ES2533787T3

ES2533787T3 - Modulación de los receptores con dominio Vps10p

Info

Publication number: ES2533787T3
Application number: ES09749511.3T
Authority: ES
Inventors: Anders Nykjaer; Mads FUGLSANG KJØLBY
Original assignee: H Lundbeck AS
Current assignee: H Lundbeck AS
Priority date: 2008-05-22
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2015-04-14
Anticipated expiration: 2029-05-20
Also published as: EP2282728A2; US20150299304A1; DK2282728T3; US9084745B2; HK1208802A1; WO2009140972A2; WO2009140972A3; US20110166036A1; DK2851084T3; ES2680222T3; EP2851084A1; EP2282728B1; EP2851084B1

Abstract

Un método in vitro para cribar un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, capaz de unirse a un receptor sortilina, que comprende las etapas de: a) proporcionar un receptor sortilina, y b) proporcionar ApoB como agonista, c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y d) proporcionar un ensayo para medir la unión de dicho agonista a dicho receptor, y e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar al ensayo, y f) determinar la cantidad de agonista unido a dicho receptor, y g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va a ensayar, h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista que altera la unión de dicho agonista a dicho receptor.

Description

Modulación de los receptores con dominio Vps10p

Campo de la invención

La invención se refiere a la identificación de ligandos capaces de actuar como antagonistas/inhibidores de los receptores con dominio Vps10p.

Antecedentes de la invención

La concentración plasmática de lipoproteínas de baja densidad (LDL) que transportan el colesterol en la circulación humana, es uno de los factores de riesgo más importantes de la morbilidad y mortalidad cardiovascular (1). Las cantidades excesivas de colesterol en la circulación son depositadas en las paredes de los vasos coronarios produciendo el cierre del lumen del vaso y la obstrucción del flujo sanguíneo al corazón (y otros órganos.) Este proceso patológico se conoce como aterosclerosis. Como consecuencia de sucesos ateroescleróticos, se produce la arteriopatía coronaria y el infarto de miocardio. Dada la importancia de la gestión de los niveles de LDL en pacientes, el colesterol LDL sigue siendo hoy el objetivo principal de la terapia cardiovascular (2, 3).

El riesgo de desarrollar enfermedades y afecciones como la ateroesclerosis, arteriopatía coronaria y cardiopatía coronaria se ha demostrado que está fuertemente correlacionado con los niveles altos de LDL-colesterol y triglicéridos. Los niveles elevados de lipoproteína de baja densidad-colesterol (LDL-colesterol) es un contribuyente asociado a lípidos significativo, por ejemplo, para la cardiopatía coronaria.

La ateroesclerosis y la arteriopatía coronaria asociada es la causa principal de la mortalidad en el mundo industrializado. A pesar de los intentos de modificar los factores de riesgo secundarios (fumar, obesidad, falta de ejercicio) y el tratamiento de la dislipidemia con la modificación de la dieta y la terapia con fármacos, la cardiopatía coronaria sigue siendo la causa más común de muerte en EE.UU., donde la enfermedad cardiovascular da cuenta de 44% de todas las muertes, con 53% de estas asociadas con cardiopatía coronaria aterosclerótica.

Se conoce una serie de rutas bioquímicas que afectan a los niveles plasmáticos de colesterol y se han considerado objetivos en la intervención terapéutica. Estas etapas incluyen la velocidad con la que es producido el colesterol en el organismo y es introducido en lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), la extensión de la conversión de VLDL en LDL, así como la eficacia de la eliminación de las LDL en los tejidos hepáticos. Además, la conversión del colesterol en ácidos biliares que son secretados en el intestino afecta a los niveles de lípidos en la circulación.

La familia de receptores con dominio Vps10p

Los autores de la presente invención han estudiado el efecto de la modulación de la actividad de los receptores con dominio Vps10p en los niveles plasmáticos de LDL-colesterol y triglicéridos. Los miembros de esta familia de receptores son Sortilina, SorLA, SorCS1, SorCS2 y SorCS3.

Sortilina

La sortilina, el miembro arquetípico de la familia de receptores con dominio Vps10p se denomina en ocasiones el receptor de neurotensina 3 (NTR3), Glicoproteína 95 (Gp95) o receptor NT 100 kDa. La sortilina humana tiene número de acceso en Swiss Prot ID No. Q99523.

La sortilina, (SEQ ID NO. 1) es un receptor de membrana de tipo I expresado en una serie de tejidos, incluyendo el cerebro, médula espinal, testículos, hígado y músculo esquelético (6-7). La sortilina pertenece a una familia de receptores que comprende Sortilina, SorLA (8), SorCS1, SorCS2 y SorCS3.

Todos los receptores de esta familia comparten la característica estructural de un dominio N-terminal de aproximadamente 600 aminoácido con un gran parecido con cada uno de los dos dominios que constituyen la parte luminal del receptor de clasificación de levaduras Vps10p (9). El dominio Vps10p (Vps10p-D) que entre otros ligandos une factores neurotróficos y neuropéptidos (10-14), constituye la parte luminal entera de la sortilina (sSortilina) y es activado por la unión de ligando por escisión enzimática propeptídica (10, 11). La sortilina es un receptor multifuncional de tipo 1 capaz de endocitosis así como de clasificación intracelular (9-11), y como se ha mostrado recientemente, también está implicada en la señalización produciendo la inducción por proneurotrofina de la apoptosis neuronal mediada por p75NTR (12, 13, 18, 19). La sortilina es sintetizada como una proproteína, que se convierte en la sortilina madura por escisión enzimática y eliminación de un propéotido N-terminal corto. Solo el receptor maduro se une a ligandos y lo que es interesante es que todos sus ligandos conocidos, por ejemplo, neurotensina (NT), lipoproteína lipasa, las proformas del factor de crecimiento nervioso ß (proNGF) y factor neurotrófico derivado del cerebro (proBDNF), proteína asociada al receptor (RAP), y su propio péptido, compiten por la unión (11-13, 16) indicando que los diversos ligandos se dirigen a un sitio de unión compartido o parcialmente compartido. El NT es un tridecapéptido, que se une a sortilina, SortLA y los dos receptores acoplados a proteína G NTR1 y NTR2 (10, 20-22). La función fisiológica de la NT en relación con la sortilina no se ha elucidado completamente (23), aunque la NT es una herramienta importante, puesto que inhibe la unión de todos los demás

ligandos al Vps10p-D de la sortilina.

SorLA

El receptor relacionado con la proteína de clasificación, abreviada SorLA (nº de ID en Swiss Prot Q92673), también conocida como LR11, es una proteína de membrana de tipo 1, de 250 kDa y el segundo miembro identificado en la familia de receptores con dominio Vps10p de SorLa, como la sortilina, cuyo dominio lumenal consiste en un dominio Vps10p solo, se sintetiza como un pro-receptor que es escindido por furina en los compartimentos tardíos de Golgi. Se ha demostrado que el truncado acondiciona el dominio Vps10p para la unión inhibidora al propéptido de neuropéptidos y la proteína asociada al receptor. Se ha demostrado (21) que se produce la unión ávida de la proteína asociada al receptor, apolipoproteína E, y la lipoproteína lipasa no inhibida por propéptido en sitios localizados en otros dominios lumenales. En células transfectadas, aproximadamente 10% de SorLa de longitud completa es expresada en la superficie celular capaz de mediar la endocitosis. El principal grupo de receptores se encuentra en los compartimentos tardíos de Golgi, y se ha sugerido la interacción con ligandos recién sintetizados.

SorCS1-3

SorCS1 (nº de ID en Swiss Prot Q8WY21), SorCS2 (nº de ID en Swiss Prot Q96PQ0) y SorCS3 (nº de ID en Swiss Prot Q9UPU3) constituyen un subgrupo de proteínas muy similares mutuamente que contienen tanto un Vps10p-D como un dominio rico en leucina limitando el dominio transmembrama (14, 26). SorCS1 puede tener una función importante fuera del sistema nervioso, ya que su región en el gen se ha identificado como un locus de característica cuantitativa de la diabetes de tipo 2 en ratones (27), y las variaciones en el gen de SorCS1 humano se asocian con características relacionadas con la diabetes (28). Se presentan indicaciones adicionales en esta dirección en otro estudio (29) en donde la SorCS1 se asocia con la región Niddm1i 16-Mb controladora de glucosa principal, en la rata GK diabética, una región que produce secreción defectuosa de insulina y que también corresponde a los locus en seres humanos y ratones asociados con la diabetes de tipo 2.

Estado de la técnica

El estado actual de la técnica para la terapia de LDL plasmático alto es la aplicación de estatinas, inhibidores que interfieren con la producción de colesterol endógeno y por lo tanto, reducen la producción de partículas LDL ricas en colesterol. Sin embargo, el uso de estatinas está asociado con un riesgo sustancial de efectos secundarios tales como efectos adversos en las funciones muscular y hepática, así como en las capacidades cognitivas (4,5). Por lo tanto, los amplios esfuerzos de investigación se dirigen a la identificación de nuevos factores que contribuyen a la regulación del metabolismo del colesterol plasmático. Estos factores pueden representar alternativas más seguras a la intervención terapéutica con altos niveles de LDL plasmático.

Recientemente, una serie de grupos ha usado estudios de asociación del genoma completo para identificar regiones cromosómicas en el genoma humano que se puedan asociar con el control de los valores de lípidos plasmáticos. En particular, estos estudios sugieren simplemente determinadas regiones en cromosomas particulares que pueden tener algún valor predictivo de las concentraciones de lípidos y riesgo cardiovascular. Ninguno de estos estudios proporciona pruebas experimentales que confirmen una función causal de los genes candidatos en dicha región cromosómica en el control de la homeostasia de lípidos.

Por ejemplo, Wilier et al. (6) así como Kathiresan et al. (7) han cartografiado ambos un locus cromosómico asociado con el LDL-colesterol en 1p13. Este locus contiene varios genes candidatos entre los cuales están CELSR2, PSRC1 y SORT1. No está claro si cualquiera de los tres genes u otros en esta región pueden ser relevantes para la determinación del LDL-colesterol, como establecen Kathiresan et al. en la página 191: "No está claro todavía qué variantes causales o incluso los genes causales en el nuevo locus"

Incluso es más confuso el que Kathiresan et al. identificaran un aumento de los niveles de ARNm para SORT1 con el alelo C que predispone a su portador a LDL plasmático bajo. Los autores concluyen, “... estas observaciones sugieren un mecanismo por el cual la expresión de la sortilina aumentada vista con el alelo C (en SNP rs646776) podría llevar a menores concentraciones de LDL-colesterol en la circulación”. En la argumentación de los autores, la sortilina actúa como un factor protector reductor de los niveles de LDL en la circulación. Cuanto mayores son los niveles de ARNm para la sortilina (SORT1), menor es la concentración plasmática de LDL.

Sin embargo, esta suposición es incorrecta como demuestran los autores de la presente invención mediante estudios funcionales usando modelos de ratón deficientes en sortilina en donde, de hecho, la pérdida de expresión de la sortilina está asociada con el LDL plasmático bajo. Por lo tanto, la actividad normal de la sortilina aumenta en lugar de disminuir las concentraciones de LDL. El aumento visto en el alelo C en el estudio de Kathiresan et al., es probable que refleje una regulación por aumento compensatoria de un alelo de sortilina difuncional.

La solicitud de patente WO 2004/056385 describe un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de dolor inflamatorio, enfermedades o trastornos del páncreas, trastornos renales, trastornos pulmonares, trastornos cardiovasculares, diferentes tipos de tumores, trastornos psiquiátricos o trastornos neuronales, mediante el uso de agentes capaces de inhibir receptores con dominio Vps10p, en particular la sortilina. Sin embargo, el documento WO 2004/056385 no describe que la sortilina esté implicada en la regulación de los

niveles plasmáticos de lípidos.

Otras solicitudes de patente tales como WO 2006/138343 y WO 2007/035716 describen composiciones que comprenden proteínas/receptores que contienen CR que se unen a la proteína asociada al receptor (RAP) para tratar un gran número de enfermedades incluyendo enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, la cita en este documento de la sortilina como una proteína que comprende repeticiones CR es incorrecta como lo es la referencia al número de acceso en SwissProt Q92673 junto con la sortilina. Q92673 es el número de acceso en SwissProt para el receptor con dominio Vps10p SorLa que comprende realmente repeticiones CR a las que se puede unir la RAP.

Una solicitud de patente adicional WO 2007/141346 describe genes que regulan el tráfico de colesterol intracelular como dianas para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el colesterol.

Una solicitud de patente adicional WO2008/074329 describe agentes para inhibir la unión de una pro-neurotrofina a un receptor con dominio Vps10p, en particular la unión de un pro-NGF o un pro-BDNF a un receptor sortilina. La invención proporciona por lo tanto agentes para tratar y/o prevenir enfermedades, trastornos y degeneraciones neurológicas, neuropsiquiátricas y oculares, así como la obesidad, diabetes, dolor y/o nocicepción en un individuo.

Resumen de la invención

La presente invención en su sentido más amplio se define por las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para el cribado de un antagonista capaz de unirse a un receptor sortilina, que comprende las etapas de: a) proporcionar un receptor sortilina, y b) proporcionar ApoB como agonista, c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y d) proporcionar un ensayo para medir la unión de dicho agonista a dicho receptor, y e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar al ensayo, y f) determinar la cantidad de agonista unido a dicho receptor, y g) comparar la cantidad determinada en f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va a

ensayar,

h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista que altera la unión de dicho agonista a dicho receptor. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método para determinar el grado de inhibición de un

antagonista en la actividad de un receptor sortilina en un cultivo celular que expresa dicho receptor, en donde dicho receptor sortilina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 60% con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un cultivo celular que expresa dicho receptor sortilina, y b) proporcionar ApoB como agonista de dicho receptor sortilina, y c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y d) proporcionar un ensayo para determinar la unión a, internalización de y señalización a través de, dicho receptor

sortilina, comprendiendo dicho ensayo,

e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar c) al cultivo celular a), en presencia de dicho agonista b), y f) determinar

i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través de dicho receptor sortilina, y

g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va a ensayar, h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista

i) capaz de unirse a dicho receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de dicho receptor sortilina, y/o iii) capaz de inhibir la internalización de dicho agonista de dicho receptor sortilina.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista en la actividad de un receptor sortilina en un cultivo celular que expresa dicho receptor y con un cultivo celular que carece de expresión de dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un cultivo celular que expresa un receptor sortilina, y b) proporcionar un cultivo celular que no expresa un receptor sortilina, y c) opcionalmente proporcionar un cultivo celular que expresa en exceso un receptor sortilina d) proporcionar ApoB como agonista del receptor sortilina, y e) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y f) proporcionar un primer ensayo que comprende a) y un segundo ensayo que comprende b) y opcionalmente un

tercer ensayo que comprende c), y g) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar a los tres ensayos, y h) determinar

i) la cantidad de antagonista unido al receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por el receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través del receptor sortilina, y

i) comparar la cantidad de antagonista determinada en la etapa g) usando a) con la cantidad determinada en g) usando b) y la cantidad determinada en g) usando c), j) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista i) capaz de unirse a un receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de un receptor sortilina, y/o

iii) capaz de inhibir la internalización de ApoB como agonista de dicho receptor sortilina. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista en la actividad de un receptor sortilina en un mamífero no humano que expresa dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) administrar dicho antagonista a un mamífero no humano que expresa el receptor de forma natural,

b) determinar i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través de dicho receptor sortilina, y

c) comparar la medición de la etapa b) con una medición obtenida en ausencia del compuesto que se va a ensayar,

d) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica el efecto de dicho antagonista en dicho mamífero no humano que expresa el receptor de forma natural. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método para determinar el grado de inhibición de un

antagonista en la actividad de un receptor sortilina en un mamífero no humano que expresa dicho receptor con un segundo mamífero no humano que carece de expresión de dicho receptor y un tercer mamífero no humano que expresa en exceso dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un mamífero no humano que expresa dicho receptor sortilina, y b) proporcionar un mamífero no humano que no expresa dicho receptor sortilina, y

c) proporcionar un mamífero no humano que expresa en exceso dicho receptor sortilina, y d) proporcionar ApoB como agonista de dicho receptor sortilina, y e) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y f) administrar dicha biblioteca de antagonistas a dicho mamífero no humano de a), b) y c) respectivamente, y g) determinar

i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través del receptor sortilina, en cada uno de los mamíferos no humanos en a),

b) y c), y

h) comparar la cantidad de antagonista determinada en la etapa g) usando a) con la cantidad determinada en g) usando b) y la cantidad determinada en g) usando c), i) en donde la diferencia en las cantidades identifica un antagonista

i) capaz de unirse a dicho receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de dicho receptor sortilina, y/o iii) capaz de inhibir la internalización de dicho agonista de ApoB de dicho receptor sortilina.

Resumen de los dibujos

Figura 1: Resumen del receptor Figura 2a: Metabolismo de colesterol y triglicéridos Figura 2b: Metabolismo del colesterol y triglicéridos Figura 3: Diagrama del colesterol en el plasma Figura 4: Diagrama de triglicéridos en el plasma Figura 5a: Perfil de lipoproteínas -colesterol y triglicéridos Figura 5b: Análisis por resonancia de plasmón de superficie de la unión de ApoB a la sortilina. Figura 6: Transcurso del tiempo para el aumento de los niveles de colesterol y perfil de FPLC en ratones que

expresan en exceso la sortilina. Figura 7: Transferencia Western del plasma de ratones que expresan en exceso la sortilina Figura 8: Colesterol y triglicéridos Figura 9: Perfil de apoproteínas y lípidos Figura 10: Unión competitiva a la sortilina inmovilizada usando péptidos

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Concentraciones plasmáticas de lípidos anómalas: La expresión concentraciones plasmáticas de lípidos anómalas como se usa en la presente memoria, se refiere al nivel de uno o más de los siguientes niveles plasmáticos de lípidos: colesterol total, LDL-colesterol, HDL-colesterol y triglicéridos.

Dichos niveles anómalos son niveles (es decir, concentraciones) que están fuera de uno o más de los siguientes intervalos de la tabla 1:

Tabla 1: Niveles plasmáticos normales de lípidos

A:Colesterol total

Grupo de pacientes: Concentración

Hombres y mujeres de 19-29 años de edad: 3,5 -6,2 mM

Hombres y mujeres de 30-59 años de edad: 4,4-7,8 mM

Mujeres de más de 59 años de edad: 4,8-8,0 mM

Hombres de más de 59 años de edad: 4,3 -7,3 mM

Niños menores de 1 año de edad: 1,5-4,5 mM

Niños de 1-18 años de edad: 2,7-6,0 mM

Límite recomendado para el tratamiento en pacientes que padecen trastornos cardiovasculares, cuando el colesterol total es mayor que:: 5 mM

Límite recomendado para el tratamiento en pacientes que padecen diabetes, cuando el colesterol total es mayor que:: 4,5 mM

B: LDL-colesterol

Mujeres de 20-29 años de edad: 1,5-4,3 mM

Mujeres de 30-45 años de edad: 1,9-4,5 mM

Mujeres de más de 45 años de edad: 2,4-5,5 mM

Hombres de 20-29 años de edad: 1,7-4,3 mM

Hombres de 30-45 años de edad: 2,1-5,0 mM

Hombres de 46-69 años de edad: 2,3-5,3 mM

Hombres de más de 69 años de edad: 2,3-4,8 mM

Niños de 10-19 años de edad: 1,8-3,5 mM

Adultos con mayor riesgo de trastorno cardiovascular cuando el LDLcolesterol es mayor que:: 3 mM

C: HDL-colesterol

Mujeres 20-40 años de edad: 1,0-2,0 mM

Mujeres de más de 40 años de edad: 1,0-2,3

Hombres de 20-60 años de edad: 0,7-1,7 mM

Hombres de más de 60 años de edad: 0,8-1,9 mM

Adultos con mayor riesgo de trastorno cardiovascular cuando el HDLcolesterol es mayor que:: 1 mM

D: Triglicéridos

Hombres y mujeres de 20-40 años de edad: 0,4-1,6 mM

Hombres y mujeres de más de 40 años de edad: 0,5-2,5 mM

Niños de 0-9 años: 0,3-1,2 mM

Adultos con mayor riesgo de trastorno cardiovascular cuando el nivel de triglicéridos es mayor que:: 2 mM

Fuentes de la tabla 1:

"Dansk Laboratorie medicin, En Håndbog" Jørgen Lyngbye, 2001

Konsensus, www.cardio.dk el 18 de mayo de 2009 (Dansk Kardiologisk Selskab).

Adyuvante: Cualquier sustancia cuya mezcla con un determinante inmunógeno/antígeno administrado aumenta o modifica de otra forma la respuesta inmunitaria a dicho determinante.

Afinidad: La interacción de la mayoría de los ligandos con sus sitios de unión se puede caracterizar en términos de afinidad de unión. En general, la unión del ligando de alta afinidad resulta de la mayor fuerza intermolecular entre el ligando y su receptor, mientras que la unión del ligando de baja afinidad implica menos fuerza intermolecular entre el ligando y su receptor. En general, la unión de alta afinidad implica un tiempo de permanencia más largo para el ligando en su sitio de unión al receptor que en el caso de la unión de baja afinidad. La unión de alta afinidad de ligandos a receptores a menudo es fisiológicamente importante cuando parte de la energía de la unión se puede usar para producir un cambio conformacional en el receptor, produciendo el comportamiento alterado de un canal de iones asociado o enzima.

Un ligando que se une a un receptor, altera la función del receptor y produce una respuesta fisiológica, se llama un agonista para ese receptor. La unión del agonista a un receptor se puede caracterizar tanto en términos de cuánto se puede producir la respuesta fisiológica y la concentración del agonista que se necesita para producir la respuesta fisiológica. La unión del ligando de alta afinidad implica que una concentración relativamente baja de un ligando es adecuada para ocupar de forma máxima un sitio de unión del ligando y producir una respuesta fisiológica. La unión del ligando se caracteriza a menudo en términos de la concentración de ligando a la que la mitad de los sitios de unión al receptor están ocupados, conocido como la constante de disociación (Kd). Por consiguiente, un antagonista que es capaz de unirse a un receptor de la familia con dominio Vps10p, inhibiendo de esta forma la actividad de dicho receptor con dominio Vps10p puede ser un antagonista que tiene mayor afinidad por el sitio de unión de un agonista del dominio Vps10p que el propio agonista.

Alcohol: Una clase de compuestos orgánicos que contienen un o más grupos hidroxilo (OH). En este contexto un grupo hidrocarbonado saturado o insaturado, ramificado o no ramificado, colocado como sustituyente en una molécula mayor.

Grupo alicíclico: la expresión “grupo alicíclico” significa un grupo hidrocarbonado cíclico que tiene propiedades parecidas a las de los grupos alifáticos.

Grupo alifático: en el contexto de la presente invención, la expresión “grupo alifático” significa un grupo hidrocarbonado saturado o insaturado, lineal o ramificado. Esta expresión se usa para abarcar grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, por ejemplo.

Grupo alquilo: la expresión “grupo alquilo” significa un grupo hidrocarbonado saturado, lineal o ramificado, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, t-butilo, heptilo, dodecilo, octadecilo, amilo, 2-etilhexilo y similares.

Grupo alquenilo: la expresión “grupo alquenilo” significa un grupo hidrocarbonado insaturado, lineal o ramificado con uno o más dobles enlaces carbono-carbono, tal como un grupo vinilo.

Grupo alquinilo: la expresión “grupo alquinilo” significa un grupo hidrocarbonado insaturado, lineal o ramificado con uno o más triples enlaces carbono-carbono.

Anfifílico: sustancia que contiene grupos tanto polares, solubles en agua, como no polares insolubles en agua.

Agonista: Un agonista es un compuesto capaz de aumentar o afectar a la actividad de un receptor. Específicamente, un agonista del receptor con dominio Vps10p es un compuesto capaz de unirse a uno o más sitios de unión de un receptor con dominio Vps10p, induciendo de esta forma la misma respuesta fisiológica que un compuesto ligando agonista endógeno dado.

Antagonista: Un antagonista en este caso es sinónimo de un inhibidor. Un antagonista es un compuesto capaz de disminuir la actividad de un efector tal como un receptor. Específicamente, un antagonista de receptor con dominio Vps10p es un compuesto capaz de unirse a uno o más sitios de unión del receptor con dominio Vps10p, inhibiendo de esta forma la unión de otro ligando, inhibiendo así una respuesta fisiológica.

ARN de sentido contrario: una molécula de ARN capaz de producir el silenciamiento de un gen mediante la unión específica a una molécula de ARNm de interés.

ADN de sentido contrario: una molécula de ADN capaz de producir el silenciamiento de un gen mediante la unión específica a una molécula de ARNm de interés.

Apoptosis: La apoptosis es un proceso de suicidio por una célula en un organismo multicelular. Es una de los tipos principales de muerte celular programada (PCD), e implica una serie orquestada de sucesos bioquímicos que conducen a una morfología celular característica y muerte.

Inhibidor de apoptosis: Cualquier compuesto capaz de disminuir el proceso de apoptosis.

Grupo aromático: la expresión “grupo aromático” o “grupo arilo” significa un grupo hidrocarbonado aromático mono o policíclico.

Unión: El término “unión” o “asociado con” se refiere a un estado de proximidad entre entidades químicas o compuestos, o partes de los mismos. La asociación puede ser no covalente, en donde la yuxtaposición es favorecida energéticamente por enlaces de hidrógeno o interacciones de van der Waals o electrostáticas, o puede ser covalente.

Sitio de unión: La expresión “sitio de unión” o “bolsillo de unión”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una región de una molécula o complejo molecular que, como resultado de su forma, se asocia favorablemente con otra molécula, complejo molecular, entidad química o compuesto. Como se usa en la presente memoria, el bolsillo comprende al menos una cavidad profunda y opcionalmente una cavidad poco profunda.

Sitio de unión 1 de la sortilina: Un sitio de unión de alta afinidad de la neurotensina o, de forma sinónima, el sitio de unión 1 es un sitio de unión de la sortilina (SEQ ID NO: 1) que tiene alta afinidad por la neurotensina o un fragmento

o variante de neurotensina, y que tiene afinidad por el propéptido de sortilina o un fragmento del mismo (restos de aminoácidos 34-37 de la SEQ ID NO. 1) dicho sitio de unión comprende los restos de aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306, T398 a G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 y T402 de la SEQ ID NO. 1. Más preferiblemente, el sitio de unión 1 comprende los aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306 y T398 a G400 de la SEQ ID NO. 1. Lo más preferiblemente, el sitio de unión 1 de la sortilina comprende los aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 y F350 a M363 de la SEQ ID NO. 1.

El sitio de unión 1 es un sitio de unión promiscuo.

Sitio de unión 2 de la sortilina: Un sitio de unión de la sortilina que tiene baja afinidad por la neurotensina o un fragmento o variante de neurotensina, comprendiendo dicho sitio de unión los restos de aminoácidos L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 y S584 a F588 de la SEQ ID NO. 1. Más preferiblemente, el sitio de unión de la sortilina de baja afinidad de la neurotensina comprende los aminoácidos L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586 y W597 de la SEQ ID NO. 1. Lo más preferiblemente, el sitio de unión de la sortilina de baja afinidad de la neurotensina comprende los aminoácidos L572, L114 y V112. El sitio de unión 2 es promiscuo y se puede unir al propéptido de sortilina (restos de aminoácidos 34-77 de la SEQ ID NO. 1).

Sitio de unión 3 de la sortilina: Un sitio de unión promiscuo de la sortilina que comprende los restos de aminoácidos D403, S420, D422, N423, S424, I425, Q426, E444, T451, Y466, E470, I498, S499 y V500 de la SEQ ID NO. 1, más preferiblemente que comprende los restos de aminoácidos D403, N423, S424, I425, T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1, lo más preferiblemente que comprende los restos de aminoácidos T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1.

Agente biorreactivo: La expresión “agente biorreactivo” como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier sustancia que se puede usar en relación con una aplicación que es terapéutica o de diagnóstico, tal como, por ejemplo, en métodos para el diagnóstico de la presencia o ausencia de una enfermedad en un paciente, y/o métodos para el tratamiento de una enfermedad en un paciente. El “agente biorreactivo” se refiere a sustancias que son capaces de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo. Los agentes bioactivos pueden ser neutros, con carga positiva o negativa. Los agentes bioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, profármacos, agentes de diagnóstico, agentes terapéuticos, agentes farmacéuticos, fármacos, agentes de suministro de oxígeno, sustitutos de sangre, moléculas orgánicas sintéticas, polipéptidos, péptidos, vitaminas, esteroides, análogos de esteroides y determinantes genéticos, incluyendo nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.

Isquemia cerebral: La isquemia cerebral global es una afección isquémica donde el cerebro no recibe suficiente flujo sanguíneo para mantener la función neurológica normal.

Coma: Un periodo prolongado de inconciencia después de lesión cerebral o trastornos metabólicos. La persona en coma puede tener un reflejo simple en respuesta al tacto o dolor, pero esencialmente no hay respuesta significativa a estímulos externos.

Grupo catiónico: Un grupo químico capaz de funcionar como un donador de protones cuando un compuesto que comprende el grupo químico se disuelve en un disolvente, preferiblemente cuando se disuelve en agua.

Complejo: Como se usa en la presente memoria, el término “complejo” se refiere a la combinación de una molécula

o una proteína, análogos conservativos o truncados de la misma, asociada con una entidad química.

Coordenadas: El término “coordenadas” como se usa en la presente memoria, se refiere a la información de la organización tridimensional de los átomos que contribuyen a una estructura de proteína. El mapa final que contiene las coordenadas atómicas de los constituyentes del cristal se puede almacenar en un soporte informático;

típicamente, los datos se almacenan en un formato de PDB o en un formato de mmCIF, los cuales son ambos conocidos para el experto en la técnica. Sin embargo, las coordenadas cristalinas también se pueden almacenar en tablas simples o formato de texto. El formato de PDB se organiza de acuerdo con las instrucciones y directrices dadas por el Research Collaboratory for Structural Biology.

Grupo cíclico: la expresión “grupo cíclico” significa un grupo hidrocarbonado de anillo cerrado que se clasifica como un grupo alicíclico, grupo aromático o grupo heterocíclico.

Cicloalquenilo: significa un radical carbocíclico insaturado que consiste en 1, 2 o 3 anillos de 3 a 8 carbonos por anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquenilo inferior, alcoxi inferior, halogenoalcoxi inferior, alqueniltio, halógeno, halogenoalquenilo, hidroxialquenilo, nitro, alcoxicarbonenilo, amino, alquenilamino, alquenilsulfonilo, arilsulfonilo, alquenilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquenilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquenilcarbonilamino y arilcarbonilamino.

Cicloalquilo: significa un radical carbocíclico saturado monovalente que consiste en 1, 2 o 3 anillos, de 3 a 8 carbonos por anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, halogenoalcoxi inferior, alquiltio, halógeno, halogenoalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino y arilcarbonilamino.

Interacción dipolo-dipolo: La expresión “interacción dipolo-dipolo” como se usa en la presente memoria se refiere a la atracción que puede ocurrir entre dos o más moléculas polares. Por lo tanto, la “interacción dipolo-dipolo” se refiere a la atracción de un extremo positivo parcial, no cargado, de una primera molécula polar, con el extremo negativo parcial, no cargado, de una segunda molécula polar. La “interacción dipolo-dipolo” también se refiere al enlace de hidrógeno intermolecular.

Interacción electrostática: La expresión “interacción electrostática” como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier interacción que se produce entre componentes cargados, moléculas o iones, debido a fuerzas de atracción cuando componentes de carga eléctrica opuesta son atraídos entre sí. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: interacciones iónicas, interacciones covalentes, interacciones entre un ion y un dipolo (ion y molécula polar), interacciones entre dos dipolos (cargas parciales de moléculas polares), enlaces de hidrógeno y enlaces de dispersión de London (dipolos inducidos de moléculas polarizables). Así, por ejemplo, la “interacción iónica” o “interacción electrostática se refiere a la atracción entre una primera molécula positivamente cargada y una segunda molécula negativamente cargada. Las interacciones iónicas o electrostáticas incluyen, por ejemplo, la atracción entre un agente bioactivo negativamente cargado.

Hipercolesterolemia familiar: La hipercolesterolemia familiar (abreviada HF) es un trastorno genético caracterizado por niveles altos de colesterol, específicamente niveles muy altos de lipoproteína de baja densidad (LDL, “colesterol malo”), en la sangre y enfermedades cardiovasculares tempranas. Muchos pacientes tienen mutaciones en el gen de LDLR que codifica la proteína receptora de LDL (véase la figura 3) que elimina el LDL de la circulación, o apolipoproteína B (ApoB), que es parte del LDL que se une al receptor de LDL. Las mutaciones en otros genes son raras. Los pacientes que tienen una copia anómala (son heterocigotos) del gen de LDLR pueden tener enfermedad cardiovascular prematura a la edad de 30 a 40 años. Tener dos copias anómalas (ser homocigoto) puede producir enfermedad cardiovascular grave en la infancia. La HF heterocigota es un trastorno genético común, que aparece en

1:500 personas en la mayoría de los países; la HF homocigota es mucho más rara, apareciendo en 1 en un millón de nacimientos. El tratamiento de la HF heterocigota normalmente es con estatinas, secuestradores de ácidos biliares u otros fármacos que disminuyen los niveles de colesterol (agentes hipolipidémicos). A los nuevos casos se les ofrece normalmente asesoramiento genético. La HF homocigota a menudo no responde a la terapia médica y puede requerir otros tratamientos, incluyendo la aféresis de LDL (eliminación del LDL en un método similar a la diálisis) y ocasionalmente el trasplante de hígado. La presente invención proporciona nuevos medios para preparar un medicamento para el tratamiento de la HF y proporciona un método de tratamiento de la HF. La invención proporciona antagonistas de receptores con dominio Vps10p, en particular antagonistas que se unen específicamente a sitios de unión de la sortilina y/o SorLA.

Forman un anillo: significa que los átomos mencionados se conectan mediante un enlace cuando se forma la estructura de anillo.

Fragmentos: Los fragmentos de polipéptidos según la presente invención, incluyendo cualesquiera equivalentes funcionales de los mismos, en una realización pueden comprender menos de 500 restos de aminoácidos, tal como menos de 450 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 400 restos de aminoácidos, tal como menos de 350 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 300 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 250 restos de aminoácidos, tal como menos de 240 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 225 restos de aminoácidos, tal como menos de 200 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 180 restos de aminoácidos, tal como menos de 160 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 150 restos de aminoácidos, tal como menos de 140 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 130 restos de aminoácidos, tal como menos de 120 restos de aminoácidos, por

ejemplo menos de 110 restos de aminoácidos, tal como menos de 100 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 90 restos de aminoácidos, tal como menos de 85 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 80 restos de aminoácidos, tal como menos de 75 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 70 restos de aminoácidos, tal como menos de 65 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 60 restos de aminoácidos, tal como menos de 55 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 50 restos de aminoácidos. Los fragmentos de neurotensina incluyen, pero no se limitan a los aminoácidos C-terminales de la neurotensina PYIL e YIL. En un aspecto, el fragmento se selecciona del grupo que consiste en LYENKPRRPYIL, YENKPRRPYIL, ENKPRRPYIL, NKPRRPYIL, KPRRPYIL, PRRPYIL, RRPYIL, RPYIL, PYIL, YIL e IL, y variantes naturales o artificiales de los mismos. En una realización de la presente invención, el antagonista no es neurotensina o un fragmento de la misma.

Equivalencia funcional: “Equivalencia funcional” como se usa en la presente memoria, según una realización preferida, se establece por referencia con la correspondiente funcionalidad de un fragmento predeterminado de la secuencia.

Los equivalentes funcionales o variantes de un antagonista del receptor con dominio Vps10p, se entiende que presentan secuencias de aminoácidos que difieren gradualmente del péptido o polipéptido predeterminado preferido, basado en la secuencia del antagonista del dominio Vps10p, al aumentar el número y alcance de inserciones, eliminaciones y sustituciones incluyendo sustituciones conservativas. Esta diferencia se mide como una reducción en la homología entre la secuencia predeterminada preferida y el fragmento o equivalente funcional.

Una variante funcional obtenida por sustitución puede presentar alguna forma o grado de actividad de antagonista del dominio Vps10p natural, y todavía ser menos homólogo, si se sustituyen los restos que contienen cadenas laterales de aminoácidos funcionalmente similares. En este aspecto, funcionalmente similares se refiere a características dominantes de las cadenas laterales tales como hidrófobo, básico, neutro o ácido, o la presencia o ausencia de impedimento estérico. Por consiguiente, en una realización de la invención, el grado de identidad no es una medida principal de un fragmento que es una variante o equivalente funcional de un fragmento preferido predeterminado, según la invención.

“Silenciamiento” de genes: un procedimiento que conduce a la expresión reducida de genes endógenos. El silenciamiento de genes preferiblemente es el resultado de la reducción postranscripcional de la expresión de genes.

Isquemia global: anoxia resultante de la detención del suministro de sangre a todo el cuerpo dando como resultado el daño tisular por una variedad de mecanismos incluyendo la apoptosis.

Grupo: (resto/sustitución) como se entiende en este campo técnico, un grado alto de sustitución no solo es tolerado, sino que a menudo es aconsejable. En los materiales de la presente invención, está prevista la sustitución. Como medio para simplificar la descripción y cita de determinada terminología usada a lo largo de esta solicitud, los términos “grupo” y “resto” se usan para diferenciar entre especies químicas que permiten la sustitución o que pueden estar sustituidas, y aquellas que no permiten o no pueden estar sustituidas. Por lo tanto, el término “grupo” se usa para describir un sustituyente químico, el material químico descrito incluye el grupo no sustituido y ese grupo con átomos de O, N y S, por ejemplo, en la cadena así como grupos carbonilo, u otra sustitución convencional. Cuando se usa el término “resto” para describir un compuesto químico o sustituyentes, se pretende que esté incluido solo un material químico no sustituido. Por ejemplo, la frase “grupo alquilo” se pretende que incluya no solo sustituyentes alquilo hidrocarbonado saturado de cadena abierta puro, tales como metilo, etilo, propilo, t-butilo, y similares, sino también sustituyentes alquilo que llevan otros sustituyentes conocidos en la técnica, tales como hidroxi, alcoxi, alquilsulfonilo, átomos de halógeno, ciano, nitro, amino, carboxilo, etc. Por lo tanto, “grupo alquilo” incluyen grupos éter, halogenoalquilos, nitroalquilos, carboxialquilos, hidroxialquilos, sulfoalquilos, etc. Por otra parte, la frase “resto alquilo” está limitada a la inclusión de solo sustituyentes alquilo hidrocarbonado saturado de cadena abierta, puros, tales como metilo, etilo, propilo, t-butilo, y similares. La misma definición se aplica a “grupo alquenilo” y “resto alquenilo”, a “grupo alquinilo” y “resto alquinilo”, a “grupo cíclico” y “resto cíclico”, a “grupo alicíclico” y “resto alicíclico”, a “grupo aromático” o a “grupo arilo” y “resto aromático” o “resto arilo”, así como a “grupo heterocíclico” y “resto heterocíclico”.

Grupo heterocíclico: la expresión “grupo heterocíclico” significa un hidrocarburo de anillo cerrado, en el que uno o más átomos en el anillo son un elemento distinto de carbono (p. ej., nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.).

Heterociclilo significa un radical cíclico saturado monovalente, que consiste en uno a dos anillos, de 3 a 8 átomos por anillo, que incorpora 1 o 2 heteroátomos en el anillo (seleccionados de N, O o S(O)0-2), y que puede estar opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, oxo, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, halogenoalcoxi inferior, alquiltio, halógeno, halogenoalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminofarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino, o arilcarbonilamino.

Heteroarilo significa un radical cíclico aromático monovalente que tiene de 1 a 3 anillos, de 4 a 8 átomos por anillo, que incorpora 1 o 2 heteroátomos en el anillo (seleccionados de N, O o azufre) dentro del anillo que puede estar opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquilo

inferior, alcoxi inferior, halogenoalcoxi inferior, alquiltio, halo, halogenoalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonlamino y arilcarbonilamino.

Homología: como se usa en la presente memoria debe entenderse como sinónimo de la expresión identidad de secuencia. Por lo tanto, “homólogo con” es sinónimo de “idéntico a”. La homología entre secuencias de aminoácidos se puede calcular usando matrices de puntuación bien conocidas, tales como una cualquiera de BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85, y BLOSUM 90.

Se describen en la presente invención fragmentos que comparten homología con fragmentos de las SEQ ID NO: 1 a 13, respectivamente. Tienen una homología de al menos aproximadamente 60 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 65 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 70 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 75 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 80 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 85 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 90 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 92 por ciento, tal como homología de al menos aproximadamente 94 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 95 por ciento, tal como homología de al menos aproximadamente 96 por ciento, tal como homología de al menos aproximadamente 97 por ciento, tal como homología de al menos aproximadamente 98 por ciento, por ejemplo homología de al menos aproximadamente 99 por ciento, con dichas secuencias de fragmentos predeterminadas, respectivamente. Los porcentajes de homología se refieren a porcentajes de identidad.

Otro método que se puede adaptar de forma adecuada para determinar las relaciones de estructura y función de fragmentos de péptidos se describe en el documento US 6.013.478. Los expertos en la técnica también conocen método de ensayo de la unión de una secuencia de aminoácidos a un resto de receptor.

Además de sustituciones conservativas introducidas en cualquier posición de un péptido o polipéptido predeterminado preferido basado en antagonista del dominio Vps10p, o un fragmento del mismo, también puede ser deseable introducir sustituciones no conservativas en una cualquiera o más posiciones de dicho antagonista.

Una sustitución no conservativa que conduce a la formación de un fragmento funcionalmente equivalente de un péptido o polipéptido basado en el antagonista del dominio Vps10p, por ejemplo, i) diferiría sustancialmente en polaridad, por ejemplo un resto con una cadena lateral polar tal como Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn o GIn, o un aminoácido cargado tal como Asp, GIu, Arg o Lys, sustituido por un resto con una cadena lateral no polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, lle, Leu, Phe o Met), o se sustituye un resto no polar por uno cargado o polar; y/o ii) diferiría sustancialmente en su efecto en la orientación de la cadena principal del polipéptido, tal como la sustitución de o por Pro o Gly por otro resto; y/o iii) diferiría sustancialmente en la carga eléctrica, por ejemplo la sustitución de un resto positivamente cargado tal como Lys, His o Arg por un resto negativamente cargado tal como Glu o Asp (y viceversa); y/o iv) diferiría sustancialmente en el impedimento estérico, por ejemplo la sustitución por un resto voluminoso tal como His, Trp, Phe o Tyr, de uno que tiene una cadena lateral menor, p. ej. Ala, Gly o Ser (y viceversa).

Las variantes obtenidas por sustitución de aminoácidos, en una realización preferida, se pueden hacer basándose en los valores de hidrofobicidad e hidrofilicidad y la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de aminoácidos, incluyendo carga, tamaño y similares. Las sustituciones de aminoácidos de ejemplo que tienen en cuenta varias de las características anteriores son bien conocidas para los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Además de las variantes descritas en la presente memoria, se pueden formular variantes estéricamente similares para imitar partes clave de la estructura variante, y dichos compuestos también se pueden usar de la misma forma que las variantes de la invención. Esto se puede lograr por técnicas de modelado y diseño químico conocidas por los expertos en la técnica.

En una realización adicional de la presente invención, se refiere a variantes funcionales que comprenden aminoácidos sustituidos que tienen valores hidrófilos o índices hidropáticos que están dentro de +/-4,9, por ejemplo dentro de +/-4,7, tal como dentro de +/-4,5, por ejemplo dentro de +/-4,3, tal como dentro de +/-4,1 , por ejemplo dentro de +/-3,9, tal como dentro de +/-3,7, por ejemplo dentro de +/-3,5, tal como dentro de +/-3,3, por ejemplo dentro de +/-3,1 , tal como dentro de +/-2,9, por ejemplo dentro de +/-2,7, tal como dentro de +/-2,5, por ejemplo dentro de +/-2,3, tal como dentro de +/-2,1 , por ejemplo dentro de +/-2,0, tal como dentro de +/-1,8, por ejemplo with-in +/-1,6, tal como dentro de +/-1,5, por ejemplo dentro de +/-1,4, tal como dentro de +/-1,3 por ejemplo dentro de +/-1,2, tal como dentro de +/-1,1 , por ejemplo dentro de +/-1,0, tal como dentro de +/-0,9, por ejemplo dentro de +/-0,8, tal como dentro de +/-0,7, por ejemplo dentro de +/-0,6, tal como dentro de +/-0,5, por ejemplo dentro de +/-0,4, tal como dentro de +/-0,3, por ejemplo dentro de +/-0,25, tal como dentro de +/-0,2 el valor del aminoácido que se ha sustituido.

La importancia de los índices hidrófilo e hidropático de aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína, se entiende bien en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982 y Hopp, patente de EE.UU. nº 4.554.101).

Los valores del índice hidropático de aminoácidos como se usan en la presente memoria son: isoleucina (+4,5);

valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5) (Kyte y Doolittle, 1982).

Los valores de hidrofilicidad de aminoácidos son: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0.+-0,1); glutamato (+3,0.+-0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5.+-0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4) (documento U.S. 4.554.101).

Además de los compuestos de peptidilo descritos en la presente memoria, se pueden formular compuestos estéricamente similares para imitar partes clave de la estructura peptídica y dichos compuestos también se pueden usar de la misma forma que los péptidos descritos en la invención. Esto se puede lograr mediante técnicas de modelado y diseño químico conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar la esterificación y otras alquilaciones para modificar los extremos amino, por ejemplo, de una cadena principal de péptido diarginina, para imitar una estructura de tetrapéptido.

También se describen en la presente invención péptidos con alquilaciones N-terminales y esterificaciones Cterminales. Los equivalentes funcionales también comprenden glicosilados y conjugados covalentes o agregativos formados con el mismo u otros antagonistas del dominio Vps10p, incluyendo dímeros o restos químicos no relacionados. Dichos equivalentes funcionales se preparan por unión de grupos funcionales a grupos que se encuentran en el fragmento, incluyendo en cualquiera o ambos de los extremos N y C, por medios conocidos en la técnica.

Por lo tanto, los equivalentes funcionales pueden comprender fragmentos conjugados a ésteres alifáticos o de acilo

o amidas del extremo carboxilo, alquilaminas o restos que contienen cadenas laterales carboxilo, p. ej., conjugados con alquilaminas en los restos de ácido aspártico; derivados de O-acilo de restos que contienen grupo hidroxilo y derivados de N-acilo del amino del aminoácido terminal o de restos que contienen grupo amino, p. ej., conjugados con fMet-Leu-Phe o proteínas inmunógenas. Los derivados de los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo (incluyendo alquilo normal de C3 a C10), formando así especies de alcanoilo, y compuestos carbocíclicos o heterocíclicos, formando así especies aroilo. Los grupos reactivos preferiblemente son compuestos difuncionales conocidos para usar en el entrecruzamiento de proteínas en matrices insolubles por los grupos laterales reactivos.

Los equivalentes funcionales covalentes o agregativos y derivados de los mismos, son útiles como reactivos en inmunoensayos o para procedimientos de purificación por afinidad. Por ejemplo, un fragmento de un péptido antagonista del dominio Vps10p encontrado por la presente invención, se puede insolubilizar por unión covalente a Sepharose activada con bromuro de cianógeno, por métodos conocidos, o se puede adsorber a superficies poliolefínicas, con o sin entrecruzamiento con glutaraldheído, para usar en un ensayo o purificación de anticuerpos anti-dominio Vps10p o receptores de superficie celular. También se pueden marcar fragmentos con un grupo detectable, p. ej., radioyodado por el procedimiento de cloramina T, unido covalentemente a quelatos de tierras raras, o conjugado con otro resto fluorescente para usar, p. ej., en ensayos de diagnóstico.

La mutagénesis de un fragmento predeterminado preferido de un péptido basado en antagonista del dominio Vps10p se puede llevar a cabo haciendo inserciones de aminoácidos, normalmente del orden de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 1 a 5 restos de aminoácidos, o eliminaciones de aproximadamente 1 a 10 restos, tal como de aproximadamente 2 a 5 restos.

En una realización, el ligando del sitio de unión 1, 2 o 3, es un oligopéptido sintetizado por síntesis automática. Se puede usar cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles en el comercio, tal como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente restos de aminoácidos a una cadena de aminoácidos en crecimiento (véase, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963).

El equipo para la síntesis automática de polipéptidos está disponible en el comercio de proveedores tales como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, Calif., y en general se pueden manejar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La síntesis en fase sólida permitirá la incorporación de sustituciones de aminoácidos deseables en cualquier fragmento de un péptido basado en antagonista del dominio Vps10p encontrado por la presente invención. Se entenderá que las sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier subcombinación de los mismos, se pueden combinar para llegar a una secuencia final de un equivalente funcional. Debe entenderse que las inserciones incluyen fusiones de amino-terminales y/o carboxilo-terminales, p. ej., con una proteína hidrófoba o inmunógena, o un vehículo tal como cualquier polipéptido o estructura de armazón capaz de servir como un vehículo.

Se describen oligómeros incluyendo dímeros, que incluyen homodímeros y heterodímeros, de fragmentos de inhibidores de sortilina encontrados por la invención. Los equivalentes funcionales y variantes del péptido o polipéptido antagonista del dominio Vps10p se pueden producir como homodímeros o heterodímeros con otras secuencias de aminoácidos, o con secuencias de inhibidor de sortilina naturales. Los heterodímeros incluyen dímeros que contienen fragmentos de inhibición de sortilina inmunorreactivos, así como fragmentos de inhibición de sortilina que no es necesario que tengan o ejerzan ninguna actividad biológica.

Los antagonistas del receptor con dominio Vps10p que incluyen fragmentos de péptido inhibidor de sortilina se

pueden sintetizar tanto in vitro como in vivo. Los métodos para la síntesis in vitro son bien conocidos, y también se describen en la técnica anterior métodos que son adecuados o que se pueden adaptar de forma adecuada a la síntesis in vivo de inhibidores de sortilina. Cuando se sintetizan in vivo, una célula hospedante se transforma con vectores que contienen ADN que codifica un péptido inhibidor de sortilina o un fragmento del mismo. Un vector se define como una construcción de ácido nucleico que se puede replicar. Los vectores se usan para mediar la expresión de un péptido basado en antagonista del dominio Vps10p. Un vector de expresión es una construcción de ADN que se puede replicar, en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento inhibidor de sortilina predeterminado, o cualquier equivalente funcional del mismo que se pueda expresar in vivo, está operativamente unida a secuencias de control adecuadas capaces de llevar a cabo la expresión del fragmento o equivalente en un hospedante adecuado. Dichas secuencias de control son bien conocidas en la técnica. Se pueden usar tanto células procariotas como eucariotas para la síntesis de ligandos. Sin embargo, los cultivos de células derivadas de organismos multicelulares representan células hospedantes preferidas. En principio, se puede trabajar con cualquier cultivo de células eucariotas superiores, sea de un cultivo de vertebrado o invertebrado. Los ejemplos de líneas celulares de hospedante útiles son células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), y líneas celulares WI38, BHK, COS-7, 293 y MDCK. Las células hospedantes preferidas son células eucariotas que se sabe que sintetizan inhibidores de sortilina endógenos. Los cultivos de dichas células hospedantes se pueden aislar y usar como una fuente del fragmento, o usar en métodos de tratamiento terapéuticos, incluyendo métodos terapéuticos dirigidos a promover o inhibir un estado de crecimiento, o métodos de diagnóstico llevados a cabo en el cuerpo humano o animal.

Enlace hidrófobo: La expresión “enlace hidrófobo” como se usa en la presente memoria se refiere a una fuerza de atracción, o puente, que puede haber entre un átomo de hidrógeno que está unido covalentemente a un átomo electronegativo, por ejemplo, oxígeno, azufre o nitrógeno, y otro átomo electronegativo. El enlace de hidrógeno puede ser entre un átomo de hidrógeno en una primera molécula y un átomo electronegativo en una segunda molécula (enlace de hidrógeno intermolecular). El enlace de hidrógeno también puede estar entre un átomo de hidrógeno y un átomo electronegativo que están ambos contenidos en una sola molécula (enlace de hidrógeno intramolecular).

Interacción hidrófoba: La expresión “interacción hidrófoba” como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier interacción que ocurre entre componentes esencialmente no polares (hidrófobos) dentro de un intervalo de atracción de una con otra en un entorno polar (p. ej., agua). Como se usa en la presente memoria, el intervalo de atracción es en la escala desde 0,1 hasta 2 nm. Un tipo particular de interacción hidrófoba es la ejercida por las “fuerzas de Van der Waals”, es decir, las fuerzas atractivas entre moléculas no polares explicadas por mecánica cuántica. Las fuerzas de Van der Waals en general están asociadas con momentos dipolares momentáneos que son inducidos por moléculas vecinas y que implican cambios en la distribución de electrones.

Hiperlipidemia: que también se conoce como hiperlipoproteinemia o dislipidemia, es la presencia de niveles elevados

o anómalos de lípidos y/o lipoproteínas en la sangre. Los lípidos (moléculas grasas) son transportados en una cápsula de proteína, y la densidad de los lípidos y el tipo de proteína, determinan el destino de la partícula y su influencia en el metabolismo. Las anomalías en lípidos y lipoproteínas son extremadamente comunes en la población general, y se consideran como un factor de riesgo altamente modificable para la enfermedad cardiovascular, debido a la influencia del colesterol, una de las sustancias lipídicas clínicamente más relevantes, en la aterosclerosis. Además, algunas formas pueden predisponer a la pancreatitis aguda. La hiperlipoproteinemia se puede clasificar en los siguientes subtipos:

Hiperlipidemia como se usa en la presente memoria, debe entenderse como una afección caracterizada por concentraciones en el plasma sanguíneo de HDL-colesterol y/o LDL-colesterol y/o triglicéridos mayores que los valores recomendados citados en la tabla 1 en la presente memoria.

Hiperlipoproteinemia de tipo I

Esta forma muy rara (conocida también como síndrome de Buerger-Gruetz, hiperlipoproteinemia primaria, o hiperquilomicronemia familiar) se debe a una deficiencia de la lipoproteína lipasa (LPL) o apolipoproteína C2 alterada, produciendo quilomicrones elevados, las partículas que transfieren los ácidos grados del tracto digestivo al hígado. La lipoproteína lipasa también es responsable de la rotura inicial de los triacilglicéridos hechos de forma endógena en la forma de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL). Como tal, se esperaría que un defecto en la LPL diera como resultado también VLDL elevada. Su prevalencia es de 0,1% de la población.

Hiperlipoproteinemia de tipo II

La hiperlipoproteinemia de tipo II, es con mucho la más común, se clasifica además en tipo IIa y tipo IIb, dependiendo principalmente en si hay elevación en el nivel de triglicéridos además del LDL-colesterol.

Hiperlipoproteinemia de tipo IIa

Hipercolesterolemia familiar -Esta puede ser esporádica (debido a factores de la dieta), poligénica, o realmente familiar como resultado de una mutación en el gen del receptor de LDL en el cromosoma 19 (0,2% de la población) o el gen de la ApoB (0,2%). La forma familiar se caracteriza por xantoma tendinoso, xantelasma y enfermedad

cardiovascular prematura.

Hiperlipoproteinemia de tipo IIb

Los niveles altos de VLDL se deben al exceso de producción de sustratos, incluyendo triglicéridos, acetil CoA, y un aumento de la síntesis de B-100. También puede estar causada por la disminución de la eliminación de la LDL. La prevalencia en la población es 10%.

Hiperlipoproteinemia familiar combinada (HFC)

Hiperlipoproteinemia combinada secundaria (normalmente en el contexto de síndrome metabólico, para el que hay un criterio de diagnóstico). Aunque la modificación de la dieta es el procedimiento inicial para el tratamiento de los tipos de hiperlipoproteinemia mencionados, muchos pacientes requieren el tratamiento con estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) para reducir el riesgo cardiovascular. Si el nivel de triglicéridos es notablemente elevado, pueden ser preferibles los fibratos debidos a sus efectos beneficiosos. El tratamiento de combinación de estatinas con fibratos, aunque es muy eficaz, produce un riesgo notablemente mayor de miopatía y rabdomiolisis, y por lo tanto solo se hace bajo una estrecha supervisión. Otros agentes añadidos normalmente a las estatinas son ezetimiba, niacina y secuestrantes de ácidos biliares. Hay algunas pruebas del beneficio de los productos que contienen esteroles vegetales y ácidos grasos ω3. La presente invención proporciona una nueva estrategia para controlar los niveles de lípidos de los pacientes que lo necesiten.

Hiperlipoproteinemia de tipo III

Esta forma se debe a quilomicrones e IDL (lipoproteína de densidad intermedia) elevados. También conocida como enfermedad de la beta ancha o disbetalipoproteinemia, la causa más común de esta forma es la presencia del genotipo ApoE E2/E2. Se debe a las VLDL ricas en colesterol (ß-VLDL). La prevalencia es 0,02% de la población.

Hiperlipoproteinemia de tipo IV

Esta forma se debe a triglicéridos elevados. Se conoce como hipertrigliceridemia (o hipertrigliceridemia pura). De acuerdo con la definición de NCEP-ATPIII de triglicéridos elevados (>200 mg/dl), la prevalencia es aproximadamente 16% de la población adulta.

Hiperlipoproteinemia de tipo V

Este tipo es muy similar a la hiperlipoproteinemia de tipo I, pero con VLDL elevada además de quilomicrones. También está asociada con intolerancia a la glucosa e hiperuricemia. Además, las formas no clasificadas y raras incluyen lipoproteinemia hipo-alfa.

Los antagonistas encontrados por la presente invención se pueden usar para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la hiperlipoproteinemia I, IIa, IIb, III, IV y V.

Inhibición: El término inhibición como se usa en la presente memoria, se refiere a la prevención de la unión entre dos

o más componentes. Los ligandos identificados por la presente invención son capaces de inhibir la unión entre un receptor con dominio Vps10p y una proneutrotrofina.

Unión inhibidora: La expresión unión inhibidora entre p. ej., una proneutrotrofina y una sortilina, como se usa en la presente memoria se refiere a un método para proporcionar un ligando identificado por la presente invención, siendo dicho ligando capaz de prevenir la unión de una proneutrotrofina al sitio de unión 3 de la sortilina, previniendo así la formación de un complejo ternario entre sortilina, proNGF y p75NTR o cualquier fragmento o variante del mismo. La expresión unión inhibidora puede referirse también a la unión inhibidora de la neurotensina y/o propéptido de sortilina al sitio de unión 1 o 2 del receptor con dominio Vps10p sortilina.

In vitro/in vivo: los términos se usan con su significado normal.

In silico: un método de llevar a cabo una operación in vitro o in vivo por simulación con ordenador.

Isquemia: Restricción del suministro de sangre con disfunción o daño tisular resultante.

Daño tisular isquémico: Daño tisular debido a isquemia.

Ligando: una sustancia o compuesto que es capaz de unirse y formar un complejo con una biomolécula para servir para un fin biológico. En un sentido más estrecho, es una molécula que produce una señal al unirse a un sitio en una proteína diana, por fuerzas intermoleculares tales como enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals. El acoplamiento (asociación) normalmente es reversible (disociación). La unión covalente irreversible real entre un ligando y su molécula diana es rara en los sistemas biológicos. A diferencia del significado en química metalorgánica e inorgánica, es irrelevante si el ligando se une realmente o no a un sitio de metal, como es el caso en la hemoglobina. La unión de ligando a receptores puede alterar la conformación química, es decir, la forma tridimensional de la proteína receptora. El estado conformacional de una proteína receptora determina el estado

funcional de un receptor. La tendencia o fuerza de la unión se llama afinidad. Los ligandos incluyen sustratos, inhibidores, activadores y neurotransmisores. Los radioligandos son compuestos marcados con radioisótopos y se usan in vivo como trazadores en estudios de PET y en estudios de unión in vitro.

Restos de un compuesto particular cubre grupo(s) o parte(s) de dicho compuesto particular.

Agente farmacéutico: Las expresiones “agente farmacéutico” o “fármaco” o “medicamento”, se refieren a cualquier agente terapéutico o profiláctico que se puede usar en el tratamiento (incluyendo prevención, diagnóstico, alivio o cura) de una dolencia, indisposición, afección, enfermedad o lesión en un paciente. Se pueden incluir determinantes genéticos, péptidos, polipéptidos y polinucleótidos terapéuticamente útiles, en el significado de la expresión agente farmacéutico o fármaco. Como se define en la presente memoria, un “agente terapéutico”, “agente farmacéutico” o “fármaco” o “medicamento” es un tipo de agente bioactivo.

Composición farmacéutica: o fármaco, medicamento o agente, se refieren a cualquier material, compuesto o composición químicos o biológicos capaces de inducir un agente terapéutico deseado cuando se administran de forma adecuada a un paciente. Algunos de los fármacos se venden en forma inactiva que se convierte in vivo en un metabolito con actividad farmacéutica. Para los propósitos de la presente invención, las expresiones “composición farmacéutica” y “medicamento” abarcan tanto el fármaco inactivo como el metabolito activo.

Polipéptido: El término “polipéptido” como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende al menos dos aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser naturales o sintéticos. Los “oligopéptidos” se definen en la presente memoria como polipéptidos de longitud no mayor de 100 aminoácidos. El término “polipéptido” se pretende que incluya también proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, estos pueden formar complejos, estar unidos covalentemente o pueden estar unidos de forma no covalente. Los polipéptidos en una proteína pueden estar glicosilados y/o comprender lípidos y/o comprender grupos prostéticos.

Polinucleótido: “Polinucleótido” como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende al menos dos ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden ser naturales o modificados, tales como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Polinucleótido como se usa en la presente memoria en general se refiere a

i) un polinucleótido que comprende una secuencia codificante determinada, o

ii) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos predeterminada, o

iii) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido codificado por los polinucleótidos (i) o (ii), en donde dicho fragmento tiene al menos una actividad predeterminada como se especifica en la presente memoria; y

iv) un polinucleótido cuya cadena complementaria hibrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido como se define en uno cualquiera de (i), (ii) y (iii), y codifica un polipéptido, o un fragmento del mismo, que tiene a menos una actividad predeterminada como se especifica en la presente memoria; y

v) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es degenerada con respecto a la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos (iii) o (iv);

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

Anticuerpo purificado: La expresión un “anticuerpo purificado” es un anticuerpo 60% al menos del cual carece de polipéptidos y moléculas orgánicas que se encuentran de forma natural, con los que está naturalmente asociado. Preferiblemente, la preparación comprende el anticuerpo en una cantidad de al menos 75 por ciento en peso, más preferiblemente al menos 90% en peso, y lo más preferiblemente al menos 99 por ciento en peso. Preferiblemente el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de conejo anti-sortilina.

Desviación media cuadrática: La expresión “desviación media cuadrática” (rmsd) se usa como medio de comparación de dos estructuras estrechamente relacionadas, y se refiere a una desviación en la distancia entre átomos relacionados de las dos estructuras después de minimizar estructuralmente esta distancia en un alineamiento. Proteínas relacionadas con estructuras estrechamente relacionadas se caracterizarán por valores de RMSD relativamente bajos, mientras que mayores diferencias darán como resultado un aumento del valor de la RMSD.

Identidad de secuencia: La identidad de secuencia se determina en una realización usando fragmentos de un péptido o polipéptido basado en antagonista del dominio Vps10p, que comprenden al menos 25 aminoácidos contiguos y que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, tal como 85%, por ejemplo 90%, tal como 95%, por ejemplo 99% idéntica con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 respectivamente, en donde el porcentaje de identidad se determina con el algoritmo GAP, BESTFIT, o FASTA en el

Wisconsin Genetics Package Release 7.0, usando los pesos de los huecos por defecto.

Las siguientes expresiones se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: “secuencia predeterminada”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” e “identidad sustancial”.

Una “secuencia predeterminada” es una secuencia definida usada como una base para una comparación de secuencias; una secuencia predeterminada puede ser un subconjunto de una secuencia más larga, por ejemplo, como un segmento de un ADN o secuencia de gen de longitud completa dado en una lista de secuencias, tal como una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 1, o puede comprender un ADN o secuencia de gen completo. En general, una secuencia predeterminada es de al menos 20 nucleótidos de longitud, con frecuencia al menos 25 nucleótidos de longitud, y a menudo al menos 50 nucleótidos de longitud.

Puesto que dos polinucleótidos puede cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia de polinucleótido completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos típicamente se llevan a cabo comparando secuencias de los polinucleótidos a lo largo de una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación” como se usa en la presente memoria, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos en donde una secuencia de polinucleótido se puede comparar con una secuencia predeterminada de al menos 20 nucleótidos contiguos, y en donde la parte de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos comparado con la secuencia predeterminada (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede llevar a cabo por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. MoI. Biol. 48: 443, por la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, el que produce el mayor porcentaje de homología a lo largo de la ventana de comparación) generado por diferentes métodos.

La expresión “identidad de secuencia” significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, basándose en nucleótido a nucleótido) a lo largo de la ventana de comparación. La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas de forma óptima a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que hay base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para dar para dar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad secuencia. La expresión “identidad sustancial” como se usa en la presente memoria, indica una característica de una secuencia de polinucleótido, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad que secuencia de al menos 85 por ciento, preferiblemente identidad de secuencia de al menos 90 a 95 por ciento, más habitualmente identidad de secuencia de al menos 99 porciento, comparada con una secuencia predeterminada a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, con frecuencia a lo largo de una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de la identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia predeterminada con la secuencia de polinucleótido que puede incluir eliminaciones o adiciones en un total de 20 por ciento o menos de la secuencia predeterminada a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia predeterminada puede ser un subconjunto de una secuencia más larga, por ejemplo, como un segmento de la secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 1 de longitud entera ilustrada en la presente memoria.

Aplicado a los polipéptidos, un grado de identidad de secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos idénticos en posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos. Un grado de homología o similitud de secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos, es decir, estructuralmente relacionados, en posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos.

Una secuencia “no relacionada” o “no homóloga” comparte una identidad menor de 40%, pero preferiblemente una identidad menor de 25%, con un péptido o polipéptido basado en el antagonista del dominio Vps10p de la presente invención. La expresión “identidad sustancial” significa que dos secuencias de péptidos, cuando están alineadas de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT que usan los pesos de huecos por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 95 por ciento o más (p. ej., una identidad de secuencia de 99 por ciento). Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son idénticos difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la intercambiabilidad de restos que tiene en cadenas

laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene en cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que tienen hidroxilo alifático es serina y treonina, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservativas preferidas son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina.

Adicionalmente, las variantes también se determinan basándose en un número predeterminado de sustituciones de aminoácidos conservativas como se define en la presente memoria más adelante. La sustitución de aminoácido conservativa como se usa en la presente memoria, se refiere a la sustitución de un aminoácido (dentro de un grupo predeterminado de aminoácidos) por otro aminoácido (dentro del mismo grupo) en donde los aminoácidos presentan características similares o sustancialmente similares.

Dentro del significado de la expresión “sustitución de aminoácido conservativa” como se aplica en la presente memoria, un aminoácido se puede sustituir por otro dentro de los grupos de aminoácidos indicados en la presente memoria a continuación:

i) Aminoácidos que tienen cadenas laterales polares (Asp, GIu, Lys, Arg, His, Asn, GIn, Ser, Thr, Tyr y Cys),

ii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares (Gly, Ala, Val, Leu, lle, Phe, Trp, Pro y Met)

iii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (Gly, Ala Val, Leu, Ile)

iv) Aminoácidos que tienen cadenas laterales cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro)

v) Aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas (Phe, Tyr, Trp)

vi) Aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (Asp, GIu)

vii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (Lys, Arg, His)

viii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida (Asn, GIn)

ix) Aminoácidos que tienen cadenas laterales con hidroxi (Ser, Thr)

x) Aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre (Cys, Met),

xi) Aminoácidos neutros, débilmente hidrófobos (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr)

xii) Aminoácidos ácidos, hidrófilos (GIn, Asn, GIu, Asp), y

xiii) Aminoácidos hidrófobos (Leu, Ile, Val)

Por consiguiente, una variante o uno de sus fragmentos puede comprender, dentro de la misma variante de la secuencia o sus fragmentos, o entre diferentes variantes de la secuencia o sus fragmentos, al menos una sustitución tal como una pluralidad de sustituciones introducidas independientemente entre sí.

Está claro a partir del esquema anterior, que la misma variante o su fragmento puede comprender más de una sustitución de aminoácido conservativa de más de un grupo de aminoácidos conservativos como se ha definido antes en la presente memoria.

La adición o eliminación de al menos un aminoácido puede ser una adición o eliminación preferiblemente de 2 a 250 aminoácidos, tal como de 10 a 20 aminoácidos, por ejemplo de 20 a 30 aminoácidos, tal como de 40 a 50 aminoácidos. Sin embargo, adiciones o eliminaciones de más de 50 aminoácidos, tal como adiciones de 50 a 100 aminoácidos, adición de 100 a 150 aminoácidos, adición de 150-250 aminoácidos, también están comprendidas dentro de la presente invención. La eliminación y/o adición pude ser, independientemente entre sí, una eliminación y/o una adición dentro de una secuencia y/o en el extremo de una secuencia.

ARNip: “ARN interferente pequeño” (ARNip) es una molécula de ARN bicatenaria, corta (a menudo, pero no restringido, de menos de 30 nucleótidos de longitud) capaz de producir el silenciamiento específico de genes en células de mamífero.

Alquilo inferior sustituido significa un alquilo inferior que tiene de 1 a 3 sustituyentes, seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, amino, amido, carboxilo, acilo, halógeno, ciano, nitro y tiol.

Tratamiento: El término “tratamiento” como se usa en la presente memoria, se refiere a un método que implica terapia, incluyendo cirugía, de una afección clínica en un individuo, incluyendo un cuerpo humano o animal. La terapia puede ser de mejora, curativa o profiláctica, es decir, que reduce el riesgo de adquirir la enfermedad.

Variantes: El término “variantes” como se usa en la presente memoria, se refiere a variantes de secuencias de aminoácidos, teniendo preferiblemente dichas variantes de secuencias una identidad de al menos 60%, por ejemplo identidad de al menos 63%, tal como identidad de al menos 66%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 70%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 72%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 75%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 80%, tal como identidad de secuencia de al menos 85%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 90%, tal como identidad de secuencia de al menos 91%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 91%, tal como identidad de secuencia de al menos 92%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 93%, tal como identidad de secuencia de al menos 94%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 95%, tal como identidad de secuencia de al menos 96%, por ejemplo identidad de secuencia de al menos 97%, tal como identidad de secuencia de al menos 98%, por ejemplo identidad de secuencia de 99% con cualquiera de las secuencias predeterminadas. Las variantes de neurotensina incluyen, pero no se limitan a variantes artificiales de la neurotensina tales como NT69L.

Regulación por aumento de la expresión: un proceso que conduce al aumento de expresión de genes, preferiblemente de genes endógenos.

Antagonista/inhibidor del receptor con dominio Vps10p

La presente invención describe además antagonistas que tienen la estructura general de fórmula (I):

en donde X es un átomo que actúa como donador de hidrógeno, seleccionado dicho átomo del grupo que consiste en N, O, S, P y en donde

Y es un átomo electronegativo que actúa como aceptor de enlace de hidrógeno seleccionado del grupo que consiste en O, N, S, F, Cl, Br, I, y en donde

R1 es alquilo C3-6, ciclilo C4-6, una estructura heterocíclica o heteroaromática que tiene 1 anillo, de 4 a 6 miembros en el anillo en cada uno y de 1 a 3 heteroátomos, o un heteroalquilo que comprende de 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O, S(0)0-2, y en donde

R2 es hidrógeno, un alquilo C1-12 o una estructura aromática, carbocíclica, heterocíclica o heteroaromática que tiene 1-3 anillos, 3-8 miembros en el anillo en cada uno, y 0-4 heteroátomos, o un heteroalquilo que comprende de 1 a 8 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste N, O, S(O)0-2, y en donde

R3 es hidrógeno, SH, imidazol, alquilo C1-12 o una estructura aromática, carbocíclica, heterocíclica o heteroaromática que tiene 1-3 anillos, 3-8 miembros en el anillo en cada uno, y 0-4 heteroátomos, o un heteroalquilo que comprende de 1 a 8 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O, S, y en donde

R4 se selecciona de los grupos funcionales alquilo lineal o ramificado C1-100, alquenilo lineal o ramificado, alquinilo lineal o ramificado, fenilo, bencilo, halogenoalcano, cloroalcano, bromoalcano, yodoalcano, halogenoformilo, hidroxilo, carbonilo, aldehído, éster de carbonato, carboxilato, carboxilo, éter, éster, hidroperoxi, peroxi, carboxamida, amina primaria, amina secundaria, amina terciaria, amonio, cetimina primaria, cetimina secundaria, aldimina primaria, aldimina secundaria, imida, azida, azo (diimida), cianato, isocianuro, isotiocianato, nitrato, nitrilo, nitrosooxi, nitro, nitroso, piridilo, fosfino, fosfato, fosfono, sulfonilo, sulfinilo, sulfhidrilo (SH), tiocianato, disulfuro, un conector L2 o L3, y una secuencia de aminoácidos que es al menos 50% idéntica a la SEQ ID NO: 10 o un fragmento de la misma.

El antagonista de fórmula (I) es específico para el sitio de unión 1 (sitio de unión de neurotensina de alta afinidad) de la sortilina.

El antagonista tiene la estructura general de fórmula (II):

en donde Z es un donador o aceptor de enlace de hidrógeno, seleccionado del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, amino, imino, amida, sulfhidrilo, cloro, fluoro, y en donde

R5 se selecciona del grupo que consiste en H, CH3, y un conector L2, y en donde

5 R6 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH3, -CH2CH3 y -OCH3, y en donde

R7 se selecciona del grupo que consiste en cadenas laterales de glutamato, glutamina, lisina, arginina, histidina, tirosina, metionina, cisteína, grupos alifáticos C4-6, y en donde

R8 se selecciona del grupo que consiste en cadenas laterales de tirosina, histidina, serina, treonina, aspartato, asparagina, cisteína, fenilalanina, yodo-tirosina y -CH2-NH2, y en donde

10 R9 se selecciona del grupo que consiste en cadena lateral de lisina, arginina, glutamina, grupos C3-8 alifáticos y heteroalifáticos, grupos carbocíclicos y heterocíclicos que comprenden 5 o 6 miembros en el anillo, y en donde

R10 se selecciona del grupo que consiste en un piroglutamato, policarbohidratos y un polipéptido de longitud mayor o igual que 10, y en donde

R11 y R12 individualmente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo lineal o ramificado C1-12, alquenilo

15 lineal o ramificado, alquinilo lineal o ramificado, fenilo, bencilo, halogenoalcano, cloroalcano, bromoalcano, yodoalcano, halogenoformilo, hidroxilo, carbonilo, aldehído, éster de carbonato, carboxilato, carboxilo, éter, éster, hidroperoxi, peroxi, carboxamida, amina primaria, amina secundaria, amina terciaria, amonio, cetimina primaria, cetimina secundaria, aldimina primaria, aldimina secundaria, imida, azida, azo (diimida), cianato, isocianuro, isotiocianato, nitrato, nitrilo, nitrosooxi, nitro, nitroso, piridilo, fosfino, fosfato, fosfono, sulfonilo, sulfinilo, sulfhidrilo

20 (SH), y en donde

los enlaces covalentes (1) y (2) se seleccionan individualmente del grupo que consiste en enlaces sencillos y enlaces dobles.

El antagonista de fórmula (II) es específico para el sitio de unión 2 (sitio de unión de neurotensina de baja afinidad) de la sortilina.

25 El antagonista puede tener además la estructura general de fórmula (III):

donde

R14, R15, R17, R19, R20 se seleccionan individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-12, alquenilo y alquinilo, y en donde R16 se selecciona del grupo que consiste en cadenas laterales de fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, metionina,

histidina, cisteína, lisina y alifática C3-7, y en donde R18 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH3 y -CH2OH, y en donde los enlaces covalentes (1) y (2) se seleccionan individualmente del grupo que consiste en enlaces sencillos y

enlaces dobles.

El antagonista de fórmula (I) o (II), en donde el conector L2 se selecciona del grupo que consiste en una cadena principal de péptido de 5 a 6 restos, alquilo C15-20, alquenilo C15-20 y alquinilo C15-20. El antagonista de fórmula (III) es específico para el sitio de unión 3 (sitio de unión de proneurotrofina) de la sortilina. En una realización, el antagonista de fórmula (I) está conectado al antagonista de fórmula (II) por un conector L2,

formando así la fórmula general (IV): [Fórmula (I)] -[Conector L2] -[Fórmula (II)] (IV) En una realización, el conector L3 se selecciona del grupo que consiste en una cadena principal de péptido de 12 a

20 restos, alquilo C30-60, alquenilo C30-60 y alquinilo C30-60.

El antagonista de fórmula (I) está conectado al antagonista de fórmula (III) por el conector L3, formando así la fórmula general (V): [Fórmula (I)] -[Conector L3] -[Fórmula (III)] (V) El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista se selecciona del

grupo que consiste en RRPYI(chg), yodoYIL, QIL, YCL, dYIL, YHL, RRPYI(acc), RRPYI(nMe)L, YIL representado en

la figura 10. El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es RRPYI(chg) representado en la figura 10.

El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es yodoYIL

representado en la figura 10. El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es QIL representado en la figura 10.

El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es YCL representado

en la figura 10. El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es dYIL representado en la figura 10.

El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es YHL representado

en la figura 10. El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es RRPYI(acc) representado en la figura 10.

El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es RRPYI(nMe)L

representado en la figura 10. El antagonista como se ha definido antes en la presente memoria en donde dicho antagonista es YIL representado en la figura 10.

En una realización de la presente invención, el animal se selecciona del grupo que consiste en ratón, rata, conejo,

animal canino y perro. En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 60% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 65% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 75% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 80% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 91% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 92% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 93% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 94% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 96% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 97% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 98% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 99% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 99,5% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente invención, el receptor con dominio Vps10p comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 99,9% con la SEQ ID NO. 1.

En una realización de la presente invención el al menos un antagonista como se define en la presente memoria, es capaz de inhibir la unión de un agonista seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 6 (proNGF), SEQ ID NO. 7 (proBDNF), SEQ ID NO. 8 (proNT3), SEQ ID NO. 9 (pro-NT4/5), SEQ ID NO. 14 (ApoE) o SEQ ID NO. 15 (LpL) o un fragmento o variante de los mismos, a dicho receptor con dominio Vps10p.

En otra realización de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306, T398 a G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 y T402 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

En otra realización más de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306 y T398 a G400 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

En otra realización más de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 y F350 a M363 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

En otra realización más de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 y

S584 a F588 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

En otra realización más de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586 y W597 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

En otra realización importante de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos L572, L114 y V112 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

En una realización importante de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos D403, S420, D422, N423, S424, I425, Q426, E444, T451, Y466, E470, I498, S499 y V500 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

En una realización preferida de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos D403, N423, S424, I425, E444, T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

En una realización muy preferida de la presente invención, el al menos un antagonista como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido del sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos E444, T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina).

El antagonista, que en este sentido es sinónimo de un inhibidor del receptor con dominio Vps10p, se selecciona, pero no está limitado al grupo que comprende proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas y ARNip.

Anticuerpos contra el receptor con dominio Vps10p

Un anticuerpo se une fuertemente a una molécula diana particular, inactivándola así directamente o marcándola para su destrucción. El anticuerpo reconoce su diana (antígeno) con una notable especificidad y fuerza que viene dada por la suma de muchas fuerzas químicas, que incluyen enlaces de hidrógeno, fuerzas hidrófobas y de van der Waals, así como interacciones iónicas. En general, cuanto más compleja químicamente es la diana, más inmunógena será. El determinante antigénico puede abarcar tramos de aminoácidos lineales cortos o un módulo de proteína tridimensional más complicado.

Conceptualmente, los anticuerpos dirigidos contra un receptor diana pueden inhibir la unión del ligando de dos formas: competitiva o alostérica. La inhibición competitiva implica la unión directa del anticuerpo a o cerca del sitio de unión del ligando en el receptor, desplazando de esta forma al ligando de su receptor, o la inhibición estérica del acercamiento del ligando al sitio de unión del ligando. La inhibición alostérica implica la unión del anticuerpo a un sitio en el polipéptido receptor que es distinto del epítopo de unión del ligando. Sin embargo, la unión a este sitio inducirá un cambio conformacional en la estructura general del receptor que hace más difícil o incluso imposible para el ligando unirse a su sitio de reconocimiento cognado.

Los autores de esta solicitud han producido anticuerpos contra varias partes de los receptores con dominio Vps10p. La presente invención describe anticuerpos contra la característica unificadora de esta familia de receptores, las de dominio Vps10p. El alineamiento de secuencias más adelante de dominios Vps10p demuestra la conservación dentro de esta familia de receptores.

Tabla 2: Anticuerpos contra receptores con dominio Vps10p

Receptor: Nombre Antígeno Especie Western IH/IC Ref.

SorLA: SORLA cabra Dominio extracelular cabra X X Schmidt et. al.,

J. Biol. Chem. 282:32956-67,

2007

Hale SORLA: Dominio citoplasmático conejo X

SORLA LA: Repetición de tipo complemento conejo X

Sol SORLA: Dominio extracelular conejo X X Andersen et al., PNAS 103:13461-6, 2005

Receptor: Nombre Antígeno Especie Western IH/IC Ref.

SORLA cola: Dominio citoplasmático conejo X

SORLA VPS: Dominio Vps10p conejo X

nº 606870: Sec. de péptido en dominio Vps10p conejo X

nº 642739: C-terminal conejo X

nº 643739: Cola citoplasmática conejo X

20C11: Dominio extracelular ratón X X

AG4: Dominio extracelular ratón X

Sortilina: nº 5264 Dominio extracelular conejo X X Munck Petersen et al., EMBO J. 18 :595-604, 1999

nº 5448: Dominio citoplasmático conejo X X Jansen et al., Nature Neurosci. 10 :1449-1457, 2007

nº 5287: Dominio citoplasmático conejo X

CP 96 334 SR 96 204: Propéptido conejo X Munck Petersen et al., EMBO J. 18 :595-604, 1999

nº 5438: Vps10p conejo X

Sortilina cabra/Laika: Dominio extracelular cabra X

F9: Dominio extracelular ratón X X

F11: Dominio extracelular ratón X X

AF2934: Dominio extracelular cabra X X R&D Systems, Jansen et al., Nature Neurosci. 10:14491457, 2007

AF3154: Dominio extracelular cabra X X R&D Systems; Jansen et al, Nature Neurosci. 10:14491457, 2007

anti-NTR3: Dominio extracelular ratón X X BD Transduction Laboratories,

ANT-009: Dominio extracelular ratón X X Alomone Labs; Nykjaer et al., Nature 427 :8 43-848, 2004

SorCS1: AF3457 Dominio extracelular cabra X X BD Transduction Laboratories

SorCSI cabra: Dominio extracelular cabra X

L-SorCS1: Dominio extracelular conejo X X Hermey et al., J. Biol. Chem. 279:50221-50229, 2003

Leu-SorCS1: Dominio rico en leucina conejo X X Hermey et al., J. Biol. Chem. 279:50221-50229, 2003

nº 5466: Dominio extracelular conejo X X

1D: Dominio extracelular ratón X

4H: Dominio extracelular ratón X

Receptor: Nombre Antígeno Especie Western IH/IC Ref.

6B: Dominio extracelular ratón X

4A: Dominio extracelular ratón X

SorCS2: AF4237 Dominio extracelular oveja X BD Transduction Laboratories

SorCS2 cabra: Dominio extracelular cabra X X

nº 5422: Dominio extracelular conejo X X Hermey et al., Biochem. J., 395:285-93, 2006

nº 5431: 28 aminoácidos Cterminales conejo X X

SorCS2-prp: Propéptido conejo X Schousboe Sjoegaard, Dissertation, Aarhus University, 2005

M1: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M3: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M4: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M7: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M9: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M10: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M13: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M15: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M18: Dominio extracelular ratón X X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

M19: Dominio extracelular ratón X X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

S21: Dominio extracelular ratón X Roland Hoist, Master of Science Thesis, Aarhus University, 2006

SorCS2-GST73aa: Dominio extracelular conejo X

Receptor: Nombre Antígeno Especie Western IH/IC Ref.

SorCS2-GST100aa: Dominio extracelular conejo X

SorCS2-GST172aa: Dominio extracelular conejo X

SorCS3: SorCS3-N Dominio extracelular conejo X

SorCS3-C: 15 aa C-terminales conejo X

Sort3 N-Term nº 5389: Dominio N-terminal conejo X X Westergaard et al., FEBS Lett. 579:1172-6, 2005

nº 5432: Dominio extracelular conejo X X

MAB3067: Dominio extracelular ratón X BD Transduction Laboratories

MAB30671: Dominio extracelular ratón X BD Transduction Laboratories

AF3326: Dominio extracelular cabra X BD Transduction Laboratories

SorCS3: Dominio extracelular cabra X

Uso genérico de un anticuerpo para inhibir la unión de un ligando

Procedimiento para hacer anticuerpos

Los anticuerpos policlonales y monoclonales dirigidos contra un antígeno específico, o epítopo de un antígeno, se pueden producir de acuerdo con procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Antibodies -A laboratory Manual de Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory 1998, ISBN 0-87969-314-2). El procedimiento para la posterior generación de anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos también se ha descrito (p. ej.,

A. M. Scott et al., Cancer Research 60:3254-3261, 2000; A. Nissim y Y. Chernajovsky, Handb. Exp. Pharmacol. 181:3-18, 2008; A. Mountain y J. R. Adair, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1-142, 1992).

Expectativas generales de éxito en la preparación de anticuerpos

Se pueden generan anticuerpos contra cualquier motivo de péptido que se elija usando oligopéptidos sintéticos cortos que abarcan el epítopo diana deseado. Por lo tanto, se garantiza que se pueden generar anticuerpos contra sitios de unión del ligando en receptores. El que la especie de anticuerpo individual tenga o no el potencial para inhibir la unión del ligando depende simplemente del hecho de que la afinidad de la inmunoglobulina por el receptor supere la del ligando. Al final es una cuestión de cribar el potencial inhibidor de una serie de anticuerpos individuales para encontrar uno con las propiedades deseadas.

Los ensayos de cribado para anticuerpos inhibidores son comúnmente conocidos y típicamente implican un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA). En detalle, el receptor recombinante o un fragmento que abarca su motivo de unión de ligando, se inmovilizan en pocillos por duplicado de placas de microvaloración. Posteriormente, los pocillos se incuban con una solución que contiene el ligando. La unión del ligando al receptor inmovilizado se confirma usando un anticuerpo que reconoce el ligando y que está acoplado con una reacción de color con colorante. La unión del ligando al receptor se ensaya en presencia de diferentes anticuerpos para identificar las especies de inmunoglobulina que bloquean la unión del ligando al receptor, y por lo tanto previenen la reacción de color en el respectivo pocillo de la placa de microvaloración.

Uso clínico satisfactorio de anticuerpos

Hay una serie de anticuerpos terapéuticos que se usan en clínica. Los ejemplos incluyen Rituxan de Genentech, un anticuerpo dirigido contra el receptor de CD20 (usado en la artritis reumatoide), Remicade de Johnson & Johnson, un anticuerpo dirigido contra el receptor del TNF alfa (en psoriasis), Avastin de Roche, un anticuerpo anti-VEGF

usado para el tratamiento del cáncer colorrectal y pulmonar, así como Herceptin, un anticuerpo contra el receptor

HRE2 usando en la terapia del cáncer de mama. La evaluación de la unión a un receptor es un trabajo rutinario para el experto en el campo de la biotecnología. En relación con esto, debe mencionarse que las proneutrofinas, así como la familia de receptores con dominio Vps10p, eran conocidos en la fecha de prioridad de esta invención, y se han mencionado en la técnica anterior ensayos de unión que implican, por ejemplo, proneurotrofinas, por ejemplo en el artículo de Lee et al. (2001) Science 294:19451948.

Por consiguiente, en una realización importante, el agonista usado en la presente invención es un anticuerpo. En una realización adicional, el anticuerpo se dirige contra una parte extracelular del receptor con dominio Vps10p. En una realización adicional, el anticuerpo se dirige contra una parte intracelular del receptor con dominio Vps10p. En una realización adicional, el anticuerpo se dirige contra una parte transmembrana del receptor con dominio

Vps10p. En una realización de la presente invención, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria, se

selecciona del grupo que consiste en: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de una cadena, anticuerpos recombinantes. La presente invención describe además un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo como se ha definido

antes en la presente memoria y un conjugado seleccionado del grupo que consiste en: un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, una toxina, o un isótopo radiactivo; un miembro de un par de unión específico, tal como avidina, o estreptavidina o un antígeno.

Métodos para cribar antagonistas/inhibidores de receptores con dominio Vps10p La presente invención se refiere a métodos in vitro e in vivo para identificar un antagonista de un receptor con dominio Vps10p, siendo capaz dicho antagonista de unirse a dicho receptor con dominio Vps10p y así inhibir la

unión de un agonista endógeno a dicho receptor, previniendo/inhibiendo por consiguiente una respuesta fisiológica asociada con la regulación de concentraciones de lípidos en el plasma sanguíneo. Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para cribar un antagonista capaz de

unirse a un receptor con dominio Vps10p, que comprende las etapas de: a) proporcionar un receptor sortilina, y b) proporcionar ApoB como agonista, c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y d) proporcionar un ensayo para medir la unión de dicho agonista a dicho receptor, y e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar al ensayo, y f) determinar la cantidad de agonista unido al receptor con dominio Vps10p, y g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va

a ensayar,

sortilina, comprendiendo dicho ensayo, e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar c) al cultivo celular a), en presencia de

dicho agonista b), y

f) determinar i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través de dicho receptor sortilina, y

g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va a ensayar, h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista i) capaz de unirse a dicho receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de dicho receptor sortilina, y/o

iii) capaz de inhibir la internalización de dicho agonista de dicho receptor sortilina. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista en la actividad de un receptor sortilina en un cultivo celular que expresa dicho receptor y con un cultivo celular que carece de expresión de dicho receptor, comprendiendo el método las etapas de:

i) comparar la cantidad de antagonista determinada en la etapa g) usando a) con la cantidad determinada en g) usando b) y la cantidad determinada en g) usando c), j) en donde la diferencia en las cantidades identifica un antagonista i) capaz de unirse a un receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de un receptor sortilina, y/o

iii) capaz de inhibir la internalización de ApoB como agonista de dicho receptor sortilina. En una realización adicional, el agonista como se ha definido antes en la presente memoria, se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 6 (proNGF), SEQ ID NO. 7 (proBDNF), SEQ ID NO. 8 (proNT3), SEQ ID NO. 9 (proNT4/5), SEQ ID NO. 14 (ApoE) o SEQ ID NO. 15 (LpL), o un fragmento o variante de los mismos.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista en la actividad de un receptor sortilina en un mamífero no humano que expresa dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) administrar dicho antagonista a un mamífero no humano que expresa el receptor de forma natural, b) determinar i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o 28

ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o

iii) el grado de señalización a través de dicho receptor sortilina, y c) comparar la medición de la etapa b) con una medición obtenida en ausencia del compuesto que se va a ensayar, d) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica el efecto de dicho antagonista en dicho mamífero no

humano que expresa el receptor de forma natural. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista en la actividad de un receptor sortilina en un mamífero no humano que expresa dicho receptor con un

segundo mamífero no humano que carece de expresión de dicho receptor y un tercer mamífero no humano que expresa en exceso dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de: a) proporcionar un mamífero no humano que expresa dicho receptor sortilina, y b) proporcionar un mamífero no humano que no expresa dicho receptor sortilina, y c) proporcionar un mamífero no humano que expresa en exceso dicho receptor sortilina, y d) proporcionar ApoB como agonista de dicho receptor sortilina, y e) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y f) administrar dicha biblioteca de antagonistas a dicho mamífero no humano de a), b) y c) respectivamente, y g) determinar

b) y c), y

Descripción detallada de los dibujos Figura 1: Familia de receptores con dominio Vps10p. Se indica su organización estructural. Figura 2a. Metabolismo de colesterol y triglicéridos. Los quilomicrones (CM) transportan los triglicéridos de la dieta a

tejidos donde son eliminados por acción de la lipoproteína lipasa (LpL). La apolipoproteína C2 (C2) activa la LpL. Las partículas remanentes resultantes (CMR) son eliminadas por el hígado. Se unen a receptores remanentes que reconocen la apo E (E) y son internalizadas y catabolizadas. Las apolipoproteínas A (A) y B48 (B48) son sintetizadas en células intestinales, mientras que la apoE es adquirida de partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL) junto con el colesterol. Cuando los triglicéridos son retirados de los quilomicrones, la apoA, apo C, colesterol y fosfolípidos son liberados de sus superficies y transferidos a las HDL donde el colesterol es esterificado. El éster de colesterilo es vuelto a transferir a la partícula remanente en un intercambio por triglicéridos por la proteína de transporte de éster de colesterilo.

Figura 2b. Metabolismo de colesterol y triglicéridos. Las partículas de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) son sintetizadas en el hígado y transportan triglicéridos endógenos desde el hígado a otros tejidos donde son eliminados por acción de la lipoproteína lipasa (LpL). Al mismo tiempo, el colesterol, fosfolípidos y apo C (C2) y apo E (E) son liberados y transferidos a partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL). Mediante este proceso las VLDL son convertidas en IDL (no se muestra). Algunas IDL son eliminadas por el hígado, pero la mayoría tienen más eliminación de triglicéridos por la lipasa hepática, y así se convierten en partículas de lipoproteína de baja densidad (LDL) (no se muestra). Por lo tanto, las partículas VLDL ricas en triglicéridos son precursores de las LDL, que comprenden principalmente colesterol (ésteres de colesterilo) y apo B100. Las LDL finalmente son eliminadas de la circulación por receptores de LDL presentes en el hígado y también en tejidos periféricos.

Figura 3: Niveles de colesterol plasmático en ratones con inactivación génica de sortilina. Los niveles de colesterol se midieron en ratones genéticamente intactos (LDLRxSort; +/+,+/+), ratones que carecían de expresión de sortilina (LDLRxSort; +/+,-/-), ratones desprovistos de receptor de lipoproteína de baja densidad LDLR (LDLRxSort; -/-,+/+), y ratones con doble inactivación génica que carecían de expresión de ambos receptores (LDLRxSort; -/-,-/-). Los animales se alimentaron con una dieta de tipo occidental rica en lípidos durante 4-6 semanas, se dejaron en ayunas durante la noche y se analizó el colesterol en las muestras de plasma. Los ratones con inactivación génica de la sortilina presentan una reducción significativa mayor del colesterol plasmático comparado con las crías de la misma camada de control (genéticamente intactos) (p=0,06). En los ratones deficientes en el receptor de LDL, un modelo de ratón de hipercolesterolemia familiar, los niveles elevados de colesterol disminuyeron en ausencia de sortilina (LDLRxSort; -/-, -/-) (p=0,02).

Figura 4: Niveles plasmáticos de triglicéridos en ratones con inactivación génica de sortilina. Se midieron los triglicéridos en ratones genéticamente intactos (LDLRxSort; +/+,+/+), ratones que carecían de expresión de sortilina (LDLRxSort; +/+,-/-), ratones desprovistos de receptor de lipoproteína de baja densidad LDLR (LDLRxSort; -/-,+/+), y ratones con doble inactivación génica que carecían de expresión de ambos receptores (LDLRxSort; -/-,-/-). Los animales se alimentaron con una dieta de tipo occidental rica en lípidos durante 4-6 semanas, se dejaron en ayunas durante la noche y se analizó el colesterol en las muestras de plasma. Los ratones con inactivación génica de la sortilina presentaban un aumento moderado de los triglicéridos plasmáticos comparado con crías de la misma camada de control (genéticamente intactos). En los ratones con doble inactivación génica de receptor LDL y sortilina (LDLRxSort; -/-, -/-), los niveles de triglicéridos eran considerablemente elevados comparado con los ratones que carecían solo de LDLR.

Figura 5a: Perfil de lipoproteínas -colesterol (izquierda) y triglicéridos (derecha). Perfiles de FPLC de lipoproteínas plasmáticas de ratón, de ratones genéticamente intactos (LDLRxSort; +/+,+/+), ratones que carecían de expresión de sortilina (LDLRxSort; +/+,-/-), ratones desprovistos de receptor de lipoproteína de baja densidad LDLR (LDLRxSort; -/-,+/+), y ratones con doble inactivación génica que carecían de expresión de ambos receptores (LDLRxSort; -/-,-/-). Los ratones con los genotipos indicados, se alimentaron con una dieta de tipo occidental rica en lípidos durante 4-6 semanas, y se recogieron muestras de plasma de cada animal y se sometieron a filtración en gel en FPLC. Posteriormente se midió el contenido de colesterol y triglicéridos en cada fracción. Se indica el tiempo de retención de las diferentes partículas de lipoproteínas.

Figura 5b: Caracterización de la unión de ApoB a sortilina humana recombinante (30). Se inmovilizó sortilina en un Sensor Chip CM5 de BIAcore con una densidad de 0,078 pmol/mm2. A) Después de calibración del valor inicial en el tampón de desarrollo (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, CaCI2 1,5 mM, P20 al 0,005%, pH 7,4), se aplicó al chip IgG de conejo anti-sortilina 10 μg/ml (12) o tampón de desarrollo solo. En t = 700 s, las unidades de respuesta obtenidas en presencia de la IgG anti-sortilina se ajustaron de forma arbitraria a 100 y se aplicó ApoB 50 nM a la celda de flujo preincubada con anticuerpo o solo con tampón. La asociación de la unión de Apo se midió hasta 1200 segundos, después de lo cual el soluto se cambió a tampón para permitir la disociación. B) Datos extraídos del panel A. La unión de la ApoB en t = 1200 segundos a la celda de flujo después de preincubación con tampón de desarrollo solo (= máxima unión de ApB) se ajustó a 100 unidades de respuesta relativas. Cuando se preincubó con el anticuerpo anti-sortilina inhibidor, no se observó unión de ApoB. C) Análisis por resonancia de plasmón de superficie de la unión de ApoB (10, 20, 50 nM) a la sortilina inmovilizada. Se registraron las velocidades de asociación y disociación, y el valor de Kd era 0,4 nM para la unión a la sortilina en el experimento presentado.

Figura 6: Transcurso de tiempo para el aumento de los niveles de colesterol y perfil de FPLC en ratones que expresan en exceso la sortilina. Datos normalizados al 100% el día 0 (t=0). Hay un aumento del colesterol plasmático selectivamente en ratones que recibieron adenovirus con sortilina (marcador circular) y no en ratones que recibieron adenovirus con LacZ (marcador cuadrado). A la derecha hay un FPLC del plasma. Los ratones se sometieron a dieta de tipo occidental desde el día -14 al día 14 (28 días).

Figura 7: Transferencia Western de apoproteínas en ratones que expresan la sortilina en exceso. Se tomaron muestras de plasma 14 días después de inyección de adenovirus con sortilina o con LacZ (inyección en la vena de la cola), y posteriormente se llevó a cabo la inmunotransferencia de AopB y ApoE. Hay una concentración mayor de ApoB100 y, en menor medida, una concentración mayor de ApoE en ratones que recibieron adenovirus con sortilina comparado con el adenovirus con ApoE. Los ratones se sometieron a dieta de tipo occidental desde el día -14 al día 14 (28 días).

Figura 8: Niveles de colesterol y triglicéridos en ratones con doble inactivación génica de SorLA/ApoE. Se midieron los lípidos (colesterol y triglicéridos en ratones genéticamente intactos (ApoExSorLa; +/+,+/+), ratones que carecían de expresión de SorLA (ApoExSorLa; +/+,-/-), ratones que desprovistos de apolipoproteína E (ApoExSorLa; -/-,+/+), y ratones con doble inactivación génica que carecían de expresión de ambas proteínas (ApoExSorLa; -/-,-/-). Los ratones mancho se alimentaron con una dieta de tipo occidental rica en lípidos durante 4-6 semanas, se dejaron en ayunas durante la noche y se analizaron el colesterol y los triglicéridos en las muestras de plasma. Los ratones con inactivación génica de SortLA presentan un aumento significativo del colesterol plasmático comparado con las crías de la misma camada de control (genéticamente intactos) (p<0,05). En los ratones deficientes en apoE, los niveles de colesterol y triglicéridos disminuyeron en ausencia de SorLA (ApoExSorLa; -/-, -/-) (p=0,001).

Figura 9: Perfiles de apolipoproteína y lipoproteínas en ratones con doble inactivación génica SorLA/ApoE. Panel A) Los sueros de ratones transgénicos con los genotipos indicados, alimentados con una dieta de tipo occidental, se aplicaron a SDS-PAGE reductora seguido de transferencia Western, usando anticuerpos contra ApoA1, ApoB y ApoE. Panel B) Perfiles de lipoproteínas -colesterol. Perfiles de FPLC de lipoproteínas plasmáticas de ratón, de ratones genéticamente intactos (ApoExSorLa; +/+,+/+), ratones que carecían de expresión de SorLA (ApoExSorLa; +/+,-/-), ratones que desprovistos de apolipoproteína E (ApoExSorLa; -/-,+/+), y ratones con doble inactivación génica que carecían de expresión de ambas proteínas (ApoExSorLa; -/-,-/-). Los ratones con los genotipos indicados se alimentaron con una dieta de tipo occidental durante 4-6 semanas, y se recogieron las muestras de plasma de cada animal y se sometieron a filtración en gel en FPLC. Posteriormente se midió el contenido de colesterol en cada fracción. Se indican los tiempos de retención de las diferentes partículas de lipoproteínas.

Figura 10: Competición de péptidos con Tyr-Ile-Leu (YIL) marcado en el extremo C con GST. Se midió la unión a la sSortilina inmovilizada por resonancia de plasmón de superficie. El 100% corresponde a las unidades de respuesta medida obtenidas para GST-YIL 100 nM en ausencia de péptido competidor. Los valores de CE50 son la concentración de péptido a la que la unión de GST-YIL se reduce a 50%. Se dan las secuencias para los péptidos y para los péptidos que contienen aminoácidos no naturales, también se muestra la estructura.

Resumen de las secuencias

SEC ID NO. 1: Sortilina

SEC ID NO. 2: SorLA

SEC ID NO. 3: SorCS1

SEC ID NO. 4: SorCS2

SEC ID NO. 5: SorCS3

SEC ID NO. 6: pre-pro-NGF

SEC ID NO. 7: pre-pro-BDNF

SEC ID NO. 8: Neurotrofina-3

SEC ID NO. 9: Neurotrofina-4/5

SEC ID NO. 10: Neurotensina (1-13)

SEQ ID NO 11: PYIL (extremo C de neurotensina)

SEQ ID NO 12: NT69L

SEQ ID NO 13: Péptido asociado a receptor (RAP)

SEQ ID NO 14: Apolipoproteína E (ApoE)

SEQ ID NO 15: Lipoproteína lipasa (LpL)

Ejemplos

Ejemplo 1: Determinación de la concentración plasmática de colesterol y lipoproteínas que contienen colesterol

Ratones de 8-12 semanas de edad se alimentaron durante 4-6 semanas con una dieta de tipo occidental, y después se llevaron a cabo las mediciones y determinación del colesterol y partículas de lipoproteínas. Se usaron las siguientes cepas: ratones genéticamente intactos y ratones que carecían de expresión de sortilina (Jansen et al., Nat. Neurosci. (2007) 10:1449-), ratones deficientes en el receptor de LDL (LDLR) (Ishibashi et al. (1993) J. Clin. Invest. 92:883-), ratones con inactivación génica de SorLA (Andersen et al., PNAS (2005) 102:13461-) y ratones con expresión alterada de la ApoE (Zhang et al., Science (1992) 258:468-). Los ratones se entrecruzaron para generar una línea que carecía de expresión de sortilina y LDLR y una línea desprovista tanto de ApoE como de SorLA. Se tomaron muestras de sangre por la mañana después de 12 h de ayuno, por sangrado retroorbital de los animales anestesiados con éter. La sangre se transfirió a tubos recubiertos de heparina sobre hielo. Después de centrifugación a 5400 rpm (3000 g) durante 15 min a 4ºC, se determinó el colesterol total usando un kit de “Cholesterol CHOD-PAP" de Roche/Hitachi. Brevemente, el colesterol se midió mezclando las muestras con reactivos CHOD-PAP para el colesterol. Después de incubación, se midió la densidad óptica (D.O.) a 492 nm. Se hizo una curva de calibración de una referencia de colesterol en el mismo experimento. La figura 3 representa niveles menores de colesterol en ratones con inactivación génica de sortilina, comparado con las crías de la misma camada de control. Además, los ratones con doble inactivación génica de sortilina/LDLR están protegidos frente al aumento de los niveles de colesterol observados en los ratones con inactivación génica de LDLR. En cambio, los ratones que carecían de SorLA tienen niveles mayores de colesterol plasmático y la deficiencia tanto de SorLA como

de ApoE produce niveles mayores de colesterol que la deficiencia de solo ApoE (figura 8).

Se llevaron a cabo mediciones de los perfiles de lipoproteínas por análisis de FPLC usando un aparato ÄKTA. Las lipoproteínas se separaron en una columna SuperoseTM 6 PC3.2/30 con un AKTATMpurifier10 usando el método de tiempo-Superose6 en el programa Unicorn 5.11 (GE Healthcare). Brevemente, se diluyó el plasma a <5 mmol/l de colesterol antes de inyección. Se inyectaron 50 µl de la muestra diluida en la columna. El análisis se llevó a cabo en las muestras recién preparadas. Posteriormente se midió el colesterol en las fracciones (véase antes). La figura 5a muestra dicho experimento. Es evidente que los ratones tipo sortilina-/-se caracterizan por niveles reducidos de LDL comparado con los ratones de control. Igualmente los ratones que carecen tanto de sortilina como de LDLR tienen menores concentraciones de LDL comparado con ratones que carecen solo de la expresión de LDLR. Hay que destacar que los ratones con doble inactivación génica de SorLA/ApoE se caracterizan por concentraciones de VLDL notablemente superiores que las observadas para ratones que carecen solo de la expresión de ApoE-/-(fig. 9A y B). Los datos demuestran que la sortilina y SorLA son capaces de modificar los niveles de colesterol y las concentraciones in vivo de LDL (para la sortilina) y de VLDL (para SorLA).

Ejemplo 2: Determinación de la concentración plasmática de triglicéridos y lipoproteínas que contienen triglicéridos

Ratones de 8-12 semanas de edad se alimentaron durante 4-6 semanas con una dieta de tipo occidental, y se usaron las mediciones de colesterol y determinación de partículas de lipoproteínas. Se usaron las siguientes cepas: ratones genéticamente intactos, ratones que carecían de expresión de sortilina (Jansen et al., (2007) Nat. Neurosci. 10:1449-,), ratones deficientes en el receptor de LDL (LDLR) (Ishibashi et al. (1993) J. Clin. Invest. 92 :883-), ratones con inactivación génica de SorLA (Andersen et al., PNAS (2005) 102:13461-) y ratones con expresión alterada de la ApoE (Zhang et al., Science (1992) 258:468-). Los ratones se entrecruzaron para generar una línea que carecía de expresión de sortilina y LDLR y una línea desprovista tanto de ApoE como de SorLA. Se tomaron muestras de sangre por la mañana después de 12 h de ayuno, por sangrado retroorbital de los animales anestesiados con éter. La sangre se transfirió a tubos recubiertos de heparina sobre hielo. Después de centrifugación a 5400 rpm (3000 g) durante 15 min a 4ºC, se determinaron los triglicéridos usando un kit disponible en el comercio “Triglycerides GPO-PAP" (Roche/Hitachi). Los triglicéridos totales se determinaron mezclando las muestras con reactivos GPO-PAP para triglicéridos de Roche/Hitachi. Después de incubación, se midió la D.O. a 492 nm.

Se hizo una curva de calibración de una referencia de glicerol en el mismo experimento. La figura 4 muestra niveles de triglicéridos ligeramente aumentados en ratones LDLR-/-cuando se compararon con las crías de la misma camada de control. Igualmente, los ratones desprovistos tanto de ApoE como de SorLA se caracterizan por niveles mayores de triglicéridos que los animales que carecen solo de ApoE, en cambio los ratones que carecen de SorLa tienen mayores niveles de colesterol plasmático y la deficiencia tanto de SorLA como de ApoE produce mayores niveles de colesterol que la deficiencia de ApoE solo (figura 8). Se llevaron a cabo mediciones de las lipoproteínas con triglicéridos usando FPLC en un aparato ÄKTA. Las lipoproteínas se separaron en una columna SuperoseTM 6 PC3.2/30 con un ÄKTA purifier10 usando el método de tiempo-Superose6 en el programa Unicorn 5.11 (GE Healthcare). Brevemente, se diluyó el plasma a <5 mmol/l de colesterol antes de inyección. Se inyectaron 50 µl de la muestra diluida en la columna. El análisis se llevó a cabo en las muestras recién preparadas. Posteriormente se midieron los triglicéridos en las fracciones (véase antes). La figura 5a muestra dicho experimento.

Ejemplo 3: Evaluación del efecto del exceso de expresión de sortilina usando vectores adenovíricos

Ratones de 8 semanas de edad se alimentaron durante 4 semanas (de día -14 a día 14) con una dieta de tipo occidental, después de los cual se hicieron las mediciones y determinación del colesterol (y triglicéridos y ALAT) y partículas de lipoproteínas (día 0, 7 y 14). Se usaron ratones genéticamente intactos. Se tomaron muestras de sangre por la mañana después de 12 h de ayuno, por sangrado retroorbital de los animales anestesiados con éter. La sangre se transfirió a tubos recubiertos de heparina sobre hielo. Después de centrifugación a 5400 rpm (3000 g) durante 15 min a 4ºC, se determinó el colesterol total usando un kit de “Cholesterol CHOD-PAP" de Roche/Hitachi. El día 0, se inyectó a los ratones en la vena de la cola un vector adenovírico con sortilina o LacZ. Las mediciones del colesterol se hicieron el día 7 y 14, para evaluar el efecto de la proteína. En la figura 6 se ilustra el efecto. Los ratones con exceso de expresión de sortilina presentan un aumento notable del colesterol comparado con el día 0. Este aumento no se vio en ratones que recibieron LacZ. Se aplicó la transferencia Western a los hígados para verificar la cantidad aumentada de sortilina, y se llevó a cabo la tinción para LacZ para comprobar los ratones que recibieron el vector vírico con LacZ. Una transferencia Western de las apoproteínas B y E (figura 7) muestra un notable aumento de ApoB100 en ratones que recibieron el adenovirus con sortilina.

Ejemplo 4: Método de cribado in vitro para identificar antagonistas y ligandos del receptor con dominio Vps10p

La determinación de la unión directa del ligando a proteína inmovilizada se puede llevar a cabo por análisis de resonancia de plasmón de superficie (Biacore, Suecia) usando CaHBS como tampón de desarrollo convencional (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2 mM, EGTA 1 mM, y Tween-20 al 0,005%). Un chip biosensor de Biacore (CMS, nº de cat. BR-1000-14) se activa usando el método de NHS/EDC tal como lo describe el proveedor, seguido de revestimiento con un receptor que pertenece a la familia de receptores con dominio Vps10p. Se pueden aplicar varias metodologías diferentes: Los antagonistas del receptor candidatos se pueden identificar comparando la señal de unión (unidades de respuesta) a un chip inmovilizado con uno de los receptores y comparando esta

señal con una celda de flujo vacía. En otra metodología, la inhibición de un ligando establecido se puede seguir en ausencia o presencia de inhibidores putativos. La diferencia en la señal representa el potencial inhibidor del antagonista. Los datos recogidos se analizaron mediante el ajuste de sensogramas para las estimaciones de afinidad y potencial inhibidor utilizando el programa Biaevaluation versión 3.1.

Se evaluaron las propiedades de unión de ApoB a la sortilina (figura 5b). A) Después de calibración de los valores iniciales en tampón de desarrollo (Hepes 10 mM, NaCI 150 mM, EGTA 1 mM, CaCI21,5 mM, P20 al 0,005%, pH 7,4), se aplicó al chip IgG de conejo anti-sortilina 10 μg/ml (Nykjaer et al., Nature (2004) 427:843-848) o tampón de desarrollo solo. En t = 700 s, las unidades de respuesta obtenidas en presencia de la IgG anti-sortilina se ajustaron de forma arbitraria a 100 y se aplicó ApoB 50 nM a la celda de flujo preincubada con anticuerpo o solo con tampón. La asociación de la unión de ApoB se midió hasta 1200 segundos, después de lo cual el soluto se cambió a tampón para permitir la disociación. B) Datos extraídos del panel A. La unión de la ApoB en t = 1200 segundos a la celda de flujo después de preincubación con tampón de desarrollo solo (= máxima unión de ApoB) se ajustó a 100 unidades de respuesta relativas. Cuando se preincubó con el anticuerpo anti-sortilina inhibidor, no se observó unión de ApoB. C) Análisis por resonancia de plasmón de superficie de la unión de ApoB (10, 20, 50 nM) a la sortilina inmovilizada. Se registraron las velocidades de asociación y disociación, y el valor de Kd era 0,4 nM para la unión a la sortilina en el experimento presentado. Por lo tanto, la ApoB se puede unir a la sortilina con alta afinidad, y está unión se puede inhibir con anticuerpos o neurotensina (NT).

El ensayo de resonancia de plasmón de superficie puede ser fácilmente transformado en otros ensayos en los que el receptor con dominio Vps10p, el ligando o el inhibidor putativo se inmoviliza sobre una fase sólida. Por ejemplo, los receptores se pueden inmovilizar, por ejemplo en pocillos de microvaloración Maxisorp de Nunc (nº de cat. 439454) mediante incubación durante 16 horas a 4°C en NaHCO3 50 mM, pH 9,6. Después del bloqueo usando albúmina de suero bovino al 5% (Sigma, nº de cat. A9647) durante 2 horas a temperatura ambiente, los pocillos se lavan tres veces con tampón MB (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl2 2 mM, y MgCI2 1 mM) antes de la incubación con un ligando marcado (por ejemplo, yodado) en ausencia o presencia de varias concentraciones de un inhibidor candidato. Después de la incubación (por ejemplo, durante la noche a 4ºC) y lavado con tampón MB, la radiactividad unida es liberada añadiendo SDS al 10%. Se determina la unión no específica de trazador a pocillos recubiertos sólo con albúmina de suero bovino y se resta de los valores determinados en los experimentos de unión. El punto de medición de la unión se puede ajustar a ecuaciones de unión usando el software Prism de GraphPad, versión 4. Del mismo modo, el antagonista se puede marcar y medir directamente la unión al receptor inmovilizado. En otra configuración más, el receptor, ligando o antagonista se pueden inmovilizar sobre perlas de centelleo y medir la unión en un ensayo de centelleo por proximidad en el que la molécula de unión al receptor se ha marcado usando radiactividad.

Ejemplo 5: Un método de cribado basado en células para identificar antagonistas de receptores con dominio Vps10p

La determinación de la unión, internalización o señalización por miembros de la familia de receptores con dominio Vps10p, se puede llevar a cabo en sistemas celulares. Células que expresan uno de los receptores, sea de forma endógena o después, p. ej., de transfección con un plásmido que contiene el ADNc del receptor, se incuban con un ligando radiomarcado, en ausencia y presencia respectivamente, de un compuesto inhibidor/antagonista candidato. Después de incubación, las células se lavan para separar la unión no específica y posteriormente se recogen. El grado de unión del inhibidor/antagonista candidato al receptor se determina usando un ensayo de radioligando convencional conocido para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bylund y Toews (1993) Am. J. Physiol. 265 (5 Pt1):L421-9 titulado "Radioligand binding methods: practical guide and tips". Igualmente, la endocitosis/internalización se pueden determinar como describen Nykjaer et al. (1992) FEBS 300:13-y Nielsen et al. (2001) EMBO J., 20:2180-.

Ejemplo 6: Un método de cribado in vivo para identificar antagonistas de receptores con dominio Vps10p

La identificación de antagonistas candidatos capaces de inhibir la unión y/o internalización y/o señalización de un receptor con dominio Vps10p, se lleva a cabo en ratones genéticamente intactos u otros animales adecuados para este fin. Los animales se alimentan con una dieta de tipo occidental rica en lípidos durante un periodo de 4-6 semanas, durante cuyo periodo se administran a dicho animal antagonistas candidatos potencialmente capaces de inhibir la unión a, internalización por, y señalización a través de un receptor con dominio Vps10p (seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 1 a 5). Los animales de control se alimentan con una comida normal de una dieta de tipo occidental rica en lípidos durante un periodo de 4-6 semanas en ausencia de compuestos antagonistas candidatos. Al final del periodo, los animales se dejan en ayunas una noche y se toman muestras de plasma y se analiza el nivel de colesterol en los dos grupos de animales. La diferencia entre el grupo al que se ha administrado el antagonista candidato y el grupo de control indican el grado de inhibición.

Ejemplo 7: Un método de cribado in vivo para identificar antagonistas de receptores con dominio Vps10p

La identificación de antagonistas candidatos capaces de inhibir la unión y/o internalización y/o señalización de un receptor con dominio Vps10p, se lleva a cabo en ratones genéticamente intactos u otros animales adecuados para este fin. Los animales se alimentan con una dieta de tipo occidental rica en lípidos durante un periodo de 4-6 semanas, durante cuyo periodo se administran a dicho animal antagonistas candidatos radiomarcados

potencialmente capaces de inhibir la unión a, internalización por, y señalización a través de un receptor con dominio Vps10p. Los animales de control se alimentan con una dieta de tipo occidental rica en lípidos durante un periodo de 4-6 semanas en ausencia de dichos compuestos antagonistas candidatos radiomarcados. Al final del periodo, los animales se dejan en ayunas una noche y se sacrifican, después de lo cual se diseccionan tejidos representativos y

5 se determina la cantidad de ligando radiomarcado unido y/o acumulado usando un ensayo de centelleo convencional.

Ejemplo 8: Una evaluación in vivo de la potencia del antagonista del receptor con dominio Vps10p

Un paciente hipercolesterolémico se trata con un tratamiento convencional (p. ej., una estatina) o régimen dietético, de modo que se determina el nivel de colesterol en el suero. Posteriormente, el paciente sustituye su tratamiento con

10 estatina durante 1 mes por el antagonista del receptor con dominio Vps10p durante hasta 4-6 semanas con una preparación de acuerdo con la presente invención, de modo que se determina de nuevo el nivel de colesterol y se compara con el nivel obtenido con o sin el tratamiento convencional (p. ej., una estatina) o régimen dietético.

Ejemplo 9: Método de tratamiento

Se diagnostica a un hombre de 55 años de edad una hiperlipidemia grave. El médico a cargo decide que el paciente

15 recibirá antagonistas del receptor con dominio Vps10p para reducir los niveles de lípidos plasmáticos anómalos. Se administra una inyección de bolo subcutáneo o intravenosa de un compuesto de esta invención. La dosis está en el intervalo de 0,5 mg/kg a 50 mg/kg. En el hospital se controlan continuamente los niveles plasmáticos de lípidos así como el estado general del paciente, hasta que se obtiene un nivel plasmático de lípidos estable normal. Se prescribe al paciente inyección o un equivalente disponible por vía oral del compuesto de la invención inyectado en

20 el hospital. La dosis oral está en el intervalo de 0,5 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal.

Ejemplo 10: Método de tratamiento

Se diagnostica a un hombre de 55 años de edad hipercolesterolemia durante un periodo más largo. La intervención convencional no ha reducido suficientemente el colesterol plasmático. Una medición de la sortilina en el hígado muestra niveles altos. Se decide en el departamento reducir la concentración de sortilina en el hígado usando un

25 ARNip dirigido al hígado. En el hospital, se controlan continuamente los niveles de lípidos plasmáticos así como el estado general del paciente hasta que se obtiene un nivel plasmático de lípidos estable normal. Se prescribe al paciente inyección o un equivalente disponible por vía oral del compuesto de la invención inyectado en el hospital.

Referencias

LISTA DE SECUENCIAS

<110> NeuronIcon ApS

<120> Modulación de los receptores con dominio Vps10p para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular 5

<130> P1895PC00

<160> 15

10 <170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 831

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> SEÑAL

<222>: (1)..(33) 20 <223> Péptido señal de sortilina

<220>

<221> PROPEP

<222>: (34)..(77) 25 <223> Propéptido de sortilina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222>: (78)..(755) 30 <223> Parte extracelular de sortilina (ssortilin)

<220>

<221> TRANSMEM

<222>: (756)..(778) 35 <223> Parte de la sortilina que atraviesa la membrana

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222>: (779)..(831) 40 <223> Dominio intracelular (citoplasmático) de sortilina

<400> 1

<210> 2

<211> 2214 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: SEÑAL 10 <222> (1)..(28)

<223> Péptido señal de SorLA

<220>

<221>: PROPEP 15 <222> (29)..(81)

<223> Propéptido de SorLA

<400> 2

<210> 3

<211> 1168

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 907

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 4

<210> 6

<211> 241 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: SEÑAL 10 <222> (1)..(18)

<223> Péptido señal de NGF

<220>

<221>: PROPEP 15 <222> (19)..(121)

<223> Propéptido de NGF (NGFpro)

<220>

<221>: CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA 20 <222> (19)..(241)

<223> proNGF

<220>

<221>: CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA 25 <222> (122)..(241)

<223> NGF maduro

<400> 6 <210> 7

<211> 246 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221>: SEÑAL 10 <222> (1)..(18)

<223> Péptido señal de BDNF

<220>

<221>: PROPEP 15 <222> (19)..(127)

<223> Propéptido de BDNF (BDNFpro)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (19)..(246)

<223> proBDNF

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (128)..(246)

<223> Péptido maduro de BDNF

<400> 7

<210> 8 15 <211> 257

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>: 20 <221> SEÑAL

<222> (1)..(16)

<223> Péptido señal de NT3

<220>: 5 <221> PROPEP

<222> (17)..(140)

<223> Propéptido de NT3 (NT3pro)

<220>: 10 <221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (17)..(257)

<223> proNT3

<220>: 15 <221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (141)..(257)

<223> Péptido maduro de NT3

<400> 8

<210> 9

<211> 210

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)..(24)

<223> Péptido señal de NT4/5

<220>

<221> PROPEP

<222> (25)..(80)

<223> Propéptido de NT4/5

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (25)..(210)

<223> proNT4/5

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (81)..(210)

<223> Péptido maduro de NT4/5

<400> 9

<210> 10

<211> 13 5 <212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA 10 <222> (1)..(13)

<223> Neurotensina

<400> 10

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo Sapiens 20

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (1)..(4)

<223> Cuatro aminoácidos C-terminales de Neurotensina 66

<400> 11

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido generado sintéticamente

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> xaa = N-metil-Arg

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (1)..(6)

<223> NT69L

<220>

<221> VARIANTE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L-neo-Trp

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5)..(5)

<223> xaa = tert-Leu

<400> 12

<210> 13

<211> 357

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (1)..(357)

<223> RAP

<400> 13

<210> 14

<211> 475 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA 10 <222> (1)..(475)

<223> LPL

<400> 14

<210> 15

<211> 317 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA 10 <222> (1)..(317)

<223> Apo E

<400> 15

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Un método in vitro para cribar un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, capaz de unirse a un receptor sortilina, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un receptor sortilina, y b) proporcionar ApoB como agonista, c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y d) proporcionar un ensayo para medir la unión de dicho agonista a dicho receptor, y e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar al ensayo, y f) determinar la cantidad de agonista unido a dicho receptor, y g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va

a ensayar,

h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista que altera la unión de dicho agonista a dicho receptor. 2.-Un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista, seleccionado de proteínas, péptidos,

polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, en la actividad de un receptor sortilina en un cultivo celular que expresa dicho receptor, en donde dicho receptor sortilina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 60% con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un cultivo celular que expresa dicho receptor sortilina, y b) proporcionar ApoB como agonista de dicho receptor sortilina, y c) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y d) proporcionar un ensayo para determinar la unión a, internalización de y señalización a través de, dicho receptor

sortilina, comprendiendo dicho ensayo,

e) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar c) al cultivo celular a), en presencia de dicho agonista b), y f) determinar

i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través de dicho receptor sortilina, y

g) comparar la cantidad determinada en la etapa f) con una cantidad medida en ausencia del antagonista que se va a ensayar, h) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica un antagonista i) capaz de unirse a dicho receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de dicho receptor sortilina, y/o

iii) capaz de inhibir la internalización de dicho agonista de dicho receptor sortilina. 3.-Un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, en la actividad de un receptor sortilina en un cultivo celular que expresa dicho receptor y con un cultivo celular que carece de expresión de dicho receptor, comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar un cultivo celular que expresa un receptor sortilina, y b) proporcionar un cultivo celular que no expresa un receptor sortilina, y c) opcionalmente proporcionar un cultivo celular que expresa en exceso un receptor sortilina d) proporcionar ApoB como agonista del receptor sortilina, y e) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y f) proporcionar un primer ensayo que comprende a) y un segundo ensayo que comprende b) y opcionalmente un

tercer ensayo que comprende c), y g) añadir la biblioteca de potenciales antagonistas que se van a ensayar a los tres ensayos, y h) determinar

i) la cantidad de antagonista unido al receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por el receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través del receptor sortilina, y

i) comparar la cantidad de antagonista determinada en la etapa g) usando a) con la cantidad determinada en g) usando b) y la cantidad determinada en g) usando c), j) en donde la diferencia en las cantidades identifica un antagonista i) capaz de unirse a un receptor sortilina, y/o ii) capaz de inhibir la señalización a través de un receptor sortilina, y/o

iii) capaz de inhibir la internalización de ApoB como agonista de dicho receptor sortilina. 4.-Un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, en la actividad de un receptor sortilina en un mamífero no humano que expresa dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) administrar dicho antagonista a un mamífero no humano que expresa el receptor de forma natural,

b) determinar i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o iii) el grado de señalización a través de dicho receptor sortilina, y

c) comparar la medición de la etapa b) con una medición obtenida en ausencia del compuesto que se va a ensayar,

d) en donde la diferencia en las dos cantidades identifica el efecto de dicho antagonista en dicho mamífero no humano que expresa el receptor de forma natural. 5.-Un método para determinar el grado de inhibición de un antagonista seleccionado de proteínas, péptidos,

polipéptidos, anticuerpos, ARN de sentido contrario, ADN de sentido contrario, moléculas orgánicas pequeñas o ARNip, en la actividad de un receptor sortilina en un mamífero no humano que expresa dicho receptor con un segundo mamífero no humano que carece de expresión de dicho receptor y un tercer mamífero no humano que expresa en exceso dicho receptor, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un mamífero no humano que expresa dicho receptor sortilina, y b) proporcionar un mamífero no humano que no expresa dicho receptor sortilina, y c) proporcionar un mamífero no humano que expresa en exceso dicho receptor sortilina, y d) proporcionar ApoB como agonista de dicho receptor sortilina, y e) proporcionar una biblioteca de potenciales antagonistas, y f) administrar dicha biblioteca de antagonistas a dicho mamífero no humano de a), b) y c) respectivamente, y g) determinar

i) la cantidad de antagonista unido a dicho receptor sortilina, y/o ii) la cantidad de antagonista internalizado por dicho receptor sortilina, y/o

iii) el grado de señalización a través del receptor sortilina, en cada uno de los mamíferos no humanos en a),

b) y c), y h) comparar la cantidad de antagonista determinada en la etapa g) usando a) con la cantidad determinada en g) usando b) y la cantidad determinada en g) usando c),

5 i) en donde la diferencia en las cantidades identifica un antagonista

i) capaz de unirse a dicho receptor sortilina, y/o

ii) capaz de inhibir la señalización a través de dicho receptor sortilina, y/o

iii) capaz de inhibir la internalización de dicho agonista de ApoB de dicho receptor sortilina.
6.-El método según las reivindicaciones 1-5, en donde dicho antagonista es un anticuerpo seleccionado del grupo 10 que consiste en: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de una

cadena, anticuerpos recombinantes. 7.-El método según las reivindicaciones 1-6, en donde dicho antagonista es un anticuerpo dirigido contra la parte extracelular de la sortilina.