JPH07285992A

JPH07285992A - 新規ペプチド

Info

Publication number: JPH07285992A
Application number: JP6159104A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Yoshikawa; 正明吉川; Ryuzo Sasaki; 隆造佐々木; Hideo Chiba; 英雄千葉
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1994-02-25
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1995-10-31

Abstract

(57)【要約】【構成】 Arg-Gly-Asp-Leu または Arg-Gly-Asp-Leu-G
lu-Arg、及びこれらのペプチドを有効成分とする血小板
凝集抑制剤または癌転移抑制剤。【効果】これらのペプチドは血小板凝集阻害活性を有
しており、その性質を利用して動脈硬化、血栓性疾患等
の予防及び治療をする医薬として用いられる。また、癌
転移を抑制する性質を有しており、癌転移抑制剤として
も用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はArg-Gly-Asp-Leu 及びAr
g-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg のアミノ酸配列を有する新規ペ
プチドに関する。また、本発明は、このようなペプチド
を有効成分とする血小板凝集抑制剤、及び癌転移抑制剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、血小板凝集のメカニズムについて
の研究が盛んに行われている。血小板凝集は血小板と細
胞外マトリックスの接着であり、この接着因子の１つと
して粘着性蛋白質であるフィブロネクチン、ビトロネク
チン、フィブリノーゲン等が関与しており、血小板膜上
に存在する主要糖蛋白インテグリンＧＰIIｂ／IIIaに対
し粘着性蛋白質が結合及び血小板相互の架橋をすること
により、活性化された血小板が凝集する。このＧＰIIｂ
／IIIaに対する粘着性蛋白質の結合はＲＧＤ配列(Arg-G
ly-Asp) 依存性であり、ＲＧＤペプチドは細胞外マトリ
ックス上のレセプターで認識され、血小板凝集及び粘着
性蛋白質の血小板への結合が抑制されることが知られて
いる。これより、ＲＧＤペプチドを血液中に投与すると
Ｂ16−Ｆ10メラノーマの転移が抑制される(Science, vo
l.233, pp.467-470, 1986)という報告や、ＲＧＤ配列を
有する種々の鎖状及び環状のオリゴペプチドを用いて血
小板凝集を阻害する方法（高分子学会予稿集、38巻、31
49頁、1989年) 、ＲＧＤ配列を有する合成オリゴペプチ
ド或いはその繰り返し構造を有するポリペプチドを用い
て、癌転移を抑制する方法(Int. J. Biol. Macromol.,
vol.11, No.1, pp23〜25, 1989及び同誌 vol.11, No.4,
pp226〜232, 1989)等が報告されている。しかし、これ
らのペプチドは必ずしも満足の行く作用を有するもので
はなく、特に血小板凝集阻害活性については活性の高い
ものでは無かった。このため、ＲＧＤ配列を含み、しか
も血小板凝集抑制活性の高いペプチドが望まれていた。

【０００３】このような状況に鑑み、本発明者らは食品
中に含まれる生理活性物質、特に我々日本人の主食であ
る米中に含まれる生理活性物質に注目し研究する過程に
おいて、米蛋白質の加水分解物中にＲＧＤ配列を含む血
小板凝集阻害活性の高い全く新規なペプチドを見出し
た。さらに、このペプチドの薬理作用を検討したとこ
ろ、メラノーマの転移抑制作用があることを見出して、
本発明を完成するに至った。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、米蛋白質加水分解物中から見出された、強い血小板
凝集阻害活性を有する新規ペプチドを提供することにあ
る。また、本発明の課題は、このペプチドと化学構造が
類似し、同様の生理活性のあるペプチドを提供すること
にある。さらに、本発明の設題は、このようなペプチド
を有効成分とする血小板凝集抑制剤及び癌転移抑制剤を
提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
ように米蛋白質の加水分解物中に強い血小板凝集阻害活
性を有するペプチドがあることを見出してこのペプチド
を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。この結果、次
のアミノ酸配列を有するペプチドを得た。 Arg-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg そして、さらにこのペプチドと化学構造が類似し、同様
に強い血小板凝集阻害活性を有するペプチドを探索した
ところ、次のアミノ酸配列を有するペプチドを得た。 Arg-Gly-Asp-Leu すなわち本発明は、次のアミノ酸配列を有するペプチド
にある。 Arg-Gly-Asp-Leu Arg-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg これらのペプチドは新規なペプチドであり、強い血小板
凝集阻害活性を示す。さらに、これらのペプチドの薬理
作用を検討したところ、癌細胞の転移を強く抑制するこ
とを見出した。このことから、本発明のペプチドは、動
脈硬化、血栓症、癌転移、その他の疾患を治療あるいは
予防するのに有用である。従って、本発明は、これらの
ペプチドを有効成分とする血小板凝集抑制剤、あるいは
癌転移抑制剤に関する。

【０００６】本発明のペプチドは、米粉に食塩水を加え
透析して得られた可溶性蛋白質をトリプシン処理し、高
速液体クロマトグラフで分画を行うことができる。又、
市販のペプチドシンセサイザーを用いることにより容易
に合成が可能である。例えば、合成装置としてＳａｍ
Ｔｗｏペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）を
用いてペプチドの合成を行う。即ち、樹脂に活性基を保
護したアミノ酸を吸着させ、これにデブロッキング液を
注入して保護基を除去し、活性基を保護したアミノ酸を
注入し、両者を反応させ、ジペプチドを合成する。この
操作を繰り返すことにより、目的とする配列を有するペ
プチドを合成する。ペプチドの担体としての樹脂からの
脱離と保護基の除去は、１０％アニソールを含む無水フ
ッ化水素中で０℃の温度条件下に１時間攪拌することに
より行う。フッ化水素を留去した後樹脂をエーテルで洗
浄し、３０％酢酸により抽出し、凍結乾燥により粗ペプ
チドが得られる。この粗ペプチドを０．１％トリフルオ
ロ酢酸に溶解した後、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）カ
ラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ₁₈）を接続した高速液体
クロマトグラフにより、０．１％のトリフルオロ酢酸を
含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製す
る。目的とするペプチドは、特有の溶出位置を示す。

【０００７】このようにして得られたペプチドのアミノ
酸配列はプロテインシーケンサーによる配列分析、アミ
ノ酸分析計によるアミノ酸分析により特定できる。

【０００８】本発明ペプチドは血小板凝集阻害活性及び
癌細胞転移阻害活性を有し、具体的にはヒト及び動物に
対して動脈硬化、各種血栓性疾患、脳梗塞発作、基礎疾
患によるＤＩＣ、及び悪性腫瘍の転移の予防及び悪性腫
瘍の治療剤、又は生化学試薬として利用可能である。

【０００９】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。しかしこれらは単に例示するのみであり、
本発明はこれらにより限定されるものではない。

【実施例１】加水分解による本発明ペプチドの製造方法ニホンバレ種の米をミキサーにて粉砕し、得られた米粉
末を７倍量の１Ｍ食塩水にて抽出し、その遠心上清を
０．１Ｍ食塩水に対して透析し可溶性蛋白質を得た。こ
の蛋白質をｐＨ７．６に調整した後、蛋白質の１／１０
０に相当するトリプシンを加え３７℃にて５時間の消化
を行い、沸騰水上にて１０分間加熱し酵素を失活させ、
トリプシン消化物とした。３０ｍｇのトリプシン消化物
をオクタデシルシランカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ
₁₈−ＡＲ、２０φ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）
を装着した高速液体クロマトグラフ（Ｍ６００、ミリポ
ア社製）にて、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセト
ニトリルの直線的濃度勾配（０〜３０％／３０分、１０
ｍｌ／分）により分画した。アセトニトリル濃度約１６
％で溶出された活性画分をフェネチルシリカカラム（Ｄ
ｅｖｅｌｏｓｉｌＰＨ−Ａ−Ｔ−５、４．６φ×２５
０ｍｍ、野村科学社製）にて０．１％トリフルオロ酢酸
を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０−３０％／
３０分、１ｍｌ／分）により分画した。アセトニトリル
濃度約１５％で溶出された活性画分をプロテインシーケ
ンサー（４７７Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）
にて解析したところ、Arg-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg の６残
基からなるペプチドと確認した。

【００１０】

【実施例２】Arg-Gly-Asp-Leu(RGDL) の合成ＳａｍＴｗｏペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
社製）により、同装置の標準プロトコールに従って合成
した。即ち、１ｇ当たり０．５ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−
Ｌｅｕを結合したアシルオキシメチル樹脂２ｇをペプチ
ド合成装置の反応容器にセットし、４５ｖ／ｖ％トリフ
ルオロ酢酸、２．５ｖ／ｖ％アニソール、５２．５ｖ／
ｖ％ジクロロメタンを含むデブロッキング液と２０分間
接触させｔ−Ｂｏｃ基を除いた。ジクロロメタンによる
洗浄の後、１０ｖ／ｖ％ジイソプロピルエチルアミンを
含むジクロロメタンにて樹脂中和し、ジクロロメタンに
より洗浄した。その後６．７ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−Ａ
ｓｐ（ＯＢｚｌ）及び６．７ｍｍｏｌのジイソプロピル
カルボジイミド（それぞれ理論当量の６．７倍）を含む
３４ｍｌのジクロロメタン、ジメチルフォルムアミド混
合液中で２時間室温にて反応せしめた。ジメチルフォル
ムアミド及びジクロロメタンにて順次洗浄した。この樹
脂を上記と同様にデブロッキングを行い、以下同様にＣ
末端側からｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、ｔ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ）を順次結合せしめ、ｔ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔ
ｏｓ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−樹脂を
得た。この樹脂を１０％アニソールを含む無水フッ化水
素中で０℃１時間反応させた後、フッ化水素の留去及び
エーテルによる洗浄を行った。得られたペプチド及び樹
脂の混合物から３０％酢酸にてペプチドを抽出し凍結乾
燥によって約４００ｍｇの粗ペプチドを得た。粗ペプチ
ドを０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した後、オクタデ
シルシラン（ＯＤＳ）カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ
₁₈−ＡＲ、２０φ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）
を接続した高速液体クロマトグラフ（Ｍ６００型、日本
ウォータース社製）により、０．１％のトリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０〜２５％
／２５分、１０ｍｌ／分）にて展開した。目的とするペ
プチドはアセトニトリル濃度約１８％にて溶出された。
得られた物質がArg-Gly-Asp-Leu であることは、アミノ
酸分析（Ａｓｐ：Ｇｌｙ：Ｌｅｕ：Ａｒｇ＝１．００：
１．００：０．９６：０．９５）及びプロテインシーケ
ンサー（４７７Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）
により確認された。

【００１１】

【実施例３】Arg-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg(RGDLER) の合成ＳａｍＴｗｏペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
社製）により、同装置の標準プロトコールに従って合成
した。即ち、１ｇ当たり０．５ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）を結合したアシルオキシメチル樹脂２
ｇをペプチド合成装置の反応容器にセットし、４５ｖ／
ｖ％トリフルオロ酢酸、２．５ｖ／ｖ％アニソール、５
２．５ｖ／ｖ％ジクロロメタンを含むデブロッキング液
と２０分間接触させｔ−Ｂｏｃ基を除いた。ジクロロメ
タンによる洗浄の後、１０ｖ／ｖ％ジイソプロピルエチ
ルアミンを含むジクロロメタンにて樹脂中和し、ジクロ
ロメタンにより洗浄した。その後６．７ｍｍｏｌのｔ−
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）及び６．７ｍｍｏｌのジイ
ソプロピルカルボジイミド（それぞれ理論当量の６．７
倍）を含む３４ｍｌのジクロロメタン、ジメチルフォル
ムアミド混合液中で２時間室温にて反応せしめた。ジメ
チルフォルムアミド及びジクロロメタンにて順次洗浄し
た。この樹脂を上記と同様にデブロッキングを行い、以
下同様にＣ末端側からｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、ｔ−Ｂｏｃ
−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）を順次結合せしめ、ｔ−Ｂｏｃ−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−樹脂を得
た。この樹脂を１０％アニソールを含む無水フッ化水素
中で０℃１時間反応させた後、フッ化水素の留去及びエ
ーテルによる洗浄を行った。得られたペプチド及び樹脂
の混合物から３０％酢酸にてペプチドを抽出し凍結乾燥
によって約８００ｍｇの粗ペプチドを得た。粗ペプチド
を０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した後、オクタデシ
ルシラン（ＯＤＳ）カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ₁₈
−ＡＲ、２０φ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を
接続した高速液体クロマトグラフ（Ｍ６００型、日本ウ
ォータース社製）により、０．１％のトリフルオロ酢酸
を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０〜２５％／
２５分、１０ｍｌ／分）にて展開した。目的とするペプ
チドはアセトニトリル濃度約１７％にて溶出された。得
られた物質がArg-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg であることは、
アミノ酸分析（Ａｓｐ：Ｇｌｕ：Ｇｌｙ：Ｌｅｕ：Ａｒ
ｇ＝１．００：０．９８：１．００：０．９６：１．９
５）及びプロテインシーケンサー（４７７Ａ、アプライ
ドバイオシステムズ社製）により確認された。

【００１２】

【試験例１】血小板凝集阻害能の測定ヘパリン採血したヒト末梢血を１１００ｒｐｍにて７分
間遠心し、上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）として回収す
る。血小板凝集計（ヘマトレーサー６０１型、二光バイ
オサイエンス社製）を用いて３７℃において比濁法によ
って凝集阻害能を測定した。２００μｌのＰＲＰに種々
の濃度のペプチドを加えた後、最終濃度４００μＭとな
るようにＡＤＰを添加して凝集反応を開始し、経時的に
濁度を測定した。濁度が一定になる点をもって凝集反応
の終点とし、凝集を５０％阻害するのに必要なペプチド
の濃度ＥＣ₅₀を求めた。結果を表１に示す。

【００１３】

【表１】ヒト血小板に対する凝集阻害活性 ─────────────────────────────────── ペプチドＥＣ₅₀ ─────────────────────────────────── Arg-Gly-Asp-Leu ７０ Arg-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg １５６ Arg-Gly-Asp-Ser （フィブロネクチン由来）１０３ ───────────────────────────────────

【００１４】

【試験例２】悪性腫瘍転移抑制試験Ｐｏｓｔｅらの方法（Cancer Res. , 40, 1636−44（19
80))を改変した方法により実験を行った。即ち、ＣＯ₂
インキュベーターを用いて１０％ウシ胎児血清及び０．
３ｇ／ｍｌＬ−グルタミンを含むイーグル最小必要培地
に３７℃で培養したＢ１６−ＢＬ６メラノーマ細胞株
（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ６３２２）をリン酸緩衝化生理的食
塩水（ＰＢＳ（−））で洗浄し、１ｍＭのＥＤＴＡを含
むＰＢＳ（−）で細胞を剥離させた。この細胞懸濁液か
ら細胞を室温で１０００ｒｐｍ、５分間で遠心沈降さ
せ、１０％ウシ胎児血清及び０．３ｇ／ｍｌＬ−グルタ
ミンを含むイーグル最小必要培地で洗浄し、０．０５％
ウシ血清アルブミンを含む無血清イーグル最小必要培地
で５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製し
た。

【００１５】投与量のＲＤＧＳ、ＲＧＤＬあるいはＲＧ
ＤＬＥＲをそれぞれイーグル培地に溶解させ、５×１０
⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＢ１６−ＢＬ６メラノーマととも
に非麻酔下で６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウスの尾静
脈内に２００μｌ投与したものを投与群とし、又、被検
試料を含まない溶液を５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＢ
１６−ＢＬ６メラノーマとともに２００μｌ投与したも
のを対照群とした。投与２週間後にこれらのマウスを解
剖し、肺を１０％ホルムアルデヒドで固定し、肺の表面
のメラノーマ転移巣の数を肉眼で計数した。

【００１６】この結果を図１に示した。図１に示すよう
に、３００μｇのＲＧＤＬ及びＲＧＤＬＥＲの投与によ
りＢ１６−ＢＬ６メラノーマの肺転移巣の数が有意に減
少した。さらに、１０００μｇのＲＧＤＬ及びＲＧＤＬ
ＥＲの投与でより強い転移抑制効果をもたらした。この
ことから、ＲＧＤＬ及びＲＧＤＬＥＲは、強い癌転移抑
制活性を有することが判明した。

【００１７】本発明のペプチドはヒト及び動物に対し、
医薬組成物として経口的及び非経口的に安全に投与され
る。好適な投与量は、症状、性別、年令によって多少相
違するが、通常は血小板凝集抑制においても、あるいは
癌転移抑制においても、一日約１０〜１０００ｍｇを１
日１回ないし数回に分けて経口あるいは非経口的に投与
することが好ましい。製剤として、例えば注射剤、錠
剤、散剤、顆粒剤及びカプセル剤等が挙げられる。これ
らの製剤は公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理
学的に許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤及び
着色剤等と共に医薬組成物として投与される。これらの
製剤に用いる担体や賦形剤として例えば乳糖、ブドウ糖
等の糖類、デンプン類、炭酸カルシウム等の無機物、カ
ンゾウ末等の植物及び結晶セルロース等が用いられる。
賦形剤として例えばデンプン糊液、アラビアゴム、トラ
ガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルエーテル、ヒドロキシプロピルセルロー
ス（ＨＰＣ）、メチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロース（ＣＭＣ）、エチルセルロース及び結晶セルロ
ース等、崩壊剤として例えばデンプン、寒天、ゼラチン
末、ＣＭＣ−Ｎａ、ＣＭＣ−Ｃａ、結晶セルロース、炭
酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウム等、滑沢剤として
例えばステアリン酸マグネシウム及びタルク等、着色剤
として例えば医薬品に添加することが許容されている周
知着色料を、各々適宜用いることができる。錠剤、顆粒
剤及びカプセル剤は矯味及び除放化製剤として、糖類、
ヒドロキシメチルセルロースフタレート及び酢酸フタル
酸セルロース等適当なコーティング物質を用いてコーテ
ィングしても良い。又、注射剤を調製する場合には、主
薬の必要に応じ適当なｐＨ調整剤、緩衝剤、安定剤、可
溶化剤等を用いて、常法により各注射剤とする。次に本
発明の製剤の実施例を示す。

【００１８】

【実施例４】（１）錠剤の製造本発明ペプチド２ｇ馬鈴薯デンプン６ｇステアリン酸タルク２ｇ乳糖１９０ｇ ────────────────────── 合計２００ｇ各成分を混合し、本発明ペプチド５ｍｇを含む５００ｍ
ｇの錠剤４００個を製造した。

【００１９】（２）顆粒剤の製造本発明ペプチド１０ｇブドウ糖５０ｇ乳糖１３６ｇタルク４ｇ ────────────────────── 合計２００ｇ各成分を混合した後、圧縮成形、粉砕、整粒して２０〜
５０メッシュの５％顆粒剤を製造した。

【００２０】（３）カプセル剤の製造本発明ペプチド５ｇ乳糖４０ｇトウモロコシデンプン５０ｇ結晶セルロース３ｇタルク２ｇ ────────────────────── 合計１００ｇ各成分を良く混和し、１号カプセルに充填し、１００個
製造した。

【００２１】（４）注射剤の製造本発明ペプチド１ｇ生理食塩水１００ｍｌ ────────────────────── 合計１ｇ／１００ｍｌ本発明ペプチドを生理食塩水に溶解した後滅菌し、１ｗ
／ｖ％の注射剤を製造した。

【００２２】

【発明の効果】本発明により、血小板凝集阻害活性を有
するペプチドが提供される。本発明のペプチドはその血
小板凝集阻害活性を利用して動脈硬化、血栓性疾患等の
予防及び治療剤（血小板凝集抑制剤）あるいは、メラノ
ーマ細胞の転移を抑制する性質を利用して癌転移抑制
剤、あるいは生化学試薬として利用可能である。

【００２３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００２４】配列番号：２配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例２による悪性腫瘍転移抑制試験結果を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｚ 8318−4Ｈ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次のアミノ酸配列を示すペプチド。 Arg-Gly-Asp-Leu
【請求項２】次のアミノ酸配列を示すペプチド。 Arg-Gly-Asp-Leu-Glu-Arg
【請求項３】請求項１または請求項２記載のペプチド
を有効成分とする血小板凝集抑制剤。
【請求項４】請求項１または請求項２記載のペプチド
を有効成分とする癌転移抑制剤。