RS57347B1

RS57347B1 - Analozi glukagona koji ispoljavaju aktivnost gip receptora

Info

Publication number: RS57347B1
Application number: RS20180728A
Authority: RS
Inventors: Richard D Dimarchi; David L Smiley; Konrad H Bleicher; Eric A Kitas
Original assignee: Univ Indiana Res & Tech Corp; Novo Nordisk As
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2018-08-31
Also published as: IL236386A0; HRP20180936T1; US20150368310A1; WO2013192130A1; KR20150039748A; AU2013277372B2; EA029025B1; CA2877127A1; JP6300239B2; TWI644920B; TW201402603A; BR112014031671A2; DK2864350T3; PT2864350T; CR20150015A; CN104583233B; AR091478A1; MX356000B; MY185217A; IL236386B

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

[0001] Prema najnovijim podacima iz National Diabetes Fact Sheet of the American Diabetes Association, 23.6 miliona dece i odraslih u SAD su pogođeni dijabetesom. Svake godine, 1.6 miliona novih slučajeva dijabetesa je dijagnostifikovano kod ljudi starosti 20 godina ili starijih. Prema studiji koja je nedavno objavljena u Journal of the American Medical Association, preko dve trećine odraslih u SAD imaju prekomernu težinu ili su gojazni (Flegal et al., JAMA 303(3): 235-241 (2010)) i preko jedne trećine ove populacije je gojazno.

[0002] Hormoni inkretini, glukagonu-sličan peptid-1 (GLP-1) i insulinotropni peptid zavisan od glukoze (GIP) su prirodni peptidni hormoni. Oba, GLP-1 i GIP stimulišu sintezu i izlučivanje insulina na način zavisan od glukoze i ne proizvode hiperglikemiju (videti, npr., Nauck et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:912-917 (1993) i Irwin et al., Regul. Pept.

153:70-76 (2009)).

[0003] Pokazano je da je GLP-1 efikasan kao dopunska terapija za dijabetes i povezan je sa gubitkom telesne težine. Ono što ostaje nejasno oko GIP-ciljane terapije je, međutim, to da li će se postići uspešan tretman dijabetesa i gojaznosti preko antagonizacije efekata ovog hormona (npr., preko antagonizma GIP receptora) ili preko imitiranja ili pojačavanja efekata GIP.

REZIME

[0004] Predmetni pronalazak se odnosi na peptid kao što je definisan u setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na dimer, multimer, konjugat ili farmaceutsku kompoziciju kao što su definisani u setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak dalje se odnosi na peptid, dimer, multimer ili konjugat kao što je definisan u setu patentnih zahteva za upotrebu u smanjenju dobitka telesne težine ili indukciji gubitka telesne težine kod subjekta kod koga postoji potreba za tim; ili za upotrebu u lečenju dijabetesa.

[0005] Ovde su obezbeđeni peptidi koji su peptidi agonisti GIP razmatrani za upotrebu u lečenju subjekata kod kojih postoji potreba za tim, npr. sa dijabetesom i gojaznošću.

[0006] Nativni glukagon ne aktivira GIP receptor, i normalno ima oko 1% od aktivnosti nativnog GLP-1 na GLP-1 receptoru. U nekim primerima izvođenja, peptidi su analozi glukagona koji sadrže strukturu na bazi aminokiselinske sekvence nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1), ali se razlikuju na jednom ili više položaja u poređenju sa SEQ ID NO: 1, pri čemu razlike, ili modifikacije, pojačavaju agonističku aktivnost analoga na GIP receptoru. Takvi analozi glukagona će imati agonističku aktivnost na GIP receptoru veću od one od nativnog glukagona i, u nekim aspektima, veću od one od nativnog GIP. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, agonist GIP ima procenat potencije GIP od najmanje 0.1%. U nekim ili bilo kojim aspektima predmetnih otkrića, analog glukagona dodatno ispoljava agonističku aktivnost na jednom ili oba od receptora za glukagon receptor i GLP-1 receptora. Prema tome, ovde su obezbeđeni agonisti GIP, koagonisti GIP-GLP-1, koagonisti GIP-glukagona i triagonisti GIP-GLP-1-glukagona.

[0007] U ilustrativnim primerima izvođenja, selektivnost peptida agonista GIP prema predmetnom pronalasku za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora je manja od 100-puta. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid agonist GIP ima procenat potencije GIP unutar 20-puta ili 10-puta različit (viši ili niži) od procenta potencije glukagona i/ili procenta potencije GLP-1.

[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje analog glukagona (SEQ ID NO: 1), koji sadrži

(A) na položaju 1 aminokiselinu koja sadrži bočni lanac od Tyr, His, Tio Ala, ili Phe, pri čemu je alfa ugljenik aminokiseline na položaju 1, vezan za strukturu izabranu iz grupe koja se sastoji od:

(i) H2N-(CH2)-(ii) H2N-(iii) H(acetil)N-(CH2)0-1-; i

(iv) H- ili CH3-(B) aminokiselinu koja sadrži acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 16, 20 ili 37-43, izborno pri čemu ne-nativna acil ili alkil grupa je vezana za takvu aminokiselinu preko spejsera;

(C) aminokiselinu koja stabilizuje alfa spiralu na jednom ili više od položaja 16-21, u

(D) do deset (npr., do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9) dodatnih aminokiselinskih modifikacija u odnosu na SEQ ID NO: 1, pri čemu, aminokiselina na položaju 1 je L-stereoizomer ili D-stereoizomer, pri čemu, izborno, aminokiselina na položaju 1 se razlikuje od L-His i L-Tyr, pri čemu, kada analog glukagona nema hidrofilnu grupu, analog glukagona ispoljava EC50na humanom GIP receptoru od manje od ili oko 0.5 nM, i pri čemu analog glukagona ima manju od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.

[0009] U prijavi, sva pozivanja na određeni aminokiselinski položaj preko broja (npr.,položaj 28) označavaju aminokiselinu na tom položaju u nativnom glukagonu (SEQ ID NO: 1) ili odgovarajući aminokiselinski položaj u bilo kom njegovom analogu. Na primer, pozivanje ovde na "položaj 28" bi označavalo odgovarajući položaj 27 za analog glukagona u kome je prva aminokiselina od SEQ ID NO: 1 deletirana. Slično, pozivanje ovde na "položaj 28" bi označavalo odgovarajući položaj 29 za analog glukagona u kome je jedna aminokiselina adirana pre N-terminusa od SEQ ID NO: 1.

[0010] U nekim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP sadrže aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-139, 141-155, 157-173, 175-194 i 196-200. U nekim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP sadrže strukturu na bazi ishodne sekvence koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-139, 141-155, 157-173, 175-194 i 196-200, ali koja se razlikuje od ishodne sekvence na jednom ili više položaja, kao što je dalje ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP sadrže aminokiselinu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 156, 174 i 195. U nekim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP sadrže strukturu na bazi ishodne sekvence koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 156, 174 i 195, ali koja se razlikuje od ishodne sekvence na jednom ili više položaja, kao što su ovde dalje opisane. U nekim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 201 ili 202. U nekim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP sadrže strukturu na bazi ishodne sekvence koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 201 i 202, ali se razlikuje od ishodne sekvence na jednom ili više položaja, kao što je dalje opisano ovde. U ilustrativnim aspektima gore navedenih peptida na bazi ishodne sekvence, aminokiselinske modifikacije se javljaju na položaju osim položaja 1.

[0011] Pronalazak shodno tome obezbeđuje peptid koji sadrži, uglavnom se sastoji od ili se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 11. Takođe je obezbeđen peptid koji sadrži, uglavnom se sastoji od ili se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 12. Pronalazak dalje obezbeđuje peptid koji sadrži, uglavnom se sastoji od ili se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 13. Pored toga, obezbeđen je peptid koji sadrži, uglavnom se sastoji od ili se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 15. Takođe je obezbeđen peptid koji sadrži, uglavnom se sastoji od ili se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 16. Pronalazak dodatno daje peptid koji sadrži, uglavnom se sastoji od ili se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 22. Pronalazak dalje obezbeđuje peptid koji sadrži:

a. sekvencu od SEQ ID NO: 11 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 11;

b. sekvencu od SEQ ID NO: 12 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 12,

c. sekvencu od SEQ ID NO: 13 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 13,

d. sekvencu od SEQ ID NO: 15 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 15,

e. sekvencu od SEQ ID NO: 16 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 16,

f. sekvencu od SEQ ID NO: 15 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 22,

pri čemu peptid ispoljava agonističku aktivnost na humanom GIP receptoru i humanom GLP-1 receptoru i peptid ima manje od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora. U ilustrativnim aspektima peptida koji sadrže bilo koju od sekvenci od SEQ ID NOs: 11-13, 15, 16 i 22 sa do 3 (npr., 1, 2, 3) aminokiselinske modifikacije, aminokiselinske modifikacije se javljaju na položaju osim položaja 1.

[0012] Pronalazak daje peptid koji sadrži

(a) sekvencu od X1X2X3GTFTSDX10SKYLX15X16X17X18X19X20X21FVQWLX27X28X29X30PSSGX35PPPS (SEQ ID NO: 35)

gde:

X1je izabran iz grupe koja se sastoji od: Acetil L-His, Acetil L-Tyr, Acetil L-Tio Ala, Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Tio Ala, Acetil beta-2-L-His, Acetil beta-2-L-Tyr, Acetil beta-2-L-Tio Ala, Acetil beta-2-D-His, Acetil beta-2-D-Tyr, Acetil beta-2-D-Tio Ala, Dezamino L-His, Dezamino L-Tyr, Dezamino L-TioAla, Dezamino D-His, Dezamino D-Tyr, Dezamino D-TioAla, Dezamino beta-2-L-His, Dezamino beta-2-L-Tyr, Dezamino beta-2-L-TioAla, Dezamino beta-2-D-His, Dezamino beta-2-D-Tyr, Dezamino beta-2-D-TioAla, D-His, D-Tyr, D-TioAla, Beta-2-D-His, Beta-2-D-Ala, Beta-2-D-TioAla, Beta-2-L-His, Beta-2-L-Tyr, Beta-2-L-TioAla i L-tioAla;

X2je Ala, Gly, Pro, sarkozin, Ser i Val,

X3je Gln, aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture I, II ili III, hidrofobna aminokiselina, kisela aminokiselina ili bazna aminokiselina, ili je aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od: Glu, Ala, Leu, Ile, Nle, Val, NorVal, homoserina, Met, metionin sulfoskida, metionin sulfona, acetil-Orn, acetil-diaminobuterne kiseline i acetil-Lys; pri čemu, struktura I, II i III su:

Struktura III

pri čemu R<1>je C0-3alkil ili C0-3heteroalkil; R<2>je NHR<4>ili C1-3alkil;

R<3>je C1-3alkil; R<4>je H ili C1-3alkil; X je NH, O ili S; i Y je NHR<4>, SR<3>ili OR<3>.

X10je Tyr ili aminokiselina kovalentno vezana za C12do C18acil ili alkil grupu;

X15je kisela aminokiselina, izborno, Glu ili Asp;

X16je bilo koja aminokiselina, izborno, bilo koja aminokiselina osim Gly, Pro i Ser; npr., Glu, Ala, alfa, alfa-disupstituisana aminokiselina (npr., AIB), His, Lys

X17je Arg, His, Gln;

X18je Arg ili Ala;

X19je Ala ili alpha, alfa disupstituisana aminokiselina;

X20je izabran iz grupe koja se sastoji od: alfa, alfa-disupstituisane aminokiseline (npr., AIB) ili Gln ili His, Lys ili Ala;

X21je kisela aminokiselina, izborno, Asp ili Glu;

X27je Leu, Ala, Nle ili Met;

X28je Ala ili kisela aminokiselina (izborno, Asp ili Glu);

X29je alifatičan, npr., Ala ili Gly ili AIB ili Val;

X30je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala ili Gly

X35je Ala ili bazna aminokiselina (izborno, Arg ili Lys);

pri čemu, kada je X28je kisela aminokiselina, X35je bazna aminokiselina;

pri čemu, izborno, kada je X28Asp, tada X29nije Gly

pri čemu, kada je X10jednako Tyr, peptid sadrži na položaju 40 aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil ili alkil grupu, i, pri čemu, izborno, peptid sadrži Gly na položaju 41,

pri čemu C-terminalna aminokiselina peptida je amidovana;

ili

(b) sekvencu SEQ ID NO: 35 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 35,

pri čemu peptid ispoljava agonističku aktivnost na humanom GIP receptoru i humanom GLP-1 receptoru i/ili humanom receptoru za glukagon,

izborno, pri čemu analog glukagona ima manju od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.

[0013] Pronalazak obezbeđuje peptid koji sadrži

(a) sekvencu od X1X2X3GTFTSDX10SKYLX15X16X17X18X19X20X21FVQWLX27X28X29X30PSSGX35PPPS (SEQ ID NO: 140)

gde:

X1je izabrana iz grupe koja se sastoji od: Acetil L-His, Acetil L-Tyr, Acetil L-Tio Ala, Acetil L-Phe, Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Tio Ala, Acetil D-Phe, Acetil beta-2-L-His, Acetil beta-2-L-Tyr, Acetil beta-2-L-Tio Ala, Acetil beta-2-L-Phe, Acetil beta-2-D-His, Acetil beta-2-D-Tyr, Acetil beta-2-D-Tio Ala, Acetil beta-2-D-Phe, Dezamino L-His, Dezamino L-Tyr, Dezamino L-TioAla, Dezamino L-Phe, Dezamino D-His, Dezamino D-Tyr, Dezamino D-TioAla, Dezamino D-Phe, Dezamino beta-2-L-His, Dezamino beta-2-L-Tyr, Dezamino beta-2-L-TioAla, Dezamino beta-2-L-Phe, Dezamino beta-2-D-His, Dezamino beta-2-D-Tyr, Dezamino beta-2-D-TioAla, Dezamino beta-2-D-Phe,D-His, D-Tyr, D-TioAla, D-Phe, Beta-2-DHis, Beta-2-D-Ala, Beta-2-D-TioAla, Beta2-D-Phe, Beta-2-L-His, Beta-2-L-Tyr, Beta-2-L-TioAla, Beta-2-L-Phe, i L-tioAla;

X2je Ala, Gly, Pro, sarkozin, Ser i Val,

X3je Gln, aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture I, II, ili III, hidrofobna aminokiselina, kisela aminokiselina ili bazna aminokiselina, ili je aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od: Glu, Ala, Leu, Ile, Nle, Val, NorVal, homoserin, Met, metionin sulfoksid, metionin sulfon, acetil-Orn, acetil-diaminobuterna kiselina i acetil-Lys; pri čemu struktura I, II i III je:

Struktura III

pri čemu R<1>je C0-3alkil ili C0-3heteroalkil; R<2>je NHR<4>ili C1-3alkil; R<3>je C1-3alkil; R<4>je H ili C1-3alkil;

X je NH, O, ili S; i Y je NHR<4>, SR<3>, ili OR<3>;

X10je Tyr ili aminokiselina kovalentno vezana za C12do C18acil ili alkil grupu;

X15je kisela aminokiselina, izborno, Glu ili Asp;

X16je bilo koja aminokiselina, izborno, bilo koja aminokiselina osim Gly, Pro i Ser; npr., Glu, Ala, alfa, alfa disupstituisana aminokiselina (npr., AIB), His, Lys

X17je Arg, His, Gln;

X18je Arg ili Ala;

X19je Ala ili alfa, alfa disupstituisana aminokiselina;

X20je izabran iz grupe koja se sastoji od: alfa, alfa-disupstituisane aminokiseline (npr., AIB) ili Gln ili His, Lys, ili Ala;

X21je kisela aminokiselina, izborno, Asp ili Glu;

X27je Leu, Ala, Nle, ili Met;

X28je Ala ili kisela aminokiselina (izborno, Asp ili Glu);

X29je alifatična, npr., Ala ili Gly ili AIB ili Val ili Leu;

X30je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala ili Gly

X35je Ala ili bazna aminokiselina (izborno, Arg ili Lys);

pri čemu, kada je X28kisela aminokiselina, X35je bazna aminokiselina;

pri čemu, izborno, kada je X28jednaka Asp, tada X29nije Gly

pri čemu, kada je X10jednaka Tyr, peptid sadrži na položaju 40 aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil ili alkil grupu, i, pri čemu, izborno, peptid sadrž Gly na položaju 41, pri čemu C-terminalna aminokiselina peptida je amidovana;

ili

(b) sekvencu SEQ ID NO: 140 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 140, pri čemu peptid ispoljava agonističku aktivnost na humanom GIP receptoru i humanom GLP-1 receptoru i/ili humanom receptoru za glukagon, izborno, pri čemu analog glukagona ima manju od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.

[0014] U ilustrativnim aspektima peptida koji sadrže sekvencu od SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 140 sa do 3 (npr., 1, 2, 3) aminokiselinske modifikacije, aminokiselinske modifikacije se javljaju na položajima osim položaja 1.

[0015] Ovde su takođe obezbeđeni dimeri i multimeri koji sadrže dva ili ili više peptida agonista GIP prema predmetnom pronalasku. Konjugati koji sadrže peptid agonist GIP prema predmetnom pronalasku i grupu konjugata su dodatno ovde obezbeđeni. U nekim aspektima, konjugat je fuzioni polipeptid koji sadrži peptid agonist GIP prema predmetnom pronalasku fuzionisan sa heterolognim peptidom. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete koji sadrže peptide agoniste GIP, dimere, multimere ili konjugate predmetnih otkrića (ili njihovu kombinaciju).

[0016] Farmaceutske kompozicije sadrže bilo koji od peptida agonista GIP, dimera, multimera ili konjugata prema predmetnom pronalasku (ili njihovu kombinaciju) i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens su dalje ovde obezbeđene predmetnim pronalaskom. Farmaceutske kompozicije su poželjno sterilne i pogodne za parenteralnu primenu. Farmaceutske kompozicije su razmatrane za upotrebu u postupcima za lečenje ili prevenciju dijabetesa ili gojaznosti, ili medicinskih stanja povezanih sa dijabetesom ili gojaznošću. Prema tome, u ilustrativnim primerima izvođenja predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za redukciju dobitka telesne težine ili indukciju gubitka telesne težine, postupak za lečenje ili prevenciju dijabetesa ili gojaznosti, i postupak za indukciju privremene paralize intestinalnog trakta. Dodatne primene peptidnih analoga i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže obezbeđeni su u sledećem opisu.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0017]

Slika 1 predstavlja grafikon ukupne promene u telesnoj težini (%) kao što je mereno na dan 7 studije.

Slika 2 predstavlja grafikon ukupnog unosa hrane (kao što je mereno na dan 7) DIO miševa kojima je subkutano injektiran kontrolni nosač ili peptid kao što je prikazano.

Slika 3 predstavlja grafikon mase masti (kao što je merena na dane 0 i 7) DIO miševa kojima je subkutano injektiran kontrolni nosač ili peptid kao što je prikazano.

Slika 4 predstavlja grafikon promene u nivoima glukoze u krvi (mg/dL; nivoi dana 7 – nivoi dana 0) DIO miševa kojima je subkutano injektiran kontrolni nosač ili peptid kao što je prikazano.

Slika 5A-D predstavljaju aminokiselinske sekvence ilustrativnih analoga glukagona.

Slika 6 predstavlja grafikon profila glukoze u stanju sitosti dbdb miševa kojima je subkutano injektirano 10 nmol/kg peptida naznačene SEQ ID NO, kontrolnog nosača ili liraglutida.

DETALJAN OPIS

[0018] Predmetni pronalazak se odnosi na peptid kao što je definisan u setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na dimer, multimer, konjugat ili farmaceutsku kompoziciju kao što je definisan u setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid, dimer, multimer ili konjugat kao što je definisan u setu patentnih zahteva za upotrebu u redukciji dobitka telesne težine ili indukciji gubitka telesne težine kod subjekta kod koga postoji potreba za tim; ili za upotrebu u lečenju dijabetesa.

[0019] Predmetni pronalazak obezbeđuje peptide agoniste GIP (npr., analoge nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1) (takođe označeni kao "analozi glukagona"), analoge bilo koje od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-200) koji ispoljavaju agonističku aktivnost na GIP receptoru. Kao što je ovde korišćen, termin "peptid" obuhvata sekvencu od 2 ili više aminokiselina i tipično manje od 100, ili manje od 50 aminokiselina. Aminokiseline mogu biti prirodne ili kodirane ili takve da se ne jevaljaju u prirodi ili nekodirane. Aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi označavaju aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi in vivo, ali koje, ipak, mogu biti ugrađene u peptidne strukture koje su ovde opisane. "Nekodirana" kao što je ovde korišćena označavaju aminokiselinu koja nije L-izomer bilo koje od sledećih 20 aminokiselina: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr. Termin "peptid agonist GIP" označava jedinjenje koje se vezuje za i aktivira nishodni prenos signala GIP receptora. Pepetid agonist GIP može imati bilo koji od nivoa aktivnosti na GIP receptoru (npr., nivo apsolutne aktivnosti ili nivo relativne aktivnosti), selektivnost za GIP receptor, ili procenat potencije GIP, koji su ovde opisani. Videti, na primer, deo pod naslovom Aktivnost GIP receptora. Međutim, ovaj termin ne bi trebalo tumačiti da ograničava da jedinjenje ima aktivnost samo na GIP receptoru. Radije, peptidi agonisti GIP predmetnih otkrića mogu da ispoljavaju dodatne aktivnosti na drugim receptorima, kao što je dalje ovde razmatrano. Peptidi agonisti GIP, na primer, mogu da ispoljavaju agonističku aktivnost na GLP-1 receptoru i/ili receptoru za glukagon.

AKTIVNOST OVDE OPISANIH PEPTIDA

Aktivnost GIP receptora

[0020] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju EC50za aktivaciju GIP receptora koja je u nanomolarnom opsegu. U ilustrativnim primerima izvođenja, EC50peptida na GIP receptoru je manja od 1000 nM, manja od 900 nM, manja od 800 nM, manja od 700 nM, manja od 600 nM, manja od 500 nM, manja od 400 nM, manja od 300 nM, manja od 200 nM. U nekim primerima izvođenja, EC50peptida na GIP receptoru je oko 100 nM ili manja, npr., oko 75 nM ili manja, oko 50 nM ili manja, oko 25 nM ili manja, oko 10 nM ili manja, oko 5 nM ili manja, ili oko 1 nM ili manja. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića ispoljava EC50za aktivaciju GIP receptora koja je u pikomolarnom opsegu. U ilustrativnim primerima izvođenja, EC50peptida agonista GIP na GIP receptoru je manja od 1000 pM, manja od 900 pM, manja od 800 pM, manja od 700 pM, manja od 600 pM, manja od 500 pM, manja od 400 pM, manja od 300 pM, manja od 200 pM. U nekim primerima izvođenja, EC50peptida na GIP receptoru je oko 100 pM ili manje, npr., oko 75 pM ili manje, oko 50 pM ili manje, oko 25 pM ili manje, oko 10 pM ili manje, oko 5 pM ili manje, ili oko 1 pM ili manje. Termin "oko" kao što je ovde korišćen označava veće ili manje od vrednosti ili opsega vrednosti naznačen sa 10 procenata, ali nije određen da obuhvata bilo koju vrednost ili opseg vrednosti samo do ove šire definicije. Svaka vrednost ili opseg vrednosti pre koje stoji termin "oko" je takođe određena tako da obuhvata primer izvođenja naznačene apsolutne vrednosti ili opsega vrednosti.

[0021] Pogodni postupci za određivanje EC50peptida za aktivaciju receptora, npr., GIP receptora, su poznati u stanju tehnike. Jedna ilustrativna in vitro analiza, u kojoj je indukcija cAMP kao što je predstavljena preko aktivnosti luciferaze merena u HEK293 ćelijama koje prekomerno eksprimiraju GIP receptor, opisana je ovde u Primeru 3.

[0022] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju pojačanu aktivnost na GIP receptoru, u poređenju sa nativnim humanim glukagonom. Nativni glukagon (SEQ ID NO: 1) ne aktivira GIP receptor; nativni glukagon ispoljava uglavnom 0% (npr., manje od 0.001%, manje od 0.0001%) aktivnosti nativnog GIP na GIP receptoru. Relativna aktivnost peptida na GIP receptoru u odnosu na nativni glukagon je izračunata kao obrnuti odnos (EC50peptida predmetnih otkrića/EC50nativnog glukagona) x 100%.

[0023] Relativna aktivnost peptida na GIP receptoru u poređenju sa nativnim GIP je izračunata kao obrnuti odnos (EC50peptida predmetnih otkrića/EC50nativnog GIP) x 100% (vrednost je ovde takođe označena kao "procenat potencije GIP").

[0024] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja predmetnih otkrića, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju procenat potencije GIP koji je najmanje ili oko 0.1%. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi ispoljavaju najmanje ili oko 0.5%, najmanje ili oko 1%, najmanje ili oko 5%, najmanje ili oko 10%, najmanje ili oko 20%, najmanje ili oko 30%, najmanje ili oko 40%, najmanje ili oko 50%, najmanje ili oko 60%, najmanje ili oko 70%, najmanje ili oko 80%, najmanje ili oko 90%, ili najmanje ili oko 100% od aktivnosti nativnog GIP na GIP receptoru.

[0025] U nekim primerima izvođenja predmetnih otkrića, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju aktivnost na GIP receptoru koja je veća od one od nativnog GIP. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP ispoljava procenat potencije GIP od najmanje ili oko 125%, najmanje ili oko 150%, najmanje ili oko 175% najmanje ili oko 200%, najmanje ili oko 300%, najmanje ili oko 400%, najmanje ili oko 500%, najmanje ili oko 600%, najmanje ili oko 700%, najmanje ili oko 800%, najmanje ili oko 900%, ili najmanje ili oko 1000%. U nekim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP koji su ovde opisani ispoljavaju procenat potencije GIP od ne više od 1000% ili ne više od 10,000%.

[0026] U nekim aspektima, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju procenat potencije GIP unutar opsega od oko 0.001 do oko 10,000 procenata, ili oko 0.01 do oko 10,000 procenata, ili oko 0.1 do oko 10,000 procenata, ili oko 1 do oko 10,000 procenata, ili oko 0.001 do oko 5000 procenata, ili oko 0.01 do oko 5000 procenata, ili oko 0.1 do oko 5000 procenata, ili oko 0.1 do oko 1000 procenata.

Koagonisti

[0027] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića je koagonistički peptid utoliko što on aktivira GIP receptor i drugi receptor različit od GIP receptora.

Koagonisti GIP/GLP-1

[0028] Na primer, peptid predmetnih otkrića u nekim aspektima ispoljava aktivnost na oba, GIP receptoru i GLP-1 receptoru ("koagonisti GLP-1/GIP receptora"). U nekim aspektima, peptidi ispoljavaju aktivnost na GLP-1 i GIP receptorima, ali aktivnost glukagona je značajno smanjena ili ne postoji, npr., preko aminokiselinske modifikacije na položaju 3. Na primer, supstitucija na ovom položaju sa kiselom, baznom ili hidrofobnom aminokiselinom (glutaminskom kiselinom, ornitinom, norleucinom) smanjuje aktivnost glukagona. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid agonist GIP je peptid koji ispoljava oko 10% ili manje (npr., oko 5% ili manje, ili oko 1% ili manje, ili oko 0.1% ili manje) od aktivnosti nativnog glukagona na receptoru za glukagon.

[0029] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, EC50peptida predmetnih otkrića na GIP receptoru je unutar oko 50-puta ili manje, oko 40-puta ili manje, oko 30-puta ili manje, oko 20-puta ili manje, ili oko 10-puta ili manje, ili oko 5-puta ili manje različita (viša ili niža) od njegove EC50na GLP-1 receptoru. Na primer, EC50na GIP receptoru može biti 10-puta viša ili 10-puta niža od EC50na GLP-1 receptoru. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, procenat potencije GIP peptida predmetnih otkrića je manje od ili oko 50-, 40-, 30-, 20-, 10-, ili 5-puta različit (viši ili niži) od njegovog procenta potencije GLP-1.

[0030] Prema tome, peptid predmetnih otkrića ima manje od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora. Kao što je ovde korišćeno, termin "selektivnost" molekula za prvi receptor u odnosu na drugi receptor označava sledeći odnos: EC50molekula na drugom receptoru podeljena sa EC50molekula na prvom receptoru. Na primer, molekul koji ima EC50od 1 nM na prvom receptoru i EC50od 100 nM na drugom receptoru ima 100-puta selektivnost za prvi receptor u odnosu na drugi receptor. U ilustrativnim primerima izvođenja, selektivnost peptida prema predmetnom pronalasku za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora je manja od 100-puta (npr., manja od ili oko 90-puta, manja od ili oko 80-puta, manja od ili oko 70-puta, manja od ili oko 60-puta, manja od ili oko 50-puta, manja od ili oko 40-puta, manja od ili oko 30-puta, manja od ili oko 20-puta, manja od ili oko 10-puta, manja od ili oko 5-puta).

[0031] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju pojačanu aktivnost na GLP-1 receptoru, u poređenju sa nativnim humanim glukagonom. Nativni glukagon ima oko 1% od aktivnosti nativnog GLP-1 na GLP-1 receptoru. Relativna aktivnost receptora na GLP-1 receptoru u odnosu na nativni glukagon je izračunata kao obrnuti odnos od (EC50peptida predmetnih otkrića/EC50nativnog glukagona) x 100%.

[0032] Relativna aktivnost peptida na GLP-1 receptoru u poređenju sa nativnim GLP-1 je izračunata kao obrnuti odnos od (EC50peptida predmetnih otkrića/EC50nativnog GLP-1) x 100% (vrednost ovde označena kao "procenat potencije GLP-1").

[0033] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja predmetnih otkrića, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju procenat potencije GLP-1 od najmanje ili oko 0.1%. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi ispoljavaju procenat potencije GLP-1 od najmanje ili oko 0.5%, najmanje ili oko 1%, najmanje ili oko 5%, najmanje ili oko 10%, najmanje ili oko 20%, najmanje ili oko 30%, najmanje ili oko 40%, najmanje ili oko 50%, najmanje ili oko 60%, najmanje ili oko 70%, najmanje ili oko 80%, najmanje ili oko 90%, ili najmanje ili oko 100%.

[0034] U nekim primerima izvođenja predmetnih otkrića, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju aktivnost na GLP-1 receptoru koja je veća od one od nativnog GLP-1. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića ispoljava procenat potencije GLP-1 od najmanje ili oko 125%, najmanje ili oko 150%, najmanje ili oko 175% najmanje ili oko 200%, najmanje ili oko 300%, najmanje ili oko 400%, najmanje ili oko 500%, najmanje ili oko 600%, najmanje ili oko 700%, najmanje ili oko 800%, najmanje ili oko 900%, ili najmanje ili oko 1000%. U nekim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju procenat potencije GLP-1 od ne više od 1000% ili ne više od 10,000%.

Koagonisti GIP/glukagona

[0035] Kao sledeći primer, peptid predmetnih otkrića u nekim aspektima ispoljava aktivnost na oba, GIP receptoru i receptoru za glukagon ("koagonisti receptora za glukagon/GIP"). U nekim primerima izvođenja, aktivnost GLP-1 je značajno smanjena ili uništena, npr., preko aminokiselinske modifikacije na položaju 7, npr., supstitucija sa Ile, delecija aminokiseline(a) C-terminalno prema aminokiselini na položaju 27 ili 28, proizvodeći 27- ili 28-aminokiselinski peptid, ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića je peptid koji ispoljava oko 10% ili manje (npr., oko 5% ili manje, ili oko 1% ili manje, ili oko 0.1% ili manje) od aktivnosti nativnog GLP-1 na GLP-1 receptoru.

[0036] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, EC50peptida predmetnih otkrića na GIP receptoru je unutar oko 50-puta ili manje, oko 40-puta ili manje, oko 30-puta ili manje, oko 20-puta ili manje, ili oko 10-puta ili manje, ili oko 5-puta ili manje različito (više ili niže) od njegove EC50na receptoru za glukagon. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, procenat potencije GIP peptida predmetnih otkrića je manje od ili oko 50-, 40-, 30-, 20-, 10-, ili 5-puta različit (viši ili niži) od njegovog procenta potencije glukagona.

[0037] U nekim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju pojačanu aktivnost na receptoru za glukagon, u poređenju sa nativnim humanim glukagonom. Relativna aktivnost peptida na receptoru za glukagon u poređenju sa nativnim glukagonom je izračunata kao obrnuti odnos od (EC50peptida predmetnih otkrića/EC50nativnog glukagona) x 100% (vrednost koja je ovde označena kao "procenat potencije glukagona").

[0038] U nekim primerima izvođenja predmetnih otkrića, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju procenat potencije glukagona od najmanje ili oko 0.1%. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi ispoljavaju procenat potencije glukagona od najmanje ili oko 0.5%, najmanje ili oko 1%, najmanje ili oko 5%, najmanje ili oko 10%, najmanje ili oko 20%, najmanje ili oko 30%, najmanje ili oko 40%, najmanje ili oko 50%, najmanje ili oko 60%, najmanje ili oko 70%, najmanje ili oko 80%, najmanje ili oko 90%, ili najmanje ili oko 100%.

[0039] U nekim primerima izvođenja predmetnih otkrića, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju aktivnost na receptoru za glukagon koja je veća od one od nativnog glukagona. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića ispoljava procenat potencije glukagona od najmanje ili oko 125%, najmanje ili oko 150%, najmanje ili oko 175% najmanje ili oko 200%, najmanje ili oko 300%, najmanje ili oko 400%, najmanje ili oko 500%, najmanje ili oko 600%, najmanje ili oko 700%, najmanje ili oko 800%, najmanje ili oko 900%, ili najmanje ili oko 1000%. U nekim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju procenat potencije glukagona od ne više od 1000% ili ne više od 10,000%.

Triagonisti

[0040] U nekim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju aktivnost na dva ili više receptora, osim GIP receptora. Prema tome, predmetna otkrića obezbeđuju u nekim aspektima peptide triagoniste GIP. U nekim aspektima, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju aktivnost na svakom od receptora za glukagon, GIP i GLP-1 ("triagonisti glukagona/GIP/GLP-1").

[0041] U nekim primerima izvođenja, EC50peptida predmetnih otkrića na GIP receptoru je unutar 50-puta ili manje, 20-puta ili manje, ili 10-puta ili manje različita (viša ili niža) od EC50peptida predmetnih otkrića na (a) GLP-1 receptoru, (b) receptoru za glukagon, ili oba. U nekim primerima izvođenja, EC50peptida predmetnih otkrića na GIP receptoru je unutar oko 40-puta, oko 30-puta, oko 20-puta različita (viša ili niža) od njegove EC50na GLP-1 receptoru, i izborno unutar oko 50-puta različita od njegove EC50na receptoru za glukagon. U nekim primerima izvođenja, procenat potencije GIP peptida predmetnih otkrića je manje od ili oko 50-puta, 20-puta ili 10-puta različita (viša ili niža) od (a) njegovog procenta potencije GLP-1, (b) njegovog procenta potencije glukagona, ili oba. U nekim primerima izvođenja, procenat potencije GIP peptida predmetnih otkrića je unutar oko 40-puta, oko 30-puta, oko 20-puta različit (viši ili niži) od njegovog procenta potencije GLP-1, i izborno unutar oko 50-puta različit od njegovog procenta potencije glukagona. U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih oktrića nema najmanje 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora. U ilustrativnim primerima izvođenja, selektivnost peptida predmetnih otkrića za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora je manja od 100-puta (npr., manja od ili oko 90-puta, manja od ili oko 80-puta, manja od ili oko 70-puta, manja od ili oko 60-puta, manja od ili oko 50-puta, manja od ili oko 40-puta, manja od ili oko 30-puta, manja od ili oko 20-puta, manja od ili oko 10-puta, manja od ili oko 5-puta).

Agonizam GIP u odsustvu agonizma GLP-1 i agonizma glukagona

[0042] U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića ispoljava aktivnost samo na GIP receptoru, i ne na bilo kom drugom receptoru, npr., GLP-1 receptoru, receptoru za glukagon. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića ispoljava aktivnost na GIP receptoru, i aktivnost glukagona i GLP-1 značajno je smanjena ili uništena, npr., aminokiselinskim modifikacijama na položajima 3 i 7. U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića je peptid koji ispoljava procenat potencije GLP-1 od oko 10% ili manje (npr., oko 5% ili manje, ili oko 1% ili manje, ili oko 0.1% ili manje). U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića je peptid koji ispoljava procenat potencije glukagona od oko 10% ili manje (npr., oko 5% ili manje, ili oko 1% ili manje, ili oko 0.1% ili manje).

Aktivnost konjugata

[0043] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, kada je peptid predmetnih otkrića konjugovan za heterolognu grupu (npr., hidrofilnu grupu (npr., polietilen glikol)), kao što je dalje ovde opisano, peptid predmetnih otkrića ispoljava smanjenu aktivnost (npr., niži procenat potencije ili višu EC50) od toga kada je peptid predmetnih otkrića u slobodnom ili nekonjugovanom obliku. Na taj način, razmatrano je kada je bilo koji od gore navedenih apsolutnih nivoa aktivnosti (npr. procenat potencije GIP, procenat potencije GLP-1 ili procenat potencije glukagona, ali ne relativni odnosi) primenjen na peptid u konjugovanom obliku, npr. pegilovan, takvi apsolutni nivoi aktivnosti su smanjeni za oko 10-puta, 20-puta, 30-puta, 40-puta, 50-puta, ili 100-puta, i da su takvi višestruko smanjeni nivoi aktivnosti razmatrani unutar obima otkrića. Suprotno tome, kada je konjugovan, peptid predmetnih otkrića ispoljava procenat potencije GIP koji je oko 10-puta, oko 20-puta, oko 30-puta, oko 40-puta, oko 50-puta, oko 100-puta ili više viši od potencije peptida predmetnih otkrića kada je konjugovan za heterolognu grupu (npr., hidrofilnu grupu (npr., polietilen glikol)).

STRUKTURA SADA OTKRIVENIH PEPTIDA

Analozi glukagona

[0044] U nekim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića su strukturno slični nativnom humanom glukagonu (SEQ ID NO: 1), npr., to je analog nativnog humanog glukagona (takođe označen ovde kao "analog glukagona" ili "peptidni analog glukagon"). Kao što su ovde korišćeni, termini "analog glukagona" i "peptidni analog glukagona," i slično, označavaju peptide koji su strukturno slični nativnom humanom glukagonu i ovi termini ne ukazuju neophodno na to da peptidi aktiviraju receptor za glukagon.

[0045] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića je analog nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na bazi aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, ali se razlikuje od SEQ ID NO: 1 utoliko što aminokiselinska sekvenca analoga glukagona sadrži jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, i u nekim slučajevima, 16 ili više (npr., 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, itd.), naznačenih ili izbornih aminokiselinskih modifikacija. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića sadrži ukupno od 1, do 2, do 3, do 4, do 5, do 6, do 7, do 8, do 9, ili do 10 dodatnih aminoksaminokiselinskih modifikacija (npr., pored naznačenih aminokiselinskih modifikacija), u odnosu na nativnu humanu sekvencu glukagona (SEQ ID NO: 1). U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, modifikacije su bilo koja od onih koje su ovde opisane, npr., acilacija, alkilacija, pegilacija, skraćenje na C-terminusu, supstitucija aminokiseline na jednom ili više od položaja 1, 2, 3, 7, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 28 i 29.

[0046] Kao što je ovde korišćena "aminokiselinska modifikacija" označava (i) supstituciju aminokiseline od SEQ ID NO: 1 sa različitom aminokiselinom (prirodna ili kodirana ili nekodirana ili aminokiselina koja se ne javlja u prirodi), (ii) adiciju aminokiseline (prirodne ili kodirane ili nekodirane ili aminokiseline koja se ne javlja u prirodi), do SEQ ID NO: 1 ili (iii) deleciju jedne ili više aminokiselina od SEQ ID NO: 1.

[0047] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija je konzervativna aminokiselinska supstitucija, npr., konzervativna supstitucija aminokiseline na jednom ili više od položaja 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 ili 29. Kao što je ovde korišćen, termin "konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ovde definisana kao supstitucija jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima slične osobine, npr., veličinu, naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost, i/ili aromatičnost, i obuhvata izmene unutar jedne od sledećih grupa:

I. Mali alifatični, nepolarni ili slabo polarni ostaci:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. Polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi i estri:

Asp, Asn, Glu, Gln, cisteinska kiselina i homocisteinska kiselina;

III. Polarni, pozitivno naelektrisani ostaci:

His, Arg, Lys; ornitin (Orn)

IV. Veliki, alifatični, nepolarni ostaci:

Met, Leu, Ile, Val, Cys, norleucin (Nle), homocistein

V. Veliki, aromatični ostaci:

Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanin

[0048] U alternativnim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija nije konzervativna aminokiselinska supstitucija, npr., to je nekonzervativna aminokiselinska supstitucija.

[0049] Kao što je ovde korišćen termin "naelektrisana aminokiselina" označava aminokiselinu koja sadrži bočni lanac koji je negativno naelektrisan (tj., deprotonovan) ili pozitivno naelektrisan (tj., protonovan) u vodenom rastvoru na fiziološkoj pH. Na primer negativno naelektrisane aminokiseline obuhvataju asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, cisteinsku kiselinu, homocisteinsku kiselinu i homoglutaminsku kiselinu, pri čemu pozitivno naelektrisane aminokiseline obuhvataju arginin, lizin i histidin. Naleketrisane aminokiseline obuhvataju naelektrisane aminokiseline među 20 kodiranih aminokiselina, kao i atipične ili aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi ili nekodirane aminokiseline. Kao št je ovde korišćen termin "kisela aminokiselina" označava aminokiselinu koja sadrži drugu kiselu grupu (osim alfa karboksilne kiseline aminokiseline), uključujući na primer, grupu karboksilne kiseline ili sulfonske kiseline bočnog lanca.

[0050] U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 25% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1). U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili ima više od 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca sada otkrivenog peptida koji ima gore navedeni % identičnosti sekvence je aminokiselinska sekvenca pune dužine sada otkrivenog peptida. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca peptida predmetnih otkrića koja ima gore navedeni % identičnosti sekvence je samo deo aminokiselinske sekvence sada otkrivenog peptida. U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima oko A% ili veću identičnost sekvence sa referentnom aminokiselinskom sekvencom od najmanje 5 uzastopnih aminokiselina (npr., najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10 aminokiselina) od SEQ ID NO: 1, pri čemu referentna aminokiselinska sekvenca počinje sa aminokiselinom na položaju C od SEQ ID NO: 1 i završava se sa aminokiselinom na položaju D od SEQ ID NO: 1, pri čemu A je 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99; C je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 i D je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29. Predviđene je bilo koja i sve moguće kombinacije gore navedenih parametara, uključujući npr., pri čemu, A je 90% i C i D su 1 i 27, ili 6 i 27, ili 8 i 27, ili 10 i 27, ili 12 i 27, ili 16 i 27.

[0051] Analozi nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1) koji su ovde opisani mogu da sadrže peptidnu osnovu od bilo kog broja aminokiselina, tj., mogu biti bilo koje dužine peptida. U nekim primerima izvođenja, peptidi opisani ovde su iste dužine kao SEQ ID NO: 1, tj., oni su 29 aminokiselina u dužinu. U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid je duži od 29 aminokiselina, npr., sada otkriveni peptid sadrži C-terminalni produžetak od 1-21 aminokiselina, kao što je dodatno ovde opisano. Prema tome, peptid predmetnih otkrića u nekim primerima izvođenja, je dužine 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid je dužine do 50 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid je duži od 29 aminokiselina u dužinu (npr., veći od 50 aminokiselina, (npr., najmanje ili oko 60, najmanje ili oko 70, najmanje ili oko 80, najmanje ili oko 90, najmanje ili oko 100, najmanje ili oko 150, najmanje ili oko 200, najmanje ili oko 250, najmanje ili oko 300, najmanje ili oko 350, najmanje ili oko 400, najmanje ili oko 450, najmanje ili oko 500 aminokiselina u dužinu) zahvaljujući fuziji sa drugim peptidom. U drugim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid je manji od dužine od 29 aminokiselina, npr., 28, 27, 26, 25, 24, 23, aminokiselina.

[0052] U skladu sa gore navedenim, u nekim aspektima, peptid predmetnih otkrića je analog nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na bazi SEQ ID NO: 1, čija sekvenca sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje utiču na aktivnost GIP, aktivnost glukagona i/ili aktivnost GLP-1, pojačavaju stabilnost, npr., smanjenjem razlaganja peptida (npr., poboljšanjem otpornosti na DPP-IV proteaze), pojačavaju rastvorljivost, povećavaju polu-život, odlažu početak delovanja, produžavaju trajanje delovanja receptora za GIP, glukagon ili GLP-1, ili kombinacije bilo kojih od gore navedenih. Takve aminokiselinske modifikacije, pored drugih modifikacija, su dalje opisane u daljem tekstu, i bilo koje od ovih modifikacija mogu biti primenjene pojedinačno ili u kombinaciji.

AMINOKISELINE KOJE SADRŽE NENATIVNU ACIL GRUPU

[0053] U skladu sa nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP koji su analozi glukagona (SEQ ID NO: 1) sadrže aminokiselinu koja sadrži nenativnu acil grupu (označena ovde kao "acilovana aminokiselina", bez obzira na to kako je pripremljena, npr., ugradnjom prethodno acilovane aminokiseline u peptid, ili acilacijom peptida posle sinteze). U nekim ili bilo kojim aspektima, acilovana aminokiselina je locirana na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, 37, 38, 39, 40, 41, 42, ili 43 analoga glukagona. U ilustrativnim aspektima, acilovana aminokiselina je locirana na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 16, 20, ili 40 analoga glukagona ili na bilo kom od položaja 10, 13, 14, 16, 17 ili 40 analoga glukagona. U ilustrativnim aspektima, acilovana aminokiselina je locirana na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40. U ilustrativnim aspektima, acilovana aminokiselina je locirana na bilo kom od položaja 10, 12 ili 16 peptidnog analoga.

[0054] Acilovana aminokiselina u nekim primerima izvođenja izaziva da peptid agonist GIP ima jedno ili više od (i) produženi polu-život u cirkulaciji, (ii) odloženi početak aktivnosti, (iii) produženo trajanje aktivnosti, (iv) poboljšanu otpornost na proteaze, kao što je DPP-IV, i (v) povećana potencija na bilo kom ili više od GIP receptora, GLP-1 receptora i receptora za glukagon.

Direktna acilacija

[0055] U nekim primerima izvođenja, acil grupa je direktno vezana za aminokiselinu peptida agonista GIP. U skladu sa jednim primerom izvođenja, peptid agonist GIP sadrži acil grupu koja je vezana za peptid preko estarske, tioestrske ili amidne veze.

[0056] U specifičnim aspektima, peptid agonist GIP sadrži acil grupu posle direktne acilacije amina, hidroksila ili tiola bočnog lanca aminokiseline peptida agonista GIP. U nekim primerima izvođenja, acilacija je na položaju 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 ili 40 (npr., na bilo kom od položaja 10, 14 i 40) peptida agonista GIP. S tim u vezi, peptid agonist GIP sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1, ili njenu modifikovanu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu ili više od aminokiselinskih modifikacija opisanih ovde, pri čemu najmanje jedna od aminokiselina na položajima 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 i 40 (npr., na bilo kom od položaja 10, 14 i 40) peptida agonista GIP je aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca.

[0057] U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca je aminokiselina formule I:

gde je n = 1 do 4

[Formula I]

U nekim primerima izvođenja, aminokiselina formule I, je aminokiselina u kojoj n je 4 (Lys) ili n je 3 (Orn). U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca je aromatična aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca. U ilustrativnim aspektima, aromatična aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca je 4-amino-fenilalanin (4-amino-Phe), p-amino fenilglicin, p-amino homofenilalanin, ili 3-amino tirozin. U ilustrativnim aspektima, aromatična aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca je 4-amino-Phe.

[0058] U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca je aminokiselina formule II:

gde je n = 1 do 4

[Formula II]

[0059] U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule II je aminokiselina u kojoj n je 1 (Ser). U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule II je aminokiselina u kojoj n je 2 (homoserin). U sličnim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca je Thr ili homotreonin. U sličnim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca je aromatična aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca. U ilustrativnim primerima izvođenja, aromatična aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca je tirozin, homotirozin, metil-tirozin ili 3-amino tirozin.

[0060] U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži tiol bočnog lanca je aminokiselina formule III:

gde je n = 1 do 4

[Formula III]

U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule III je aminokiselina u kojoj n je 1 (Cys).

[0061] U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca je disupstituisana aminokiselina koja sadrži strukturu formule I, formule II ili formule III, osim što je vodonik vezan za alfa ugljenik aminokiseline formule I, formule II ili formule III zamenjen drugim bočnim lancem.

Acilacioni spejseri

[0062] U alternativnim primerima izvođenja, acil grupa je vezana preko spejsera za aminokiselinu peptida agonista GIP, pri čemu je spejser postavljen između aminokiseline peptida agonista GIP i acil grupe. U nekim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži spejser između peptida i acil grupe. U nekim primerima izvođenja, peptid agonist GIP je kovalentno vezan za spejser, koji je kovalentno vezan za acil grupu.

[0063] U nekim primerima izvođenja, spejser je aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca, ili dipeptid ili tripeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca. Aminokiselina za koju je vezan spejser može biti bilo koja aminokiselina (npr., jednostruko ili dvostruko α-supstituisana aminokiselina) koja sadrži grupu koja omogućava vezivanje za spejser. Na primer, aminokiselina koja sadrži NH2, - OH, ili –COOH bočnog lanca (npr., Lys, Orn, Ser, Asp, ili Glu) je pogodna. U tom smislu, peptidni agonist GIP u nekim aspektima sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1, ili njenu modifikovanu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, pri čemu najmanje jedan od aminokiselina na položajima 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 i 37-43 (npr., položaju 10, 14, ili 40) je aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili karboksilat bočnog lanca.

[0064] U nekim primerima izvođenja, spejser je aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca, ili dipeptid ili tripeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca.

[0065] Kada je acil grupa vezana preko grupe amina spejsera, acil grupa u nekim aspektima je vezana preko alfa amina ili preko amina bočnog lanca spejsera aminokiseline. U slučaju u kome je acil grupa vezana preko alfa amina, aminokiselina spejsera može biti bilo koja aminokiselina. Na primer, aminokiselina spejsera može biti hidrofobna aminokiselina, npr., Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-amino kapronska kiselina, 5-aminovalerijanska kiselina, 7-aminoheptanska kiselina i 8-aminokaprilna kiselina. Alternativno, u nekim aspektima, aminokiselina spejsera je kiseli ostatak, npr., Asp, Glu, homoglutaminska kiselina, homocisteinska kiselina, cisteinska kiselina, gama-glutaminska kiselina.

[0066] U slučaju u kome je acil grupa vezana preko amina bočnog lanca aminokiselinskog spejsera, spejser je aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca, npr., aminokiselina formule I (npr., Lys ili Orn). U ovom slučaju, moguće je za oba, alfa amin i amin bočnog lanca aminokiseline spejsera da je vezan za acil grupu, tako da je peptidni agonist GIP diacilovan. Primeri izvođenja otkrića obuhvataju takve diacilovane molekule. U nekim primerima izvođenja, acil grupa je vezana za 4-amino-Phe, p-amino fenilglicin, p-aminohomofenilalanin ili 3-amino tirozin.

[0067] Kada je acil grupa vezana preko hidroksil grupe spejsera, aminokiselina ili jednа od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule II. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Ser. U sličnim ilustrativnim primerima izvođenja, acil grupa je vezana za Thr ili homotreonin. U sličnim ilustrativnim primerima izvođenja, acil grupa je vezana preko hidroksila aromatične aminokiseline koja sadrži hidroksil bočnog lanca, npr., tirozin, homotirozin, metil-tirozin, ili 3-amino tirozin.

[0068] Kada je acil grupa vezana preko tiol grupe spejsera, aminokiselina ili jedan od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule III. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Cys.

[0069] U nekim primerima izvođenja, spejser je hidrofilni bifunkcionalni spejser. U ilustrativnim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži dve ili više reaktivnih grupa, npr., amin, hidroksil, tiol i karboksil grupu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U ilustrativnim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži hidroksil grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži grupu amina i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži tiol grupu i karboksilat. U specifičnom primeru izvođenja, spejser sadrži amino poli(alkiloksi)karboksilat. S tim u vezi, spejser može da sadrži, na primer, NH2(CH2CH2O), (CH2)mCOOH, gde m je ceo broj od 1 do 6 i n je bilo koji ceo broj od 2 do 12, kao što je, npr., 8-amino-3,6-dioksakaprilna kiselina, koja je komercijalno dostupna iz Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

[0070] U ilustrativnim primerima izvođenja, spejser sadrži malu polietilen glikol grupu (PEG) koja sadrži strukturu [-O-CH2-CH2-]n, pri čemu n je ceo broj između 2 i 16, (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16). Takvi mali PEG su ovde označeni kao "miniPEG." U ilustrativnim aspektima, miniPEG je funkcionalizovani miniPEG koji sadrži jednu ili više funkcionalnih grupa. Pogodne funkcionalne grupe obuhvataju, ali bez ograničenja na, amin, hidroksil, tiol i karboksil grupu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U ilustrativnim aspektima, miniPEG je miniPEG kiselina koja sadrži strukturu {[-O-CH2-CH2-]n-COO-}, pri čemu n je definisan kao u prethodnom tekstu. U ilustrativnim aspektima, miniPEG je amido miniPEG koji sadrži strukturu {-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n}, gde n je definisan kao u prethodom tekstu. U ilustratuvnim aspektima, miniPEG je amido miniPEG kiselina koja sadrži strukturu {-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n-COO-}, gde n je definisan kao u prethodnom tekstu. Pogodni reagensi za upotrebu u acilaciji aminokiseline sa miniPEG su komercijalno dostupni od nabavljača, kao što je Peptides International (Louisville, KY). Takođe, pogodne tehnike za acilaciju aminokiseline sa miniPEG su opisane ovde (videti Primer 1).

[0071] U nekim primerima izvođenja, spejser je hidrofobni bifunkcionalni spejser. Hidrofobni bifunkcionalni spejseri su poznati u stanju tehnike. Videti, npr., Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996). U ilustrativnim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži dve ili više reaktivnih grupa, npr., amin, hidroksil, tiol i karboksil grupu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U ilustrativnim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži hidroksil grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži grupu amina i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži tiol grupu i karboiksilat. Pogodni hidrofobni bifunkcionalni spejseri koji sadrže karboksilat i hidroksil grupu ili tiol grupu su poznati u stanju tehnike i obuhvataju, na primer, 8-hidroksikaprilnу kiselinu i 8-merkaptokaprilnu kiselinu.

[0072] U nekim primerima izvođenja, bifunkcionalni spejser nije dikarboksilna kiselina koja sadrži negranati metilen od 1-7 atoma ugljenika između karboksilat grupa. U nekim primerima izvođenja, bifunkcionalni spejser je dikarboksilna kiselina koja sadrži negranati metilen od 1-7 atoma ugljenika između karboksilatnih grupa.

[0073] Spejser (npr., aminokiselina, dipeptid, tripeptid, hidrofilni bifunkcionalni spejser ili hidrofobni bifunkcionalni spejser) u specifičnim primerima izvođenja je 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma, (npr., 6, 7, 8, 9, ili 10 atoma) u dužinu. U specifičnijim primerima izvođenja, spejser je oko 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma) u dužinu i acil grupa je grupa C12do C18masne kiseline, npr., grupa C14masne kiseline, grupa C16masne kiseline, tako da je ukupna dužina spejsera i acil grupe 14 do 28 atoma, npr., oko 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 atoma. U nekim primerima izvođenja, dužina spejsera i acil grupe je 17 do 28 (npr., 19 do 26, 19 do 21) atoma.

[0074] U skladu sa nekim ili bilo kojim od gore navedenih primera izvođenja, bifunkcionalni spejser može biti sintetička ili prirodna aminokiselina (uključujući bilo koju od onih koje su ovde opisane) koja sadrži aminokiselinsku osnovu koja je 3 do 10 atoma u dužinu (npr., 6-amino kapronska kiselina, 5-aminovalerijanska kiselina, 7-aminoheptanska kiselina i 8-aminokaprilna kiselina). Alternativno, spejser može biti dipeptidni ili tripeptidni spejser koji ima peptidnu osnovu koja je 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma) u dužinu. Svaka aminokiselina dipeptidnog ili tripeptidnog spejsera može biti ista ili različita od druge aminokiseline (aminokiselina) dipeptida ili tripeptida i može biti nezavisno izabrana iz grupe koja se sastoji od: prirodnih ili kodiranih i/ili nekodiranih aminokiselina ili aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi, uključujući, na primer, bilo koji od D ili L izomera prirodnih aminokiselina (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), ili bilo koji od D ili L izomera od aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi ili nekodiranih aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od: β-alanina (β-Ala), N-α-metilalanina (Me-Ala), aminobuterne kiseline (Abu), γ-aminobuterne kiseline (γ-Abu), aminokapronske kiseline (ε-Ahx), aminoizobuterne kiseline (Aib), aminometilpirol karboksilne kiseline, aminopiperidinkarboksilne kiseline, aminoserina (Ams), aminotetrahidropiran-4-karboksilne kiseline, arginin N-metoksi-N-metil amida, βasparaginske kiseline (β-Asp), azetidin karboksilne kiseline, 3-(2-benzotiazolil)alanina, α,-terc-butilglicina, 2-amino-5-ureido-n-valerijanske kiseline (citrulin, Cit), β-cikloheksilalanina (Cha), acetamidometil-cisteina, diaminobuterne kiseline (Dab), diaminopropionske kiseline (Dpr), dihidroksifenilalanina (DOPA), dimetiltiazolidina (DMTA), γ-glutaminske kiseline (γ-Glu), homoserina (Hse), hidroksiprolina (Hyp), izoleucin N-metoksi-N-metil amida, metilizoleucina (MeIle), izonipekotinske kiseline (Isn), metil-leucina (MeLeu), metil-lizina, dimetil-lizina, trimetil-lizina, metanoprolina, metionin-sulfoksida (Met(O)), metionin-sulfona (Met(O2)), norleucina (Nle), metil-norleucina (Me-Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), paraaminobenzoјeve kiseline (PABA), penicilamina (Pen), metilfenilalanina (MePhe), 4-hlorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 4-nitrofenilalanina (Phe(4-NO2)), 4-cijanofenilalanina ((Phe(4-CN)), fenilglicina (Phg), piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3,4-dehidroprolina, pirolidinilalanina, sarkozina (Sar), selenocisteina (Sec), O-benzil-fosfoserina, 4-amino-3-hidroksi-6-metilheptanske kiseline (Sta), 4-amino-5-cikloheksil-3-hidroksipentanske kiseline (ACHPA), 4-amino-3-hidroksi-5-fenilpentanske kiseline (AHPPA), 1,2,3,4,-tetrahidro-izohinolin-3-karboksilne kiseline (Tic), tetrahidropiranglicina, tienilalanina (Thi ili Tio Ala), O-benzil-fosfortirozina, O-fosfotirozina, metoksitirozina, etoksitirozina, O-(bis-dimetilamino-fosfono)-tirozina, tirozin sulfat tetrabutilamina, metil-valina (MeVal) i alkilovane 3-merkaptopropionske kiseline. U ilustrativnim aspektima, spejser je Cys ostatak ili Lys ostatak.

[0075] U nekim primerima izvođenja, spejser sadrži ukupno negativno naelektrisanje, npr., sadrži jednu ili dve negativno naelektrisane aminokiseline. U nekim primerima izvođenja, dipeptid nije bilo koji od dipeptida opšte strukture A-B, pri čemu A je izabran iz grupe koja se sastoji od Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe i Pro, pri čemu B je izabran iz grupe koja se sastoji od Lys, His, Trp. U nekim primerima izvođenja, aminokiseline dipeptidnog spejsera su izabrane iz grupe koja se sastoji od: Ala, β-Ala, Leu, Pro, γaminobuterne kiseline, Glu i γ-Glu.

[0076] U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži acil grupu posle acilacije amina, hidroksila ili tiola spejsera, koji spejser je vezan za bočnu stranicu aminokiseline na položaju 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40), ili na C-terminalnoj aminokiselini peptida agonista GIP.

[0077] U specifičnijim primerima izvođenja, acil grupa je vezana za aminokiselinu na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40) peptidnog analoga i dužina spesera i acil grupe je 14 do 28 atoma. Aminokiselina na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40), u nekim aspektima, je aminokiselina formule I, npr., Lys, ili disupstituisana aminokiselina vezana za formulu I. U specifičnijim primerima izvođenja, peptidni analog nema intramolekularni most, npr., kovalentni intramolekularni most. Analog glukagona, na primer, može biti analog glukagona koji sadrži jedni ili više alfa, alfadisupstituisanih aminokiselina, npr., AIB, za stabilizaciju alfa spirale analoga.

Acil grupe

[0078] Acil grupa acilovane aminokiseline može biti bilo koje veličine, npr., bilo koje dužine ugljeničnog lanca, i može biti linearna ili granata. U nekim specifičnim primerima izvođenja, acil grupa je C4do C30masna kiselina. Na primer, acil grupa može biti bilo koja od C4masne kiseline, C6masne kiseline, C8masne kiseline, C10masne kiseline, C12masne kiseline, C14masne kiseline, C16masne kiseline, C18masne kiseline, C20masne kiseline, C22masne kiseline, C24masne kiseline, C26masne kiseline, C28masne kiseline, ili C30masne kiseline. U nekim primerima izvođenja, acil grupa je C8do C20masna kiselina, npr., C12do C18masna kiselina, C14masna kiselina ili C16 masna kiselina. U ilustrativnim primerima izvođenja, acil grupa je C16do C30masna kiselina, npr., C20do C28masna kiselina, C16do C22masna kiselina.

[0079] U alternativnom primeru izvođenja, acil grupa je žučna kiselina. Žučna kiselina može biti bilo koja pogodna žučna kiselina, uključujući holnu kiselinu, henodezoksiholnu kiselinu, dezoksiholnu kiselinu, litoholnu kiselinu, tauroholnu kiselinu, glikoholnu kiselinu i holesterolnu kiselinu.

[0080] U ilustrativnim primerima izvođenja, acil grupa je ćilibarna kiselina ili derivat ćilibarne kiseline. "Derivat ćilibarne kiseline" kao što je ovde korišćen označava jedinjenje koje sadrži supstituisanu ćilibarnu kiselinu ili supstituisanu cikličnu ćilibarnu kiselinu (tj., anhidrid ćilibarne kiseline) ili supstituisani anhidrid ćilibarne kiseline sa proširenim prstenom, (tj. 6-8 –člani prsten koji sadrži -C(O)-O-C(O)- grupu i 3 do 5 dodatnih ugljenika), pri čemu supstituisana ćilibarna kiselina, supstituisana ciklična ćilibarna kiselina (tj., anhidrid ćilibarne kiseline) ili supstituisani anhidrid ćilibarne kiseline sa proširenim prstenom je supstituisan sa jednim ili više alkil lanaca ili jednim ili više funkcionalizovanih ugljeničnih lanaca.

[0081] U ilustrativnim aspektima, derivat ćilibarne kiseline sadrži strukturu formule V:

[Formula V]

gde svaki od R i R’ je nezavisno H, linearni ili granati C4-C30ugljenikov lanac, ili linearni ili granati C4-C30funkcionalizovani ugljenikov lanac. U ilustrativnim primerima izvođenja, R i/ili R’ je ugljenikov lanac koji sadrži C4do C30alkil lanac. Na primer, alkil grupa može biti bilo koja od C4alkil, C6alkil, C8alkil, C10alkil, C12alkil, C14alkil, C16alkil, C18alkil, C20alkil, C22alkil, C24alkil, C26alkil, C28alkil, ili C30alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8do C20alkil, npr., C12do C18alkil, C14alkil ili C16alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je C16do C30alkil, npr., C20do C28alkil, C16do C22alkil. U ilustrativnim aspektima, funkcionalizovani ugljenikov lanac sadrži funkcionalnu grupu, uključujući karboksil, sulfhidril, amin, ketil, sulfoksil ili amido.

[0082] U ilustrativnim aspektima, derivat ćilibarne kiseline sadrži anhidrid ćilibarne kiseline koji sadrži strukturu formule VI:

[Formula VI]

gde svaki od R i R’ je nezavisno H, linearni ili granati C4-C30 ugljenikov lanac, ili linearni ili granati C4-C30funkcionalnizovani ugljenikov lanac. U ilustrativnim primerima izvođenja, R i/ili R’ je ugljenikov lanac koji sadrži C4do C30alkil lanac. Na primer, alkil grupa može biti bilo koja od C4alkil, C6alkil, C8alkil, C10alkil, C12alkil, C14alkil, C16alkil, C18alkil, C20alkil, C22alkil, C24alkil, C26alkil, C28alkil, ili C30alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8do C20alkil, npr., C12do C18alkil, C14alkil ili C16alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je C16do C30alkil, npr., C20do C28alkil, C16do C22alkil. U ilustrativnim aspektima, funkcionalizovani ugljenikov lanac sadrži funkcionalnu grupu, uključujući karboksil, sulfihidril, amin, ketil, sulfoksil ili amido.

[0083] U ilustrativnim aspektima, derivat ćilibarne kiseline je derivat anhidrida ćilibarne kiseline, uključujući one formule VII:

[Formula VII]

gde n je 1-4, i

gde je svaki od R i R’ nezavisno H, linearni ili granati C4-C30ugljenikov lanac, ili linearni ili granati C4-C30funkcionalizovani ugljenikov lanac. U ilustrativnim primerima izvođenja, R i/ili R’ je uljenikov lanac koji sadrži C4do C30alkil lanac. Na primer, alkil grupa može biti bilo koja od C4alkil, C6alkil, C8alkil, C10alkil, C12alkil, C14alkil, C16alkil, C18alkil, C20alkil, C22alkil, C24alkil, C26alkil, C28alkil, ili C30alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8do C20alkil, npr., C12do C18alkil, C14alkil ili C16alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je C16do C30alkil, npr., C20do C28alkil, C16do C22alkil. U ilustrativnim aspektima, funkcionalizovani ugljenikov lanac sadrži funkcionalnu grupu, uključujući karboksil, sulfhidril, amin, ketil, sulfoksil ili amido.

[0084] Kada samo jedan od R i R’ formula V-VI je H, acilovana aminokiselina je označena kao "Cx sukcinoil." Kao što je ovde korišćen, termin "Cx sukcinoil," gde x je ceo broj, označava strukturu u kojoj R je alkil lanac od y ugljenika i y = x-1, i y ne obuhvata ugljenike sukcinoil grupe. Na primer struktura formule VI u kojoj R je C15alkil grupa i R’ je H je označena kao C16sukcionil. Na primer, Slika 3A prikazuje C16sukcinoil Lys, gde Lys je sukcinoilovan na ε aminu. Kada nijedan od R ili R’ formula V-VI nije H, tada je acilovana aminokiselina označena kao "Cx,Cx’ sukcinoil." Kao što je ovde korišćen, termin "Cx,Cx’ sukcinoil," u kome x i x’ su celi brojevi, označava strukturu u kojoj R je alkil lanac od y ugljenika i R’ je alkil lanac od y’ ugljenika, i y’ = x’-1. Na primer, struktura formule VI u kojoj R je C15alkil grupa i R’ je C13alkil grupa je označena kao C16,C14sukcinoil. Kada je derivat ćilibarne kiseline supstituisani anhidrid ćilibarne kiseline sa proširenim prstenom i nijedan od R ili R’ formule VII je H, tada je acilovana aminokiselina označena kao "Cx,Cx’-n-sukcinoil." Kao što je ovde korišćen, termin "Cx,Cx’-n-sukcinoil," u kome x, x’ i n su celi brojevi, označava strukturu u kojoj R je alkil lanac od y ugljenika, R’ je alkil lanac od y’ ugljenika, i prsten anhidrida ćilibarne kiseline je proširen za n ugljenika. Na primer, struktura formule VII u kojoj R i R’ su C15alkil grupe i n = 2 je označena kao C16,C16-2-sukcinoil.

[0085] U ilustrativnim primerima izvođenja, acil grupa je maleinska kiselina ili derivat maleinske kiseline. "Derivat maleinske kiseline" kao što je ovde korišćen označava jedinjenje koje sadrži supstituisanu maleinsku kiselinu ili supstituisanu cikličnu maleinsku kiselinu (tj., anhidrid maleinske kiseline) ili supstituisani anhidrid maleinske kiseline sa proširenim prstenom, (tj. 6-8 člani prsten koji sadrži -C(O)-O-C(O)- grupu i 3 do 5 dodatna ugljenika), pri čemu je supstituisana maleinska kiselina, supstituisana ciklična maleinska kiselina (tj., anhidrid maleinske kiseline), ili supstituisani anhidrid maleinske kiseline sa proširenim prstenom je supstituisan sa jednim ili više alkil lanaca ili jednim ili više funkcionalizovanih ugljenikovih lanaca.

[0086] U ilustrativnim aspektima, derivat maleinske kiseline sadrži strukturu formule VIII:

[Formula VIII]

gde je svaki od R i R’ nezavisno H, linearni ili granati C4-C30ugljenikov lanac, ili linearni ili granati C4-C30funkcionalizovani ugljenikov lanac. U ilustrativnim primerima izvođenja, R i/ili R’ je ugljenikov lanac koji sadrži C4do C30alkil lanac. Na primer, alkil grupa može biti bilo koja od C4alkil, C6alkil, C8alkil, C10alkil, C12alkil, C14alkil, C16alkil, C18alkil, C20alkil, C22alkil, C24alkil, C26alkil, C28alkil, ili C30alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8do C20alkil, npr., C12do C18alkil, C14alkil ili C16 alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je C16do C30alkil, npr., C20do C28alkil, C16do C22alkil. U ilustrativnim aspektima, funkcionalizovani ugljenikov lanac sadrži funkcionalnu grupu, uključujući karboksil, sulfhidril, amin, ketil, sulfoksil ili amido.

[0087] U ilustrativnim aspektima, derivat maleinske kiseline sadrži anhidrid maleinske kiseline koji sadrži strukturu formule IX:

[Formula IX]

u kojoj svaki od R i R’ je nezavisno H, linearni ili granati C4-C30ugljenikov lanac, ili linearni ili granati C4-C30funkicionalizovani ugljenikov lanac. U ilustrativnim primerima izvođenja, R i/ili R’ je ugljenikov lanac koji sadrži C4do C30alkil lanac. Na primer, alkil grupa može biti bilo koja od C4alkil, C6alkil, C8alkil, C10alkil, C12alkil, C14alkil, C16alkil, C18alkil, C20alkil, C22alkil, C24alkil, C26alkil, C28alkil, ili C30alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8do C20alkil, npr., C12do C18alkil, C14alkil ili C16 alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je C16do C30alkil, npr., C20do C28alkil, C16do C22alkil. U ilustrativnim aspektima, funkcionalizovani ugljenikov lanac sadrži funkcionalnu grupu, uključujući karboksil, sulfhidril, amin, ketil, sulfoksil ili amido.

[0088] U ilustrativnim aspektima, derivat maleinske kiseline je derivat anhidrida maleinske kiseline, uključujući one formule X:

[Formula X]

gde n je 1-4, tu je najmanje jedna C=C dvoguba veza između dva ne-karbonil ugljenika, i gde je svaki od R i R’ nezavisno H, linearni ili granati C4-C30ugljenikov lanac, ili linearni ili granati C4-C30 funkcionalizovani ugljenikov lanac. U ilustrativnim primerima izvođenja, R i/ili R’ je ugljenikov lanac koji sadrži C4do C30alkil lanac. Na primer, alkil grupa može biti bilo koja od C4alkil, C6alkil, C8alkil, C10alkil, C12alkil, C14alkil, C16alkil, C18alkil, C20alkil, C22alkil, C24alkil, C26alkil, C28alkil, ili C30alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8do C20alkil, npr., C12do C18alkil, C14alkil ili C16alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je C16do C30alkil, npr., C20do C28alkil, C16do C22alkil. U ilustrativnim aspektima, funkcionalizovani ugljenikov lanac sadrži funkcionalnu grupu, uključujući karboksil, sulfhidril, amin, ketil, sulfoksil ili amido.

[0089] Kada je samo jedan od R i R’ formula VIII-IX jednak H, acilovana aminokiselina je označena kao "Cx Maleoil." Kao što je ovde korišćen, termin "Cx Maleoil," u kome x je ceo broj, označava strukturu u kojoj R je alkil lanac od y ugljenika i y = x-1, i y ne obuhvata ugljenike maleoil grupe. Na primer struktura formule IX u kojoj R je C15alkil grupa i R’ je H je označena kao C16Maleoil. Kada nijedan od R niti R’ formula VIII-IX nije H, tada je acilovana aminokiselina označena kao "Cx,Cx’ maleoil." Kao što je ovde korišćen, termin "Cx,Cx’ maleoil," u kome x i x’ su celi brojevi, označava strukturu u kojoj R je alkil lanac od y ugljenika i R’ je alkil lanac od y’ ugljenika i y’ = x’-1. Na primer, struktura formule IX u kojoj R je C15alkil grupa i R’ je C13alkil grupa je označena kao C16,C14maleoil. Kada je derivat maleinske kiseline supstituisani anhidrid maleinske kiseline sa proširenim prstenom i nijedan od R niti R’ formule X nije H, tadaje acilovana aminokiselina označena kao "Cx,Cx’-n-Maleoil." Kao što je ovde korišćen, termin "Cx,Cx’-n-maleoil," u kome x, x’, i n su celi brojevi, označava struktur u kojoj R je alkil lanac od y ugljenika, R’ je alkil lanac od y’ ugljenika, i prsten anhidrida maleinske kiseline je proširen za n ugljenika. Na primer, struktura formule X u kojoj R i R’ su C15alkil grupe i n = 2 je označen kao C16,C16-2-maleoil.

Postupci za vezivanje acil grupe

[0090] Pogodni postupci za vezivanje acil grupa za peptide preko amina, hidroksila i tiola peptida poznati su u stanju tehnike. Videti, na primer, Primer 1 i Primer 2 (za postupke acilacije preko amina), Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi i Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); i Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (za postupke acilacije preko hidroksila); i San i Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (za postupke acilacije preko tiola); Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History i Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin i their Biological Activity" Vol.6, No: 2 pp.171-176 (1989).

[0091] U nekim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži acilovanu aminokiselinu acilacijom dugolančanog alkana peptidom agonistom GIP. U specifičnim aspektima, dugolančani alkan sadrži amin, hidroksil ili tiol grupu (npr., oktadecilamin, tetradekanol i heksadekantiol) koja reaguje sa karboksil grupom ili njegovim aktiviranim oblikom, peptida agonista GIP. Karboksil grupa, ili njen aktivirani oblik, peptida agonista GIP može biti deo bočnog lanca aminokiseline (npr., glutaminske kiseline, asparaginske kiseline) peptida agonista GIP ili može biti deo peptidne osnove.

[0092] U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži acil grupu acilacijom dugolančanog alkana spejserom koji je vezan za peptid agonist GIP. U specifičnim aspektima, dugolančani alkan sadrži amin, hidroksil ili tiol grupa koja reaguje sa karboksil grupom, ili njenim aktiviranim oblikom, spejsera. Pogodni spejseri koji sadrže karboksil grupu, ili njen aktivirani oblik, opisani su ovde i obuhvataju, na primer, bifunkcionalne spejsere, npr., aminokiseline, dipeptide, tripeptide, hidrofilne bifunkcionalne spejsere i hidrofobne bifunkcionalne spejsere.

[0093] Kao što je ovde korišćen, termin "aktivirani oblik karboksil grupe" označava karboksil grupu sa opštom formulom R(C=O)X, gde X je odlazeća grupa i R je analog glukagona ili spejser. Na primer, aktivirani oblici karboksil grupa mogu da obuhvataju, ali bez ograničenja na, acil hloride, anhidride i estre. U nekim primerima izvođenja, aktivirana karboksil grupa je estar sa N-hidroksisukcinimidnom estarskom (NHS) odlazećom grupom.

[0094] U vezi sa ovim aspektima, u kojima dugolančani alkan je acilovan pomoću analoga glukagona ili spejsera, dugolančani alkan može biti bilo koje veličine i može da sadrži bilo koju dužinu ugljenikovog lanca. Dugolančani alkan može biti linearan ili granat. U ilustrativnim aspektima, dugolančani alkan je C4do C30alkan. Na primer, dugolančani alkan može biti bilo koji od C4alkana, C6alkana, C8alkana, C10alkana, C12alkana, C14alkana, C16alkana, C18alkana, C20alkana, C22alkana, C24alkana, C26alkana, C28alkana, ili C30alkana. U nekim primerima izvođenja, dugolančani alkan sadrži C8do C20alkan, npr., C12do C18alkan, C14alkan, C16alkan, ili C18alkan. U ilustrativnim primerima izvođenja, dugotrajni alkan je C16do C30alkan, npr., C20do C28alkan, C16do C22alkan.

[0095] Takođe, u nekim primerima izvođenja, amin, hidroksil ili tiol grupa peptida agonista GIP je acilovana sa holesterol kiselinom. U specifičnom primeru izvođenja, peptid agonist GIP je vezan za holesterol kiselinu preko alkilovanog des-amino Cys spejsera, tj., spejsera alkilovane 3-merkaptopropionske kiseline.

[0096] Kada je acil grupa jednaka ćilibarnoj kiselini, derivatu ćilibarne kiseline, maleinskoj kiselini ili derivatu maleinske kiselinu peptid je sukcinoilovan/maleoilovan reakcijom amin, hidroksil ili tiol grupe peptida agonista GIP, ili spejsera, sa ćilibarnom kiselinom, derivatom ćilibarne kiseline, maleinskom kiselinom ili derivatom maleinske kiseline formule V, formule VI, formule VII, formule VIII, formule IX ili formule X. Postupci sukcinoilacije su opisani ovde.

Dodatne acil grupe

[0097] Peptid u nekim ili bilo kojim primerima izvođenja sadrži acilovanu aminokiselinu na položaju osim položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40). Lokacija acilovane aminokiseline može biti bilo koji položaj unutar peptida agonista GIP, uključujući bilo koji od položaja 1-29, položaj C-terminalan za 29. aminokiselinu (npr., aminokiselina na položaju 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 44, 45, 46, 47, itd., na položaju unutar C-terminalnog produžetka ili na C-terminusu), izborno zajedno sa drugom acilovanom aminokiselinom na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40), uz uslov da aktivnost agonista GIP peptida analoga je zadržana, ako ne pojačana. Neograničavajući primeri obuhvataju položaje 5, 7, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28, ili 29.

[0098] U skladu sa gore navedenim, analog glukagona, u ilustrativnim aspektima, sadrži dve (ili više) acilovanih aminokiselina, i može se smatrati dvostrukim acilovanim peptidom ili diacilovanim peptidom, kada su prisutne dve acil grupe. U ilustrativnim aspektima, sve acilovane aminokiseline su locirane na dva položaja od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više položaja 10, 14 i 40). U ilustrativnim aspektima, acilacije se javljaju na dva od položaja 10, 14 i 40. U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži prvu acilovanu aminokiselinu na položaju 10 i drugu acilovanu aminokiselinu na položaju 40.

[0099] U dodatnim ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži dve (ili više) acil grupa vezane za jednu aminokiselinu peoptidne osnove. Peptid se može smatrati dvostrukim acilovanim peptidom ili diacilovanim peptidom, kada su prisutne dve acil grupe. Dve (ili više) acil grupa mogu biti ista acil grupa ili različite acil grupe, uređene u granatoj ili lineranoj formaciji. Na primer, da bi se postigla granata formacija, analog glukagona može da sadrži jednu acilovanu aminokiselinu (koja je deo peptidne osnove) vezanu za spejser koji sadrži najmanje tri funkcionalne grupe – od kojih su najmanje dve svaka kovalentno vezana za acil grupu i od kojih je jedna vezana za acilovanu aminokiselinu peptidne osnove. U ilustrativnim aspektima, granata formacija može biti postignuta preko, npr., Lys ostatka koji sadrži dve amino grupe (amin bočnog lanca i alfa amin) za direktno vezivanje za grupu masne kiseline ili indirektno vezivanje za grupu masne kiseline preko spejsera. U ilustrativnim aspektima, dodatni spejser može biti postavljen između aminokiselina peptidne osnove i spejsera koji sadrži najmanje tri funkcionalne grupe. Na primer, aminokiselina peptidne osnove može biti vezana (npr., preko svog bočnog lanca) za prvi spejser, koji, je zatim vezan za drugi spejser, pri čemu drugi spejser sadrži najmanje tri funkcionalne grupe – od kojih su najmanje dve svaka kovalentno vezana za alkil grupu i od kojih je jedna vezana za prvi spejser.

[0100] U ilustrativnim aspektima, pri čemu su alkil grupe uređene u linearnoj formaciji, analog glukagona sadrži jednu acilovanu aminokiselinu (koja je deo peptidne osnove) direktno vezanu za prvu acil grupu, koja, zatim, je vezana za spejser, koji, je zatim vezan za drugu acil grupu.

[0101] Primeri struktura dvostrukih acilovanih jedinjenja su prikazani na Slici 5A.

Hidrofilne grupe i acil grupe

[0102] Peptidni agonist GIP koji sadrži acilovanu aminokiselinu izborno dalje sadrži hidrofilnu grupu. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja hidrofilna grupa sadrži polietilen glikol (PEG) lanac. Ugradnja hidrofilne grupe je postignuta preko bilo kojih pogodnih sredstava, kao što su bilo koji od postupaka koji su ovde opisani. U tom smislu, peptidni agonist GIP može da sadrži SEQ ID NO: 1, uključujući bilo koje od modifikacija koje su ovde opisane, u kojima najmanje jedna od aminokiselina na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17 20 i 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40) je acilovana aminokiselina i najmanje jedna od aminokiselina na položaju 16, 17, 21, 24, ili 29, položaj unutar C-terminalnog produžetka, ili C-terminalna aminokiselina je Cys, Lys, Orn, homo-Cys, ili Ac-Phe, od koje je bočni lanac je kovalentno vezan za hidrofilnu grupu (npr., PEG). U nekim primerima izvođenja, aminokiselina na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 i 37-43 (npr., na jednom ili više položaja 10, 14 i 40)peptida agonista GIP je vezana (izborno preko spejsera) za acil grupu i ta aminokiselina je dalje vezana za hidrofilnu grupu ili je dalje vezana za Cys, Lys, Orn, homo-Cys, ili Ac-Phe, koja je vezana za hidrofilnu grupu.

[0103] Alternativno, acilovani analog glukagona može da sadrži spejser, pri čemu je spejser acilovan i modifikovan tako da sadrži hidrofilnu grupu. Neograničavajući primeri pogodnih spejsera obuhvataju spejser koji sadrži jednu ili više aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od Cys, Lys, Orn, homo-Cys i Ac-Phe.

[0104] U nekim aspektima, peptid agonist GIP u nekim primerima izvođenja su acilovani na istom aminokiselinskom položaju gde je hidrofilna grupa vezana, ili na različitom aminokiselinskom položaju. Neograničavajući primeri obuhvataju acilaciju na položaju 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 40 (npr., na jednom ili više položaja 10, 14 i 40) i pegilaciju na jednom ili više položaja u C-terminalnom delu analoga glukagona, npr., položaju 24, 28 ili 29, unutar C-terminalnog produžetka (npr., 37-43), ili na C-terminusu (npr., preko dodavanja C-terminalnog Cys).

[0105] U nekim specifičnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP koji sadrži acilovanu aminokiselinu nema intramolekularni most, npr., kovalentni intramolekularni most (npr., laktamski most).

AMINOKISELINE KOJE SADRŽE NENATIVNU ALKIL GRUPU

[0106] U skladu sa nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptidi agonisti GIP koji su analozi glukagona (SEQ ID NO: 1) sadrže aminokiselinu koja sadrži nenativnu alkil grupu (ovde označena kao "alkilovana aminokiselina," bez obzira na to kako je pripremljena, npr., ugradnjom prethodno alkilovane aminokiseline u peptid, ili alkilacijom peptida posle sinteze). U nekim ili bilo kojim aspektima, alkilovana aminokiselina je locirana na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, 37, 38, 39, 40, 41, 42, ili 43 (npr., na jednom ili više od položaja 10, 14 i 40). U ilustrativnim aspektima, alkilovana aminokiselina je locirana na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 16, 20, ili 40 ili na bilo kom od položaja 10, 13, 14, 16, 17, ili 40. U ilustrativnim aspektima, alkilovana aminokiselina je locirana na bilo kom od položaja 10, 12, 16, ili 40 ili na bilo kom od položaja 10, 12, ili 16. U ilustrativnim aspektima, alkilovana aminokiselina je locirana na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40.

[0107] Alkilovana aminokiselina u nekim primerima izvođenja uzrokuje da peptid agonist GIP ima jedan ili više od (i) produženog polu-života u cirkulaciji, (ii) odloženog početka aktivnosti, (iii) produženog trajanja aktivnosti, (iv) poboljšane rezistencije na proteaze, kao što je DPP-IV, i (v) povećane potencije na jednom ili više od GIP receptora, GLP-1 receptora, i receptora za glukagon.

Direktna alkilacija

[0108] U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je direktno vezana za aminokiselinu peptida agonista GIP. U skladu sa jednim primerom izvođenja, peptid agonist GIP sadrži alkil grupu koja je vezana za peptid preko etarske, tioetarske ili amin veze.

[0109] U specifičnim aspektima, peptid agonist GIP sadrži alkil grupu posle direktne alkilacije amina, hidroksila ili tiola bočnog lanca aminokiseline peptida agonista GIP. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, alkil grupa je vezana za aminokiselinu peptida agonista GIP reakcijom amina, hidroksila ili tiola sa aktiviranom alkil grupom. Alkil grupe u nekim aspektima su aktivirane sa odlazećom grupom, na primer, halogen, sulfonatni estar, piridiltiol, amonijum so ili fenoksil.

[0110] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, alkilovana aminokiselina je locirana na jednom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 40 (npr., na bilo kom od položaja 10, 14, i 40) ili na jednom od položaja 10, 12 ili 16. U tom smislu, peptid agonist GIP sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1, ili njenu modifikovanu aminokiselinsku sekvencu, koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih midifikacija koje su ovde opisane, pri čemu najmanje jedna od aminokiselina na položajima 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 i 40 (npr., na bilo kom od položaja 10, 14 i 40) je aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca.

[0111] U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca je aminokiselina formule I. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina formule I, je aminokiselina u kojoj n je 4 (Lys) ili n je 3 (Orn). U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca je aromatčna aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca. U ilustrativnim aspektima, aromatična aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca je 4-amino-fenilalanin (4-aminoPhe), p-amino fenilglicin, p-amino homofenilalanin ili 3-amino tirozin. U ilustrativnim aspektima, aromatična aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca je 4-amino-Phe.

[0112] U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca je aminokiselina formule II. U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule II je aminokiselina u kojoj n je 1 (Ser). U ilustrativnim aspektima, aminokiselina formule II je aminokiselina u kojoj n je 2 (homoserin). U sličnim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca je Thr ili homotreonin. U sličnim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca je aromatična aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca. U ilustrativnim aspektima, aromatična aminokiselina koja sadrži hidroksil bočnog lanca je tirozin, homotirozin, metiltirozin, ili 3-amino tirozin.

[0113] U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži tiol bočnog lanca je aminokiselina formule III. U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule III je aminokiselina u kojoj n je 1 (Cys). U nekim ili bilo kojim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule III je kovalentno vezana za alkil grupu, npr., nefunkcionalizovani ili funkcionalizovani ugljenikov lanac. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina je S-palmitil-alkilovana (tj. S-palmitat-alkilovana) u kojoj je atom sumpora Cys ostatka kovalentno vezan za β ugljenik palmitata. U drugim primerima izvođenja, aminokiselina formule III je kovalentno vezana za β ugljenik Cn acetata preko atoma sumpora Cys ostatka, pri čemu je n ceo broj od 4 do 30. Primeri različitih puteva do S-palmitil alkilata su prikazani na Slikama 6 i 7.

[0114] U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca je disusptituisana aminokiselina koja sadrži istu strukturu formule I, formule II, ili formule III, osim što je vodonik vezan za alfa ugljenik aminokiseline formule I, formule II, ili formule III zamenjen drugiom bočnim lancem.

Alkilacioni spejseri

[0115] U alternativnim primerima izvođenja, nenativna alkil grupa je vezana preko spejsera za aminokiselinu peptida agonista GIP, pri čemu je spejser postavljen između aminokiseline peptida agonista GIP i nenativne alkil grupe. U nekim primerima izvođenja, peptid agonist GIP je kovalentno vezan za spejser, koji je kovalentno vezan za nenativnu alkil grupu.

[0116] U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona je modfiikovan tako da sadrži nenativnu alkil grupu alkilacijom amina, hidroksila ili tiola spejsera, pri čemu je spejser vezan za bočni lanac aminokiseline na jednom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom od položaja 10, 14 i 40). U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je vezana za spejser reakcijom amina, hidroksila ili tiola spejsera sa alkil grupom koja ima odlazeću grupu (npr., halogen, sulfonatni estar, piridiltiol, amonijum so, fenoksil).

[0117] Aminokiselina za koji je spejser vezan može biti bilo koja aminokiselina koja sadrži grupu koja dozvoljava vezivanje za spejser. Na primer, aminokiselina koja sadrži NH2, -OH, ili -COOH bočnog lanca (npr., Lys, Orn, Ser, Asp, ili Glu) je pogodna. U tom smislu, alkilovani analog glukagona može da sadrži modifikovanu aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1, koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, sa najmanje jednom od aminokiselina na položajima 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40) modifikovanih do bilo koje aminokiseline koja sadrži amin, hidroksil ili karboksilat bočnog lanca.

[0118] U nekim primerima izvođenja, spejser je aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca, ili dipeptid ili tripeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca. Aminokiselina za koju je vezan spejser može biti bilo aminokiselina (npr., jednostruko ili dvostruko α-supstituisana aminokiselina) koja sadrži grupu koja omogućava vezivanje za spejser. Na primer, aminokiselina koja sadrži NH2, - OH ili –COOH bočnog lanca (npr., Lys, Orn, Ser, Asp, ili Glu) je pogodna. U tom smislu, peptid agonist GIP u nekim aspektima sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1, ili njenu modifikovanu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, pri čemu najmanje jedan od aminokiselina na položajima 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 i 37-43 (npr., na bilo kom od položaja 10, 14 i 40) je aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili karboksilat bočnog lanca.

[0119] U nekim primerima izvođenja, spejser je aminokiselina koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca, ili dipeptid ili tripeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži amin, hidroksil ili tiol bočnog lanca.

[0120] Kada je alkil grupa vezana preko amino grupe spejsera, alkil grupa u nekim aspektima je vezana preko alfa amina ili preko amina bočnog lanca spejser aminokiseline. U nekom slučaju u kome je alkil grupa vezana preko alfa amina, aminokiselina spejsera može biti bilo koja aminokiselina. Na primer, aminokiselina spejsera može biti hidrofobna aminokiselina, npr., Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-amino kapronska kiselina, 5-aminovalerijanska kiselina, 7-aminoheptanska kiselina i 8-aminokaprilna kiselina. Alternativno, u nekim aspektima, aminokiselina spejsera je kiseli ostatak, npr., Asp, Glu, homoglutaminska kiselina, homocisteinska kiselina, cisteinska kiselina, gamaglutaminska kiselina.

[0121] U slučaju u kome je alkil grupa vezana preko amina bočnog lanca aminokiselinskog spejsera, spejser je aminokiselina koja sadrži amin bočnog lanca, npr., aminokiselina formule I (npr., Lys ili Orn). U tom slučaju, moguće je za oba, alfa amin i amin bočnog lanca aminokiseline spejsera da je vezan za alkil grupu, tako da je peptid agonist GIP dialkilovan. Primeri izvođenja otkrića obuhvataju takve dialkilovane molekule. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je vezana za 4-amino-Phe, p-amino fenilglicin, p-amino homofenilalanin, ili 3-amino tirozin.

[0122] Kada je alkil grupa vezana preko hidroksil grupe spejsera, aminokiselina ili jedan od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule II. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Ser. U sličnim ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je vezana za Thr ili homotreonin. U sličnim ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je vezana preko hidroksila aromatične aminokiseline koja sadrži hidroksil bočnog lanca, npr., tirozin, homotirozin, metil-tirozin, ili 3-amino tirozin.

[0123] Kada je alkil grupa vezana preko tiol grupe spejsera, aminokiselina ili jedna od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule III. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Cys. Kada je alkil grupa vezan preko tiol grupe spejsera, aminokiselina ili jedan od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule III. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Cys. U ilustrativnim primerima izvođenja, spejser je Cys ostatak, koji je kovalentno vezan za alkil grupu, npr., nefunkcionalizovani ili funkcionalizovani ugljenikov lanac. U ilustrativnim aspektima, Cys ostatak je alkilovan S-palmitil (tj., alkilovan S-palmitat), izborno, pri čemu je Cys ostatak vezan za Lys ostatakl koji je deo peptidne osnove. U alternativnim primerima izvođenja, spejser je dipeptid koji sadrži Cys ostatak, koji je kovalentno vezan za alkil grupu. U ilustrativnim aspektima, Cys je alkilovan S-palmitil i Cys je vezan za drugu aminokiselinu spejsera, koji je, zatim, vezan za, npr., Lys ostatak koji je deo peptidne osnove.

[0124] U drugim ilustrativnim primerima izvođenja, spejser je bifunkcionalni spejser koji sadrži (i) prvi kraj koji sadrži odlazeću grupu koja reaguje sa alkil grupom koja sadrži amin, hidroksil ili tiol i (ii) drugi kraj koji sadrži funkcionalnu grupu koja reaguje sa bočnim lancem aminokiselina analoga glukagona. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina analoga glukagona je aminokiselina formule I (npr., Lys) ili formule II (npr., Ser) i aminokiselina je funkcionalizovana sa karboksilnom kiselinom ili derivatom karboksilne kiseline. U alternativnim ilustrativnim aspektima, aminokiselina analoga glukagona je aminokiselina formule III i aminokiselina je funkcionalizovana sa haloacetamidom, maleimido ili disulfidom. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina analoga glukagona je aminokiselina koja sadrži karboksilat bočnog lanca, npr., Glu, Asp, funkcionalizovan sa aminom, hidroksilom ili tiolom.

[0125] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, spejser je hidrofilni bifunkcionalni spejser. U ilustrativnim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži dve ili više reraktivnih grupa, npr., amin, hidroksil, tiol i karboksil grupu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U ilustrativnim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži hidroksil grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži amino grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži tiol grupu i karboksilat. U specifičnom primeru izvođenja, spejser sadrži amino poli(alkiloksi)karboksilat. U tom smislu, spejser može da sadrži, na primer, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, gde m je bilo koji ceo broj od 1 do 6 i n je bilo koji ceo broj od 2 do 12, kao što je, npr., 8-amino-3,6-dioksakaprilna kiselina, koja je komercijalno dostupna iz Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

[0126] U ilustrativnim primerima izvođenja, spejser sadrži malu polietilen glikol grupu (PEG) koja sadrži strukturu [-O-CH2-CH2-]n, gde n je ceo broj između 2 i 16, (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16). Takvi mali PEG su ovde označeni kao "miniPEG." U ilustrativnim aspektima, miniPEG je funkcionalizovani miniPEG koji sadrži jednu ili više funkcionalnih grupa. Pogodne funkcionalne grupe obuhvataju, ali bez ograničenja na, amin, hidroksil, tiol i karboksil grupu ili bilo koje njihove kombinacije. U ilustrativnim aspektima, miniPEG je miniPEG kiselina koja sadrži strukturu {[-O-CH2-CH2-]n-COO-}, gde je n definisan kao u prethodnom tekstu. U ilustrativnim aspektima, miniPEG je amido miniPEG koji sadrži strukturu {-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n}, gde je n definisan kao u prethodnom tekstu. U ilustrativnim aspektima, miniPEG je amido miniPEG kiselina koja sadrži strukturu {-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n-COO-}, gde je n definisan kao u prethodnom tekstu. Pogodni reagensi za upotrebu u alkilaciji aminokiseline sa miniPEG su komercijalno dostupni od nabavljača, kao što je Peptides International (Louisville, KY).

[0127] U nekim primerima izvođenja, spejser je hidrofobni bifunkcionalni spejser. Hidrofobni bifunkcionalni spejseri su poznati u stanju tehnike. Videti, npr., Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996). U ilustrativnim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži dve ili više reaktivnih grupa, npr., amin, hidroksil, tiol i karboksil grupu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U ilustrativnim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži hidroksil grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži amino grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži tiol grupu i karboksilat. Pogodni hidrofobni bifunkcionalni spejseri koji sadrže karboksilat i hidroksil grupu ili tiol grupu su poznati u stanju tehnike i obuhvataju, na primer, 8-hidroksikaprilnu kiselinu i 8-merkaptokaprilnu kiselinu.

[0128] U nekim primerima izvođenja, bifunkcionalni spejser nije dikarboksilna kiselina koja sadrži negranati, metilen od 1-7 atoma ugljenika između karboksilatnih grupa. U nekim primerima izvođenja, bifunkcionalni spejser je dikarboksilna kiselina koja sadrži negranati, metilen od 1-7 atoma ugljenika između karboksilatnih grupa.

[0129] Spejser (npr., aminokiselina, dipeptid, tripeptid, hidrofilni bifunkcionalni spejser ili hidrofobni bifunkcionalni spejser) u specifičnim primerima izvođenja je 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma, (npr., 6, 7, 8, 9 ili 10 atoma) u dužinu. U specifičnijim primerima izvođenja, spejser je oko 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma) u dužinu i nenativna alkil grupa je C12do C18alkil, npr., C14alkil, C16alkil, tako da je ukupna dužina spejsera i alkil grupe 14 do 28 atoma, npr., oko 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 atoma. U nekim primerima izvođenja, dužina spejsera i alkil grupe je 17 do 28 (npr., 19 do 26, 19 do 21) atoma.

[0130] U skladu sa nekim ili bilo kojim od gore navedenih primera izvođenja, bifunkcionalni spejser može biti sintetička ili prirodna aminokiselina (uključujući bilo koju od onih koje su ovde opisane) koje sadrže aminokiselinsku osnovu koja je 3 do 10 atoma u dužinu (npr., 6-amino kapronska kiselina, 5-aminovalerijanska kiselina, 7-aminoheptanska kiselina i 8-aminokaprilna kiselina). Alternativno, spejser može biti dipeptidni ili tripeptidni spejser koji ima peptidnu osnovu koja je 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma) u dužinu. Svaka aminokiselina dipeptidnog ili tripeptidnog spejsera može biti ista kao ili različita od druge aminokiseline(a) dipeptida ili tripeptida i može biti nezavisno izabrana iz grupe koja se sastoji od: prirodnih ili kodiranih i/ili nekodiranih aminokiselina ili aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi, uključujući, na primer, bilo koji od D ili L izomera prirodnih aminokiselina (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), ili bilo koji od D ili L izomera aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi ili nekodiranih aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od: β-alanina (β-Ala), N-α-metil-alanina (Me-Ala), aminobuterne kiseline (Abu), γ-aminobuterne kiseline (γ-Abu), aminokapronske kiseline (ε-Ahx), aminoizobuterne kiseline (Aib), aminometilpirol karboksilne kiseline, aminopiperidinkarboksilne kiseline, aminoserina (Ams), aminotetrahidropiran-4-karboksilne kiseline, arginin N-metoksi-N-metil amida, β-asparaginske kiseline (β-Asp), azetidin karboksilne kiseline, 3-(2-benzotiazolil)alanina, α,-terc-butilglicina, 2-amino-5-ureido-nvalerijske kiseline (citrulin, Cit), β-cikloheksilalanin (Cha), acetamidometil-cistein, diaminobuterne kiseline (Dab), diaminopropionske kiseline (Dpr), dihidroksifenilalanina (DOPA), dimetiltiazolidina (DMTA), γ-glutaminske kiseline (γ-Glu), homoserina (Hse), hidroksiprolina (Hyp), izoleucin N-metoksi-N-metil amida, metil-izoleucina (MeIle), izonipekotinske kiseline (Isn), metil-leucina (MeLeu), metil-lizina, dimetil-lizina, trimetillizina, metanoprolina, metionin-sulfoksida (Met(O)), metionin-sulfona (Met(O2)), norleucina (Nle), metil-norleucina (Me-Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), para-aminobenzojeve kiseline (PABA), penicilamina (Pen), metilfenilalanina (MePhe), 4-hlorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 4-nitrofenilalanina (Phe(4-NO2)), 4-cijanofenilalanina ((Phe(4-CN)), fenilglicina (Phg), piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3,4-dehidroprolina, pirolidinilalanina, sarkozina (Sar), selenocisteina (Sec), O-benzil-fosfoserina, 4-amino-3-hidroksi-6-metilheptanske kiseline (Sta), 4-amino-5-cikloheksil-3-hidroksipentanske kiseline (ACHPA), 4-amino-3-hidroksi-5-fenilpentanske kiseline (AHPPA), 1,2,3,4,-tetrahidroizohinolin-3-karboksilne kiseline (Tic), tetrahidropiranglicina, tienilalanina (Thi ili Tio Ala), O-benzil-fosfotirozina, O-fosfotirozina, metoksitirozina, etoksitirozina, O-(bis-dimetilaminofosfono)-tirozina, tirozin sulfat tetrabutilamina, metil-valina (MeVal) i alkilovane 3-merkaptopropionske kiseline. U ilustrativnim aspektima, spejser je Cys ostatak.

[0131] U nekim primerima izvođenja, spejser sadrži ukupno negativno naelektrisanje, npr., sadrži jednu ili dve negativno naleketrisane aminokiseline. U nekim primerima izvođenja, dipeptid nije bilo koji od dipeptida opšte strukture A-B, gde je A izabran iz grupe koja se sastoji od Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe i Pro, gde je B izabran iz grupe koja se sastoji od Lys, His, Trp. U nekim primerima izvođenja, aminokiseline dipeptidnog spejsera su izabrane iz grupe koja se sastoji od: Ala, β-Ala, Leu, Pro, γ-aminobuterne kiseline, Glu i γ-Glu.

[0132] U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži alkil grupu posle alkilacije amina, hidroksila ili tiola spejsera, koji spejser je vezan za bočni lanac aminokiseline na položaju 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43, (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40), ili na C-terminalnoj aminokiselini peptida agonista GIP.

[0133] U specifičnijim primerima izvođenja, alkil grupa je vezana za aminokiselinu na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više položaja 10, 14 i 40), peptida analoga i dužina spejsera i alkil grupe je 14 do 28 atoma. Aminokiselina na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43, (npr., na bilo kom ili više položaja 10, 14 i 40), u nekim aspektima, je aminokiselina formule I, npr., Lys, ili disusptituisana aminokiselina vezana za formulu I. U specifičnijim primerima izvođenja, peptidni analog nema intramolekularni most, npr., kovalentni intramolekularni most. Analog glukagona, na primer, može biti analog glukagona koji sadrži jednu ili više alfa, alfadisusptituisanih aminokiselina, npr., AIB, za stabilizaciju alfa spirale analoga.

Alkil grupe

[0134] Nenativna alkil grupa alkilovane aminokiseline može biti bilo koje veličine, npr., ugljenikov lanac bilo koje dužine, i može biti linearan ili granat. U nekim specifičnim primerima izvođenja, alkil grupa je C4do C30alkil. Na primer, alkil grupa može biti bilo koja od C4alkil, C6alkil, C8alkil, C10alkil, C12alkil, C14alkil, C16alkil, C18alkil, C20alkil, C22alkil, C24alkil, C26alkil, C28alkil, ili C30alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8do C20alkil, npr., C12do C18alkil, C14alkil ili C16alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je C16do C30alkil, npr., C20do C28alkil, C16do C22alkil.

[0135] U ilustrativnim primerima izvođenja, nenativna alkil grupa alkilovane aminokiseline je funkcionalizovanui linearni ili granati ugljenikov lanac bilo koje dužine. U nekim specifičnim primerima izvođenja, ugljenikov lanac je C4do C30alkil. Na primer, alkil grupa može biti bilo koja od C4alkil, C6alkil, C8alkil, C10alkil, C12alkil, C14alkil, C16alkil, C18alkil, C20alkil, C22alkil, C24alkil, C26alkil, C28alkil, ili C30alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8do C20alkil, npr., C12do C18alkil, C14alkil ili C16alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, alkil grupa je C16do C30alkil, npr., C20do C28alkil, C16do C22alkil. U ilustrativnim aspektima, funkcionalizovani ugljenkov lanac sadrži funkcionalnu grupu, uključujući karboksi, sulfhidril, amin, ketil, sulfoksil ili amido.

[0136] U ilustrativnim primerima izvođenja, nenativna alkil grupa je karboksifunkcionalizovani ugljenikov lanac strukture -Cx-COOH, gde je x ceo broj, izborno ceo broj između 4-30 (npr., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30), pri čemu, karboksi ugljenik je alfa ugljenik i svaki od ugljenika od Cx su označeni beta, gama, delta, epsilon, itd., pri čemu je beta ugljenik vezan za alfa ugljenik. Na primer, gde, kada je x jednako 4, nenativna alkil grupa bi bila označena kao što sledi: Cε-Cδ-CγCβ-CαOOH. U ilustrativnim primerima izvođenja, karboksi-funkcionalizovani ugljenikov lanac je vezan preko ugljenika osim karboksi ugljenika, tj., jednog od ugljenika od Cx. U ilustrativnim aspektima, karboksi-funkcionalizovani ugljenikov lanac je vezan preko beta, gama, delta, ili epsilon ugljenika karboksi-funkcionalizovano ugljenikovog lanca za bočni lanac alkilovane aminokiseline. U alternativnim primerima izvođenja, karboksifunkcionalizovan ugljenikov lanac je vezan preko beta, gama, delta ili epsilon ugljenika karboksi-funkcionalizovanog ugljenikovog lanca za bočni lanac spejsera, pri čemu je taj spejser vezan za alkilovanu aminokiselinu. U ilustrativnim aspektima, karboksifunkcionalizovani ugljenikov lanac je vezan preko beta ugljenika karboksifunkcionalizovanog ugljenikovog lanca za bočni lanac alkilovane aminokiseline. U alternativnim primerima izvođenja, karboksi-funkcionalizovani ugljenikov lanac je vezan preko beta ugljenika karboksi-funkcionalizovanog ugljenikovog lanca za bočni lanac spejsera, pri čemu je taj spejser vezan za alkilovanu aminokiselinu.

Postupci vezivanja alkil grupe

[0137] Postupci za vezivanje alkil grupe za aminokiselinu su prikazani u stanju tehnike. Na primer, alkil grupe aktivirane sa odlazećom grupom mogu da reaguju sa aminokiselinom koja sadrži nukleofilni bočni lanac, npr., bočni lanac koji sadrži amin, hidroksil ili tiol. Odlazeća grupa u ilustrativnim aspektima je halogen, sulfonatni estar, piridiltiol, amonijum so ili fenoksil.

[0138] U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja se vezuje za alkil grupu je Cys ostatak i atom sumpora je alkilovan, npr., "S-alkilovan." U ilustrativnim primerima izvođenja, sumpor u Cys je reagovao sa odlazećom grupom alkil grupe koja sadrži karboksifunkcionalizovan ugljenikov lanac strukture -Cx-COOH, gde je x ceo broj, izborno ceo broj između 4 - 30 (npr., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30), pri čemu, karboksi ugljenik je alfa ugljenik i svaki od ugljenika Cx su označeni kao beta, gama, delta, epsilon, itd., pri čemu je beta ugljenik vezan za alfa ugljenik. Na primer, pri čemu, kada je x jednako 4, nenativna alkil grupa bi bila označena kao što sledi: Cε-Cδ-CγCβ-CαOOH. U ilustrativnim primerima izvođenja, karboksi-funkcionalizovani ugljenikov lanac je vezan preko ugljenika osim karboksi ugljenika, tj., jedan od ugljenika od Cx. U ilustrativnim aspektima, karboksi-funkcionalizovani ugljenikov lanac je vezan preko beta, gama, delta, ili epsilon ugljenika karboksi-funkcionalizovanog ugljenikovog lanca za bočni lanac alkilovane aminokiseline. U alternativnim primerima izvođenja, karboksifunkcionalizovani ugljenikov lanac je vezan preko beta, gama, delta, ili epsilon ugljenika karboksi-funkcionalizovanog ugljenikovog lanca za bočni lanac spejsera, pri čemu je taj spejser vezan za alkilovanu aminokiselinu. U ilustrativnim aspektima, karboksifunkcionalizovani ugljenikov lanac je vezan preko beta ugljenika karboksifunkcionalizovanog ugljenikovog lanca za bočni lanac alkilovane aminokiseline. U alternativnim primerima izvođenja, karboksi-funkcionalizovan ugljenikov lanac je vezan preko beta ugljenika karboksi-funkcionalizovanog ugljenikovog lanca za bočni lanac spejsera, pri čemu je taj spejser vezan za alkilovanu aminokiselinu.

[0139] U ilustrativnim aspektima, odlazeća grupa je halogen, kao što je jod, brom, hlor ili fluor, sulfonatni estri kao što su su tozilat, triflati ili fluorosulfonati, piridiltiol, amonijum so, diazonijum so, nitrati, fosfati ili fenoksil.

[0140] U specifičnim aspektima, alkil grupa sadrži odlazeću grupu joda i karboksifunkcionalizovani ugljenikov lanac koji sadrži ukupno 16 ugljenika (uključujući ugljenik karboksilata). Alkilacija sa jodo-karboksilnom kiselinom može biti označena kao "S-palmitil alkilacija" koja je sinonim sa "alkilacijom S-palmitata." Dodatno ilustrovanje S-palmitil alkilacije je ovde obezbeđeno u Primerima 1 i 20.ž

Dodatne alkil grupe

[0141] Peptid u nekim aspektima sadrži alkilovanu aminokiselinu na položaju osim položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više položaja 10, 14 i 40).

Lokacija alkilovane aminokiseline može biti bilo koji položaj unutar peptida agonista GIP, uključujući bilo koje položaje 1-29, položaj C-terminalan prema 29. aminokiselini (npr., aminokiselina na položaju 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 44, 45, 46, 47, itd., na položaju unutar C-terminalnog produžetka ili na C-terminusu), izborno zajedno sa drugom alkilovanom aminokiselinom na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40), uz uslov da je aktivnost agonista GIP peptida analoga zadržana, ako ne pojačana. Neograničavajući primeri obuhvataju položaje 5, 7, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28, ili 29.

[0142] U skladu sa gore navedenim, analog glukagona, u ilustrativnim aspektima, sadrži dve (ili više) alkilovanih aminokiselina. U ilustrativnim aspektima, sve od alkilovanih aminokiselina su locirane na dva položaja od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40). U ilustrativnim aspektima, peptid koji sadrži prvu alkilovanu aminokiselinu na položaju 10 i drugu alkilovanu aminokiselinu na položaju 40.

[0143] U dodatnim ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži dodatne alkil grupe vezane za jednu aminokiselinu peptidne osnove. Dve (ili više) alkil grupa mogu biti ista alkil grupa ili različite alkil grupe, uređene u granatoj ili linearnoj formaciji. Na primer, da bi se postigla granata formacija, analog glukagona može da sadrži jednu alkilovanu aminokiselinu (koja je deo peptidne osnove) vezanu za spejser koji sadrži najmanje tri funkcionalne grupe – od kojih su najmanje dve svaka kovalentno vezane za alkil i od kojih je jedna vezana za alkilovanu aminokiselinu peptidne osnove. U ilustrativnim aspektima, granata formacija može biti postignuta preko, npr., Lys ostatka koji sadrži dve amino grupe (amin bočnog lanca i alfa amin) za direktno vezivanje za masnu alkil grupu ili indirektno vezivanje za masnu alkil grupu preko spejsera. U ilustrativnim aspektima, dodatni spejser može biti postavljen između aminokiseline peptidne osnove i spejsera koji sadrži najmanje tri funkcionalne grupe. Na primer, aminokiselina peptidne osnove može biti vezana (npr., preko njenog bočnog lanca) za prvi spejser, koji, zauzvrat, je vezan za drugi spejser, pri čemu drugi spejser sadrži najmanje tri funkcionalne grupe – od kojih su najmanje dve svaka kovalentno vezane za alkil grupu i od kojih je jedna vezana za prvi spejser.

[0144] U ilustrativnim aspektima, gde su alkil grupe uređene u linearnoj formaciji, analog glukagona sadrži jednu alkilovanu aminokiselinu (koja je deo peptidne osnove) direktno vezanu za prvu alkil grupu, koja, je zauzvrat, vezana za spejser, koji, je zauzvrat, vezan za drugu alkil grupu.

[0145] Ilustrativne strukture dvostrukih alkilovanih jedinjenja se mogu izvesti iz dvostrukih acilovanih jedinjenja prikazanih na Slici 5A.

Hidrofilne grupe i alkil grupe

[0146] Peptidi agonisti GIP koji sadrže alkilovanu aminokiselinu izborno dalje sadrži hidrofilnu grupu. U nekim specifičnim primerima izvođenja hidrofilna grupa sadrži polietilen glikol (PEG) lanac. Ugradnja hidrofilne grupe u nekim aspektima je postignuta preko bilo kojih pogodnih načina, kao što je bilo koji od postupaka koji su ovde opisani. U tom smislu, peptid agonist GIP može da sadrži SEQ ID NO: 1, uključujući bilo koju od modifikacija koje su ovde opisane, u kojima najmanje jedan od aminokiselina na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 i 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40) peptida agonista GIP sadrži alkil grupu i najmanje jedna od aminokiselina na položaju 16, 17, 21, 24, ili 29, položaju unutar C-terminalnog produžetka, ili C-terminalna aminokiselina je Cys, Lys, Orn, homo-Cys, ili Ac-Phe, čiji je bočni lanac kovalentno vezan za hidrofilnu grupu (npr., PEG). U nekim primerima izvođenja, aminokiselina na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 i 37-43 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40) peptida agonist GIP je vezana (izborno preko spejsera) za alkil grupu i ta aminokiselina je dalje vezana za hidrofilnu grupu ili je dalje vezana za Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, koja je vezana za hidrofilnu grupu.

[0147] Alternativno, alkilovani analog glukagona može da sadrži spejser, pri čemu je spejser i alkilovan i modifikovan tako da sadrži hidrofilnu grupu. Neograničavajući primeri pogodnih spejsera obuhvataju spejser koji sadrži jednu ili više aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od Cys, Lys, Orn, homo-Cys i Ac-Phe.

[0148] U nekim aspektima, peptidi agonisti GIP u nekim primerima izvođenja su alkilovani na istom aminokiselinskom položaju gde je hidrofilna grupa vezana, ili na različitom aminokiselinskom položaju. Neograničavajući primeri obuhvataju alkilaciju na položaju 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, ili 40 (npr., na bilo kom ili više od položaja 10, 14 i 40) i pegilaciju na jednom ili više položaja u C-terminalnom delu analoga glukagona, npr., položaju 24, 28 ili 29, unutar C-terminalnog produžetka (npr., 37-43), ili na C-terminusu (npr., preko dodavanja C-terminalnog Cys).

Dodatni primeri izvođenja alkil grupe

[0149] U specifičnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP koji sadrži alkilovanu aminokiselinu nema intramolekularni most, npr., kovalentni intramolekularni most (npr., laktamski most).

STABILIZACIJA ALFA SPIRALE I AMINOKISELINE KOJE STABILIZUJU ALFA SPIRALU

[0150] Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, peptidi agonisti GIP koji su analozi glukagona sadrže spiralnu strukturu, npr., alfa spiralu. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži aminokiseline koje stabilizuju alfa spiralnu strukturu. Prema tome, u nekim aspektima, peptid agonist GIP sadrži jednu ili više aminokiselina koje stabilizuju alfa spiralu. Kao što je ovde korišćen, termin "aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu" je korišćen naizmenično sa terminom "aminokiselina koja stabilizuje spiralu" i označava aminokiselinu koja obezbeđuje povećanu stabilnost na alfa spiralu peptida agonista GIP od koga je deo. Aminokiseline koje stimulišu alfa spiralu su poznate u stanju tehnike. Videti, na primer, Lyu et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 88: 5317-5320 (1991); Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, New York, NY, 1991; Fasman, Prediction of Protein Structure i the Principles of Protein Conformation, ed. Fasman, Plenum, NY, 1989). Pogodne aminokiseline koje stimulišu alfa spiralu za svrhe navedene ovde obuhvataju, ali bez ogranićenja na: alanin, norvalin, norleucin, alfa aminobuternu kiselinu, alfa-aminoizobuternu kiselinu (AIB), leucin, izoleucin, valin i slično. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je bilo aminokiselina koja je deo alfa spirale koja se nalazi u prirodnom proteinu, npr., Leu, Phe, Ala, Met, Gly, Ile, Ser, Asn, Glu, Asp, Lys, Arg.

[0151] U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu obezbeđuje više stabilnosti alfa spirali u poređenju sa glicinom ili alaninom. U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je alfa, alfa disupstituisana aminokiselina, npr., AIB.

Alfa spirala: Položaj aminokiselina koje stimulišu alfa spiralu

[0152] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja predmetnih otkrića, peptid agonist GIP sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je slična nativnom glukagonu (SEQ ID NO: 1) i peptid agonist GIP sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja stimuliše spiralu na jednom ili više položaja 16-21 peptida analoga (npr., jedan ili više položaja 16, 17, 18, 19, 20, 21). U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid analog sadrži aminokiselinu koja stimuliše alfa spiralu na jednom, dva, tri ili sve od položaja 16, 17, 20 i 21.

Alfa spirala: alfa, alfa di-supstituisane aminokiseline

[0153] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je alfa,alfa di-supstituisana aminokiselina. U specifičnim primerima izvođenja, alfa, alfa disupstituisana aminokiselina sadrži R<1>i R<2>, od kojih je svaki vezan za alfa ugljenik, pri čemu je svaki od R<1>i R<2>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od C1-C4alkila, izborno supstituisanog sa hidroksil, amid, tiol, halo, ili R<1>i R<2>zajedno sa alfa ugljenikom za koji su vezani formiraju prsten (npr., C3-C8prsten). U ilustrativnim primerima izvođenja, svaki od R<1>i R<2>je izabran iz grupe koja se sastoji od: metil, etil, propil i n-butil, ili R<1>i R<2>zajedno formiraju ciklooktan ili cikloheptan (npr., 1-aminociklooktan-1-karboksilna kiselina). U ilustrativnim primerima izvođenja, R<1>i R<2>su isti. U drugim primerima izvođenja, R<1>je različit od R<2>. U ilustrativnim aspektima, svaki od R<1>i R<2>je C1-C4alkil. U nekim aspektima, svaki od R<1>i R<2>je C1ili C2alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, svaki od R<1>i R<2>je metil, tako da alfa, alfa disupstituisana aminokiselina je alfa-aminoizobuterna kiselina (AIB). U drugim ilustrativnim primerima izvođenja, alfa, alfa disupstituisana aminokiselina je ACPC.

[0154] U nekim aspektima, peptid agonist GIP koji je ovde opisan sadrži jednu ili više alfa, alfa di-supstituisanih aminokiselina i peptid agonist GIP specifično nema kovalentni intramolekularni most (npr., laktam), s obziriom na to da je alfa, alfa disupstituisana aminokiselina sposobna za stabilizaciju alfa spirale u odsustvu kovalentnog mosta. U nekim aspektima, peptid agonist GIP sadrži jednu ili više alfa, alfa di-supstituisanih aminokiselina na C-terminusu (oko položaja 12-29). U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, jedan, dva, tri, četiri ili više položaja 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 ili 29 ili, jedan, dva, tri, četiri, pet ili svi od položaja 16, 17, 18, 19, 20, ili 21 peptida agonista GIP je supstituisan sa α, α-disupstituisanom aminokiselinom, npr., amino izo-buternom kiselinom (AIB), aminokiselinom disupstituisanom sa istom ili različitom grupom izabranom od metil, etil, propil i n-butil, ili sa ciklooktanom ili cikloheptanom (npr., 1-aminociklooktan-1-karboksilnom kiselinom). Na primer, supstitucija položaja 20 sa AIB pojačava aktivnost GIP, u odsustvu intramolekularnog mosta, npr., nekovalentnog intramolekularnog mosta (npr., mosta soli) ili kovalentnog intramolekularnog mosta (npr., laktama). U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, jedan, dva, tri ili više od položaja 16, 20, 21 ili 24 su supstituisani sa AIB. U ilustrativnim primerima izvođenja, jedna, dve ili sve od aminokiselina koje odgovaraju položajima 2, 16 i 20 nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1) supstituisane sa alfa, alfa disupstituisanom aminokiselinom kao što je AIB. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži AIB na položajima 2 i 16 ili na položajima 2 i 20. U drugim ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži D-Ser na položaju 2 i AIB na položaju 16 ili položaju 20.

Alfa spirala: intramolekularni mostovi

[0155] U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je aminokiselina koja je vezana za drugu aminokiselinu peptida agonista GIP preko intramolekularnog mosta. U takvim primerima izvođenja, svaka od ove dve aminokiseline vezane preko intramolekularnog mosta smatra se aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži jedan ili dva intramolekularna mosta. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži jedan intramolekularni most u kombinaciji sa najmanje jednom drugom aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu, npr., alfa, alfa-disupstituisanom aminokiselinom.

[0156] U nekim primerima izvođenja, intramolekularni most je most koji povezuje dva dela peptida agonista GIP preko nekovalentnih veza, uključujući, na primer, van der Waals-ove interakcije, vodonične veze, jonske veze, hidrofobne interakcije, dipol-dipol interakcije i slično. U tom smislu, analog glukagona sadrži nekovalentni intramolekularni most. U nekim primerima izvođenja, nekovalentni intramolekularni most je most soli.

[0157] U nekim primerima izvođenja, intramolekularni most je most koji povezuje dva dela peptida agonista GIP preko kovalentnih veza. U tom smislu, peptid agonist GIP sadrži kovalentni intramolekularni most.

[0158] U nekim primerima izvođenja, intramolekularni most (npr., nekovalentni intramolekularni most, kovalentni intramolekularni most) je formiran između dve aminokiseline koje su udaljene za 3 aminokiseline, npr., aminokiseline na položajima i i i+4, gde je i ceo broj između 12 i 25 (npr., 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 i 25). Naročito, bočni lanci aminokiselinskih parova 12 i 16, 16 i 20, 20 i 24 ili 24 i 28 (aminokiselinski parovi u kojima je i = 12, 16, 20, ili 24) su vezani međusobno i na taj način stabilizuju alfa spiralu. Alternativno, i može biti 17. U nekim specifičnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži intramolekularni most između aminokiselina 17 i 21. U nekim specifičnim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži intramolekularni most između aminokiselina na položajima 16 i 20 ili 12 i 16 i drugi intramolekularni most između aminokiselina na položajima 17 i 21. Ovde su razmatrani peptidi agonisti GIP koji sadrže jedan ili više intramolekularnih mostova. U specifičnim primerima izvođenja, gde su aminokiseline na položajima i i i+4 spojene intramolekularnim mostom, veličina linkera je oko 8 atoma, ili oko 7-9 atoma.

[0159] U drugim primerima izvođenja, intramolekularni most je formiran između dve aminokiseline koje su udaljene za dve aminokiseline, npr., aminokiseline na položajima j i j+3, gde je j bilo koji ceo broj između 12 i 26 (npr., 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 i 26). U nekim specifičnim primerima izvođenja, j je 17. U specifičnim primerima izvođenja, gde su aminokiseline na položajima j i j+3 spojene intramolekularnim mostom, veličina linkera je oko 6 atoma, ili oko 5 do 7 atoma.

[0160] U drugim primerima izvođenja, intramolekularni most je formiran između dve aminokiseline koje su udaljene za 6 aminokiselina, npr., aminokiseline na položajima k i k+7, gde je k bilo koji ceo broj između 12 i 22 (npr., 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 i 22). U nekim specifičnim primerima izvođenja, k je 12, 13, ili 17. U ilustrativnom primeru izvođenja, k je 17.

Alfa spirala: Aminokiseline uključene u intramolekularne mostove

[0161] Primeri aminokiselinskih parova koji su sposobni za vezivanje (kovalentno ili nekovalentno) tako da se formira vezujući most od šest atoma obuhvataju Orn i Asp, Glu i aminokiselinu formule I, gde je n jednako 2, i homoglutaminsku kiselinu i aminokiselinu formule I, gde je n jednako 1, gde je formula I jednaka:

gde je n = 1 do 4

[Formula I]

[0162] Primeri aminokiselinskih parova koji su sposobni za vezivanje tako da formiraju vezujući most od sedam atoma obuhvataju Orn-Glu (laktamski prsten); Lys-Asp (laktam); ili Homoser-Homoglu (lakton). Primeri aminokiselinskih parova koji mogu da formiraju linker od osam atoma obuhvataju Lys-Glu (laktam); Homolys-Asp (laktam); Orn-Homoglu (laktam); 4-aminoPhe-Asp (laktam); ili Tyr-Asp (lakton). Primeri aminokiselinskih parova koji mogu da formiraju linker od devet atoma obuhvataju Homolys-Glu (laktam); Lys-Homoglu (laktam); 4-aminoPhe-Glu (laktam); ili Tyr-Glu (lakton). Bilo koji od bočnih lanaca na ovim aminokiselinama mogu dodatno biti supstituisani dodatnim hemijskim grupama, sve dok trodimenzionalna struktura alfa spirale nije prekinuta. Stručnjak iz date oblasti tehnike može da predvidi alternativne parove ili alternativne aminokiselinske analoge, uključujući hemijski modifikovane derivate, koji bi stvorili stabilizujuću strukturu slične veličine i željeni efekat. Na primer, homocistein-homocistein disulfidni most je 6 atoma u dužinu i može biti dalje modifikovan da bi se obezbedio željeni efekat.

[0163] Čak bez kovalentne veze, aminokiselinski parovi koji su opisani u prethodnom tekstu (ili slični parovi koje stručnjak iz date oblasti tehnike može da predvidi) mogu takođe da obezbede stabilnost alfa spirali preko nekovalentnih veza, na primer, preko formiranja mostova soli ili interakcija vodoničnih veza. Prema tome, mostovi soli mogu biti formirane između: Orn i Glu; Lys i Asp; Homo-serina i Homo-glutamata; Lys i Glu; Asp i Arg; Homo-Lys i Asp; Orn i Homo-Glutamata; 4-aminoPhe i Asp; Tyr i Asp; Homo-Lys i Glu; Lys i Homo-Glu; 4-aminoPhe i Glu; ili Tyr i Glu. U nekim primerima izvođenja, analog sadrži most soli između bilo kog od sledećih parova aminokiselina: Orn i Glu; Lys i Asp; Lys i Glu; Asp i Arg; Homo-Lys i Asp; Orn i Homo-Glutamata; Homo-Lys i Glu; i Lys i Homo-Glu. Mostovi soli mogu biti formirani između drugih parova suprotno naelektrisanih bočnih lanaca. Videti, npr., Kallenbach et al., Role of the Peptide Bond in Protein Structure i Folding, in The Amide Linkage: Structural Significance in Chemistry, Biochemistry, i Materials Science, John Wiley & Sons, Inc. (2000).

[0164] U nekim primerima izvođenja, nekovalentni intramolekularni most je hidrofobni most. U skladu sa jednim primerom izvođenja, alfa spirala analoga je stabilizovana preko ugradnje hidrofobnih aminokiselina na položajima j i j+3 ili i i i+4. Na primer, i može biti Tyr i i+4 može biti Val ili Leu; i može biti Phe i i+4 može biti Met; ili i može biti Phe i i+4 može biti Ile. Trebalo bi razumeti da, za svrhe koje su ovde navedene, gore navedeni aminokiselinski parovi mogu biti obrnuti, tako da bi naznačena aminokiselina na položaju i mogla alternativno biti locirana na i+4, dok i+4 aminokiselina može biti locirana na i položaju. Trebalo bi razumeti da pogodni aminokiselinski parovi mogu biti fomirani za j i j+3.

Alfa spirala: Kovalentni intramolekularni most

[0165] U nekim primerima izvođenja, kovalentni intramolekularni most je laktam prsten ili laktam most. Veličina laktam prstena može da varira u zavisnosti od dužine bočnih lanaca aminokiseline, i u jednom primeru izvođenja laktam je formiran vezivanjem bočnih lanaca ornitina za bočni lanac asparaginske kiseline. Laktam mostovi i postupci za pripremu istih su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Houston, Jr., et al., J Peptide Sci 1: 274-282 (2004), i Primer 1 ovde. U nekim primerima izvođenja, analog sadrži modifikovanu sekvencu od SEQ ID NO: 1 i laktam most između i i i+4, gde je i kao što je definisano ovde u prethodnom tekstu. U nekim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži dva laktamska mosta: jedan između aminokiselina na položajima 16 i 20 i drugi između aminokiselina na položajima 17 i 21. U nekim primerima izvođenja, peptid agonist GIP sadrži jedan laktamski most i jedan most soli. Dodatni ilustrativni primeri izvođenja, su ovde opisani u delu pod naslovom "PRIMERI." Dodatni ilustrativni primeri izvođenja obuhvataju sledeće parove, izborno sa laktamskim mostom: Glu na položaju 12 sa Lys na položaju 16; nativni Lys na položaju 12 sa Glu na položaju 16; Glu na položaju 16 sa Lys na položaju 20; Lys na položaju 16 sa Glu na položaju 20; Glu na položaju 20 sa Lys na položaju 24; Lys na položaju 20 sa Glu na položaju 24; Glu na položaju 24 sa Lys na položaju 28; Lys na položaju 24 sa Glu na položaju 28.

[0166] U nekim primerima izvođenja, kovalentni intramolekularni most je lakton. Pogodni postupci za pripremu laktonskog mosta su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Sheehan et al., J Am Chem Soc 95: 875-879 (1973).

[0167] U nekim aspektima, olefin metateza je korišćena za unakrsno vezivanje jednog ili dva navoja alfa spirale analoga upotrebom sve-ugljovodoničnog unakrsno vezujućeg sistema. Peptid agonist GIP u ovom slučaju sadrži α-metilovane aminokiseline koje nose olefiniske bočne lance različite dužine i konfigurisane sa R ili S stereohemijom na j i j+3 ili i i i+4 položajima. U nekim primerima izvođenja, olefinski bočni lanac sadrži (CH2)n, gde je n bilo koji ceo broj između 1 do 6. U nekim primerima izvođenja, n je 3 za dužinu unakrsne veze od 8 atoma. U nekim primerima izvođenja, n je 2 za dužinu unakrsne veze od 6 atoma. Pogodni postupci za formiranje takvih intramolekularnih mostova su opisani u stanju tehnike. Videti, na primer, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) i Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004). U alternativnim primerima izvođenja, analog sadrži O-alil Ser ostatke locirane na susednim navojima spirale, koji su premošćeni zajedno preko rutenijumom-katalizovane metateze koja zatvara prsten. Takvi postupci unakrsnog vezivanja su opisani u, na primer, Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed.37: 3281-3284 (1998).

[0168] U specifičnim aspektima, upotreba neprirodne tio-dialanin aminokiseline, lantionina, koja je široko prihvaćena kao peptidomimetik cistina, je korišćena za unkrsno vezivanje jednog navoja alfa spirale. Pogodni postupci ciklizacije na bazi lantionina su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman i Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996); i Osapay i Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993).

[0169] U nekim primerima izvođenja, α, ω-diaminoalkan teteri, npr., 1,4-diaminopropan i 1,5-diaminopentan) između dva Glu ostatka na položaju i i i+7 su korišćeni za stabilizaciju alfa spirale analoga. Takvi lanci dovode do formiranja mosta od 9-atoma ili više u dužinu, u zavisnosti od dužine diaminoalkan lanca. Pogodni postupci za proizvodnju peptida unakrsno vezanih sa takvim lancima su opisani u stanju tehnike. Videti, na primer, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc.119: 455-460 (1997).

[0170] U drugim primerima izvođenja, disulfidni most je korišćen za unakrsno vezivanje jednog ili dva navoja alfa spirale analoga. Alternativno, modifikovani disulfidni most u kome su jedan ili oba atoma sumpora zamenjeni metilenskom grupom što rezultuje u izosternoj makrociklizaciji je korišćen za stabilizaciju alfa spirale analoga. Pogodni postupci za modifikaciju peptida sa disulfidnim mostovima ili ciklizacija na bazi sumpora opisani su u, na primer, Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991) i Rudinger i Jost, Experientia 20: 570-571 (1964).

[0171] U drugim primerima izvođenja, alfa spirala analoga je stabilizovana preko vezivanja atoma metala sa dva His ostatka ili His i Cys parom koji se nalazi na j i j+3, ili i i i+4. Atom metala može biti, na primer, Ru(III), Cu(II), Zn(II), ili Cd(II). Takvi postupci stabilizacije alfa spirale na bazi vezivanja metala poznati su u stanju tehnike. Videti, na primer, Andrews i Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); i Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc.119: 9063-9064 (1997).

[0172] Alfa spirala peptida agonista GIP može alternativno biti stabilizovana preko drugih načina ciklizacije peptida, pri čemu su ti načini prikazani u Davies, J. Peptide. Sci.9: 471-501 (2003). Alfa spirala može biti stabilizovana preko formiranja amidnog mosta, tioetarskog mosta, tioestarskog mosta, urea mosta, karbamatnog mosta, sulfonamidnog mosta, i slično. Na primer, tioestarski most može biti formiran između C-terminusa i bočnog lanca Cys ostatka. Alternativno, tioestar može biti formiran preko bočnih lanaca aminokiselina koje imaju tiol (Cys) i karboksilnu kiselinu (npr., Asp, Glu). U sledećem postupku, sredstvo za unakrsno vezivanje, kao što je dikarboksilna kiselina, npr., suberinska kiselina (oktandioinska kiselina), itd. može da uvede vezu između dve funkcionalne grupe aminokiselinskog bočnog lanca, kao što je slobodna amino, hidroksil, tiol grupa i njihove kombinacije.

DODATNI OPISI

[0173] U daljem tekstu su dati dodatni opisi analoga glukagona predmetnih otkrića. Kao što je ovde razmatrano, položaj aminokiseline u opisima u daljem tekstu je označen u odnosu na aminokiselinsku numeraciju od SEQ ID NO: 1. Takođe, dok su opisi u daljem tekstu razmatrani u vezi sa nativnim humanim glukagonom (SEQ ID NO: 1), npr., modifikacije od SEQ ID NO: 1, ovi opisi neophodno ne ukazuju na to (i) da su takve modifikacije prisutne u svim od sada otkrivenih peptida i (ii) da je jedini postupak za pripremu sada otkrivenih peptida je početi sa nativnim humanim glukagonom i modifikovati tu sekvencu. Radije, opisi su obezbeđeni da bi opisali neke primere izvođenja analoga glukagona predmetnih otkrića, i peptidi predmetnih otkrića mogu biti pripremljeni de novo bez upotrebe nativnog humanog glukagona kao početni materijal, kao što je dalje opisano u delu pod naslovom "POSTUPCI ZA PRIPREMU PEPTIDA."

Položaji 1 i 2

[0174] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 1, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu koja nije His na položaju 1. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži veliku, aromatičnu aminokiselinu na položaju 1. U ilustrativnim primerima izvođenja, velika, aromatična aminokiselina je Tyr, Phe, Trp, amino-Phe (npr., 4-amino-Phe), hloro-Phe, sulfo-Phe, 4-piridil-Ala, metil-Tyr, ili 3-amino-Tyr.

[0175] U drugim ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinu koja sadrži imidazol bočni lanac na položaju 1. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 1 sadrži strukturu formule A:

[Formula A]

gde je svaki od R<1>i R<2>nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H, (C1-6)alkila, O(C1-6)alkila, (C1-6)alkil-OH, F i (C1-C6)alkila od kojih je najmanje jedan H zamenjen sa F.

[0176] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 1 je nativni ostatak glukagona (SEQ ID NO: 1) L-histidin (His), ili je derivat od His (His derivat), npr., derivat od His u kome su alfa atomi modifikovani. His derivativ u ilustrativnim aspektima je D-histidin, dezaminohistidin, hidroksil-histidin, acetil-histidin, homohistidin, N-metil histidin, alfa-metil histidin, imidazol sirćetna kiselina ili alfa, alfa-dimetil imidiazol sirćetna kiselina (DMIA).

[0177] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 1 sadrži analog strukture formule A, gde su jedan ili oba od azota prstena vezani za C1-C3alkil.

[0178] U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 1 je DPP-IV zaštitna aminokiselina, kao što je ovde opisana. Kao što je ovde korišćen, termin "DPP-IV zaštitna aminokiselina" označava aminokiselinu koja postiže značajnu otpornost trenutno opisanog peptida protiv cepanja dipeptidil peptidazom IV (DPP IV). U nekim aspektima, DPP-IV zaštitna aminokiselina je derivat od His.

[0179] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 1 je aminokiselina koja sadrži bočni lanac od Tyr, His, Tio Ala, ili Phe, pri čemu je alfa ugljenik aminokiseline na položaju 1, vezan za strukturu izabranu iz grupe koja se sastoji od:

(i) H2N-(CH2)-(ii) H2N-(iii) H(acetil)N-(CH2)0-1-; i

(iv) H- ili CH3-.

[0180] Kao što je ovde korišćen, termin "Tio Ala" označava 2-tienilalanin ili 2-tiofenalanin. Tio Ala ima sledeću strukturu:

[0181] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 1 sadrži sledeću strukturu:

gde je R bočni lanac od Tyr, His, Tio Ala, ili Phe, gde je X jedan od:

(i) H2N-(CH2)-(ii) H2N-(iii) H(acetil)N-(CH2)0-1-; i

(iv) H- ili CH3-[0182] Kada aminokiselina sadrži strukturu H2N-(CH2)- vezanu za alfa ugljenik (umesto alfa NH2), aminokiselina može se smatrati kao "beta-2" oblik aminokiseline, npr., Beta-2-L-Tyr, Beta-2-D-His, Beta-2-D-Ala, Beta-2-D-TioAla, Beta-2-L-His, Beta-2-L-Tyr, Beta-2-L-TioAla.

[0183] Kada aminokiselina sadrži strukturu H(acetil)N- vezanu za alfa ugljenik (umesto alfa NH2), aminokiselina se može smatrati kao "acetil" ili "acetilovani" oblik aminokiseline, npr., Acetil L-His, Acetil L-Tyr, Acetil L-Tio Ala, Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Tio Ala. Kada aminokiselina sadrži H(acetil)N-(CH2)-, aminokiselina se može smatrati kao "acetil-Beta-2-" oblik aminokiseline, npr., Acetil beta-2-L-His, Acetil beta-2-L-Tyr, Acetil beta-2-L-Tio Ala, Acetil beta-2-D-His, Acetil beta-2-D-Tyr, Acetil beta-2-D-Tio Ala.

[0184] Kada aminokiselina sadrži strukturu H- vezanu za alfa ugljenik (umesto alfa NH2), aminokiselina se može smatrati kao "dezamino" oblik aminokiseline, npr., Dezamino L-His, Dezamino L-Tyr, Dezamino L-TioAla, Dezamino D-His, Dezamino D-Tyr, Dezamino D-TioAla.

[0185] Kada aminokiselina sadrži strukturu CH3- vezanu za alfa ugljenik (umesto alfa NH2), aminokiselina se može smatrati kao "dezamino-beta-2" oblik aminokiseline, npr., Dezamino beta-2-L-His, Dezamino beta-2-L-Tyr, Dezamino beta-2-L-TioAla, Dezamino beta-2-D-His, Dezamino beta-2-D-Tyr, Dezamino beta-2-D-Tio-Ala.

[0186] Kada aminokiselina sadrži H2N- vezan za alfa ugljenik, aminokiselina se može smatrati aminokiselinom koja sadrži nemodifikovanu alfa amino grupu i može biti L-stereoizomer ili D-stereoizomer aminokiseline, npr., D-His, D-Tyr, D-TioAla.

[0187] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 1 je druga osim L-His, L-Tyr, i L-Phe.

[0188] U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: Acetil L-His, Acetil L-Tyr, Acetil L-Tio Ala, Acetil L-Phe, Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Tio Ala, Acetil D-Phe, Acetil beta-2-L-His, Acetil beta-2-L-Tyr, Acetil beta-2-L-Tio Ala, Acetil beta-2-L-Phe, Acetil beta-2-D-His, Acetil beta-2-D-Tyr, Acetil beta-2-D-Tio Ala, Acetil beta-2-D-Phe, Dezamino L-His, Dezamino L-Tyr, Dezamino L-TioAla, Dezamino LPhe, Dezamino D-His, Dezamino D-Tyr, Dezamino D-TioAla, Dezamino D-Phe, Dezamino beta-2-L-His, Dezamino beta-2-L-Tyr, Dezamino beta-2-L-TioAla, Dezamino beta-2-L-Phe, Dezamino beta-2-D-His, Dezamino beta-2-D-Tyr, Dezamino beta-2-D-TioAla, Dezamino beta-2-D-Phe, D-His, D-Tyr, D-TioAla, D-Phe, Beta-2-D-His, Beta-2-D-Ala, Beta-2-D-TioAla, Beta-2-D-Phe, Beta-2-L-His, Beta-2-L-Tyr, Beta-2-L-TioAla, Beta-2-L-Phe i L-tioAla.

[0189] U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 1 je izabrana od Acetil D-Tyr, Acetil D-His, DezaminoTyr, D-Tyr, D-His i Acetil-D-Phe.

[0190] U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptidi sadrže DPP-IV zaštitnu aminokiselinu na položaju 2. U nekim aspektima, DPP-IV zaštitna aminokiselina je jedna od D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina ili alfa, aminoizobuterne kiseline (AIB). U nekim aspektima, DPP-IV zaštitna aminokiselina je α,α-disupstituisana aminokiselina. U nekim aspektima, α,α-disusptituisana aminokiselina sadrži R<1>i R<2>, od kojih je svaki vezan za alfa ugljenik, pri čemu je svaki od R<1>i R<2>nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od C1-C4alkila, izborno supstituisanog sa hidroksil, amid, tiol, halo, ili R<1>i R<2>zajedno sa alfa ugljenikom za koji su vezani formiraju prsten. U nekim aspektima, α,α-disusptituisana aminokiselina je AIB ili 1-aminociklopropan-1-karboksilat (ACPC).

[0191] Termin "C1-Cn alkil" gde n može biti od 1 do 6, kao što je ovde korišćen, predstavlja granatu ili linearnu alkil grupu koja ima od jedan do naznačenog broja atoma ugljenika. Tipične C1-C6alkil grupe obuhvataju, ali bez ograničenja na, metil, etil, n-propil, izo-propil, butil, izo-butil, sek-butil, terc-butil, pentil, heksil i slično.

[0192] U ilustrativnim primerima izvođenja, DPP-IV zaštitna aminokiselina je D-izomer od Ser (D-Ser), ili njena konzervativna aminokiselinska supstitucija. Na primer, DPP-IV zaštitna aminokiselina može da sadrži strukturu bočnog lanca od -(C1-C4alkil)OH. Izborno, kada struktura bočnog lanca sadrži -(C3alkil)OH ili -(C4alkil)OH, ugljenikov lanac može biti sa lineranim lancem ili granat.

[0193] U ilustrativnim primerima izvođenja, DPP-IV zaštitna aminokiselina na položaju 2 je izabrana iz grupe koja se sastoji od Ala, Gly, Pro, sarkozina i Val. U ilustrativnim aspektima, DPP-IV zaština aminokiselina na položaju 2 je Ala ili Gly.

[0194] U ilustrativnim aspektima, kada je DPP-IV zaštitna aminokiselina je D-Ser i aminokiselina na položaju 1 je His, peptid agonist GIP nije konjugovan za heterolognu grupu, npr., hidrofilnu grupu (npr., PEG). U drugim aspektima predmetnih otkrića, DPP-IV zaštitna aminokiselina nije D-serin.

[0195] U ilustrativnim aspektima, kada je aminokiselina na položaju 2 jednaka Ala, aminokiselina na položaju 1 je D-stereoizomer aminokiseline.

[0196] U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0197] U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0198] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 1 sadrži sledeću strukturu:

gde R je bočni lanac od His ili Tio Ala ili R sadrži strukturu:

gde je R’ izborno prisutan, i, kada je prisutan, on je C1-4 alkilen, gde je X jedan od:

(i) H2N-(CH2)-(ii) H2N

(iii) H(acetil)N-(CH2)0-1-; i

(iv) H- ili CH3-.

[0199] U ilustrativnim aspektima, R’ je odsutan i X je H. U takvim aspektima, aminokiselina se može smatrati kao 4-hidroksifenilsirćetna kiselina.

Položaj 3

[0200] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 3 aminokiselinu koja pruža analogu glukagona smanjenu aktivnost na receptoru za glukagon, u poređenju sa poklapajućim kontrolnim peptidom koji ima nativni ostatak glukagona na ovom položaju (Gln). U nekim aspektima, analozi glukagona koji imaju ovaj tip aminokiseline na položaju 3 imaju oko 10% ili manje od aktivnosti nativnog glukagona na receptoru na glukagon, npr.,oko 1-10%, ili oko 0.1-10%, ili više od oko 0.1%, ali manje od oko 10%. U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona ispoljavaju oko 0.5%, oko 1% ili oko 7% od aktivnosti nativnog glukagona. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 3 je kiseo, bazan ili hidrofobni aminokiselinski ostatak, npr., glutaminska kiselina, ornitin, norleucin. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 3 je Ile ili Leu.

[0201] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži nativnu aminokiselinu od SEQ ID NO: 1 na položaju 3, npr., glutamin, ili sadrži analog glutamina. Bez vezivanja za određenju teoriju, takvi analozi glukagona koji sadrže analog glutamina ne ispoljavaju značajni gubitak aktivnosti na receptoru za glukagon, i u nekim slučajevima, analog glukagona koji sadrži analog glutamina pojačava aktivnost receptora za glukagon. U nekim primerima izvođenja, analog glutamina sadrži na položaju 3 aminokiseline koja sadrži bočni lanac strukture I, II ili III:

Struktura II

Struktura III

gde je R<1>jednako C0-3alkil ili C0-3heteroalkil; R<2>je NHR<4>ili C1-3alkil; R<3>je C1-3alkil; R<4>je H ili C1-3alkil ; X je NH, O ili S; i Y je NHR<4>, SR<3>, ili OR<3>. U nekim primerima izvođenja, X je NH ili Y je NHR<4>. U nekim primerima izvođenja, R<1>je C0-2alkil ili C1heteroalkil. U nekim primerima izvođenja, R<2>je NHR<4>ili C1alkil. U nekim primerima izvođenja, R<4>je H ili C1alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture I je ovde obezbeđena, R<1>je CH2-S, X je NH, i R<2>je CH3(acetamidometil-cistein, C(Acm)); R<1>je CH2, X je NH, i R<2>je CH3(acetildiaminobuterna kiselina, Dab(Ac)); R<1>je C0alkil, X je NH, R<2>je NHR<4>, i R<4>je H (karbamoildiaminopropanska kiselina, Dap(urea)); R<1>je CH2-CH2, X je NH, i R<2>je CH3(acetilornitin, Om(Ac)); ili R<1>je (CH2)3, X je NH, i R<2>je CH3(acetil lizin (Ac Lys). U ilustrativnim primerima izvođenja, u ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture II je obezbeđen gde, R<1>je CH2, Y je NHR<4>, i R<4>je CH3(metilglutamin, Q(Me)); U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture III je ovde obezbeđena, R<1>je CH2i R<4>je H (metionin-sulfoksid, M(O)); U specifičnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 3 je supstituisana sa Dab(Ac).

[0202] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 3:

(i) alifatičnu aminokiselinu, npr., Ala, Val, norleucin (Nle), ili norvalin (NorVal);

(ii) aminokiselinu sa bočnim lancem strukture S1:

-(CH2)n-X [struktura S1]

gde je n ceo broj između 1 do 4; i

gde je X jednako SCH3, S(O)CH3; ili SOO; ili

(iii) aminokiselinu sa bočnim lancem strukture S2:

-(CH2)n-OH [struktura S2]

gde je n ceo broj između 1 do 4.

[0203] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina sa bočnim lancem strukture S1 je Met, metionin sulfoksid, ili metionin sulfon. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina sa bočnim lancem strukture S2 je homoserin. Bez vezivanja za određenu teoriju, takvi analozi glukagona održavaju izvesnu aktivnost glukagona.

Položaj 7

[0204] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 7, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Thr na položaju 7. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 7 je velika, alifatična aminokiselina, npr., Ile, Leu, Ala i slično. Bez vezivanja za određenu teoriju, analozi glukagona koji sadrže takvu aminokiselinu na položaju 7 veruje se da ispoljavaju drastično smanjenu aktivnost na GLP-1 receptoru.

Položaj 9

[0205] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 9, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Asp na položaju 9. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži negativno naleketrisanu aminokiselinu osim Asp, npr., Glu, homoglutaminsku kiselinu, cisteinsku kiselinu, homocisteinsku kiselinu. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 9 je acilovana aminokiselina ili alkilovana aminokiselina, kao što je ovde razmatrana.

Položaj 10

[0206] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 10, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Tyr na položaju 10. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 10 je Trp. Bez vezivanja za određenu teoriju, analozi glukagona koji sadrže takvu aminoksielinu na položaju 10 veruje se da ispoljavaju aktivnost na GIP receptoru, GLP-1 receptoru i/ili receptoru za glukagon koja nije redukovana, u poređenju sa odgovarajućim peptidom sa Tyr na položaju 10.

[0207] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu ili alkilovanu aminokiselinu, kao što je ovde razmatrana.

Položaj 11

[0208] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 11, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Ser na položaju 11. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 11 je mala alifatična aminokiselina, npr., Gly ili Ala. Bez vezivanja za određenu teoriju, analozi glukagona koji sadrže takvu aminokiselinu na položaju 10 veruje se da ispoljavaju smanjenu aktivnost na receptoru za glukagon.

Položaj 12

[0209] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 12, u odnosu na SEQ ID NO: 1. npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Lys na položaju 10. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 12 je velika, alifatična, nepolarna aminokiselina, izborno, izoleucin. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 12 je Arg. Bez vezivanja za određenu teoriju, analozi glukagona koji sadrže veliku, alifatičnu, nepolarnu aminokiselinu, npr., Ile, ispoljavaju pojačanu aktivnost na GIP receptoru. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu ili alkilovanu aminokiselinu, kao što je ovde razmatrana.

Položaj 15

[0210] U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona sadrže aminokiselinsku modifikaciju na položaju 15, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Asp na položaju 15. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 15 je deletirana ili je glutaminska kiselina, homoglutaminska kiselina, cisteinska kiselina ili homocisteinska kiselina. Bez vezivanja za određenu teoriju, takvi analozi glukagona ispoljavaju poboljšanu stabilnost, npr., putem smanjenja razlaganja ili cepanja analoga tokom vremena, naročito u kiselim ili alkalnim puferima, npr., puferima na pH unutar opsega od 5.5 do 8. U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona koji sadrže ovu modifikaciju zadržavaju najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% od originalnog analoga posle 24 časa na 25°C.

Položaj 16

[0211] U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona sadrže aminokiselinsku modifikaciju na položaju 16, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Ser na položaju 16. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 16 je glutaminska kiselina ili sa drugom negativno-naelektrisanom aminokiselinom koja ima bočni lanac sa dužinom od 4 atoma, ili alternativno sa bilo kojom od glutamina, homoglutaminske kiseline ili homocisteinske kiseline, ili naelektrisanom aminokiselinom koja ima bočni lanac koji sadrži najmanje jedan heteroatom, (npr., N, O, S, P) i sa bočnim lancem dužine od oko 4 (ili 3-5) atoma. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 16 aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina, homoglutaminske kiseline, homocisteinske kiseline, treonina ili glicina ili je aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina, homoglutaminske kiseline i homocisteinske kiseline.

[0212] Bez vezivanja za određenu teoriju, takvi analozi glukagona ispoljavaju pojačanu stabilnost, npr., putem smanjenja razlaganja peptida tokom vremena, naročito u kiselim ili alkalnim puferima, npr., puferima na pH unutar opsega od 5.5 do 8. Takvi analozi glukagona su manje podložni cepanju Asp15-SeR16 peptidne veze.

[0213] U nekim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 16 je negativno naelektrisana aminokiselina, izborno u kombinaciji sa aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu (npr., alfa, alfa disupstituisanom aminokiselinom, ili AIB) na položaju 20. Takvi analozi glukagona ispoljavaju aktivnost GIP.

[0214] U alternativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 16 Thr ili aminokiselinu koja stimuliše alfa spiralu, kao što je opisano u prethodnom tekstu. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je AIB ili Glu.

[0215] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 16 je pozitivno naelektrisana aminokiselina, npr., formula IV:

gde je n jednako 1 do 16, ili 1 do 10, ili 1 do 7, ili 1 do 6, ili 2 do 6, ili 2 ili 3 ili 4 ili 5, svaki od R<1>i R<2>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C18alkila, (C1-C18alkil)OH, (C1-C18alkil)NH2, (C1-C18alkil)SH, (C0-C4alkil)(C3-C6)cikloalkil, (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklik), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R<7>, i (C1-C4alkil)(C3-C9heteroaril), gde je R<7>jednako H ili OH. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 16 analoga glukagona je Lys.

[0216] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu ili alkilovanu aminokiselinu na položaju 16, kao što je ovde razmatrano.

[0217] U dodatnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 16 je aminokiselina koja sadrži bočni lanac koji je konjugovan za heterolognu grupu, kao što je ovde opisana pod naslovom "KONJUGATI."

[0218] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži alifatičnu aminokiselina na položaju 16. Na primer, analozi glukagona mogu imati Gly, Ala, Val, Leu, ili Ile, na položaju 16 analoga glukagona. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži mali alifatični ostatak, npr., Gly, Ala.

[0219] U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinu koja sadrži bočni lanac imidazola. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 16 sadrži strukturu formule A:

gde je svaki od R<1>i R<2>nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H, (C1-6)alkila, O(C1-6)alkila, (C1-6)alkil-OH, F i (C1-C6)alkila od kojih je najmanje jedan H zamenjen sa F. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 16 sadrži analog strukture formule A, pri čemu su jedan ili oba od azota prstena vezani za C1-C3alkil.

[0220] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 16 je L-histidin (His). U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 16 je derivat od His (His derivat), od kojih su neki ovde opisani. Videti, npr., navode pod naslovom "Položaj 1."

Položaji 17 i 18

[0221] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na bilo kom ili oba položaja 17 i 18, u odnosu na SEQ ID NO: 1, tako da je dvobazno Arg-Arg mesto na položajima 17 i 18 eliminisano. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Arg na jednom ili oba položaja 17 i 18. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, veruje se da eliminacija dvobaznog mesta poboljšava in vivo efikasnost analoga glukagona. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 17 nije bazna aminokiselina. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 17 je alifatična aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 17 je supstituisana sa drugom aminokiselinom kao što je ovde opisana, npr., aminokiselina koja sadrži hidrofilnu grupu, sa aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu formira nekovalentni intramolekularni most sa aminokiselinom na j+3 ili i+4. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 17 je Gln.

[0222] U drugim aspektima, analog glukagona predmetnih otkrića sadrži aminokiselinu koja sadrži bočni lanac imidazola na položaju 17. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 17 sadrži strukturu formule A:

pri čemu je svaki od R<1>i R<2>nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H, (C1-6)alkila, O(C1-6)alkila, (C1-6)alkil-OH, F i (C1-C6)alkila od kojih je najmanje jedan H zamenjen sa F. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 17 sadrži analog strukture formule A, gde su jedan ili oba od azota prstena vezani za C1-C3alkil.

[0223] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 17 je L-histidin (His). U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 17 je derivat od His (His derivat), od kojih su neki ovde opisani. Videti, npr., navode pod naslovom "Položaj 1."

[0224] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 18 nije bazna aminokiselina. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 18 je alifatična aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 18 je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala.

[0225] U nekim specifičnim aspektima, aminokiselina na položaju 18 je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala, i aminokiselina na položaju 17 je Arg. U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 18 je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala i aminokiselina na položaju 17 je Gln.

[0226] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 17 je aminokiselina koja sadrži bočni lanac koji je konjugovan za heterolognu grupu, kao što je ovde opisana u delu pod naslovom "KONJUGATI.

Položaji 19

[0227] U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona sadrže aminokiselinsku modifikaciju na položaju 19, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., analog glukagona sadrži aminokiselinu osim Ala na položaju 19. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 19 je aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu (npr., alfa, alfa disupstituisana aminokiselina, ili AIB). Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, analog glukagona koji sadrži alfa, alfa disupstituisanu aminokiselinu, npr., AIB, ispoljava smanjenu aktivnost agonista glukagona, u poređenju sa poklapajućim kontrolnim peptidom, pri čemu je aminokiselina na položaju 19 nativni aminokiselinski ostatak, Ala.

Položaj 20

[0228] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 20, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., aminokiselina na položaju 20 je aminokiselina osim Gln. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu, npr. Kao što je opisana u prethodnom tekstu. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je alfa, alfa disupstituisana aminokiselina, npr., AIB, ACPC. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu formira nekovalentni intramolekularni most sa aminokiselinom na j-3 ili i-4.

[0229] U nekim specifičnim primerima izvođenja aminokiselina je hidrofilna aminokiselina koja ima bočni lanac koji je naelektrisan ili ima sposobnost vodonične veze, i najmanje je oko 5 (ili oko 4-6) atoma u dužinu, na primer, lizin, citrulin, arginin ili ornitin. U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je Ser, Thr, Ala ili AIB.

[0230] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je acilovana aminokiselina ili alkilovana aminokiselina, kao što je ovde razmatrana.

[0231] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je aminokiselina koja sadrži bočni lanac koji je konjugovan za heterolognu grupu, kao što je ovde opisano u delu pod naslovom "KONJUGATI.

[0232] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 20 analoga glukagona sadrži bočni lanac imidazola. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 20 sadrži strukturu formule A:

gde je svaki od R<1>i R<2>nezavisno je izabran iz grupe koja se sastoji od H, (C1-6)alkila, O(C1-6)alkila, (C1-6)alkil-OH, F i (C1-C6)alkila od kojih je najmanje jedan H zamenjen sa F. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 20 sadrži analog strukture formule A, gde su jedan ili oba od azota prstena vezani za C1-C3alkil.

[0233] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je L-histidin (His). U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je derivat od His (His derivat), od kojih su neki ovde opisani. Videti, npr., navode pod naslovom "Položaj 1."

[0234] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je pozitivno naelektrisana aminokiselina, npr., formula IV:

gde je n jednako 1 do 16, ili 1 do 10, ili 1 do 7, ili 1 do 6, ili 2 do 6, ili 2 ili 3 ili 4 ili 5, svaki od R<1>i R<2>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C18alkila, (C1-C18alkil)OH, (C1-C18alkil)NH2, (C1-C18alkil)SH, (C0-C4alkil)(C3-C6)cikloalkila, (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklik), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R<7>i (C1-C4alkil)(C3-C9heteroaril),

wherein R<7>je H ili OH. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 20 analoga glukagona je Lys.

[0235] Bez vezivanja za određenu teoriju, takvi analozi glukagona ispoljavaju pojačanu aktivnost na receptoru za GLP-1 i/ili GIP receptoru ili ispoljavaju smanjeno razlaganje koje se javlja preko deamidacije Gln i/ili ispoljavaju povećanu stabilnost.

Položaj 21

[0236] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 21, u odnosu na SEQ ID NO: 1, npr., aminokiselina na položaju 21 je aminokiselina osim Asp. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 21 je Ser, Thr, Ala ili AIB. U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 21 je Lys, Arg, Orn, ili Citrulin. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 21 je Glu, homoglutaminska kiselina ili homocisteinska kiselina. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 21 je aminokiselina koja sadrži bočni lanac koji je konjugovan za heterolognu grupu, kao što je opisano u delu pod naslovom "KONJUGATI.

[0237] U nekim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 21 je aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu formira nekovalentni intramolekularni most sa aminokiselinom na j-3 ili i-4.

[0238] Bez vezivanja za određenu teoriju, takvi analozi glukagona ispoljavaju smanjeno razlaganje koje se javlja preko razlaganja preko dehidratacije Asp tako da se formira ciklični sukcinimid intermedijer nakon čega sledi izomerizacija do izo-aspartata i/ili ispoljavaju povećanu stabilnost.

Položaj 23

[0239] U nekim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 23, u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 23 je aminokiselina osim Val, uključujući Ile.

Položaj 24

[0240] U nekim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 24, u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 24 je aminokiselina osim Gln, npr., Ala, Asn, Cys. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 24 je aminokiselina koja sadrži bočni lanac koji je konjugovan za heterolognu grupu, kao što je ovde opisano u delu pod naslovom "KONJUGATI.

Položaj 27

[0241] U nekim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 27, u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 27 je aminokiselina osim Met. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 27 aminokiselinu koja sprečava oksidativno razlaganje peptida. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 27 je metionin sulfoksid, leucin, izoleucin ili norleucin. U nekim specifičnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 27 je leucin ili norleucin.

[0242] U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 27 je alifatična aminokiselina (npr., Gly, Ala, Val, Leu, Ile) ili aminokiselina formule IV, kao što je ovde opisana, npr., Lys. U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 27 je Val ili Lys. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, takva aminokiselinska modifikacija smanjuje aktivnost glukagona.

Položaji 28 i 29

[0243] U nekim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 28, u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je aminokiselina osim Asn. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je Ala, Ser, Thr, ili AIB. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je naelektrisana aminokiselina, npr., negativno naelektrisana aminokiselina, kao što je ovde dalje opisana. Videti deo pod naslovom "Naelektrisani C-terminus." U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je Asp. U ilustrativnim poželjnim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je Glu.

[0244] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je aminokiselina formule IV kao što je ovde opisana. Aminokiselina u ilustrativnim primerima izvođenja je Lys. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, takva aminokiselinska modifikacija smanjuje aktivnost glukagona.

[0245] U nekim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 29, u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 29 je aminokiselina osim Thr. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 29 je alifatični ostatak, npr., Gly, Ala, Val, Leu, Ile. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 29 je mala alifatična aminokiselina. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 29 je Ala ili Gly ili Leu. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 29 je α, α-disupstituisana aminokiselina, kao što je bilo koja od onih koje su ovde opisane. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 29 je AIB.

[0246] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 29 je aminokiselina koja sadrži bočni lanac koji je konjugovan za heterolognu grupu, kao što je ovde opisana u delu pod naslovom "KONJUGATI.

[0247] Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, kada je položaj 28 jednak Asp i položaj 29 je Gly, analog glukagona može imati izvestan stepen hemijske nestabilnosti. Na taj način, u ilustrativnim aspektima, analog glukagona nema oba Asp na položaju 28 i Gly na položaju 29, i može da ispoljava pojačanu hemijsku stabilnost. Na primer, u nekim aspektima, analog glukagona sadrži Asp na položaju 28 i aminokiselinu osim Gly na položaju 29. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži Asp na položaju 28 i jednu od Gly, Ala, Val, Leu, Ile, ili AIB na položaju 29. U alternativnim aspektima, analog glukagona sadrži Gly na položaju 29 i aminokiselinu osim Asp na položaju 28. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži Ala, Ser, Thr, Lys, AIB, ili Glu na položaju 28 i Gly na položaju 29. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži Glu na položaju 28 i Gly na položaju 29. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži Asp ili Glu na položaju 28 i Ala na položaju 29. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži Asp na položaju 28 i Leu na položaju 29.

Naelektrisani C-terminus

[0248] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija i/ili adicija koje uvode naelektrisanu aminokiselinu u C-terminalni deo analoga, u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim primerima izvođenja, takve modifikacije pojačavju stabilnost i rastvorljivost. Kao što je ovde korišćen termin "naelektrisana aminokiselina" ili "naelektrisani ostatak" označava aminokiselinu koja sadrži bočni lanac koji je pozitivno naelektrisan ili negativno naelektrisan (tj., de-protonovan) ili pozitivno naelektrisan (tj., protonovan) u vodenom rastvoru na fiziološkoj pH. U nekim aspektima, ove aminokiselinske supstitucije i/ili adicije koje uvode naelektrisane aminokiselinske modifikacije su na položaju C-terminalnom prema položaju 27 od SEQ ID NO: 1. U nekim primerima izvođenja, jedna, dve ili tri (i u nekim slučajevima, više od tri) naelektrisane aminokiseline su uvedene unutar C-terminalnog dela (npr., položaja (jednog ili više) C-terminalnog prema položaju 27). U skladu sa nekim primerima izvođenja, nativna aminokiselina(e) na položajima 28 i/ili 29 su susptituisane sa naelektrisanim aminokiselinama i/ili u dodatnom primeru izvođenja jedna do tri naelektrisane aminokiseline su takođe dodate na C-terminus analoga. U ilustrativnim primerima izvođenja, jedna, dve ili sve naelektrisane aminokiseline su negativno naelektrisane. Negativno naelektrisana aminokiselina u nekim primerima izvođenja je asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, cisteinska kiselina, homocisteinska kiselina ili homoglutaminska kiselina. U nekim aspektima, ove modifikacije povećavaju rastvorljivost ili stabilnost. U nekim primerima izvođenja, položaj 30 nije naelektrisana aminokiselina. Bez vezivanja za određenu teoriju, naelektrisana aminokiselina, npr., negativno naelektridana aminokiselina, npr., Glu, smanjila je aktivnost GIP.

C-terminalno skraćenje

[0249] U skladu sa nekim primerima izvođenja, analozi glukagona koji su ovde otkriveni su modifikovani skraćenjem C-terminusa za jedan ili dva aminokiselinska ostatka. Takvi modifikovani peptidi glukagona, zadržavaju sličnu aktivnost i potenciju na receptoru za glukagon i GLP-1 receptoru. U tom smislu, peptidi glukagona mogu da sadrže aminokiseline 1-27 ili 1-28 nativnog analoga glukagona (SEQ ID NO: 1), izborno sa bilo kojom od dodatnih modifikacija koje su ovde opisane.

Neutralno naelektrisani C-terminus

[0250] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži grupu negativnog naleketrisanja, kao što je amid ili estar, na C-terminusu umesto alfa karboksilata, u odnosu na SEQ ID NO: 1. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, takve modifikacije u ilustrativnim aspektima povećavaju aktivnost analoga glukagona na GLP-1 receptoru. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, analog glukagona je amidovani peptid, tako da C-terminalni ostatak sadrži amid umesto alfa karboksilata aminokiseline. Kao što je ovde korišćeno generalno pozivanje na peptid ili analog je određeno tako da obuhvata peptide koji imaju modifikovani amino terminus, karboksi terminus, ili oba amino i karboksi terminuse. Na primer, aminokiselinski lanac koji sadrži grupu amida umesto terminalne karboksilne kiseline je namenjen da bude obuhvaćen aminokiselinskom sekvencom koja označava standardne aminokiseline.

C-terminalni produžeci

[0251] U nekim primerima izvođenja predmetnih otkrića, analozi glukagona sadrže C-terminalni produžetak od 1-21 aminokiselina fuzionisan sa aminokiselinom na položaju 29. C-terminalni produžetak može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 21 aminokiseline. U nekim aspektima, C-terminalni produžetak je bilo koji od heterolognih peptida opisanih u daljem tekstu u delu pod naslovom "KONJUGATI." Na primer, analog glukagona sadrži na položaju 30 alifatični ostatak, npr., Gly, Ala, Val, Leu, Ile. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži na položaju 30 mali alifatični ostatak, npr., Gly, Ala.

[0252] Takođe, na primer, u nekim aspektima, produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu koja formira strukturu kaveza Trp, npr., produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu od GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5), ili njenu konzervativno supstituisanu sekvencu. U alternativnim aspektima, produžetak od 1 do 21 aminokiseline sadrži najmanje jednu naelektrisanu aminokiselinu. U ilustrativnim aspektima, produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu od: X1-X2, gde je X1naelektrisana aminokiselina i X2je mala alifatična aminokiselina. U nekim aspektima, X1je pozitivno naelektrisana aminokiselina, npr., Arg. U nekim aspektima, produžetak sadrži Arg-Gly.

[0253] U nekim primerima izvođenja, produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 5 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 6 (GGPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 7 (KRNRNNIA), ili SEQ ID NO: 8 (KRNR). U specifičnim aspektima, aminokiselinska sekvenca je vezana preko C-terminalne aminokiseline analoga glukagona, npr., aminokiseline na položaju 29. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca bilo koje od SEQ ID NOs: 5-8 je vezana za aminokiselinu 29 analoga glukagona preko peptidne veze. U nekim specifičnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 29 analoga glukagona je Gly i Gly je fuzionisana za bilo koju od aminokiselinskih sekvenci bilo koje od SEQ ID NOs: 5-8.

[0254] U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži produžetak koji formira strukturu poznatu u stanju tehnike kao Trp kavez (videti, npr., Paschek et al., Proc Natl Acad Sci USA 105 (46): 17754-17759 (2008). U nekim aspektima, produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5) ili GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 6) ili GPSSGRPPPS (SEQ ID NO: 183) ili sekvencu od jedne od gore navedenih sa 1, 2, ili 3 konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U ilustrativnim aspektima, kada produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 183, aminokiselina na položaju 28 je negativno naelektrisana aminokiselina, npr., Asp ili Glu.

Druge modifikacije

[0255] Opisi drugih modifikacija, u odnosu na SEQ ID NO: 1, analoga glukagona predmetnih otkrića nalaze se u ovoj prijavi. Gore navedeni spisak nije iscrpan, već samo ilustrativan.

[0256] U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona koji su ovde opisani su glikozilovani, amidovani, karboksilovani, fosforilisani, esterifikovani, N-acilovani, ciklozovani preko, npr., disulfidnog mosta, ili su prevedeni u so (npr., kiselu adicionu so, baznu adicionu so), i/ili izborno dimerizovani, multimerizovani, ili polimerizovani, ili konjugovani.

ISKLJUČENI PEPTIDI

[0257] Analozi glukagona predmetnih otkrića su strukturno različiti od analoga glukagona koji ispoljavaju aktivnost sgonista GIP receptora opisanu u međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT US2009/47447 (podnetoj 16.6.2009,), SAD prijavi br.61/073,274 (podnetoj 17.6.2008.); SAD prijavi br. 61/078,171 (podnetoj 3.7.2008.); SAD prijavi br. 61/090,448 (podnetoj 20.8.2008.), SAD prijavi br. 61/151,349 (podnetoj 10.2.2009.), SAD prijavi br. 61/187,578 (podnetoj 16.6.2009.), međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2010-038825 (podnetoj 16.6.2010.); SAD privremenoj patentnoj prijavi br. 61/426,285, podnetoj 22.12.2010.; SAD privremenoj patentnoj prijavi br. 61/514,609, podnetoj 3.8.2011., i međunarodnoj prijavi br. PCT/US2011/066164, podnetoj 20.12,2011. Prema tome, u bilo kojoj ili svim primerima izvođenja, analog glukagona predmetnih otkrića nije bilo koji od analoga glukagona ili peptida opisanih u međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2009/47447 (podnetoj 16.6.2009., i objavljenoj kao WO 2010/011439), SAD prijavi br. 61/073,274 (podnetoj 7.6.2008.); SAD prijavi br. 61/078,171 (podnetoj 3.6.2008.); SAD prijavi br. 61/090,448 (podnetoj 20.8.2008.), SAD prijavi br. 61/151,349 (podnetoj 10.2.2009.), SAD prijavi br.

61/187,578 (podnetoj 16.6.2009.), međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2010/038825 (podnetoj 16.6.2010., i objavljenoj kao WO 2010/148089), SAD prijavi br. 61/298,812 (podnetoj 27.1.2010.), međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2011/022608 (podnetoj 26.1.2011., i objavljenoj kao WO 2011/094337), SAD privremenoj patentnoj prijavi br.

61/426,285, podnetoj 22.12.2010.; SAD privremenoj patentnoj prijavi br. 61/514,609, podnetoj 3.8.2011., ili međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2011/066164, podnetoj 20.12.2011. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi, peptidi glukagona ili analozi glukagona predmetnih otkrića nisu (tj., isključuju) bilo koji ili sve od peptida od SEQ ID NOs: 1-262 od WO 2010/011439; SEQ ID NOs: 1-680 of WO 2010/148089, ili SEQ ID NOs: 1-1318 of PCT/US2011/022608.) ili SEQ ID NOs: 10-262 međunarodne patentne prijave br. PCT/US2011/066164, podnete 20.12.2011.

[0258] U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi, peptidi glukagona ili analozi glukagona predmetnih otkrića nisu (tj., isključuju) bilo koji ili sve od peptida od SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, i/ili 262 međunarodne patentne prijave br. WO 2010/011439.

[0259] U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi, peptidi glukagona ili analozi glukagona predmetnih otkrića nisu (tj., isključuju) bilo koji ili sve od peptida od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 , 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, i/ili 680 objave međunarodne patentne prijave br. WO 2010/148089. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi, peptidi glukagona ili analozi glukagona predmetnih otkrića nisu (tj., isključuju) bilo koji ili sve od peptida od SEQ ID NO: 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669 objave međunarodne patentne prijave br. WO 2010/148089, kojis u ovde predstavljeni kao SEQ ID NOs: 219-229, respektivno.

[0260] U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi, peptidi glukagona ili analozi glukagona predmetnih otkrića nisu (tj., isključuju) bilo koji ili sve od peptida od SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, , 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, , 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, , 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, , 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, , 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, , 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, , 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, , 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, , 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, , 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, , 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, , 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, , 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, , 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, , 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, , 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, , 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, , 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, , 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, , 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, , 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, , 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, , 676, 677, 678, 679, 680 , 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, , 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, , 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, , 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, , 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, , 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, , 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, , 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, , 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, , 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, , 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, , 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, 1000, 1001, 1002, 1003, 1004, 1005, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 1020, 1021, 1022, 1023, 1024, 1025, 1026, 1027, 1028, 1029, 1030, 1031, 1032, 1033, 1034, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1044, 1045, 1046, 1047, 1048, 1049, 1050, 1051, 1052, 1053, 1054, 1055, 1056, 1057, 1058, 1059, 1060, 1061, 1062, 1063, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1069, 1070, 1071, 1072, 1073, 1074, 1075, 1076, 1077, 1078, 1079, 1080, 1081, 1082, 1083, 1084, 1085, 1086, 1087, 1088, 1089, 1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096, 1097, 1098, 1099, 1100, 1101, 1102, 1103, 1104, 1105, 1106, 1107, 1108, 1109, 1110, 1111, 1112, 1113, 1114, 1115, 1116, 1117, 1118, 1119, 1120, 1121, 1122, 1123, 1124, 1125, 1126, 1127, 1128, 1129, 1130, 1131, 1132, 1133, 1134, 1135, 1136, 1137, 1138, 1139, 1140, 1141, 1142, 1143, 1144, 1145, 1146, 1147, 1148, 1149, 1150, 1151, 1152, 1153, 1154, 1155, 1156, 1157, 1158, 1159, 1160, 1161, 1162, 1163, 1164, 1165, 1166, 1167, 1168, 1169, 1170, 1171, 1172, 1173, 1174, 1175, 1176, 1177, 1178, 1179, 1180, 1181, 1182, 1183, 1184, 1185, 1186, 1187, 1188, 1189, 1190, 1191, 1192, 1193, 1194, 1195, 1196, 1197, 1198, 1199, 1200, 1201, 1202, 1203, 1204, 1205, 1206, 1207, 1208, 1209, 1210, 1211, 1212, 1213, 1214, 1215, 1216, 1217, 1218, 1219, 1220, 1221, 1222, 1223, 1224, 1225, 1226, 1227, 1228, 1229, 1230, 1231, 1232, 1233, 1234, 1235, 1236, 1237, 1238, 1239, 1240, 1241, 1242, 1243, 1244, 1245, 1246, 1247, 1248, 1249, 1250, 1251, 1252, 1253, 1254, 1255, 1256, 1257, 1258, 1259, 1260, 1261, 1262, 1263, 1264, 1265, 1266, 1267, 1268, 1269, 1270, 1271, 1272, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1286, 1287, 1288, 1289, 1290, 1291, 1292, 1293, 1294, 1295, 1296, 1297, 1298, 1299, 1300, 1301, 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307, 1308, 1309, 1310, 1311, 1312, 1313, 1314, 1315, 1316, 1317, i/ili 1318 objave međunarodne prijave br. WO/2011/094337.

ILUSTRATIVNI PRIMERI IZVOĐENJA

[0261] U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića je analog glukagona (SEQ ID NO: 1), koji sadrži

A. na položaju 1 aminokiselinu koja sadrži bočni lanac od Tyr, His, Tio Ala ili Phe, gde je alfa ugljenik aminokiseline na položaju 1, vezan za strukturu izabranu iz grupe koja se sastoji od:

(i) H2N-(CH2)-(ii) H2N-;

(iii) H(acetil)N-(CH2)0-1-; i

(iv) H- ili CH3-B. na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 20, ili 37-43 acilovanu aminokiselinu ili alkilovanu aminokiselinu, izborno gde je acil ili alkil grupa vezana za aminokiselinu preko spejsera; C. aminokiselinu koja stabilizuje alfa spiralu na jednom ili više od položaja 16-21, i

D. do deset dodatnih aminokiselinskih modifikacija u odnosu na SEQ ID NO: 1; aminokiselina na položaju 1 je L-stereoizomer ili D-stereoizomer, gde, izborno, aminokiselina na položaju 1 se razlikuje od L-His, L-Phe i L-Tyr, pri čemu, kada analog glukagona nema hidrofilnu grupu, analog glukagona ispoljava EC50na humanom GIP receptoru od manje od ili oko 0.5 nM (npr., manje od ili oko 0.01 nM, manje od ili oko 0.05 nM, ili manje od ili oko 0.03 nM), i gde analog glukagona ima manje od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.

[0262] U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića je analog glukagona (SEQ ID NO: 1), koji sadrži

A. na položaju 1 aminokiselinu koja sadrži sledeću strukturu:

gde je R bočni lanac od His ili Tio Ala ili R je:

gde je R’ izborno prisutan, i, kada je prisutan, je C1-4 alkilen, gde je X jedan od:

(i) H2N-(CH2)-(ii) H2N-(iii) H(acetil)N-(CH2)0-1-; i

(iv) H- ili CH3-.

B. na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 20, ili 37-43 acilovanu aminokiselinu ili alkilovanu aminokiselinu, izborno gde je acil ili alkil grupa vezana za aminokiselinu preko spejsera; C. aminokiselinu koja stabilizuje alfa spiralu na jednom ili više položaja 16-21, i

D. do deset dodatnih aminokiselinskih modifikacija u odnosu na SEQ ID NO: 1;

pri čemu aminokiselina na položaju 1 je L-stereoizomer ili D-stereoizomer, gde, izborno, aminokiselina na položaju 1 se razlikuje od L-His, L-Phe i L-Tyr, gde, kada analog glukagona nema hidrofilnu grupu, analog glukagona ispoljava EC50na humanom GIP receptoru od manje od ili oko 0.5 nM (npr., manje od ili oko 0.01 nM, manje od ili oko 0.05 nM, ili manje od ili oko 0.03 nM), i gde analog glukagona ima manje od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora. U ilustrativnim aspektima, R’ je C1-2 alkilen. U ilustrativnim aspektima, R’ je odsutan i X je H. U takvim aspektima, aminokiselina može se smatrati kao 4-hidroksifenilsirćetna kiselina.

[0263] Analozi glukagona koji su ovde opisani mogu da sadrže bilo koji profil aktivnosti koji je ovde opisan. Videti, npr., deo pod naslovom "AKTIVNOST SADA OTKRIVENIH PEPTIDA." U ilustrativnim aspektima, analog glukagona ispoljava procenat potencije GIP od najmanje ili oko 1%, najmanje ili oko 10%, najmanje ili oko 50%, najmanje ili oko 90%, najmanje ili oko 100%, najmanje ili oko 300%, ili najmanje ili oko 500%. U nekim aspektima, analog glukagona takođe ispoljava procenat potencije GLP-1 od najmanje ili oko 1%, najmanje ili oko 10%, najmanje ili oko 50%, najmanje ili oko 90%, najmanje ili oko 100%, najmanje ili oko 300%, ili najmanje ili oko 500%. U alternativnim ili dodatnim aspektima, analog glukagona ispoljava procenat potencije glukagona od najmanje ili oko 1%, najmanje ili oko 10%, najmanje ili oko 50%, najmanje ili oko 90%, ili najmanje ili oko 100%. Prema tome, dok se analozi glukagona mogu smatrati peptidom agonistom GIP, u nekim aspektima, analozi glukagona dodatno mogu biti smatrani kao koagonist GIP-GLP-1, koagonist GIP-glukagona ili triagonist GIP-GLP-1-glukagona. Na primer, peptid može da ispoljava agonističku aktivnost na svakom od humanog GIP receptora, humanog GLP-1 receptora i izborno humanog receptora za glukagon, pri čemu peptid ispoljava EC50na GIP receptoru koja je unutar 100-puta (npr., 50-puta, 40-puta, 30-puta, 20-puta, 15-puta, 10-puta, ili manje) njegove EC50na GLP-1 receptoru i izborno je unutar 100-puta (npr., 50-puta, 40-puta, 30-puta, 20-puta, 15-puta, 10-puta, ili manje) njegove EC50na receptoru za glukagon. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona ima manje od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.

[0264] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: Acetil L-His, Acetil LTyr, Acetil L-Tio Ala, Acetil L-Phe, Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Tio Ala, Acetil D-Phe, Acetil beta-2-L-His, Acetil beta-2-L-Tyr, Acetil beta-2-L-Tio Ala, Acetil beta-2-L-Phe, Acetil beta-2-D-His, Acetil beta-2-D-Tyr, Acetil beta-2-D-Tio Ala, Acetil beta-2-D-Phe,Dezamino L-His, Dezamino L-Tyr, Dezamino L-TioAla, Dezamino L-Phe, Dezamino D-His, Dezamino D-Tyr, Dezamino D-TioAla, Dezamino D-Phe,Dezamino beta-2-L-His, Dezamino beta-2-LTyr, Dezamino beta-2-L-TioAla, Dezamino beta-2-L-Phe, Dezamino beta-2-D-His, Dezamino beta-2-D-Tyr, Dezamino beta-2-D-TioAla, Dezamino beta-2-D-Phe, D-His, D-Tyr, D-TioAla, D-Phe,Beta-2-D-His, Beta-2-D-Tyr, Beta-2-D-Tio-Ala, Beta-2-D-Phe, Beta-2-L-His, Beta-2-L-Tyr, Beta-2-L-TioAla, Beta-2-L-Phe i L-tioAla u ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 1 je izabrana od Acetil D-Tyr, Acetil D-His, DezaminoTyr, D-Tyr, D-His i Acetil-D-Phe.

[0265] U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži na položaju 2 aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: Ala, Gly, Pro, sarkozina i Val. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 2 je Ser. U drugim aspektima, aminokiselina na položaju 2 je Ala ili Gly.

[0266] U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži na položaju 1 D-stereoizomer aminokiseline, kada je aminokiselina na položaju 2 jednaka Ala.

[0267] U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0268] U ilustrativnim aspektima, kada analog glukagona sadrži Gly na položaju 2, analog ne sadrži D-His, dezamino His na položaju 1. U nekim aspektima, analog glukagona ne sadrži na položaju 1 dezamino His i na položaju 2 Ala. U nekim aspektima, glukagon ne sadrži acetil His na položaju 1 i sarkozin na položaju 2.

[0269] U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0270] U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinu koja stabilizuje alfa spiralu na jednom ili više od položaja 16-21. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži na položaju 16 aminokiselinu koja stabilizuje alfa spiralu, izborno, negativno naelektrisanu aminokiselinu (npr., Glu) ili alfa, alfa disupstituisanu aminokiselinu. U ilustrativnim aspektima α,α-disupstituisana aminokiselina sadrži R<1>i R<2>, od kojih je svaki vezan za alfa ugljenik, gde je svaki od R<1>i R<2>nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od C1-C4alkila, izborno supstituisan sa hidroksil, amid, tiol, halo, ili R<1>i R<2>zajedno sa alfa ugljenikom za koji su vezani formiraju prsten. U ilustrativnim aspektima, α,α-disupstituisana aminokiselina je AIB. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži Arg na položaju 17 i malu alifatičnu aminokiselinu, izborno, Ala, na položaju 18. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona nije modifikovan na položaju 20 u poređenju sa SEQ ID NO: 1 i aminokiselina na položaju 20 je Gln. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži Glu na položaju 16, Arg na položaju 17, Ala na položaju 18, Ala na položaju 19 i Gln na položaju 20.

[0271] U ilustrativnim aspektima gore navedenog, analog glukagona sadrži acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 16, 20. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil grupu ili alkil grupu na bilo kom od položaja 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17 i 20. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu na položaju 10. U nekim aspektima, analog glukagona sadrži produžetak od 1 do 21 aminokiseline C-terminalno prema aminokiselini na položaju 29 i sadrži acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu na bilo kom od položaja 37-43 (npr., 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43). U nekim aspektima, aminokiselina koja sadrži ne-nativnu acil ili alkil grupu je na položaju 40.

[0272] U ilustrativnim aspektima gore navedenog, analog glukagona sadrži produžetak od 1 do 21 aminokiseline C-terminalno prema aminokiselini na položaju 29 i, u nekim aspektima, produžetak formira strukturu poznatu u stanju tehnike kao Trp kavez. U nekim aspektima, produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5) ili GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 6) ili GPSSGRPPPS (SEQ ID NO:68) ili sekvencu od jednog od gore navedenih sa 1, 2 ili 3 konzervativne aminokiselinske supstitucije. U ilustrativnim aspektima kada analog glukagona sadrži produžetak od 1 do 21 aminokiseline, analog glukagona sadrži Gly, Ala ili Leu na položaju 29.

[0273] U ilustrativnim aspektima, acilovana aminokiselina ili alkilovana aminokiselina sadrži strukturu formule I (izborno, Lys), formule II, (izborno, Cys), ili formule III, (izborno, Ser).

Izborno, u nekim aspektima, acilovana aminokiselina ili alkilovana aminokiselina sadrži strukturu formule I, npr., Lys.

[0274] U nekim aspektima, acilovana aminokiselina ili alkilovana aminokiselina je vezana za acil grupu ili alkil grupu preko spejsera. U nekim aspektima, spejser je 3 do 10 atoma u dužinu. U nekim aspektima, spejser je aminokiselina ili dipeptid, i, u nekim aspektima, spejser sadrži jedan ili dva kisela aminokiselinska ostatka, npr., Glu. U nekim aspektima, acil ili alkil grupa je vezana za aminokiselinu pri čemu je ukupna dužina spejsera i acil grupe oko 14 do oko 28 atoma u dužinu. U nekim aspektima, spejser sadrži jedan ili dva gama-Glu.

[0275] U vezi sa acilovanom aminokiselinom, acil grupa u nekim aspektima je C12do C18(npr., C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18) masna acil grupa. U nekim aspektima, acil grupa je C14 ili C16 masna acil grupa.

[0276] U ilustrativnim aspektima gore navedenih primera izvođenja, analog glukagona sadrži Glu na položaju 15, položaju 21, ili položaju 28, ili na položajima 15 i 21, na položajima 15 i 28, ili na položajima 21 i 28, ili na položajima 15, 21 i 28. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži Glu na jednom položaju 28 od položaja 15, 21 i 28.

[0277] U nekim aspektima predmetnih otkrića, analog glukagona sadrži najmanje jednu naleketrisanu aminokiselinu C-terminalno prema aminokiselini na položaju 27. Na primer, u nekim aspektima, analog glukagona sadrži naleketrisanu aminokiselinu (npr., negativno naelektrisanu aminokiselinu) na položaju 28. Negativno naelektrisana aminokiselina u nekim aspektima je Asp ili Glu. Negativno naelektrisana aminokiselina u nekim aspektima je Glu. U alternativnim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je pozitivno naelektrisana aminokiselina, npr., pozitivno naelektrisana aminokiselina je aminokiselina formule I, npr., Lys.

[0278] U alternativnim ili dodatnim aspektima, analog glukagona sadrži aminokiselinsku modifikaciju na položaju 27, na položaju 29, ili na oba položaja 27 i 29. Na primer, aminokiselina na položaju 27 je u nekim aspektima Leu, Nle, Val ili Lys i/ili aminokiselina na položaju 29 je u nekim aspektima Gly ili Thr.

[0279] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je Asp i izborno, amino na položaju 29 je aminokiselina osim Gly, npr., Val, Ala, Leu, ili AIB.

[0280] U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 28 je Glu i aminokiselina na položaju 29 je Gly, Ala, ili Leu.

[0281] Analozi glukagona koji su ovde opisani mogu da sadrže dodatne aminokiselinske modifikacije, npr., do deset (npr., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) dodatnih aminokiselinskih modifikacija, u odnosu na SEQ ID NO: 1, kao što je dalje ovde razmatrano. U ilustrativnim aspektima, analog glukagona sadrži jedan ili više od:

i. Ile na položaju 7;

ii. Ile ili Arg na položaju 12;

iii. alifatičnu aminokiselinu, izborno, Ala, na položaju 18;

iv. kiselu aminokiselinu, izborno, Glu, na položaju 21;

v. Asn, Ala, ili AIB na položaju 24;

vi. alifatičnu aminokiselinu, izborno, Ala, ili Leu, ili Nle, na položaju 27;

vii. kiselu aminokiselinu, izborno, Glu, ili alifatičnu aminokiselinu, izborno, Ala, na položaju 28;

viii. alifatičnu aminokiselinu, izborno, Ala, na položaju 29;

ix. amidaciju na C-terminusu.

[0282] U skladu sa gore navedenim, analog glukagona u ilustrativnim aspektima sadrži, uglavnom se sastoji od ili se sastoji od aminokiselinske sekvence bilo koje od SEQ ID NOs: 11-34.

[0283] Otkriće daje peptid koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 35, X1X2X3GTFTSDX10SKYLX15X16X17X18X19X20X21FVQWLX27X28X29X30PSSGX35PPPS (SEQ ID NO: 35)

gde:

X1je izabran iz grupe koja se sastoji od: Acetil L-His, Acetil L-Tyr, Acetil L-Tio Ala, Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Tio Ala, Acetil beta-2-L-His, Acetil beta-2-L-Tyr, Acetil beta-2-L-Tio Ala, Acetil beta-2-DHis, Acetil beta-2-D-Tyr, Acetil beta-2-D-Tio Ala, Dezamino L-His, Dezamino L-Tyr, Dezamino L-TioAla, Dezamino D-His, Dezamino D-Tyr, Dezamino D-TioAla, Dezamino beta-2-L-His, Dezamino beta-2-L-Tyr, Dezamino beta-2-L-TioAla, Dezamino beta-2-D-His, Dezamino beta-2-D-Tyr, Dezamino beta-2-D-TioAla, DHis, D-Tyr, D-TioAla, Beta-2-D-His, Beta-2-D-Ala, Beta-2-D-TioAla, Beta-2-L-His, Beta-2-L-Tyr, Beta-2-LtioAla i L-tioAla;

X2je Ala, Gly, Pro, sarkozin, Ser i Val,

X3je Gln ili aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture I, II, ili III;

gde je struktura I, II i III jednaka:

Struktura III

gde R<1>je C0-3alkil ili C0-3heteroalkil; R<2>je NHR<4>ili C1-3alkil; R<3>je C1-3alkil; R<4>je H ili C1-3alkil;

X je NH, O, ili S; i Y je NHR<4>, SR<3>, ili OR<3>;

X10je Tyr ili aminokiselina kovalentno vezana za C12do C18acil ili alkil grupu;

X15je kisela aminokiselina, izborno, Glu ili Asp;

X17je Arg, His, Gln;

X19je Ala ili alfa, alfa disupstituisana aminokiselina;

X18je Arg ili Ala;

X20je izabrana iz grupe koja se sastoji od: alfa, alfa disupstituisane aminokiseline (npr., AIB) ili Gln ili His, Lys ili Ala;

X21je kisela aminokiselina, izborno, Asp ili Glu;

X27je Leu, Ala, Nle, ili Met;

X28je Ala ili kisela aminokiselina (izborno, Asp ili Glu);

X29je alifatična, npr., Ala ili Gly ili AIB ili Val;

X30je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala ili Gly

X35je Ala ili bazna aminokiselina (izborno, Arg ili Lys);

pri čemu, kada je X28jednak kiseloj aminokiselini, X35je bazna aminokiselina;

gde, izborno, kada je X28jednako Asp, tada X29nije Gly

gde, kada je X10jednako Tyr, peptid sadrži na položaju 40 aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil ili alkil grupu, i, gde, izborno, peptid sadrži Gly na položaju 41, i

gde C-terminalna aminokiselina peptida je amidovana;

gde, kada analog glukagona nema hidrofilnu grupu, analog glukagona ispoljava EC50na humanom GIP receptoru od manje od ili oko 0.5 nM, i gde analog glukagona ima manje od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.

[0284] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: Acetil D-Tyr, Acetil DHis, DezaminoTyr, D-Tyr, D-His i Acetil D-Phe.

[0285] U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži na položaju 2 aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: Ala, Gly, Pro, sarkozina i Val. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 2 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: Ala i Gly.

[0286] U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži D-stereoizomer aminokiseline na položaju 1, kada je aminokiselina na položaju 2 jednaka Ala.

[0287] U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0288] U ilustrativnim aspektima, kada peptid sadrži Gly na položaju 2, peptid ne sadrži D-His, dezamino His na položaju 1. U nekim aspektima, peptid ne sadrži na položaju 1 dezamino His i na položaju 2 Ala. U nekim aspektima, peptid ne sadrži acetil His na položaju 1 i sarkozin na položaju 2.

[0289] U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0290] U ilustrativnim aspektima peptida od SEQ ID NO: 35, X10je Tyr, peptid sadrži na položaju 40 aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil ili alkil grupu, i peptid izborno sadrži Gly na položaju 41. U alternativnim ilustrativnim aspektima peptida od SEQ ID NO: 35, X10je aminokiselina kovalentno vezana za C12-C18acil ili alkil grupu.

[0291] U ilustrativnim aspektima peptida od SEQ ID NO: 35, X20je Gln. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 16 je negativno naelektrisana aminokiselina, izborno, Glu. U ilustrativnim aspektima, X18je Ala. U ilustrativnim aspektima, X28je Glu. Takođe, u ilustrativnim aspektima, X27je Leu ili Nle, X29je Gly, peptid sadrži amidovani Gly na C-terminusu, ili njegovu kombinaciju.

[0292] Otkriće dodatno daje peptid koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 35 sa do 3 aminokiselinske modifikacije (npr., 0, 1, 2, ili 3 aminokiselinske modifikacije) u odnosu na SEQ ID NO: 35, gde peptid ispoljava agonističku aktivnost na humanom GIP receptoru i, humanom GLP-1 receptoru i/ili humanom receptoru za glukagon. Aminokiselinske modifikacije mogu biti bilo koja od onih koje su ovde opisane. U ilustrativnim aspektima peptida koji sadrže sekvencu od SEQ ID NO: 35 sa do 3 (npr., 1, 2, 3) aminokiselinskih modifikacija, aminokiselinske modifikacije se javljaju na položaju osim položaja 1.

[0293] Otkriće daje peptid koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 35, X1X2X3GTFTSDX10SKYLX15X16X17X18X19X20X21FVQWLX27X28X29X30PSSGX35PPPS (SEQ ID NO: 140)

gde:

X1je izabran iz grupe koja se sastoji od: Acetil L-His, Acetil L-Tyr, Acetil L-Tio Ala, Acetil L-Phe, Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Tio Ala, Acetil D-Phe, Acetil beta-2-L-His, Acetil beta-2-L-Tyr, Acetil beta-2-L-Tio Ala, Acetil beta-2-L-Phe, Acetil beta-2-D-His, Acetil beta-2-D-Tyr, Acetil beta-2-D-Tio Ala, Acetil beta-2-D-Phe, Dezamino L-His, Dezamino L-Tyr, Dezamino L-TioAla, Dezamino L-Phe, Dezamino D-His, Dezamino D-Tyr, Dezamino D-TioAla, Dezamino D-Phe, Dezamino beta-2-L-His, Dezamino beta-2-L-Tyr, Dezamino beta-2-L-TioAla, Dezamino beta-2-L-Phe, Dezamino beta-2-D-His, Dezamino beta-2-D-Tyr, Dezamino beta-2-D-TioAla, Dezamino beta-2-D-Phe, D-His, D-Tyr, D-TioAla, D-Phe, Beta-2-D-His, Beta-2-D-Ala, Beta-2-D-TioAla, Beta-2-D-Phe, Beta-2-L-His, Beta-2-L-Tyr, Beta-2-L-TioAla, Beta-2-L-Phe i L-tioAla.;

X2je Ala, Gly, Pro, sarkozin, Ser i Val,

X3je Gln ili aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture I, II ili III; gde, struktura I, II i III je:

Struktura I

Struktura III

X je NH, O, ili S; i Y je NHR<4>, SR<3>, ili OR<3>;

X10je Tyr ili aminokiselina kovalentno vezana za C12do C18acil ili alkil grupu;

X15je kisela aminokiselina, izborno, Glu ili Asp;

X17je Arg, His, Gln;

X19je Ala ili alfa, alfa disupstituisana aminokiselina;

X18je Arg ili Ala;

X20je izabran iz grupe koja se sastoji od: alfa, alfa disupstituisane aminokiseline (npr., AIB) ili Gln ili His, Lys ili Ala;

X21je kisela aminokiselina, izborno, Asp ili Glu;

X27je Leu, Ala, Nle, ili Met;

X28je Ala ili kisela aminokiselina (izborno, Asp ili Glu);

X29je alifatična, npr., Ala ili Gly ili AIB ili Val;

X30je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala ili Gly

X35je Ala ili bazna aminokiselina (izborno, Arg ili Lys);

gde, kada je X28kisela aminokiselina, X35je bazna aminokiselina;

gde, izborno, kada je X28jednako Asp, tada X29nije Gly

gde, kada je X10jednak Tyr, peptid sadrži na položaju 40 aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil ili alkil grupu, i, gde, izborno, peptid sadrži Gly na položaju 41, i

gde je C-terminalna aminokiselina peptida amidovana;

[0294] U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: Acetil D-Tyr, Acetil DHis, DezaminoTyr, D-Tyr, D-His i Acetil-D-Phe.

[0295] U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži na položaju 2 aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: Ala, Gly, Pro, sarkozin i Val. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 2 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: Ala i Gly.

[0296] U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži D-stereoizomer aminokiseline na položaju 1, kada je aminokiselina na položaju 2 jednaka Ala.

[0297] U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0298] U ilustrativnim aspektima, kada peptid sadrži Gly na položaju 2, peptid ne sadrži D-His, dezamino His na položaju 1. U nekim aspektima, peptid ne sadrži na položaju 1 dezamino His i na položaju 2 Ala. U nekim aspektima, peptid ne sadrži acetil His na položaju 1 i sarkozin na položaju 2.

[0299] U ilustrativnim aspektima, peptid sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

[0300] U ilustrativnim aspektima peptida od SEQ ID NO: 140, X10je Tyr, peptid sadrži na položaju 40 aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil ili alkil grupu, i peptid izborno sadrži Gly na položaju 41. U alternativnim ilustrativnim aspektima peptida od SEQ ID NO: 140, X10je aminokiselina kovalentno vezana za C12-C18acil ili alkil grupu.

[0301] U ilustrativnim aspektima peptida od SEQ ID NO: 140, X20je Gln. U ilustrativnim aspektima, aminokiselina na položaju 16 je negativno naelektrisana aminokiselina, izborno, Glu. U ilustrativnim aspektima, X18je Ala. U ilustrativnim aspektima, X28je Glu. Takođe, u ilustrativnim aspektima, X27je Leu ili Nle, X29je Gly, peptid sadrži amidovani Gly na C-terminusu, ili njihovu kombinaciju.

[0302] Pronalazak dodatno daje peptid koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 140 sa do 3 aminokiselinske modifikacije (npr., 0, 1, 2, ili 3 aminokiselinske modifikacije) u odnosu na SEQ ID NO: 140, gde peptid ispoljava agonističku aktivnost na humanom GIP receptoru i, humanom GLP-1 receptoru i/ili humanom receptoru za glukagon. Aminokiselinske modifikacije mogu biti bilo koje od onih koje su ovde opisane. U ilustrativnim aspektima peptida koji sadrže sekvencu od SEQ ID NO: 140 sa do 3 (npr., 1, 2, 3) aminokiselinske modifikacije, aminokiselinske modifikacije se javljaju na položaju osim položaja 1.

[0303] Pronalazak dalje daje peptid koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 11. U ilustrativnim aspektima, peptid se uglavnom sastoji od ili se sastoji od SEQ ID NO: 11.

[0304] Peptid koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 12 je takođe obezbeđen pronalaskom. U ilustrativnim aspektima, peptid se uglavnom sastoji ili se sastoji od SEQ ID NO: 12.

[0305] Peptid koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 13 je takođe obezbeđen pronalaskom. U ilustrativnim aspektima, peptid se uglavnom sastoji ili se sastoji od SEQ ID NO: 13.

[0306] Peptid koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 15 je takođe obezbeđen pronalaskom. U ilustrativnim aspektima, peptid se uglavnom sastoji ili se sastoji od SEQ ID NO: 15.

[0307] Peptid koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 16 je takođe obezbeđen pronalaskom. U ilustrativnim aspektima, peptid se uglavnom sastoji ili se sastoji od SEQ ID NO: 16.

[0308] Peptid koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 22 je takođe obezbeđen pronalaskom. U ilustrativnim aspektima, peptid se uglavnom sastoji ili se sastoji od SEQ ID NO: 22.

[0309] Ovde je takođe obezbeđen peptid koji sadrži:

(A) sekvencu od SEQ ID NO: 11 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 11;

(B) sekvencu od SEQ ID NO: 12 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 12,

(C) sekvencu od SEQ ID NO: 13 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 13, or

(D) sekvencu od SEQ ID NO: 15 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 15,

(E) sekvencu od SEQ ID NO: 16 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 16,

(F) sekvencu od SEQ ID NO: 22 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 22,

gde peptid ispoljava agonističku aktivnost na humanom GIP receptoru i humanom GLP-1 receptoru. U ilustrativnim aspektima peptida koji sadrže sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 11-13, 15, 16 i 22 sa do 3 (npr., 1, 2, 3) aminokiselinske modifikacije, aminokiselinske modifikacije se javljaju na položaju osim položaja 1.

[0310] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži strukturu na bazi ishodne sekvence koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-200, ali se razlikuje od ishodne sekvence na jednom ili više položaja.

[0311] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića je analog ishodne sekvence koji sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-200 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu na bazi aminokiselinske sekvence ishodne sekvence, ali se razlikuje od ishodne sekvence po tome što aminokiselinska sekvenca analoga sadrži jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, i u nekim slučajevima, 16 ili više (npr., 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, itd.), naznačenih ili izbornih aminokiselinskih modifikacija. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića sadrži ukupno 1, do 2, do 3, do 4, do 5, do 6, do 7, do 8, do 9, ili do 10 dodatnih aminokiselinskih modifikacija u odnosu na ishodnu sekvencu koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-200. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, modifikacije su bilo koja od onih opisanih ovde u odnosu na analoge glukagona, npr., acilacija, alkilacija, pegilacija, skraćenje na C-terminusu, supstitucija aminokiseline na jednom ili više od položaja 1, 2, 3, 7, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 28 i 29. U ilustrativnim aspektima, aminokiselinske modifikacije se javljaju na položaju osim položaja 1.

[0312] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, modifikacija je aminokiselinska supstitucija ili zamena, npr., konzervativna aminokiselinska supstitucija. U nekim aspektima, konzervativna supstitucija je zamena aminokiseline na jednom ili više od položaja 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 ili 29. U alternativnim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija nije konzervativna aminokiselinska supstitucija, npr., to je nekonzervativna aminokiselinska supstitucija. U ilustrativnim aspektima, aminokiselinska modifikacija se javlja na položaju osim položaja 1.

[0313] U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 25% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom ishodne sekvence, koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-200. U nekim primerima izvođenja, peptid predmetnih otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili ima više od 90% identičnosti sekvence ishodnoj sekvenci. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca sada otkrivenog peptida koji ima gore navedeni % identičnosti sekvence je aminokiselinska sekvenca pune dužine sada otkrivenog peptida. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca peptida predmetnih otkrića koja ima gore navedeni % identičnosti sekvence je samo deo aminokiselinske sekvence sada otkrivenog peptida. U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima oko A% ili veću identičnost sekvence sa referentnom aminokiselinskom sekvencom od najmanje 5 uzastopnih aminokiselina (npr., najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10 aminokiselina) ishodne sekvence, pri čemu referentna aminokiselinska sekvenca počinje sa aminokiselinom na položaju C od SEQ ID NO: 1 i završava se sa aminokiselinom na položaju D od SEQ ID NO: 1, gde A je 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99; C je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 i D je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29. Bilo koja i sve moguće kombinacije gore navedenih parametara su predviđeni, uključujući npr., gde je A jednako 90% i C i D su 1 i 27, ili 6 i 27, ili 8 i 27, ili 10 i 27, ili 12 i 27, ili 16 i 27.

[0314] Analozi ishodne sekvence koji sadrže bilo koju od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-200 opisani ovde sadrže peptidnu osnovu bilo kog broja aminokiselina, tj., mogu biti bilo koje dužine peptida. U nekim primerima izvođenja, peptidi koji su ovde opisani su iste dužine kao SEQ ID NO: 1, tj., oni su 29 aminokiselina u dužinu. U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid je duži od 29 aminokiselina u dužinu, npr., sada otkriveni peptid sadrži C-terminalni produžetak od 1-21 aminokiselina, kao što je dodatno ovde opisano. Prema tome, peptid predmetnih otkrića u nekim primerima izvođenja, je 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50 aminokiselina u dužinu. U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid je dužine do 50 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid je duži od 29 aminokiselina u dužinu (npr., veći od 50 aminokiselina (npr., najmanje ili oko 60, najmanje ili oko 70, najmanje ili oko 80, najmanje ili oko 90, najmanje ili oko 100, najmanje ili oko 150, najmanje ili oko 200, najmanje ili oko 250, najmanje ili oko 300, najmanje ili oko 350, najmanje ili oko 400, najmanje ili oko 450, najmanje ili oko 500 aminokiselina u dužinu) kao posledica fuzije sa drugim peptidom. U drugim primerima izvođenja, sada otkriveni peptid je dužine manje od 29 aminokiselina u dužinu, npr., 28, 27, 26, 25, 24, 23, aminokiselina.

[0315] U skladu sa gore navedenim, u nekim aspektima, peptid predmetnih otkrića je analog ishodne sekvence koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 11-18, 21-23, 25-31, 33-36, 38, 39, 100-200 koja sekvenca od analoga sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje utuču na aktivnost GIP, aktivnost glukagona i/ili aktivnost GLP-1, pojačavaju stabilnost, npr., smanjenjem razlaganja peptida (npr., poboljšanjem otpornosti na DPP-IV proteaze), pojačavaju rastvorljivost, povećavaju polu-život, odlažu početak aktivnosti, produžavaju trajanje delovanja na receptoru za GIP, glukagon ili GLP-1, ili kombinaciju bilo kojih od gorenavedenih. Takve aminokiselinske modifikacije, pored drugih modifikacija, su dalje opisane ovde u odnosu na analoge glukagona, i bilo koja od ovih modifikacija može biti primenjena pojedinačno ili ukombinaciji.

POSTUPCI ZA PRIPREMU PEPTIDA

[0181] Analozi glukagona otkrića mogu biti dobijeni pomoću postupaka poznatih u stanju tehnike. Pogodni postupci de novo sinteze peptida su opisani u, na primer, Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide i Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; i SAD patentu br. 5,449,752. Dodatni ilustrativni postupci za pripremu peptida predmetnih otkrića su navedeni u Primerima 1 i 2.

[0317] U nekim primerima izvođenja, peptidi koji su ovde opisani su komercijalno sintetisani od strane kompanija, kao što su Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) i Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). U tom smislu, peptidi mogu biti sintetički, rekombinantni, izolovani i/ili prečišćeni.

[0318] Takođe, u slučajevima u kojima analozi otkrića ne sadrže nijednu nekodiranu ili neprirodnu aminokiselinu, analog glukagona može biti rekombinantno proizveden upotrebom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu analoga upotrebom standardnih rekombinantnih postupaka. Videti, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates i John Wiley & Sons, NY, 1994.

[0319] U nekim primerima izvođenja, izolovani su analozi glukagona otkrića. Termin "izolovan" kao što je ovde korišćen označava da je uklonjen iz njegove prirodne sredine. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog je pripremljen preko rekombinantnih postupaka i analog je izolovan iz ćelije domaćina.

[0320] U nekim primerima izvođenja, prečišćeni su analozi glukagona otkrića. Termin "prečišćen," kao što je ovde korišćen označava izolaciju molekula ili jedinjenja u obliku koji je značajno bez kontaminanata koji su u nekim aspektima normalno povezani sa molekulom ili jedinjenjem u nativnoj ili prirodnoj sredini i označava da je povećana čistoća kao rezultat odvajanja od drugih komponenti originalne kompozicije. Prečišćeni peptid ili jedinjenje obuhvataju, na primer, peptide značajno bez molekula nukleinske kiseline, lipida i ugljenih hidrata, ili drugog početnog materijala ili intermedijera koji su korišćeni ili formirani u toku hemijske sinteze peptida. Prepoznaje se da je "čistoća" relativan termin, i ne bi ga trebalo neophodno tumačiti kao čistoću ili apsolutno obogaćenje ili apsolutnu selekciju. U nekim aspektima, čistoća je najmanje ili oko 50%, je najmanje ili oko 60%, najmanje ili oko 70%, najmanje ili oko 80%, ili najmanje ili oko 90% (npr., najmanje ili oko 91%, najmanje ili oko 92%, najmanje ili oko 93%, najmanje ili oko 94%, najmanje ili oko 95%, najmanje ili oko 96%, najmanje ili oko 97%, najmanje ili oko 98%, najmanje ili oko 99% ili je približno 100%.

KONJUGATI

[0321] Pronalazak dalje daje konjugate koji sadrže jedan ili više analoga glukagona koji su ovde opisani konjugovane za heterolognu grupu. Kao što je ovde korišćen, termin "heterologna grupa" je sinonim sa terminom "grupa konjugata" i označava bilo koji molekul (hemijski ili biohemijski, koji se javlja u prirodi ili nekodiran) koji je različit od analoga glukagona koji su ovde opisani. Primeri grupa konjugata kojei mogu biti vezane za bilo koji od analoga koji su ovde opisani obuhvataju, ali bez ograničenja na heterologni peptid ili polipeptid (uključujući na primer, protein plazme), ciljno sredstvo, imunoglobulin ili njegov deo (npr., varijabilni region, CDR ili Fc region), dijagostički obeleživač kao što je radioaktivni izotop, fluorofora ili enzimatski obeleživač, polimer uključujući polimere rastvorljive u vodi, ili druga terapeutska ili dijagnostička sredstva. U nekim primerima izvođenja obezbeđen je konjugat koji sadrži analog predmetnog otkrića i protein plazme, pri čemu je protein plazme izabran iz grupe koja se sastoji od albumina, transferina, fibrinogena i globulina. U nekim primerima izvođenja deo proteina plazme od konjugata je albumin ili transferin. Konjugat u nekim primerima izvođenja sadrži jedan ili više analoga glukagona koji su ovde opisani i jedan ili više od: peptida (koji se razlikuje od aktivnih analoga glukagona receptora za glukagon i/ili GLP-1 receptora koji su ovde opisani), polipeptida, molekula nukleinske kiseline, antitela ili njegovog fragmenta, polimera, kvantne tačke, malog molekula, toksina, dijagnostičkog sredstva, ugljenog hidrata, aminokiseline.

[0322] U nekim primerima izvođenja, heterologna grupa je peptid koji je različit od analoga glukagona koji su ovde opisani i konjugat je fuzioni peptid ili himerni peptid. U nekim primerima izvođenja, heterologna grupa je peptidni produžetak od 1-21 aminokiselina. U specifičnim primerima izvođenja, produžetak je vezan za C-terminus analoga glukagona, npr., za aminokiselinu na položaju 29.

[0323] U nekim specifičnim aspektima, produžetak je jedna aminokiselina ili dipeptid. U specifičnim primerima izvođenja, produžetak sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: naelektrisane aminokiseline (npr., negativno naelektrisane aminokiseline (npr., Glu), pozitivno naelektrisane aminokiseline), aminokiseline koja sadrži hidrofilni deo. U nekim aspektima, produžetak je Gly, Glu, Cys, Gly-Gly, Gly-Glu.

[0324] U nekim primerima izvođenja, produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 9 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 10 (GGPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 8 (KRNRNNIA) ili SEQ ID NO: 11 (KRNR). U specifičnim aspektima, aminokiselinska sekvenca je vezana preko C-terminalne aminokiseline analoga glukagona, npr., aminokiseline na položaju 29. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca od SEQ ID NOs: 13-16 je vezana za aminokiselinu 29 analoga glukagona preko peptidne veze. U nekim specifičnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 29 analoga glukagona je Gly i Gly je fuzionisan sa jednom od aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NOs: 8-11.

[0325] U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je polimer. U nekim primerima izvođenja, polimer je izabran iz grupe koja se sastoji od: poliamida, polikarbonata, polialkilena i njihovih derivata uključujući, polialkilen glikole, polialkilen okside, polialkilen tereftalate, polimere akrilnih i metakrilnih estara, uključujući poli(metilmetakrilat), poli(etil metakrilat), poli(butilmetakrilat), poli(izobutil metakrilat), poli(heksilmetakrilat), poli(izodecil metakrilat), poli(lauril metakrilat), poli(fenil metakrilat), poli(metil akrilat), poli(izopropil akrilat), poli(izobutil akrilat), i poli(oktadecil akrilat), polivinil polimeri uključujući polivinil alkohole, polivinil etre, polivinil estre, polivinil halogenide, poli(vinil acetat), i polivinilpirolidon, poliglikolide, polisiloksane, poliuretane i njihove kopolimere, celuloze uključujući alkil celulozu, hidroksialkil celuloze, celulozne etre, celulozne estre, nitro celuloze, metil celulozu, etil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksi-propil metil celulozu, hidroksibutil metil celulozu, celuloza acetat, celuloza propionat, celuloza acetat butirat, celuloza acetat ftalat, karboksiletil celulozu, celuloza triacetat i celuloza sulfat natrijum so, polipropilen, polietilene uključujući poli(etilen glikol), poli(etilen oksid), i poli(etilen tereftalat), i polistiren.

[0326] U nekim aspektima, polimer je biorazgradivi polimer, uključujući sintetički biorazgradivi polimer (npr., polimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline, polianhidridi, poli(orto)estre, poliuretane, poli(buterna kiselina), poli(valerijanska kiselina) i poli(laktidkokaprolakton)), i prirodni biorazgradivi polimer (npr., alginat i drugi polisaharidi uključujući dekstran i celulozu, kolagen, njihove hemijske derivate (supstitucije, adicije hemijskih grupa, na primer, alkil, alkilen, hidroksilacije, oksidacije i druge modifikacije rutinski napravljene od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike), albumin i druge hidrofilne proteine (npr., zein i druge poliamine i hidrofobne proteine)), kao i bilo koji kopolimer ili njegovu smešu. Uopšteno, ovi materijali se razlažu putem enzimatske hidrolize ili preko izlaganja vodi in vivo, putem površinske ili obilne erozije.

[0327] U nekim aspektima, polimer je bioadhezivni polimer, kao što je bioerodiblni hidrogen opisan od strane H. S. Sawhney, C. P. Pathak i J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587, polihijaluronske kiseline, kazein, želatin, glutin, polianhidridi, poliakrilna kiselina, alginat, hitozan, poli(metil metakrilati), poli(etil metakrilati), poli(butilmetakrilat), poli(izobutil metakrilat), poli(heksilmetakrilat), poli(izodecil metakrilat), poli(lauril metakrilat), poli(fenil metakrilat), poli(metil akrilat), poli(izopropil akrilat), poli(izobutil akrilat), i poli(oktadecil akrilat).

[0328] U nekim primerima izvođenja, polimer je polimer rastvorljiv u vodi ili hidrofilni polimer. Hidrofilni polimeri su dalje ovde opisani pod "Hidrofilni delovi." Pogodni polimeri rastvorljivi u vodi su poznati u stanju tehnike i obuhvataju, na primer, polivinilpirolidon, hidroksipropil celulozu (HPC; Klucel), hidroksipropil metilcelulozu (HPMC; Methocel), nitrocelulozu, hidroksipropil etilcelulozu, hidroksipropil butilcelulozu, hidroksipropil pentilcelulozu, metil celulozu, etilcelulozu (Ethocel), hidroksietil celulozu, različite alkil celuloze i hidroksialkil celuloze, različite celulozne etre, celuloza acetat, karboksimetil celulozu, natrijum karboksimetil celulozu, kalcijum karboksimetil celulozu, kopolimere vinil acetata/krotonske kiseline, poli-hidroksialkil metakrilat, hidroksimetil metakrilat, kopolimere metakrilne kiseline, polimetakrilnu kiselinu, polimetilmetakrilat, kopolimere anhidrida maleinske kiseline/metil vinil etra, polivinil alkohol, natrijum i kalcijum poliakrilnu kiselinu, poliakrilnu kiselinu, kisele karboksi polimere, karboksipolimetilen, karboksivinil polimere, polioksietilen polioksipropilen kopolimer, polimetilviniletar ko-anhidrid maleinske kiseline, karboksimetilamid, kalcijum metakrilat divinilbenzen ko-polimer, polioksietilenglikoli, polietilen oksid, i njihove derivate, soli i kombinacije.

[0329] U specifičnim primerima izvođenja, polimer je polialkilen glikol, uključujući, na primer, polietilen glikol (PEG).

[0330] U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je ugljeni hidrat. U nekim primerima izvođenja, ugljeni hidrat je monosaharid (npr., glukoza, galaktoza, fruktoza), disaharid (npr., saharoza, laktoza, maltoza), oligosaharid (npr., rafinoza, stahioza), polisaharid (npr., skrob, amilaza, amilopektin, celuloza, hitin, kaloza, laminarin, ksilan, manan, fukoidan, galaktomanan.

[0331] U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je lipid. Lipid, u nekim primerima izvođenja, je masna kiselina, ejkozanoid, prostaglandin, leukotrien, tromboksan, N-acil etanolamin), glicerolipid (npr., mono-, di-, tri-supstituisani gliceroli), glicerofosfolipid (npr., fosfatidilholin, fosfatidilinozitol, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin), sfingolipid (npr., sfingozin, ceramid), sterol lipid (npr., steroid, holesterol), prenol lipid, saharolipid, ili poliketid, ulje, vosak, holesterol, sterol, vitamin rastvorljiv u masti, monoglicerid, diglicerid, triglicerid, fosfolipid.

[0332] U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je vezan preko nekovalentne ili kovalentne veze za analog predmetnog otkrića. U ilustrativnim aspektima, heterologni deo je vezan za analog predmetnog otkrića preko linkera. Veza može biti postignuta preko kovalentnih hemijskih veza, fizičkih sila kao što su elektrostatička, vodonična, jonska, van der Waals-ove, ili hidrofobne ili hidrofilne interakcije. Mogu biti korišćeni različiti sistemi nekovalentnog spajanja, uključujući biotin-avidin, ligand/receptor, enzim/supstrat, nukleinska kiselina/vezujući protein nukleinske kiselne, lipid/vezujući protein lipida, partneri ćelijskih adhezionih molekula; ili bilo koji vezujući partneri ili njihovi fragmenti koji imaju afinitet jedan za drugog.

[0333] Analog glukagona u nekim primerima izvođenja je vezan za konjugovane delove preko direktne kovalentne veze reakcijom ciljanih aminokiselinskih ostataka analoga sa organskim derivatizujućim sredstvom koje je sposobno da reaguje sa izabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima ovih ciljanih aminokiselina. Reaktivne grupe na analogu ili konjugatnom delu obuhvataju, npr., aldehid, amino, estar, tiol, α-haloacetil, maleimido ili hidrazino grupu. Derivatizujuća sredstva obuhvataju, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid estar (konjugacija preko cisteinskih ostataka), Nhidroksisukcinimid (preko lizinskih ostataka), glutaraldehid, anhidrid ćilibarne kiseline ili druga sredstva poznata u stanju tehnike. Alternativno, konjugatni delovi mogu biti vezani za analog indirektno preko intermedijernih nosača, kao što su polisaharidni ili polipeptidni nosači. Primeri polisaharidnih nosača obuhvataju aminodekstran. Primeri pogodnih polipeptidnih nosača obuhvataju polilizin, poliglutaminsku kiselinu, poliasparaginsku kiselinu, njihove ko-polimere i mešani polimeri ovih aminokiselina i drugih, npr., serina, za obezbeđivanje poželjnih osobina rastvorljivosti za rezultujući dodati nosač.

[0334] Cisteinil ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina, hloroacetamid da bi se dobili karboksimetil ili karboksiamidometil derivati. Cisteinil ostaci su takođe derivatizovani reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, alfa-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, phloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.

[0335] Histidil ostaci su derivatizovani reakcijom sa dietilpirokarbonatom na pH 5.5-7.0 zbog toga što je ovo sredstvo relativno specifično za histidil bočni lanac. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija je poželjno izvedena u 0.1 M natrijum kakodilatu na pH 6.0.

[0336] Lizinil i amino-terminalni ostaci su reagovali sa anhidridom ćilibarne ili anhidridima drugih karboksilnih kiselina. Derivatizacija sa ovim sredstvima ima efekat reverzije naelektrisanja lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrži alfa-amino obuhvataju imidoestre kao što su metil pikolinimidat, piridoksal fosfat, piridoksal, hloroborohidrid, trinitrobenzensulfonska kiselina, O-metilizourea, 2,4-pentandion i reakcija sa glioksilatom katalizovana transaminazom.

[0337] Arginil ostaci su modifikovani pomoću reakcije sa jednim ili nekoliko konvencionalnih reagenasa, među njima fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion, i ninhidrin. Derivatizacija argininskih ostataka zahteva da reakcija bude izvedena u alkalinnim uslovima zbog visoke pKa guanidin funkcionalne grupe. Pored toga, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina kao i arginin epsilon-amino grupom.

[0338] Specifična modifikacija tirozil ostataka može biti napravljena, sa posebnim interesom u uvođenju spektralnih obeleživača u tirozil ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće, N-acetilimidizol i tetranitrometan su korišćeni za formiranje O-acetil tirozil vrsta i 3-nitro derivata, respektivno.

[0339] Karboksil bočne grupe (aspratil ili glutamil) su selektivno modifikovane reakcijom sa karbodiimidima (R-N=C=NR’), gde su R i R’ različite alkil grupe, kao što je 1-cikloheksil-3(2-morfolinil-4-etil)karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)karbodiimid. Pored toga, aspartil i glutamil ostaci su prevedeni u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijum jonima.

[0340] Druge modifikacije obuhvataju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksil grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju alfa-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure i Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), deamidaciju asparagina ili glutamina, acetilaciju N-terminalnog amina i/ili amidaciju ili esterifikaciju C-terminalne grupe karboksilne kiseline.

[0341] Sledeći tip kovalentne modifikacije obuhvata hemijsko ili enzimatsko kuplovanje glikozida za analog. Šećer(i) mogu biti vezani za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksil grupe, (c) slobodne sulfhidril grupe kao što su one od cisteina, (d) slobodne hidroksil grupe kao što su one od serina, treonina ili hidroksiprolina, (e) aromatične ostatke kao što su oni od tirozina ili triptofana, ili (f) amidnu grupu glutamina. Ovi postupci su opisani u WO87/05330 objavljenom 11.09.1987., i u Aplin i Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306 (1981).

[0342] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je konjugovan za heterologni deo preko kovalentne veze između bočnog lanca aminokiseline analoga glukagona i heterolognog dela. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je konjugovan za heterologni deo preko bočnog lanca aminokiseline na položaju 16, 17, 21, 24 ili 29, položaju unutar C-terminalnog produžetka, ili C-terminalne aminokiseline ili kombinacije ovih položaja. U nekim aspektima, aminokiselina kovalentno vezana za heterologni deo (npr., aminokiselina koja sadrži heterologni deo) je Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, i bočni lanac aminokiseline je kovalentno vezan za heterologni deo.

[0343] U nekim primerima izvođenja, konjugat sadrži linker koji spaja analog glukagona za heterologni deo. U nekim aspektima, linker sadrži lanac od atoma od 1 do oko 60, ili 1 do 30 atoma ili duže, 2 do 5 atoma, 2 do 10 atoma, 5 do 10 atoma, ili 10 do 20 atoma dužine. U nekim primerima izvođenja, atomi lanca su svi atomi ugljenika. U nekim primerima izvođenja, atomi lanca u osnovi linkera su izabrani iz grupe koja se sastoji od C, O, N i S. Atomi lanca i linkeri mogu biti izabrani prema njihovoj očekivanoj rastvorljivosti (hidrofilnosti) tako da se obezbedi rastvorljiviji konjugat. U nekim primerima izvođenja, linker obezbeđuje funkcionalnu grupu koja je podvrgnuta cepanju enzimom ili drugim katalizatorom ili hidrolitičkim uslovima koji se nalaze u ciljnom tkivu ili organu ili ćeliji. U nekim primerima izvođenja, dužina linkera je dovoljno duga da smanji potencijal za prostornu prepreku. Ako je linker kovalentno vezan ili peptidil veza i konjugat je polipeptid, ceo konjugat može biti fuzioni protein. Takvi peptidil linkeri mogu biti bilo koje dužine. Primeri linkera su od oko 1 do 50 aminokiselina u dužinu, 5 do 50, 3 do 5, 5 do 10, 5 do 15, ili 10 do 30 aminokiselina u dužinu. Takvi fuzioni proteini mogu alternativno biti proizvedeni pomoću postupaka rekombinantnog genetičkog inženjeringa poznatih stručnjaku iz date oblasti tehnike.

Konjugati: Fc fuzije

[0344] Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, u nekim primerima izvođenja, analozi su konjugovani, npr., fuzionisani za imunoglobulin ili njegov deo (npr., varijabilni region, CDR, ili Fc region). Poznati tipovi imunoglobulina (Ig) obuhvataju IgG, IgA, IgE, IgD ili IgM. Fc region je C-terminalni region teškog lanca Ig, koji je odgovoran za vezivanje za Fc receptore koji izvršavaju aktivnosti kao to je reciklaža (koja rezultira u produženom polu-životu), ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), i citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).

[0345] Na primer, prema nekim definicijama humani Fc region teškog lanca IgG se proteže od Cys226 do C-terminusa teškog lanca. "Zglobni region" generalno se proteže od Glu216 do Pro230 humanog IgG1 (zglobni regioni drugih IgG izotipova mogu biti poravnati sa IgG1 sekvencom poravnanjem cisteina uključenih u vezivanje cisteina). Fc region od IgG obuhvata dva konstanta domena, CH2i CH3. CH2domen humanog Fc regiona IgG obično se proteže od aminokiselina 231 do aminokiseline 341. CH3domen gumanog Fc regiona IgG obično se proteže od aminokiselina 342 do 447. Pozivanje na aminokiselinsku numeraciju imunoglobulina ili fragmenata ili regiona imunoglobulina, su svi bazirani na Kabat et al.

1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md. U srodnim primerima izvođenja, Fc region može da sadrži jedan ili više nativnih ili modifikovanih konstatnih regiona iz teškog lanca imunoglobulina, osim CH1, na primer, CH2 i CH3 regione od IgG i IgA, ili CH3i CH4 regione od IgE.

[0346] Pogodni konjugovani delovi obuhvataju delove imunoglobulinske sekvence koji obuhvataju FcRn vezujuće mesto. FcRn, spašavajući receptor, je odgovoran za reciklažu imunoglobulina i njihovo vraćanje u cirkulaciju krvi. Region Fc dela od IgG koji se vezuje za FcRn receptor opisan je na osnovu rendgenske kristalografije (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Glavna površina kontakta Fc sa FcRn je blizu spoja CH2 i CH3 domena. Fc-FcRn kontakti su svi unutar jednog teškog lanca Ig. Glavna mesta kontakta obuhvataju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 od CH2 domena i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 od CH3 domena.

[0347] Neki konjugatni delovi mogu ili ne moraju da obuhvataju FcγR vezujuće mesto(a). FcγR su odgovorni za ADCC i CDC. Primeri položaja unutar Fc regiona koji prave direktni kontakt sa FcγR su aminokiseline 234-239 (donji zglobni region), aminokiseline 265-269 (B/C petlja), aminokiseline 297-299 (C’/E petlja), i aminokiseline 327-332 (F/G) petlja (Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000). Donji zglobni region od IgE takođe je uključen u vezivanje FcRI (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997). Ostaci uključeni u vezivanje IgA receptora opisani su u Lewis et al., (J Immunol. 175:6694-701, 2005). Aminokiselinski ostaci uključeni u vezivanje IgE receptora opisani su u Sayers et al. (J Biol Chem.279(34):35320-5, 2004).

[0348] Aminokiselinske modifikacije mogu biti napravljene u Fc regionu imunoglobulina. Takve varijante Fc regiona sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju u CH3domenu Fc regiona (ostaci 342-447) i/ili najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju u CH2domenu Fc regiona (ostaci 231-341). Mutacije za koje se veruje da daju povećani afinitet za FcRn obuhvataju T256A, T307A, E380A i N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem.

276:6591). Druge mutacije mogu da smanje vezivanje Fc regiona za FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB i/ili FcγRIIIA bez značajnog smanjenja afiniteta za FcRn. Na primer, supstitucija Asn na položaju 297 Fc regiona sa Ala ili drugom aminokiselinom uklanja visoko konzervativno N-glikozilaciono mesto i može da rezultira u smanjenoj imunogenosti sa istovremenim produženim polu-životom Fc regiona, kao i smanjenim vezivanjem za FcγRs (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al.1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Napravljene su aminokiselinske modifikacije na položajima 233-236 od IgG1 koje smanjuju vezivanje za FcγRs (Ward i Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 i Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613). Neke ilustrativne aminokiselinske supstitucije su opisane u SAD patentima 7,355,008 i 7,381,408.

Konjugati: hidrofilni delovi

[0349] Analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti dalje modifikovani tako da poboljšaju njegovu rastvorljivost i stabilnost u vodenim rastvorima na fiziološkoj pH, uz zadržavanje visoke biološke aktivnosti u odnosu na nativni glukagon. Hidrofilni delovi kao što su PEG grupe mogu biti vezani za analoge pod bilo kojim pogodnim uslovima korišćenim za reakciju proteina sa aktiviranim polimernim molekulom. Bilo koji načini poznati u stanju tehnike mogu biti korišćeni, uključujući preko acilacije, reduktivne alkilacije, Michael-ove adicije, tiol alkilacije ili drugih postupaka hemoselektivne konjugacije/ligacije preko reaktivne grupe na PEG delu (npr., aldehidna, amino, estarska, tiol, α-haloacetil, maleimido ili hidrazino grupa) za reaktivnu grupu na ciljnom jedinjenju (npr., aldehidna, amino, estarska, tiol, α-haloacetil, maleimido ili hidrazino grupa). Aktivirajuće grupe koje mogu biti korišćene za vezivanje polimera rastvorljivog u vodi za jedan ili više proteina obuhvataju bez ograničenja sulfon, maleimid, sulfhidril, tiol, triflat, trezilat, azidirin, oksiran, 5-piridil i alfahalogenizovanu acil grupu (npr., alfa jodo sirćetna kiselina, alfa-bromosirćetna kiselina, alfahlorosirćetna kiselina). Ako je vezan za analog putem reduktivne alkilacije, izabrani polimer bi trebalo da ima jedan reaktivni aldehid tako da je stepen polimerizacija kontrolisan. Videti, na primer, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev.54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); i Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995).

[0350] U specifičnim aspektima, aminokiselinski ostatak analoga koji ima tiol je modifikovan sa hidrofilnim delom kao što je PEG. U nekim primerima izvođenja, tiol je modifikovan sa maleimidom-aktiviranim PEG u Michael-ovoj reakciji adicije da bi se dobio PEGilovani analog koji sadrži tioetarsku vezu prikazanu u daljem tekstu:

[0351] U nekim primerima izvođenja, tiol je modifikovan sa haloacetilom-aktiviranim PEG u reakciji nukleofilne supstitucije da bi se dobio PEGilovani analog koji sadrži tioetarsku vezu.

[0352] Pogodni hidrofilni delovi obuhvataju polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol, polioksietilovane poliole (npr., POG), polioksietilovani sorbitol, polioksietilovanu glukozu, polioksietilovani glicerol (POG), polioksialkilene, polietilen glikol propionaldehid, kopolimere etilen glikola/propilen glikola, monometoksi-polietilen glikol, mono-(C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol, karboksimetilcelulozu, poliacetale, polivinil alkohol (PVA), polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilena/anhidrida maleinske kiseline, poli (beta-aminkiseline) (homopolimeri ili slučajni kopolimeri), poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimeri (PPG) i drugi polialkilen oksidi, kopolimeri polipropilen oksida/etilen kopolimeri, kiseline debelog creva ili drugi polisaharidni polimeri, Ficoll ili dekstran ili njihove smeše. Dekstrani su polisaharidni polimeri glukoznih podjedinica, pretežno vezani preko α1-6 veza. Dekstran je dostupan u mnogim opsezima molekulskih težina, npr., oko 1 kD to oko 100 kD, ili od oko 5, 10, 15 ili 20 kD do oko 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90 kD. Razmatrani su linearni ili granati polimeri. Rezultujući preparati konjugata mogu biti uglavnom monodisperzni ili polidisperzni, i mogu imati oko 0.5, 0.7, 1, 1.2, 1.5 ili 2 polimerna dela po analogu.

[0353] U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, analog glukagona je konjugovan za hidrofilnu grupu preko kovalentne veze između bočnog lanca aminokiseline analoga glukagona i hidrofilne grupe. U nekim ili bilo kojim primerima izvođenja, analog glukagona je konjugovan za hidrofilni grupu preko bočnog lanca aminokiseline na položaju 16, 17, 21, 24 ili 29, položaju unutar C-terminalnog produžetka, ili C-terminalne aminokiseline, ili kombinacije ovih položaja. U nekim aspektima, aminokiselina kovalentno vezana za hidrofilnu grupu (npr., aminokiselina koja sadrži hidrofilnu grupu) je Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, i bočni lanac aminokiseline je kovalentno vezan za hidrofilnu grupu (npr., PEG).

Konjugati: rPEG

[0354] U nekim primerima izvođenja, konjugat predmetnog otkrića sadrži analog glukagona koji ima aktivnost agonista receptora za glukagon fuzionisan za pomoćni analog koji je sposoban da formira produženu konformaciju sličnu hemijskom PEG (npr., rekombinantni PEG (rPEG) molekul), kao što su oni opisani u objavi međunarodne patentne prijave br. WO2009/023270 i objavi SAD patentne prijave br. US20080286808. rPEG molekul u nekim aspektima je polipeptid koji sadrži jedan ili više od glicina, serina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, alanina ili prolina. U nekim aspektima, rPEG je homopolimer, npr., poli-glicin, poli-serin, poli-glutaminska kiselina, poli-asparaginska kiselina, polialanin, ili poli-prolin. U drugim primerima izvođenja, rPEG sadrži ponovljena dva tipa aminokiselina, npr., poli(Gly-Ser), poli(Gly-Glu), poli(Gly-Ala), poli(Gly-Asp), poli(Gly-Pro), poli(Ser-Glu), itd. U nekim aspektima, rPEG sadrži tri različita tipa aminokiselina, npr., poli(Gly-Ser-Glu). U specifičnim aspektima, rPEG povećava polu-život analoga agonista glukagona i/ili GLP-1. U nekim aspektima, rPEG sadrži ukupno pozitivno ili ukupno negativno naelektrisanje. rPEG u nekim aspektima nema sekundarnu strukturu. U nekim primerima izvođenja, rPEG je veći od ili jednak 10 aminokiselina u dužinu i u nekim primerima izvođenja je oko 40 do oko 50 aminokiselina u dužinu. Pomoćni peptid u nekim aspektima je fuzionisan za N- ili C-terminus analoga predmetnog otkrića preko peptidne veze ili mesta cepanja proteinazom, ili je inseriran u petlje analoga predmetnog otkrića. rPEG u nekim aspektima sadrži afinitetni obeleživač ili je vezan za PEG koji je veći od 5 kDa. U nekim primerima izvođenja, rPEG daje analog prema predmetnom otkriću sa povećanim hidrodinamičkim radijusom, polu-životom u serumu, otpornošću na proteazu ili rastvorljivošću i u nekim aspektima daje analog sa smanjenom imunogenošću.

Konjugati: multimeri

[0355] Pronalazak dalje daje multimere ili dimere analoga koji su ovde opisani, uključujući homo- ili heteromultimere ili homo- ili hetero- dimere. Dva ili više od analoga mogu biti vezani zajedno upotrebom standardnih vezujućih sredstava i postupaka poznatih stručnjaku iz date oblasti tehnike. Na primer, dimeri mogu biti formirani između dva peptida preko upotrebe bifunkcionalnih tiol unakrsnih linkera i bi-funkcionalnih amino unakrsnih linkera, naročito za analoge koji su supstituisani sa ostacima cisteina, lizina, ornitina, homocisteina ili acetil fenilalanina. Dimer može biti homodimer ili alternativno može biti heterodimer. U ilustrativnim primerima izvođenja, linker koji vezuje dva (ili više) analoga je PEG, npr., 5 kDa PEG, 20 kDa PEG. U nekim primerima izvođenja, linker je disulfidna veza. Na primer, svaki monomer dimera može da sadrži Cys ostatak (npr., terminalni ili interno pozicionirani Cys) i atom sumpora svakog Cys ostatka učestvuje u formiranju disulfidne veze. U ilustrativnim aspektima, svaki monomer dimera je vezan preko tioetarske veze. U ilustrativnim aspektima, epsilon amin od Lys ostatka jednog monomera je vezan za Cys ostatak, koji, je zauzvrat, vezan preko hemijske grupe za epsilon amin od Lys ostatka drugog monomera. Postupci pripreme takvih tioetarski vezanih dimera su dalje opisani ovde. U nekim aspektima, monomeri su vezani preko terminalnih aminokiselina (npr., N-terminalnih ili C-terminalnih), preko internih aminokiselina, ili preko terminalne aminokiseline najmanje jednog monomera i interne aminokiseline najmanje jednog drugog monomera. U specifičnim aspektima, monomeri nisu vezani preko N-terminalne aminoiseline. U nekim aspektima, monomeri multimera su vezani zajedno u "rep-ka-repu" orijentaciji u kojoj su C-terminalne aminokiseline svakog monomera vezane zajedno.

PROLEKOVI

[0356] Dalje su obezbeđeni otkrićem prolekovi peptida i analoga opisanih ovde. Kao što je ovde korišćen, termin "prolek" je definisan kao bilo koje jedinjenje koje se podvrgava hemijskoj modifikaciji pre ispoljavanja njegovih potpunih farmakoloških efekata.

[0357] U ilustrativnim primerima izvođenja, prolek je peptidni prolek na bazi amida, sličan onima koji su opisani u objavi međnarodne patentne prijave br. WO/2010/071807, koja je objavljena 24.6.2010. Takvi prolekovi su namenjeni za odlaganje početka delovanja i produženje polu-života leka. Odloženi početak aktivnosti je povoljan po tome što omogućava sistemsku raspodelu proleka pre njegove aktivacije. Prema tome, primena prolekova eliminiše komplikacije uzrokovane maksimalnim aktivnostima posle primene i povećava terapeutski indeks ishodog leka.

[0358] U ilustrativnim aspektima, prolek sadrži strukturu: A-B-Q; gde je Q jednak peptidu ili analogu opisanom ovde; A je aminokiselina ili hidroksi kiselina; B je N-alkilovana aminokiselina vezana za Q preko amidne veze između A-B i amina od Q; gde A, B ili aminokiselina od Q za koju je A-B vezan je nekodirana aminokiselina, pored toga, gde poluživot hemijskog cepanja (t1/2) od A-B iz Q je najmanje oko 1 čas do oko 1 nedelje u PBS pod fiziološkim uslovima. Kao što je ovde korišćen termin "hidroksi kiselina" označava aminokiselinu koja je modifikovana za zamenu amino grupe alfa ugljenika sa hidroksil grupom.

[0359] U nekim primerima izvođenja dipeptidni prolek element ima opštu strukturu formule I:

gde

R1, R2R4i R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-C18alkila, C2-C18alkenila, (C1-C18alkil)OH, (C1-C18alkil)SH, (C2-C3alkil)SCH3, (C1-C4alkil)CONH2, (C1-C4alkil)COOH, (C1-C4alkil)NH2, (C1-C4alkil)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4alkil)(C3-C6cikloalkil), (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklika), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, (C1-C4alkil)(C3-C9heteroarila) i C1-C12alkil(A)(W1)C1-C12alkila, gde W1 je heteroatom izabran iz grupe koja se sastoji od N, S i O, ili R1i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju C3-C12cikloalkil ili aril; ili R4i R8zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju C3-C6cikloalkil; R3je izabran iz grupe koja se sastoji od C1-C18alkila, (C1-C18alkil)OH, (C1-C18alkil)NH2, (C1-C18alkil)SH, (C0-C4alkil)(C3-C6)cikloalkila, (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklika), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7i (C1-C4alkil)(C3-C9heteroaril) ili R4i R3zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4, 5 ili 6 –člani heterocikilični prsten;

R5je NHR6ili OH;

R6je H, C1-C8alkil ili R6i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4, 5 ili 6 –člani heterociklični prsten; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH.

[0360] U drugim primerima izvođenja dipeptidni prolek element ima opštu strukturu formule I:

gde

R1, R2R4i R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-C18alkila, C2-C18alkenila, (C1-C18alkil)OH, (C1-C18alkil)SH, (C2-C3alkil)SCH3, (C1-C4alkil)CONH2, (C1-C4alkil)COOH, (C1-C4alkil)NH2, (C1-C4alkil)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4alkil)(C3-C6cikloalkil), (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklika), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, (C1-C4alkil)(C3-C9heteroaril) i C1-C12alkil(W1)C1-C12alkila, gde W1je heteroatom izabran iz grupe koja se sastoji od N, S i O, ili R1i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju C3-C12cikloalkil; ili R4i R8zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju C3-C6cikloalkil;

R3je izabran iz grupe koja se sastoji od C1-C18alkila, (C1-C18alkil)OH, (C1-C18alkil)NH2, (C1-C18alkil)SH, (C0-C4alkil)(C3-C6)cikloalkila, (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklika), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7i (C1-C4alkil)(C3-C9heteroaril) ili R4i R3zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4, 5 ili 6 –člani heterociklični prsten;

R5je NHR6ili OH;

R6je H, C1-C8alkil ili R6i R1zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4, 5 ili 6-člani heterociklični prsten; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila, C2-C18alkenila, (C0-C4alkil)CONH2, (C0-C4alkil)COOH, (C0-C4alkil)NH2, (C0-C4alkil)OH i halo.

[0361] U nekim primerima izvođenja R8je H i R5je NHR6.

[0362] U nekim primerima izvođenja dipeptidni prolek element ima strukturu formule I, gde R1i R8su nezavisno H ili C1-C8alkil;

R2i R4su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-C8alkil, C2-C8aleknila, (C1-C4alkil)OH, (C1-C4alkil)SH, (C2-C3alkil)SCH3, (C1-C4alkil)CONH2, (C1-C4alkil)COOH, (C1C4alkil)NH2, (C1-C4alkil)NHC(NH2+) NH2, (C0-C4alkil)(C3-C6cikloalkil), (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklika), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7i CH2(C3-C9heteroaril),

ili R1i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju C3-C12cikloalkil ili aril;

R5je NHR6; i

R6je H ili C1-C8alkil.

[0363] U drugim primerima izvođenja dipeptidni prolek element ima strukturu formule I, gde

R1i R8su nezavisno H ili C1-C8alkil;

R2i R4su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-C8alkil, C2-C8alkenila, (C1-C4alkil)OH, (C1-C4alkil)SH, (C2-C3alkil)SCH3, (C1-C4alkil)CONH2, (C1-C4alkil)COOH, (C1-C4alkil)NH2, (C1-C4alkil)NHC(NH2+) NH2, (C0-C4alkil)(C3-C6cikloalkil), (C0-C4alkil)(C2-C5heterociklika), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7i CH2(C3-C9heteroaril),

ili R1i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju C3-C12cikloalkil;

R3je C1-C18alkil;

R5je NHR6;

R6je H ili C1-C8alkil; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkil, C2-C18alkenila, (C0-C4alkil)CONH2, (C0-C4alkil)COOH, (C0-C4alkil)NH2, (C0-C4alkil)OH i halo.

[0364] Polu-život proleka formiranog u skladu sa predmetnim otkrićem je određen pomoću supstituenata dipeptidnog prolek elementa, njegove lokacije i aminokiselina za koju je vezan. Na primer, prolek može da sadrži peptid ili analog koji je ovde opisan, pri čemu je dipeptidni prolek element vezan preko alfa amino grupe N-terminalne aminokiseline peptida ili analoga koji je ovde opisan. U ovom primeru izvođenja prolekovi koji imaju t1/2od, npr., oko 1 čas sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde

R1i R2su nezavisno C1-C18alkil ili aril; ili R1i R2su vezani preko - (CH2)p, gde p je 2-9; R3je C1-C18alkil;

R4i R8su svaki vodonik; i

R5je amin.

[0365] U drugim primerima izvođenja, prolekovi koji imaju t1/2od, npr., oko 1 časa sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde

R1i R2su nezavisno C1-C18alkil ili (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7; ili R1i R2su vezani preko -(CH2)p, gde p je 2-9;

R3je C1-C18alkil;

R4i R8su svaki vodonik;

R5je NH2; i

[0366] Pored toga, prolekovi koji imaju dipeptidni prolek element vezan za N-terminalnu alfa aminokiselinu peptida ili analoga koji je ovde opisan i koji ima t1/2, npr., između oko 6 do oko 24 časa, sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila i arila, ili R1i R2su vezani preko (CH2)p, gde p je 2-9;

R3je C1-C18alkil ili R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4-12 heterociklični prsten;

R4i R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i arila; i R5je amin;

uz uslov da oba R1i R2nisu vodonik i uz uslov da je jedan od R4ili R8jednak vodoniku.

[0367] U nekim primerima izvođenja, prolekovi koji imaju dipeptidni prolek element vezan za N-terminalnu alfa aminokiselinu peptida ili analoga opisanog ovde i koji ima t1/2, npr., između oko 12 do oko 72 časa, ili u nekim primerima izvođenja između oko 12 do oko 48 časova, sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika , C1-C18alkil, (C1-C18alkil)OH, (C1-C4alkil)NH2i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, ili R1i R2su vezani preko (CH2)p, gde p je 2-9;

R4i R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R5je NH2; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C18alkila, C2-C18alkenila, (C0-C4alkil)CONH2, (C0-C4alkil)COOH, (C0-C4alkil)NH2, (C0-C4alkil)OH i halo;

uz uslov da oba R1i R2nisu vodonik i uz uslov da je najmanje jedan od R4ili R8jednak vodoniku.

[0368] U nekim primerima izvođenja, prolekovi koji imaju dipeptidni prolek element vezan za N-terminalnu aminokiselinu peptida ili analoga koji je ovde opisan i koji imaju t1/2, npr., između oko 12 do oko 72 časa, ili u nekim primerima izvođenja između oko 12 do oko 48 časova, sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i (C1-C4alkil)NH2, ili R1i R2su vezani preko (CH2)p, gde p je 2-9;

R3je C1-C8alkil ili R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4-6 heterociklični prsten;

R4je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-C8alkila; i

R5je NH2;

uz uslov da oba R1i R2nisu vodonik.

[0369] U drugim primerima izvođenja, prolekovi koji imaju dipeptidni prolek element vezan za N-terminalnu aminokiselinu peptida ili analoga koji je ovde opisan i kojima imaju t1/2, npr., između oko 12 do oko 72 hours, ili u nekim primerima izvođenja između oko 12 do oko 48 časova, sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde

R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i (C1-C4alkil)NH2;

R3je C1-C6alkil;

R4je vodonik; i

R5je NH2;

uz uslov da oba R1i R2nisu vodonik.

[0370] U nekim primerima izvođenja, prolekovi koji imaju dipeptidni prolek element vezan za N-terminalnu aminokiselinu peptida ili analoga koji je ovde opisan i kojima imaju t1/2, npr., između oko 12 do oko 72 časa, ili u nekim primerima izvođenja između oko 12 do oko 48 časova, sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde

R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-Cs alkila, (C1-C4alkil)NH2, ili R1i R2su vezani preko (CH2)p, gde p je 2-9;

R3je C1-C8alkil;

R4je (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R5je NH2; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i (C0-C4alkil)OH;

uz uslov da oba R1i R2nisu vodonik.

[0371] Pored toga, obezbeđen je prolek koji ima dipeptidni prolek element vezan za N-terminalnu alfa aminokiselinu peptida i analoga opisanog ovde i koji ima t1/2, npr., od oko 72 do oko 168 časova gde dipeptidni prolek element ima strukturu:

R1je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i arila;

R3je C1-C18alkil;

R4i R8su svaki vodonik; i

R5je amin ili N-supstituisani amin ili hidroksil;

uz uslov da, ako je R1jednako alkil ili aril, tada R1i R5zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4-11 heterociklični prsten.

[0372] U nekim primerima izvođenja, dipeptidni prolek element ima strukturu:

gde je R1izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R3je C1-C18alkil;

R4i R8su svaki vodonik;

R5je NHR6ili OH;

R6je H, C1-C8alkil, ili R6i R1zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4, 5 ili 6 –člani heterociklični prsten; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila, C2-C18alkenila, (C0-C4alkil)CONH2, (C0-C4alkil)COOH, (C0-C4alkil)NH2, (C0-C4alkil)OH i halo;

uz uslov da, ako je R1jednako alkil ili (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, tada R1i R5zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4-11 heterociklični prsten.

[0373] U nekim primerima izvođenja dipeptidni prolek element je vezan za amin bočnog lanca interne aminokiseline peptida ili analoga koji je ovde opisan. U ovom primeru izvođenja prolekovi koji imaju t1/2, npr., od oko 1 časa imaju strukturu:

gde

R1i R2su nezavisno C1-C8alkil ili aril; ili R1i R2su vezani preko (CH2)p, gde p je 2-9;

R3je C1-C18alkil;

R4i R8su svaki vodonik; i R5je amin.

[0374] U nekim primerima izvođenja, prolekovi koji imaju t1/2, npr., od oko 1 časa imaju strukturu:

gde

R1i R2su nezavisno C1-C8alkil ili (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7; ili R1i R2su vezani preko -(CH2)p-, gde p je 2-9;

R3je C1-C18alkil;

R4i R8su svaki vodonik;

R5je NH2; i

[0375] Pored toga, prolekovi koji imaju t1/2, npr., između oko 6 do oko 24 časa i koji imaju dipeptidni prolek element vezan za bočni lanac interne aminokiseline sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i arila, ili R1i R2su vezani preko -(CH2)p, gde p je 2-9;

R4i R8su nezavisno C1-C18alkil ili aril; i

R5je amin ili N-supstituisani amin;

[0376] U nekim primerima izvođenja, prolekovi koji imaju t1/2, npr., između oko 12 do oko 72 časa, ili u nekim primerima izvođenja između oko 12 do oko 48 časova, i koji imaju dipeptidni prolek element vezan za bočni lanac interne aminokiseline sadrže dipeptidni prolek element sa strukturom:

gde su R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, ili R1i R2su vezani preko -(CH2)p-, gde p je 2-9;

R3je C1-C18alkil ili R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4-12 heterocikličan prsten;

R4i R8su nezavisno vodonik, C1-C18alkil ili (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R5je NHR6;

R6je H ili C1-C8alkil, ili R6i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4, 5 ili 6 – člani heterociklični prsten; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkil, C2-C18alkenila, (C0-C4alkil)CONH2, (C0-C4alkil)COOH, (C0-C4alkil)NH2, (C0-C4alkil)OH i halo;

[0377] Pored toga obezbeđen je prolek koji ima t1/2, npr., od oko 72 do oko 168 časova i koji ima dipeptidni prolek element vezan za bočni lanac interne aminokiseline peptida ili analoga koji je ovde opisan gde dipeptidni prolek element ima strukturu:

gde R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila i arila; R3je C1-C18alkil;

R4i R8su svaki vodonik; i

R5je amin ili N-supstituisani amin ili hidroksil;

uz uslov da, ako su R1i R2oba nezavisno alkil ili aril, bilo koji R1ili R2je vezan preko (CH2)pza R5, gde je p jednak 2-9.

[0378] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je prolek koji ima t1/2, npr., od oko 72 do oko 168 časova i koji ima dipeptidni prolek element vezan za bočni lanac interne aminokiseline peptida ili analoga koji je ovde opisan gde dipeptidni prolek element ima strukturu:

gde je R1izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R3je C1-C18alkil;

R4i R8sus vaki vodonik;

R5je NHR6ili OH;

R6je H ili C1-C8alkil, ili R6i R1zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4, 5 ili 6 – člani heterociklični prsten; i

uz uslov da, ako su R1i R2oba nezavisno alkil ili (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, bilo koji R1ili R2je vezan preko (CH2)pza R5, gde je p jednako 2-9.

[0379] U nekim primerima izvođenja dipeptidni prolek element je vezan za amin bočnog lanca interne aminokiseline peptida ili analoga opisanog ovde pri čemu interna aminokiselina sadrži strukturu formule II:

gde

n je ceo broj izabran od 1 do 4. U nekim primerima izvođenja n je 3 ili 4 i u nekim primerima izvođenja interna aminokiselina je lizin. U nekim primerima izvođenja dipeptidni prolek element je vezan za primarni amin na bočnom lancu aminokiseline locirane na položaju 12, 16, 17, 18, 20, 28, ili 29 peptida ili analoga koji je ovde opisan. U nekim primerima izvođenja aminokiselina na 12, 16, 17, 18, 20, 28, ili 29 sadrži strukturu formule II:

gde n je ceo broj izabran od 1 do 4 i dipeptidni prolek element je vezan za bočni lanac aminokiseline preko amidne veze. U nekim primerima izvođenja n je 4 i aminokiselina je locirana na položaju 20.

[0380] U dodatnom primeru izvođenja dipeptidni prolek element je vezan za peptid ili njegov analog preko amina prisutnog na aril grupi aromatične aminokiseline. U nekim primerima izvođenja aromatična aminokiselina je interna aminokiselina peptida ili analoga opisanog ovde, međutim aromatična aminokiselina takođe može biti N-terminalna aminokiselina. U nekim primerima izvođenja aromatična aminokiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od amino-Phe, amino-naftil alanina, amino triptofana, amino-fenil-glicina, amino-homo-Phe i amino tirozina. U nekim primerima izvođenja primarni amin koji formira amidnu vezu sa dipeptidnim prolek elementom je u para-položaju na aril grupi. U nekim primerima izvođenja aromatični amin sadrži strukturu formule III:

gde je m ceo broj od 1 do 3.

[0381] Za one primere izvođenja u kojima je dipeptidni prolek element vezan za peptid ili analog opisan ovde preko amina prisutnog na aril grupi aromatične aminokiseline, prolekovi koji imaju t1/2, npr., od oko 1 časa imaju dipeptidnu strukturu od:

gde su R1i R2nezavisno C1-C18alkil ili aril;

R4i R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila i arila; i R5je amin ili hidroksil.

[0382] U nekim primerima izvođenja, dipeptidni prolek element je vezan za peptid ili analog opisan ovde preko amina prisutnog na aril grupi aromatične aminokiseline, prolekovi imaju t1/2, npr., od oko 1 časa imaju dipeptidnu strukturu od:

gde su R1i R2nezavisno C1-C18alkil ili (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R4i R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R5je NH2ili OH; i

[0383] Pored toga, obezbeđeni su prolekovi koji imaju dipeptidni prolek element je vezan preko aromatične aminokiseline i ima t1/2, npr., od oko 6 do oko 24 časa gde dipeptid sadrži strukturu od:

gde

R1je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila i arila, ili R1i R2su vezani preko -(CH2)p, gde je p jednako 2-9;

R3je C1-C18alkil ili R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4-6 heterocikličan prsten;

R4i R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila i arila; i R5je amin ili N-supstituisani amin.

[0384] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su prolekovi koji imaju dipeptidni prolek element vezan preko aromatične aminokiseline i koji imaju t1/2, npr., od oko 6 do oko 24 časa gde dipeptid sadrži strukturu od:

gde

R1je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila, (C1-C18alkil)OH, (C1-C4alkil)NH2i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R4i R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkil i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7;

R5je NHR6;

[0385] Pored toga, obezbeđeni su prolekovi koji imaju dipeptidni prolek koji je vezan preko aromatične aminokiseline i koji imaju t1/2, npr., od oko 72 do oko 168 časova gde dipeptid sadrži strukturu od:

gde R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila i arila; R3je C1-C18alkil ili R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4-6 heterocikličan prsten;

R4i R8su svaki vodonik; i

R5je izabran iz grupe koja se sastoji od amina, N-supstituisanog amina i hidroksila.

[0386] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su prolekovi koji imaju dipeptidni prolek element vezan preko aromatične aminokiseline i koji imaju t1/2, npr., od oko 72 do oko 168 časova gde dipeptid sadrži strukturu od:

gde R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C8alkila, (C1-C4alkil)COOH i (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, ili R1i R5zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4-11 heterocikličan prsten;

R4je vodonik ili formira 4-6 heterocikličan prsten sa R3;

R8je vodonik;

R5je NHR6ili OH;

R6je H ili C1-C8alkil, ili R6i R1zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 4, 5 ili 6 – člani heterocikličan prsten; i

[0387] U nekim primerima izvođenja dipeptidni prolek element je vezan za aromatičnu aminokiselinu preko primarnog amina prisutnog kao aril supstituent aromatične aminokiseline, gde je aromatična aminokiselina locirana na položaju 10, 13, 22, ili 25 peptida ili analoga koji je ovde opisan (na osnovu numeracije za nativni glukagon, videti npr., SEQ ID NO: 1). U nekim primerima izvođenja dipeptidni prolek element vezan za aromatičnu aminokiselinu je lociran na položaju 22 peptida ili analog koji je ovde opisan.

[0388] U skladu sa nekim primerima izvođenja dipeptidni prolek element je vezan na N-terminalnom aminu peptida ili analoga koji je ovde opisan, uključujući na primer peptid srodan glukagonu, ili osteokalcin, kao i analoge, derivate i konjugate gorenavedenih, gde dipeptidni prolek element sadrži strukturu:

gde je R1izabran iz grupe koja se sastoji od H i C1-C8alkila;

R2i R4su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-C8alkila, C2-C8alkenila, (C1-C4alkil)OH, (C1-C4alkil)SH, (C2-C3alkil)SCH3, (C1-C4alkil)CONH2, (C1-C4alkil)COOH, (C1-C4alkil)NH2, (C1-C4alkil)NHC(NH2+) NH2, (C0-C4alkil)(C3-C6cikloalkil), (C0-C4alkil)(C6-C10aril)R7, CH2(C5-C9heteroaril), ili R1i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju C3-C6cikloalkil;

R3je izabran iz grupe koja se sastoji od C1-C8alkila, (C3-C6)cikloalkila ili R4i R3zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5 ili 6 –člai heterociklični prsten;

R5je NHR6ili OH;

R6je H, ili R6i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5 ili 6 –člani heterociklični prsten; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH. U nekim primerima izvođenja R1je H ili C1-C8alkil, R2je izabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6alkila, CH2OH, (C1-C4alkil)NH2, (C3-C6cikloalkil) i CH2(C6aril)R7ili R6i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5 –člani heterociklični prsten, R3je C1-C6alkil, i R4je izabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila, (C3-C6)cikloalkila, (C1-C4alkil)OH, (C1-C4alkil)SH i (C0-C4alkil)(C6aril)R7, ili R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5-člani heterociklični prsten. U dodatnom primeru izvođenja R3je CH3, R5je NHR6, i u alternativnom dodatnom primeru izvođenja R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5-člani heterociklični prsten i R5je NHR6.

[0389] U skladu sa sledećim primerom izvođenja dipeptidni prolek element je vezan na N-terminalnom aminu peptida ili analoga koji je ovde opisan, pri čemu dipeptidni prolek element sadrži strukturu:

gde je R1izabran iz grupe koja se sastoji od H i C1-C8alkila;

R3je izabran iz grupe koja se sastoji od C1-C8alkila, (C3-C6)cikloalkila ili R4i R3zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5 ili 6 –člani heterociklični prsten;

R5je NHR6ili OH;

R6je H, ili R6i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5 ili 6-člani heterociklični prsten; i

R7je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-C18alkila, C2-C18alkenila, (C0-C4alkil)CONH2, (C0-C4alkil)COOH, (C0-C4alkil)NH2, (C0-C4alkil)OH i halo. U nekim primerima izvođenja R1je H ili C1-C8alkil, R2je izabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6alkila, CH2OH, (C1-C4alkil)NH2, (C3-C6cikloalkil) i CH2(C6aril)R7ili R6i R2zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5 –člani heterociklični prsten, R3je C1-C6alkil, i R4je izabran iz grupe koja se sastoji od H, C1-C4alkila, (C3-C6)cikloalkila, (C1-C4alkil)OH, (C1-C4alkil)SH i (C0-C4alkil)(C6aril)R7, ili R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5 –člani heterociklični prsten. U dodatnom primeru izvođenja R3je CH3, R5je NHR6, i u alternativnom dodatnom primeru izvođenja R3i R4zajedno sa atomima za koje su vezani formiraju 5 –člani heterociklični prsten i R5je NHR6.

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE, UPOTREBE I KOMPLETI

Soli

[0390] U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je u obliku soli, npr., farmaceutski prihvatljive soli. Kao što je ovde korišćen termin "farmaceutski prihvatljiva so" označava soli jedinjenja koje zadržavaju biološku aktivnost ishodnog jedinjenja, i koja nisu biološki ili na drugi način nepoželjna. Takve soli mogu biti pripremljene in situ u toku krajnje izolacije i prečišćavanja analoga, ili posebno pripremljene reakcijom funkcionalne grupe slobodne baze sa pogodnom kiselinom. Mnoga od jedinjenja koja su ovde opisana su sposobna da formiraju kisele i/ili bazne soli pomoću prisustva amino i/ili karboksil grupa ili grupa koje su njima slične.

[0391] Farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli mogu biti pripremljene od neorganskih ili organskih kiselina. Reprezentativne kisele adicione soli obuhvataju, ali bez ograničenja na acetat, adipat, alginat, citrat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butirat, kamforat, kamfor sulfonat, diglukonat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, fumarat, hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroksietansulfonat (izotionat), laktat, maleat, metan sulfonat, nikotinat, 2-naftalen sulfonat, oksalat, palmitoat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, pikrat, pivalat, propionat, sukcinat, tartrat, tiocijanat, fosfat, glutamat, bikarbonat, p-toluensulfonat i undekanoat. Soli poreklom od neorganskih kiselina obuhvataju hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, sumpornu ksielinu, azotnu kiselinu, fosfornu kiselinu i slično. Soli poreklom od organskih kiselina obuhvataju sirćetnu kiselinu, propionsku kiselinu, glikolnu kiselinu, piruvinsku kiselinu, oksalnu kiselinu, jabučnu kiselinu, malonsku kiselinu, ćilibarnu kiselinu, maleinsku kiselinu, fumarnu kiselinu, vinsku kiselinu, limunsku kiselinu, benzoevu kiselinu, cimetnu kiselinu, bademovu kiselinu, metansulfonsku kiselinu, etansulfonsku kiselinu, p-toluen-sulfonsku kiselinu, salicilnu kiselinu, i slično. Primeri kliselina koje mogu biti korišćene za formiranje farmaceutski prihvatljivih kiselih adicionih soli obuhvataju, na primer, neorgansku kiselinu, npr., hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, sumpornu kiselinu i fosfornu kiselinu, i organsku kiselinu, npr., oksalnu kiselinu, maleinsku kiselinu, ćilibarnu kiselinu i limunsku kiselinu.

[0392] Bazne adicione soli takođe mogu biti pripremljene in situ u toku krajnje izolacije i prečišćavanja izvora salicilne kiseline, ili reakcijom dela koji sadrži karboksilnu kiselinu sa pogodnom bazom kao što je hidroksid, karbonat ili bikarbonat farmaceutski prihvatljivog katjona metala ili sa amonijakom ili organskim primarnim, sekundarnim ili tercijarnim aminom. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju, ali bez ograničenja na, katjone na bazi alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala kao što su litijum, natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum i aluminijum soli, i slično, i netoksične kvaternarne amonijum i amino katjone uključujući amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamonijum, dimetilamonijum, trimetilamonijum, trietilamonijum, dietilamonijum i etilamonijum, pored ostalih. Drugi reprezentativni organski amini korisni za formiranje baznih adicionih soli obuhvataju, na primer, etilendiamin, etanolamin, dietanolamin, piperidin, piperazin i slično. Soli poreklom od organskih baza obuhvataju, ali bez ograničenja na, soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina.

[0393] Pored toga, bazne grupe koje sadrže azot mogu biti kvaternizovane sa analogom predmetnog otkrića kao niži alkil halogenidi kao što su metil, etil, propil i butil hloridi, bromidi i jodidi; dugolančani halogenidi kao što su decil, lauril, miristil i stearil hloridi, bromidi i jodidi; arilalkil halogenidi kao što su benzil i fenetil bromidi i drugi. Na taj način su dobijeni proizvodi koji su rastvorljivi ili disperzibilni u vodi ili ulju.

Formulacije

[0394] U skladu sa nekim primerima izvođenja, obezbeđena je farmaceutska kompozicija pri čemu kompozicija sadrži analog glukagona predmetnog otkrića ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što je ovde korišćen, termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, kao što je fosfatno puferisani fiziološki rastvor, voda, emulzije kao što je emulzija ulje/voda ili voda/ulje, i različiti tipovi sredstava za vlaženje. Ovaj termim takođe obuhvata bilo koji od sredstava odobrenih od strane regulatorne agencije SAD federalne vlage ili naveden u SAD farmakopeji za upotrebu na životinjama, uključujući ljude.

[0395] Farmaceutska kompozicija može da sadrži bilo koji farmaceutski prihvatljiv sastojak, uključujući, na primer, sredstva za zakišeljavanje, aditive, adsorbente, propelante aerosola, sredstva za ististikivanje vazduha, alkilizujuća sredstva, sredstva protiv zgrudvavanja, antikoagulanta, antimikrobijalni konzervansi, antioksidansi, antiseptici, baze, vezujuća sredstva, puferujuća sredstva, helatirajuća sredstva, sredstva za oblaganje, sredstva za bojenje, desikante, deterdžente, razblaživače, dezinfektante, sredstva za raspadanje, sredstva za dispergovanje, sredstva za pojačanje rastvaranja, boje, emolijense, emulgatore, stabilizatore emulzije, punioce, sredstva za formiranje filma, pojačivače ukusa, sredstva za poboljšanje ukusa, pojačivače protoka, gelirajuća sredstva, granulaciona sredstva, humektante, lubrikante, mukoadhezive, baze za masti, masti, uljane nosače, organske baze, baze za pastile, pigmente, plastifikatore, sredstva za poliranje, konzervanse, sekvestirajuća sredstva, kožne penetrante, solubilizujuća sredstva, rastvarače, stabilizujuća sredstva, baze za supozitorije, površinski aktivna sredstva, surfaktante, suspendujuća sredstva, zaslađivače, terapeutska sredstva, sredstva za zgušnjavanje, sredstva za podešavanje toničnosti, sredstva za toksičnost, sredstva za povećanje toksičnosti, sredstva za apsorbovanje vode, korastvarače koji se mešaju sa vodom, omekšivače vode ili sredstva za vlaženje.

[0396] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži bilo koju ili kombinaciju sledećih komponenti: akacija, acesulfam kalijum, acetiltributil citrat, acetiltrietil citrat, agar, albumin, alkohol, dehidratisani alkohol, denaturisani alkohol, razblaženi alkohol, aleuritinska kiselina, alginska kiselina, alifatični poliestri, alumina, aluminijum hidroksid, aluminijum stearat, amilopektin, α-amiloza, askrobinska kiselina, askorbil palmitat, aspartam, bakteriostatička voda za injekciju, bentonit, bentonit magma, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzojeva kiselina, benzil alkohol, benzil benzoat, bronopol, butilovan hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, butilparaben, butilparaben natrijum, kalcijum alginat, kalcijum askorbat, kalcijum karbonat, kalcijum ciklamat, dvobazni anhidrovani kalcijum fosfat, dvobazni dehidrat kalcijum fosfat, trobazni kalcijum fosfat, kalcijum propionat, kalcijum silikat, kalcijum sorbat, kalcijum stearat, kalcijum sulfat, kalcijum sulfat hemihidrat, ulje od uljane repice, karbomer, ugljen dioksid, karboksimetil celuloza kalcijum, karboksimetil celuloza natrijum, β-karoten, karaginan, ricinusovo ulje, hidrogenisano ricinusovo ulje, katjonski emulgujući vosak, celuloza acetat, celuloza acetat ftalat, etil celuloza, mikrokristalna celuloza, celuloza u prahu, silicifikovana mikrokristalna celuloza, natrijum karboksimetil celuloza, cetostearil alkohol, cetrimid, cetil alkohol, hlorheksidin, hlorobutanol, hlorokrezol, holesterol, hlorheksidin acetat, hlorheksidin glukonat, hlorheksidin hidrohlorid, hlorodifluoroetan (HCFC), hlorodifluorometan, hlorofluorokarboni (CFC) hlorofenoksietanol, hloroksilenol, čvrste supstance kukuruznog sirupa, anhidrovana limunska kiselina, monohidrat limunske kiseline, kakao puter, sredstva za bojenje, kukuruzno ulje, ulje od semena pamuka, krezol, m-krezol, o-krezol, p-krezol, kroskarmeloza natrijum, krospovidon, ciklaminska kiselina, ciklodekstrini, dekstrati, dekstrin, dekstroza, anhidrovana dekstroza, diazolidinil urea, dibutil ftalat, dibutil sebacat, dietanolamin, dietil ftalat, difluoroetan (HFC), dimetil-β-ciklodekstrin, jedinjenja tipa ciklodekstrina kao što je Captisol®, dimetil etar, dimetil ftalat, dikalijum edentat, dinatrijum edentat, dinatrijum hidrogen fosfat, dokusat kalcijum, dokusat kalijum, dokusat natrijum, dodecil galat, dodeciltrimetilamonijum bromid, edentat kalcijum dinatrijum, etilendiamintetrasirćetna kiselina, eglumin, etil alkohol, etilceluloza, etil galat, etil laurat, etil maltol, etil oleat, etilparaben, etilparaben kalijum, etilparaben natrijum, etil vanilin, fruktoza, tečna fruktoza, mlevena fruktoza, fruktoza bez pirogena, fruktoza u prahu, fumarna kiselina, želatin, glukoza, tečna glukoza, gliceridne smeše zasićenih biljnih masnih kiselina, glicerin, gliceril behenat, glicerl monooleat, gliceril monostearat, samo-emulgujući gliceril monostearat, gliceril palmitostearat, glicin, glikoli, glikofurol, guar guma, heptafluoropropan (HFC), heksadeciltrimetilamonijum bromid, visoko fruktozni sirup, humani serum albumin, ugljovodonici (HC), razblažena hlovorodonična kiselina, hidrogenisano biljno ulje, tip II, hidroksietil celuloza, 2-hidroksietil-β-ciklodekstrin, hidroksipropil celuloza, niskosupstituisana hidroksipropil celuloza, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin, hidroksipropil metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza ftalat, imidurea, indigo karmin, jonski izmenjivači, gvožđe oksidi, izopropil alkohol, izopropil miristat, izopropil palmitat, izotičan fiziološki rastvor, kaolin, mlečna kiselina, laktitol, laktoza, lanolin, lanolin alkoholi, anhidrovani lanolin, lecitin, magnezijum aluminijum silikat, magnezijum karbonat, normalni magnezijum karbonat, anhidrovani magnezijum karbonat, magnezijum karbonat hidroksid, magnezijum hidroksid, magnezijum lauril sulfat, magnezijum oksid, magnezijum silikat, magnezijum stearat, magnezijum trisilikat, anhidrovani magnezijum trisilikat, jabučna kiselina, slad, maltitol, rastvor maltitola, maltodekstrin, maltol, maltoza, manitol, trigliceridi srednje dužine lanca, meglumin, mentol, metilceluloza, metil metakrilat, metil oleat, metilparaben, metilparaben kalijum, metilparaben natrijum, mikrokristalna celuloza i karboksimetilceluloza natrijum, mineralno ulje, svetlo mineralno ulje, mineralno ulje i lanolin alkoholi, ulje, maslinovo ulje, monoetanolamin, montmorilonit, oktil galat, oleinska kiselina, palmitinska kiselina, parafin, ulje od kikirikija, vazelin, vazelin i lanolin alkoholi, farmaceutska glazura, fenol, tečni fenol, fenoksietanol, fenoksipropanol, feniletil alkohol, fenilmerkuri acetat, fenilmerkuri borat, fenilmerkuri nitrat, polakrilin, polakrilin kalijum, poloksamer, polidekstroza, polietilen glikol, polietilen oksid, poliakrilati, polietilen-polioksipropilen-blok polimeri, polimetakrilati, polioksietilen alkil etri, polioksietilen derivati ricinusovog ulja, polioksietilen sorbitol estri masnih kiselina, polioksietilen stearati, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, kalijum alginat, kalijum benzoat, kalijum bikarbonat, kalijum bisulfit, kalijum hlorid, kalijum citrat, kalijum citrat anhidrovani, kalijum hidrogen fosfat, kalijum metabisulfit, monobazni kalijum fosfat, kalijum propionat, kalijum sorbat, povidon, propanol, propionska kiselina, propilen karbonat, propilen glikol, propilen glikol alginat, propil galat, propilparaben, propilparaben kalijum, propilparaben natrijum, protamin sulfat, ulje od uljane repice, Ringerov rastvor, saharin, saharin amonijum, saharin kalcijum, saharin natrijum, ulje od suncokreta, saponit, proteini seruma, susamovo ulje, koloidni silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, natrijum alginat, natrijum askrobat, natrijum benzoat, natrijum bikarbonat, natrijum bisulfit, natrijum hlorid, anhidrovani natrijum citrat, natrijum citrat dehidrat, natrijum hlorid, natrijum ciklamat, natrijum edentat, natrijum dodecil sulfat, natrijum lauril sulfat, natrijum metabisulfit, natrijum fosfat, dvobazni, natrijum fosfat, monobazni, natrijum fosfat, trobazni, anhidrovani natrijum propionat, natrijum propionat, natrijum sorbat, natrijum skrob glikolat, natrijum stearil fumarat, natrijum sulfit, sorbinska kiselina, sorbitan estri (sorbitan masni estri), sorbitol, rastvor sorbitola 70%, sojino ulje, spermaceti vosak, skrob, kukuruzni skrob, krompirov skrob, preželatinizirani skrob, sterilizujući kukuruzni skrob, stearinska kiselina, prečišćena stearinska kiselina, stearil alkohol, saharoza, šećeri, kompresibilni šećer, poslastičarski šećer, šećerne sfere, invertni šećer, Sugartab, Sunset Yellow FCF, sintetički parafin, talk, vinska kiselina, tartrazin, tetrafluoroetan (HFC), teobroma ulje, timerosal, titanijum dioksid, alfa tokoferol, tojoferil acetat, alfa tokoferil kisselina sukcinat, beta-tokoferol, delta-tokoferol, gama-tokoferol, tragant, triacetin, tributil citrat, trietanolamin, trietil citrat, trimetil-β-ciklodekstrin, trimetiltetradecilamonijum bromid, tris pufer, trinatrijum edentat, vanilin, tip I hidrogenisano biljno ukje, voda, meka voda, tvrda voda, voda bez ugljen dioksida, voda bez pirogena, voda za injekciju, sterilna voda za inhalaciju, sterilna voda za injekciju, sterilna voda za irigaciju, voskovi, anjonski emulgujući vosak, karnauba vosak, katjonski emulgujući vosak, cetil estar vosak, mikrokristalni vosak, nejonski emulgujući vosak, vosak za supozitorije, beli vosak, žuti vosak, beli vazelin, lanolin, ksantan guma, ksilitol, zein, cink propionat, soli cinka, cink stearat, ili bilo koji ekscipijens iz Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000). Remington’s Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980), opisuje različite komponente korišćene u formulaciji farmaceutski prihvatljivih kompozicija i poznate tehnike za njihovu pripremu. Osim ukoliko je bilo koje konvencionalno sredstvo nekompatibilno sa farmaceutskim kompozicijama, razmatrana je njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama. Dopunski aktivni sastojci takođe mogu biti ugrađeni u kompozicije.

[0397] U nekim primerima izvođenja, gore navedene komponenta(e) mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji u bilo kojoj koncentraciji, kao što je, na primer, najmanje A, gde je A jednako 0.0001 % tež./zapr., 0.001 % tež./zapr., 0.01 % tež./zapr., 0.1 % tež./zapr., 1% tež./zapr., 2% tež./zapr., 5% tež./zapr., 10% tež./zapr., 20% tež./zapr., 30% tež./zapr., 40% tež./zapr., 50% tež./zapr., 60% tež./zapr., 70% tež./zapr., 80% tež./zapr. ili 90% tež./zapr. U nekim primerima izvođenja, gore navedene komponenta(e) mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji u bilo kojoj koncentraciji, kao što je, na primer, najviše B, pri čemu je B jednako 90% tež./zapr., 80% tež./zapr., 70% tež./zapr., 60% tež./zapr., 50% tež./zapr., 40% tež./zapr., 30% tež./zapr., 20% tež./zapr., 10% tež./zapr., 5% tež./zapr., 2% tež./zapr., 1% tež./zapr., 0.1 % tež./zapr., 0.001 % tež./zapr. ili 0.0001 %. U drugim primerima izvođenja, gore navedene komponenta(e) mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji u bilo kom opsegu koncentracija, kao što je, na primer od oko A do oko B. U nekim primerima izvođenja, A je 0.0001% i B je 90%.

[0398] U nekim primerima izvođenja, farmaceutski prihvatljiv sastojak je izabran iz grupe koja se sastoji od šećera (npr., glukoze, saharoze, trehaloze, laktoze, fruktoze, maltoze, dekstrana, glicerina, dekstrana, melibioze, melezitoze, rafinoze, manotrioze, stahioze, maltoze, laktuloze, maltuloze ili izo-maltuloze, ili kombinacija ovih šećera), šećernog alkohola (npr., glikola, glicerola, eritritola, treitola, arabitola, ksilitola, ribitola, manitola, sorbitola, dulcitola, iditola, izomalta, maltitola, laktitola ili glucitola, ili kombinacije ovih šećernih alkohola), soli (npr., natrijum hlorida), emulgatora ili surfaktanta (npr., polisorbata, kao što je polioksietilen 20 sorbitan monooleat, ili drugi blok kopolimeri etilen oksida i propilen oksida), lioprotektanata, i njihovih smeša. Na primer, prisutni su ekscipijensi kao što su šećeri ili šećerni alkoholi, npr., u koncentraciji od oko 20 mg/mL do oko 40 mg/mL, ili 25 do 45 mg/mL, kao što je 35 mg/mL.

[0399] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane tako da se postigne fiziološki kompatibilna pH. U nekim primerima izvođenja, pH farmaceutske kompozicije može biti najmanje 5, najmanje 5.5, najmanje 6, najmanje 6.5, najmanje 7, najmanje 7.5, najmanje 8, najmanje 8.5, najmanje 9, najmanje 9.5, najmanje 10 ili najmanje 10.5 do i uključujući pH 11, u zavisnosti od formulacije i puta primene, na primer između 4 i 7, ili 4.5 i 5.5. U ilustrativnim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije mogu da sadrže puferujuća sredstva da bi se postigla fiziološki kompatibilna pH. Puferujuća sredstva mogu da obuhvataju bilo koja jedinjenja sposobna da puferuju na željenoj pH kao što su, na primer, foafatni puferi (npr., PBS), trietanolamin, Tris, bicin, TAPS, tricin, HEPES, TES, MOPS, PIPES, kakodilat, MES, acetat, citrat, sukcinat, histidin ili drugi farmaceutski prihvatljivi puferi. U ilustrativnim primerima izvođenja, jačina pufera je najmanje 0.5 mM, najmanje 1 mM, najmanje 5 mM, najmanje 10 mM, najmanje 20 mM, najmanje 30 mM, najmanje 40 mM, najmanje 50 mM, najmanje 60 mM, najmanje 70 mM, najmanje 80 mM, najmanje 90 mM, najmanje 100 mM, najmanje 120 mM, najmanje 150 mM ili najmanje 200 mM. U nekim primerima izvođenja, jačina pufera nije više od 300 mM (npr., najviše 200 mM, najviše 100 mM, najviše 90 mM, najviše 80 mM, najviše 70 mM, najviše 60 mM, najviše 50 mM, najviše 40 mM, najviše 30 mM, najviše 20 mM, najviše 10 mM, najviše 5 mM, najviše 1 mM). Na primer, koncentracija pufera može biti oko 2 mM do oko 100 mM, ili oko 10 mM do oko 50 mM.

Putevi primene

[0400] Sledeća diskusija o putevima primene je data samo za ilustraciju ilustrativnih primera izvođenja i ne bi je trebalo tumačiti kao ograničavajuću za obim ni na koji način.

[0401] Formulacije pogodne za oralnu primenu mogu da se sastoje od (a) tečnih rastvora, kao što je efikasna količina analoga predmetnog otkrića rastvorena u razblaživačima, kao što su voda, fiziološki rastvor ili sok od narandže; (b) kapsula, skrobnih kapsula, tableta, lozengi, i pastila, od kojih svaka sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka, kao čvrste supstance ili granule; (c) prahove; (d) suspenzije u odgovarajućoj tečnosti; i (e) pogodne emulzije. Tečne formulacije mogu da obuhvataju razblaživače, kao što su voda i alkoholi, na primer, etanol, benzil alkohol i polietilen alkoholi, bilo sa ili bez dodavanja farmaceutski prihvatljivog surfaktanta. Oblici kapsule mogu biti uobičejnog tipa sa tvrdom- ili mekomželatinskom ljuskom koji mogu da sadrže, na primer, surfaktante, lubrikante i inertne punioce, kao što su laktoza, saharoza, kalcijum fosfat, i kukuruzni skrob. Oblici tablete mogu da obuhvataju jedan ili više od laktoze, saharoze, manitola, kukuruzni skrob, skrob od krompira, alginiska kiselina, mikrokristalna celuloza, akacija, želatin, guar guma, koloidni silicijum dioksid, kroskarmeloza natrijum, talk, magnezijum stearat, kalcijum stearat, cink stearat, stearinska kiselina i drugi ekscipijensi, boje, razblaživači, puferujuća sredstva, sredstva za raspadanje, sredstva za vlaženje, konzervansi, arome, i drugi farmakološki kompatibilni ekscipijensi. Oblici lozengi mogu da sadrže analog predmetnog otkrića u aromi, obično saharoze i akacije ili traganta, kao i pastile koje sadrže analog predmetnog otkrića u inertnoj bazi, kao što je želatin i glicerin, ili saharoza i akacija, emulzije, gelovi i slično koje sadrže pored takvih ekscipijenasa kao što su poznati u stanju tehnike.

[0402] Analozi otkrića, pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim pogodnim komponentama, mogu biti primenjeni preko plućne primene i mogu biti napravljeni u formulacijama aerosola za primenu preko inhalacije. Ove formulacije aerosola mogu biti postavljene u prihvatljive propelante pod pritiskom, kao što su dihlorodifluorometan, propan, azot, i slično. One takođe mogu biti formulisane kao lekovi za preparate koji nisu pod pritiskom, kao što je u nebulizatoru ili atomizatoru. Takve formulacije spreja takođe mogu biti korišćene za prskanje mukoze. U nekim primerima izvođenja, analog je formulisan u mešavini praha ili u mikročestice ili nanočestice. Pogodne plućne formulacije su poznate u stanju tehnike. Videti, npr., Qian et al., Int J Pharm 366: 218-220 (2009); Adjei i Garren, Pharmaceutical Research, 7(6): 565-569 (1990); Kawashima et al., J Controlled Release 62(1-2): 279-287 (1999); Liu et al., Pharm Res 10(2): 228-232 (1993); objave međunarodnih patentnih prijava br. WO 2007/133747 i WO 2007/141411.

[0403] Formulacije pogodne za parenteralnu primenu obuhvataju vodene i nevodene, izotonične sterilne rastvore za injekciju, koji mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostate, i supstance koje se rastvaraju koje omogućavaju da formulacija bude izotonična sa krvlju namenjenog primaoca, i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da obuhvataju suspendujuća sredstva, solubilizatore, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore i konzervanse. Termin, "parenteralni" označava ne preko probavnog kanala, već preko nekog drugog puta kao što je potkožni, intramuskularni, intraspinalni ili intravenski. Analog predmetnog otkrića može biti primenjen sa fiziološki prihvatljivim razblaživačem u farmaceutskom nosaču, kao što je sterilna tečnost ili smeša tečnosti, uključujući vodu, fiziološki rastvor, vodeni rastvor dekstroze i rastvore srodnih šećera, alkohol, kao što je etanol ili heksadecil alkohol, glikol, kao što je propilen glikol ili polietlen glikol, dimetilsulfoksid, glicerol, ketali kao što je 2,2- dimetil-153-dioksolan-4-metanol, etri, poli(etilenglikol) 400, ulja, masne kiseline, estri ili gliceridi masnih kiselina ili acetilovani gliceridi masnih kiselina sa ili bez dodavanja farmaceutski prihvatljivog surfaktanta, kao što je sapun ili deterdžent, suspendujuće sredstvo, kao što je pektin, karbomeri, metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza ili karboksimetilceluloza, ili emulgujuća sredstva i drugi farmaceutski adjuvanti.

[0404] Ulja, koja mogu biti korišćena u parenteralnim formulacijama obuhvataju petrolej, životinjska, biljna ili sintetička ulja. Specifični primeri ulja obuhvataju ulje od kikirikija, soje, susama, pamuka, kukuruza, maslinovo, vazelin i mineralno ulje. Pogodne masne kiseline za upotrebu u parenteralnim formulacijama obuhvataju oleinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, i izostearinsku kiselinu. Etil oleat i izopropil miristat su primeri pogodnih estara masnih kiselina.

[0405] Pogodni sapuni za upotrebu u parenteralnim formulacijama obuhvataju soli masne kiseline i alkalnog metala, amonijuma i trietanolamina, i pogodni deterdženti obuhvataju (a) katjonske deterdžente kao što su, na primer, dimetil dialkil amonijum halogenidi, i alkil piridinijum halogenidi, (b) anjonske deterdžente kao što su, na primer, alkil, aril i olefin sulfonati, alkil, olefin, etar i monoglicerid sulfati i sulfosukcinati, (c) nejonske deterdžente kao što su, na primer, masni amin oksidi, alkanolamini masnih kiselina i polioksietilenpolipropilen kopolimeri, (d) amfoterni deterdženti kao što su, na primer, alkil-βaminopropionati i 2-alkil -imidazolin kvaternarne amoniojum soli i (e) njihove smeše.

[0406] Parenteralne formulacije će tipično sadržati od oko 0.5 do oko 25% prema težini analoga predmetnog otkrića u rastvoru. Konzervansi i puferi mogu biti korišćeni. U cilju minimizacije ili eliminacije iritacije na mestu injekcije, takve kompozicije mogu da sadrže jedan ili više nejonskih surfaktanata koji imaju ravnotežu hidrofil-lipofil (HLB) od oko 12 do oko 17. količina surfaktanta u takvim formulacijama će tipično biti u opsegu od oko 5% do oko 15% prema težini. Pogodni surfaktanti obuhvataju estere polietilen glikol sorbitan estre masnih kiselina, kao što je sorbitan monooleat i adukte visoke molekulske težine etilen oksida sa hidrofobnom bazom, formirane kondenzacijom propilen oksida sa propilen glikolom. Parenteralne formulacije mogu biti predstavljene u hermetički zatvorenim kontejnerima sa jediničnom dozom ili sa višestrukim dozama, kao što su ampule i vijalice, i mogu biti čuvane u stanju osušenom zamrzavanjem (liofilizovanom) koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog ekscipijensa, na primer, vode, za injekcije, neposredno pre upotrebe. Ex tempore injekcioni rastvori i suspenzije mogu biti pripremljeni od sterilnih praškova, granula i tableta vrste koja je prethodno opisana.

[0407] Injektabilne formulacije su u skladu da otkrićem. Uslovi za efikasne farmaceutske nosače za injektabilne kompozicije su dobro poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike (videti, npr., Pharmaceutics i Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker i Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), i ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)).

[0408] Pored toga, analog predmetnih otkrića može biti napravljen u supozitorije za rektalnu primenu putem mešanja sa različitim bazama, kao što su emulgujuće baze ili baze rastvorljive u vodi. Formulacije pogodne za vaginalnu primenu mogu biti predstavljene kao materični ulošci, tamponi, kreme, gelovi, paste, pene ili formule spreja koji sadrže, pored aktivnog sastojka, takve nosače kao što su poznati u stanju tehnike kao odgovarajući.

[0409] Stručnjaku iz date oblasti tehnike biće jasno da, pored gore opisanih farmaceutskih kompozicija, analog otkrića može biti formulisan kao inkluzioni kompleksi, kao što su inkluzioni kompleksi ciklodekstrina, ili lipozomi.

Doza

[0410] Veruje se da su analozi otkrića korisni u postupcima za lečenje bolesti ili medicinskog stanja u kome agonizam receptora za glukagon, koagonizam GIP/GLP-1 receptora, koagonizam GIP/receptora za glukagon ili triagonizam GIP/GLP-1/receptora za glukagon ima ulogu. Za svrhe otkrića, primenjena količina ili doza analoga predmetnog otkrića trebalo bi da je dovoljna da postigne, npr., terapeutski ili profilaktički odgovor, kod subjekta ili životinje u razumnom vremenskom okviru. Na primer, doza analoga predmetnog otkrića trebalo bi da je dovoljna da se stimuliše izlučivanje cAMP iz ćelija kao što su ovde opisane ili dovoljne da se povećaju nivoi glukoze u krvi, nivoi masti, nivoi unosa hrane ili telesna težina sisara, u periodu od oko oko 1 do 4 minuta, 1 do 4 časa ili 1 do 4 nedelje ili duže, npr., 5 do 20 ili više nedelja, od vremena primene. U ilustrativnim primerima izvođenja, vremenski period bi čak mogao biti duži. Doza će biti određena preko efikasnosti određenog analoga predmetnog otkrića i stanja životinje (npr., čoveka), kao i telesne težine životinje (npr., čoveka) koja se tretira.

[0411] Mnoge analize za određivanje primenjene doze su poznate u stanju tehnike. Za svrhe koje su ovde navedene, mogla bi se koristiti analiza, koja sadrži poređenje veličine do koje su nivoi glukoze u krvi sniženi posle primene date doze analoga predmetnog otkrića na sisara među grupom životinja od kojih je svakoj data različita doza analoga, za određivanje početne doze koja će biti primenjena na sisara. Veličina do koje su nivoi glukoze u krvi sniženi posle primene određene doze može biti analizirana pomoću postupaka poznatih u stanju tehnike, uključujući, na primer, postupke koji su opisani ovde kao Primer 4.

[0412] Doza analoga predmetnog otkrića takođe će biti određena preko postojanja, prirode i veličine bilo kojih štetnih sporednih efekata koji bi mogli da prate primenu određenog analoga predmetnog otkrića. Tipično, nadležni lekar će odlučiti o dozi analoga predmetnog otkrića sa kojom bi trebalo lečiti svakog pojedinačnog pacijenta, uzimajući u obzir različite faktore, kao što su starost, telesna težina, opšte zdravstveno stanje, ishrana, pol, analog predmetnog otkrića koji će se primeniti, put primene i težina stanja koje se leči. Na primer i bez namere da se otkriće ograniči, doza analoga predmetnog otkrića može biti oko 0.0001 do oko 1 g/kg telesne težine subjekta koji se leči/dan, od oko 0.0001 do oko 0.001 g/kg telesne težine/dan, ili oko 0.01 mg do oko 1 g/kg telesne težine/dan. U ilustrativnim primerima izvođenja, doza može biti ukupna dnevna doza od oko 1 mg do oko 40 mg, ili oko 4 mg to oko 30 mg, ili oko 4 do oko 20 mg, ili oko 10 do oko 20 mg, ili oko 12 mg do oko 30 mg.

[0413] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži bilo koji od analoga koji su ovde otkriveni na nivou čistoće pogodnim za primenu na pacijenta. U nekim primerima izvođenja, analog ima nivo čistoće od najmanje oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98% ili oko 99%, i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač ili ekscipijens. Farmaceutska kompozicija u nekim aspektima sadrži analog predmetnog otkrića u koncentraciji od najmanje A, pri čemu je A od oko 0.001 mg/ml, oko 0.01 mg/ml, 0 oko 1 mg/ml, oko 0.5 mg/ml, oko 1 mg/ml, oko 2 mg/ml, oko 3 mg/ml, oko 4 mg/ml, oko 5 mg/ml, oko 6 mg/ml, oko 7 mg/ml, oko 8 mg/ml, oko 9 mg/ml, oko 10 mg/ml, oko 11 mg/ml, oko 12 mg/ml, oko 13 mg/ml, oko 14 mg/ml, oko 15 mg/ml, oko 16 mg/ml, oko 17 mg/ml, oko 18 mg/ml, oko 19 mg/ml, oko 20 mg/ml, oko 21 mg/ml, oko 22 mg/ml, oko 23 mg/ml, oko 24 mg/ml, oko 25 mg/ml ili više. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži analog u koncentraciji od najviše B, pri čemu je B oko 30 mg/ml, oko 25 mg/ml, oko 24 mg/ml, oko 23, mg/ml, oko 22 mg/ml, oko 21 mg/ml, oko 20 mg/ml, oko 19 mg/ml, oko 18 mg/ml, oko 17 mg/ml, oko 16 mg/ml, oko 15 mg/ml, oko 14 mg/ml, oko 13 mg/ml, oko 12 mg/ml, oko 11 mg/ml, oko 10 mg/ml, oko 9 mg/ml, oko 8 mg/ml, oko 7 mg/ml, oko 6 mg/ml, oko 5 mg/ml, oko 4 mg/ml, oko 3 mg/ml, oko 2 mg/ml, oko 1 mg/ml ili oko 0.1 mg/ml. U nekim primerima izvođenja, kompozicije mogu da sadrže analog u opsegu koncentracija od A do B mg/ml, na primer, oko 0.001 do oko 30.0 mg/ml.

Ciljni oblici

[0414] Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da analozi otkrića mogu biti modifikovani na bilo koji od određenog broja načina, tako da je terapeutska ili profilaktička efikasnost analoga predmetnih otkrića povećana preko modifikacija. Na primer, analog predmetnog otkrića može biti konjugovan bilo direktno ili indirektno preko linkera za ciljni deo. Praksa konjugovanja jedinjenja, npr., analoga glukagona koji su ovde opisani, za ciljne delove je poznata u stanju tehnike. Videti, na primer, Wadhwa et al., J Drug Targeting, 3, 111-127 (1995) i SAD patent br. 5,087,616. Termin "ciljni deo" kao što je ovde korišćen, označava bilo koji molekul ili sredstvo sposobno da specifično prepozna i veže se za receptor na ćelijskoj površini, tako da ciljni deo usmerava primenu analoga predmetnih otkrića na populaciju ćelija na čijoj površini je eksprimiran receptor (receptor za glukagon, GLP-1 receptor). Ciljni delovi obuhvataju, ali bez ograničenja na, antitela ili njihove fragmente, peptide, hormone, faktore rasta, citokine i bilo koje druge prirodne ili neprirodne ligande, koji se vezuju za receptore na ćelijskoj površini (npr., receptor za epitelijalni faktor rasta (EGFR), T-ćelijski receptor (TCR), B-ćelijski receptor (BCR), CD28, receptor za faktor rasta poreklom od trombocita (PDGF), nikotinski acetilholinski receptor (nAChR), itd.). Kao što je ovde korišćen "linker" je veza, molekul ili grupa molekula koji vezuje dva posebna entiteta međusobno. Linkeri mogu da obezbede otpimalnu udaljenost dva entiteta ili mogu dalje da obezbede slabu vezu koja omogućava da dva entiteta budu odvojena. Slabe veze obuhvataju grupe koje se mogu cepati usled svetlosti, delove koji su osetljivi na kiselinu, delove koji su osetljivi na baze i grupe koje se cepaju enzimima. Termin "linker" u nekim primerima izvođenja označava bilo koje sredstvo ili molekul koji premošćuje analog predmetnih otkrića za ciljni deo. Stručnjak iz date oblasti tehnike zna da su mesta na analogu predmetnih otkrića, koja nisu neophodna za funkciju analoga predmetnih otkrića, idealna mesta za vezivanje linkera i/ili ciljnog dela, uz uslov da linker i/ili ciljni deo, pošto se vežu za analog predmetnih otkrića, ne utiču na funkciju analoga predmetnih otkrića, tj., sposobnost da stimulišu izlučivanje cAMP iz ćelija, za lečenje dijabetesa ili gojaznosti.

Formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem

[0415] Alternativno, analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti modifikovani u depo oblik, tako da je način na koji se analog predmetnih otkrića oslobađa u telo na koje se primenjuje kontrolisan u odnosu na vreme i lokaciju unutar tela (videti, na primer, SAD patent br. 4,450,150). Depo oblici analoga predmetnih otkrića mogu biti, na primer, implantabilna kompozicija koja sadrži analog predmetnih otkrića i porozni i neporozni materijal, kao što je polimer, pri čemu je analog predmetnih otkrića inkapsuliran od strane ili raširen kroz razloženi porozni i/ili neporozni materijal. Depo je zatim implantiran u željenu lokaciju unutar tela i analog predmetnih otkrića je oslobođen iz implanta unapred određenom stopom.

[0416] Farmaceutska kompozicija u određenim aspektima je modifikovana tako da ima bilo koji tip profila in vivo oslobađanja. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija je formulacija sa neposrednim oslobađanjem, kontrolisanim oslobađanjem, produženim oslobađanjem, produženim oslobađanjem, odloženim oslobađanjem ili bi-faznim oslobađanjem. Postupci za formiranje peptida za kontrolisano oslobađanje su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Qian et al., J Pharm 374: 46-52 (2009) i objave međunarodnih patentnih prijava br. WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; i WO 1999/040942.

[0417] Predstavljene kompozicije mogu dalje da sadrže, na primer, micele ili lipozome, ili neki drugi inkapsulirani oblik, ili mogu biti primenjene u obliku za produženo oslobađanje tako da se obezbedi efekat produženog čuvanja i/ili primene. Opisane farmaceutske formulacije mogu biti primenjene prema bilo kom režimu uključujući, na primer, jednom dnevno (1 na dan, 2 puta na dan, 3 puta na dan, 4 puta na dan, 5 puta na dan, 6 puta na dan), svaka dva dana, svaka tri dana, svaka četiri dana, svakih pet dana, svakih šest dana, jednom nedeljno, dva puta nedeljno, svake tri nedelje, jednom mesečno ili dva puta mesečno.

Kombinacije

[0418] Analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti primenjeni pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima koja imaju za cilj lečenje ili prevenciju bilo koje od bolesti ili medicinskih stanja koji su ovde opisani. Na primer, analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti koprimenjivani sa (istovremeno ili uzastopno) anti-dijabetičkim sredstvom ili sredstvom protiv gojaznosti. Anti-dijabetička sredstva poznata u tehnici ili koja se ispituju obuhvataju insulin, leptin, Peptid YY (PYY), peptid pankreasa (PP), faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21), agoniste Y2Y4 receptora, sulfoniluree, kao što je tolbutamid (Orinase), acetoheksamid (Dymelor), tolazamid (Tolinase), hlorpropamid (Diabinese), glipizid (Glucotrol), gliburid (Diabeta, Micronase, Glynase), glimepirid (Amaril) ili gliklazid (Diamicron); meglitinide, kao što je repaglinid (Prandin) ili nateglinid (Starlix); biguanide kao što je metformin (Glucophage) ili fenformin; tiazolidindione kao što je rosiglitazon (Avandia), pioglitazon (Actos) ili troglitazon (Rezulin), ili drugi inhibitori PPARγ; inhibitore alfa glukozidaze koji inhibiraju razlaganje ugljenih hidrata, kao što je miglitol (Glyset), akarboza (Precose/Glucobay); eksenatid (Byetta) ili pramlintid; inhibitore dipeptidil peptidaze-4 (DPP-4) kao što je vildagliptin ili sitagliptin; inhibitore SGLT (natrijum-zavisnog transportera glukoze 1); aktivatore glukokinaze (GKA); antagoniste receptora za glukagon (GRA); ili inhibitore FBPaze (fruktoza 1,6-bisfosfataze).

[0419] Sredstva protiv gojaznosti poznata u stanju tehnike ili koja se ispituju obuhvataju supresante apetita, uključujući stimulante tipa fenetilamina, fentermin (izborno sa fenfluraminom ili deksfenfluraminom), dietilpropion (Tenuate®), fendimetrazin (Prelu-2®, Bontril®), benzfetamin (Didrex®), sibutramin (Meridia®, Reductil®); rimonabant (Acomplia®), druge antagoniste kanabinoidnog receptora; oksintomodulin; fluoksetin hidrohlorid (prozak); Qnexa (topiramat i fentermin), Ekskalija (bupropion i zonisamid) i kontrave (bupropion i naltrekson); ili inhibitore lipaze, slične XENICAL (Orlistat) ili Cetilistat (takođe poznat kao ATL-962) ili GT 389-255.

[0420] Peptidi koji su ovde opisani u nekim primerima izvođenja se koprimenjuju sa sredstvom za lečenje bolesti nealkoholne masne jetre ili NASH. Sredstva korišćena za lečenje bolesti nealkoholne masne jetre obuhvataju ursodeoksiholnu kiselinu (takođe poznata kao, aktigal, URSO i ursodiol), metformin (Glucophage), rosiglitazon (Avandia), klofibrat, gemfibrozil, polimiksin B, i betain.

[0421] Peptidi koji su ovde opisani u nekim primerima izvođenja su koprimenjivani sa sredstvom za lečenje neurodegenerativne bolesti, npr., Parkinsonove bolesti. Sredstva protiv Parkinsonove bolesti su dalje poznata u stanju tehnike i obuhvataju levodopa, karbidopa, antiholinergike, bromokriptin, pramipeksol i ropinirol, amantadin i rasagilin.

[0422] U pogledu gore navedenog, otkriće dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije i komplete koji dodatno sadrže jedno od ovih drugih terapeutskih sredstava. Dodatno terapeutsko sredstvo može biti primenjivano istovremeno ili uzastopno sa analogom predmetnog otkrića. U nekim aspektima, analog je primenjen pre dodatnog terapeutskog sredstva, dok u drugim aspektima, analog je primenjen posle dodatnog terapeutskog sredstva.

Upotrebe

[0423] Na osnovu informacija koje su ovde obezbeđene po prvi put, razmatrano je da su kompozicije (npr., srodne farmaceutske kompozicije) predmetnih otkrića korisne za lečenje bolesti ili medicinskog stanja, kod koga npr., nedostatak aktivnosti na GIP receptoru, GLP-1 receptoru ili na oba receptora, je faktor u početku i/ili tokom napredovanja bolesti ili medicinskog stanja. Prema tome, predmetna otkrića obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju bolesti ili medicinskog stanja kod pacijenta, pri čemu, bolest ili medicinsko stanje je bolest ili medicinsko stanje kod koga je nedostatak aktivacije GIP receptora i/ili aktivacije GLP-1 receptora povezan sa početkom i/ili napredovanjem bolesti ili medicinskog stanja. Postupak sadrži obezbeđivanje pacijentu kompozicije ili konjugata u skladu sa bilo kojim od onih koji su ovde opisani u količini koja je efikasna za lečenje ili prevenciju bolesti ili medicinskog stanja.

[0424] U nekim primerima izvođenja, bolest ili medicinsko stanje je metabolički sindrom. Metabolički sindrom, takođe poznat kao metabolički sindrom X, sindrom insulinske rezistencije ili Reaven-ov sindrom, je poremećaj koji pogađa preko 50 miliona Amerikanaca. Metabolički sindrom je tipično okarakterisan grupisanjem najmanje tri ili više od sledećih faktora rizika: (1) abdominalna gojaznost (prekomerno masno tkivo u i oko abdomena), (2) aterogena dislipidemija (poremećaji masti u krvi uključujući visoke trigliceride, nizak HDL holesterol i visok LDL holesterol koji pojačava akumulaciju plaka u zidovima arterija), (3) povišeni krvni pritisak, (4) insulinska rezistencija ili intolerancije glukoze, (5) protrombotičko stanje (npr., visok fibrinogen ili plazminogen aktivator inhibitor-1 u krvi), i (6) proinflamatorno stanje (npr., povišeni C-reaktivni protein u krvi). Drugi faktori rizika mogu da obuhvataju starenje, hormonalnu neravnotežu i genetičku predispoziciju.

[0425] Metabolički sindrom je povezan sa povećanim rizikom od koronarne bolesti srca i drugim poremećajima povezanim sa akumulacijom vaskularnih plakova, kao što je šlog i periferna vaskularna bolest, označena kao aterosklerotična kardiovaskularna bolest (ASCVD). Pacijenti sa metaboličkim sindromom mogu da napreduju od stanja insulinske rezistencije u njegovim ranijim stadijumima do potpuno razvijenog dijabetesa tipa II sa dalje rastućim rizikom od ASCVD. Bez namere da se vežemo za bilo koju određenu teoriju, veza između insulinske rezistencije, metaboličkog sindroma i vaskularne bolesti može da uključuje jedan ili više istovremenih patogenih mehanizama uključujući oštećenu insulinom-stimulisanu vazodilataciju, smanjenje u dostupnosti NO kao posledica pojačanog oksidativnog stresa povezano sa insulinskom rezistencijom i abnormaliteti u hormonima poreklom od adipocita kao što je adiponektin (Lteif i Mather, Can. J. Cardiol.20 (suppl. B):66B-76B (2004)).

[0426] Prema 2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel (ATP III), bilo koje tri od sledećih osobina kod iste individue ispunjavaju kriterijume za metabolički sindrom: (a) abdominalna gojaznost (obim struka preko 102 cm kod muškaraca i preko 88 cm kod žena); (b) trigliceridi u serumu (150 mg/dl ili iznad); (c) HDL holesterol (40 mg/dl ili niže kod muškaraca i 50 mg/dl ili niže kod žena); (d) krvni pritisak (130/85 ili više); i (e) glukoza prilikom gladovanja (110 mg/dl ili više). Prema Svetskoj zdravstvenoj organiziji (WHO), individua koja ima visoke nivoe insulina (povišena glukoza prilikom gladovanja ili samo povišena posle obroka) sa najmanje dva od sledećih kriterijuma ispunjavaju kriterijume za metabolički sindrom: (a) abdominalna gojaznost (odnos struka prema kukovima veći od 0.9, indeks telesne mase od najmanje 30 kg/m<2>, ili mera struka preko 37 inča); (b) panel holesterola koji pokazuje nivo triglicerida od najmanje 150 mg/dl ili HDL holesterol niži od 35 mg/dl; (c) krvni pritisak od 140/90 ili više, ili na tretmanu za visok krvni pritisak). (Mathur, Ruchi, "Metabolic Syndrome," ed. Shiel, Jr., William C., MedicineNet. com, May 11, 2009).

[0427] Za svrhe ovde navedene, ako individua ispunjava bilo koji ili oba kriterijuma navedena u 2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel ili WHO, ta individua se smatra pogođenom metabočkim sindromom.

[0428] Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, kompozicije i konjugati koji su ovde opisani su korisni za lečenje metaboličkog sindroma. Prema tome, otkriće daje postupak za prevenciju ili lečenje metaboličkog sindroma, ili smanjenje jednog, dva, tri ili više njegovih faktora rizika, kod subjekta, koji sadrži obezbeđivanje subjektu analoga koji je ovde opisan u količini koja je efikasna za sprečavanje ili lečenje metabočkog sindroma, ili njegovog faktora rizika.

[0429] U nekim primerima izvođenja, postupak leči hiperglikemijsko medicinsko stanje. U određenim aspektima, hiperglikemijsko medicinsko stanje je dijabetes, dijabetes melitus tipa I, dijabetes melitus tipa II, ili gestacioni dijabetes, bilo insulin-zavisni ili ne-insulin-zavisni. U ilustrativnim aspektima, postupak leči hiperglikemijsko medicinsko stanje redukcijom jedne ili više komplikacija dijabetesa uključujući nefropatiju, retinopatiju i vaskularnu bolest.

[0430] U nekim aspektima, bolest ili medicinsko stanje je gojaznost. U nekim aspektima, gojaznost je gojaznost indukovana lekom. U nekim aspektima, postupak leči gojaznost prevencijom ili smanjenjem dobitka na telesnoj težini ili povećanjem gubitka na telesnoj težinu kod pacijenta. U nekim aspektima, postupak leči gojaznost smanjenjem apetita, smanjenjem unosa hrane, snižavanjem nivoa masti u pacijentu ili smanjenjem stope kretanja hrane u gastrointestinalnom sistemu.

[0431] Kako je gojaznost povezana sa početkom ili napredovanjem drugih bolesti, postupci za lečenje gojaznosti su dalje korisni u postupcima za smanjenje komplikacija povezanih sa gojaznošću uključujući vaskularnu bolest (koronarna arterijska bolest, šlog, periferna vaskularna bolest, ishemija reperfuzija, itd.), hipertenzija, početak dijabetesa tipa II, hiperlipidemija i muskuloskeletne bolesti. Predmetno otkriće prema tome obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju ovih komplikacija povezanih sa gojaznošću.

[0432] U nekim primerima izvođenja, bolest ili medicinsko stanje je bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD). NAFLD označava široki spektar bolesti jetre u opsegu od masne jetre (steatoza), do nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), do ciroze (ireverzibilno, uznapredovalo oštećenje jetre). Svi stadijumi NAFLD imaju zajedničku akumulaciju masti (infiltracija masti) u ćelijama jetre (hepatocitama). Masna jetra je abnormalna akumulacija određenog tipa masti, triglicerida, u ćelijama jetre bez inflamacije ili oštećenja. Kod NASH, akumulacija masti je povezana sa različitim stepenima inflamacije (hepatitisa) i oštećenja (fibroza) jetre. Inflamatorne ćelije mogu da unište ćelije jetre (hepatocelularna nekroza). U terminima "steatohepatitis" i "steatonekroza", steato označava infiltraciju masti, hepatitis označava inflamaciju u jetri, i nekroza označava uništene ćelije jetre. NASH može konačno da dovede do oštećenja jetre (fibroza) i zatim ireverzibilnog, uznapredovalog oštećenja (ciroze). Ciroza koja je izazvana sa NASH je poslednji i najteži stadijum u spektru NAFLD. (Mendler, Michel, "Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) i Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH)," ed. Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, August 29, 2005).

[0433] Alkoholna bolest jetre ili alkoholom-indukovana bolest jetre, obuhvata tri patološki posebne bolesti jetre povezane sa ili izazvane prekomernom upotrebom alkohola: masna jetra (steatoza), hronični ili akutni hepatatis, i ciroza. Alkoholni hepatitis može biti u opsegu od blagog hepatitisa, sa abnormalnim laboratorijskim testovima koji su samo indikacija bolesti, do teške disfunkcije jetre sa komplikacijama kao što je žutica (žuta koža izazvana zadržavanjem bilirubina), hepatična encefalopatija (neurološka disfunckija izazvana insuficijencijom jetre), asciti (akumulacija tečnosti u abdomenu), varikozne vene u jednjaku koje krvare (varikozne vene u jednjaku), abnormalno zgrušavanje krvi i koma. Histološki, alkoholni hepatitis ima karakterističan izgled sa degeneracijom hepatocita u obliku balona, inflamacija sa neutrofilima i nekada Mallory tela (abnormalne agregacije ćelijskih intermedijernih filamentnih proteina). Ciroza je karakteristična anatomski po široko raširenim čvorićima u jetri kombinovanih sa fibrozom. (Worman, Howard J., "Alcoholic Liver Disease", Columbia University Medical Center website).

[0434] Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, kompozicije i konjugati koji su ovde opisani su korisni za lečenje alkoholne bolesti jetre, NAFLD, ili bilo kog njenog stadijuma, uključujući, na primer, steatozu, steatohepatitis, hepatitis, hepatičku inflamaciju, NASH, cirozu ili njihove komplikacije. Prema tome, predmetna otkrića daju postupak za prevenciju ili lečenje bolesti alkoholne jetre, NAFLD, ili bilo kog njenog stadijuma, kod subjekta koji sadrži obezbeđivanje subjektu kompozicije koja je ovde opisana u količini efikasnoj za sprečavanje ili lečenje alkoholne bolesti jetre, NAFLD, ili njenog stadijuma. Takvi postupci za lečenje obuhvataju smanjenje jednog, dva, tri ili više od sledećih: sadržaj masti u jetri, incidenca ili napredovanje ciroze, incidenca ili hepatoćelijski karcinom, znaci inflamacije, npr., abnormalni nivoi hepatičkog enzima (npr., aspartat aminotransferaza AST i/ili alanin aminotransferaza ALT ili LDH), povišeni feritin u serumu, povećani bilirubin u serumu i/ili znaci fibroze, npr., povećani nivoi TGF-beta. U ilustrativnim primerima izvođenja, kompozicije su korišćene za lečenje pacijenata koji su napredovali preko masne jetre (steatoza) i ispoljavaju znake inflamacije ili hepatitisa. Takvi postupci mogu da rezultiraju, na primer, u smanjenju nivoa AST i/ili ALT.

[0435] Pokazano je da GLP-1 i eksendin-4 imaju izvestan neuroprotektivni efekat. Predmetno otkriće takođe daje upotrebe kompozicija koje su ovde opisane u lečenju neurodegenerativnih bolesti, uključujući Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, multiplu sklerozu, amiotrofnu lateralnu sklerozu, druge poremećaje povezane sa demijelizacijom, senilnu demenciju, subkortikalnu demenciju, arteriosklerotičku demenciju, demenciju povezanu sa SIDA-om ili druge demencije, kancer centralnog nervnog sistema, traumatsku povredu mozga, povredu kičmene moždine, šlog ili cerebralnu ishemiju, cerebralni vaskulitis, epilepsiju, Huntingtonovu bolest, Tourette-ov sindrom, Guillain Barre sindrom, Wilson-onovu bolest, Pick-ovu bolest, neuroinflamatorne poremećaje, encefalitis, encefalomijelitis ili meningitis virusnog, gljivičnog ili bakterijskog porekla, ili druge infekcije centralnog nervnog sistema, prionske bolesti, cerebelarne ataksije, cerebelarnu degeneraciju, sindrome spinocerebelarne degeneracije, Friedreichs ataksiju, ataksiju telangiektaziju, kičmenu dismiotrofiju, progresivnu supranuklearnu paralizu, distoniju, spastičnost mišića, tremor, retinitis pigmentosa, striatonigralnu degeneraciju, mitohondrijalne encefalomiopatije, neuronalnu ceroidnu lipofuscinozu, hepatičke encefalopatije, renalne encefalopatije, metaboličke encefalopatije, toksinima indukovane encefalopatije i zračenjem-indukovano oštećenje mozga.

[0436] U nekim primerima izvođenja, kompozicije su korišćene zajedno sa parenteralnom primenom hranljivih sastojaka na nedijabetičke pacijente u bolničkom okruženju, npr., na pacijente koji primaju parenteralnu ishranu ili totalnu parenteralnu ishranu. Neograničavajući primeri obuhvataju pacijente koji su imali operaciju, pacijente u komi, pacijente sa bolešću digestivnog trakta ili nefunkcionalnim gastrointestinalnim traktom (npr. kao posledica hirurškog odstranjivanja, blokade ili oštećenog apsorptivnog kapaciteta, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, opstrukcije gastrointestinalnog trakta, fistule gastrointestinalnog trakta, akutnog pankreatitisa, ishemičnog creva, velike gastrointestinalne operacije, određenih kongenitalnih anomalija gastrointestinalnog trakta, produžene dijareje ili sindroma skraćenog creva kao posledica operacije, pacijenata u šoku i pacijenata koji prolaze kroz proces lečenja često primaju parenteralnu primenu ugljenih hidrata zajedno sa različitim kombinacijama lipida, elektrolita, minerala, vitamina i aminokiselina. Kompozicije koje sadrže peptid agonist GIP i peptid agonist glukagona, kao što su ovde opisane, i kompozicija za parenteralnu ishranu mogu biti primenjivane u sito vreme, u različita vremena, jedna pre, ili posle druge, uz uslov da kompozicija ispoljava željeni biološki efekat u isto vreme kada se digestira kompozicija parenteralne ishrane. Na primer, parenteralna ishrana može buiti primenjivana 1, 2 ili 3 puta na dan, dok se kompozicija primenjuje jednom svakog drugog dana, tri puta nedeljno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom u svake 2 nedelje, jednom svake 3 nedelje ili jednom mesečno.

[0437] Kao što je ovde korišćen, termin "lečenje/tretman" obuhvata profilaksu specifičnog poremećaja ili stanja, ili ublažavanje simptoma povezanih sa specifičnim poremećajem ili stanjem i/ili prevenciju ili eliminaciju navedenih simptoma. Na primer, kao što je ovde korišćen termin "lečenje dijabetesa" označavaće generalno promenu nivoa glukoze u krvi u smeru normalnih nivoa i može da obuhvata povećanje ili smanjenje nivoa glukoze u krvi u zavisnosti od date situacije.

[0438] Kao što je ovde korićena "efikasna" količina ili "terapeutski efikasna količina" peptida glukagona označava netoksičnu, ali dovoljnu količinu peptida da bi se obezbedio željeni efekat. Na primer, jedan željeni efekat bi bio prevencija ili lečenje hipoglikemije, kao što je merena, na primer, preko povećanja nivoa glukoze u krvi. Alternativan željeni efekat za peptida glukagona predmetnog otkrića bi obuhvatao lečenje hiperglikemije, npr., kao što je merena preko promene u nivou glukoze u krvi bliže normalnom, ili indukcijom gubitka telesne težine/prevencije dobitka telesne težine, npr., kao što je mereno preko redukcije u telesnoj težini, ili prevencije ili redukcije u povećanju telesne težine, ili normalizaciji raspodele telesne masti. Količina koja je "efikasna" variraće od subjekta do subjekta, u zavisnosti od starosti i opšteg stanja individue, načina primene i slično. Na taj način, nije uvek moguće naznačiti tačnu "efikasnu količinu." Međutim, odgovarajuća "efikasna" količina u bilo kom individualnom slučaju može biti određena od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike upotrebom rutinskih eksperimenata.

SUBJEKTI

[0439] U vezi sa gore navedenim postupcima lečenja, pacijent je bilo koji domaćin. U nekim primerima izvođenja, domaćin je sisar. Kao što je ovde korišćen, termin "sisar" označava bilo koju životinju kičmenjaka iz klase sisara, uključujući bilo koju od kljunara, torbara i placentalnih taksona. U nekim primerima izvođenja, sisar je jedan od sisara reda Rodentia, kao što su miševi i hrčci, i sisari reda Logomorpha, kao što su zečevi. U ilustrativnim primerima izvođenja, sisari su iz reda Carnivora, uključujući Felines (mačke) i Canines (pse). U ilustrativnim primerima izvođenja, sisari su iz reda Artiodactyla, uključujući Bovines (krave) i svinje (prasiće) ili iz reda Perissodactyla, uključujući Equines (konje). U nekim slučajevima, sisari su iz reda Primates, Ceboids ili Simoids (majmuna) ili iz reda Anthropoids (ljudi i čovekoliki majmuni). U određenim primerima izvođenja, sisar je čovek.

KOMPLETI

[0440] Analozi glukagona predmetnog otkrića mogu biti obezbeđeni u skladu sa jednim primerom izvođenja kao deo kompleta. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, obezbeđen je komplet za primenu analoga glukagona na pacijenta kod koga postoji potreba za tim, pri čemu komplet sadrži analog glukagona kao što je ovde opisan.

[0441] U jednom primeru izvođenja obezbeđen je uređaj za primenu analoga glukagona na subjekta. Uređaj u nekim aspektima je igla šprica, olovka špric, jet injector ili drugi injektor bez igle. Komplet može alternativno ili dodatno da sadrži jedan ili više spremnika, npr., vijalica, epruveta, bočica, prethodno napunjenih špriceva sa jednom ili više komora, kertridža, infuzionih pumpi (spoljašnjih ili implantirajućih), mlaznih injektora, prethodno napunjenih špric olovaka i slično, izborno koji sadrže analog glukagona u liofilizovanom obliku ili u vodenom rastvoru. Kompleti u nekim primerima izvođenja sadrže uputstva za upotrebu. U skladu sa jednim primerom izvođenja uređaj kompleta je uređaj za primenu aerosola, pri čemu je kompozicija prethodno spakovana unutar uređaja za aerosol. U sledećem primeru izvođenja komplet sadrži špric i iglu, i u jednom primeru izvođenja sterilna kompozicija šprica je prethodno pakovana unutar šprica.

[0442] Kompleti u nekim primerima izvođenja sadrže uputstva za upotrebu. Uputstva u nekim aspektima uključuju uputstva za upotrebu u skladu sa bulo kojim od postupaka opisanih ovde. Uputstva mogu dodatno sadržati uputstva za održavanje zdrave ishrane i/ili program fizičkih vežbi. Uputstva mogu biti u obliku papirnog pamfleta, ili u elektronskom obliku, npr., uređaja za skadištenje koji se može pročtati kompjuterom koji sadrži uputstva.

[0443] Sledeći primeri su dati samo za ilustraciju predmetnog pronalaska, a ne za ograničavanje njegovog obima ni na koji način.

PRIMERI

PRIMER 1

[0444] U sledećem tekstu dati su ilustrativni postupci za sintezu peptidnih analoga predmetnih otkrića.

Sinteza peptidnih fragmenata glukagona

Materijali:

[0445] Svi peptidi koji su opisani ovde u PRIMERIMA su amidovani osim ukoliko nije naznačeno drugačije.

[0446] MBHA smola (4-metilbenzhidrilamin polistiren smola je korišćena u toku sinteze peptida. MBHA smola, 100-180 mreža, 1% DVB unakrsno-vezani polistiren; punjenje od 0.7-1.0 mmol/g), Boc-zaštićene i Fmoc zaštićene aminokiseline su kupljene iz Midwest Biotech. Čvrsto fazna sinteza peptida upotrebom Boc-zaštićenih aminokiselina je izvedena na Applied Biosystem 430A Peptide Synthesizer. Sinteza Fmoc zaštićene aminokiseline je izvedena upotrebom Applied Biosystems Model 433 Peptide Synthesizer.

Sinteza peptida (Boc aminokiseline/HF cepanje):

[0447] Sinteza ovih analoga je izvedena na Applied Biosystem Model 430A Peptide Synthesizer. Sintetički peptidi su konstruisani sekvencijalnim dodavanjem aminokiselina u kertridž koji sadrži 2 mmol Boc zaštićene aminokiseline. Specifično, sinteza je izvedena upotrebom Boc DEPBT-aktiviranih pojedinačnih kuplovanja. Na kraju koraka kuplovanja, peptidil-smola je tretirana sa TFA da bi se uklonila N-terminalna Boc zaštićena grupa. Ispirana je više puta sa dimetilformamidom (DMF) i ovaj ponavljajujući ciklus je ponavljan željeni broj koraka kuplovanja. Posle sklapanja, zaštita bočnog lanca, Fmoc, je uklonjena sa 20% piperidinskim tretmanom i acilacija je izvedena upotrebom DIC. Peptidil-smola na kraju cele sinteze je sušena upotrebom dihlorometana (DCM) i peptid je otcepljen sa smole sa anhidrovanim HF.

[0448] Za laktamizaciju, ortogonalne zaštitne grupe su izabrane za Glu i Lys (npr., Glu(Fm), Lys(Fmoc)). Posle uklanjanja zaštitnih grupa i pre HF cepanja, ciklizacija je izvedena kao što je prethodno opisano (videti, npr., objavu međunarodne patentne prijave br. WO2008/101017).

HF tretman peptidil-smole

[0449] Peptidil-smola je tretirana sa anhidrovanim fluorovodonikom (HF), i ovo je tipično proizvelo približno 350 mg (~50% prinos) sirovog deprotektovanog peptida. Specifično, peptidil-smola (30mg do 200mg) je postavljena u reakcionu posudu sa fluorovodonikom (HF) za cepanje. 500 µL p-krezola je dodato u posudu kao akceptor karbonijum jona. Posuda je vezana za HF sistem i potopljena u smeši metanola/suvog leda. Posuda je ispražnjena sa vakuumskom pumpom i 10 ml HF je destilovano u reakcionu posudu. Ova reakciona smeša peptidil-smole i HF je mešana jedan čas na 0°C, nakon čega je uspostavljen vakuum i HF je brzo ispražnjen (10-15 min). Posuda je pažljivo uklonjena i napunjena sa približno 35 ml etra da bi se istaložio peptid i ekstrahovao p-krezol i mali molekuli organske zaštine grupe koje su rezultat HF tretmana. Ova smeša je filtrirana upotrebom teflonskog filtera i ponovljena dva puta da bi se uklonio višak krezola. Ovaj filtrat je odbačen. Istaloženi peptid se rastvara u približno 20 ml od 10% sirćetne kiseline (vodeni rastvor). Ovaj filtrat, koji je sadržao željeni peptid je sakupljen i liofilizovan.

[0450] Analitička HPLC analiza sirovog solubilizovanog peptida je izvedena pod sledećim uslovima [4.6X 30 mm Xterra C8, 1.50 mL/min, 220 nm, A pufer 0.1% trifluorosirćetna kiselina (TFA)/10% akrilonitril (ACN), B pufer 0.1% TFA/100% ACN, gradijent 5-95% B tokom 15 minuta]. Ekstrakt je razblažen dva puta sa vodom i sipan na 2.2 X 25 cm Vydac C4preparativnu reverzno-faznu kolonu i eluiran upotrebom gradijenta acetonitrila na Waters HPLC sistemu (A pufer od 0.1 % TFA/10% ACN, B pufer od 0.1 % TFA/10% ACN i gradijent od 0-100% B tokom 120 minuta na protoku od 15.00 ml/min. HPLC analiza prečišćenog peptida pokazala je veću od 95% čistoću i elektrosprej jonizacija-masena spektralna analiza je korišćena da bi se potvrdio identitet peptida.

Acilacija peptida

[0451] Acilovani peptidi su pripremljeni na sledeći način. Peptidi su sintetisani na čvrstoj podlozi smole upotrebom CS Bio 4886 Peptide Synthesizer ili Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer. In situ neutralizacija je korišćena kao što je opisano od strane Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992). Za acilovane peptide, ciljni aminokiselinski ostatak koji će se acilovati (npr., položaj deset, u odnosu na aminokiselinski položaj od SEQ ID NO: 3) je supstituisan sa N ε -FMOC lizinskim ostatkom. Tretman kompletnog N-terminalno BOC zaštićenog peptida sa 20% piperidinom u DMF u trajanju od 30 minuta uklonio je FMOC/formil grupe. Kuplovanje sa slobodnim ε-amino Lys ostatkom je postignuto spajanjem desetostrukog molarnog viška FMOC-zaštićene spejser aminokiseline (pr. FMOC-Glu-OtBu) ili acil lanca (pr. CH3(CH2)14-COOH) i PyBOP ili DEPBT kuplujućeg reagensa u DMF/DIEA. Kasnije uklanjanje FMOC grupe spejser aminokiseline je praćeno ponavljanjem kuplovanja sa acil lancem. Finalni tretman sa 100% TFA rezultovao je u uklanjanju bilo kojih zaštitnih grupa bočnog lanca i N-terminalne BOC grupe. Peptidne smole su bile neutralizovana sa 5% DIEA/DMF, sušene i zatim otcepljene iz podloge upotrebom HF/p-krezola, 95:5, na 0°C za jedan čas. Posle etarske ekstrakcije, 5% HOAc rastvor je korišćen za solvatiranje sirovog peptida. Zatim je potvrđeno da uzorak rastvora sadrži peptid ispravne molekulske težine pomoću ESI-MS. Ispravni peptidi su prečišćeni pomoću RP-HPLC upotrebom linearnog gradijenta od 10% CH3CN/0.1% TFA do 0.1% TFA u 100% CH3CN. Vydac C1822 mm x 250 mm proteinska kolona je korišćena za prečišćavanje. Acilovani peptidni analozi generalno su završili eluiranje sa odnosom pufera od 20:80. Porcije su sakupljene i proverene u odnosu na čistoću na analitičkoj RP-HPLC. Čiste frakcije su liofilizovane proizvodeći bele, čvrste peptide.

[0452] U daljem tekstu je primer acilovanog Lys ostatka gde je acil grupa vezana preko γ-Glu-γ-Glu dipeptidnog spejsera.

gde n je 1 do 29.

[0453] Ako je peptid sadržao laktamski most i ciljne ostatke koji će biti acilovani, acilacija je izvedena kao što je opisano u prethodnom tekstu posle dodavanja te aminokiseline peptidnoj osnovi.

[0454] Dvostruke acilacije ili di-acilacije su pripremljene kao što sledi. Peptidi su sintetisani na čvrstoj podlozi smole upotrebom CS Bio 4886 Peptide Synthesizer ili Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer. In situ neutralizaciona hemija je korišćena kao što su opisali Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992). Za peptide dvostruko acilovane na dva mesta, ciljni aminokiselinski ostaci koji se aciluju (npr., položaj deset i 40, u odnosu na numeraciju aminokiselinskog položaja od SEQ ID NO: 3) su supstituisani sa N ε-FMOC lizinskim ostacima. Tretman kompletnog N-terminalno BOC zaštićenog peptida sa 20% piperidinom u DMF u trajanju od 30 minuta uklanja FMOC/formil grupe. Kuplovanje za sloodan ε-amino Lys ostatak je postignuto kuplovanjem desetostrukog molarnog viška FMOC-zaštićene spejser aminokiseline (pr. FMOC-Glu-OtBu) ili acil lanca (pr. CH3(CH2)14-COOH) i PyBOP ili DEPBT kuplujućeg reagensa u DMF/DIEA. Kasnije uklanjanje FMOC grupe spejser aminokiseline je praćeno ponavljanjem kuplovanja sa acil lancem. Finalni tretman sa 100% TFA rezultuje u uklanjanju bilo kojih zaštitinih grupa bočnog lanca i N-terminalne BOC grupe. Peptidne smole su neutralizovane sa 5% DIEA/DMF, sušene i zatim otcepljene od podloge upotrebom HF/p-krezola, 95:5, na 0°C u toku jednog časa. Posle etarske ekstrakcije, 5% HOAc rastvor je korišćen za solvataciju sirovog peptida. Uzorak rastvora je zatim potvrđen da sadrži peptid ispravne molekulske težine pomoću ESI-MS. Ispravni peptidi su prečišćeni pomoću RP-HPLC upotrebom linearnog gradijenta od 10% CH3CN/0.1% TFA do 0.1% TFA u 100% CH3CN. Vydac C1822 mm x 250 mm proteinska kolona je korišćena za prečišćavanje. Acilovani peptidni analozi generalno završavaju eluiranje odnosom pufera 20:80. Porcije su sakupljene zajedno i proverene za čistoću na analitičkoj RP-HPLC. Čiste frakcije su liofilizovane proizvodeći bele, čvrste peptide.

[0455] Dvostruke acilacije grane jednog mesta su pripremljene na sledeći način. Peptidi su sintetisani na čvrstoj podlozi smole upotrebom CS Bio 4886 Peptide Synthesizer ili Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer. In situ neutralizaciona hemija je korišćena kao što je opisano od strane Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992). Za acilovane peptide, ciljni aminokiselinski ostatak koji se aciluje (npr., položaj deset u odnosu na numeraciju aminokiselinskog položaja SEQ ID NO: 3) je supstituisan sa N ε-FMOC lizinskim ostatkom. Tretman završenog N-terminalnog BOC zaštićenog peptida sa 20% piperidinom u DMF u trajanju od 30 minuta uklanja FMOC/formil grupe. Kuplovanje za Lys ostatak preko C-terminusa je postignuto kuplovanjem desetostrukog molarnog viška ε-amino i α-amino FMOC-zaštićene spejser aminokiseline (pr. FMOC-Lys(FMOC)-OH) i PyBOP ili DEPBT kuplujućeg reagensa u DMF/DIEA. Kasnije uklanjanje FMOC grupa spejser aminokiselina je praćeno kuplovanjem svake od ε-amino i α-amino grupa sa acil lancem.

Finalni tretman sa 100% TFA rezultuje u uklanjanju bilo kojih zaštitnih grupa bočnog lanca i N-terminalne BOC grupe. Peptidne smole su neutralizovane sa 5% DIEA/DMF, sušene i zatim otcepljene od podloge upotrebom HF/p-krezola, 95:5, na 0°C u trajanju od jednog časa. Posle etarske ekstrakcije, 5% HOAc rastvor je korišćen za solvataciju sirovog peptida. Uzorak rastvora je zatim potvrđen da sadrži peptid ispravne molekulske težine pomoću ESI-MS. Ispravni peptidi su prečišćšeni pomoću RP-HPLC upotrebom linearnom gradijenta od 10% CH3CN/0.1% TFA do 0.1% TFA u 100% CH3CN. Vydac C1822 mm x 250 mm proteinska kolona je korišćena za prečišćavanje. Acilovani peptidni analozi generalno završavaju eluiranje do odnosa pufera od 20:80. Porcije su sakupljene i proverene u odnosu na čistoću na analitičkoj RP-HPLC. Čiste frakcije su liofilizovane proizvodeći bele, čvrste peptide.

[0456] Linearne dvostruke acilacije jednog mesta su pripremljene na sledeći način. Peptidi su sintetisani na čvrstoj podlozi smole upotrebom CS Bio 4886 Peptide Synthesizer ili Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer. In situ neutralizaciona hemija je korišćena kao što su opisali Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992). Za acilovane peptide, ciljni aminokiselinski ostatak koji se aciluje (npr., položaj deset, u odnosu na numeraciju aminokiselinskog položaja od SEQ ID NO: 3) je supstituisan sa N ε -FMOC lizinskim ostatkom. Tretman završenog N-terminalno BOC zaštićenog peptida sa 20% piperidinom u DMF u trajanju od 30 minuta uklanja FMOC/formil grupe. Kuplovanje za slobodan ε-amino Lys ostatak je postignuto kuplovanjem desetostrukog molarnog viška FMOC-zaštićene spejser aminokiseline (pr. FMOC-Glu-OtBu) ili acil lanca (pr. CH3(CH2)14-COOH) i PyBOP ili DEPBT kuplujući reagens u DMF/DIEA. Kasnije uklanjanje FMOC grupe spejser aminokiseline je praćeno kuplovanjem sa acil lancem funkcionalizovanim na kraju repa masne kiseline sa zaštićenom aminokiselinom kao što je FmocNH-(CH2)11-COOH. Rezultujuća jedna acilovana aminokiselina je tretirana sa 20% piperidinom u DMF da bi se uklonila FMOC zaštitna grupa, nakon čega je usledilo kuplovanje sa acil lancem. Finalni tretman sa 100% TFA rezultuje u uklanjanju bilo kojih zaštitnih grupa bočnog lanca i N-terminalne BOC grupe. Peptidne smole su neutralizovane sa 5% DIEA/DMF, sušene i zatim odepljene od podloge upotrebom HF/p-krezola, 95:5, na 0°C u trajanju od jednog časa. Posle etarske ekstrakcije, 5% HOAc rastvor je korišćen za solvataciju sirovog peptida. Uzorak rastvora je zatim verifikovan tako da sadrži peptid ispravne molekulske težine pomoću ESI-MS. Ispravni peptidi su prečišćeni pomoću RP-HPLC upotrebom linearnog gradijenta od 10% CH3CN/0.1% TFA do 0.1% TFA u 100% CH3CN. Vydac C1822 mm x 250 mm proteinska kolona je korišćena za prečišćavanje. Acilovani peptidni analozi generalno završavaju eluiranje preko odnosa pufera od 20:80. Porcije su sakupljene zajedno i proverene u odnosu na čistoću na analitičkoj RP-HPLC. Čiste frakcije su liofilizovane proizvodeći bele, čvrste peptide.

[0457] U slučajevima dvostrukih acila jednog mesta ili dva mesta, dva acil lanca koja se kupluju za peptid mogu biti ista ili različita. U slučaju dva različita acil lanca, ciljna aminokiselina(e) koje se aciluju su supstituisane sa dve različite zaštitne grupe. Na primer N ε-FMOC lizinski ostatak i N ε-ivDde lizinski ostatak (dvostruka acilacija dva mesta) ili FMOC Lys (ivDde)-OH (dvostruka acilacija jednog mesta, 852082 Novabiochem). Tretman završenog N-terminalno BOC zaštićenog peptida sa 20% piperidinom u DMF u trajanju od 30 minuta uklonilo je FMOC/formil grupe. Slobodan ε-amino Lys ostatak je kuplovan sa acil grupom ili spejser aminokiselinom, praćeno kuplovanjem za acil grupu. Rezultujući jedan acilovani peptid je tretiran sa 2% hidrazinom/DMF da bi se uklonila (ivDde) zaštitna grupa. Slobodan amino Lys ostatak je kuplovan sa acil grupom ili spejser aminokiselinom, praćeno kuplovanjem za acil grupu. Dvostruko acilovani peptid je izolovan kao što je opisano u prethodnom tekstu.

[0458] Primer sinteze dvostruko acilovanog peptida (Glukagon Aib2 E16 A18 L27 D28 Cex K40(C16yE-KyEC12) G41-amid, koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 211) je prikazan na Slici 5B i dalje je opisan u donjem tekstu:

[0459] 0.28gm (0.2mmol) mbha-smole (Midwest Biotech) postavljeno je u reakcionu posudu i sledeća sekvenca je sklopljena na CSBio336 uređaju za sintetisanje upotrebom DEPBT/DIEA aktiviranih pojedinačnih kuplovanja Boc aminokiselina.

Boc-HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-mbha smola

[0460] Boc zaštićena peptid smola je prebačena u manualnu reakcionu posudu i tretirana sa 20% piperidinom/DMF na sobnoj temperaturi u trajanju od 10 min. Smola je filtrirana, isprana sa DMF 3 puta, i dodat je aktivirani rastvor Fmoc Lys(ivDde)-OH (EMD-Novabiochem) (prethodno pripremljen rastvaranjem 2 mmol Fmoc Lys(ivDde) u 4.0 ml 0.5M DEPBT/DMF i dodato je 0.35 ml (2mmol) DIEA.

[0461] Peptid smola je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 16 časova, zatim filtrirana, isprana sa DMF i tretirana sa 20% piperidinom/DMF u trajanju od 10min. Smola je filtrirana, isprana sa DMF nekoliko puta, i dodat je aktivni rastvor Fmoc Glu-OBzl (prethodno pripremljen rastvaranjem 2mmol Fmoc Glu-OBzl u 4.0ml 0.5M DEPBT/DMF i dodato je 0.35ml DIEA). Reakcija je mešana 1 čas na sobnoj temperaturi i zatim je filtrirana i smola je isprana sa DMF. Posle još jednog tretmana sa 20% pip/DMF, smola je isprana sa DMF nekoliko puta, i aktivni rastvor palmitinske kiseline je dodat da bi se završila acilacija αamina bočnog lanca Lys na položaju 40 (prethodno pripremljen rastvaranjem 2mmol palmitinske kiseline u 4.0ml 0.5M DEPBT/DMF i dodavanjem 0.35ml DIEA). Reakcija je mešana u trajanju od 1 časa.

[0462] Peptid smola je filtrirana, isprana sa DMF i tretirana sa 2% hidrazinom/DMF na sobnoj temperaturi u trajanju od 15min, filtrirana i isprana sa DMF nekoliko puta. Dodat je aktivirani rastvor Fmoc Glu-OBzl (isti kao u prethodnom tekstu) i reakcija je mešana u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi. Smola je podeljena u tri porcije za finalnu acilaciju na ε-lizinskom aminu. U tom slučaju, dodata je jedna porcija aktiviranog rastvora dodekanoinske kiseline. Prethodno je pripremljena rastvaranjem 1 mmol dodekanoinske kiseline (Aldrich) u 2.0ml 0.5M DEPBT/DMF i dodato je 0.175ml DIEA. Reakcija je mešana 1 čas, filtrirana, isprana sa DMF, i zatim dihlorometanom. N-terminalna Boc grupa je uklonjena tretmanom sa 50%TFA/DCM, i posle neutralizacije sa 5%DIEA/DCM, cepanje HF je izvedeno u ledenom kupatilu u trajanju od 1 časa upotrebom p-krezola kao skevendžera. Posle isparavanja HF, ostatak je suspendovan u etil etar i smeša peptida/smole je filtrirana i isprana etrom. Peptid je ekstrahovan u vodeni rastvor sirćetne kiseline i analiziran na HPLC. (4.6x50mm Zorbax SB-C8, 1ml/min, 45°C, 214nm (0.5A) A=0.1%TFA, B=0.1%TFA/90%ACN. Preostali ekstrakt od cepanja je sipan na 21.2x250mm Amberchrom XT20 kolonu i gradijent 0.1%TFA/acetonitrila je izveden na Pharmacia FPLC za prečišćavanje.

[0463] Frakcije 83-86 su spojene, zamrznute i liofilizovane da bi se dobilo 22.3 mg peptida od SEQ ID NO: 211 sa čistoćom od 90%+. Teorijska mol. tež.= 5202.9, ESI zabeležena masa = 5202.0

Acilacija peptida preko sukcinoilacije

[0464] Sukcinoilovani peptidi su pripremljeni kao što sledi. Peptidi su sintetisani na čvrstoj podlozi smole korišćenjem ili CS Bio 4886 Peptide Synthesizer ili Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer. Korišćena je in situ neutralizaciona hemija kao što je opisano od strane Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992). Za sukcinoilovane peptide, ciljni aminokiselinski ostatak koji se aciluje (npr., položaj deset, u odnosu na numerisanje položaja aminokiselina SEQ ID NO: 3) supstituisan je sa N ε-FMOC lizinskim ostatkom. Tretman kompletiranog N-terninalno BOC zaštićenog peptida sa 20% piperidinom u DMF 10 minuta uklonio je FMOC/formil grupe. Smola je filtrirana, isprana sa DMF/DCM i resuspendovana u DCM. Kuplovanje sa slobodnim ε-amino Lys ostatkom je postignuto kuplovanjem deset puta većeg molekulskog viška n-heksadecilsukcinskog anhidrida (TCI) zajedno sa 4-dimetilaminopiridinom. Smola je mešana preko noći, filtrirana, isprana sa DCM i tretirana sa 50% TFA/DCM da bi se uklonile bilo koje zaštitne grupe bočnog lanca i N-terminalni BOC. Peptid smole su neutralizovane sa 5% DIEA/DMF, osušene, i zatim su isečene iz podloge korišćenjem HF/p-krezola, 95:5, na 0°C jedan čas. Nakon ekstrakcije sa etrom, 5% HOAc rastvor je korišćen za solvatiranje sirovog peptida. Uzortak rastvora je zatim verifikovan sa HPLC analizom. Preostali rastvor sirćetne kiseline je napunjen u 10X250 mm Amberchrom XT20 kolonu za prečišćavanje. Vodeni TFA/ACN gradijent je pušten uz sakupljanje frakcije i praćenje UV na 214 nm. Čiste frakcije su liofilizovane, dajući čvrste peptide.

[0465] Primer sinteze sukcinoilovanog peptida (Glukagon Aib2 E16 A18 L27 D28 Cex K40(C16 sukcinoil) G41-amid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 156) je prikazan na Slici 3C i dodatno je opisan u nastavku:

[0466] 0.28 gm (0.2 mmol) mbha-smole (Midwest Biotech) je stavljeno u reakcioni sud i sledeća sekvenca je sastavljena na CSBio336 sintetizatoru korišćenjem DEPBT/DIEA aktiviranih pojedinačnih kuplovanja.

Boc-HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-mbha smola

[0467] Približno, jedna trećina Boc zaštićene peptidne smole je preneta u manuelni reakcioni sud i tretirana sa 20% piperidin/DMF na sobnoj temepraturi 10min. Smola je filtrirana, isprana sa DMF 3 puta, dva puta sa dihlorometanom i resuspendovana u 10ml DCM.324 mg (1 mmol) n-heksadecilsukcinskog anhidrida (TCI) dodato je zajedno sa 2-3 mg 4-dimetilaminopiridina (Aldrich).

[0468] Smola je mešana preko noći na sobnoj temperaturi pre filtriranja, ispiranja sa DCM dva puta, i tretiranja sa 50%TFA/DCM 1-2 min. Smola je filtrirana, isprana nekoliko puta sa DCM, neutralizovana ispiranjem sa 5%DIEA/DCM i preneta u HF reakcioni sud. HF cepanje je izvedeno korišćenjem 5ml tečnog fluorovodonika i 0.5ml p-krezol skevendžera. Nakon mešanja 1 čas u ledenom kupatilu, HF je uklonjen in vacuo i ostatak je suspendovan sa etil etrom. Suspenzija je filtrirana korišćenjem levka od sinterovanog stakla, čvrste supstance su isprane sa etrom, i peptid je ekstrahovan u 15 ml 50% vodenog rastvora sirćetne kiseline.

Nakon analize na HPLC (4.6x50 mm Zorbax SB-C8, 1 ml/min, 45°C,214 nm, A=0.1%TFA, B=0.1%TFA/90%ACN, gradijent = 30%B do 90%B tokom 10 min), ekstrakt isecanja je napunjen na 21.2X250 mm Amberchrom XT20 kolonu za prečišćanje. Vodeni rastvor TFA/acetonitril gradijenta je izveden uz sakupljanje frakcija i praćenje UV apsorbance. Frakcije 55-56 su identifikovane kao pojedinačna komponenta i zamrznute su i liofilizovane.

32.5 mg je rekuperovano sa čistoćom od 90%+ (DLS-027-68B). Teoretska mol. tež.=4720.3, ESI uočena masa = 4717.0

Alkilacija peptida (npr., S-alkilacija)

[0469] Primer sinteze alkilovanog (npr., S-alkilovanog) peptida (Glukagon Aib2 E16 A18 L27 D29 Cex Cys40(S-2 palmitil)amid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 164) je prikazan na Slici 6 i dodatno je opisan u nastavku:

0.28 gm 0.2 mmol mbha-smole (Midwest Biotech) je stavljeno u CSBio reakcioni sud i sastavljena je sledeća sekvenca na CSBio336 sintetizatoru korišćenjem Boc aminokiselina i DEPBT/DIEA aktiviranog pojedinačnog kuplovanja.

HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSC-amid

[0470] Peptid smola je preneta u HF reakcioni sud i HF isecanje je izvedeno korišćenjem 10 ml tečnog fluorovodonika i 1ml p-krezol skevendžera u ledenom kupatilu 1 čas. Nakon uparavanja HF, ostatak je suspendovan u etil etru i peptid i smola su filtrirani u levak od sinterovanog stakla. Nakon ispiranja sa etil etrom i brzog sušenja na vazduhu, peptid je ekstrahovan u 50% vodeni rastvor sirćetne kiseline. Nakon analize sa HPLC (4.6x50 mm Zorbax SB-C8, 1 ml/min, 45°C, 214 nm, A=0.1%TFA, B=0.1%TFA/90%ACN, 30% do 90%B tokom 10 min), ekstrakt isecanja je razblažen 3-4 sa vodom i napunjen je u 22.2X250 mm Amberchrom XT20 kolonu za prečišćavanje korišćenjem vodenog TFA/CAN gradijenta. Inicijalni pul je ponovo prečišćen preko iste kolone da bi se dobilo 79 mg 95% čistoće. Teoretska mol. tež.= 4313.7, ESI uočena masa = 4312.0.

[0471] 16 mg (3.7 mmol) prethodno pomenutog slobodnog tiol peptida suspendovano je u 1 ml metanola i uz mešanje pod strujom azota, dodato je 1.5ul tetrametilguandina u 1 ml metanola (MeOH) nakon čega je dodato 3mg (7.8mmol) 2-jodoheksadekanske kiseline (2-jodopalmitinske kiseline) u 0.5mg tetrahidrofuran (THF). 2- jodoheksadekanska kiselina je prethodno pripremljena tretiranjem 2-bromoheksadekanske kiseline sa kalijum jodidom u acetonu (DLS-027-52). Reakcija alkilacije je zagrejana u kupatilu 10 min kada je uparena većina rastvarača. Ostatak je rastvoren u vodenom rastvoru sirćetne kiseline, analiziran sa HPLC i nađeno je da je hidrofobniji od početnog peptida. Preostali rastvor sirćetne kiseline je napunjen u 10X250mm Amberchrom XT20 kolonu za prečišćavanje. Vodeni TFA/ACN gradijent je izveden uz sakupljanje frakcija i praćenje UV na 214nm. Frakcije 64-68 su kombinovane, zamrznute i liofilizovane da bi se dobilo 6.1mg materijala (peptid SEQ ID NO: 164) sa čistoćom od 90%+. Teoretska mol. tež. = 4568.1, MALDI uočena masa = 4568.79

[0472] Kada peptid sadrži Lys ostatak umesto Cys ostatka na C-terminusu, peptid se može napraviti prvo sa Lys osnovom. Ciljni aminokiselinski ostatak koji treba N-alkilovati je supstituisan sa N ε-FMOC lizinskim ostatkom. Tretiranje kompletnog N-terminalno BOC zaštićenog peptida sa 20% piperidina u DMF 30 minuta uklanja FMOC/formil grupe iz Lys ostatka. Cys ostatak je kuplovan sa slobodnim ε-amino Lys ostatkom. Cys ostatak je zatim alkilovan reakcijom sa 2-jodopalmitinskom kiselinom kao što je prethodno opisano.

Acilacija peptida sa "miniPEG" spejserima

[0473] Primer sinteze acilovanog peptida preko mini-PEG spejsera (peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89) je opisan u nastavku:

[0474] 0.28gm (0.2mmol) 4-metilbenzhidrilamin (mbha) smole (Midwest Biotech, Inc., Fishers, IN) stavljen je u reakcionu posudu i sledeća sekvenca je sastavljena na CSBio336 sintetizatoru korišćenjem Boc aminokiselina i 3-(dietoksifosforiloksi)-3H-benzo[d][1,2,3] triazin-4-on /N,N-Diizopropiletilamin (DEPBT/DIEA) aktiviranih pojedinačnih kuplovanja.

Boc- HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-mbha

[0475] Približno, jedna trećina Boc zaštićene peptidne smole je preneta u manuelni reakcioni sud i tretirana sa 20% piperidin/dimetilformamid na sobnoj temperaturi 10 min. Smola je filtrirana, isprana sa dimetilformamidom (DMF) nekoliko puta i dodat je aktivirani rastvor Fmoc amidoPEG4 (prethodno rastvarajući 487.5mg 1.0mmol N-Fmoc Amido dPEG4 Acid (Peptides International, Louisville, KY) u 2.0ml 0.5M DEPBT/DMF i dodavanjem 0.175ml 1mmol diizopropiletilamina). Reakcija je mešana na sobnoj temepraturi približbno 1 čas.

[0476] Peptidna smola je filtrirana i isprana sa DMF, i ponovo tretirana sa 20% piperidin/DMF 10min. Smola je filtrirana, isprana sa DMF nekoliko puta, i dodat je aktivirani rastvor Fmoc Glu-OBzl (prethodno pripremljen rastvaranjem 470mg 1mmol Fmoc Glu-γ-OBzl (Aapptec, Louisville, KY) u 2.0ml 0.5M DEPBT/DMF i dodavanjem 0.175ml 1mmol DIEA). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 1 čas.

[0477] Peptidna smola je ponovo filtrirana, isprana sa DMF, i tretirana sa 20% piperidin/DMF na sobnoj temperaturi 10 min. Smola je filtrirana, isprana sa DMF nekoliko puta, i dodat je aktivirani rastvor palmitinske kiseline (prethodno pripremljen rastvaranjem 256mg 1mmol palmitinske kiseline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u 2.0 ml 0.5M DEPBT/DMF i dodavanjem 0.175ml DIEA. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 1 čas.

[0478] Konačno, peptidna smola je filtrirana, isprana sa DMF nakon čega je doat dihlorometan i tretirana sa 50%TFA/DCM da bi se uklonila N-terminalna Boc grupa. Nakon 1-2 min, smola je filtrirana, isprana sa DCM nekoliko puta a zatim sa rastvorom 5%DIEA/DCM. Peptidna smola osušena na vazduhu je preneta u HF reakcioni sud i HF isecanje je izvedeno korišćenjem 5ml tečnog fluorovodonika i 0.5ml p-krezol skevendžera. Nakon mešanja 1 čas u ledenom kupatilu, HF je uklonjen in vacuo i ostatak je suspendovan u etil etru. Smeša peptid/smola je filtrirana u levku od sinterovanog stakla, isprana sa etil etrom, i brzo osušena na vazduhu. Peptid je ekstrahovan u 10ml 50% vodenog rastvora sirćetne kiseline koji je analiziran sa HPLC (4.6x50mm Zorbax SB-C8, 1ml/min, 214nm, A=0.1%TFA, B=0.1%TFA/90%ACN, gradijent = 30%B do 90%B tokom 10min). Preostali sirovi ekstrakt je razblažen 3X sa vodom i napunjen je na 22.2X250mm Amberchrom XT20 kolonu za prečišćavanje korišćenjem vodenog TFA/ACN gradijent. Inicijalno prečišćeni pul je ponovo prečišćen preko iste kolone da bi se dobilo 19 mg proizvoda sa čistoćom od 90%+. Teoretska masa =5010.6 , ESI uočena masa bila je 5008.0.

[0479] Ista procedura je ponovljena korišćenjem različitih N-Fmoc Amido dPEG kiselina. U jednom slučaju, korišćena je N-Fmoc amido dPEG8 kiselina (Peptides International, Louisville, KY) a u drugom slučaju, korišćena je N-Fmoc Amido dPEG2 kiselina (Peptides International, Louisville, KY). Strukture acilovanih peptida su prikazane na Slikama 12A -12C.

Dimerizacija peptida – dimerizacija disulfida

[0480] Primer sinteze disulfidnog dimera je opisan u nastavku:

0.28gm (0.2mmol) mbha-smole (Midwest Biotech) je stavljeno u CSBio reakcioni sud i sledeća sekvenca je sastavljena na CSBio336 sintetizatoru korišćenjem Boc aminokiselina i DEPBT/DIEA aktiviranih pojedinačnih kuplovanja.

Boc- HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-amid

[0481] Boc zaštićena peptidna smola je preneta u manuelni reakcioni sud i tretirana sa 20% piperidin/DMF na sobnoj temperaturi 10 min. Smola je filtrirana, temeljno isprana sa DMF, zatim acilovana sa aktiviranim rastvorom Fmoc Cys(Trt) (prethodno pripremljen rastvaranjem 1.17gm 2mmol Fmoc Cys(Trt)-OH (Aapptec) u 4.0ml 0.5M DEPBT/DMF i dodavanjem 0.35ml 2mmol diizopropiletilamin). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 2 časa, zatim filtrirana isprana sa DMF i ista procedura je korišćena da se doda Fmoc Glu-OBzl nakon čega je sledila palmitinska kiselina.

[0482] Konačno, smola je filtrirana, isprana sa DMF, sa dihlorometanom, i tretirana sa 50% TFA/DCM 1-2 min. Nakon neutralizacije sa 5%DIEA/DCM, peptidna smola je preneta u HF reakcioni sud i HF isecanje je izvedeno korišćenjem 10 ml tečnog fluorovodonika i 1ml pkrezol skevendžera u vodenom kupatilu 1 čas. Nakon uparavanja HF, ostatak je suspendovan u etil etru i peptid i smola su filtrirani u levku od sinterovanog stakla. Nakon ispiranja sa etil etrom i brzog sušenja na vazduhu, peptid je ekstrahovan u 50% vodenom rastvoru sirćetne kiseline. Nakon analize sa HPLC (4.6x50mm Zorbax SB-C8, 1ml/min, 45°C, 214nm, A=0.1%TFA, B=0.1%TFA/90%ACN, 30% do 90%B tokom 10min), ekstrakt isecanja razblažen je 3-4 sa vodom i napunjen je na 21.2X250mm Amberchrom XT20 kolonu za prečišćavanje korišćenjem vodenog TFA/acetonitril gradijenta. Prečišćene frakcije 64-67 su kombinovane, zamrznute, i liofilizovane da bi se dobilo 58.7 mg materijala sa HPLC čistoćom od 90%+.

[0483] DLS-027-97A teoretska mol.tež.= 4866.48, ESI uočena masa = 4864.0

HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Cys(SH) yE-C16)G-amid

[0484] 18.6mg (3.8mmol) gornjeg peptida je rastvoreno u 2.0 ml 3M guanidin/0.05M tris (pH8.5) i dodato je 1ml dimetilsulfoksida. Reakcija je mešana na sobonj temepraturi i izložena vazduhu. Nakon 6 časova, analitička HPLC u poređenju sa početnim peptidom pokazala je prisustvo više hidrofobnog pika.

[0485] Reakciona smeša je razblažena sa 20 ml 0.1%TFA i napunjena na 10X250mm Amberchrom XT20 kolonu. Prečišćavanje je izvedeno korišćenjem 0.1%TFA/acetonitril gradijenta uz praćenje UV apsorbance na 220 nm. Frakcije 68-72 su kombinovane i liofilizovane da bi se dobilo 5.5 mg prečišćenog dimera.

[0486] HPLC čistoća bila je 90%+. Teoretska mol. tež. =9743.99, MALDI uočena masa= 9745.1. DLS-027-98B. Struktura rezultujućeg dimera je prikazana na Slici 9A.

Dimerizacija peptida – dimerizacija tioetra

[0487] Primer sinteze dimera tioetra je opisan u nastavku:

0.28gm (0.2mmol) mbha-smole (Midwest Biotech) postavljeno je u reakcioni sud i sledeća sekvenca je sastavljena na CSBio336 sintetizatoru korišćenjem DEPBT/DIEA aktiviranih pojedinačnih kuplovanja.

Boc- HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Fmoc)G-mbha

[0488] Jedna trećina Boc zaštićene peptidne smole je preneta u manuelni reakcioni sud i tretirana sa 20% piperidin/dimetilformamid na sobnoj temperaturi 10 min. Nakon ispiranja nekoliko puta sa DMF, dodat je aktivirani rastvor Boc Dap(Fmoc) (prethodno pripremljen rastvaranjem 426 mg 1 mmol Boc Dap(Fmoc)-OH (Chem-Impex) u 2.0ml 0.5M DEPBT/DMF i dodat je 0.175 ml 1 mmol DIEA). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 2 časa, filtrirana, isprana sa DMF i ponovo tretirana sa 20% piperidin/DMF kao prethodno. Nakon ispiranja sa DMF, smola je acilovana sa aktiviranim rastvorom bromosirćetne kiseline (prethodno pripremljene rastvaranjem 139mg 1mmol bromosirćetne kiseline (Aldrich) u 2.0ml 0.5M DEPBT/DMF i dodavanjem 0.175ml DIEA). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 1-2 časa, zatim filtrirana i smola je isprana sa DMF a zatim i DCM. Peptidna smola je tretirana sa 50%TFA/DCM na sobnoj temperaturi 2 min, zatim filtrirana, isprana sa DCM i neutralizovana sa 5% DIEA/DCM. Kompletna peptidna smola preneta je u HF reakcioni sud i HF isecanje je izvedeno korišćenjem 5ml tečnog fluorovodonika /0.5ml pkrezola. Nakon mešanja 1čas u ledenom kupatilu, HF je uparen i ostatak je suspendovan u etil etru. Smola/peptid smeša je filtrirana u levak od sinterovanog stakla i isprana sa etrom. Peptid je ekstrahovan u 50% vodenom rastvoru sirćetne kiseline i sirovi proizvod je analiziran sa HPLC: 4.6x50mm Zorbax SB-C8, 1ml/min, 45°C,214nm, A=0.1%TFA, B=0.1%TFA/90%ACN, gradijent= 30%B do 90%B tokom 10min. Isečeni ekstrakt je napunjen u 21.2X250mm Amberchrom XT20 kolonu i prečišćavanje je izvedeno korišćenjem vodenog TFA/acetonitril gradijenta uz praćenje UV apsorbance na 220 nm. Frakcije 48-53 su kombinovane zamrznute, i liofilizovane da bi se dobilo 18mg peptida SEQ ID NO: 89 sa K40(Dap-BrAcetil), čistoća =90%+. Teoretska mol. tež.= 4602.8, ESI uočena masa= 4616.0

HaibQGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPSK(Dap- BrAcetil)G-amid

[0489] 15 mg (3.2 mmol) gornjeg K40(Dap-BrAcetil) peptida i 15 mg peptida SEQ ID NO: 89 K40(CysyE-C16) rastvoreno je u 3.0 ml 7 M urea/0.05M tris (pH 8.6) i mešano je na sobnoj temperaturi uz praćenje HPLC napredovanja reakcije. Nakon 30 min, većina početnih materijala imala je smanjenu visinu pika dok je novi pik bila glavna komponenta. Reakciona smeša je razblažena sa 25ml 0.1%TFA i napunjena je na 10X250mm Amberchrom XT20 kolonu za prečišćavanje. Vodeni TFA/acetonitril gradijent je izveden uz praćenje UV apsorbance na 220nm. Frakcije 57-61 su kombinovane, zaleđene, i liofilizovane da bi se dobilo 7.1 mg tioetar dimera. HPLC čistoća= 90%+, Teoretska mol.tež.=9401.4, MALDI uočena masa= 9402.8. Struktura dimera je prikazana na Slici 9B.

PEGilacija peptida

[0490] Za PEGilaciju peptida, 40 kDa metoksi poli(etilen glikol) jodoacetamid (NOF) je reagovao sa molarnim ekvivalentom peptida u 7 M Urea, 50 mM Tris-HCl pufera korišćenjem minimalne količine rastvarača potrebnog da rastvori i peptid i PEG u bistar rastvor (generalno manje od 2 mL za reakciju korišćenjem 2-3 mg peptida). Snažno mešanje na sobnoj temperaturi započeto je u trajanju od 4-6 časova i reakcija je analizirana analitičkom RP-HPLC. PEGilovani proizvodi pojavili su se jasno različito od početnog materijala sa smanjenim retencionim vremenima. Prečišćavanje je izvedeno na Vydac C4koloni sa uslovima sličnim onima korišćenim za inicijalno prečišćavanje peptida. Eluiranje se vršilo oko odnosa pufera od 50:50. Frakcije čistog PEGilovanog peptida su nađene i liofilizovane. Prinosi su bili iznad 50%, uz variranje po reakciji.

Analiza korišćenjem masene spektrometrije

[0491] Maseni spektri su dobijeni korišćenjem Sciex API-III elektrosprej kvadrupol masenog spektrometra sa standardnim ESI jonskim izvorom. Koiršćeni uslovi jonizacije koji su korišćeni su kao što sledi: ESI u modu pozitivnog jona; voltaža jonskog spreja, 3.9 kV; potencijal otvora, 60 V. Nebulizatorski i gas za zavesu koji je korišćen bio je azot sa stopom protoka od .9 L/min. Maseni spektri su snimljeni sa 600-1800 Thompsons na 0.5 Th po koraku i 2 msec vremena zadržavanja. Uzorak (oko 1 mg/mL) je rastvoren u 50% vodenom acetonitrilu sa 1% sirćetnom kiselinom i introdukovan je sa spoljnom špric pumpom pri stopi od 5 µL/min.

[0492] Kada su peptidi analizirani u PBS rastvoru sa ESI MS, prvo su odsoljeni korišćenjem ZipTip ekstrakcije čvrste faze sas 0.6 µL C4smole, prema uputstvima obezbeđenim od strane proizvođača (Millipore Corporation, Billerica, MA, videti Millipore vebsajt na vebu na millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737).

Analiza tečnom hromatografijom visoke performanse (HPLC):

[0493] Preliminarne analize su izvedene sa ovim sirovim peptidima da bi se dobila aproksimacija njihovih relativnih stopa konverzije u natrijum fosfatnom puferu (PBS) (pH, 7.2) korišćenjem tečne hromatografije visoke performanse (HPLC) i MALDI analize. Uzorci sirovog peptida su rastvoreni u PBS puferu u koncentraciji od 1 mg/ml. 1 ml rezultujućeg rastvora je uskladišten u 1.5 ml HPLC vijalicu koja je zatim zapečaćena i inkubirana na 37 °C. Alikvoti od 100 ml izvučeni su u različitim vremenskim intervalima, ohlađeni do sobne temperature i analizirani sa HPLC.

[0494] HPLC analize su izvedene korišćenjem Beckman System Gold Chromatography sistema korišćenjem UV detektora na 214 nm. HPLC analize su izvedene na 150 mm x 4.6 mm C18Vydac koloni. Stopa protoka bila je 1 ml/min. Rastvarač A sadržao je 0.1% TFA u destilovanoj vodi, i rastvarač B je sadržao 0.1% TFA u 90% CH3CN. Linearni gradijent je upotrebljen (40% do 70%B u toku 15 minuta). Podaci su sakupljeni i analizirani korišćenjem Peak Simple Chromatography softvera.

[0495] Inicijalne stope hidrolize su korišćene da bi se izmerila konstanta stope disocijacije respektivnih prolekova. Koncentracije proleka i leka su procenjeni iz njihovih oblasti pika respektivno. Konstante stope disocijacije prvog reda određene su plotovanjem logaritma koncentracije proleka u različitim vremenskim intervalima. Nagib ove krive daje konstantu ’k’ stope. Polu-životi degradacije različtih prolekova su zatim izračunati korišćenjem formule t1/2 = .693/k.

PRIMER 2

[0496] Sledeće obezbeđuje primere postupaka sintetisanja peptidnih analoga predmetnih otkrića.

Sinteza peptidnih fragmenata glukagon materijala korišćenjem Fmoc strategije:

[0497] Svi peptidi su amidovani ukoliko nije naznačeno drugačije i sintetisani na Tentagel S RAM-Rink smoli, (90um; punjenje od 0.26 mmol/g). Fmoc zaštićene aminokiseline i smola je kupljena od Novabiochem. Čvrsta faza sinteze peptida je izvedena na CS Bio CS136XT Peptide Synthesizer.

Sinteza peptida (Fmoc strategija):

[0498] Sintetički peptidi konstruisani sekvencijalnom adicijom rastvora aminokiselina (0.33Mol/l u NMP koji sadrži 0.05Mol/l HOBt) u sudu za mešanje. Specifično, sineteza je izvedena korišćenjem COMU/DIPEA aktivacijom (4 ekv aminokiseline, 4 ekv COMU, 8 ekv DIPEA) sa pojedinačnim kuplovanjima. Na kraju koraka kuplovanja (standardno vreme 30 min na RT), peptidil-smola je tretirana sa Piperidin-rastvorom (40% u DMF, 1X10 min 2x 5min) da bi se uklonila N-terminalna Fmoc zaštitina grupa. Smola je ispirana uzastopno sa dimetilformamidom (DMF) i ovaj ciklus sinteze je ponavljan željeni broj koraka kuplovanja. N-cap-peptidi su generisani tretiranjem peptidil-smole sa viškom od 18 ekv sirćetnog anhidrida/DIPEA u DMF 30 min na RT.

Acilovani peptidi

[0499] Da bi se vezala acilaciona grupa (npr C16), Dde-Lys(Fmoc)-OH je introdukovan u peptidnu sekvencu na željenom položaju korišćenjem standardnih uslova kao što je prethodno opisano. Nakon kvantitativnog kuplovanja, Fmoc-grupa je uklonjena sa DBU/DMF (2% tretman 3 x 3min kontinuiranog protoka, uzastopno ispirana sa DMF, ova procedura je ponovljena 5 puta). Kuplovanje acilacione grupe je postignuto korišćenjem kuplujućih uslova kao što je prethodno opisano. Nakon kvantitativnog kuplovanja acilacione grupe N-terminalna Dde zaštitna grupa je uklonjena sa 20% hidrazin monohidrata (64%) u DMF 2% (5 x 3 min, kontinuirani protok, uzastopno ispirana sa DMF). Preostali koraci kuplovanja izvedeni su kao što je prethodno opisano.

Isecanje peptida i deprotekcija

[0500] Na kraju cele sinteze, peptidil-smola je isprana sa dihlorometanom (DCM), i peptid je isečen iz smole korišćenjem reagensa K (TFA/Tioanizol/voda/fenol/TIS - 82.5/5/5/5/2.5) 2 č na RT sa tipičnim prinosom od približno 250 mg (~50% prinosa) sirovog deprotektovanog -peptida.

[0501] Specifično, peptidil-smola (30-200 mg) je stavljena u fritovani kertridž zatim je dodat reagens K (~20 ml za 1.2 g smole) i smola je mešana na RT 2 č. Nakon što je tečnost otfiltrirana, smola je isprana sa 5 ml reagensa K i dva puta 3 ml DCM. Proizvod je istaložen sa hladnim etrom. Suspenzija je centrifugirana, tečnost je otfiltrirana, i sirovi peptid je ponovo rastvoren u vodi/ACN i zamrznut da bi se dobilo ca 250 mg (~50% prinos) sirovog peptida.

[0502] Analitička HPLC analiza sirovog peptida je izvedena pod sledećim uslovima:

HPLC kolona 4.6 X 150 mm Poroshell 120 SB-C18;

Eluent sistem: Pufer: A: 0.1% trifluorosirćetna kiselina (TFA)/10% akrilonitril/90% voda; Pufer B: 0.1% TFA/10% voda/90% CAN; Gradijent: 5-100% B tokom 30 minuta.

[0503] Sirovi peptidi su prečišćeni preko preparativne HPLC korišćenjem 16 X 150 mm Dr. Maisch Reprosil Gold 120 C18, 5 um, preparativne reverzno fazne kolone i eluirani korišćenjem istih mobilnih faza kao na analitičkom sistemu sa gradijentom od 5-100% B tokom 190 minuta i protokom od 1.80 ml/min. Nakon LC/MS analize dobijenih frakcija, čisti uzorci su kombinovani i osušeni zamrzavanjem da bi se dobio beli prašak.

PRIMER 3

[0504] Ovaj primer opisuje primer postupka testiranja biološke aktivnosti peptida prema predmetnim opisima, naznačeno time da postupak uključuje analizu cAMP sinteze.

[0505] Sposobnost glukagonskih analoga da indukuju cAMP merena je u testu zasnovanom na reporteru luciferaze svica. HEK293 ćelijama ko-transfektovanim sa receptorom (glukagon receptor, GLP-1 receptor ili GIP receptor) i genom luciferaze povezanom sa cAMP responsivnim elementom uskraćen je serum kultivisanjem 16 č u DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) sa dodatkom 0.25% Bovine Growth Serum (HyClone, Logan, UT) i zatim su inkubirane sa serijskim razblaženjima ili glukagona, GLP-1, GIP ili novih glukagonskih analoga 5 č na 37°C, 5% CO2u poli-D-lizin-obloženim "Biocoat" pločama sa 96 bunarčića (BD Biosciences, San Jose, CA). Na kraju inkubacije 100 mikrolitarta LucLite luminescentnog supstratnog reagensa (Perkin-Elmer, Wellesley, MA) dodato je svakom bunarčiću. Ploča je kratko šejkirana, inkubirana 10 min u mraku i oslobođena svetlost je merena na MicroBeta-1450 scincilacionom brojaču za tečnost (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Efikasne 50% koncentracije izračunate su korišćenjem Origin softvera (OriginLab, Northampton, MA.

PRIMER 4

[0506] Ovaj primer opisuje primer postupka analiziranja stabilnosti peptida predmetnih otkrića.

[0507] Svaki glukagonski analog je je razblažen u vodi ili PBS i inicijalna HPLC analiza je izvedena. Nakon podešavanja pH (4, 5, 6, 7), uzorci su inkubirani tokom specifikovanog vremenskog perioda na 37°C i ponovo su analizirani sa HPLC da bi se odredio integritet peptida. Koncentracija specifičnog peptida od interesa je određena i procenat preostalog intaktnog je izračunat u odnosu na inicijalnu analizu.

PRIMER 5

[0508] Ovaj primer opisuje primer postupka za analizu rastvorljivosti peptida.

[0509] Rastvor (1 mg/ml ili 3 mg/ml) glukagona (ili analoga) je pripremljen u 0.01N HCl.

100 ul stok rastvora je razblaženo do 1 ml sa 0.01N HCl i UV apsorbanca (276 nm) je određena. pH preostalog stok rastvora je podešena do pH7 korišćenjem 200-250 ul 0.1M Na2HPO4(pH 9.2). Dozvoljeno je da rastvor odstoji preko noći na 4°C zatim je centrifugiran.

100 ul supernatanta je zatim razblaženo do 1ml sa 0.01N HCl, i UV apsorbanca je određena (u duplikatu).

[0510] Inicijalno očitavanje apsorbance je kompenzovano u odnosu na povećanje zapremine i sledeće izračunavanje je izvedeno da bi se ustanovio procenat rastvorljivosti:

PRIMER 6

[0511] Ovaj primer opisuje primer postupka analize peptida za vezivanje za receptor.

[0512] Afinitet peptida za glukagon receptor je merena u analizi kompetitivnog vezivanja korišćenjem tehnologije analize scincilacione blizine. Serijska 3-struka razblaženja peptida napravljena u puferu za analizu scincilacione blizine (0.05 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.1% tež/zapr goveđi serum albumin) su pomešani u beloj/sa providnim dnom ploči sa 96 bunarčića (Corning Inc., Acton, MA) sa 0.05 nM (3-[<125>I]-jodotirozil) TyR10 glukagon (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 1-6 mikrograma po bunarčiću, fragmenti plazma membrane pripremljeni od ćelija koje prekomerno eksprimiraju humani glukagon receptor, i 1 mg/bunarčiću polietilenimin-tretirane aglutinin tip A klice pšenice kuglica za analizu scincilacione blizine (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Nakon 5 min šejkiranja na 800 rpm na rotirajućem šejkeru, ploča je inkubirana 12 č na sobnoj temperaturi i zatim je očitana na MicroBeta1450 scincilacionom brojaču za tečnost (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Nespecifično vezana (NSB) radioaktivnost je merena u bunarčićima sa 4 puta većom koncentracijom "hladnog" nativnog liganda od koncentracije u test uzorcima i ukupna vezna radioaktivnost je detektovana u bunarčićima bez kompetitora. Procenat specifičnog vezivanja je izračunat kao što sledi: % specifičnog vezivanja = ((vezano - NSB)/(ukupno vezano -NSB)) X 100. IC50vrednosti su određene korišćenjem Origin softvera (OriginLab, Northampton, MA).

PRIMER 7

[0513] Analozi peptida sa SEQ ID NO: 37 sintetisani su suštinski kao što je opisano u Primeru 1 ili Primeru 2 i testirani in vitro za agonističku aktivnost na svakom od GLP-1 receptora, glukagon receptora, i GIP receptora suštinski kao što je opisano u Primeru 3.

[0514] EC50na GLP-1 receptoru (GLP-1R), glukagon receptoru (GR), i GIP receptoru (GIPR) su date u Tabeli 1.

TABELA 1

PRIMER 8

[0515] In vivo efekti izabranih peptida iz Tabele 1 procenjeni su injektiranjem 10 nmol/kg peptida ili kontrole sa vehikulumom DIO miševima. Naime, peptid sa SEQ ID NO: 10, 12, 15, 16, 22, ili 37, ili kontrola sa vehikulumom primenjeni su na miševe 3 puta nedeljno (ponedeljkom, sredom i petkom) 2 nedelje. Miševima je davana dijabetogena ishrana i svaka grupa miševa je sadržala 8 životinja po grupi. Prosečna telesna težina bila je -50 g i miševi su bili ~ 6 meseci stari mužjaci.

[0516] Telesna težina i uzimanje hrane mereni su na dane kada je peptid ili kontrolni vehikulum primenjen na miševe. Telesni sastav je analiziran na Dane 0, 7, i 14. Nivoi glukoze u krvi pri gladovanju su mereni jednom nedeljno na dane 0, 7, i 14. Podaci iz ove studije su prikazani na Slikama 1-4.

[0517] Kao što je prikazano na Slici 1, svi peptidi su izazvali najmanje 10% smanjenje telesne težine nakon 7 dana. Ukupan unos hrane od strane miševa injektiranih sa jednim od peptida bio je između 50% i 60% ukupnog unosa hrane od strane miševa injektiranih sa kontrolnim vehikulumom (videti Sliku 2). Za svaku grupu miševa kojima je davan peptid, masa masti se smanjila, u poređenju sa miševima injektiranim sa kontrolnim vehikulumom (Slika 3). kao što je prikazano na Slici 4, miševi injektirani sa peptidom pokazali su smanjene nivoe glukoze u krvi, u poređenju sa miševima sa kontrolnim vehikulumom.

PRIMER 9

[0518] Analozi peptida sa SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 12 bili su sintetisani suštinski kao što je opisano u Primeru 1 ili Primeru 2. Analozi su testirani in vitro u odnosu na agonističku aktivnost na svakom od glukagon receptora, GLP-1 receptora, i GIP receptora, suštinski kao što je opisano u Primeru 3.

[0519] EC50na glukagon receptoru (GR), GLP-1 receptoru (GLP-1R), i GIP receptoru (GIPR) su obezbeđeni u Tabelama 2 i 3.

TABELA 2

TABELA 3

PRIMER 10

[0520] In vivo efekti izabranih peptida iz Tabela 1-3 su procenjeni primenom jedne potkožne injekcije kontrolnog vehikuluma, ili 10 nmol/kg peptida, ili 30 nmol/kg liraglutida u ~11-nedelja stare mužjake dijabetičkih db/db miševa. Miševima je dozvoljen ad libitum pristup hrani i vodi. Dva časa pre primene tretmana, miševi su podeljeni u grupe (n = 6/grupi) prema njihovim nivoima glukoze kada su siti (prosečno ~ 23 mM glukoza) i telesna težina (prosečno ~ 45 g).

[0521] Profili glukoze pri sitom stanju miševa mereni su 24 časa nakon tretmana sa vehikulumom ili peptidom ili liraglutidom. Kao što je prikazano na Slici 6, primena mnogih od peptida izazvalo je značajno smanjenje u nivoima glukoze u krvi, dok vehikulum i liraglutid nisu promenili nivoe glukoze u krvi. Peptidi sa SEQ ID NOs: 12, 17, 18, 23, 29, 142, i 143 izazvali su smanjenje koje je veće od 50% od osnovnih nivoa glukoze u sitom stanju.

[0522] Upotreba termina "a" i "an" i "the" i sličnih referenata u kontekstu opisivanja pronalaska (naročito u kontekstu sledećih patentnih zahteva) treba shvatiti da pokrivaju i jedninu i množinu, ukoliko nije drugačije naznačeno ovde ili jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Termini "sadrži," "ima," "uključuje," i "obuhvata" treba shvatiti kao otvorene termine ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0523] Namera je da navođenje opsega vrednosti ovde služi kao skraćeni postupak za pojedinačno pozivanje na svaku zasebnu vrednost koja potpada u taj opseg i svaku krajnju tačku, ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, i svaka zasebna vrednost i krajnja tačka je inkorporisana u specifikaciju kao da su ovde navedene pojedinačno.

[0524] Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti po bilo kom pogodnom redosledu ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili drugačije jasno kontradiktorno prema kontekstu. Namera je da upotreba bilo kog i svih primera, ili primera u jezičkom smislu (npr., "kao što je") koja je ovde obezbeđena, bolje rasvetli pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska ukoliko nije drugačije tražena zaštita. Nikakve jezičke oblike u specifikaciji ne treba smatrati kao da ukazuju na bilo koji elemenat za koji nije tražena zaštita koji je esencijalan za izvođenje pronalaska.

Claims

Patentni zahtevi 1. Peptid koji sadrži sekvencu od X1X2X3GTFTSDX10SKYLX15X16X17X18X19X20X21FVQWLX27X28X29X30PSSGX35PPPS (SEQ ID NO: 140), gde i) X1odgovara položaju 1 nativnog glukagona i X1je izabran iz grupe koja se sastoji od: Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Phe, Dezamino Tyr, D-His i D-Tyr; X2je Ala, Gly, Pro, sarkozin, Ser i Val, X3je Gln, aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture I, II, ili III, hidrofobna aminokiselina, kisela aminokiselina ili bazna aminokiselina, ili je aminokiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od: Glu, Ala, Leu, Ile, Nle, Val, NorVal, homoserina, Met, metionin sulfoksida, metionin sulfona, acetil-Orn, acetil-diaminobuterne kiseline i acetil-Lys; gde struktura I, II i III je:

Struktura III gde R1je C0-3alkil ili C0-3heteroalkil; R2je NHR4ili C1-3alkil; R3je C1-3alkil; R4je H ili C1-3alkil; X je NH, O, ili S; i Y je NHR4, SR3, ili OR3; X10je Tyr ili aminokiselina kovalentno vezana za C12do C18acil ili alkil grupu; X15je kisela aminokiselina, izborno, Glu ili Asp; X16je bilo koja aminokiselina, izborno, bilo koja aminokiselina osim Gly, Pro i Ser; npr., Glu, Ala, alfa, alfa disupstituisana aminokiselina (npr., AIB), His, Lys X17je Arg, His, Gln; X18je Arg ili Ala; X19je Ala ili alfa, alfa disupstituisana aminokiselina; X20je izabrana iz grupe koja se sastoji od: alfa, alfa disupstituisane aminokiseline (npr., AIB) ili Gln ili His, Lys, ili Ala; X21je kisela aminokiselina, izborno, Asp ili Glu; X27je Leu, Ala, Nle, ili Met; X28je Ala ili kisela aminokiselina (izborno, Asp ili Glu); X29je alifatična, npr., Ala ili Leu ili Gly ili AIB ili Val; X30je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala ili Gly X35je Ala ili bazna aminokiselina (izborno, Arg ili Lys); gde, kada je X28jednaka kiseloj aminokiselini, X35je bazna aminokiselina; gde, izborno, kada je X28jednako Asp, tada X29nije Gly gde, kada je X10jednako Tyr, peptid sadrži na položaju 40 aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil ili alkil grupu, i, gde, izborno, peptid sadrži Gly na položaju 41, gde je C-terminalna aminokiselina peptida amidovana; ili ii) X1odgovara položaju 1 nativnog glukagona i X1je izabran iz grupe koja se sastoji od: Acetil D-His, Acetil D-Tyr, Acetil D-Phe, Dezamino Tyr, D-His i D-Tyr; X2je Ala ili Gly, X3je Gln; X10je aminokiselina kovalentno vezana za C12-C18acil ili alkil grupu; X15je Asp; X16je Glu; X17je Arg, His, ili Gln; X18je Ala; X19je Ala; X20je Gln; X21je Asp; X27je Leu; X28je Glu; X29je Gly; X30je Gly X35je Ala; gde peptid ispoljava agonističku aktivnost na humanom GIP receptoru i humanom GLP-1 receptoru i/ili humanom receptoru za glukagon, izborno, gde analog glukagona ima manje od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.
2. Peptid prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži na položajima 1 i 2 par aminokiselina izabran iz grupe koja se sastoji od:

pored toga gde X10je aminokiselina kovalentno vezana za C12-C18acil ili alkil grupu, ili kada je X10jednako Tyr, peptid sadrži na položaju 40 aminokiselinu kovalentno vezanu za C12do C18acil ili alkil grupu, i peptid izborno sadrži Gly na položaju 41.
3. Peptid prema patentnom zahtevu 1(ii), gde i) aminokiselina na položaju 1 je izabrana od Acetil D-Tyr, Acetil D-His, DezaminoTyr, D-Tyr, D-His i Acetil D-Phe; ii) aminokiselina na položaju 2 je Ala ili Gly. iii) aminokiselina na položaju 10 je kovalentno vezana za C12-C18acil ili alkil grupu; iv) X20je Gln; v) X16i X28su oba Glu; vi) X18je Ala; vii) X27je Leu, X29je Gly, i peptid sadrži amidovani Gly na C-terminusu.
4. Peptid prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 11.
5. Peptid prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 12.
6. Peptid prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 13.
7. Peptid prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 15.
8. Peptid prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 16.
9. Peptid prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži sekvencu od SEQ ID NO: 22.
10. Analog peptida prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži a. sekvencu od SEQ ID NO: 11 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 11; b. sekvencu od SEQ ID NO: 12 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 12, c. sekvencu od SEQ ID NO: 13 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 13, d. sekvencu od SEQ ID NO: 15 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 15, e. sekvencu od SEQ ID NO: 16 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 16, ili f. sekvencu od SEQ ID NO: 22 sa do 3 aminokiselinske modifikacije u odnosu na SEQ ID NO: 22, gde peptid ispoljava agonističku aktivnost na humanom GIP receptoru i humanom GLP-1 receptoru i peptid ima manje od 100-puta selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.
11. Dimer ili multimer koji sadrži dva ili više peptida ili peptidna analoga prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
12. Konjugat koji sadrži peptid ili peptidni analog prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva i grupu konjugata.
13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid ili peptidni analog prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, dimer ili multimer prema patentnom zahtevu 11, konjugat prema patentnom zahtevu 12, ili njihovu kombinaciju i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.
14. Peptid ili peptidni analog ili peptidni analog prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, dimer ili multimer prema patentnom zahtevu 11, ili konjugat prema patentnom zahtevu 12 za upotrebu u smanjenju telesne težine ili indukciji gubitka telesne težine kod subjekta kod koga postoji potreba za tim, ili upotreba peptida ili peptidnog analoga prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, dimera ili multimera prema patentnom zahtevu 11, ili konjugata prema patentnom zahtevu 12 u pripremi leka za smanjenje telesne težine ili indukciju gubitka telesne težine.
15. Peptid ili peptidni analog prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, dimer ili multimer prema patentnom zahtevu 11, konjugat prema patentnom zahtevu 12 za upotrebu u lečenju dijabetesa.