ＳＴ１４）を過剰発現する細胞の浸潤性及び腫瘍原性の増大に関与している。マトリプターゼ選択的ＲＡＰ変異体単独、抗ＣＲ特異的抗体、又はマトリプターゼ選択性のＲＡＰ変異体とプロテアーゼ阻害剤との融合物は、そのタンパク分解活性と関連しているマトリプターゼの効果を特異的に阻止するものと思われる。ＬＲＰ６選択的ＲＡＰ変異体、抗ＣＲ特異的抗体又は変異体融合体は、ＬＲＰ６のエンドサイトーシスを引き起こすことによって、又はＬＲＰ６を介するＷｎｔシグナル変換事象を妨害することによって、腫瘍細胞上のＬＲＰ６を下方制御することができると思われる。同様に、薬物（例えば、癌化学治療薬）又は診断薬と複合体化させたＬＲＰ６選択的ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体を、ＬＲＰ６を過剰表現する組織を標的とするために使用することができる。
ＬＲＰ５を介する、増強されたＷｎｔシグナルは、骨芽細胞の分化を増加し、破骨細胞活性を抑制し、骨沈着を増強することがわかっている（Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｇｅｎｅ ３４１，１９−３９；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４，４６７７−４６８４）。この機序は、骨芽細胞に特異的なＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）ノックアウトマウス、及びＤＫＫ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）−１及びスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）介在性の阻害に対して非感受性のＬＲＰ５突然変異体によって実証されている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４，４６７７−４６８４；Ｈｏｌｍｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）。阻害剤の結合を妨げるか、又はその他の手段（例えば、Ｗｎｔの結合を阻止することなくＬＲＰ５を安定化すること）によってＷｎｔシグナルを増強するＬＲＰ５特異的ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体には同様の効果があると予想されるだろう。例えば、２つのＬＲＰ５ ＣＲ対のいずれかに対して特異的なＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体と、ベータプロペラシャペロンタンパク質Ｍｅｓｄとの融合体は、ＬＲＰ５を介するＷｎｔシグナル伝達におけるＤＫＫ−１介在性の拮抗作用を妨げるものと思われる（Ｈｓｉｅｈ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｅｌｌ１１２、３５５−３６７；Ｈｅｒｚ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｅｌｌ１１２、２８９−２９２）。これらの変異体又は抗体はさらに、骨粗鬆症、又は骨芽細胞活性の縮小及び／又は破骨細胞活性の増加に関連したその他の疾患の処置における治療的効果を有することが予想される。
より一般的な実施形態において、受容体選択的ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体は、単独で又は組み合わせて、受容体が特異的に制御され得る手段を構成する。制御が影響を受け得る、少なくとも以下の４つの機序が存在する：ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体のリガンド結合部位との直接的結合による、リガンド結合の競合的阻害、ＲＡＰ変異体に引き起こされたリガンド結合部位のアロステリック修飾による、リガンド結合の非競合的阻害、同じ又は異なる受容体間で変異体又は変異体融合体により引き起こされる架橋形成後の、細胞表面からの受容体のクリアランス、受容体選択的ＲＡＰ変異体と結合する物質（例えば、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、グリコシダーゼ、放射性同位体、抗アポトーシス薬、毒素、治療分子（薬物）、その他の受容体結合成分等）による、標的とされた受容体又はその受容体が発現される細胞、又はその細胞が存在する組織の修飾。
ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体は、膠細胞由来の神経成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、当該技術分野で知られたその他の神経栄養因子、ＡＤＡＭ１０、ＡＰＰ又はＡβに作用するその他のプロテアーゼ等の治療用タンパク質、ＭＥＳＤ、癌化学療法剤、プロテアーゼ阻害剤、自己免疫抗原、アポトーシス関連分子、リソソーム酵素、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡへと融合され得ることが意図される。ＬＤＬＲ受容体への改善された親和性を備えた、ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体に対するこれらの薬物の融合は、脳血液関門及び他の組織部位を横切る輸送を促進するだろう。１態様において、ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体に対する融合は、静脈内、皮下、筋肉内、脳室内、鞘内又は実質内への投与後に、ＲＡＰ−治療薬融合体の組織分布の変化をもたらすことが意図される。
１以上の以下の効果により引き起こされる、融合パートナーの医薬活性における変化をもたらすＲＡＰ又はＲＡＰドメイン変異体、又は抗ＣＲ特異的抗体に対する融合体がさらに提供される：力価増加、意図された標的受容体又は組織とは異なる受容体又は組織への結合の低減、意図された標的受容体又は組織である受容体又は組織への結合の増加、意図された標的受容体又は組織である受容体又は組織への接近の増加、身体からのクリアランス速度の変化、及び、そのタンパク質に対する免疫応答特性における変化。
該核酸の組織選択的な分布を向上し、かつ、前記核酸の細胞へのエンドサイトーシスを助けるために、ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体を、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ等の治療的核酸へと複合体化し得ることがさらに提供される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５、３２６−３３２）。
（Ｆ． ＲＡＰ変異体及び活性物質の複合体）
「ＲＡＰコンジュゲート」、「リガンド−ポリペプチドコンジュゲート」「活性物質に対しコンジュゲート化されたＲＡＰ変異体を含むキメラ分子」とは、それぞれ、活性物質へと連結されたＲＡＰ変異体を含む化合物をいう。本明細書中で用いる場合、用語「コンジュゲート化された」とは、治療薬及びＲＡＰ変異体ポリペプチド又は抗ＣＲ特異的抗体が、例えば、共有化学結合、ファン・デル・ワールス又は疎水的相互作用等の物理的な力、カプセル化、包埋又はそれらの組み合わせによって連結されていることを意味する。好ましい実施形態において、治療薬及びＲＡＰ変異体ポリペプチド又は抗ＣＲ特異的抗体は、共有的化学結合により物理的に連結される。そのように、好ましい化学的治療薬は、ＲＡＰ変異体又はその断片に対するコンジュゲートの中で使用されるアルコール、酸、カルボニル化合物、チオール又はアミン基等の官能基を含む。アドリアマイシンはアミンクラスに含まれ、同様にカルボニル化合物を介して連結される可能性がある。パクリタキセルはアルコールクラスにある。適切なコンジュゲーション基がない化学療法剤は、そのような基を加えるために、さらに修飾される場合がある。これらの化合物は全てこの発明中で意図される。複数の治療薬の場合には、様々なコンジュゲーションの組み合わせを使用することができる。
いくつかの実施形態において、直接であり得る（介在する原子がない）、又は間接であり得る（例えば共有結合で結合した原子の鎖等のリンカーを通じて）共有結合的な化学結合は、ＲＡＰ変異体、抗ＣＲ特異的抗体及び活性物質を連結する。好ましい実施形態において、ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体及びコンジュゲートの活性物質部分は、ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体の原子及び活性物質の原子の間の共有結合により、直接的に連結される。いくつかの好ましい実施形態において、メガリン結合部分は、ＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体を活性物質へと連結可能な、事実上任意のアミノ酸配列又は任意の分子又は複数原子からなる共有結合又はペプチドを含むリンカーにより、本発明の化合物の活性物質部分へと連結される。
いくつかの実施形態において、リンカーは、１〜約６０、又は１〜３０原子もしくはそれ以上、２〜５原子、２〜１０原子、５〜１０原子、又は１０〜２０原子長の原子鎖を含む。いくつかの実施形態において、鎖原子は全て炭素原子である。いくつかの実施形態において、鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される。鎖原子及びリンカーは、より可溶性のコンジュゲートを提供するために、それらの予期される溶解度（親水性）に従って選択され得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、リゾソーム中で酵素の攻撃に供される官能基を提供する。いくつかの実施形態において、リンカーは、標的組織又は器官で見出された酵素による攻撃に供される官能基を提供し、攻撃又は加水分解は、活性物質及びＲＡＰ変異体又は抗ＣＲ特異的抗体間の結合を切断する。いくつかの実施形態において、リンカーは、標的部位で見出される条件（例えばリゾソームにおける低いｐＨ）下で加水分解に供される官能基を提供する。リンカーは１つ以上のそのような官能基を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーの長さは、ＲＡＰ変異体結合部位及び活性物質活性化部位の１つ又は両方の間での立体障害（活性物質が大きい場合に）の可能性を低減するために十分な長さである。
リンカーが共有結合又はペプチドであり、活性物質がポリペプチドである場合、全体のコンジュゲートは融解タンパク質であり得る。そのようなペプチド性のリンカーは任意の長さであり得る。例示的なリンカーは、約１〜５０のアミノ酸長、５〜５０、又は１０〜３０のアミノ酸長である。このような融合タンパク質は、当業者に公知の組み換え遺伝子工学的な方法により生産することができる。いくつかの実施形態において、コンジュゲートのＲＡＰ変異体部分は、迅速に分解して活性化合物を放出するように設計される。他の実施形態において、リンカーは、細胞内、又は好ましくはリソソーム環境内での開裂に供され、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体ポリペプチド部分からから活性成分を放出する又は分離する。
コンジュゲートは、同一のＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体に連結された１以上の活性成分を含み得る。例えば、コンジュゲート化反応は、１〜５、約５、約１〜１０、約５〜１０、約１０〜２０、約２０〜３０又は３０以上のＲＡＰ変異体ポリペプチドへの活性成分分子をコンジュゲート化し得る。これらの製剤は混合物として使用することができ、又は、それらは特定の化学量論的製剤へと精製される場合もある。当業者は、どのような形態で、どのような化学量論が好ましいかを決定することができる。さらに、標的部位又は画分に対して１以上のタイプの活性成分を送達することが所望される場合、１以上のタイプの活性成分がＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体ポリペプチドに連結され得る。複数の活性成分種が同じＲＡＰ変異体ポリペプチド、例えばアドリアマイシン−シスプラチンＲＡＰ変異体ポリペプチド（又はその他のＲＡＰ変異体）コンジュゲートへと連結され得る。したがって、コンジュゲートは一定範囲の化学量論からなり、１以上のタイプの活性成分を組込み得る。これらもまた、精製された混合物へと分離され得、又は、凝集物中で用いられる場合もあり得る。
本発明のＲＡＰ変異体又はその破片又はＣＲ特異的抗体、コンジュゲートは、その安定性又は薬物動態学的特性（例えば、ＰＥＧ化）を増強することが所望される場合に、修飾され得る。ＲＡＰ変異体ポリペプチド及び活性成分をコンジュゲート化するために好適なリンカー及びそれらの官能基、及び、そのようなものを調製するために容易に適応可能な合成化学的方法は、本出願と同一の譲受人による、米国特許出願第６０／３９５，７６２号中に記載され、参照としてその全体を本明細書中に取り入れるものとする。
これらのコンジュゲートの合成は効率的かつ簡便であり、水溶性が向上した薬剤を高収率で製造する。
（Ｇ． 活性物質）
本発明の活性物質は、生物学的プロセスに影響を及ぼし得る物質を含む。本発明の化合物組成物及び方法で使用される特に好ましい活性物質は、薬剤及び診断用薬を含む治療薬である。用語「薬剤」又は「治療薬」は、治療上有効な量で投与された時に、医薬的活性又は有益な健康状態を与える活性物質をいう。特に好ましい薬剤は、天然の生物学的物質（例えば酵素、タンパク質、ポリヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、ナノ粒子、複合糖質）。いくつかの実施形態中で、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体へとコンジュゲート化される活性物質は、分子ならびに、生存中の宿主の生物学的プロセスを調整することが可能な任意の結合部分又はその断片である。薬剤又は治療薬の例は、疾病又は状態の予防、診断、緩和、処置又は回復に使用される物質を含む。薬剤が疾患を引き起こさない物質であることが特に意図される。具体的には、薬剤は、アミロイドβタンパク質ではない。
（ｉ．タンパク質性の活性物質）
活性物質は、非タンパク質又はタンパク質であり得る。活性物質は、本質的に、タンパク質又は酵素の治療活性又は生物学的活性の実質的に全て又は全てを引き続き維持している、タンパク質又は酵素、又はそれらの任意の断片である。いくつかの実施形態において、このタンパク質又は酵素は、発現されないか産生されない、あるいは発現や産生が実質的に少ない場合には、限定されるものではないが、リソソーム蓄積症等の疾患を生じさせるであろうものである。好ましくは、そのタンパク質又は酵素は、ヒトあるいはマウスに由来し、又はヒトあるいはマウスから得られる。
本発明の好ましい実施例中において、活性物質又はＣＲ特異的抗体へと結合したＲＡＰ又はＲＡＰ変異体ポリペプチドがタンパク質又は酵素、又は、そのタンパク質又は酵素の生物学的活性を保持するその断片である場合、活性物質は、ヒト又は哺乳類のタンパク質又は酵素における対応する部分のアミノ酸配列順序と同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、コンジュゲートの活性物質部分は、ヒト又は哺乳動物の種に固有のタンパク質又は酵素である。他の実施形態において、タンパク質又は酵素又はそのフラグメントは、対応するヒト又は哺乳動物タンパク質又は酵素の相当する生来の配列と実質的に同じ（すなわち、少なくとも長さが１０、２５、５０、１００、１５０、又は２００アミノ酸、又は活性物質の全長にわたり、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、より好ましくは９８％、又は、最も好ましくは９９％同一）である。
活性物質がタンパク質である場合、化合物は、酵素又はその酵素の活性のいくらか、実質的に全て、又は全てを引き続き保持する任意の酵素断片であり得る。好ましくは、リソソーム蓄積症の治療の場合、酵素は細胞中で見出される酵素であり、発現又は産生されないか、実質的に発現が低減された場合にはリソソーム蓄積症を生じさせるであろうものである。好ましくは、酵素はヒト及びマウスに由来する。好ましくは、酵素は、リソソームの貯蔵酵素であるα−Ｌ−イズロニダーゼ及びイズロン酸−２−スルファターゼ、ヘパラン Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アリルスルファターゼ
Ａ、ガラクトシルセラミダーゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、ヘキソサミニダーゼα、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はその他のリソソームの貯蔵酵素である。
従って、いくつかの実施形態において、ヒトリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の処置においては、ＲＡＰ変異体（又はＣＲ特異的抗体−）−活性物質コンジュゲートは、処置される対象又は患者のリソソーム中に欠乏している活性物質タンパク質又は酵素を含む。そのような酵素は、例えば、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ヘパラン Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アリルスルファターゼ Ａ、ガラクトシルセラミダーゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、チオエステラーゼ、ヘキソサミニダーゼ Ａ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、又は任意のその他のリソソーム貯蔵酵素である。リソソーム蓄積症及び、活性物質として有用なそれらにおける欠乏タンパク質に関する表は以下である：
すなわち、本発明の方法を用いて処置され又は予防され得るリソソーム蓄積症は、限定するものではないが、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ Ｔ）、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＭＢ、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、クラッベ、ポンペ、セロイドリポフスチン症、タイ・サックス、ニーマン−ピックＡ及びＢ、及びその他のリソソーム蓄積症を含む。
すなわち、上記の表につき、各疾病について、コンジュゲート化された物質は、好ましくは、その疾病で欠乏している特定の活性物質酵素を含む。例えば、ＭＰＳ Ｉに関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素はα−Ｌ−イズロニダーゼである。ＭＰＳ ＩＩに関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼである。ＭＰＳ ＩＩＩＡに関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素は、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼである。ＭＰＳ ＩＩＩＢに関する方法に関し、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである。異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）に関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素は、アリルスルファターゼである。クラッベ病に関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素は、ガラクトシルセラミダーゼである。ポンペ病に関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素は、酸性α−グルコシダーゼである。ＣＬＮに関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素は、トリペプチジルペプチダーゼである。タイ・サックスに関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素は、ヘキソサミニダーゼαである。ニーマン−ピックＡ及びＢに関する方法に関し、好ましい化合物又は酵素は酸性スフィンゴミエリナーゼである。
ＲＡＰ変異体（又はＣＲ特異的抗体）−活性物質のコンジュゲートは、ＲＡＰ変異体又はそのメガリン結合断片又はＣＲ特異的抗体へと連結された１以上の活性物質部分（例えば、１〜１０又は１〜４又は２〜３の部分）を含むことができる。例えば、コンジュゲート化反応は、１〜４又はそれ以上のα−Ｌ−イズロニダーゼ分子を、単一のＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体へと、ＲＡＰ変異体ポリペプチド分子のようにコンジュゲート化することができる。これらの形成物は混合物として使用することができ、又は、それらを精製して、特定のＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体−薬剤を化学量論的に形成することができる。当業者は、どのような様式及びどの化学量論が好ましいかを決定することができる。さらに、貯蔵された基質がより完全に分解することを助けるために、１以上の活性物質を、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体の任意の所定の分子に連結することができる。これらのＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体は、一定の範囲の化学量論的な比率で構成され得る。これらはまた、精製された混合物へと分離することもでき、あるいは、凝集させた状態で用いることもできる。融合体中のＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体及びＬＳＤの順序は、メガリンに結合するためのメガリン結合部分の能力に対して重要である。したがって、好ましい実施形態において、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体は、ＬＳＤ酵素のコーディング配列に対し、Ｎ末端側に位置する。特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートは、ＬＳＤ酵素コーディング配列に対してＮ末端側に位置するＲＡＰコーディング配列又はＣＲ特異的抗体を含むことが意図される。
ＲＡＰ変異体−（又はＣＲ特異的抗体−）コンジュゲート化された活性物質は、ＣＮＳ存在下、又はＣＮＳ非存在下で、細胞リソソーム内に、入り込み、通過して最終的に留まることができる。コンジュゲート化された薬剤の通過速度は、メガリン結合活性を有する任意の化合物又はタンパク質により調節され得る。好ましい実施形態において、コンジュゲートの非ＬＲＰ１受容体への結合親和性は、ＬＲＰ１への結合親和性よりも高い。細胞は、リソソーム蓄積症に罹患した任意の組織又は器官から得ることができる。細胞は、例えば、内皮、上皮、筋肉、心臓、骨、肺、脂肪、腎臓、又は肝臓細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞はむしろ、ＢＢＢの内部に見出される細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はニューロン又は脳細胞である。他の実施形態において、細胞は、周辺細胞であるか、ＢＢＢのもののような内皮細胞によって全身循環から分離されない細胞である。
（ｉｉ． 薬物活性物質）
通常、薬物活性物質は、任意のサイズをとり得る。好ましい薬剤は、対象の標的に結合可能な小さな有機分子である。コンジュゲートの薬剤部分は、小分子の場合、通常分子量が少なくとも５０Ｄ、通常少なくとも１００Ｄであり、分子量が５００Ｄ以上の場合でも、通常分子量２０００Ｄを超えることはないであろう。
薬剤部分は、主題の方法を実行する間にコンジュゲートが投与される宿主中の標的と相互作用可能なものである。標的がタンパク質、ホスホリピッド、核酸及びその他のものであり得る場合、対象の標的が細胞内及び細胞外の標的を含む場合、その標的は多くの異なるタイプの天然の構造物であり得、タンパク質は特に興味深い。対象の特定のタンパク質の標的は、限定するものではないが、酵素、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、レダクターゼ、シクロオキシゲナーゼ、プロテアーゼ及びその他のものであり、標的はＳＨ２、ＳＨ３、ＰＴＢ及びＰＤＺドメイン等のタンパク質−タンパク質相互作用に関与するドメイン、例えば、アクチン、チューブリンなどの構造タンパク質、例えば、ＩｇＥ等の免疫グロブリン、細胞接着受容体、インテグリン等の細胞膜受容体、イオンチャネル、膜貫通型のポンプ、転写因子、シグナリングタンパク質等を含む。
いくつかの実施形態において、活性物質又は薬剤は、イソシアン酸塩試薬で反応するための水酸基又はアミノ基を有するか、又は、活性物質は、イソシアン酸塩試薬で反応するための水酸基又はアミノ基を導入するために化学的に修飾される。
いくつかの実施形態において、活性物質又は薬剤は、好ましくは、活性物質の所望される生物学的活性を失うことなく、修飾されるか、及び／又は、共有結合に関与し得る領域を含む。薬剤部分はしばしば、環状の炭素又は複素環構造及び／又は、上記の官能基の１つ以上が置換された芳香族又は多環芳香族構造を含む。薬剤分子としての対象の構造は、生体分子、タンパク質、酵素、ポリサッカライド、及びペプチドを含むポリペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造類似体又はそれらの組み合わせの中に含まれて見出される。
好適な活性物質は、限定するものではないが、向精神薬、例えば（１）中枢神経系降下剤、例えば全身麻酔薬（バルビツール酸塩、ベンゾジアゼピン、ステロイド、シクロヘキサノン誘導体及びその他雑多な薬剤）、鎮静催眠薬（ベンゾジアゼピン、バルビツール酸塩、ピペリジンジオン及びトリオン、キナゾリン誘導体、カーバメート剤、アルデヒド類及び誘導体、アミド類、非環性ウレイド、ベンザゼピン類及び関連する薬、フェノチアジン等）、中枢髄意筋調整薬（ヒダントイン、バルビツール酸塩、オキサゾリジンジオン、スクシンイミド、アシルウレイド、グルタルイミド、ベンゾジアゼピン、２級及び３級アルコール、ジベンザゼピン誘導体、バルプロ酸及び誘導体、ＧＡＢＡ類似体等の抗痙攣薬）、鎮痛剤（モルヒネ及び誘導体、オリパビン誘導体、モルフィナン誘導体、フェニルピペラジン、２，６−メタン−３−ベンザゾカイン誘導体、ジフェニルプロピルアミン及び等量式、サリチル酸塩、ｐ−アミノフェノール誘導体、５−ピラゾロン誘導体、アリール酸誘導体、フェナメート及び等量式等）及び鎮吐剤（抗コリン作用薬、抗ヒスタミン剤、抗ドーパミン作動薬等）、（２）中枢神経系刺激物、例えば興奮剤（呼吸刺激薬、けいれん誘発薬、精神運動興奮薬）、麻薬拮抗薬（モルヒネ誘導体、オリパビン誘導体、２，６−メタン−３−ベンゾキサシン誘導体、モルフィナン誘導体）、向知性薬、（３）抗精神薬、例えば抗不安鎮静剤（ベンゾジアゼピン、プロパンジオールカーバメート剤）、抗精神病薬（フェノチアジン誘導体、チオキサンチン誘導体、その他三環化合物、ブチロフェノン誘導体及び等量式、ジフェニルブチルアミン誘導体、置換ベンズアミド、アリピラジン誘導体、インドール誘導体等）、抗うつ薬（三環化合物、ＭＡＯ阻害剤等）、（４）呼吸器官薬、例えば、中枢性鎮咳薬（ケシアルカロイド及びそれらの誘導体）；薬理学的物質、例えば（１）末梢神経系薬、例えば局所麻酔薬（エステル誘導体、アミド誘導体）、（２）シナプス又は神経効果器接合部部位に作用する薬物、例えばコリン作動薬、コリン作動性遮断薬、神経筋肉遮断薬、アドレナリン作動薬、抗アドレナリン作動薬、（３）平滑筋活性化薬、例えば鎮痙剤（抗コリン作用薬、ムスクロトロピックスパスモリティクス（ｍｕｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｃ ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃｓ））、血管拡張剤、平滑筋刺激物、（４）ヒスタミン及び抗ヒスタミン剤、例えば、ヒスタミン及びその誘導体（ベタゾール）、抗ヒスタミン剤（Ｈ１アンタゴニスト、Ｈ２アンタゴニスト）、ヒスタミン代謝薬、（５）心血管剤、例えば強心薬（植物抽出物、ブテノリド、ペンタジエノリド、エリスロフレウム種からのアルカロイド類、イオノフォア、アドレナリン受容体刺激物等）、不整脈治療薬、降圧薬、抗脂血症薬（クロフィブリン酸誘導体、ニコチン酸誘導体、ホルモン及び類似体、抗生物質、サリチル酸及び誘導体）、抗静脈瘤薬、止血剤、（６）血液及び造血形薬剤、例えば貧血治療薬、血液凝固薬（止血薬、抗凝血剤、抗血栓剤、血栓溶解剤、血液タンパク質及びそれらの画分）、（７）胃腸管薬、例えば消化薬（健胃消化剤、胆汁分泌促進薬）、抗潰瘍薬、抗下痢剤、（８）局所作用薬；化学療法薬、例えば（１）抗感染性剤、例えば、外部寄生虫撲滅薬（塩素殺菌された炭化水素、ピレトリン、硫化された化合物）、駆虫剤、抗原生動物薬、抗マラリア剤、抗アメーバ薬、抗リーシュマニア薬、抗トリコモナス薬、抗トリパノソーマ薬、スルホアミド、抗ミコバクテリウム薬、抗ウイルス性化学療法薬等の化学療法剤及び（２）細胞増殖抑止剤、すなわち、アルキル化薬等の抗腫瘍薬又は細胞毒性薬、例えば塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、マスターゲン、ＨＮ２）、シクロホスファミド（シトヴァン、エンドキサナ）イフォスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）（ＩＦＥＸ）、クロラムブチル（ロイケラン）、メルファラン（フェニルアラニンマスタード、Ｌ−サルコリシン、アルケラン、Ｌ−ＰＡＭ）、ブスルファン（ミレラン）、チオテパ（トリエチレンチオホスホラミド）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ、ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ、ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン（ザノサール）及び同種のもの；植物アルカロイド、例えばビンクリスチン（オンコビン）、ビンブラスチン（ベルバン、ベルベ）、パクリタキセル（タキソール）及び同種のもの；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート（ＭＴＸ）、メルカプトプリン（プリネトール、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−ＴＧ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（サイトサール−Ｕ、アラ（Ａｒａ）−Ｃ）、アザシチジン（ミソサール、５−ＡＺＡ）等、；抗生物質、例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメゲン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ドーノマイシン、セルビジン）、イダルビシン（イダマイシン）、ブレオマイシン（ブレオキサン）、ピカマイシン（ミトラマイシン、ミトラマイシン）マイトマイシン（ムタマイシン）等、及びその他の抗細胞増殖剤、例えばヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ）、プロカルバジン（ムタラン）、デカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）、シスプラチン（プラチノール）、カルボプラチン（パラプラチン）、アスパラギナーゼ（エルスパー）、エトポシド（ベペシド、ＶＰ−１６−２１３）、アンサルクリン（ＡＭＳＡ、ｍ−ＡＭＳＡ）、ミトタン（リソドレン）、ミトキサントロン（ノバトロン）等、を含む。好ましい化学療法剤はそれらであり、それは遊離の形態で、所望の投与量で、許容不可能な全身毒性を示す。このような薬剤による治療のレベルに関連した全体的な全身毒性は、ＲＡＰ変異体ポリペプチド又はＣＲ特異的抗体にそれらが結合することにより、低減される場合がある。特に好ましいのは、有用な治療薬ではあるが、心臓毒性を有することにより制限されている心臓毒性を有する化合物である。典型的な例は、ダウノルビシンのようなアドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られる）及びその類似体である。ＲＡＰ又はＲＡＰの変異体ポリペプチド又はＣＲ特異的抗体へとかかる薬剤を連結することは、心臓及び関連する心臓毒性における活性物質の蓄積を抑制するかもしれない。
好適な活性物質は、限定するものではないが；アミノ配糖体、例えばアミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、フォルチミシン、ゲンタマイシン、イセパミシン、カナマイシン、ミクロノムシン、ネオマイシン、ネチルミシン、パロマイシン、リボスタマイシン、シソミシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、トロスペストシン；アンフェニコル、例えばアジドダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、テイマフェニコール；アンサマイシン、例えばリファミド、リファムプシン、リファマイシン、シファペンチン、リファキシミン）；β−ラクタム類、例えば、カルボセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、セファマイシン、モノバクタム、オキサフェム、ペニシリン；リンコサミド類、例えば、クリナマイシン、リンコマイシン；マクロライド系抗生物質、例えばクラリスロマイシン、ダルトロマイシン、エリスロマイシン等；ポリペプチド、例えばアンフォマイシン、バシトラシン、カプレオマイシンなど；テトラサイクリン、例えばアピシクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン等；合成抗菌物質、２、４−ジアミノピリミジン、ニトロフラン、キノロン類及びその類似体、スルホンアミド類、スルホネート等の抗生物質等を含み；
好適な活性物質は、限定するものではないが：ポリエン等の抗真菌剤、例えばアンフォテリシンＢ、カンジシジン、デルモスタチン、フィリピン、フンギクロミン、ハチマイシン、ハマイシン、ルセンソマシン、メパルトリシン、ナタマイシン、ナイスタチン、ペシロシン、ペリミシン；アリルアミン等の合成抗真菌剤、例えば、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン；イミダゾール類、例えばビフォナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン、クロロルミダゾール等、例えばトルシクラート、トリアゾール等のチオカルバメート類、例えばフルコナゾール、イトラコナゾール、テルコナゾール等の抗真菌物質を含み；
好適な活性物質は、限定するものではないが：アレコリン、アスピジン、アスピジノール、ジクロロフェン、エンベリン、コシン、ナフタレン、ニクロサミド、ペレチエリン、キナクリン、アラントラクトン、アモカルジン、アモスカネート、アスカリドール、ベフェニウム、ビトスカナート、四塩化炭素、カルバクロール、シクロベンダゾール、ジエチルカルバマジン等の駆虫薬を含み；
好適な活性物質は、限定するものではないが：アセダプソン、アモジアキン、アルテエーテル、アルテメトル、アルテミシニン、アルテスナート、アトバクオン、ベベリン、ベルベリン、シラータ、クロログアニド、クロロキン、クロロプロガウニル、キナの木、シンコニジン、シンコニン、シクログアニル、ゲンチオピクリン、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、メフロキン塩酸塩、３−メチルアルサセチン、パマキン、プラスモシド、プリマキン、ピリメタミン、キナクリン、キニジン、キニーネ、キノシド、キノリン、第二ヒ酸ナトリウム等の抗マラリア薬を含み；
好適な活性物質は、限定するものではないが：アクラニル、チニダゾール、イプロニダゾール、エチルスチバミン、ペンタミジン、アセタルソン、アミニトロゾール、アニソマイシン、ニフラテル、チニダゾール、ベンジダゾール、スラミン等の抗原虫物質等を含む。
活性物質として使用するための好適な薬物もまた列挙される：Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ
Ｇｉｌｍａｎ’ｓ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（９ｔｈ Ｅｄ）（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ）（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）（１９９６）；及び１９９９ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９８）。
好適な活性物質は、限定するものではないが、米国特許第
号中で開示される抗腫瘍薬；
米国特許第
号中で開示される精神薬理的物質／向精神薬；
米国特許第
号中で開示される心血管作動薬；
米国特許第
号中で開示される抗菌薬；
米国特許第
号中で開示される抗炎症薬；
米国特許第
号中で開示される免疫抑制剤；
米国特許第
号中で開示される免疫モジュレーター；
米国特許第
号中で開示される鎮痛剤；
米国特許第
号中で開示されるコリン作動薬；
米国特許第
号中で開示されるアドレナリン作動薬；
米国特許第
号中で開示される抗ヒスタミン剤；
米国特許第
号中で開示されるステロイド剤；
を含み、上述のもの全ての開示を、参照として本明細書中に取り入れるものとする。
コンジュゲートの薬物部分は、対象の標的に対する親和性及び特異性を維持する、全体の薬物又はその結合断片又は部分であることができ、さらに、ベクタータンパク質リガンド又はリンカーへと共有結合するための結合部位を有する。そのような薬物のコンジュゲートは、同様の疾患、疾病、及び薬物それら自身としての適用のために使用され得る。
（ｉｉｉ． 好ましい癌の化学療法用活性物質）
ＲＡＰ変異体又はＣＲ−特異的な抗体をベースとする、本発明のコンジュゲート中に使用するために好ましい癌の化学療法用物質は、脳中又は脳周辺の脳腫瘍又はその他の新生物を処置するために有用な、遊離の形態であるか、又は遊離の形態でそのような腫瘍に対し有用でない場合、ＲＡＰ変異体又はメガリンに結合するその断片又はＣＲ−特異的な抗体に対し結合した場合に有用であるもののいずれかである、全ての薬物を含む。そのような化学療法物質は、好ましくは、限定するものではないが、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示すアドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られる）、シスプラチン、パクリタキセル、それらのアナログ及びその他の化学療法物質等を含む細胞毒性を有する化学療法物質である。そのような化学療法物質はまた、アルキル化物質、代謝拮抗物質、天然物（ビンカアルカロイド類、ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ、抗生物質、酵素及び生物学的応答モディファイア等の）、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、紡錐体毒、ホルモン及びアンタゴニスト、及び白金配位コンジュゲート、アントラセンジオン、置換された尿素等の雑多な物質を含む。当業者は、その他の化学療法物質を知るであろう。
好ましい化学療法物質は、遊離の形態では、所望の投与量で許容不可能な全身毒性を示すものである。ＲＡＰ変異体又はＣＲ−特異的抗体に対するそれらの結合により、治療的レベルのそのような物質と結合した一般的な全身毒性は低減される。具体的には、有用な治療薬である心臓毒性の化合物が好ましいが、心臓毒性のために、投与量は制限される。古典的な例は、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られる）及びダウノルビシン等のそのアナログである。ＲＡＰ変異体又はＣＲ−特異的抗体をそのような薬物へと結合させることにより、心臓への蓄積と、それに関連する心臓毒性が低減される。
（ｉｖ． 複合糖質）
複合糖質（グリココンジュゲート）は、炭水化物部分を含む任意の分子である。例としては、限定するものではないが、糖タンパク質、オリゴサッカライド、糖脂質及びプロテオグリカンを含む。かかる分子は、治療薬の生物適合性の強化又は病原的機序を阻止する能力等の有益な機能を有する。例えば、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼは、この酵素へと結合したオリゴマンノース ７−ビスホスフェート決定基により体内全体に効率的に分布する複合糖質（糖タンパク質）である。ヘパリン硫酸は、ヒトにおける凝固経路を阻止するために有用な、プロテオグリカンの炭水化物である。好適なＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的な抗体の、治療活性を有する複合糖質への結合は、生体内分布に影響を及ぼすことによって、複合糖質の性能を高める手段を提供し得る。あるいは、ＲＡＰ変異体−（又はＣＲ特異的抗体−）融合体は、特定の組織中で１以上の受容体の機能に直接的に影響を及ぼす能力を有する、ビス特異的な受容体結合分子として作用するように作製され得る。
（ｖ． ナノ粒子）
ナノ粒子は、生分解性及び非生分解性のポリマー、又は脂質等のその他の物質から構築される巨大分子の集合である。かかる集合は、粒子内の空隙に治療的分子を含むように設計され得る。この方法を通じて、ナノ粒子は、薬物の生体内分布、薬物動態、免疫原性及び有効性を変化させる手段を提供する。好適なＲＡＰ変異体又はＣＲ−特異的抗体の結合は、言い換えれば、これらの分子の組織分布の特異性を増加させる手段を提供する。
（Ｈ． ＲＡＰコンジュゲートの製造方法）
（ｉ． 宿主細胞）
キメラタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、バクテリア、酵母、昆虫、非哺乳類脊椎動物又は哺乳類細胞であり；哺乳類細胞は、限定するものではないが、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ及びヒト細胞を含む。宿主細胞は、不死化細胞（細胞株）又は非不死化（一次又は二次）細胞であることができ、限定するものではないが、繊維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣又はＣＨＯ細胞）、内皮細胞、膠細胞、神経細胞、血液の有形成分（例えばリンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、肝細胞及びこれらの体細胞タイプの前駆体等の、広範な細胞タイプの任意のものであり得る。宿主細胞は、ＣＨＯ１３−５−１等のＬＲＰを発現しないＣＨＯ細胞の変異体を含み得る（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，１２９（６）：１５３３−４１、１９９５）。
キメラタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含み、かつ発現する細胞を、本明細書中では、遺伝子的に修飾された細胞と称する。キメラタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含みかつ発現する哺乳類細胞を、本明細書中では、遺伝子的に修飾された哺乳類細胞と称する。ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞への導入は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、パーティクルガン、リン酸カルシウム沈殿、リン酸改変カルシウム沈殿、カチオン性脂質処置、フォトポレーション、融合方法論、受容体介在トランスファー、又はポリブレン沈殿等の公知のトランスフェクション方法による。あるいは、ＤＮＡ又はＲＮＡは、ウィルスベクターを用いた感染により導入され得る。キメラタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを発現する細胞哺乳類を含む細胞を製造する方法は、米国特許第６，０４８，７２９号、同第５，９９４，１２９号及び同第６，０６３，６３０号中に記載される。これらの出願のそれぞれの教示は、その全文を参照として明確に本明細書に取り入れるものとする。
（ｉｉ． 核酸構築物）
キメラタンパク質を発現するために用いられる核酸構築物は、トランスフェクトされた哺乳類細胞中、染色体外で（エピソームで）発現されるか、又は、相同組み換えを通じて、ランダムに又は予め選択されて標的化された部位のいずれかで受容細胞のゲノムへと統合されるものである。染色体外で発現される構築物は、キメラタンパク質をコードする配列に加えて、細胞中のタンパク質の発現、任意には、構築物の複製にとって十分な配列を含む。それは、典型的には、プロモーター、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ及びポリアデニル化部位を含む。キメラタンパク質をコードするＤＮＡは、その発現がプロモーターの制御下にある形で、構築物中に位置する。任意に、この構築物は、以下の１以上等の付加的な成分を含み得る：スプライス部位、エンハンサー配列、適当なプロモーターの制御下の選択可能なマーカー遺伝子、及び、適当なプロモーターの制御下の増幅可能なマーカー遺伝子。
ＤＮＡ構築物が細胞のゲノム中へと統合されるそれらの実施形態において、それは、キメラタンパク質をコードする核酸配列のみを含むことを必要とする。任意に、それは、プロモーター及びエンハンサー配列、ポリアデニル化部位又は複数部位、スプライス部位又は複数部位、選択可能なマーカー又は複数マーカーをコードする核酸配列、増幅可能なマーカー遺伝子をコードする核酸配列及び／又はゲノム中の選択された部位へのＤＮＡの統合を標的化するための（ＤＮＡ又はＤＮＡ配列を標的とする）、受容細胞中のゲノムＤＮＡと相同なＤＮＡを含み得る。
（ｉｉｉ． 細胞培養方法）
キメラタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含む哺乳類細胞は、細胞の増殖及びＤＮＡ又はＲＮＡの発現にとって適当な条件下で培養される。キメラタンパク質を発現するそれらの細胞は、本明細書中に記載される公知の方法及び複数の方法を用いて特定され得、キメラタンパク質もまた、本明細書中に記載される公知の方法及び複数の方法を用いて、キメラタンパク質の増幅を伴う又は伴わないいずれかのタンパク質生産により、単離され、精製され得る。特定は、例えば、ＰＣＲスクリーニング、サザンブロット分析によるスクリーニング、又はキメラタンパク質の発現に関するスクリーニング等の、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの存在を示す表現形を呈する遺伝子的に改変された哺乳類細胞のスクリーニングを通じて、行うことができる。取り込まれたキメラタンパク質をコードするＤＮＡを有する細胞の選択は、ＤＮＡ構築物中に選択可能なマーカーを含ませ、その選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞のみが生き残るために適当な条件下で、選択可能なマーカー遺伝子を含むトランスフェクトされた又は感染した細胞を培養することにより実現される。導入されたＤＮＡ構築物のさらなる増幅は、増幅のための適当な条件下で、遺伝子的に修飾された哺乳類細胞を培養する（例えば、増幅可能なマーカー遺伝子の複数のコピーを含む細胞のみが生き残れる濃度の薬物存在下で、その増幅可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子的に修飾された哺乳類細胞を培養する）ことにより、影響を受け得る。
キメラタンパク質を発現する、遺伝子的に修飾された哺乳類細胞は、本明細書中に記載されるように、発現産物を検出することにより同定することができる。例えば、担体がＲＡＰ変異体である、キメラタンパク質を発現する哺乳類細胞は、サンドイッチ酵素免疫アッセイにより同定可能である。抗体は、コンジュゲートのメガリン結合部分又は活性物質部分へと直接的に向けられる。
（ｉｖ． ＲＡＰ変異体ポリペプチドの製造）
本発明に使用するＲＡＰ変異体ポリペプチドは、米国特許第５，４７４，７６６号中に開示されたものを含み、本発明の化合物及び組成物中で使用するためのそのようなペプチド及びそれらの製造法を開示する目的で、その全文を参照として本明細書中に取り入れるものとする。ＲＡＰ変異体ポリペプチドは、当業者に公知の任意のタンパク質調製及び精製方法を用いて製造される。
リガンドは、天然のタンパク質供給源から精製され、そのリガンドを発現する組み換え宿主から単離されるか、又はタンパク質合成のよく知られた公知の技術を用いて合成することができる。当業者は、受容体結合部位を含むＲＡＰ変異体を得るために、多様なかかる技術を直ちに適合する（Ｍｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（３１）： ２９３３８−２９３４６（２００１）；Ｓａｖｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７４（３６）：２５８７７−２５８８２（１９９９）；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：７５２１−７５２５（１９９７）；Ｍｅｄｖｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（２）：７１７−７２７（１９９９）；Ｒａｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（３７）：２４１５２−２４１５７（１９９８）；Ｏｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ３１６１−３１６３（１９９４））。
天然のＲＡＰタンパク質の単離は、先に記載されている（Ａｓｈｃｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１０：１０４１−１０４８（１９９０）及びＪｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２５５：２７５−２８０（１９８９））。ＲＡＰ変異体断片は、単離した天然のタンパク質から、酵素的及び／又は化学的な開裂により変換されて全体のタンパク質の断片を生じることにより生成される。米国特許第６，４４７，７７５号は、ＲＡＰ変異体ポリペプチドを得るためのかかる方法に関する特定の参照を伴って、参照として本明細書中に取り入れるものとする。さらに、ＲＡＰ変異体は、組み換えバクテリア中で発現される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９０３５−９０４０（１９９２）；Ｗｕｒｓｈａｗｓｋｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３３２５−３３３０（１９９４）。組み換えＥ．ｃｏｌｉ株由来の３９ｋＤａのＲＡＰタンパク質の精製方法が、先に記載されている（Ｈｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６、２１２３２−２１２３８（１９９１）；米国特許第５，４７４，７６６号）。
発現プラスミドｐＧＥＸ−３９ｋＤａを保持するＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で、３７℃にて、対数期中期まで培養する。培養物を３０℃まで冷却し、０．０１％のイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドを添加して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−３９ｋＤａ融合タンパク質の発現を引き起こす。４−６時間の３０℃での誘導後、培養物を氷で冷却し、遠心分離により回収する。さらなるステップを４℃で行う。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１μＭのペプスタチン、２．５μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、及び１μＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳ中で、細胞ペレットを溶解する。溶解液をＢｒａｎｓｏｎ Ｍｏｄｅｌ ４５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒを用いて超音波処理し、１５，０００ｇにて１５分間遠心分離することにより、得られる膜及びその他の細胞破片を分離する。回収された上清を、アガロース固定化したグルタチオンビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）と共にＰＢＳ及び０．１％のアジ化ナトリウム中で一晩インキュベートする。ビーズを洗浄し、５ｍＭの還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いた競合によって、融合タンパク質を溶出する。透析後に、融合タンパク質を、５０μｇの融合タンパク質あたり１００ｎｇの活性化ヒトトロンビンと共に一晩インキュベーションして開裂させる。次いで、アガロース固定化グルタチオンビーズと共にさらにインキュベーションすることによって、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼエピトープを除去する。
上述の方法がＲＡＰの製造および精製について記載するのに加えて、上述のように、その他のＲＡＰ変異体もまた、同様の技術を用いて製造することができる。そのようなリガンドの概説を、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＢｉｒｎの文献中に見出すことができる（Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８０：Ｆ５６２−Ｆ５７３、２００１、特に表１及び本明細書中に引用された参考文献を参照）。かかるリガンドの製造及び精製技術は、当業者によく知られている。
（Ｉ． ＲＡＰコンジュゲートの特徴付け）
（ｉ． 標識）
いくつかの実施形態において、ＲＡＰ変異体に基づく活性物質コンジュゲート又はＣＲ特異的抗体又は抗体コンジュゲートは、その検出を助けるために標識される。「標識」又は「検出する可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的又はその他の物理的手法により検出可能な組成物である。例えば、本発明で使用するのに好適な標識には、例えば、放射活性標識（例えば３２Ｐ等）、蛍光プローブ（例えばフルオレセイン）、電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで通常的に用いられる）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は、例えばそのハプテン又はペプチド中へと放射標識を取り込むことにより、もしくはそのハプテン又はペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いることにより検出可能であり得る、ハプテン及びタンパク質を含む。
上述の通り、利用されるスクリーニングアッセイに依存して、活性物質、リンカー又はコンジュゲート又はＣＲ特異的抗体のＲＡＰ変異体ポリペプチド部分が標識され得る。用いられる特定の標識又は検出可能な基は、それがそのコンジュゲートの生物学的活性を顕著に妨げない限りは、本発明における非常に重要な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的又は化学的な特性を有する任意の物質であり得る。すなわち、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的な手段により検出可能な任意の組成物である。
本発明での使用に好適な標識の例としては、限定するものではないが、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びその他の通常ＥＬＩＳＡで使用されるもの）及び金コロイド又は着色ガラス又はプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）等の比色的標識を含む。
標識は、当該技術分野でよく知られた方法に従うアッセイでの所望の成分へと、直接的に又は間接的に結合され得る。好ましくは、一実施形態における標識は、コンジュゲート化するためのイソシアネート試薬を用いて、本発明の活性物質をバイオポリマーへ共有結合する。本発明の一態様において、そこに連結された活性物質を伴わない標識バイオポリマーコンジュゲートを形成するために、標識をバイオポリマーへとコンジュゲート化する目的で、本発明の両性イソシアネート試薬を用いることができる。標識バイオポリマーコンジュゲートは、本発明の標識されたコンジュゲートを合成するための中間体として用いることができ、又は、そのバイオポリマーコンジュゲートを検出するために用いることができる。上述の通り、広範な標識を用いることができ、必要とされる感度、アッセイ中の所望の成分とのコンジュゲート化の容易性、安定性の必要性、入手可能な装置、及び廃棄条件に依存する、標識の選択を伴う。非放射活性標識がしばしば間接的な手段として添付される。通常、リガンド分子（例えばビオチン）は、分子に共有結合する。リガンドは別の分子（例えばストレプトアビジン）分子へと結合し、それは本質的に検出可能であるか、又は、検出可能な酵素、蛍光化合物、又は化学発光化合物等のシグナル系へと共有結合されるかのいずれかである。
コンジュゲートは、例えば、酵素又は蛍光プローブと共にコンジュゲート化することにより、直接的にシグナル生成化合物へとコンジュゲート化されることもできる。標識として使用するために好適な酵素は、限定するものではないが、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ、及びグリコシダーゼ又はオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼを含む。標識として使用するために好適な蛍光化合物、すなわち、蛍光プローブは、限定するものではないが、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等を含む。さらなる好適な蛍光プローブの例は、限定するものではないが、エオシン、ＴＲＩＴＣアミン、キニン、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリスロセイン、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、等を含む。標識として使用するために好適な化学発光化合物は、限定するものではないが、ルシフェリン及び、例えばルミノール等の２，３−ジヒドロフタラジンジオン類を含む。本発明の方法に使用され得る各種標識又はシグナル生成系の概説に関しては、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
標識の検出方法は、当業者によく知られている。すなわち、例えば、標識が放射活性標識である場合、検出の手段はシンチレーションカウンター、又は、オートラジオグラフィーの場合は写真用フィルムを含む。標識が蛍光標識の場合、それは、蛍光色素を適当な波長の光で励起し、得られる蛍光を検出することにより検出することができる。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は光電子増倍管等の電子的な検出装置の使用により、視覚的に検出できる。同様に、酵素的標識は、その酵素に対する適当な基質を提供し、得られる反応産物を検出することにより検出できる。比色的な又は化学発光による標識は、標識に関連する色を観察することにより、単純に検出することができる。本発明の方法に使用するのに適している、その他の標識及び検出システムは、当業者には直ちに明らかであろう。かかる標識されたモジュレーター及びリガンドは、疾病又は健康状態の診断に使用することができる。
（ｉｉ． ＲＡＰ変異体−活性物質コンジュゲート、ＣＲ特異的抗体及びそれらの輸送の調節因子に関するスクリーニングアッセイ）
本発明は、ＲＡＰ変異体ポリペプチド−（又はＣＲ特異的抗体−）活性物質コンジュゲートに関するスクリーニングアッセイを提供し、そのコンジュゲートは、全細胞中、細胞抽出物中、半精製状態、精製状態、又は、その活性を測定し得る任意のその他の状況におかれ得る特異的受容体の測定可能な活性に対して影響を及ぼし得るそれらの能力を試験される。活性は、例えば、そのような活性の量又はタイミング等を含む、メガリンの発現、機能又は分解における任意の活性であり得る。かかる活性は、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳又は受容体遺伝子配列又はｍＲＮＡ転写物の転写安定性を含む。かかる活性は、例えば、新たな受容体の合成、その受容体のサブセルでの配置、及び、受容体生物学的な活性化を含む。そのような活性は、例えば、受容体の、物質を結合する能力、立体構造を導入する能力、触媒反応、公知のリガンドへの結合等を含む。かかる活性は、例えば、受容体の量又は安定性、又は受容体の除去又は分解などを含む。好ましい実施形態において、使用されるＲＡＰ変異体は、修飾されているか、又は、天然に、その他のどの受容体よりも、標的化された受容体に対し、より高い結合親和性を有しているものである。
本発明は、多様なスクリーニング形態を包含する。いくつかのデザインは、低スループットであり、順次又は並行して、ひとつだけ、又は、少数の化合物を試験する。高スループットのスクリーニングアッセイは、数万又は数十万の化合物を週単位又は月単位でスクリーニングするために適している。シリコン内での（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）のスクリーニング形態は、メガリンの生物学的活性の強力なモジュレーターを同定するための、コンピューターに助けられた合理的設計を利用する。
（Ｊ． 医薬組成物の使用方法、及びその投与）
コンジュゲート及びモジュレーターは、多様な経路により投与されることができる。経口調製のためには、コンジュゲートを、単独で、又は、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ又はジャガイモデンプン；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等の結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン又はカルボキシメチルセルロース等の粉砕剤；タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑剤；及び、所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤及び着香剤等の従来の添加剤と適当な添加剤と組み合わせて使用し、錠剤、粉末、顆粒又はカプセルを製造することができる。
コンジュゲート及びモジュレーターは、それらを、植物性又はその他の同様のオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸又はプロピレングリコールのエステル類；及び、所望により、溶解剤、等張化剤、懸濁剤、エマルジョン化剤、安定剤及び保存剤等の従来の添加剤と共に、水性又は非水性溶媒中に溶解、懸濁又はエマルジョン化することによって、注射用調製物へと製剤化することができる。
コンジュゲート、モジュレーター、及びＬＤＬＲリガンドは、吸入により投与するためのエアロゾル形態で使用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の圧縮可能な高圧ガスへと製剤化することができる。
さらに、コンジュゲート及びモジュレーターは、基剤又は水溶性の基剤を乳化する等によって各種の基剤と混合することにより、坐薬とすることができる。本発明の化合物は、坐薬を介して直腸投与することができる。坐薬は、体温で融解するが室温では固体化しているカカオバター、カーボワックス及びポリエチレングリコール等のビヒクルを含み得る。
シロップ、エリキシル剤及び座薬等の、経口投与又は直腸投与のためのコンジュゲート、モジュレーター及びＬＤＬＲリガンドは、例えば、茶さじ１杯、大さじ１杯、錠剤又は坐薬等の各単位投与量が、活性物質を含む所定量の組成物を含むように提供され得る。同様に、注射又は静脈内投与のための単位投与量が、滅菌水、通常の食塩水、又は別の医薬的に許容可能な担体中の溶液として組成物中のコンジュゲートを含み得る。
実際的な使用において、本発明のコンジュゲート、モジュレーター及びＬＤＬＲリガンドは、密に混合された混合物中の活性成分として、従来の医薬合成技術によって医薬的担体と結合することができる。担体は、例えば、経口又は腹腔内（静脈内を含む）等の、投与に関し所望される調製物の形態に依存して広範な形態をとり得る。経口投与形態のための組成物を調製する際には、例えば懸濁液、エリキシル剤及び溶液等の経口液状調製物の場合、例えば水、グリコール類、油、アルコール、香料、保存剤、着色剤等；又は、液状調製物よりも好ましい固体経口調製物、例えば粉末、ハード及びソフトカプセル、及び錠剤経口固体調製物の場合、例えば、デンプン、砂糖、微結晶性セルロース、希釈剤、顆粒化剤、滑剤、結合剤、崩壊剤等の、通常的な任意の医薬的媒体を使用し得る。
経皮的な投与経路に関する、薬剤の経皮的な投与用方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９８５）中に開示されている。皮膚パッチあるいは肌パッチは、本発明のコンジュゲート、モジュレーター及びＬＤＬＲリガンドを経皮的に送達するための好ましい手段である。パッチは、好ましくは、化合物の吸収を増加させるために、ＤＭＳＯ等の吸収促進剤を提供する。経皮的な薬物送達に関するその他の方法は、米国特許第５，９６２，０１２号、同第６，２６１，５９５号及び同第６，２６１，５９５号中に開示されている。それらの各々は、その全文を参照として本明細書中に取り入れるものとする。
特定の実施形態においては、本明細書中に記載されるコンジュゲートの治療的投与は、ＣＳＦへの硬膜下投与することを包含する。本発明の硬膜下投与は、脳室へと医薬組成物を導入することを含み得る。あるいは、硬膜下投与は、医薬組成物を腰部へと導入することを含み得る。さらに別の実施形態においては、硬膜下投与は、医薬組成物を小脳延髄槽へと導入することを含み得る。そのような任意の投与は、好ましくはボーラス注射を介する。症状の深刻性及び治療に対する対象の応答性に応じて、このようなボーラス注射を、毎月１回、６か月毎に１回、又は毎年投与することができる。別の実施形態においては、硬膜下投与は、輸液ポンプの使用により達成される。医薬は、当然に、一定期間、少なくとも数日間連続的に硬膜下に投与され、あるいは、硬膜下投与は少なくとも４週間連続して行われる。もちろん、投与が連続的注入による場合、ボーラス注射による投与と比較して、酵素補充療法の投与単位の投与速度は非常に短縮される可能性がある。好ましい実施形態においては、コンジュゲートの活性物質はイズロニダーゼであり、それは、ＭＰＳのために処置される哺乳動物の体重２０ｋｇあたり約１ｍｇのイズロニダーゼを含む量で送達される。特定の実施形態において、上記の投与量は１５ｃｃ ＣＳＦまで送達される。そのような濃度では、酵素濃度はＣＳＦの１ｍｌ当たり１８，０００ユニットになるであろうと予測される。前述の投与量は単に例示的な投与量であり、当業者であればこの投与量が可変であると理解するだろうことがわかるに違いない。
本発明の方法及び組成物は、酵素補充療法の前に、抗原特異的寛容性を引き起こす方法及び組成物と組み合わせることができる。そのような方法には、例えば、シクロスポリン
Ａなどの免疫抑制物質を投与することを含む抗原特異的寛容性の誘導を含み、さらに、限定するものではないが、ヌクレオチドアナログ又は代謝拮抗物質を含む抗増殖物質の投与を含む。抗増殖物質はアザチオプリンであり得る。さらなる方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３０２１１１１３として公開された米国特許出願第１０／１４１，６６８号；及び米国特許出願公開第２００４０００９９０６として公開された米国特許出願第１０／４２９，３１４８号中に記載され、各々を参照として本明細書中に取り入れるものとする。
ビヒクル、アジュバント、担体又は希釈剤等の医薬的に許容可能な賦形剤は、市販されている。さらに、ｐＨ調節及び緩衝剤、等張モジュレーター、安定剤、湿潤剤等の医薬的に許容可能な補助物質も市販されている。
当業者は、副作用に特定の化合物、症状の深刻性及び副作用に対する対象の感受性の関数として投与量が変化し得ることを容易に認識するであろう。所定の化合物に対する好ましい投与量は、限定するものではないが、患者、試験動物及びｉｎ ｖｉｔｒｏで投与量応答及び薬物動態を調べることを含む多様な手段により、当業者により迅速に決定される。
所定の場合に最も適している経路は、部分的には、処置される状態の性質及び深刻性、及び活性成分の性質に依存するものではあるが、これらの各態様において、組成物は、限定されるものではないが、経口的、直腸的、局所的、非経口的（皮下的、筋肉内及び静脈内を含む）、経肺（経鼻吸入又は頬粘膜吸入）、経鼻投与のために適切な組成を含む。投与の例示的な経路は経口及び静脈内の経路である。組成物は、簡便のために単位投与量の形態で示される場合もあり、医薬技術においてよく知られた任意の方法によっても調製することができる。
実際的な使用において、本発明のモジュレーターは、密に混合された混合物中の活性成分として、従来の医薬合成技術によって医薬的担体と結合することができる。担体は、例えば、経口又は腹腔内（静脈内を含む）等の、投与に関し所望される調製物の形態に依存して広範な形態をとり得る。経口投与形態のための組成物を調製する際には、例えば懸濁液、エリキシル剤及び溶液等の経口液状調製物の場合、例えば水、グリコール類、油、アルコール、香料、保存剤、着色剤等；又は、液状調製物よりも好ましい固体経口調製物、例えば粉末、ハード及びソフトカプセル及び錠剤経口固体調製物の場合、例えば、デンプン、砂糖、微結晶性セルロース、希釈剤、顆粒化剤、滑剤、結合剤、崩壊剤等の、通常的な任意の医薬的媒体を使用し得る。
投与の容易性により、固形医薬担体が明白に使用される錠剤及びカプセルは最も都合のよい経口投与単位形態である。所望であれば、錠剤は、標準的な水性又は非水性の技術によってコーティングされ得る。これらの組成物中での活性化合物の割合は当然に可変であり得、その化合物は、その単位重量の約２パーセントから約６０パーセントの間である。
本発明のコンジュゲート、モジュレーター及びリガンドは、動物中、及び特にヒトにおける治療的、予防的、及び診断的項目に関して有用である。本明細書中に記述されるように、コンジュゲートは、使用されるバイオポリマーに応じて、任意の標的器官、区画又は部位中で活性成分を優先的に蓄積し、及び／又は放出することが示されている。
本発明の組成物は、ウイルスエンベロープ又は小胞内にカプセル化されるか、結合されるか、あるいは細胞へと取り込まれて投与することができる。小胞は、通常球状で、頻繁に脂質性であるミセル粒子である。リポソームは二分子膜から形成された小胞である。好適な小胞は、限定するものではないが、単層の小胞及び多層の脂質小胞又はリポソームを含む。そのような小胞及びリポソームは、例えば、米国特許第４，３９４，４４８号中に記載されるもの等の標準的な技術を用いて、ホスファチジルコリン、フォスファチジン酸、フォスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、糖脂質、ガングリオシド等の広範な脂質又はリン脂質の化合物から製造され得る。そのような小胞あるいはリポソームは、化合物を細胞内に投与し、標的器官へと化合物を送達するために使用することができる。対象のｐ９７組成物の制御された放出も、カプセル化を用いて達成される（例えば米国特許第５，１８６，９４１号参照）。
ＲＡＰ変異体、ＣＲ特異的抗体、ＲＡＰ変異体をベースとする活性物質コンジュゲート又はモジュレーター組成物を血流中又は少なくとも血液脳関門の外側へと送達する、任意の投与経路が用いられ得る。好ましくは、組成物は腹腔内に投与され、最も好ましくは静脈内に投与され、又は心臓カテーテルにより投与される。頸静脈孔内注射はさらに有用である。組成物は、腹腔内に、又は筋肉内に皮下的に等、局所的あるいは領域的に投与される場合がある。１態様において、組成物は好適な医薬的希釈剤あるいは担体と共に投与される。
投与量は、使用される活性物質の所望の効果、バイオポリマー及び選択された投与経路における個別の必要性に依存する。好ましい投与量は、約０．２ｐｍｏｌ／ｋｇから約２５ｎｍｏｌ／ｋｇまでの範囲内であり、特に好ましい投与量は、２−２５０ｐｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり；あるいは、好ましいコンジュゲートの投与量は０．０２〜２０００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。これらの投与量は、活性成分又はバイオポリマーと結合した部分の数により影響を受けるであろう。
好ましい実施形態において、コンジュゲートはＲＡＰ変異体を含む。例えば、ＲＡＰ変異体であるアドリアマイシンを０．００５〜１００ｍｇ／ｋｇ含むアドリアマイシンの投与量は、ｉｎ ｖｉｖｏでも有用である。ＲＡＰ変異体であるアドリアマイシンを０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ含むアドリアマイシンの投与量は特に好ましい。当業者は、遊離形態の化合物について使用される推奨投与量に部分的に基づいて、ＲＡＰ変異体に関連する化合物の適している投与量を決定することができる。ＲＡＰ変異体への活性成分のコンジュゲートは、一般に、同様の結果を得るために必要とされる薬物の量を低減する。
本発明のコンジュゲート及びモジュレーターは、動物及び、特にヒトにおける治療的、予防的、及び診断的項目に関して有用である。ＲＡＰ変異体化合物は、特定の組織中での優先的な蓄積を示し得る。診断的用途に関する好ましい医学的な適応は、例えば、対象の標的器官（例えば肺、肝臓、腎臓、膵臓）と結合する任意の条件を含む。特定の好ましい実施形態において、対象とする標的器官は脳である。
主題の方法は、様々な異なる疾病状態の治療での用途を見出す。特定の対象に関する特定の実施形態において、所望される活性物質及び薬物が先に同定されているが、その活性物質及び薬物が満足できる治療効果を奏するように標的とされる部位、領域又は区画に適切には送達されていないという疾病状態において、主題の方法に関する用途が存在する。そのような活性物質及び薬物により、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体へと活性物質をコンジュゲートさせる主題の方法は、活性物質及び薬物の治療的有効性及び治療指数を強化するために使用することができる。
主題のコンジュゲートにより治療可能な具体的な疾患状態は、そのコンジュゲート中に存在する薬物部分のタイプによって変化する。したがって、疾患状態は、新生物疾患のような細胞増殖性疾患、自己免疫疾患、心臓血管疾患、ホルモン異常疾患、変性疾患、加齢疾患、中枢神経系疾患（例えばアルツハイマー病、てんかん、高脂血症等）、精神医学的疾患及び状態（例えば統合失調症、気分障害、うつ病及び不安神経症等）、伝染性疾病、酵素欠乏症、上述されたもののようなリソソーム蓄積症等を含む。
治療は、コンジュゲートを投与することに関連する対象に対して生じる、疾患を発症する可能性の低減、疾患予防、遅延、停止又は疾患の進行を逆行させること、あるいは、宿主を冒す疾患症状に関連する症状の緩和等を含む、任意の有益性を意図し、ここで用いられる緩和又は利益とは、広義の意味で、少なくとも、取り扱われる炎症及び痛み等の、治療される病理学的状態に関連する症状等に関するパラメーター強度を減少させることをいう。そのため、治療は、病理学状態又は取り扱われる症状の発症を止めることにより、又は、例えば、宿主がその病理学状態にもはや苦しむことがないか、又は、少なくとも特徴的な病理学状態がなくなるように終了させる事などによって停止され、完全に阻害される状態をさらに含む。
具体的実施形態において、処置される疾患は、リソソーム蓄積症であり、コンジュゲートは、前述哺乳動物の脳組織中に存在する貯蔵顆粒の量を減少させるために有効な量の中の医薬組成物として投与される。典型的には、このような障害の症状は、病歴、身体検査、超音波心臓検診、心電図記録法、核磁気共鳴映像法、睡眠ポリグラフ計、骨格調査、関節可動域測定、角膜写真及び皮膚生体組織検査のルーチン評価によってモニターされる。そのような障害における、治療薬にコンジュゲート化したＲＡＰ変異体、ＣＲ特異的抗体あるいは抗体コンジュゲートの投与は、前述の対象における発達遅延及び退行の正常化、高圧水頭症の低減、前述の対象における脊髄圧縮の低減、ならびに、前述の対象における脳血管周辺の血管周辺嚢胞数及び／又は大きさの正常化をもたらす。モニタリングの方法及びそのような結果の評価は、当業者に公知である。当業者は、そのような結果を追加的に記述する米国特許第６，５８５，９７１号；米国特許第６，５６９，６６１号及び米国特許第６，４２６，２０８号、及び米国特許出願公開第２００４０００９９０６号を参照されたい。
いくつかの態様において、治療が送達される動物の慣用性を増加させることが有用である場合がある。そのような方法は、２００３年５月５日に提出され、米国特許出願公開第２００４０００９９０６号として公開された米国特許出願第１０／４２９，３１４号中に記載されている（その全文を参照として本明細書中に取り入れるものとする）。
好ましい実施形態において、動物は、酸性ムコ多糖代謝異常症Ｉに苦しんでおり、正常なα―Ｌ−イズロニダーゼ活性の約５０％以下の量を有する。そのような実施形態において、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の効果的な投与量のヒトα−Ｌ−イズロニダーゼを、コンジュゲートの部分として、その欠乏症に苦しむ対象に毎週投与することが望ましいであろう。その他の実施形態において、対象は、前記ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼを、毎週、約０．０１ｍｇ／１５ｃｃのＣＳＦ〜約５．０ｍｇ／１５ｃｃのＣＳＦの間で哺乳動物中に投与される。本明細書中に包含される治療は、リソソーム蓄積症を有する対象の脳細胞中でのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分解を促進する。脳細胞はニューロン、神経膠細胞、上衣細胞であり得る。典型的には、粒剤蓄積が生じており、本発明のコンジュゲートの投与によって改善されるべき脳細胞は、ニューロン、膠細胞、小膠細胞、星状細胞、乏枝神経膠細胞、血管周囲細胞、周囲細胞、髄膜細胞、上衣細胞、クモ膜顆粒細胞、クモ膜の細胞膜、硬膜、軟膜及び脈絡叢細胞を含む。好ましい実施形態における治療は、髄膜細胞中の貯蔵顆粒を、前記コンジュゲートの投与を行わない状態での同様の細胞中のリソソームの貯蔵顆粒の数と比較して減少させる。これは、ある対象において高圧水頭症の症状を取り除く治療効果を生じ、前述の対象の髄膜組織中でのＣＳＦ流体の量を減少させる。
（ｉｖ． 神経学的疾患）
特定の実施形態において、処置される疾患は神経学的な疾患であり、コンジュゲートは、このような神経学的な疾患を予防する、管理するか、又は処置するために有効な量の医薬組成物として投与される。神経学的な疾患は、限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症（筋萎縮性側索硬化症）、その他の脱ミエリン化関連疾患、中枢神経系癌、外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳梗塞あるいは大脳虚血、プラーク硬化症、大脳脈管炎（てんかん）、ハンチントン舞踏病、トゥレット症候群、ギラン・バレー症候群、ウィルソン病、ピック病、神経炎症性障害、脳炎、脳脊髄炎あるいはウイルスか、菌によるか、バクテリアの起源の脳膜炎、もしくはその他の中枢神経系の感染、プリオン病、小脳性運動失調、小脳変性症、脊髄小脳変性症症候群、フリードライヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調、脊柱ダミオトロフィー（ｄａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、進行性核上麻痺、失調症、筋肉痙性、身震い、色素性網膜炎、老人性痴呆症、皮質下痴呆、動脈硬化性痴呆、ＡＩＤＳ関連痴呆又は他の痴呆、線条体黒質変性症、ミトコンドリア脳脊髄障害、ニューロン性のセロイドリポフスチン症、中枢神経系の関与を伴うリソソーム性記憶障害、白質萎縮症、尿素サイクル欠陥障害、肝性脳症、腎性脳症、代謝性脳症、ポルフィリン症、神経毒性化合物による中毒、放射線により引き起こされる脳障害、あるいは精神病、不安神経症、うつ病、注意欠陥障害、記憶障害、認知障害、欲求障害、肥満、依存症、渇望あるいは薬物依存症のような精神疾患を含む。
（アルツハイマー病）
好ましい実施形態において、処置される疾患は、罹患した患者の脳内で、４０−４２アミノ酸ペプチドであるアミロイドβ（Ａβ）のレベルが上昇することに関連するアルツハイマー病である（Ｓｅｌｋｏｅ、ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，１８２９５−１８２９８）。一連のタンパク質分解事象によってそれが生成した後に、Ａβはオリゴマー化し、最終的に、神経間質内部の不溶性プラーク中に蓄積される。可溶性及び不溶性形態のＡβの両方は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで神経毒性を示す（Ｚｅｒｂｉｎａｔｔｉ、ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ Ｕ Ｓ Ａ １０１、１０７５−１０８０；Ｔｓａｉ、ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；Ｓｃｈｍｉｔｚ、ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４、１４９５−１５０２；Ｇｏｎｇ、ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ １００、１０４１７−１０４２２；Ｂａｒｄ、ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ Ｍｅｄ ６、９１６−９１９；Ｓｃｈｅｎｋ、ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００、１７３−１７７；Ｈｓｉａ、ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ ９６、３２２８−３２３３）。可溶性Ａβモノマー及びオリゴマーはまた、長期増強を阻害することにより、記憶の欠損を逆に引き起こすことを示す（Ｇｏｎｇ、ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ Ｕ Ｓ Ａ １００，１０４１７−１０４２２）。
Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質又はＡＰＰのタンパク質分解断片であり、未知の機能を有する細胞表層膜タンパク質である。Ａβの形成は、神経分泌経路内で、又は、ＬＤＬＲファミリー受容体の構成員であるＬＲＰ１によるＡＰＰのエンドサイトーシスを通じて開始される（Ｃａｍ、ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９，２９６３９−２９６４６）。エンドソーム系において、ＡＰＰは、膜プロテアーゼであるβ部位のＡＰＰ開裂酵素又はＢＡＣＥにより開裂される。ＢＡＣＥは、膜貫通型ドメインのちょうどＮ末端に位置する位置６７１におけるＡＰＰを切断する。ＡＰＰの残りの部分は、次いで、γセクレターゼコンジュゲートを構成する３つのタンパク質、プレセニリン−１、プレセニリン−２及びニカストリンのコンジュゲートにより２回切断される（Ｘｉａ、ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｄ １１６、２８３９−２８４４）。プレセニリンは、脂質二重層の内膜内でそれらの基質を開裂させる。γセクレターゼの開裂ステップは、ＡＰＰの膜貫通型ドメイン内の位置７１１及び７１３の間で起こる。γセクレターゼの開裂は、ニューロン内に維持されるか、又は細胞外空隙へと分泌されるかのいずれかで、Ａβを遊離する。いずれかの配置において、Ａβはニューロンに対し毒性を有する（Ｃａｓａｓ、ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６５、１２８９− １３００）。
β及びγセクレターゼによるＡＰＰの逐次的な開裂を、アミロイド生成経路と称する。ＡＰＰの全長細胞外ドメインは受容体の開口、α−セクレターゼにより触媒されるタンパク質分解プロセスを通じて遊離される、代替的な経路が、正常な脳中で優勢である。遊離された細胞外ドメインはｓＡＰＰαと称され、神経防護作用及び記憶向上効果を有することが示されている（Ｆｕｒｕｋａｗａ、ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６７、１８８２−１８９６；Ｍｅｚｉａｎｅ、ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ ９５、１２６８３−１２６８８）。ＡＰＰ細胞外ドメインの遊離は、非アミロイド生成経路において鍵となる事象である。この場合でのタンパク質分解は、アミロイド生成の間にＡβとなるＡＰＰの領域内の位置６８８において生じる（Ａｌｌｉｎｓｏｎ、ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｄ Ｒｅｓ ７４、３４２−３５２）。従って、アミロイド生成経路及び非アミロイド生成経路は相互排他的である。ｓＡＰＰαの遊離は、α−セクレターゼ、ＡＤＡＭ１０あるいは膜結合型プロテアーゼにより特徴付けられる（Ｆａｈｒｅｎｈｏｌｚ、ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｄ ９２０、２１５−２２２）。ＡＤＡＭ１０はディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼであり、「シェダーゼ」酵素ファミリーに属し、ノッチ開裂酵素（クズバニアン）及びＴＮＦα前駆体開裂酵素（ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ１７）を含む。ＡＤＡＭ１０は、ＢＡＣＥの細胞外ドメインの開口に関与することが発見されている（Ｈｕｓｓａｉｎ、ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８、３６２６４−３６２６８）。
その他のＡＤＡＭファミリーの構成員と同様に、ＡＤＡＭ１０は、Ｎ末端のプロドメイン、触媒プロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、膜貫通型ドメイン及び細胞質尾部を有する。酵素の適正なフォールディングのために、プロドメインは触媒ドメインと緊密に結合することを必要とする。この結合はまた、プロドメイン中のシステインを活性部位の亜鉛原子へと可逆的に結合して、酵素のタンパク質分解活性をマスクすることができる一方、その分泌経路を通過させる。ゴルジ体を通過する際に、構成的分泌経路中で、プロタンパク質転換酵素のフリンはＡＤＡＭ１０の残基２１１−２１４（ＲＫＫＲ）を認識して、プロドメインを開裂させ、この酵素をタンパク質分解的に活性化させる。
ｓＡＰＰαの遊離を犠牲にした、β及びγセクレターゼによるＡβの遊離の増加が、アルツハイマー病の基盤であると信じられている。ＢＡＣＥ又はγ−セクレターゼコンジュゲートの医薬的阻害剤を開発するための多数のプログラムが開発途中にある。補完的なアプローチは、脳間質中のα−セクレターゼのレベルを上げることにより、Ａβを犠牲にしてｓＡＰＰαの産生を増加させることである。動物モデルでは、特定の神経プロテアーゼであるＡＤＡＭ１０の細胞内レベルを適度に補充することにより、ＡＰＰのタンパク質分解的な処理の不均衡が補正されている。脳中のＡＤＡＭ１０レベルを増加させることの有益性が、アルツハイマー病マウスモデルで確認されている（Ｐｏｓｔｉｎａ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１３，１４５６−１４６４；Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ、ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１３，１３８４−１３８７）。脳のＡＤＡＭ１０レベルのわずかな増加が、疾病表現形を抑制することが見出されている。
本発明は、ＲＡＰ、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体又はその組み合わせ及びＡＤＡＭ１０の間の融合体を静脈投与することに基づく、アルツハイマー病の治療を意図する。好ましい実施形態は、ＡＤＡＭ１０−ＲＡＰ又はＲＡＰ変異体融合体又はＣＲ特異的抗体を投与すること、及び、脳のα−セクレターゼ活性を増加させることを含むアルツハイマー病の治療方法であり、本明細書中に記載の投与は、静脈内、頸動脈又は髄腔内投与を介して行われる。α−セクレターゼのレベルの増加は、言い換えれば、ＡＰＰの処理アミロイド生成経路から遠ざけて転換させることが期待される。ｓＡＰＰα産生の強化及びその結果であるＡβの産生の減少は、アルツハイマー病に苦しむ患者に対する治療的効果を有することが予測される。あるいは、本発明は、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体、及び、ＡＰＰ又はＡβ上に作用する、又はβ−セクレターゼ阻害剤を伴う又はγ−セクレターゼ阻害剤を伴うその他のプロテアーゼの間の融合体を投与することを含む、アルツハイマー病の治療を意図する。
関連する態様において、本発明は、連結されたプロドメインを有するＡＤＡＭ１０−ＲＡＰ融合体又はＣＲ特異的抗体を用いて、静脈注射された活性なシェダーゼ酵素の周辺効果を最小化することを意図する。無傷のプロＡＤＡＭ１０−ＲＡＰは、フリン阻害剤であるα１−アンチトリプシン Ｐｏｒｔｌａｎｄを用いた共発現により、標準的な生産系から単離され得る（Ｓｒｏｕｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５５４、２７５−２８３；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ、ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，２６２１０−２６２１８）。次いで、融合体の活性化は、トランスサイトーシスの間、又は、脳間質に到達する際のいずれかに、組織へのクリアランス後の、プロドメインの除去により生じるであろう。トランスサイトーシスの間に、ＬＲＰとの結合によって、融合体は膜に結合される。融合体−受容体コンジュゲートは、次いで、エンドソーム内で細胞を通過する。ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの先の研究は、トランスサイトーシス中の通過における、いくつかのタンパク質の部分的タンパク質分解を示した（Ｌｉｓｉ、ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ ２６、１１０５−１１１０）。ＡＤＡＭ１０−ＲＡＰ又はＣＲ特異的抗体のエンドサイトーシスは、内皮細胞への初発のエンドサイトーシスの際に、又は、ニューロンへの最終的なエンドサイトーシスの際のいずれかに、初期エンドソーム中で前記の融合体をフリンへと曝すだろう（Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ５２、５６７−５７９；Ｂｏｓｓｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２６，１１５７−１１７２；Ｒｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ
Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１３（Ｐｔ１２），２０９３−２１０１）。ＡＤＡＭ１０の活性化を遅延させるための別のアプローチは、プロドメイン及び触媒ドメインに結合するフリン感受性ペプチドリンカーを、ＡＤＡＭ感受性ペプチドリンカーへと置換することである。修飾されたドメインが生産系中で開裂される程度に、この反応は、ヒドロキサメート阻害剤存在下での培養により、又は、ＴＩＭＰ１又はＴＩＭＰ３（Ａｍｏｕｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４７３、２７５−２７９）を用いた共発現により、阻害され得る。周辺部でのＲＡＰ融合体の半減期が短い一方、ＡＤＡＭ感受性のプロＡＤＡＭ１０−ＲＡＰ融合体の蓄積は、間質腔内部のニューロン表面で、融合体を内因性の活性ＡＤＡＭ１０に曝すことを引き起こすであろう。次いで、タンパク質分解的な連鎖反応は、続いてより多くのＡＤＡＭ１０−ＲＡＰを活性化する、活性化された各々のＡＤＡＭ１０−ＲＡＰ融合体を用いて予測されるであろう。マンニトールを用いた頸動脈内共投与ならびに髄腔内投与は、不活化ＡＤＡＭ１０を必要としないであろう。
本発明により意図されるさらなる神経疾患は、以下に記載の通りである。例えば、パーキンソン病は、身震い及び運動ニューロン機能の減少、剛性及び運動不能により特徴付けられる。これらの神経学的徴候は、黒質線条体の主要な遠心性の突出、すなわち黒質線条体路の、機能不良によるものである。ドーパミン作動系中のニューロンの細胞体は、ＰＤの進行に関与する主要な細胞である。主要なパーキンソン症候群の例には、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、及び、多系統萎縮症（ＭＳＡ）として公知の症候群における、オリーブ橋小脳変性（ＯＰＣＤ）及びシャイ・ドレーガー症候群（ＳＤＳ）を含めた線条体黒質変性症（ＳＮＤ）を含む。
しばしば「ルー・ゲーリッグ病」と称される筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脳と脊髄の中の運動ニューロンを攻撃する進行性の神経組織変成の疾病である。ＡＬＳにおける運動ニューロンの進行性の退化は、脳が筋肉移動を開始させ制御する能力を低下させて、それらを最終的に死に導く。
遺伝性の疾患であるが、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）は、線条体中型有棘ＧＡＢＡ生産性ニューロンの変性をもたらす（Ｈｉｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ． ２７：２５５−６５、２００３）。この変性は、無制御な動作、知的機能の損失および情緒障害を引き起こす。
多発性硬化症（ＭＳ）は若年成人において頻度が高く、病弱化させる疾患である。この疾患は、おそらく自己免疫タイプの炎症反応によって特徴づけられ、脱ミエリンの頻度は、乏突起膠細胞の損失、中枢神経系中のミエリン形成細胞にしばしば関連する。現在の利用可能な治療は、ＭＳの炎症因子に向けられており、再ミエリン化への有効性は、もしあったとしても、ごくわずかでほとんどない。
本発明の組成物は脳の癌を治療するのに有用である。最も一般的な脳腫瘍は、神経膠組織で開始されるグリオーマである。星状細胞腫は、成人の大脳中で、星状細胞と称される小型の星形細胞から最もしばしば生じる。グレードＩＩＩの星状細胞腫は、時に未分化星状細胞腫と称される。グレードＩＶの星状細胞腫は、通常、多形膠芽腫と呼ばれる。脳幹グリオーマは、脳の最も低い軸状部分に生じる。脳幹は多くの生活機能を制御する。最も多い脳幹グリオーマは、高グレードの星形細胞である。上衣細胞腫は、通常、心室の裏側内部で成長する。さらにそれらはまた、脊髄中に生じる場合もある。乏突起膠腫は、神経を保護する脂肪の覆いであるミエリンを生産する細胞中で発生する。これらの腫瘍は、通常大脳中で発生する。それらはゆっくりと成長し、脳組織を取り巻く部分へは通常広がらない。髄芽細胞腫は、誕生後の身体には通常残らない原始的な神経細胞から発達する。この理由のために、髄芽細胞腫は時々、原始人神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）と呼ばれる。ほとんどの髄芽細胞腫は小脳中で発生する；しかしそれらは、他の領域で同様に生じる場合もあり得る。髄膜腫は髄膜から成長する。それらは通常良性である。これらの腫瘍は非常にゆっくり成長するので、脳はそれらの存在に適合し得る；それらが徴候を引き起こす前に、髄芽細胞腫は、しばしば非常に大きくなる。神経鞘腫は、聴神経を保護するミエリンを生産するシュワン細胞の中で始まる良性腫瘍である。聴神経腫は一種の神経鞘腫である。頭蓋咽頭腫は、視床下部の近くの脳下垂体領域で進行する。それらは通常、良性であり；しかしながら、それらは時に、有害であると考えられる、なぜなら、それらは視床下部を押し、又は損傷する場合があり、そして、生物機能に影響を及ぼし得るからである。生殖細胞腫瘍は、原始的な（進行中の）生殖細胞あるいは性細胞から発生する。脳中で最も頻繁なタイプの性細胞腫瘍は、ジャーミノーマである。松果体領域の腫瘍は、松果体中あるいは松果体周辺で生じる。腫瘍は増殖の遅い松果体細胞腫又は増殖の速いものであり得る（松果体芽細胞腫）。松果体領域は非常に到達しにくく、これらの腫瘍はしばしば除去できない。
脳腫瘍の治療は多くの要因に依存する。これらの中には、腫瘍のタイプ、位置およびサイズ、ならびに患者の年齢及び総体的な健康がある。通常、脳腫瘍は外科、放射線治療および化学療法で処置される。一態様において、本発明は、本発明のＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体を含む組成物を、神経芽細胞腫又は神経腫瘍を有する対象へと投与することを含む、神経芽細胞腫及び神経腫瘍の生育及び進行を阻害する方法を提供する。さらなる態様において、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体は、神経腫瘍を処置するために有用な物質に対してコンジュゲート化することができる。
（ＧＤＮＦ）
別の好ましい実施形態において、本発明は、ＲＡＰ又はＲＡＰ変異体コンジュゲートを、膠細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）等の神経成長因子へと投与することによる、神経変性の疾患の処置方法を意図する。そのような神経変性の疾患は、限定するものではないが、パーキンソン病を含む。ＧＤＮＦは本来、胚性中脳ドーパミンニューロンに対する栄養素として、ラットグリオーマ細胞株上清から精製された。Ｉｎ ｖｉｖｏで、ＧＤＮＦホモダイマーは、その受容体ＧＦＲα−１と結合し（多分ダイマーも同様である）、次いでＧＤＮＦ−ＧＦＲα−１コンジュゲートが、ダイマー化するＲｅｔタンパク質へと結合する。Ｒｅｔのダイマー化は、チロシン１０６２の自動リン酸化を引き起こす。研究により、ＧＤＮＦが、その他の神経亜母集団に及ぼす顕著な効果を有することが示された。ＧＤＮＦがパーキンソン病の動物モデルでドーパミンニューロンを保護し、ｉｎ ｖｉｖｏで運動ニューロンを救出するため、いくつかの神経変性の疾患を処置するための治療薬としてＧＤＮＦを使用できるという希望が浮上した。しかし、ＧＤＮＦは血液脳関門を通過しない。本発明は、ＲＡＰ又はＧＤＮＦに対する受容体特異的ＲＡＰ変異体コンジュゲートを投与することを含む、血液脳関門を通過してＧＤＮＦを輸送する方法を提供する。
（ｖ．肝臓疾患）
ＬＲＰ１は、ＲＡＰと強力に結合するＬＤＬＲメンバーであり、肝細胞において多く発現されている。本発明の一態様は、肝臓疾患の処置のために肝臓に治療化合物を送達するために、化学治療薬又はその他の物質をＲＡＰ又はＲＡＰ断片と結合させることを意図する。肝臓疾患を処置するためにＲＡＰコンジュゲートを投与することによって、肝臓疾患の処置と関係するいくつかの問題、例えば、肝臓による物質のクリアランス等を解決し得る。なぜならば、大部分の薬物は、注射後、ほとんど直ちに肝細胞へ直接送達されるからである。さらに、ＲＡＰコンジュゲートはＬＲＰ１を介して取り込まれ得るので、原形質膜（ＭＤＲ、Ｐ−糖タンパク質）中の薬物抵抗機序はバイパスされ得る。
本発明によって意図される肝臓疾患は、限定するものではないが、以下に記載される疾患を含む。肝細胞癌、又は肝癌は、世界で５番目に多い一般的な癌であり、罹患率は徐々に上昇している。肝細胞癌は肝細胞の疾患である。発癌性肝細胞は高レベルのＬＲＰ１発現を維持している。腫瘍細胞は高い割合で薬物抵抗性を示し、且つ、使用される化学治療薬は、特に、全身（静脈内）投与によって心臓及び腎臓で深刻な毒性を有することから、肝細胞癌は化学治療薬に対して十分な効き目を表さない。
肝炎は肝臓の炎症に対する総称である。肝炎は急性又は慢性であり得、例えば、ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型若しくはＥ型肝炎又は非ＡＢＣＤＥ型肝炎、ＣＭＶ、エプスタイン・バー）、真菌、リケッチア又は寄生虫による感染、アルコール、化学的毒素、薬物（例えば、アセトアミノフェン、アミオダロン、イソニアジド、ハロタン、クロルプロマジン、エリスロマイシン）、代謝性肝臓疾患（例えば、ウィルソン病、α１抗トリプシン欠損症）、癌、特発性自己免疫肝臓疾患、肝硬変（例えば、原発性胆汁性肝硬変）、胆道閉塞による急性又は慢性の肝不全が含まれ得る。Ａ型、Ｂ型及び／又はＣ型肝炎ウイルスによる肝臓への感染は、肝不全につながる肝臓疾患をゆっくりと進行させ得る。急性の肝炎感染は通常、Ａ型肝炎ウイルスによって引き起こされる。Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎はいずれも体内で持続し、長期間にわたる感染（慢性）となり得る。Ｃ型肝炎は肝硬変及び癌等の重篤な症状を引き起こし得る。
ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体と結合させた組成物を用いて処置し得ることが意図される、さらなる肝臓疾患又は症状としては、肝脂肪変性（米国特許第６，５９６，７６２号）、胆汁うっ滞（米国特許第６，０６９，１６７号）、肝硬変、中毒性肝臓障害、肝切除術後症状、胆汁うっ積が挙げられる。
肝臓疾患の処置に対する、Ｒａｐ変異体又はＣＲ特異的抗体との結合のための候補薬物には、限定するものではないが：５−フルオロウラシル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及び表１に示されるその他の化学治療薬、アデフォビル、ラミブジン、エンテカビル、リバビリン、インターフェロンα、ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、及びその他の抗ウイルス薬、ビタミンＥ、ウルソデオキシコール酸、及び肝臓疾患を処置するために使用されるその他の薬剤を含む。
（ｖｉ． ＲＡＰ、ＲＡＰドメイン、ＲＡＰ変異体、ＲＡＰコンジュゲート、ＣＲ特異的抗体及びその組み合わせによる阻害）
（腫瘍）
別の特定の実施形態において、本発明は、特定のＣＲドメイン又はＣＲドメインの組み合わせに対して向上された選択性を有するＲＡＰ、ＲＡＰドメイン、ＲＡＰ変異体、ＲＡＰコンジュゲート又はＣＲ特異的抗体及びそれらの組み合わせを投与することを含む、疾病の処置方法を包含する。ＬＲＰ５、ＬＲＰ６及びマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＴｌ、ＳＴ１４、ＴＡＤＧ−１５）の過剰発現は、病気に冒された組織の発癌性の増加に関連する（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，９１２９−９１３５；Ｈｏａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０９、１０６−１１１；Ｔａｎｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９２、２７８−２８３；Ｓａｎｔｉｎ、ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１２、１４−２５；Ｓａｎｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃａｎｃｅｒ ９８，１８９８−１９０４；Ｔａｎｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ ２２、１０４−１１４）。これらの発癌性のＣＲ含有タンパク質に結合する分子は、タンパク質機能を直接的に阻止することにより、又は、その選択的分子に対し連結された抗腫瘍薬物によって、これらのタンパク質を過剰発現する組織を標的化することにより、それらの発癌性効果を低減させる手段を提供し得る。マトリプターゼは、Ｎ末端のタイプＩＩ膜貫通型ドメインを介して、上皮細胞の外側膜又は側底膜に固定されている（Ｐｆｉｓｔｅｒｍｕｅｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３９６、１４−２０）。膜に埋め込まれている配列に続いて、細胞外ＳＥＡドメイン、２つのＣＵＢドメイン、４つのＣＲドメイン及びタンパク質Ｃ末端のトリプシンドメインが存在する。マトリプターゼ内のＣＲ配列における突然変異生成は、得られるプロテアーゼ変異体が活性化されないという結果をもたらす（Ｑｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２２、２９１−３０３）。同様に、マトリプターゼの３番目のＣＲドメインに結合する抗体は、その酵素の活性化を阻止する（Ｂａｓｕ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４、３０３−１３）。第３のＣＲドメインを含む、マトリプターゼ内の２つのＣＲ対のうち１つに対する親和性を有するＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体は、この領域に対する抗体によって観察された阻害と同様に、タンパク質分解活性を妨げることが予測された。かかる変異体は、病気に冒された組織中でのマトリプターゼの過剰発現による転移性及び発癌性の効果を低減することが期待された。
（骨粗鬆症）
さらなる実施形態において、本発明は、骨の維持、及び、骨の生育、発達及び維持を阻止する阻害因子に関連するＬＤＬＲに選択的に結合するＲＡＰ分子、ＲＡＰ変異体、ＲＡＰコンジュゲート又はＣＲ特異的抗体又はそれらの組み合わせを投与することによる骨粗鬆症の処置を包含する。ＬＤＬＲ ＬＲＰ５を通じて強化されたＷｎｔシグナルは、骨芽細胞分化の増加、破骨細胞活性の阻害及び骨堆積の促進に関連する（Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ ３４１、１９−３９；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４、４６７７−４６８４；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ４９、８０−８６）。かかるシグナル伝達の機序は、骨芽細胞特異的ＡＰＣ（大腸腺腫性ポリポーシス）ノックアウトマウスを用いて、及びＤＫＫ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）−１に対し非感受性のＬＲＰ５変異体及びスクレロスチン介在性阻害を用いて確認されている（Ｚｈａｎｇ、ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４、４６７７−４６８４；Ｈｏｌｍｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）。本発明は、ＬＲＰ５に選択的に結合して阻害剤のＬＲＰ５への結合を妨げる及び／又はＬＲＰ５を通じてＷｎｔシグナルを強化する分子を投与することにより、骨芽細胞活性の減少及び／又は破骨細胞活性の増加に関連する骨粗鬆症又はその他の疾病の処置方法を包含する。
多様な宿主又は対象が、対象の方法に従って処置可能である。通常、かかる宿主は「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、これらの用語は、食肉目（例えばイヌ及びネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモット及びラット）及び霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー及びサル）を含む哺乳網内の生物を記載するために広く用いられる。多くの実施形態において、宿主はヒトであるだろう。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。発明者によって見出された代表的技術に従う、実施例中に開示された技術が、本発明の実践において良好に機能し、従って、その実践のための好ましい様式を構成すると考え得ることが、当業者により理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示された具体的な実施形態での多くの変更がなされ得、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、なお、類似する又は同様の結果が得られることを理解する。以下の実施例は、ＲＡＰ変異体の製造、単離、及び、それらの好ましい受容体との相互作用を特徴付けるための実験的プロトコルを提供する。
（実施例１）
ＲＡＰ変異体の製造及び分析
材料及び方法
材料−Ｍ１３ファージディスプレイベクターは、Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。発現ベクターｐＥＴ３０（＋）ａ及びＳ−タグ精製試薬はＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。抗ＲＡＰ抗体はＢｉｏＭａｒｉｎ Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃにて製造した。制限酵素及びＴ４ ＤＮＡリガーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。配列データの生成及び分析のためには、ＡＢＩ ３１００ Ａｖａｎｔ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いた。ヘキサヒスチジンタグ精製試薬は、Ｑｉａｇｅｎから入手した。抗ＲＡＰポリクローナル抗体は先に記載されたものである（４９）。
ＣＲタンパク質の発現、リフォールディング及び精製−ＣＲタンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏで発現され、精製され、それらの天然形態へとリフォールドされ得ることが、他者により的確に示されている。（４５、５０−５４）。本明細書に記載の研究では、この工程について以下のＣＲ配列が選択された：ＬＲＰ６（ＣＲ１−３）由来のＣＲトリプレット、前記トリプレット（ＣＲ１及び２、ＣＲ１２と称する、ＣＲ２及び３、ＣＲ２３と称する）内のＬＲＰ６由来の２つのＣＲ対、ヒトＶＬＤＬＲ（ＣＲ６−８）由来のＣＲトリプレット、ＶＬＤＬＲ（ＣＲ７８）由来のＣＲ対、ＬＲＰ２（ＣＲ３４−３６）由来のＣＲトリプレット、ＬＲＰ２（ＣＲ８９、ＣＲ３４３５）由来の２つのＣＲ対、マトリプターゼ／ＳＴ１４／ＴＡＤＧ−１５（ＣＲ１２、ＣＲ２３及びＣＲ３４）由来の３つのＣＲ対、ＬＲＰ１（ＣＲ３−５）由来のＣＲトリプレット及びＦＤＣ−８Ｄ６抗原由来のＣＲ対。各々をコードするＤＮＡ断片は、ヒトｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ（商標）から、又は、ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰｆｕＴｕｒｂｏ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び以下のプライマーを用いて先にクローニングされたＬＲＰ６ ｃＤＮＡ（９）からＰＣＲ増幅した：
それぞれの増幅された断片を次いで、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、同様に消化したｐＥＴ３０（＋）ａへと連結した。得られるプラスミドは、ＣＲ断片へと融合されたＮ−末端ヘキサヒスチジン及びＳ−ペプチドからなるタンパク質をコードする。連結反応物を、エレクトロポレーションによってＸＬ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと形質転換し、単コロニーからプラスミドを単離した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ 試薬及び以下のプライマーを用いて、３つの変異、Ｙ１０４０Ｗ、Ｖ１０４７Ｄ及びＲ１０８８Ｄを、単独で又は組み合わせて、ＬＲＰ２ ＣＲ８９発現プラスミドへと導入した：
挿入配列及び発現ベクターとの連結を確認するために、全ての発現構築物の配列を解析した。各プラスミドを次いで、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＰＬ（商標）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために用いた。３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充したＬＢ倍地中で生育させた対数増殖期の細胞中に２ｍＭのＩＰＴＧを添加し、次いでインキュベーターの温度を３２℃に下げて、２５０×ｇで攪拌しながら４時間インキュベーションすることにより、ＣＲタンパク質の発現を引き起こした。細胞を沈殿させ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８Ｍの尿素中に、初発培養量の３．５％となるよう再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞を液体窒素中で凍結し、３７℃で迅速に融解して、３ｍｍのプローブに連結されたＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ ＣＰ−１３０超音波処理装置を用いて、振幅設定６０で１０秒間超音波処理を行った。この処理を２回繰り返し、細胞を完全に溶解するようにした。Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５遠心分離装置中で１５℃、２０分間、１０，０００×ｇにて２回遠心分離することにより、溶解液を清澄化した。ＣＲタンパク質の精製には、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）、１．５ｍＬの充填カラム）を用いた。手短に言えば、２カラム容量の溶解緩衝液で樹脂を平衡化した。次いで、清澄化溶解液に、イミダゾールを２０ｍＭまで補充し、平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂と共に一晩、４℃にてインキュベートした。通過画分を廃棄した。カラムを１カラム容量の溶解緩衝液を用いて洗浄し、次いで、２０ｍＭのイミダゾールを補充した１カラム容量のＴＢＳ、ｐＨ８にて３回洗浄した。次いで、ＣＲが搭載されたビーズをカラムから除去し、２００ｍＭのイミダゾールを含む１カラム容量の同様の緩衝液と共に室温で３０分間インキュベートすることによって、ＣＲタンパク質を溶出した。このステップを１度繰り返し、溶出液をプールした。次いで、溶出したＣＲタンパク質溶液を、２Ｍの尿素、１０ｍＭのＣａＣｌ２及び５ｍＭのＤＴＴへと添加した。精製され、変性されたＣＲタンパク質溶液を３，５００ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）カセットへと移し、２００倍過剰量の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭの還元型グルタチオン、０．５ｍＭの酸化型グルタチオンに対して、室温にて一晩、次いで、５ｍＭのＣａＣｌ２を添加したＴＢＳに対して、４℃にて一晩、順次透析した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより調べ、純度は、クマシー・ブリリアント・ブルーを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
ＲＡＰファージディスプレイライブラリーの調製−ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ（商標）試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ファージディスプレイファージミドのｐＨａｇｅ３．２を修飾し、ｐＩＩＩリーダー配列内のＰｆｌＭＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を除去した。さらに、ｐＨａｇｅ３．２のポリリンカーを、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ及びＡｇｅＩ部位を含む二重鎖リンカーへと連結することにより修飾した。得られた修飾ファージミドをｐＨａｇｅ３．６と名付けた。ＲＡＰ及びヒト−□−Ｌ−イズロニダーゼ間の融合体を発現するための先に記載されたベクターであるｐｃ３Ｂ−ＲＡＰＩＤＵ（４９）を、ＢａｍＨＩ及びＡｇｅＩを用いて消化し、ヒトＲＡＰ配列をコードするＤＮＡ断片を得た。この配列はＲＡＰ ｃＤＮＡのヌクレオチド１０２から開始し、ヌクレオチド１０５９で終わる。コードされたＲＡＰタンパク質は、Ｎ末端のＲＡＰシグナルペプチド及びＣ末端のＨＮＥＬ小胞体保留シグナルをいずれも欠く。さらに、５’末端にインフレームのＢａｍＨＩ部位、及び、３’末端にＡｇｅＩ部位を含むペプチドＡＥＡＥＴＧをコードするインフレーム配列が存在する。同様に消化したｐＨａｇｅ３．６へとＲＡＰ配列を連結し、Ｍ１３ ｐＩＩＩリーダーペプチド、ＲＡＰ配列及びｐＩＩＩ配列の間の融合体を作製した。この構築物をｐＨａｇｅ３．６ＲＡＰと名付けた。次に、受容体結合にとって重要であることが先に報告されている、ＲＡＰの第３ドメイン内の２つの位置（ＲＡＰ ｄ３のＫ２５６及びＫ２７０）を変異させた（５５）。これらの２つの位置を、以下の通常の及び変異原性のプライマー対を用いて、ＲＡＰ ｄ３の５’及び３’側の半分を別々にＰＣＲ増幅することによって飽和させた：
ｐｃ３Ｂ−ＲＡＰＩＤＵから断片を増幅した。各変異原性のプライマーは、選択されたリジンコドンのひとつを、４７のその他のコドンのひとつ又は３つの可能性ある停止コドンと置換する。この置換は、ヌクレオチドの２３０４通りの可能性ある組み合わせ及び、アミノ酸（又は終止コドン）の４４１通りの可能性ある組み合わせのプールを創り出す。ＲＡＰ ｄ３ ５’及びＲＡＰ ｄ３ ３’のＰＣＲ断片の両方を、ＰｖｕＩＩを用いて共通の部位で消化し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いた連結反応により結合した。ＰｖｕＩＩ部位で融合された５’及び３’断片からなるヘテロダイマーの連結産物を、ＦＭＣ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ（商標）アガロースゲル上で分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＧＦＸ（商標）試薬を用いて精製した。ヘテロダイマーをＵＶ分光により定量し、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺ ｃｌｏｎｅ（商標）試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びプライマーＲＡＰＫＸＦ及びＲＡＰｍｕｔ１Ｒ（上述）を用いた変異性のＰＣＲによる、さらなる回の変異に供した。ヘテロダイマーの濃度は、最終的な変異頻度を最大化するために、各５０μＬの反応液に対し４００ｐｇ以下に維持した。変異したＤＮＡをＡｇｅＩにより消化し、ＧＦＸにより精製し、ＵＶ分光により定量して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＥＺｃｌｏｎｅ（商標）試薬を用いた、ｐＨａｇｅ３．６ＲＡＰへの、リガーゼを用いないクローニングに使用した。リガーゼを用いないクローニング反応産物を、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ（商標）カラムを用いて精製した。精製されたリガーゼを用いないクローニング産物のアリコート（３μＬ）を、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（商標）化学的コンピテント細胞の５０μＬのアリコートを形質転換するために使用した。形質転換された細胞のアリコートを連続希釈し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢプレート上にプレーティングして、一次形質転換体の数を調べた。残りの形質転換細胞を、Ｎｕｎｃｌｏｎ ２５×２５ｃｍのプレート上にプレーティングした。３５０ｍＬのＱｉａｇｅｎ ＧｉｇａＰｒｅｐ（商標）Ｐ１緩衝液により、総数１１９，５００個の一次形質転換体コロニーをプレートから回収した。Ｑｉａｇｅｎ試薬及びプロトコルを用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミド調製物を定量し、ＢａｍＨＩ及びＡｇｅＩを用いて消化し、適当な大きさの挿入物の存在を確認した。
ＲＡＰ ｄ３変異体ライブラリーの調製−ＰｆｕＵｌｔｒａ酵素及び試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたＰＣＲにより、ＲＡＰ ｄ３変異体ライブラリーを調製した。ＨＰＬＣにて精製した以下のプライマーを用いて、ｄ３コーディング配列の５’及び３’側の半分を別々に増幅した。
プライマーは、位置２５１、２５６及び２７０のコドンをＮＮＢに置換し、これらの位置に任意の可能性あるアミノ酸をもたらす。さらに、ＲＡＰ ｄ３コーディング配列内のＰｖｕＩＩ部位は、単独のサイレント塩基置換により除去された。増幅された断片をＡｍｅｒｓｈａｍ ＧＦＸ試薬を用いて精製し、次いでＰｆｕＵｌｔｒａを用いたプライマーを用いないＰＣＲによって組み合わせた。次いで、組み立てられたＲＡＰ ｄ３変異体配列のプールを定量し、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた突然変異生成に供した。変異させたＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩ及びＡｇｅＩを用いて順次消化し、各反応後にＧＦＸ試薬を用いた精製を行った。次いで、消化されたＲＡＰ
ｄ３変異体断片プールを、同様に消化したｐＨａｇｅ３．６（上述）へと連結した。ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の形質転換及び、カルベニシリンを補充したＬＢ培地の２５×２５ｃｍプレート上へのプレーティングにより、プラスミドライブラリーを調製した。コロニーをプレートから回収し、プラスミドＤＮＡを上述のように調製した。
ファージの調製−エレクトロポレーションによってＸＬ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を形質転換するために、プラスミドライブラリー（１０ｎｇ）を用いた。２％のグルコースを補充した１ｍＬの２×ＹＴ中での、１時間、３７℃のインキュベーションに続いて、形質転換細胞の培養物にカルベニシリンを１００μｇ／ｍＬまで添加し、さらに６時間生育させた。この期間の後に、５０ｍＬ容の三角フラスコ中、２％のグルコース、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び１０８ｐｆｕ／ｍＬのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加した１０ｍＬの２×ＹＴに植菌するために、１ｍＬの培養物を用いた。この培養物を２５０×ｇにて２時間、３７℃にて震盪し、次いでＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５遠心分離装置中で、２，０００×ｇにて１０分間遠心分離し、細胞を沈殿させた。細胞を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１０ｍｌの２×ＹＴ中に再懸濁し、一晩、３７℃にて震盪した。培養物を２度の１０，０００×ｇでの遠心分離により清澄化し、上清を回収した。上清を１容量の冷ＴＢＳ、及び０．２容量の２％のＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ）、２．５ＭのＮａＣｌと合わせることによりファージを沈殿させ、１０，０００×ｇでの遠心分離により回収し、ＴＢＳ中に再懸濁した。ファージサンプルを連続希釈し、対数期のＸＬ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’と共にインキュベートして、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した２×ＹＴプレート上にプレーティングすることにより、ファージ力価を調べた。
ファージパンニング−Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６穴ウェルプレートを被覆するために、精製されフォールディングされたＣＲタンパク質を、１μｇ／ウェルで、一晩、４℃にて、５ｍＭのＣａＣｌ２を補充したＴＢＳ中で使用した。ウェルをすすぎ、ファージの添加前に、５ｍＭのＣａＣｌ２を補充したＴＢＳ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）にてブロッキングした。５ｍＭのＣａＣｌ２及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を補充したＴＢＳ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（商標）中で、１０９ｃｆｕ（１０１０ｃｆｕ／ｍＬ）の精製されたファージライブラリーを、被覆されたウェルへと添加し、２時間、室温にてインキュベートした。次いで、ＴＢＳＴＣ（５ｍＭのＣａＣｌ２及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を補充した２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を用いてウェルを１５回洗浄した。結合したファージを、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２中で溶出し、０．２容量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１を含むチューブに移してｐＨを中性にした。溶出液を対数期のＸＬ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細胞と共に混合することにより、溶出されたファージを回収した。液体培養中で３０℃、一晩（１６時間）生育させることにより、レスキューされたファージを増幅した。さらに、サンプルを連続希釈し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２×ＹＴ寒天上にプレーティングすることにより、形質転換された細胞のアリコートの力価を求めた。ファージを精製し、ＰＥＧ沈殿により、培地上清から濃縮した。
ＲＡＰ ｄ３タンパク質の発現−ｄ３ Ｒｅｓｃｕｅ Ｆを用いて、ＲＡＰ ｄ３配列：５’−ＧＣＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３９）及びｄ３ Ｒｅｓｃｕｅ Ｒ：５’−ＧＣＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣ−３’（配列番号４０）をＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、同様に消化したｐＥＴ３０（＋）ａへと連結した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＰＬ（商標）中でＲＡＰ ｄ３タンパク質を発現させ、上述のように、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄのアッセイにより測定し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。
変異体ＲＡＰ ｄ３の逐次的な復帰及び野生型ＲＡＰ ｄ３の前進突然変異−親和性により選択されたＲＡＰ ｄ３変異体の範囲内で、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ（商標）試薬及び以下のプライマーを用いて、各変異を個々に野生型へと復帰させた：
同様の方法及び以下のプライマーを用いて、野生型ＲＡＰ ｄ３を変異させた：
固相結合アッセイ−精製され、リフォールドされたＣＲタンパク質（１μｇ）を、５ｍＭのＣａＣｌ２（ＴＢＳＣ）を添加したＴＢＳ（ｐＨ８）中で、一晩、４℃にて、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６穴ウェルプレートへと結合させた。ウェルをＴＢＳＣを用いて洗浄し、次いで、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴＢＳＣにてブロッキングした。ＲＡＰリガンドを次いで、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を添加した上記ブロッキング緩衝液中で、室温にて、固定化した受容体と共に、各種の濃度にて、２時間インキュベートした。対照のウェルには、リガンドを添加しなかった。カルシウムが存在しないことが結合に影響を及ぼすか否かを調べるための、さらなる対照として、同じサンプルに対するインキュベーション培地中に、１０ｍＭのＥＧＴＡを含ませた。ウェルをＴＢＳＴＣにて洗浄し、ポリクローナル抗ＲＡＰ（ＢＰ４１／４２、１：１，０００、ＢｉｏＭａｒｉｎ）を用いて、結合したリガンドを検出した。過剰な一次抗体を除去し、二次抗体であるＨＲＰをコンジュゲート化したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とインキュベーションする前に、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＨＲＰを検出するために、ＴＭＢ基質溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。１ＮのＨＣｌを用いて色の進行を停止した。マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、４５０ｎｍにおける吸収を測定した。データをプロットし、単一部位結合の仮定による非線形回帰により、Ｋｄ値を得た（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
（結果）
ヒトプロテオーム内のタンデムなＣＲ対を同定し、先にＲＡＰへの結合に関係するとみなされている対の中でのそれらの位置を解析するために、Ｐｆａｍデータベース（ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）中に特定された１９０の重複のないヒトＣＲ配列をスプレッドシートへと移した。次いで、ＣＲ配列のタンデムな対を、その中でそれらが見出されたタンパク質の一次配列内で互いに極めて隣接する２つのＣＲ配列として配置されるという要件のみによって特定した。Ｐｆａｍデータベース中に定義される場合で、各ＣＲ配列の最初のアミノ酸間の距離を７５アミノ酸という限界を課し、この条件で適切に試験を行った。ＣＲ配列を定義するためのＲＡＰの結合に関する歴史的なデータにそのような対が優勢に含まれることから、タンデムな配置の要件を仮定した。３つのＣＲ配列の直鎖アレイが２つのＣＲ対を含むように、オーバーラップする対が含まれる。このやり方で同定された１４９のタンデムなＣＲ対が存在した。カルシウム結合ループの領域での配列保存性が、解析における次のステップである、先の研究でのＲＡＰ結合に関与する４つのアミノ酸の抽出を助けた（５６、５７）。これらは、ＣＲ対の各ＣＲ配列でのＡｘｃＢｘＣｘＤモチーフ由来のＡ及びＣに相当する。次いで、各対の最初のＣＲ配列由来のＡ及びＣの位置における、各対の第二のＣＲ配列（以降、Ａ’及びＣ’）由来のＡ及びＣ位置におけるアミノ酸とのアミノ酸同一性を比較する目的で、単一の、テトラマーのテキスト文字列（ＡＣＡ’Ｃ）にコンカテマー化した。各ＣＲ対に対するテキスト文字列を、その他全てのＣＲ対のものと比較し、各々の頻度を係数した。この分析で特定された１４９の重複のないヒトのタンデムなＣＲ対の配列の中で、Ａ、Ｃ、Ａ’及びＣに最も共通的なアミノ酸の組み合わせはＷＤＷＤであり、１６回繰り返して見出された。さらに、ＷＥＷＤの形を有する合計４つのＣＲ対が存在し、ＷＥＷＥを有する２つの対、及びＷＤＷＥを有する６つの対が存在し、標準的なＣＲ対の定義に合致する合計２８の対が存在していた。標準的なＣＲ対の形式は、ＬＤＬＲファミリー中、特にＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ＬＲＰ４、アポＥＲ２及びソーチリン中にのみ見出された。これらの受容体の全ては、高い親和性でＲＡＰを結合することが先に示されている。より低い頻度での、重複のある組み合わせに加えて、その全てのＣＲ対を含むタンパク質が少なくとも１つを有する１０１の固有の組み合わせが同定された。次いで、それぞれのＡ、Ｃ、Ａ’及びＣにおける４つのアミノ酸の組み合わせを、それらの側鎖の、おおよその物理化学的特性に基づく６グループへとアミノ酸を割り当てることによって生成した。疎水性脂肪族アミノ酸はグループ１（Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ）、小さい親水性アミノ酸がグループ２（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ）、塩基性アミノ酸はグループ３（Ｈ、Ｋ、Ｒ）、酸性アミノ酸はグループ４（Ｄ、Ｅ）、カルボキシアミドアミノ酸はグループ５（Ｎ、Ｑ）及び芳香族アミノ酸はグループ６（Ｆ、Ｗ、Ｙ）へと割り当てられた。前述の通り、生成された各々の組み合わせを、次いで、その他のかかる全ての組み合わせと比較し、それらの頻度を計数した。最も一般化された共通的な組み合わせは６４６４であることが見出され、Ａ及びＡ’の位置が芳香族アミノ酸であり、Ｃ及びＣ’の位置が酸性アミノ酸であった。このグループは、２８の特定の重複を有する組み合わせを全て含み、１４９のＣＲ対の組み合わせのうち４４を占める。このクラスのＣＲ対の代表例は、ＬＤＬＲファミリー外の２つであるｃｏｒｉｎおよびパールカンを含む１０種のタンパク質中に見出された。合計５７の生成された組み合わせは固有のものであり、前述の通り、少なくとも１つの固有の組み合わせが、ＶＬＤＬＲを除いて、各ＬＤＬＲ受容体細胞外ドメイン中に見出され得るものであった。選択された位置に固有に生成されたアミノ酸の組み合わせを有する、ＣＲ対を含むその他のタンパク質としては、膜貫通型セリンプロテアーゼであるマトリプターゼ１、２及び３（ＭＴ−ＳＰ１、ＳＴ１４、ＴＡＤＧ−１５）、ＦＤＣ−８Ｄ６抗原、コリン（ｃｏｒｉｎ）、補体因子Ｉ及びヘパリン硫酸プロテオグリカンタンパク質、パールカン（２５、５８）を含む。
各ＣＲのカルシウム結合ループ内のＡ、Ｃ、Ａ’及びＣにおいてアミノ酸の固有の組み合わせを有する多数のＣＲ対から、ＲＡＰ ｄ３へのそれらの結合を試験するために、ＣＲ対又はトリプレットが選択された（図２）。ＦＤＣ−８Ｄ６タンパク質由来の付加的な対が試験され、配列（ＧＳＳＣＰＰＴＫＦＱＣＲＴＳＧＬＣＶＰＬＴＷＲＣＤＲＤＬＤＣＳＤＧＳＤＥＥＥＣＲＩＥＰＣＴＱＫＧＱＣＰＰＰＰＧＬＰＣＰＣＴＧＶＳＤＣＳＧＧＴＤＫＫＬＲＮＣＳＲＬＡＣＬＡＧＥＬＲＣＴＬＳＤＤＣＩＰＬＴＷＲＣＤＧＨＰＤＣＰＤＳＳＤＥＬＧＣＧ）（配列番号９１）を有する８Ｄ６ ＣＲ１２として設計された。選択された受容体断片は、ＣＲ配列の単独の対又は２つのオーバーラップする対（トリプレット）を含んでなり、選択された位置でのアミノ酸の組み合わせの範囲を反映することが意図された。オーバーラップする対が分離された対よりも効率的にフォールディングされないことを考慮して、各トリプレットを形成する１つ又は両方のオーバーラップする対をいくつかの場合で発現させることも行った。配列は、ＬＲＰ６ ＣＲ１−３と称される、ヒトＬＲＰ６（Ｕｎｉｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｏ７５５８１）の全長のアミノ酸１２４７−１３６３に相当するＬＲＰ６ ＣＲトリプレット；ＬＲＰ６トリプレット、ＬＲＰ６ ＣＲ１２及びＬＲＰ６ ＣＲ２３、アミノ酸１２４７−１３２２及び１３２３−１３６３を含む両方のオーバーラップするＣＲ対；ＶＬＤＬＲ ＣＲ６−８と称する、アミノ酸２３５−３５８（Ｕｎｉｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ９８１５５）のＶＬＤＬＲ断片；アミノ酸２９５−３５８を含む、ＶＬＤＬＲ ＣＲ７８と称するＶＬＤＬＲトリプレット内のＣＲ対；ＭＡＴ ＣＲ１２（ＳＴ１４ ＣＲ１２）と称する、アミノ酸４５２−５２４の、ＭＡＴ ＣＲ２３（ＳＴ１４ ＣＲ２３）と称する、アミノ酸４８７−５６６（Ｕｎｉｐｒｏｔ アクセッション Ｑ８ＷＶＣ１）の、及びＭＡＴ ＣＲ３４（ＳＴ１４ ＣＲ３４）と称する、アミノ酸５２５−６０２の膜貫通型セリンプロテアーゼであるマトリプターゼ由来の３つのＣＲ対；ＦＤＣ−８Ｄ６抗原、アミノ酸５３−１６８（Ｕｎｉｐｒｏｔ アクセッション Ｑ９ＮＰＦ０）、及び、アミノ酸８５２−９７３（Ｕｎｉｐｒｏｔ アクセッション Ｐ９８１５７）を含む、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５と称するＬＲＰ１由来のトリプレット由来のＣＲ対、を含んでいた。ＬＲＰ１ ＣＲ３−５は、２つの、オーバーラップする重複を有するＷＤＷＤの形態のＣＲ対からなり、各々は先に、ＲＡＰ ｄ３と高親和性で結合することが示されている（５６）。
先の多数の研究が、ＣＲ対及びトリプレットがバクテリア中で発現され得、ｉｎ ｖｉｔｒｏで天然構造へとリフォールドされ得ることを示している（４５、５０−５４、５６、５７、５９−６２）。精製され、リフォールドされたそれぞれのＣＲタンパク質は、発現され、還元的条件及び非還元的条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された（図３）。還元的条件下で、ＣＲの移動度は予測される分子量と一致し、各タンパク質は９０％以上の純度であると判定された。非還元的条件下で、各ＣＲタンパク質は、ゲルを通じて、予測される分子量について期待されたよりも、より迅速に移動した。この知見は、分子内ジスルフィド結合の形成に依存してコンパクトにフォールディングされた構造と合致する。多数の可能性あるジスルフィド結合の組み合わせがあり得、上記に引用された研究は、天然のジスルフィド結合パターンが、再フォールディングの間、特にカルシウム存在下で好ましいことを示す。最も多くの場合、かつ、電気泳動分析の分離性が相対的に低いことを考慮して、フォールディングされた形態のＣＲタンパク質は、シングルバンドとして存在するように見える（図３）。
野生型ＲＡＰ ｄ３の、各ＣＲ対又はオーバーラップする対のセットへの結合を、次いで固相アッセイにより測定した（図４）。このアッセイにおいて、ＲＡＰ ｄ３がＬＲＰ１ ＣＲ３−５へと結合するための見かけのＫｄは１１ｎＭであり、先に報告された値と同様の範囲であった（５６、５７、６３）。ＬＲＰ６ ＣＲ１２、ＬＲＰ６ ＣＲ２３、ＬＲＰ６ ＣＲ１−３、ＶＬＤＬＲ ＣＲ７８、ＬＲＰ２ ＣＲ３５３６、ＬＲＰ２ ＣＲ３４−３６及びＭＡＴ ＣＲ２３へと結合するＲＡＰ ｄ３は、試験した最高のリガンド濃度におけるＬＲＰ１ ＣＲ３−５の値の５％未満であった。別のセットの試験において測定されたＭＡＴ ＣＲ１２及びＣＲ３４に対するＲＡＰ ｄ３の結合も、検出不能であった。ＶＬＤＬＲ ＣＲ６−８及びＬＲＰ２ ＣＲ８９へと結合するＲＡＰ ｄ３はわずかに高く、結合アイソサームに対し信頼性を有して曲線が適合した。それにも関わらず、ＲＡＰ ｄ３のこれらの受容体断片に対する結合に関する見かけの解離定数は３００ｎＭを超えていた。
カルシウム結合ループ内でのアミノ酸の固有の組み合わせを含むＣＲ対に対してＲＡＰ
ｄ３が結合しないことが確立されており、そのような対に結合可能なＲＡＰ ｄ３の変異体に関する親和性選抜系が開発された。その他のタンパク質に対するＲＡＰの融合体が、哺乳類及びバクテリア細胞の両方で発現され、天然ＲＡＰの受容体結合挙動を維持していることが示されている（４９、６４、６５）。従って、その他のタンパク質を用いて先に行ったように、Ｍ１３ ｐＩＩＩ構造タンパク質に対しＮ−末端で融合させた全長ＲＡＰのライブラリーを作製した（６６）。ＲＡＰ変異体のプールを作製するために、全長ＲＡＰコーディング配列内の第３ドメインに対し、２つの変異原性の手法が適用された。受容体の結合に直接的に関与することが先に示されている２つの位置、Ｋ２５６及びＫ２７０に関するコドンが、飽和突然変異生成に最初に供された。変異性のＰＣＲを用いて、さらなる変異が次いでランダムにＲＡＰ ｄ３へと導入された。これらの手順に続いて、合計３８のランダムに選択されたクローンが、変異頻度を調べるために配列解析された。１０個のクローン（２６％）が塩基挿入、欠失又は置換され、ＲＡＰ配列内の停止コドンをもたらした。ファージ組み立て及び感染のプロセス中には、かかる配列をコードする組み換えファージが好ましいであろう、なぜなら、野生型のｐＩＩＩのみがファージキャプシド内へと取り込まれるからである。さらなる４つのクローン（１１％）が野生型ＲＡＰをコードすることが見出された。残る２４クローン（６３％）のＲＡＰファージ−ｐＩＩＩ融合体は、ｄ３中に変異を有するＲＡＰタンパク質をコードしていた。これらのクローンのいずれもが、２５６及び２７０の位置のアミノ酸に同様の組み合わせを有さず、期待通り、これらの部位で一定の範囲の置換が生じることを示唆した。位置２５６及び２７０以外での平均的な変異の頻度は、ＲＡＰの最後の１１０アミノ酸内で、２．４アミノ酸置換であった（ＲＡＰ ｄ３）。３８クローン中のひとつは、インフレームの７コドンの欠失を有し、一方、別のものは、ＲＡＰ ｄ３の３’末端が部分的に置換された未同定の配列の、インフレームの挿入を有していた。ＲＡＰのｄ１又はｄ２内に変異は見出されなかった。
第二のファージディスプレイライブラリーを、ＲＡＰ ｄ３のみをコードするように作製した。このライブラリーは、変異体中のこの部位が重要であることが先のスクリーニング（以下参照）から明らかであることに基づいて、付加的な位置である２５１を除いては，全長ＲＡＰライブラリーと同様の様式で作製された。位置２５１、２５６及び２７０は別として、ＲＡＰ ｄ３変異体ライブラリーは、ＲＡＰの最後の１１０アミノ酸内で２アミノ酸が置換するという平均的変異頻度を有していた。このライブラリー中で、野生型ＲＡＰ配列の見かけの過剰な発現は見られなかった。
親和性に基づいてＲＡＰ配列を単離するためにファージパンニング系が使用可能であるかどうかを調べるために、野生型ＲＡＰを発現するファージ調製物を、ＣＲ対への結合能力を失った変異体ＲＡＰ（Ｋ２５６Ｄ、Ｋ２７０Ｄ）（５５）を発現するファージ調製物へと１０００倍に希釈した。記載された方法によってパンニングを実行した。回収されたファージを増幅し、力価を調べた。１０個の回収されたコロニー由来のＲＡＰ ｄ３配列を配列解析した。単回のパンニング後に、パンニング試験由来の１０コロニー中の２個が、初発のプールから２００倍に富化された野生型ＲＡＰを含んでいた。より複雑な配列のプールを用いたさらなる系の試験として、位置２５６及び２７０がランダム化されたＲＡＰファージライブラリーをＬＲＰ１ ＣＲ３−５上でパンニングした。最初のファージライブラリー中で、野生型ＲＡＰ配列は１０ファージのうちの約１つによりコードされていた（選抜前のランダムなクローンの配列解析に基づく）。最初の回のパンニングに続いて、野生型ＲＡＰ配列は、１０ファージ中の７つによりコードされていた。この結果は、１回のパンニング後で、複雑な配列プールから得られる選択された配列に関する、７倍の富化を示す。
ＲＡＰ配列がファージディスプレイライブラリーから親和性選択によって単離され得ることを結論して、我々は野生型ＲＡＰ、ＬＲＰ２ ＣＲ８９には結合しないＣＲ対を最初に選択し、それを、二重変異された全長ＲＡＰファージライブラリーと共にパンニング基質として用いた。４回のパンニング後に、８つのランダムに選択したクローンのうち３つは同一であった。共通の配列は７つの変異：Ｖ１７５Ｌ、Ｓ２１３Ｔ、Ｅ２１７Ｋ、Ｈ２４９Ｙ、Ｅ２５１Ｋ、Ｋ２５６Ａ、Ｋ２７０Ｅを有していた。第２のグループの４つのクローンは、位置２５６及び２７０に同一の置換を有し（Ｋ２５６Ａ、Ｋ２７０Ｒ）ていたが、これらの２つの部位以外は可変的な置換パターンを有していた。５回目のパンニング後には、ランダムに選択された８クローン中の７つは先に観察されたＶ１７５Ｌ、Ｓ２１３Ｔ、Ｅ２１７Ｋ、Ｈ２４９Ｙ、Ｅ２５１Ｋ、Ｋ２５６Ａ、Ｋ２７０Ｅの変異セットであった。ＲＡＰｖ２Ａ又はＭｅｇａＲＡＰ１と称する、この配列に関する全ての変異は、変異体ライブラリーを作製するために特異的に変異させた領域中に存在していた。
ライブラリーの分離が親和性選抜の結果として生じたことを確認するために、ＲＡＰ及びＭｅｇａＲＡＰ１ファージを調製し、ＬＲＰ２ ＣＲ８９への結合を調べた。同様の初発力価を用いて、ＭｅｇａＲＡＰ１ファージを用いてパンニングすることにより、野生型ＲＡＰファージよりも２．６倍多いコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）が得られた。結合したファージを抗ｐＩＩＩ抗体を用いて検出した場合に同じような結果が得られたことから、２つのファージの間の感染性の差は、回収されたファージの力価における差によるものではなかったことが示された。５０ｍＭのＥＤＴＡ存在下で結合反応を起こさせることにより、ＭｅｇａＲＡＰ１の結合は、カルシウムに依存して決定され、受容体として望まれるＣＲのフォールディングが必要とされることと合致する。ＲＡＰ及びＭｅｇａＲＡＰ１ファージの両方は、単一の保存された置換（Ｖ１７５Ｌ）が異なる同様のｄ１配列及びｄ２配列を有しているために、我々は、ｄ３中の差異がＬＲＰ２ ＣＲ８９への結合を向上させるために関与すると仮定した。従って、ＲＡＰ ｄ３及びＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３が、次なる結合分析のためにサブクローニングされ、発現された。さらなる研究のために発現されるｄ３領域は、成熟ＲＡＰのアミノ酸２０１−３１９を含んでなり、ＲＡＰｖ２Ａの結合挙動に及ぼすＶ１７５Ｌ変異の効果は調べなかった。
次に、ＲＡＰ ｄ３及びＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３タンパク質の、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５及びＬＲＰ２ ＣＲ８９への結合を調べた。親和性の差に対する各ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３変異の相対的な寄与を理解するために、我々はまた、全てがＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３及び野生型ＲＡＰ ｄ３の間の配列変異体中間体を含む、多数のＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３復帰突然変異体及びＲＡＰ ｄ３前進突然変異体を調製した（図５Ａ及び５Ｂ、表１）。全てにおいて、１０ｍＭのＥＧＴＡは、ＲＡＰ ｄ３及びＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３の両方のＣＲタンパク質への結合を妨げた。カルシウムは、結合緩衝液中に存在する唯一の二価金属イオンであるため、この知見は、ＲＡＰ ｄ３及びＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３の両方がカルシウムを有するＣＲ対へと結合することに合致する。１６ｎＭの解離定数でＬＲＰ１ ＣＲ３−５と結合したＲＡＰ ｄ３は、図４中に示されるデータと一致する、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に対する顕著な親和性を示した。逆に、３８ｎＭの見かけの解離定数でＬＲＰ２
ＣＲ８９と結合したＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３は、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５に対する顕著な親和性は示さなかった。従って、野生型ＲＡＰ ｄ３及びＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３では、これらの２つの受容体断片に対する結合優先度が逆転した。２つのＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３復帰突然変異体であるＴ２１３Ｓ及びＫ２１７Ｅでは、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に対する親和性がわずかに向上し、依然として、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５には検出可能な結合をすることができなかった。３つのＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３復帰突然変異体である、Ｙ２４９Ｈ、Ｋ２５１Ｅ及びＡ２５６Ｋは、いずれかの受容体断片に結合することができず、変異がＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３及びＬＲＰ２ ＣＲ８９の間の相互作用にとって重要であり、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５に対する結合を破壊するために個々には関与しないことを示した。興味深いことに、Ｅ２７０Ｋ復帰突然変異体は、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３よりも高い親和性で両方の受容体断片に結合し、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に対し８ｎＭ、及びＬＲＰ１ ＣＲ３−５に対し１４２ｎＭの見かけの解離定数を与えた。ＬＲＰ２ ＣＲ８９への親和性に基づいてＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３変異体が選択され、この結果は初発のライブラリーの多様性と合致し、全ての可能性を有する配列変異体にとって十分ではなかった。あるいは、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３及びＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３ Ｅ２７０Ｋとの間の親和性の差が、後者が反復的なパンニング上で優位を示すようにするためには不十分である可能性がある。二重復帰突然変異体のＴ２１３Ｓ、Ｅ２７０Ｋは、我々のアッセイでＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３から識別されない結合挙動を有していた。これらの位置での２つの単独部位復帰突然変異体がＬＲＰ２ ＣＲ８９に対して向上された親和性を示すように思われ、Ｅ２７０Ｋ、ＬＲＰ１ １５、ＣＲ３−５の場合にもそうであることから、この結果は、これらの先祖がえりからもたらされる結合効果の欠如、又は、我々のアッセイ中の、この親和性範囲内での正確性の欠如を示す。Ｋ２５１Ｅ、Ｅ２７０Ｋ二重復帰突然変異体の結合挙動は、Ｅ２５１Ｋ変異上のＬＲＰ２ ＣＲ８９に対するＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３の親和性に強い依存性を示す。この復帰突然変異体及び単一部位Ｅ２７０Ｋ２０復帰突然変異体の間の、ＬＲＰ２ ＣＲ８９親和性の差は、ほとんど２０倍である。Ａ２５６Ｋ、Ｅ２７０Ｋ二重復帰突然変異体は、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に対する親和性の２倍の損失をもたらし、Ｋ２５６Ａ ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３変異がこの断片に関する親和性において有する、中程度の正の効果を示す。しかし、最も大きなこの二重復帰突然変異体及びＥ２７０Ｋ単独部位復帰突然変異体の間の違いは、およそ３０倍の、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５への親和性向上である。従って、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３中のＫ２５６Ａ２５変異は、２つの受容体断片の間を区別するこの変異体の能力に関する決定要因であり、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に関して同程度に向上した親和性を有する一方で、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５に関しては親和性に負に影響することにより、その効果を及ぼす。
試験したＲＡＰ ｄ３前進突然変異体のうちで、Ｅ２５１Ｋ、Ｋ２５６Ａ及びＫ２７０Ｅの組み合わせのみが、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に関する測定可能な親和性をもたらした。この三重変異体のＬＲＰ２ ＣＲ８９に関する結合の見かけの解離定数は１１４ｎＭであり、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３と比較してなお相対的に高かった。この親和性の差は、Ｈ２４９Ｙ変異を加えることにより、さらに縮まるようである。２１７、２４９及び２５１における単独部位ＲＡＰ ｄ３変異体は、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５の結合に最小の効果を有し、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に対する測定可能な範囲での親和性をもたらさなかった。Ｋ２７０Ｅ変異は、単独で、又はＥ２５１Ｋ、Ｋ２５６Ａ又はその両方と組み合わせてのいずれかで、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５を測定可能に結合できなかった。ＲＡＰ ｄ３のＬＲＰ１への結合に対する、Ｋ２５６Ａ又はＫ２７０Ｅの顕著な負の効果は、機能喪失ＲＡＰ変異体の研究において先に報告されている（５５）。ここで報告された結果は、本研究と一致する。全体として、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３中の２４９、２５１及び２５６における、ＬＲＰ２
ＣＲ８９を結合することに対する変異の正の寄与、及び、２５６及び２７０における、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５を結合することに対する変異の負の寄与は、２つの受容体断片に対し結合しているＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３及び野生型ＲＡＰ ｄ３の間の違いに主として関するようにみえる。
この研究の１つの前提は、ＣＲ対中のカルシウム結合ループ内のＡ、Ｃ、Ａ’及びＣにおけるアミノ酸が、ＲＡＰに対する結合親和性鍵となる要因であり、ＲＡＰ変異体の結合にとって同様に重要であろうということである。この考えを試すために、変異体ＬＲＰ２
ＣＲ８９を調製し、これらの位置での天然の、重複のない残基を、非天然で重複のある残基で順次置換するように調製した。上記に定義されるように、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に関するＡ、Ｃ、Ａ’及びＣ文字列はＹＶＷＲである。変異体は、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ（ＷＶＷＲ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｖ１０４７Ｄ（ＹＤＷＲ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｒ１０８８Ｄ（ＹＶＷＤ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｖ１０４７Ｄ Ｒ１０８８Ｄ（ＹＤＷＤ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｖ１０４７Ｄ Ｒ１０８８Ｄ（ＷＤＷＤ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｖ１０４７Ｄ（ＷＤＷＲ）、ＬＲＰ２ ＣＲ８９ Ｙ１０４２Ｗ Ｒ１０８８Ｄ（ＷＶＷＤ）を含んでいた。ＲＡＰ ｄ３及びＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３の両方への結合は、各ＬＲＰ２ ＣＲ８９変異体について、固相アッセイにより測定した。ＹＶＷＤ変異体のみがＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３への顕著な結合を維持し、ＬＲＰ２ ＣＲ８９に対し、約２倍、親和性を喪失した（図６及び表２）。ＹＤＷＲの４つの配列文字列を有する位置Ｃの変異体は、全てのその他の単独変異又はＡ又はＣを含む変異の組み合わせのいずれかがそうであるようには、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３に対して測定可能に結合できなかった。興味深いことに、通常的な保存的なＹ１０４２Ｗ変異のみで、ＭｅｇａＲＡＰ１ ｄ３の結合を阻止するためには十分であった。ＬＲＰ２ ＣＲ８９中のＡ’の位置は、野生型ＲＡＰ ｄ３の結合のための標準的な残基であるトリプトファンであり、我々の試験においては変異されていなかった。Ａ、Ｃ、Ａ’及びＣにおけるアミノ酸の置換は、ＭｅｇａＲａＰ１ ｄ３の結合に強い負の効果を有さず、ＬＲＰ１ ＣＲ５６等のその他のＣＲ対中で、ＲＡＰ ｄ３によって好ましいアミノ酸へ置換した場合でも、これらの置換はＲＡＰ ｄ３に対する親和性には大きく影響しなかった。我々は、Ａ、Ｃ、Ａ’及びＣにおけるＷＶＷＤ及びＷＤＷＤの組み合わせに対し、ＲＡＰ ｄ３の結合がわずかに増加したことを見出した。これらの結果は、カルシウム結合ループ中のいくつかのアミノ酸はＲＡＰ及びＲＡＰｖ２Ａの結合挙動を規定するために重要であるが、一方でそれらは単独では不十分であることを示す。
スクリーニング方法の一般性に関する試験として、ファージライブラリーパンニング実験を、さらなるＣＲタンパク質上で実行した。単離した変異体配列を表３及び図８中に示す。最初に、ヒトＶＬＤＬＲの最後の３つのＣＲドメインを構成するＶＬＤＬＲ ＣＲ６−８を、ＲＡＰ ｄ３のみの変異体をコードするファージ−ディスプレイライブラリーによるパンニング用の基質として用いた。５回のパンニング後にランダムに選択されたクローンの８つのうち５つは、同様の変異のセットを有していた：Ｒ２０５Ｓ、Ｅ２５１Ｒ、Ｋ２５６Ｌ、Ｋ２７０Ｅ、Ｒ２９６Ｌ、Ｇ３１３Ｄ。この配列変異体のＶＲＡＰ１）ｄ３を固相結合試験のために発現させた。ＶＲＡＰ１ ｄ３、ＭｅｇａＲａＰ１ ｄ３及びＲＡＰ ｄ３の、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５、ＬＲＰ２ ＣＲ８９及びＶＬＤＬＲ ＣＲ６−８に対する結合を比較した。同様の変異体配列である、Ｅ２５１Ｔ、Ｋ２５６Ｉ、Ｋ２７０Ｅ、Ｒ２９６Ｌを、ＶＬＤＬＲ ＣＲ７８上で選択した。また、同様のｄ３ライブラリーを用いて、ヒトマトリプターゼ由来の３つのＣＲ対である、ＭＡＴ ＣＲ１２、ＭＡＴ ＣＲ２３及びＭＡＴ ＣＲ３４上でパンニングを行った。マトリプターゼ対上での６回目のパンニングにより、ファージライブラリーは優勢な配列へと帰着された。ＭＡＴ ＣＲ２３上で選択されたこの優勢配列はＥ２５１Ｇ、Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２７０Ｗであった。この変異体をＭａｔＲＡＰ１（ＲＡＰｖＭＡ）と名付けた。ＭＡＴ ＣＲ３４上で選択された優勢な配列は、Ｓ２３２Ｐ、Ｅ２３９Ｇ、Ｅ２４６Ｇ、Ｅ２５１Ｌ、Ｋ２５６Ｐ、Ｉ２６６Ｔ、Ａ２６７Ｖ、Ｈ２６８Ｒ、Ｋ２７０Ｐ、Ｈ２７３Ｙ、Ｒ２８７Ｈ、Ｈ２９０Ｙ、Ｋ２９８Ｒ、Ｓ３１２Ｆであった。この変異体を、ＭａｔＲＡＰ２（ＲＡＰｖＭＢ）と名付けた。ＦＤＣ−８Ｄ６抗原由来のＣＲ対上でもパンニング実験を実行した。選択された優勢変異体は、Ｋ２５６Ｓ、Ｋ２７０Ｓ、Ｌ２７１Ｍ、Ｄ２７９Ｙ、Ｖ２８３Ｍ、Ｋ３０５Ｔ、Ｋ３０６Ｍであった。この変異体を３２０ＲＡＰ１と名付けた。
ＲＡＰ ｄ３配列変異体が最小化される長さに関する程度を試験するために、ＰＣＲによってＭａｔＲＡＰ１の順次短縮した部分を調製し、発現させ、精製して、上述のような結合試験を行った（図９）。１０アミノ酸の除去によって、親和性はわずかに減少したが、３１及び４２アミノ酸をＮ−末端から除去することにより、親和性に関し、全長のｄ３変異体を超える３倍までの増加がもたらされた。さらなる１０アミノ酸の短縮（合計５２個）から開始する、さらなるＮ−末端の短縮は、結合の完全な喪失をもたらした。最も良好なＮ−末端の短縮変異体（ＭａｔＲＡＰ１ Ｎ−４２）に関する、その後のＣ−末端の短縮は、Ｃ−末端リンカー及び親和性タグの除去後に２倍の増加（全長の６倍）、及び、次いで、Ｃ−末端からのさらなる６アミノ酸の除去後に４倍の増加（全長の１２倍）を伴う、結合親和性のさらなる顕著な増加をもたらした。さらに１９アミノ酸から開始する、さらなるＣ−末端の短縮は、結合の完全な喪失をもたらした。最も良好な短縮変異体は、アミノ酸２４３−３１３（７１アミノ酸）からなる。親和性向上に関するこの修飾の一般性を試験するために、３２０ＲＡＰ１へも同様の短縮を行った。得られた短縮形態の変異体は、全長の変異体と比較して、ＦＤＣ−８Ｄ６抗原対に対する親和性が３．５倍向上して結合した（図１０）。
ＶＲＡＰ１ ｄ３がＶＬＤＬＲ ＣＲ７８に対し結合する見かけの解離定数は４４±９ｎＭであることがわかった。次いで、ＬＲＰ１ ＣＲ３−５、ＬＲＰ２ ＣＲ８９、ＬＲＰ２ ＣＲ２７２８、ＬＲＰ２ ＣＲ３０３１、ＬＲＰ２ ＣＲ３４−３６、ＬＲＰ２ ＣＲ３５３６、ＶＬＤＬＲ ＣＲ７８、ＶＬＤＬＲ ＣＲ６−８、ＬＲＰ６ ＣＲｌ−３、ＬＲＰ６ ＣＲ１２、ＬＲＰ６ ＣＲ２３、ＭＡＴ ＣＲ１２、ＭＡＴ ＣＲ２３及びＭＡＴ ＣＲ３４を含む１４のＣＲ対又はトリプレットに対し、各８０ｎＭの濃度で、ＲＡＰ ｄ３、ＭｅｇａＲａＰ１ ｄ３、ＶＲＡＰ１ ｄ３、ＭａｔＲＡＰ１ ｄ３及びＭａｔＲＡＰ２ ｄ３の結合を比較した（図７）。前述の通り、ＲＡＰ ｄ３はＬＲＰ１ ＣＲ３−５にのみ結合した。ＭｅｇａＲａＰ１ ｄ３はＬＲＰ２ ＣＲ８９にのみ結合した。ＶＲＡＰ１ ｄ３は、ＶＬＤＬＲ ＣＲ７８及びＣＲ７８対を含むトリプレットであるＶＬＤＬＲ ＣＲ６−８の両方に対し結合した。ＭａｔＲＡＰ１及びＭａｔＲＡＰ２は、ＭＡＴ ＣＲ１２及びＭＡＴ ＣＲ２３の両方に対し結合したが、その他のＣＲ対に対しては感知できるほどには結合しなかった。
ＣＲ対及びトリプレット上でのパンニングに加えて、ＣＲ対を含むヒトタンパク質全体を、ＲＡＰ ｄ３変異体ファージパンニング手法の標的として使用した。これらの市販のタンパク質は、ｃｏｒｉｎの細胞外ドメイン、ＬＲＰ６、ＦＤＣ−８Ｄ６抗原及び補体因子Ｉを含んでいた。単離されたＣＲ対及びトリプレットに関し記載される通りに、パンニングを実行した。
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いたＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的な抗体の評価
ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的な抗体は、治療薬として、又は治療用又は診断用の物質を血液−脳 関門 又はその他のタイプの組織膜を通過して輸送し、各種のヒトの状態又は疾患を処置するために有用である。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの活性又は輸送アッセイ、及び、ｉｎ ｖｉｖｏのＲＡＰ変異体活性又は局在に関する測定は、ＲＡＰ変異体の有効性を調べるための方法の例である。そのようなアッセイの例を以下に開示する。
本明細書中に記載される任意の繰り返しＣＲドメインに結合するＣＲ特異的抗体の調製は、当該技術分野で公知の任意の手段を用いて実行することができ、このため、抗体は、その他のＣＲ対と比較して、所望のＣＲ対に対して、相対的により高い結合をすることによって選抜することができる。次いで、そのようにして選択された抗体の、所望のＣＲを含むタンパク質への結合を、そのファミリー中の１以上のその他のＣＲを含むタンパク質と比較して試験する。これらの基準に合致する抗体を次いで、単独で又はその他の活性物質とコンジュゲート化して、所望の組織へと標的化する能力、受容体活性を変化させる能力、及び／又は、後述のような実験的なアッセイにおける疾病予防又は処置能力に関してアッセイすることができる。
マトリプターゼ選択的なＲＡＰ変異体を用いたｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイ−マトリプターゼ選択的ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体が有する、腫瘍形成及び進行に及ぼすアンタゴニスト効果を調べるために、少なくとも２つのｉｎ ｖｉｖｏモデルを使用することができる。第一のモデルは、ヒト腫瘍細胞株を接種したヌードマウスを使用し、文献中によく記載されている。この系は、ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体の腫瘍の進行を遅らせる能力を試験するために有用である。第二のモデルは、発現を上皮組織に限定して、ケラチンプロモーターの制御下でマウスマトリプターゼを過剰発現するトランスジェニックマウスモデルを使用する。このモデルは先にも記載されている（Ｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００５、１９：１９３４−１９５０）。
組み換えＭＤＣＫ細胞を用いたＬＲＰ２及びＶＬＤＬＲ選択的なＲＡＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ輸送アッセイ−細胞膜を通過するＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体の輸送を調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ輸送アッセイが使用される。ヒトＬＲＰ２（ＬＢ２）及び全長ヒトＶＬＤＬＲのミニレセプター（ｍｉｎｉｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現する、安定的にトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。これらの細胞を、０．４μｍの単一孔サイズを有するトランスウェルポリアセテートメンブレンインサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｏｌｙａｃｅｔａｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｓｅｒｔｓ）（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）上にプレーティングする。細胞を２×１０５／ｍｌ個の密度で撒き、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養する。培地を３日おきに交換する。細胞を５％のＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で維持する。トランスサイトーシス試験を３連で実行する。輸送アッセイの２０分前に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓを、輸送緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び０．１％のアルブミンを含有するＨａｎｋの平衡塩類溶液）中、３７℃で平衡化する。１２５Ｉ−ＲＡＰ変異体（１μＣｉ／ｍｌ）及び９９ｍＴｃ−アルブミン（２μＣｉ／ｍｌ）を上槽又は下槽へと添加することにより、輸送を開始する。全体の手順の間、プレートを１３０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら３７℃に維持する。標識されたタンパク質の添加から５、１０、１５、２０、３０、４０、５０及び６０分後に、１０μｌのサンプルを各ウェルの下槽及び上槽から回収する。６０分間後に上槽及び下槽の溶液を氷上の別々の試験管へと移す。デュアルチャネルプログラムを有するγ−カウンターで１２５Ｉ及び９９ｍＴｃ由来の総放射活性を同時に測定する。酸沈殿及びサンプルの可溶性及び不溶性画分中の放射カウントの比較により、輸送後の完全なＲＡＰ及びアルブミンの量を測定する。
マウス中のＲＡＰ及びＲＡＰ変異体の組織分布測定−ＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体がｉｎ ｖｉｖｏで組織へと出入りする（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｅ）能力を調べるために、処理動物由来の組織サンプル中でのＲＡＰ変異体又はＣＲ特異的抗体の組織分布を測定する。
体重２５〜３５グラムの雄ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ペントバルビタール３０ｍｇ／ｋｇ及びケタミン３０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射することにより麻酔する。各マウスに、１２５Ｉ−ＲＡＰ又はＲＡＰ変異体或いはＣＲ特異的抗体及び１３１Ｉ−アルブミンを、血管間隙マーカー（１％のアルブミンを含有する乳酸リンゲル液中の１μＣｉの各標識タンパク質）として、左頸静脈を通じボーラス注射する。指定された間隔（注射後１〜６０分間）で、右総頸動脈を切断することにより血液を回収し、マウスの頭部を切断する。脳及び周辺組織サンプルを回収し、重量及び放射活性を調べた。分布量は、当該技術分野でよく知られた技術を用いて計算する。組織サンプル中の放射活性の減少は、ＲＡＰ変異体が標識された野生型ＲＡＰとの結合に競合し、野生型ＲＡＰの代わりに取り込まれることを示す。
細胞増殖アッセイにおけるＬＲＰ６選択的ＲＡＰ変異体の抗増殖効果測定−ＬＲＰ６の過剰発現は、腫瘍原性の増加と相関していた。ＲＡＰタンパク質はＬＲＰ６の強力な結合剤であり、ＲＡＰの変異体は、ＲＡＰ／ＬＲＰ６相互作用を阻害する、又はＬＲＰ６を発現する細胞へと薬物を輸送するために有用であり得る。ＲＡＰ変異体の、ＬＲＰ６に介在される細胞増殖を調節する能力を調べるために、細胞増殖アッセイを実行した。
ＬＲＰ６発現構築物（Ｌｉ，（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３、９１２９−９１３５）を用いてトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞を、６−ウェルプレートへと撒いた（ウェルあたり５×１０４細胞）。ＲＡＰ変異体及びその他の試験化合物を、生育培地中に５〜５０ｎＭで含有させる。毎日培地を交換し、細胞を回収する。細胞を計数し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞分析システムを用いて生存率をスコア化する。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた非線形回帰により、各種の試験条件下での倍加時間を得る。ＲＡＰ変異体存在下での細胞増殖の低下は、ＲＡＰ変異体がＬＲＰ６により引き起こされる細胞増殖の有効な阻害剤であることを示す。同様のアッセイを、ＣＲ特異的抗体を用いて実行することができる。
軟寒天コロニーアッセイにおけるＬＲＰ６選択的ＲＡＰ変異体の抗増殖効果の測定−ＬＲＰ６発現構築物を用いてトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞を、寒天層（０．５％の寒天及び５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）でコーティングした６−ウェルプレート中で培養する。０．３３％の寒天及び５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に２×１０３の細胞を含有する第二の層の中に、細胞を撒く。乾燥を防ぐために、寒天及び細胞に培地を重層する。ＲＡＰ変異体を含む試験化合物を、直接的に培地へと添加し、細胞と共にインキュベートさせる。培地を３日毎に交換する。各細胞株について３連のウェルを調製する。３週間のインキュベーション後、直径０．１ｍｍよりも大きいコロニーを計数する。ＲＡＰ変異体存在下でのコロニー形成の低減は、ＲＡＰ変異体が、引き起こされる細胞増殖の有効な阻害剤であることを示す。
腫瘍原性のヌードマウスモデルにおけるＬＲＰ６選択的、マトリプターゼ選択的及びＦＤＣ−８Ｄ６−選択的なＲＡＰ変異体の抗腫瘍効果の測定−ｉｎ ｖｉｖｏのＬＲＰ６、マトリプターゼ又はＦＤＣ−８Ｄ６抗原阻害におけるＲＡＰ変異体の効果を調べるために、腫瘍原性の実験動物モデルを用いた。同様のアッセイを、ＣＲ特異的抗体を用いて実行することができる。
雌無胸腺ヌードマウス（４〜５週齢）（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の脇腹（９）皮下に、ＬＲＰ６発現構築物によってトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞（５０％のマトリゲルマトリックス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する２００μＬの無血清ＤＭＥＭ中に６×１０６個の細胞）、ＣＷＲ２２Ｒ前立腺癌細胞（マトリプターゼ）（６７）又はＬ３０５５バーキットリンパ腫細胞（ＦＤＣ−８Ｄ６抗原）（３６）を注射する。腫瘍細胞を受けたマウス又は対照動物に対して、選択的ＲＡＰ変異体又はビヒクル単独を、滅菌ＰＢＳ中で１日おきに、尾静脈に投与する。腫瘍のサイズを７日毎に測定し、幅（ａ）及び長さ（ｂ）の測定（ａ２×ｂ／２、ここでａ＜ｂ）を用いて腫瘍体積を計算する。
培養骨芽細胞中のＬＲＰ５依存的Ｗｎｔシグナリングに及ぼすＲＡＰ変異体の効果測定−ＬＲＰ５を通じたＷｎｔシグナリングは、骨芽細胞の分化を増加させ、破骨細胞活性を阻害し、骨沈着を促進することが示されている（Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ，（２００４）Ｇｅｎｅ ３４１、１９−３９； Ｚｈａｎｇ、ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４、４６７７−４６８４； Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ、ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ４９、８０−８６）。ＲＡＰはＬＲＰ５中のＣＲへと結合するため、ＲＡＰ変異体は受容体を通じてＷｎｔシグナリングを調節するために有用であり得る。Ｗｎｔシグナリングを調節するためのＲＡＰ変異体の能力は、培養骨芽細胞を用いて測定される。同様のアッセイを、ＣＲ特異的抗体を用いて実行することができる。
骨芽細胞の細胞株のＭＧ６３は、多量なＬＲＰ１を発現し、ＶＬＤＬＲは発現しない。ＳＡＯＳ−２細胞は多量のＶＬＤＬＲを発現し、ＬＲＰ１はほとんど発現しない（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）アクセッション番号＃ＨＴＢ−８５）。ＭＧ６３及びＳＡＯＳ−２細胞を、１０％のＣＯ２中、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、３７℃にて生育させる。Ｗｎｔシグナル経路を引き起こすために、緩衝液、ＤＫＫ−１、Ｍｅｓｄ、ＲＡＰ又はＲＡＰ変異体と共に、培地にＷｎｔ７ａを補充する。氷冷ＰＢＳ中で洗浄後、細胞を回収して、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＰＭＳＦ、及び１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼインヒビター（５００μｌ／ウェル）を用いて、ガラス製Ｄｏｕｎｃｅ ホモジナイザー中でホモジナイズする。ホモジネートを、１０分間、５００×ｇにて遠心分離し、上清をさらに、１００，０００×ｇ、４℃にて９０分間遠心分離する。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手したβ−カテニン特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、清澄化した上清中のβ−カテニンのレベルを測定する。ＥＣＬ ｓｙｓｔｅｍを用いて、免疫反応性のタンパク質を検出する。あるいは、細胞を、０．５μｇのβ−カテニン発現ベクター、０．５μｇのＷｎｔ１発現ベクター、又は空のｐｃＤＮＡ３ベクターと共に、０．５μｇのＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ ＴＣＦ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、まずトランスフェクトする。トランスフェクション効率の内部対照として、β−ガラクトシダーゼ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含有させる。４８時間後、培地を交換し、いずれかの緩衝液、ＤＫＫ−１、Ｍｅｓｄ、ＲＡＰ又はＲＡＰ変異体を添加した。さらに６時間インキュベート後、細胞を溶解し、酵素アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性を調べる。ルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ルミノメーターを用いて調べる。ルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化する。
（実施例３）
潜在的治療薬としてのＲＡＰ−ＧＤＮＦ融合体の製造及び特徴付け
ＣＨＯ細胞中でのＲＡＰ−ＧＤＮＦの生産−組み換えＲＡＰ−ＧＤＮＦを発現するＣＨＯ細胞株を、２．５％のウシ胎児血清、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＵｌｔｒａＣＨＯ培地中で維持した。５００ｍＬ容スピナーフラスコ中で、マイクロキャリアを用いた中スケールの培養を行うために、４０００個／ｍＬの細胞を、１５０ｍＬのＪＲＨ３０２培地、２．５％のウシ胎児血清、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン中の溶液中に入れた０．３ｇのＣｙｔｏｐｏｒｅビーズ溶液に添加した。血清濃度を徐々にゼロまで低減し、ＲＡＰ−ＧＤＮＦの産生を２週間継続した。培地を毎日交換し、グルコースの消費（ＹＳＩ ２７００ ａｎａｌｙｚｅｒ）を測定することにより細胞の成育を評価し、ＲＡＰ−ＧＤＮＦの産生を機能的ＥＬＩＳＡにより定量した。無血清懸濁培養に適応させるために、１２Ｌの振盪機中、２０ｍＬのＪＲＨ３０２培地、２．５％のウシ胎児血清、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン中に、４０，０００個／ｍＬの細胞を撒いた。生存率が安定的であるとき、血清濃度を徐々にゼロへと低減して、２０００個／ｍＬの密度で細胞を継代した。血清濃度を低減する前であって、培養物に血清を含まない場合、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ産生の特性を定義する目的で、及び、最良の産生クローンを選択するために、バッチ培養を実行した。細胞密度、生存率及びＲＡＰ−ＧＤＮＦ産生を４日間、培地を交換せずにモニターした。
機能的ＥＬＩＳＡ−ＧＦＲα−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１００μＬの２０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ８．２）中の１μｇの受容体により、各ウェルを４℃で一晩コーティングすることにより、９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）中に固定化した。コーティング工程を除き、全ての手順を室温で実行した。各ステップの後で、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤＰＢＳを用いてウェルを３回洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートを、２０μＬのブロッキング緩衝液（Ｂｌｏｃｋ＆Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に２時間インキュベートした。ＲＡＰ−ＧＤＮＦ融合体及びｒｈＧＤＮＦ標準品（Ｐｒｏｍｅｇａ）をブロッキング緩衝液にて希釈し、次いで各ウェルへと添加した。２時間のインキュベート後、非結合の物質を洗浄により除去し、結合したタンパク質を、ブロッキング緩衝液中１：２，０００で希釈した抗ＧＤＮＦ ｍＡｂを用いて検出した。１時間のインキュベーション後、免疫コンジュゲートに二次抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰコンジュゲート、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して１時間、次いでＴＭＢ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（西洋ワサビペルオキシダーゼ用ＴＭＢ安定化基質、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた比色アッセイにより検出した。色の進行を停止するために、塩酸を用いた。反応停止から３０分以内に、４５０ｎｍにて各ウェルの光学密度（ＯＤ）を測定した（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。この方法により、コンジュゲート混合物中のＲＡＰ−ＧＤＮＦの正確な定量が可能になる。
固相結合アッセイ−マイクロタイタープレートを５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中、ＧＤＮＦ又はＲＡＰ−ＧＤＮＦでコーティングした。プレートを次いで、ブロッキング緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に室温にて１時間ブロッキングし、１μｍのＲＥＴの存在下又は非存在下で、ＧＦＲα−１の連続希釈物（０〜１０ｎＭ）と共にインキュベートした（２時間、室温）。抗ＧＤＮＦモノクローナル抗体（Ｂ８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、次いで抗マウスＨＲＰコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた確認により、コンジュゲートを同定した。ＴＭＢ溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の添加後、色の進行をＨＣｌを用いて停止し、ＯＤ４５０ｎｍをプレートリーダーを用いて測定した。工程の間に、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した。この方法は、ＲＡＰ−ＧＤＮＦのＧＦＲαに対する親和性の定量方法を提供する。
チロシンリン酸化アッセイ−実験開始前（４８時間）に、フラスコにＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１ｌ）を撒いた。ＲＡＰ−ＧＤＮＦ又はＧＤＮＦの添加１２時間前にＲＥＴの発現レベルを増加させるために、細胞を１μｍのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）で処理した。細胞を１時間、３７℃にて、無血清培地（ＭＥＭ、２ｍＭのグルタミン、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中でインキュベートした。次いで細胞を、ＧＤＮＦ標準（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＲＡＰ−ＧＤＮＦ（ｎｇ／ｍＬ）及び可溶性ＧＦＲα−１（１ｎｇ／ｍＬ）を伴って又は伴わずに、１５分間、３７℃にてインキュベートした。細胞を次いで氷冷ＰＢＳにより洗浄し、氷上で、氷冷溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＩＧＥＰＡＬ、０．０１Ｍのバナジウム酸塩、０．５％のデオキシコール酸塩、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル）と共に１０分間インキュベートし、掻き取ることにより回収した。細胞溶解液を１５分間、３，０００ＲＰＭで、４℃にて遠心分離した。清澄な溶解液を新たなチューブへと移した。抗ＧＤＮＦ、ＧＦＲα−１、ＲＥＴ又はホスホチロシン抗体をこの溶解液へと添加し、震盪しながら２時間、４℃にてインキュベートした。プロテイン Ｇ セファロース（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を次いでチューブへと添加し、震盪しながら２時間、４℃にてインキュベートした。ビーズを次いで、溶解緩衝液にて２回、ＰＢＳにて１回洗浄した。免疫沈殿したタンパク質を、ＳＤＳサンプル緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） ＬＤＳ サンプル緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で５分間ビーズを煮沸することにより遊離し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、抗ＲＥＴ（Ｃ−１９又はＨ−３００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホチロシン（組み換え１０、Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗ホスホ−ＲＥＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＧＤＮＦ（Ｂ８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＧＤＮＦ（Ｄ２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＧＦＲαｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は抗ＲＡＰ（ポリクローナル、ＢｉｏＭａｒｉｎ）のいずれかを用いて試験した。あるいは、固定化した抗ＲＡＰ（先に２回洗浄し溶解緩衝液を用いて２倍に希釈したもの）を、細胞溶解液へと添加した。混合物を、震盪しながら３時間、４℃にてインキュベートした。次いで抗ＲＡＰビーズを、溶解緩衝液で２回、ＰＢＳで１回洗浄した。免疫沈殿したタンパク質を、ＳＤＳサンプル緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） ＬＤＳ サンプル緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で５分間ビーズを煮沸することにより遊離し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、同様の抗体を用いて試験した。この方法で、受容体チロシンキナーゼの活性化に関するＲＡＰ−ＧＤＮＦの機能を測定する。
細胞分化アッセイ−１０％の胎児ウマ血清、２．５％の胎児ウシ血清、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＦ−１２培地（ＡＴＣＣ）中で、ＰＣ−１２細胞を維持した。神経突起伸長の実験のために、１０％のウマ胎児血清、２．５％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、１０μｇ／ｍＬのＧＦＲαｌ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＦ−１２培地中に１０μｇ／ｍＬのＥＨＳラミニン（Ｓｉｇｍａ）を含む６０μＬの溶液を２４−ウェルプレートの底部に１時間コーティングした、１ｍＭのカバースリップ上に、細胞をのせた（細胞を添加する前にコーティング溶液を除去した）。細胞を次いで、各種濃度のＧＤＮＦ又はＲＡＰ−ＧＤＮＦ（１０、１００、ｌ０００ｎｇ／ｍＬ）、３Ｍの塩素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、ヘパリナーゼＩＩＩ又はコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｉｇｍａ）の存在下又は非存在下で、３〜４日間インキュベートした。神経突起の数及びサイズの関数としての分化レベルを評価することにより、定性的応答が記録された。
（結果）
ウェスタンブロッティングの結果は、ＲＡＰ−ＧＤＮＦが、ＧＤＮＦ等のようなジスルフィド連結されたホモダイマーとして分泌されることを示した（図１１）。結合試験により、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ／ＧＦＲα−１コンジュゲートが、約５ｎｇ／ｍＬ、又は５ｐＭ（ＲＡＰ−ＧＤＮＦの分子量は約１２０ｋＤである、図１２）の解離定数を有することが示された。この値は文献で報告されているＧＤＮＦ／ＧＦＲα−１コンジュゲートの値に近似する。
チロシンリン酸化アッセイ−ｉｎ ｖｉｖｏで、ＧＤＮＦホモダイマーはその受容体ＧＦＲα−１と結合し（おそらくはダイマーでも同様である）、次いでそのＧＤＮＦ−ＧＦＲα−１コンジュゲートは、ダイマー化するＲｅｔタンパク質へと結合する。Ｒｅｔのダイマー化はチロシン１０６２の自動リン酸化を引き起こす。ＲＡＰ−ＧＤＮＦがＧＦＲα−１に結合することが示されたため、次のステップは、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ融合タンパク質もまたＲｅｔに結合し、自動リン酸化を引き起こすことができることを立証することであった。ヒトの神経芽細胞腫株ＳＫ−Ｎ−ＳＨを、ＧＦＲα−１と組み合わせた各種濃度のＲＡＰ−ＧＤＮＦ又はＧＤＮＦに曝し、Ｒｅｔのリン酸化レベルを免疫沈殿によって調べた。Ｒｅｔのリン酸化を検出可能にする実験条件を保つために、一連の正及び負の対照を試験した。免疫沈殿（図１３）により、ＧＤＮＦ及びＧＦＲα−１を共に添加した場合のみにＲｅｔのリン酸化が生じることが示された；Ｒｅｔの活性化は、抗Ｒｅｔ抗体を用いたブロット上で共染色される、Ｒｅｔに関し予測される大きさである約１６０Ｄａのリン酸化されたタンパク質により証明された。このアッセイが定量的ならびに定性的であり得るがどうかを確認するために、各種濃度の標準ＧＤＮＦを試験した（図１３）。このバンドの強さは、添加したＧＤＮＦの量と共に増加した。この実験は、免疫沈殿アッセイが、ＧＤＮＦにより引き起こされるＲｅｔのリン酸化に関する定性的かつ定量的な試験を可能にすることを示す。
３成分からなるコンジュゲートの免疫沈殿−Ｒｅｔの自動リン酸化は、ＧＤＮＦ／ＧＦＲα−１コンジュゲートがＲｅｔに結合する時に生じる。ＲＡＰ−ＧＤＮＦが同様に機能するとすれば、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ／ＧＦＲα−１及びＲｅｔを含む３成分からなるコンジュゲートが検出可能であるはずである。図１４は、このコンジュゲートを検出するために設計された実験から得られた結果を示す。抗ＲＡＰ抗体−アガロースコンジュゲートを用いて、活性化されたＲｅｔを含むコンジュゲートの３つの成分を精製することができた。これらの結果は、これらのタンパク質の直接的な相互作用と一致する。さらに、ここで示されるＲｅｔのリン酸化は、ＲＡＰ−ＧＤＮＦによる活性化と一致する。
分化アッセイ−先の結果は、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ融合タンパク質がその受容体へと結合してＲｅｔを活性化することができたことを示した。さらなる下流の事象が、細胞分化の誘導を通じて確認され得る。濃度を高めたＧＤＮＦ又はＲＡＰ−ＧＤＮＦを、ＰＣ１２細胞へと添加した。これらの細胞はプラスチックに付着しにくく、大きなクラスターを形成して生育する傾向を有するため、ラミニン及びＧＦＲα−１を用いて予めコーティングされたカバースリップが用いられた。分化のレベルは、神経突起の存在、その量及びそのサイズにより評価した。ＲＡＰ−ＧＤＮＦは、ＧＤＮＦ同様にＰＣ１２細胞中での神経突起の伸張を引き起こすことができた。図１５Ａ及び１５Ｂは、ＲＡＰ−ＧＤＮＦの添加からもたらされる分化を示す。分化のレベルは、添加したＧＤＮＦ又はＲＡＰ−ＧＤＮＦの量の関数であることが観察された。引き起こされた分化の見かけのレベルは、ＧＤＮＦ及びＲＡＰ−ＧＤＮＦのおおよそのモル濃度と同様であり、ＲＡＰ−ＧＤＮＦ融合体がＧＤＮＦ単独のものと実質的に同様の有効性を維持していることを示した。
（結論）
ＧＤＮＦに血液脳関門を通過する能力がないことを確認するために、ＧＤＮＦを、血液脳関門を通過することが先に示されているタンパク質であるＲＡＰと融合させた。ＲＡＰ−ＧＤＮＦをＣＨＯ細胞中で産生させ、ウェスタンブロット分析することにより、ジスルフィド連結された約１２０ｋＤのホモダイマーの分泌が確認された。さらなる分析により、ＲＡＰ−ＧＤＮＦが、ＧＤＮＦと同様の親和性（Ｋｄ）を有するＧＦＲα−１と結合し；この結合したＲＡＰ−ＧＤＮＦ／ＧＦＲαコンジュゲートがＲｅｔを活性化し；ＲＡＰ−ＧＤＮＦが培養物中のＰＣ１２細胞における神経突起の伸張を誘導することが示された。この試験により、ＲＡＰ又は受容体選択的なＲＡＰ変異体とＧＤＮＦの融合体がｉｎ ｖｉｖｏのＧＤＮＦ依存的な生理学的プロセスの強力なエフェクターであろうことが示される。
本明細書中に開示され、請求される組成物及び／又は方法の全ては、本開示に照らして、過度な実験を行うことなくなされ、実行され得る。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点から記載してきたが、当業者であれば、本明細書中に記載される方法の組成物及び／又は方法ならびにステップ又は一連のステップに対して、本発明の精神及び範囲から逸脱することのないバリエーションが適用できることは明らかである。より具体的には、化学的及び生理学的の両者に関連する特定の物質が、本明細書中に記載される物質と置換されることができ、さらに同一又は同様の結果が得られるであろうことは、明らかであろう。当業者にとって明らかな、そのような同様の全ての置換及び修飾は、添付の請求項により定義されるように、本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。
本明細書中に引用される参考文献は、それらが例示的な手法、又は本明細書中に説明されるものに対する補足的なその他の詳細を提供する程度に、具体的に、参照として本明細書中に取り入れるものとする。
（参考文献）
（補足資料）

Claims (15)

  1. 配列番号２に示されるα−２−マクログロブリン／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質結合タンパク質１（ＲＡＰ）のアミノ酸配列変異体を含むポリペプチドであって、前記ＲＡＰ変異体が、タンパク質内部の相補的な形式の繰り返しの対に対し、同様な相補的な形式の繰り返しの対に対する野生型ＲＡＰの親和性よりも少なくとも３倍高い親和性で、選択的に結合し、ここで、前記ＲＡＰ変異体は、成熟ＲＡＰの以下の位置：１７５、２０５、２１３、２１７、２２６、２３０、２３２、２３９、２４６、２４９、２５１、２５６、２５７、２６１、２６６、２６７、２６８、２７０、２７３、２８７、２９０、２９４、２９６、２９７、２９８、３０５、３１２または３１３のうちの１つ以上の位置に変異を含み、そして、前記ＲＡＰ変異体は、以下：

    に示されるＭｅｇａＲＡＰ１、ＶＲＡＰ、ＭａｔＲＡＰ１、ＭａｔＲＡＰ２および３２０ＲＡＰのアミノ酸配列からなる群より選択される、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドのオリゴマー的な組み合わせからなり、前記組み合わせにおける各ポリペプチドによって規定される多価結合特性を伴う、ポリペプチド。
  3. 請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、疾患の処置のための組成物であって、前記ポリペプチドが、前記疾患の病態生理学に関与するタンパク質と選択的に結合する、組成物。
  4. 診断薬又は治療薬と結合している請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む化合物。
  5. 前記ポリペプチドと診断薬又は治療薬とがリンカーを通じて結合している、請求項４に記載の化合物。
  6. 前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項５に記載の化合物。
  7. 前記治療薬が、膠細胞由来神経成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン１０（ＡＤＡＭ１０）、ＬＲＰ５／６に対するシャペロンタンパク質（ＭＥＳＤ）、癌化学治療薬、プロテアーゼ阻害剤、プロアポトーシス分子、自己免疫抗原、リソソーム酵素、ナノ粒子、複合糖質及び核酸からなる群より選択される、請求項４に記載の化合物。
  8. 薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤中に請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項４〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
  9. 請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項４〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、対象の中枢神経系に診断薬又は治療薬を送達するための組成物。
  10. 前記対象が神経系疾患を罹患するヒト対象である、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記神経系疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及び中枢神経系の癌からなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
  12. 請求項８に記載の医薬組成物を含む、対象の特異的組織又は組織群に、診断薬又は治療薬を送達するための組成物。
  13. 前記診断薬又は治療薬が血液脳関門を通過して送達される、請求項１２に記載の組成物。
  14. 請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  15. （ａ） 候補となるＲＡＰ変異体を作製する工程と、
    （ｂ） 相補的な形式の繰り返し（ＣＲ）含有タンパク質由来の少なくとも２つのＣＲ対に対する、前記候補となるＲＡＰ変異体の結合を測定する工程であって、前記ＣＲ対が、全てのＣＲ含有タンパク質のうち任意のその他のＣＲ対の内部には存在しないカルシウム結合ループ内のアミノ酸の組み合わせによって特定される、測定する工程と、
    を含む、請求項１に記載のＲＡＰ変異体をスクリーニングする、方法。
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