RU2157239C2 - Способ модификации, способ обеспечения связывания белка с антителом, фармацевтические композиции, способ диагностики - Google Patents
Способ модификации, способ обеспечения связывания белка с антителом, фармацевтические композиции, способ диагностики Download PDFInfo
- Publication number
- RU2157239C2 RU2157239C2 RU94024566/14A RU94024566A RU2157239C2 RU 2157239 C2 RU2157239 C2 RU 2157239C2 RU 94024566/14 A RU94024566/14 A RU 94024566/14A RU 94024566 A RU94024566 A RU 94024566A RU 2157239 C2 RU2157239 C2 RU 2157239C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- lipidized
- antibodies
- lipoamine
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 117
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 title abstract description 4
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 claims abstract description 31
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 75
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 75
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 40
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 35
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 30
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- -1 1,4-disubstituted cyclohexyl Chemical group 0.000 claims description 19
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 18
- IJGPPNPGGXUNBK-UHFFFAOYSA-N 1-amino-20-(octadecylamino)icosan-2-one Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCNCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)CN IJGPPNPGGXUNBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 14
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 125000004448 alkyl carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000000732 arylene group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 abstract description 7
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 abstract description 7
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 103
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 92
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 31
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 19
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 12
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 12
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 12
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 11
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 11
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 10
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 8
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 7
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 101000926208 Homo sapiens Inactive glutathione hydrolase 2 Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000004858 capillary barrier Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 5
- GKBMIFPNPOSTHB-BJBKLNMKSA-N recombinant soluble cd4 Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GKBMIFPNPOSTHB-BJBKLNMKSA-N 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 101710107035 Gamma-glutamyltranspeptidase Proteins 0.000 description 4
- 101710173228 Glutathione hydrolase proenzyme Proteins 0.000 description 4
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 4
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 4
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 4
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 4
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 101100068347 Rattus norvegicus Ggt1 gene Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 3
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 3
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 3
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- HKUFIYBZNQSHQS-UHFFFAOYSA-N n-octadecyloctadecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCNCCCCCCCCCCCCCCCCCC HKUFIYBZNQSHQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLGYVWRJIZPQMM-HHHXNRCGSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-di(dodecanoyloxy)propyl] phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCC ZLGYVWRJIZPQMM-HHHXNRCGSA-N 0.000 description 2
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical compound CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N acetic anhydride Substances CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 125000005530 alkylenedioxy group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- IPVHCVDGLKVVMQ-UHFFFAOYSA-N benzyl n-[2-(2-hydroxy-5-nitrophenyl)-2-oxoethyl]carbamate Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1C(=O)CNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 IPVHCVDGLKVVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 125000002642 gamma-glutamyl group Chemical group 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000053563 human MYC Human genes 0.000 description 2
- 102000012194 human gamma-glutamyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRFABIOHRRJLCU-UHFFFAOYSA-N 1-amino-18-(hexadecylamino)octadecan-2-one Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCNCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)CN SRFABIOHRRJLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAGUSEHJTGJJRJ-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)-2-oxoethyl]pentanamide Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(C(=O)CNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC LAGUSEHJTGJJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ANBHJYHZZBJIKB-UHFFFAOYSA-N 20-amino-N-octadeca-2,4-dienoyl-19-oxoicosa-2,4-dienamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC=CC=CC(=O)NC(=O)C=CC=CCCCCCCCCCCCCCC(=O)CN ANBHJYHZZBJIKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102000004631 Calcineurin Human genes 0.000 description 1
- 108010042955 Calcineurin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102000018711 Facilitative Glucose Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027279 Facilitative Glucose Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150029965 HAT gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MNLRQHMNZILYPY-MDMHTWEWSA-N N-acetyl-alpha-D-muramic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]1NC(C)=O MNLRQHMNZILYPY-MDMHTWEWSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000009658 Peptidylprolyl Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010020062 Peptidylprolyl Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000157426 Pernis Species 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100027584 Protein c-Fos Human genes 0.000 description 1
- 102000012515 Protein kinase domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002122 Protein kinase domains Proteins 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 108010072960 Proto-Oncogene Proteins c-fyn Proteins 0.000 description 1
- 102000007131 Proto-Oncogene Proteins c-fyn Human genes 0.000 description 1
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 101150085390 RPM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004644 alkyl sulfinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- IYABWNGZIDDRAK-UHFFFAOYSA-N allene Chemical group C=C=C IYABWNGZIDDRAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- JCSJTDYCNQHPRJ-FDVJSPBESA-N beta-D-Xylp-(1->4)-beta-D-Xylp-(1->4)-D-Xylp Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)C(O)OC2)O)OC1 JCSJTDYCNQHPRJ-FDVJSPBESA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 125000004186 cyclopropylmethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C1([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000005265 dialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N dicarbon monoxide Chemical compound [C]=C=O VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008290 endocytic mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004954 endothelial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000006130 geranylgeranylation Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- SYECJBOWSGTPLU-UHFFFAOYSA-N hexane-1,1-diamine Chemical compound CCCCCC(N)N SYECJBOWSGTPLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 230000008606 intracellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N lipoamide Chemical group NC(=O)CCCCC1CCSS1 FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000024717 negative regulation of secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 125000000843 phenylene group Chemical group C1(=C(C=CC=C1)*)* 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000002534 radiation-sensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000006453 vascular barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа модификации белка, такого как антитело, способа обеспечения связывания белка с антителом, фармацевтических композиций модифицированных белков для лечения человека. Сущность изобретения включает связанный с липидом белок, в котором одна или более ацильных групп связаны с белком посредством боковой углеводной цепи и различными ковалентными связями. Липидизированные антитела могут применяться в лечебных и диагностических целях. Преимущество изобретения заключается в усилении проникновения модифицированных белков в клетки. 7 с. и 13 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.
Description
Изобретение обеспечивает способы нацеливания белка, такого как антитело, во внутриклеточные компартменты эукариотической клетки, способы усиления поглощения органами белков, фармацевтические композиции модифицированных белков для лечения человека и способы приготовления модифицированных белков. Модифицированные белки настоящего изобретения включают связанный с липидом белок, в котором одна или более ацильных групп связаны с белком посредством боковой углеводной цепи и различными ковалентными связями.
Предпосылки к созданию изобретения
Множество естественно встречающихся или модифицированных белков предлагается в качестве диагностических и/или терапевтических агентов для человека и домашних животных. Однако белки, в основном, очень плохо проходят через сосудистые эндотелиальные мембраны, если вообще проходят, и обычно не могут преодолеть клеточные мембраны, чтобы получить доступ к внутриклеточным компартментам. Так, например, можно получить антитела против очищенных внутриклеточных белков, таких как факторы транскрипции, внутриклеточные ферменты и структурные белки, но такие антитела, в основном, не способны проникать в интактную клетку и связываться с внутриклеточными антигенными мишенями, пока клеточная мембрана не повреждена.
Множество естественно встречающихся или модифицированных белков предлагается в качестве диагностических и/или терапевтических агентов для человека и домашних животных. Однако белки, в основном, очень плохо проходят через сосудистые эндотелиальные мембраны, если вообще проходят, и обычно не могут преодолеть клеточные мембраны, чтобы получить доступ к внутриклеточным компартментам. Так, например, можно получить антитела против очищенных внутриклеточных белков, таких как факторы транскрипции, внутриклеточные ферменты и структурные белки, но такие антитела, в основном, не способны проникать в интактную клетку и связываться с внутриклеточными антигенными мишенями, пока клеточная мембрана не повреждена.
Создание методики моноклональных антител в середине 1970-х годов провозгласило новую эру в медицине. В первое время исследователи и клиницисты имели доступ к практически неограниченным количествам стандартных антител, способных связываться с предопределенными антигенными сайтами и обладающих разнообразными иммунологическими эффекторными функциями. Эти белки, известные как "моноклональные антитела", казалось, подавали большие надежды, например, для удаления вредных клеток, микробных патогенов и вирусов in vivo. Способы, делающие возможным разработку специфичных моноклональных антител, обладающих специфичностью связывания, направленной против практически любого желательного антигенного эпитопа, включая антитела, которые расположены во внутриклеточных компартментах, обещали настоящий рог изобилия лекарственных "волшебных пуль".
К несчастью, разработка подходящих лекарственных продуктов, основанных на моноклональных антителах, а также поликлональных антисыворотках, серьезно затруднялась рядом недостатков, связанных с химическим строением натуральных антител. Первое, антитела, в основном, не способны эффективно проникать внутрь клеток, поскольку иммуноглобулины не способны преодолеть плазматическую мембрану клеток, и обычно только интернализируются, если это вообще происходит, как следствие неэффективных эндоцитотических механизмов. Второе, антитела, в основном, не пересекают сосудистые оболочки (например, субэндотелиальную базальную мембрану), что затрудняет эффективное включение антител в органы и интерстициальные пространства. Следовательно, можно было бы разработать лекарства для лечения многих серьезных заболеваний, если бы существовал эффективный способ доставки специфичных биологически активных молекул иммуноглобулинов через капиллярные барьеры и во внутриклеточные участки. Например, жизненный цикл ретровируса, такого как ВИЧ, включает внутриклеточную репликацию, при которой несколько закодированных вирусом полипептидов, имеющих важное значение для продукции контагиозных вирионов в инфицированной клетке, могли бы быть угнетены или блокированы, если бы специфичные моноклональные антитела против кодируемых вирусом белков могли легко проникать во внутриклеточные участки, где наблюдается репликация ретровируса.
Иммунолипосомы были разработаны как потенциальная нацеливающая система доставки различных молекул, содержащихся в липосоме, в клетку-мишень. Иммунолипосомы используют иммуноглобулины в качестве нацеливаемых агентов, причем ацилированный иммуноглобулин закреплен на липидном бислое липосомы, чтобы нацелить липосому на определенные клеточные типы, которые имеют внешние антигены, которые связываются ацилированным иммуноглобулином (иммуноглобулинами) иммунолипосом (Connor и Huang (1985) J. Cell Biol. 101: 582; Huang, L. (1985) Biochemistry 24:29; Babbitt и др., (1984) Biochemistry 23: 3920; Connor и др. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:1715; Huang и др. (1983) J. Biol. Chem. 258:14034; Shen и др. (1982) Biochim. Biophys. Acta 689:31; Huang и др. (1982) Biochim. Biophys. Acta 716:140; Huang и др. (1981). J.Immunol. Methods 46:141; и Huang и др. (1980) J. Biol. Chem. 255: 8015). Иммунолипосомы, в основном, содержат иммуноглобулины, которые присоединены к ацильным заместителям липосомного бислоя посредством поперечно-связывающего агента, такого как N-гидроксисукцимид, и которые, таким образом, закрепляются на липидном бислое липосомы. Следовательно, поперечно-связанный иммуноглобулин зафиксирован на липосоме и служит для нацеливания липосом на специфичные типы клеток, которые несут определенный заведомо внешний антиген, путем присоединения к внешнему клеточному антигену. В то время как такие способы могут служить для нацеливания липосом на определенные клеточные типы, иммунолипосомы обладают несколькими существенными недостатками, которые ограничивают их использование в качестве средств доставки лекарственных агентов, в частности для доставки белков внутрь клетки.
Были предприняты попытки модифицировать белки так, чтобы облегчить их транспорт через капиллярные барьеры и внутрь клеток (ЕР 0329185), однако до сих пор не сообщалось о создании всесторонне удовлетворительного способа. Сообщалось о химической модификации белков, таких как антитела, посредством неспецифической "катионизации", для облегчения трансваскулярной и внутриклеточной доставки белков (U.S.S.N. 07/693, 872). Однако существующие в настоящее время способы получения катионизированных иммуноглобулинов приводят к значительной утрате связывающего сродства (приблизительно 90%) катионизированного иммуноглобулина к его предопределенному эпитопу, по сравнению с некатионизированным иммуноглобулином. В общих чертах, катионизация включает присоединение диамина, такого как путресцин или гександиамин, посредством карбодиимидной связи к карбоксильным группам остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот в полипептидной цепи иммуноглобулина. Эти химические модификации первичных аминокислот, вероятно, нарушают вторичную и третичную структуру иммуноглобулина в степени, достаточной для потери связывающего сродства. Также настоящие способы производят некоторую степень катионизации остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, расположенных в различных доменах иммуноглобулиновой цепи, что приводит к значительной утрате связывающего сродства и/или специфичности.
Химическая модификация малых молекул также была предложена в качестве способа усиления транспорта малых биологически активных соединений. Felgner (W 091/17242) описывает формирование липидных комплексов, состоящих из липидных пузырьков и заключенных в них биологически активных веществ. Felgner и др. (W 091/16024) описывают катионные липидные соединения, которые, как утверждается, пригодны для усиления переноса малых биологически активных молекул в растениях и животных. Липосомы и поликатионные нуклеиновые кислоты были предложены в качестве способов доставки полинуклеотидов в клетки. Липосомы часто демонстрируют узкий спектр клеточной специфичности, и когда ДНК покрывает их снаружи, она зачастую чувствительна к действию клеточных нуклеаз. Новейшие поликатионные липосперминовые соединения подвергают воздействию широкий спектр клеток (Behr и др. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6982) и ДНК покрывают этими соединениями. В добавление, комбинация нейтрального и катионного липидов рассматривается как способ трансфекции животных клеток (Rose и др., (1991), Bio-Techniquer 10:520).
Другие подходы к усилению доставки лекарств, в частности, через гематоэнцефалический барьер, применяют фармакологически обоснованные процедуры, включающие перевод лекарств в инертное состояние или превращение гидрофильных лекарств в жирорастворимые. Большинство подходов по переводу в инертное состояние включают блокирование гидроксильных, карбоксильных и первичных аминогрупп лекарства, чтобы сделать его более жирорастворимым и, таким образом, облегчить его транспорт через гематоэнцефалический барьер. Pardridge и Schimmel, U. S. Patent 4902505 раскрывают химерные пептиды для усиления транспорта посредством рецептор-опосредованного трансцитоза.
Таким образом, в данной области существует потребность в методах облегчения транспорта специфичных белков, таких как антитела, через капиллярные барьеры и внутрь клетки и в фармацевтических композициях таких иммуноглобулинов для лечения заболеваний человека и животных, которые поддаются лечению внутриклеточными белками и прицельными агентами, такими как моноклональные антитела.
Краткое изложение изобретения
Существующий ранее способ увеличения транспорта антител внутрь клеток посредством соединения катионного заместителя с первичной полипептидной цепью иммуноглобулина относительно неспецифичным связующим реагентом производит пагубные изменения во вторичной, третичной и/или четвертичной структуре белка. Эти структурные изменения однозначно вызывают потери в связывающем сродстве катионизированных антител. Чтобы преодолеть это явление, настоящее изобретение создает способы, при которых липидные заместители связываются с белком, таким как иммуноглобулин, обычно ковалентной связью с углеводной боковой цепью белка, таким образом, что липидный заместитель не наносит существенного вреда биологической активности белка (например, связыванию с антигеном).
Существующий ранее способ увеличения транспорта антител внутрь клеток посредством соединения катионного заместителя с первичной полипептидной цепью иммуноглобулина относительно неспецифичным связующим реагентом производит пагубные изменения во вторичной, третичной и/или четвертичной структуре белка. Эти структурные изменения однозначно вызывают потери в связывающем сродстве катионизированных антител. Чтобы преодолеть это явление, настоящее изобретение создает способы, при которых липидные заместители связываются с белком, таким как иммуноглобулин, обычно ковалентной связью с углеводной боковой цепью белка, таким образом, что липидный заместитель не наносит существенного вреда биологической активности белка (например, связыванию с антигеном).
Настоящее изобретение обеспечивает способы приготовления липидизированных белков, в основном, посредством липидизирования углеводной части гликопротеина или гликопептида. В целом, способы настоящего изобретения используют для присоединения липида, такого как липоамин, к полипептиду, обычно ковалентной связью липида и углеводной части белка, причем углеводная часть в общем случае химически окислена и реагирует с липоамином, образуя липидизированный белок. Получающийся в результате липидизированный белок, в основном, обладает выгодными фармакокинетическими характеристиками, такими как возросшая способность преодолевать сосудистые барьеры и достигать паренхимных клеток различных органов и возросшая способность достигать внутриклеточных компартментов. В одном аспекте настоящего изобретения липидизирование белков, таких как антитела, направленные против факторов транскрипции (например, Fos, Jun, AP-1, OCT-1, NF-AT), облегчает внутриклеточную локализацию липидизированного белка (белков).
Изобретение также обеспечивает способы приготовления липидизированных антител, которые эффективно транспортируются через капиллярные барьеры и интернализируются в клетки млекопитающих in vivo. Способы настоящего изобретения относятся к способам для химического присоединения по крайней мере одного липидного заместителя (например, липоамина) к углеводной части иммуноглобулина с целью получения липидизированного через углеводную часть иммуноглобулина, при которых липидизированный иммуноглобулин способен к внутриклеточной локализации. В альтернативных вариантах осуществления изобретения, по крайней мере, один липидный заместитель (например, липоамин) ковалентно связан с неуглеводной частью белка или полипептида (например, путем образования амидной связи с остатком аспарагиновой или глутаминовой кислоты карбоксильного заместителя боковой цепи или тиоэфирной связи с остатком цистеина). Также можно присоединить жирную кислоту к остатку аргинина или лизина с помощью аминозаместителей боковой цепи.
Подобно этому липидные заместители могут быть ковалентно присоединены к пептидомиметическим соединениям. Пептидные аналоги широко применяют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарств, обладающих свойствами, аналогичными свойствам матричных пептидов. Эти виды непептидных соединений называют пептидомиметиками (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber и Freidinger (1985) TINS стр. 392; и Evans и др. (1987) J. Med. Chem. 30: 1229, включенные в настоящий документ в качестве ссылки) и обычно разрабатывают с помощью компьютерного молекулярного моделирования. Пептидомиметики, которые по структуре сходны с лекарственными пептидами, можно применять для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. В целом, пептидомиметики структурно сходны с типичными полипептидами (т.е. с полипептидами, обладающими биологической или фармакологической активностью), но имеют одну или более пептидных связей, факультативно замещенных связями, выбранными из следующей группы:
-CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(цис и транс),
-COCH2, -CH(OH)-CH2 и -CH2SO-, с помощью способов, известных в данной области, и кроме того описанных в следующих ссылках: Spatola, A.F. в "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptider, and Proteins", B. Weinstein, eds. , Marcel Dekker, New York, стр. 267 (1983); Spatola, A.F. Vega Data (March 1983), vol.1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (общий обзор); Morley, J.S., Trends Pharm. Sci (1980) стр. 463-468 (общий обзор); Hudson, D. и др., Int. J. Pept.Prot Res. (1979) 14:177 - 185 (-CH2NH-, CH2-CH2-); Spatola, A.F. и др., Life Sci. (1986) 38:1243 - 1249 (-CH2-S); Hann, M. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, цис и транс); Almquist, R,G и др., J. Med. Chem. (1980) 23:1392 - 1398 (-COCH2-); Iennings -Wtite, C. и др., Tetrahedron Lett. (1982) 23:2533 (-COCH2); Szelke, М. и др. , European Appln. ЕР 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)-CH2-); Holladay, M.W. и др., Tetrahedron Lett. (1983) 25: 4401 - 4404 (-C(ОН)CH2-); и Hruby, V.J., Life Sci. (1982) 31:189 - 199 (-CH2-S-); каждый из этих источников включен в настоящий документ в качестве ссылки. Особенно предпочтительной непептидной связью является - CH2NH-. Такие пептидомиметики могут иметь значительные преимущества перед полипептидами, включающими, например, более экономичное производство, большую химическую стабильность, усиленные фармакологические свойства (полупериод жизни, адсорбцию, мощность, эффективность и т. д. ), измененную специфичность (например, широкий спектр биологического действия), уменьшенная антигенность и другие. Липидизирование пептидомиметиков обычно включает ковалентное присоединение одной или более ацильных цепей непосредственно или через спейсер (например, амидогруппу), к неинтерферирующим позициям пептидомиметика, которые предсказаны количественными данными структуры-активности и/или молекулярным моделированием. Такие неинтерферирующие позиции, в целом, являются позициями, которые не образуют прямых контактов с макромолекулой (например, рецептором), с которой пептидомиметик связывается, производя таким образом терапевтический эффект. Липидизирование пептидомиметиков не должно существенно мешать желаемому биологическому или фармакологическому действию пептидомиметика.
-CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(цис и транс),
-COCH2, -CH(OH)-CH2 и -CH2SO-, с помощью способов, известных в данной области, и кроме того описанных в следующих ссылках: Spatola, A.F. в "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptider, and Proteins", B. Weinstein, eds. , Marcel Dekker, New York, стр. 267 (1983); Spatola, A.F. Vega Data (March 1983), vol.1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (общий обзор); Morley, J.S., Trends Pharm. Sci (1980) стр. 463-468 (общий обзор); Hudson, D. и др., Int. J. Pept.Prot Res. (1979) 14:177 - 185 (-CH2NH-, CH2-CH2-); Spatola, A.F. и др., Life Sci. (1986) 38:1243 - 1249 (-CH2-S); Hann, M. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, цис и транс); Almquist, R,G и др., J. Med. Chem. (1980) 23:1392 - 1398 (-COCH2-); Iennings -Wtite, C. и др., Tetrahedron Lett. (1982) 23:2533 (-COCH2); Szelke, М. и др. , European Appln. ЕР 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)-CH2-); Holladay, M.W. и др., Tetrahedron Lett. (1983) 25: 4401 - 4404 (-C(ОН)CH2-); и Hruby, V.J., Life Sci. (1982) 31:189 - 199 (-CH2-S-); каждый из этих источников включен в настоящий документ в качестве ссылки. Особенно предпочтительной непептидной связью является - CH2NH-. Такие пептидомиметики могут иметь значительные преимущества перед полипептидами, включающими, например, более экономичное производство, большую химическую стабильность, усиленные фармакологические свойства (полупериод жизни, адсорбцию, мощность, эффективность и т. д. ), измененную специфичность (например, широкий спектр биологического действия), уменьшенная антигенность и другие. Липидизирование пептидомиметиков обычно включает ковалентное присоединение одной или более ацильных цепей непосредственно или через спейсер (например, амидогруппу), к неинтерферирующим позициям пептидомиметика, которые предсказаны количественными данными структуры-активности и/или молекулярным моделированием. Такие неинтерферирующие позиции, в целом, являются позициями, которые не образуют прямых контактов с макромолекулой (например, рецептором), с которой пептидомиметик связывается, производя таким образом терапевтический эффект. Липидизирование пептидомиметиков не должно существенно мешать желаемому биологическому или фармакологическому действию пептидомиметика.
Настоящее изобретение относится также к лекарственным и диагностическим композициям липидизированных белков, которые могут преодолевать сосудистые мембраны и проникать во внутриклеточные компартменты, в частности, липидизированных антител, которые присоединяются к внутриклеточным иммунотерапевтическим мишеням, таким как кодируемые вирусным геном продукты, являющиеся главными компонентами жизненного цикла вируса (например, ВИЧ-1 Tat белок), к внутриклеточным антигенам, которые активны биологически (например, онкогенный белок, такой как c-fos, c-src, c-myc, c-lck (p 56), c-fyn (p 59) и c-abl), и/или к трансмембранным или внеклеточным антигенам (например, рецепторы гормонов полипептидной природы, такие как 1-2 рецептор; рецептор фактора роста, полученного из тромбоцитов; рецептор фактора роста эпидермиса; рецептор фактора роста нервной ткани, рецептор фактора роста или TNF рецептор).
Другие белки, на которые можно нацеливать липидизированные антитела, включают, но не исчерпываются следующим списком: с-rasp21, с-her-2 белок, с- raf, любые из разных G белков и/или белки, активирующие G белки (GАБ), факторы транскрипции, такие как NF-AT, кальцинейрин, цис-транс пролилизомеразы. Липидизированные антитела можно применять, чтобы поместить диагностический реагент, такой как рентгеноконтрастное вещество, компонент магнитного резонанса, дающий изображение, в специфический участок тела, такой как специфический орган, ткань, участок тела, тип клеток, неоплазма или другие анатомические структуры (например, патологическое поражение). Липидизированные антитела также можно применять, чтобы поместить связанные с ними лекарственные агенты, такие как химиотерапевтические препараты, радиосенсибилизирующие агенты, радионуклиды, антибиотики и другие агенты, в специфические участки тела. И наоборот, липидизированные антитела настоящего изобретения могут быть использованы в терапии для нейтрализации (т.е. для связывания и, таким образом, инактивации) внутриклеточного антигена-мишени, такого как ВИЧ-1 Tat белок, трансмембранный или связанный с мембраной антиген-мишень (например, γ-глутамилтранспептидаза, c-rasH p21, rasGAP), или внеклеточный антиген-мишень (например, отложения β-амилоидного белка в мозгу при болезни Альцгеймера). Липидизированные антитела могут пересекать гематоэнцефалический барьер и реагировать с внеклеточным антигеном-мишенью, который обычно недоступен для действия иммуноглобулинов, циркулирующих в крови или лимфатической системе. Липидизированные антитела также могут реагировать с внутриклеточной частью трансмембранных белков, такими как цитоплазматический конец гликопротеинов вирусной оболочки или домены протеинкиназы протоонкогенных белков (с-srс, c-abl), и, таким образом, ингибировать продукцию инфективного вируса в оболочке или активность киназы соответственно.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает структурные формулы, представляющие различные липоамины, которые можно использовать в настоящем изобретении. Правая колонка приводит примеры липоаминов с разветвленной цепью, левая колонка приводит примеры липоаминов с прямой цепью.
Фиг. 1 показывает структурные формулы, представляющие различные липоамины, которые можно использовать в настоящем изобретении. Правая колонка приводит примеры липоаминов с разветвленной цепью, левая колонка приводит примеры липоаминов с прямой цепью.
Фиг. 2 схематически представляет (1) гликозилированное антитело, включающее тетрамер иммуноглобулина (две легкие цепи, соединенные с двумя тяжелыми цепями) и (2) липидизированные через углевод иммуноглобулины настоящего изобретения. В качестве примера показаны липоамидные заместители с разветвленной цепью, присоединенные к частично окисленным углеводным боковым цепям тетрамера иммуноглобулина. Такие углеводные боковые цепи могут быть расположены в участках CH, VH, CZ и/или VZ.
Фиг. 3 показывает благоприятное воздействие липидизированного анти-Tat иммуноглобулина на выживание in vitro клеток, зараженных ВИЧ-1, по сравнению с отсутствием эффекта у нативного (т.е. нелипидизированного) анти-Tat иммуноглобулина. Фиг. 4 показывает, что липидизированные антитела анти-Tat значительно ингибировали активность хлорамфеникол- ацетилтрансферазы (приблизительно на 75%), в то время как нативные (нелипидизированные) анти-Tat антитела, липидизированные анти-гп 120 антитела или rs CD4 были значительно менее эффективными в ингибировании активности этого фермента в клетках HZCD4-ХАТ.
Подробное описание
Определения
Все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют общепринятый смысл, если не было дано иного определения, и будут легко поняты специалистами в данной области, для которых предназначено настоящее изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут применяться в практике или испытаниях настоящего изобретения, описываются предпочтительные материалы и методы. Ниже приводятся определения терминов настоящего изобретения.
Определения
Все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют общепринятый смысл, если не было дано иного определения, и будут легко поняты специалистами в данной области, для которых предназначено настоящее изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут применяться в практике или испытаниях настоящего изобретения, описываются предпочтительные материалы и методы. Ниже приводятся определения терминов настоящего изобретения.
В том виде, в котором они используются здесь, названия аминокислот и их аббревиатуры являются общепринятыми (Immunology-A Synthesis, 2-е издание, E. S. Golub и D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts (1991), включены в настоящий документ в качестве ссылки).
Термин "соответствует" означает, что полинуклеотидная последовательность является гомологичной (т. е. является идентичной, но не строго эволюционно родственной) всей или части полинуклеотидной последовательности, на которую ссылаются, или что полинуклеотидная последовательность является идентичной полипептидной последовательности, на которую ссылаются. В отличие от этого, термин "является комплементарной" означает, что комплементарная последовательность является гомологичной всей или части полинуклеотидной последовательности, на которую ссылаются. Для иллюстрации нуклеотидная последовательность "ТАТАЦ" соответствует последовательности "ТАТАЦ", на которую ссылаются, и является комплементарной последовательности "ГТАТА".
Термины "значительное сходство" или "значительная идентичность", как они применяются в настоящем документе, означают характеристику полипептидной последовательности или последовательности в нуклеиновой кислоте, при которой полипептидная последовательность имеет по крайней мере 59% идентичной последовательности с последовательностью, на которую ссылаются, а последовательность в нуклеиновой кислоте имеет по крайней мере 70% последовательности, идентичной той, на которую ссылаются. Процент идентичности вычисляется, исключая малые делеции или добавки, которые в сумме составляют менее 25% последовательности, на которую ссылаются. Последовательность, на которую ссылаются, может быть частью большей последовательности, такой как константная область домена константной области гена иммуноглобулина; однако последовательность, на которую ссылаются, по крайней мере на 18 нуклеотидов длиннее в случае полинуклеотидов, и по крайней мере на 6 аминокислотных остатков длиннее в случае полипептидов.
Термин "естественно встречающийся" применяется здесь к объекту, который может быть обнаружен в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории, является естественно встречающейся. Липопротеин (например, естественно встречающийся белок, содержащий изопрен или миристимовую кислоту), который может быть выделен из организма, встречающегося в природе, а не был изготовлен человеком, является естественно встречающимся липопротеином.
"Участки гликозилирования" относятся к аминокислотным остаткам, которые распознаются эукариотической клеткой в качестве участков присоединения остатков сахаров. Аминокислотами, к которым углевод, такой как олигосахарид, обычно присоединяется, являются остатки аспарагина (N-связь), серина (O-связь) и треонина (O-связь). Аминокислотная последовательность, которая обычно является сигналом специфического сайта присоединения, обозначается здесь как "последовательность участка гликозилирования". Последовательность участка гликозилирования для гликозилирования N-связью - Aсн-X-Cур или - Aсн-X-Tре, где X может быть любой из обычных аминокислот, кроме пролина. Предоминантная последовательность участка гликозилирования для гликозилирования O-связью - (тре или сер)-X-X-про, где X - любая из обычных аминокислот. Последовательность узнавания для гликозаминогликанов (специфического типа сульфатированного сахара) - -сер- гли-X-гли-, где Х является любой обычной аминокислотой. Термины "N-связь" и "О-связь" относятся к химическим группам, которые служат участками присоединения между молекулой сахара и аминокислотным остатком. N-связанные сахара присоединяются через аминогруппу; O-связанные сахара присоединяются через гидроксильную группу.
Однако не все последовательности участка гликозилирования белка обязательно гликозилированы; некоторые белки секретируются как в гликозилированной, так и в негликозилированной формах, в то время как другие полностью гликозилированы по одной последовательности участка гликозилирования, но имеют другую последовательность участка гликозилирования, которая не гликозилирована. Следовательно, не все последовательности участков гликозилирования, которые присутствуют в полипептиде, являются обязательно участками гликозилирования, к которым действительно присоединены остатки сахаров. Начальное N-гликозилирование во время биосинтеза включает "стержневой углевод" или "стержневой олигосахарид" (Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (ed.), W.H. Freeman and Company, New York, включенный здесь в качестве ссылки).
Применяемый здесь термин "гликозилирующая клетка" обозначает клетку, способную гликозилировать белки, в частности эукариотическую клетку, способную прибавлять N-связанный "стержневой олигосахарид", содержащий, по крайней мере, один остаток маннозы и/или способную прибавлять О-связанный сахар к, по крайней мере, одному участку гликозилирования, по крайней мере, одного полипептида, экспрессируемого названной клеткой, в частности, секретируемого белка. Так, гликозилирующая клетка обладает, по крайней мере, одной ферментативной активностью, которая катализирует присоединение остатка сахара к последовательности гликозилирующего участка белка или полипептида, и эта клетка действительно гликозилирует, по крайней мере один экспрессируемый полипептид. Для примера, но не ограничения, клетки млекопитающих являются типичными гликозилирующими клетками. Другие эукаристические клетки, такие как клетки насекомых или дрожжи, могут быть гликозилирующими клетками.
Применяемый здесь термин "антитело" относится к белку, состоящему из одного или более полипептидов, главным образом кодируемых генами надсемейства иммуноглобулинов (например, см. The Immunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams and A.N. Barclay, в Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F.W. Alt, и T. H. Rabbitts, eds. , (1989) Academic Press: San Diego, CA, стр. 361-387, которая включена здесь в качестве ссылки). Для примера, но не ограничения, антитело может включать часть или целую тяжелую цепь, часть или всю легкую цепь, или может включать только часть или целую тяжелую цепь. Ген узнавания иммуноглобулина включает каппа-, лямбда-, альфа-, гaммa(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), дельта-, эпсилон- и мю-гены константной области, а также бесчисленные гены вариабельных областей иммуноглобулина. "Легкие цепи" иммуноглобулинов (около 25 кДа или 214 аминокислот) кодируются вариабельным участком гена NH2-конца (около 110 аминокислот), а каппа- или лямбда константные области генов на COOH-конце. "Тяжелые цепи" иммуноглобулинов (около 50 кДа или 446 аминокислот) также кодируются вариабельной областью гена (около 116 аминокислот) и одной из ранее упомянутых констант областей гена, например гамма (кодирует около 330 аминокислот). Антитела включают, но не исчерпываются следующим перечнем: фрагменты иммуноглобулинов (например, Fab, F(ab)2, Fv), иммуноглобулины, состоящие из одной цепи, химерные иммуноглобулины, гуманизированные иммуноглобулины, приматизированные иммуноглобулины и различные комбинации легкая цепь-тяжелая цепь. Антитела могут вырабатываться в гликозилирующих клетках (например, в лимфоцитах человека, клетках гибридомы, дрожжевых клетках и т.д.), в негликозилирующих клетках (например, Е. coli) или синтезироваться химическими способами или производиться системами трансляции in vitro с использованием полинуклеотидной матрицы для прямой трансляции.
Применяемый здесь термин "липидизированное антитело" означает антитело, модифицированное таким образом, что получается липидное производное (например, ковалентное присоединение липоамина, такого как глицилдиоктадециламид, дилауроилфосфатидилэтаноламин или диоктадециламидоглицилспермидин) по одной или более углеводной доле, соединенной с иммуноглобулином в участке гликозилирования. В основном, липидный заместитель, такой как липоамин, ковалентно соединен через естественно встречающуюся углеводную часть в естественно встречающемся участке гликозилирования. Однако возможно получить иммуноглобулины с измененной последовательностью участка гликозилирования (в типичном случае, путем сайт-направленного мутагенеза полинуклеотидов, кодирующих цепи иммуноглобулина) и/или измененным характером гликозилирования (например, путем экспрессии кодирующих иммуноглобулин полинуклеотидов в гликозилирующих клетках, иных чем лимфоциты или в лимфоцитах других видов). Липидные заместители могут быть присоединены к одной или более естественно встречающейся или не естественно встречающейся углеводной части цепи иммуноглобулина. В случае, когда антитело производится путем прямого полипептидного синтеза или путем биосинтеза в негликозилирующих клетках (например, демонстрационной библиотеки фагов), в основном необходимо присоединение углеводного заместителя путем химической или энзимной модификации для последующего липидизирования (напротив, углевод можно липидизировать до присоединения к иммуноглобулину).
Применяемый здесь термин "липидизированный белок" относится к белку (включая мультимерные белки, гликопротеины и полипептиды различной длины), который был модифицирован путем присоединения липида (например, липоамина), в основном, через углеводную часть. Липидизированный белок приготовляется путем получения такого производного белка, в результате которого липидизированный белок отличается от естественно встречающихся связанных с липидами белков и липопротеинов. Для белков, обладающих биологической активностью (например, ферментов, рецепторов, факторов транскрипции), липидизирование не должно существенно уменьшать биологическую активность (например, по крайней мере 15% нативной биологической активности должны быть сохранены в липидизированном белке). Липидизированные пептидомиметики должны сохранять, по крайней мере, от 25 до 95% фармакологической активности соответствующего нелипидизированного пептидомиметика.
"Алкил" относится к полностью насыщенной алифатической группе, которая может быть прямой, разветвленной или циклической. Алкильные группы включают группы, примерами которых могут быть: метил, этил, циклопропил, циклопропилметил, sec-бутил, гептил и додецил. Все вышеперечисленные группы могут быть как незамещенными, так и замещенными неинтерферирующими заместителями, например галогеном; C1-C4 алкокси; C1-C4 ацилокси; формил; алкилендиокси; бензилокси; фенил или бензил, каждый из которых факультативно замещен от 1 до 3 заместителями, выбранными из галогена, C1-C4 алкокси или C1-C4 ацилокси. Термин "неинтерферирующий" характеризует заместители как не оказывающие вредного влияния на любые реакции, которые будут выполняться в соответствии с процедурой настоящего изобретения. Если в данной молекуле присутствует более одной алкильной группы, каждую из них можно независимо выбирать из группы "алкил", если не оговорено иное.
"Алкилен" относится к полностью насыщенному двухвалентному радикалу, содержащему только углерод и водород, и который может быть разветвленным или с прямой цепью. Этот термин в дальнейшем иллюстрируется такими примерами, как метилен, этилен, n-пропилен, t-бутилен, i-пентилен, n-гептилен и им подобными. Все перечисленные выше радикалы могут быть незамещенными или замещенными одним или более неинтерферирующими заместителями, например галогеном; C1-C4 алкокси; C1-C4 ацилокси; формил; алкилендиокси; бензилокси; фенил или бензил, каждый из которых факультативно замещен от 1 до 3 заместителями, выбранными из следующей группы: галоген, C1-C4 алкокси или C1-C4 ацилокси. Термин "неинтерферирующий" характеризует заместители, как не оказывающие неблагоприятного влияния на любые реакции, которые должны быть выполнены в соответствии с процедурой настоящего изобретения. Если в данной молекуле присутствует более одной алкиленовой группы, каждая из них может независимо избираться из группы "алкилены", если не оговорено иное.
"Арил", обозначаемый Ar, включает моноциклические или конденсированные карбоциклические ароматические группы из 6-20 атомов углерода. Арильные группы включают приведенные здесь в качестве примера фенил и нафтил. Эти группы могут быть замещены одним или более неинтерферирующими заместителями, например, выбранными из следующей группы: низший алкил, низший алкенил, низший алкинил, низший алкокси, низший алкилтио, низший алкилсульфинил, низший алкилсульфонил, диалкиламин, галоген, гидрокси, фенил, фенилокси, бензил, бензоил и нитро. Каждый заместитель может быть факультативно замещен добавочными неинтерферирующими заместителями.
"Амино" относится к группе -NH2.
"Алкилкарбонил" относится к группе -(CHR1)-CO-, в которой R1 является дополнительно обозначенной α-позицией. R1 может быть водородом, алкилом или аминогруппой. Предпочтительно R1 является аминогруппой.
Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
В соответствии с настоящим изобретением созданы новые способы для облегчения химически модифицированным белкам, таким как антитела, прохождения через капиллярные барьеры и внутрь клеток. В целом, способы включают ковалентное присоединение по крайней мере одного неинтерферирующего липидного заместителя (например, глицилдиоктадециламида, глицилдигептадециламида, глицилдигексадециламида, дилауроилфосфатидилэтаноламина и глицилдиоктадекадиеноиламида) к реактивному участку молекулы белка (например, к окисленной периодатом углеводной части). Различные неинтерферирующие липидные заместители могут быть присоединены к белкам для получения липидизированных белков, таких как липидизированные антитела настоящего изобретения. Для примера, но не для ограничения, можно привести примеры липидов, которые можно присоединять к белкам, представляющим интерес, для получения липидизированного белка: липоамины, липополиамины, жирные кислоты (например, стеариновая кислота, олеиновая кислота и другие). В общих чертах, липид должен быть присоединен ковалентной связью к углеводу, связанному с белком (например, к углеводной боковой цепи гликопротеина). Предпочтительно использовать естественно встречающиеся углеводные боковые цепи для присоединения липоамина, хотя могут быть созданы и новые участки гликозилирования в полипептиде посредством манипуляций генетического характера с кодирующим полинуклеотидом и экспрессии кодирующего полинуклеотида в гликозилирующей клетке для получения гликозилированного полипептида.
В соответствии с настоящим изобретением созданы новые способы для облегчения химически модифицированным белкам, таким как антитела, прохождения через капиллярные барьеры и внутрь клеток. В целом, способы включают ковалентное присоединение по крайней мере одного неинтерферирующего липидного заместителя (например, глицилдиоктадециламида, глицилдигептадециламида, глицилдигексадециламида, дилауроилфосфатидилэтаноламина и глицилдиоктадекадиеноиламида) к реактивному участку молекулы белка (например, к окисленной периодатом углеводной части). Различные неинтерферирующие липидные заместители могут быть присоединены к белкам для получения липидизированных белков, таких как липидизированные антитела настоящего изобретения. Для примера, но не для ограничения, можно привести примеры липидов, которые можно присоединять к белкам, представляющим интерес, для получения липидизированного белка: липоамины, липополиамины, жирные кислоты (например, стеариновая кислота, олеиновая кислота и другие). В общих чертах, липид должен быть присоединен ковалентной связью к углеводу, связанному с белком (например, к углеводной боковой цепи гликопротеина). Предпочтительно использовать естественно встречающиеся углеводные боковые цепи для присоединения липоамина, хотя могут быть созданы и новые участки гликозилирования в полипептиде посредством манипуляций генетического характера с кодирующим полинуклеотидом и экспрессии кодирующего полинуклеотида в гликозилирующей клетке для получения гликозилированного полипептида.
Гликозилированные белки можно липидизировать для усиления его транссосудистого транспорта, поглощения органом и внутриклеточного проникновения, включая проникновение внутрь ядра клетки. В целом, гликозилированный полипептид, такой как антитело, окисляют посредством химического окислителя (например, периодата) для получения дополнительных карбоксильных и/или альдегидных групп, и он реагирует с липоамином для формирования ковалентной (амидной или имидной, соответственно) связи липоамина и белка.
В типичном случае, окисление углеводной боковой цепи является частичным окислением, в результате которого образуется по крайней мере одна реактивная карбоксильная или альдегидная группа, хотя, в основном, методы химического окисления производят некоторое количество молекул, которые окислены частично, и некоторое количество молекул, которые не окислены или окислены полностью. Однако, чтобы быть липидизированным реакцией с липоамином, белку необходимо быть окисленным для получения по крайней мере одной дополнительной альдегидной группы, которая может прореагировать с липоамином, несмотря на то, что возможно получить липидизированные белки путем связи также с дополнительными карбоксильными группами. Дополнительная карбоксильная или альдегидная группа окисленного гликопротеина является карбоксильной или альдегидной группой с карбонильным углеродом, полученным от окисленного олигосахарида, и который ковалентно связан с белком, как непосредственно, так и через вставку (например, неокисленную часть N- или O-связанного углеводной боковой цепи). Предпочтительно, N-связанные или O- связанные углеводные цепи должны быть окислены неполностью, чтобы получить множество реактивных альдегидных и карбоксильных групп в каждой позиции гликозилирования для дальнейшей реакции с липоаминами. Чаще гликопротеины, имеющие один или более сложных N-связанных олигосахаридов, имеющие, например, разветвленный (манноза)3 (β-N-ацетилглюкозамино) стержень, частично окисляют ограниченной реакцией с подходящим оксидантом, в основном, периодатом. Связанные олигосахариды, содержащие N-ацетилглюкозамин (NAG), маннозу, галактозу, фукозу (6-дезоксигалактозу), N-ацетилнейраминовую кислоту (сиаловую кислоту), глюкозу, N-ацетилмурамовую кислоту, N-ацетилгалактозамин, ксилозу, или комбинации этих моносахаридов, могут быть окислены и реагируют с липоаминами для получения липидизированных белков, в частности липидизированных через углевод. Гликопротеины, содержащие олигосахариды из моносахаридных единиц, иных, чем перечисленные выше в качестве примеров, включая не встречающиеся в природе моносахариды, также могут быть окислены и ковалентно присоединены к липоамину для получения липидизированного белка.
Липоамины являются молекулами, имеющими, по крайней мере, одну ацильную группу и, по крайней мере, один свободный амин (т.е. первичный или вторичный амин). Предполагается, что в практике настоящего изобретения можно использовать также липоамины, которые имеют третичные амины, обладающие, по крайней мере, одним заместителем, который может быть заменен реакцией с окисленным углеводом. Примеры липоаминов, обладающих первичным амином, приведены на фиг. 1. Например, способ настоящего изобретения позволяет получать липидизированные белки посредством реакции гликопротеина с липоамином, обладающим прямой цепью, следующей формулы:
NH2-R-(CH2)n-CH3,
где R - двузамещенный алкил (алкилен), предпочтительно, метилен (-CH2-); 1,4-двузамещенный циклогексил; двузамещенный арил (арилен), предпочтительно 1,4-двузамещенный фенил (фенилен); амидогруппа формулы -(CHR1)-CO-NH-, где R1 является водородом или аминогруппой; алкилкарбонил, предпочтительно α-аминозамещенный алкилкарбонил; или фосфат диэфир, предпочтительно формулы -CH2-O-PO2-O-. n - целое число, обычно от 1 до 50, предпочтительно от 5 до 30, наиболее предпочтительно - от 0 до 25, чаще от 15 до 20. В целом, выбор осуществляется на усмотрение практика, которому необходимо руководствоваться следующим соображением: если молекула, которую необходимо липидизировать, велика (т. е. белок более 10 кДа), предпочтительно, чтобы было по меньшей мере 8-12 или более, для увеличения гидрофобности получающегося липидизированного белка; если молекула, которую необходимо липидизировать, мала (например, олигопептид), в типичном случае будет от 2 до 18, но может быть и больше, если желательна дополнительная гидрофобность липидизированной молекулы.
NH2-R-(CH2)n-CH3,
где R - двузамещенный алкил (алкилен), предпочтительно, метилен (-CH2-); 1,4-двузамещенный циклогексил; двузамещенный арил (арилен), предпочтительно 1,4-двузамещенный фенил (фенилен); амидогруппа формулы -(CHR1)-CO-NH-, где R1 является водородом или аминогруппой; алкилкарбонил, предпочтительно α-аминозамещенный алкилкарбонил; или фосфат диэфир, предпочтительно формулы -CH2-O-PO2-O-. n - целое число, обычно от 1 до 50, предпочтительно от 5 до 30, наиболее предпочтительно - от 0 до 25, чаще от 15 до 20. В целом, выбор осуществляется на усмотрение практика, которому необходимо руководствоваться следующим соображением: если молекула, которую необходимо липидизировать, велика (т. е. белок более 10 кДа), предпочтительно, чтобы было по меньшей мере 8-12 или более, для увеличения гидрофобности получающегося липидизированного белка; если молекула, которую необходимо липидизировать, мала (например, олигопептид), в типичном случае будет от 2 до 18, но может быть и больше, если желательна дополнительная гидрофобность липидизированной молекулы.
В практике настоящего изобретения можно применять также липоамины с разветвленной цепью, которые включают, например, липоамины следующей формулы:
где R' - трехзамещенный алкил, предпочтительно - CH2CH< или 1,2,4-трехзамещенный циклогексил; трехзамещенный арил, предпочтительно 1, 2, 4-трехзамещенный фенил; амидогруппа формулы -(CHR1)-CO- N<, где R1 является водородом или аминогруппой; иминогруппа формулы -CHR2-NH-CH<, где R2 является водородом или аминогруппой, или иминогруппа формулы -CH2-N<; или фосфат диэфир, предпочтительно формулы -CH2-CH2-O-PO2-O-CH2-CH(CO2-)2, m и n независимо избираются и являются целыми числами, обычно от 1 до 50, предпочтительно от 5 до 30, более предпочтительно от 10 до 25, чаще от 15 до 20. В общих чертах, выбирается на усмотрение практика, который руководствуется следующими соображениями: если молекула, которую необходимо липидизировать, велика (т.е. белок более 10 кДа), предпочтительно, чтобы и/или были по меньшей мере 8-12 и более, для увеличения гидрофобности получающегося липидизированного белка; если молекула, которую необходимо липидизировать, мала (например, олигопептид), обычно составляет от 2 до 18, но может быть и больше, если желательна добавочная гидрофобность липидизированной молекулы.
где R' - трехзамещенный алкил, предпочтительно - CH2CH< или 1,2,4-трехзамещенный циклогексил; трехзамещенный арил, предпочтительно 1, 2, 4-трехзамещенный фенил; амидогруппа формулы -(CHR1)-CO- N<, где R1 является водородом или аминогруппой; иминогруппа формулы -CHR2-NH-CH<, где R2 является водородом или аминогруппой, или иминогруппа формулы -CH2-N<; или фосфат диэфир, предпочтительно формулы -CH2-CH2-O-PO2-O-CH2-CH(CO2-)2, m и n независимо избираются и являются целыми числами, обычно от 1 до 50, предпочтительно от 5 до 30, более предпочтительно от 10 до 25, чаще от 15 до 20. В общих чертах, выбирается на усмотрение практика, который руководствуется следующими соображениями: если молекула, которую необходимо липидизировать, велика (т.е. белок более 10 кДа), предпочтительно, чтобы и/или были по меньшей мере 8-12 и более, для увеличения гидрофобности получающегося липидизированного белка; если молекула, которую необходимо липидизировать, мала (например, олигопептид), обычно составляет от 2 до 18, но может быть и больше, если желательна добавочная гидрофобность липидизированной молекулы.
По существу, любой гликопротеин можно липидизировать по способу настоящего изобретения посредством реакции между липоамином и окисленной углеводной боковой цепью. Фиг. 2 схематически изображает гликозилированное антитело и липидизированное через углерод антитело настоящего изобретения, соответственно. Негликозилированные белки можно конъюгировать с липидами посредством подходящего поперечно связывающего агента (например, посредством карбодиимидной связи).
В соответствии с настоящим изобретением, созданы новые липидизированные антитела, способные специфично связываться с предопределенными внутриклеточными эпитопами с сильным сродством. Эти антитела без труда проникают во внутриклеточный компартмент и обладают связующим сродством по крайней мере около 1 • 106 M-1 предпочтительно 1 • 107 M-1 до 1 • 108 M-1 более предпочтительно по меньшей мере 1 • 109 M-1 или более. В типичном случае липидизированные антитела имеют липидные заместитель, присоединенный к естественно встречающейся углеводной боковой цепи исходной цепи иммуноглобулина, что составляет антитело, специфично реагирующее с внутриклеточным, трансмембранным или внеклеточным эпитопом. Поскольку углеводы расположены в Fc части иммуноглобулинов, маловероятно, чтобы химическая модификация углеводных остатков путем липидизирования приводила к существенной утрате сродства антител к их антигенам (Rodwell и др., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 83:2632). Липидизированные антитела в целом сохраняют существенное сродство к своим антигенам, а их авидность можно без труда измерить с помощью известных анализов связывания антиген-антитело. Эти антитела можно достаточно экономично производить в больших количествах и использовать, например, для лечения различных заболеваний человека с помощью разнообразных методик.
Основную структурную единицу антитела составляет определенная форма иммуноглобулина. Эта форма - тетрамер и состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре различные участки легкой и тяжелой цепей совместно ответственны за связывание антигена, и константные области являются ответственными за эффекторные функции антител. Дополнительно к антителам, иммуноглобулины могут существовать во множестве разнообразных форм, например Fv, Fab и (Fab')2, а также в форме бифункциональных гибридных антител, слитых белков и в других формах (например, Lanzavecchia и др., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) и в виде одиночных цепей (например, Huston и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) и Bird и др., Science, 242, 423-426 (1988)). (Cм. Hood. и др., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2-е изд. (1984) и Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)).
Антитела могут вырабатываться в гликозилирующих клетках (например, лимфоцитах человека, клетках гибридомы, дрожжах и т.д.), в негликозилирующих клетках (например, Е. coli), или синтезироваться химическими способами или вырабатываться vi vitro трансляционными системами с применением полинуклеотидной матрицы для прямой трансляции. Одним из источников гибридомных клеточных линий и кодирующих иммуноглобулины полинуклеотидов является Американская коллекция тканевых культур (АТСС), Rockville, MD. Способы экспрессии ксеногенных белков в рекомбинантных хозяевах, химического синтеза полипептидов и трансляции in vitro хорошо известны специалистам в данной области и описаны далее в Maniatis и др. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2-е издание. Cold Spring Harbor, N.Y; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91: 501; Chaiker J. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser и др., (1989) Science 243:187; Merrifield, В. (1986) Science 232:342; Kent, S.B.H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:957; и Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки). Антитела, которые вырабатывают в негликозилирующих клетках, могут быть присоединены к липиду посредством бифункционального поперечносвязывающего агента или, предпочтительно, посттрансляционно гликозилированы в гликозилирующей системе, такой как очищенные микросомы поджелудочной железы собаки (Mueckler and Lodish (1986) Cell 44: 629 и Walter, P. (1983) Meth. Enzymol. 96: 84, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки). В другом варианте полинуклеотиды, кодирующие антитела, могут быть выделены путем скрининга из библиотек экспрессии прокариотических клеток, таких как библиотеки фрагментов антител и впоследствии экспрессироваться в гликозилирующих клетках для выработки гликозилированных антител. В соответствии с этими способами могут быть получены гликозилированные антитела, обладающие естественно встречающимся или неестественно встречающимся характером гликозилирования. Такие гликозилированные антитела можно липидизировать в соответствии со способами настоящего изобретения.
Показано, что гликозилирование иммуноглобулинов значительно воздействует на их эффекторные функции, структурную стабильность и скорость секреции из антител продуцирующих клеток (Leatherbarrow и др. , Md. Immunol. 22:507 (1985)). Углеводные группы, ответственные за эти свойства, в основном, присоединены к константным (C) областям антител. Например, требуется гликозилирование IgG по аспарагину 297 в домене CH2 для достижения полной мощности IgG в отношении активации классического комплемент-зависимого цитолиза (Taoо and Morrison, J. Immunol. 143:2595 (1989)). Гликозилирование lgM по аспарагину 402 в домене CH3 необходимо для получения должной упорядоченной структуры и цитолитической активности антитела (Muraoka and Shulman, J. Immunol. 142: 695 (1989)). Удаление участков гликозилирования по позициям 162 и 419 в доменах CH1 и CH3 IgA антитела приводит к внутриклеточной деградации и по крайней мере 90% подавления секреции (Taylor and Wall, Mol. Cell. Biol. 8: 4197 (1988)).
Также было рассмотрено гликозилирование иммуноглобулинов в вариабельной области (V). Sox and Hood. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.66: 975 (1970) сообщают, что около 20% антител человека гликозилированы по области. Предполагают, что гликозилирование по домену происходит вследствие случайной встречаемости сигнала N-связанного гликозилирования асн-Хаа-сер-тре в последовательности области и не играет существенной роли для функции иммуноглобулинов.
Таким образом, в основном, предпочтительно, чтобы липидизированию подвергались антитела с естественным характером гликозилирования. Если участки гликозилирования встроены в антитело, предпочтительно, чтобы новый участок гликозилирования был внедрен в константную область или в вариабельную область каркасного участка, которые с меньшей вероятностью оказывают неблагоприятное воздействие на антигенсвязывающую активность антитела. В целом, самым предпочтительным вариантом является встраивание новых участков гликозилирования в антитело в константной области.
В другом варианте полипептидные фрагменты, содержащие только часть первичной структуры антитела и углеводную боковую цепь, которую можно преобразовать с помощью липидного заместителя, могут быть получены, причем эти фрагменты будут обладать одной или более активностью иммуноглобулина (например, антиген-связывающей активностью). Эти полипептидные фрагменты можно произвести посредством протеолитического расщепления интактных антител способами, хорошо известными специалистам, или посредством сайт-направленного мутагенеза в желательных участках экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие иммуноглобулиновые белки, например, после CH1 для получения Fab фрагментов или после шарнирной области для получения (Fab')2 фрагментов. Антитела с одной цепью можно получить соединением VZ и VH ДНК линкером (см. Hustor и др., цит. Bird и др., цит.). Так же, поскольку, как и множество других генов, гены, связанные с кодированием иммуноглобулинов, содержат отдельные функциональные участки, каждый из которых обладает одной или более различающихся биологических активностей, гены могут быть слиты по функциональным участкам с другими генами, имеющими новые свойства. Полинуклеотидные последовательности для выработки иммуноглобулинов настоящего изобретения способны, в конечном счете, экспрессировать желаемые антитела и могут быть сформированы из множества различных полинуклеотидов (геномные, кДНК, РНК, синтетические олигонуклеотиды и т.д.) и компонентов (например, V, J, D и C участки), а также с применением множества различных методик. Соединение подходящих синтетических и геномных последовательностей в настоящее время является наиболее распространенным способом, однако могут применяться также последовательности кДНК (см. European Patent Publication 0239400 и L. Reichmann и др., Nature, 332,323-327 (1988)).
Иммуноглобулины и/или последовательности ДНК, кодирующие иммуноглобулиновые цепи, могут быть получены, например, посредством гибридомных клонов, которые можно получить с помощью методик, хорошо известных специалистам (Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511, включенные в настоящий документ в качестве ссылки), или могут быть получены из различных источников ("ATCC Catalog of Cell Lines and Hybridomas", ATCC, Rockville, MD, включенные в настоящий документ в качестве ссылки). Последовательности ДНК, кодирующие иммуноглобулиновые цепи, могут быть получены стандартными методиками клонирования, хорошо известными специалистам и описанными в различных публикациях, например Maniatis и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд. , (1989), Cold Spring Harbor, N.J. и Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc. , San Diego, CA, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки.
Как сказано выше, последовательности ДНК будут экспрессированы в хозяевах, в типичном случае, в гликозилирующих клетках, после того, как они будут присоединены к последовательности контроля экспрессии. Эти экспрессирующие векторы обычно реплицируются в организме-хозяине как в качестве эписом, так и в качестве целой части хромосомной ДНК хозяина. В общем случае, экспрессирующие векторы будут содержать маркеры селекции, например, устойчивость к тетрациклину или устойчивость к G418, чтобы сделать возможным обнаружение тех клеток, которые будут трансформированы желаемыми последовательностями ДНК (см., например, U.S. Patent 4,704,362).
E.coli является одним из прокариотических хозяев, подходящих, в частности, для клонирования последовательностей ДНК настоящего изобретения. Другие микроорганизмы-хозяева, подходящие для этих целей, включают бациллы, такие как Bacillus Subtilis, и другие Enterobacteriaceae, такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. В этих прокариотических хозяевах также можно создать экспрессирующие векторы, которые будут содержать последовательности контроля экспрессии, совместимые с клеткой-хозяином (например, репликатор). В добавление, там будет присутствовать и множество хорошо известных промоторов, таких как лактозная промоторная система, триптофановая промоторная система, β-галактозидазная промоторная система или промоторная система из фага лямбда. Промоторы будут контролировать экспрессию факультативно с помощью последовательности оператора и будут содержать последовательности участка связывания рибосомы и им подобные, для инициации и полного завершения транскрипции и трансляции. Белки, такие как антитела, которые экспрессируются негликозилирующими клетками, можно посттрансляционно гликозилировать в гликозилирующей системе (Mueckler and Lodish, цит.).
Другие микроорганизмы, такие как дрожжи, также можно использовать для экспрессии. Saccharomycer является предпочтительной гликозилирующей клеткой-хозяином при наличии подходящих векторов, имеющих последовательности контроля экспрессии, такие как промоторы, включающих 3-фосфоглицераткиназу или другие гликолитические ферменты, репликатор, терминальную последовательность и другие, если это желательно.
Помимо микроорганизмов, клетки культур тканей млекопитающих также можно использовать для экспрессии и выработки полипептидов настоящего изобретения (см. Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)).
Эукариотические клетки вообще являются более предпочтительными, поскольку создано множество подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные иммуноглобулины, и включают CHO клеточные линии, различные COS клеточные линии, клетки HeLa, предпочтительно, миелоидные клеточные линии и т. д. и транфсформированные B-клетки или гибридомы. Экспрессирующие векторы для этих клеток могут включать последовательности контроля экспрессии, такие как репликатор, промотор, усилитель (Gueen и др., Immunol. Rev., 89, 49-68 (1986)), и необходимые сайты процессинговой информации, такие как участки связывания рибосомы, участки сплайсинга PHK, сайты полиаденилирования и последовательности, терминирующие транскрипцию. Предпочтительными последовательностями контроля экспрессии являются промоторы, выделенные из генов иммуноглобулинов, SV40, аденовирусов, цитомегаловирусов, вируса бычьей папилломы и пр.
Векторы, содержащие сегменты ДНК, представляющие интерес (например, последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи, и последовательности контроля экспрессии), могут быть внедрены в клетку-хозяин с помощью хорошо известных специалистам методик, которые варьируют в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, для прокариотических клеток обычно используют трансфекцию посредством хлорида кальция, в то время как для других клеток-хозяев можно использовать обработку фосфатом кальция или электропорацию (см. Maniatis и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1982)).
Будучи экспрессированными, целые антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулинов настоящего изобретения, могут быть выделены в соответствии со стандартными процедурами, такими как преципитация сульфатом аммония, аффинные колонки, колоночная хроматография, электрофорез в геле и подобными (см. R.Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N. Y. (1982)). Предпочтительны существенно очищенные иммуноглобулины с гомогенностью по меньшей мере от 90 до 95%, для фармацевтических целей наиболее предпочтительна гомогенность 98-99% и более. Будучи очищены, частично или до полной гомогенности по желанию, полипептиды затем можно применять в терапевтических целях (включая экстракорпоральное применение) или для разработки и постановки аналитических процедур, иммунофлюоресцентного окрашивания и пр. (см. Immunological Methods, Vols. 1 и 11, Lefkovits and Pernis, eds. Academic Precc, New York, N.Y. (1979 и 1981).
В способах настоящего изобретения предпочтительно применяют интактные иммуноглобулины или их связывающие фрагменты. В типичном случае липидизированные антитела будут изотипами IgM или IgG человека, однако другие константные области млекопитающих могут применяться, если потребуется. Могут быть получены липидизированные антитела классов IgA, IgG, IgM, IgE и IgD. Предпочтительно, липидизированные антитела настоящего изобретения являются антителами человека, мыши, крупного рогатого скота, лошади, свиньи или приматов, наиболее предпочтительны антитела человека или мыши. Настоящее изобретение можно применять для получения липидизированных антител различных типов, включая, но не ограничиваясь следующим перечнем: химерные антитела, гуманизированные антитела, приматизированные антитела, Fv фрагменты, конъюгаты токсин-антитело, конъюгаты изотоп-антитело и конъюгаты томографический агент-антитело. Для томографии in vivo липидизированные антитела метят диагностической меткой, вводят пациенту и их локализацию определяют в различные периоды времени после введения. Различные способы мечения антител диагностическими препаратами (например, Tc99, другими радиолигандами, радиоконтрастными агентами, рентгенонепроницаемыми красителями) хорошо известны специалистам в данной области.
Белки и олигопептиды (т.е. полипептиды, включающие от 2 до 50 аминокислотных остатков, связанных посредством пептидной связи), иные нежели иммуноглобулины, можно липидизировать согласно способам настоящего изобретения. Естественно встречающиеся гликопротеины (например, γ-глутамилтранспептидаза, тромбомодулин, белки транспорта глюкозы) являются предпочтительными субстратами для липидизирования через углевод, хотя, по существу, любой полипептид можно липидизировать ковалентным присоединением через поперечно связывающий агент (например, N-гидроксисукцимид) к подходящей боковой аминокислотной цепи. В других вариантах осуществления изобретения, по крайней мере, один липидный заместитель (например, липоамин) ковалентно присоединен к неуглеводной части белка или полипептида (например, образованием амидной связи с остатком асп или глу карбоксильного заместителя боковой цепи или тиоэфирной связи с остатком цис). Также можно присоединить жирную кислоту к арг или лиз остаткам посредством аминных заместителей боковой цепи. Примерами негликозилированных белков, которые можно липидизировать для усиления трансваскулярного или внутриклеточного транспорта, являются, но не исчерпываются следующим перечнем: c-for, c-myc, c-src, NF-AT и HMG CoA редуктаза. Естественно встречающиеся липопротеины, такие как нативные белки, претерпевающие физиологическое фарнесилирование, геранилгеранилирование и пальмитилирование, являются натуральными продуктами и не называются в настоящем документе "липидизированными белками".
Липидизированные антитела и фармацевтические композиции на их основе являются, в частности, полезными для парентерального применения, т.е. подкожного, внутримышечного или внутривенного. Композиции для парентерального применения включают чаще всего раствор иммуноглобулина или коктейль из него, растворенный в приемлемом носителе, предпочтительно в водном. Можно использовать множество водных носителей, например воду, буферную воду, 0,4% раствор хлорида натрия, 0,3% глицин и пр. Эти растворы должны быть стерильными и свободными от твердых частиц. Эти композиции можно стерилизовать стандартными, хорошо известными способами стерилизации. Эти композиции могут содержать фармацевтически приемлемые добавочные вещества, если это требуется для приближения к физиологическим условиям, например подгонка pH и буферные агенты; агенты, снижающие токсичность и подобные, например ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия, альбумин человека и т.д. Концентрация антител в этих рецептурах может широко варьировать, т.е. от менее чем 0,5%, обычно по меньшей мере 1%, до 15-20% по весу и выбирается, основываясь на объеме жидкости, вязкости и т.д., в соответствии с конкретным избранным способом введения пациенту.
Так, типичная фармацевтическая композиция для инъекций содержит 1 мл стерильной воды с буфером и 1-10 мг липидизированного иммуноглобулина. Типичная композиция для внутривенных вливаний содержит 250 мл стерильного раствора Рингера и 150 мг антитела. Актуальные способы приготовления композиций для парентерального применения хорошо известны специалистам в данной области и описываются в подробностях, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15-е издание, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), включенном в настоящий документ в качестве ссылки.
Липидизированные белки и антитела настоящего изобретения можно замораживать или лиофилизировать для хранения и восстанавливать в подходящем носителе непосредственно перед употреблением. Эти методики проявили себя эффективными в отношении стандартных иммуноглобулинов, поэтому можно применять известные в данной области методики лиофильной сушки и последующего восстановления. Специалистам ясно, что лиофилизация и восстановление могут привести к различным степеням потери активности (например, что касается стандартных глобулинов, известно, что IgM теряют активность более, чем IgG) и что уровни использования надо корректировать с целью компенсировать потерю активности.
Композиции, содержащие настоящие липидизированные белки (например, антитела), или коктейль из них можно применять с профилактическими и/или терапевтическими целями. Для терапевтических целей композиции вводятся пациенту в количестве, достаточном для лечения или, по крайней мере, приостановки заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для выполнения этих задач, определяется здесь как "терапевтически эффективная доза". Количества, эффективные для этих целей, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента, но, в основном, варьируют в пределах от приблизительно 1 до приблизительно 200 мг антител на дозу, наиболее часто применяют дозы от 5 до 25 мг. Нужно иметь в виду, что материалы настоящего изобретения могут, в основном, применяться при серьезных болезненных состояниях, то есть в угрожающих жизни или потенциально угрожающих жизни ситуациях.
В профилактических целях композиции, содержащие настоящие иммуноглобулины или коктейль из них, вводятся пациенту, который не находится еще в болезненном состоянии, для усиления его сопротивляемости. Такое количество определяется здесь как "профилактически эффективная доза". Для этих целей, точные количества также зависят от состояния здоровья пациента и общего уровня иммунной защиты, но, в основном, варьируют от 0,1 до 25 мг на дозу.
Однократные или множественные введения пациенту настоящих композиций выполняются при уровнях доз и характере применения, определяемых лечащим врачом. В любом случае, фармацевтические рецептуры обеспечат количество липидизированных белков и/или антител(а), достаточное для эффективного лечения пациента.
Для диагностических целей липидизированные антитела могут быть как мечеными, так и немеченными. Немеченные антитела можно использовать в сочетании с другими мечеными антителами (вторичные антитела), которые вступают в реакцию с липидизированными антителами, например антитела, специфичные в отношении константных областей иммуноглобулинов человека. В другом варианте, липидизированные антитела можно метить непосредственно. Можно использовать целый ряд меток, таких как радионуклиды, ферменты, ферментные субстраты, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, лиганады (особенно, гаптены), радиоконтрастные агенты, хелаты металлов и т.д. Многочисленные виды топографических применений являются доступными и хорошо известны специалистам в данной области. Для примера, но не ограничения, антитела, которые связывают опухолевые антигены (например, антитела против карциноэмбриональных антигенов), могут быть липидизированы и соединены с радиоконтрастным агентом или материалов для ядерно-магнитно-резонансной томографии, введены пациенту и определены для установления мест локализации опухоли или метастатических поражений.
Липидизированные иммуноглобулины настоящего изобретения можно использовать для диагностики и лечения. Для иллюстрации, но не ограничения, назовем применение для лечения рака, аутоиммунных заболеваний или вирусных инфекций. Для лечения рака антитела будут специфично связываться с антигенами, которые экспрессируют определенные раковые клетки, такими как c-myc продукт гена и другие, хорошо известные специалистам. Предпочтительно, липидизированное антитело будет связываться с мутантным белком, таким как c-ras онкогенный продукт, имеющий патогенную (например, неопластическую) последовательность, такую как замена позиции 12, 13, 59 или 61 белка (например, замена серина на позиции 12 p21ras). Для лечения аутоиммунного заболевания антитела в типичном случае должны связываться с главным регуляторным белком, который первично экспрессируют активированные T-клетки, таким как NF-AT, и многими другими внутриклеточными белками, хорошо известными специалистам (например, см. Fundamental Immunology, 2-е изд., W.E. Paul. ed., Raven Press: New York, N.Y. включенный в настоящий документ в качестве ссылки). Для лечения вирусных заболеваний антитела в типичном случае должны связываться с белком, который экспрессируют клетки, зараженные определенным вирусом, таким как кодируемые вирусом полимеразы и ВИЧ-1 Tat, и многими другими вирусными белками, хорошо известными специалистам (см. , например, Virology, 2-е изд., B.N. Fields и др. , eds. , (1990), Raven Press: New York, N.Y. включенный в настоящий документ в качестве ссылки).
Также могут составляться наборы для использования конкретных липидизированных антител для защиты или определения клеточной активности или для определения присутствия внутриклеточного белка определенных клеток или для диагностики заболеваний. Так, можно создать определенную композицию настоящего изобретения, обычно в лиофилизированной форме в контейнере, как отдельно, так и в сочетании с добавочными антителами, специфичными в отношении желательного клеточного типа. Липидизированные антитела, которые могут быть конъюгированы с меткой или токсином, или неконъюгированы, включают в наборы вместе с буферами, такими как Трис, фосфатный буфер, карбонатный буфер и т. д. , стабилизаторами, биоцидными агентами, инертными белками, например сывороточным альбумином или ему подобными, и с инструкциями по применению набора. В основном, эти материалы присутствуют в количестве, менее чем 5% от веса активных антител, и, обычно, в количестве 0,001% от общего веса, снова на основе концентрации антител. Часто бывает желательным включение инертного наполнителя для разведения активных ингредиентов, в количестве приблизительно от 1 до 99% от веса всей композиции. Если применяются дополнительные антитела, способные связываться с липидизированными антителами, они должны находиться в отдельных сосудах. Эти вторые антитела могут быть конъюгированы с меткой и находиться в такой же рецептуре, как и описанные выше рецептуры для основных антител, а также и сами могут быть липидизированными.
Липидизированные антитела настоящего изобретения также подходят для применения в усовершенствованных диагностических методах и в методах очистки и выделения белков. Например, множество внутриклеточных белков являются нестабильными (например, обладают коротким полупериодом выделения или чувствительны к протеолизу) или склонными к агрегированию (например, β-амилоидный белок), что делает выделение и/или диагностическое определение затруднительными. Липидизированные антитела способны проникать внутрь клетки и связываться со специфичными внутриклеточными антигенами-мишенями; такое связывание антиген-антитело может стабилизировать антиген-мишень и блокировать ферменты, участвующие в расщеплении антигена-мишени (например, протеазы, убиквитин-связывающие ферменты, гликозидазы), облегчая определение и/или выделение антигена-мишени.
В одном варианте осуществления изобретения, липидизированное антитело, которое специфично связывается с внутриклеточным антигеном-мишенью, контактирует с живыми клетками, содержащими внутриклеточный антиген-мишень, при физиологических условиях (например, в условиях культуры клеток, в условиях организма), и инкубация происходит в течение периода времени, подходящего для связывания (например, от 10 минут до нескольких часов). Липидизированное антитело специфически связывается с антигеном-мишенью, образуя комплекс антиген-антитело, который менее подвержен деградации и/или агрегации, чем сам антиген-мишень. В типичном случае клетки затем фиксируют, делают проницаемыми, и определяют комплекс антиген-антитело, включающий мишень-антиген, связанный с липидизированным антителом, обычно с помощью дополнительного меченого антитела, которое специфически связывается с липидизированным антителом. Примерами предпочтительных меток, соединяемых с дополнительными антителами, являются: FITC, родамин, конъюгаты пероксидазы хрена обыкновенного, конъюгаты щелочной фосфатазы, конъюгаты β--галактозидазы, биотинил, радиоизотопы и подобные. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторичное антитело может быть липидизировано, а этапы фиксации и/или повышения проницаемости могут быть опущены и заменены тщательным отмыванием клеточного образца для удаления неспецифичного окрашивания. Также является возможным непосредственное применение липидизированного и помеченного первичного антитела без использования дополнительных, вторичных антител. Меченый белок А также может заменить вторичное антитело для определения первичного (липидизированного) антитела.
Липидизированные антитела также можно применять для внутриклеточной терапии, например для связывания предопределенного внутриклеточного антигена-мишени и модифицирования биохимических свойств антигена-мишени. Например, мультимерные белки, такие как гетеромультимерные белки (например, факторы транскрипции, G-белки) или гомодимерные белки (например, полимеризованный тубулин) могут обладать биохимической активностью (например, ГТФ-азной активностью) или иной активностью, требующей внутриклеточных взаимодействий, которые могут быть блокированы липидизированным антителом, которое специфично связывается с одной или более субъединицами и предотвращает функциональное взаимодействие субъединиц. Например, липидизированное антиFos антитело, которое связывается с частью Fos (например, с "застежкой-молнией" лейцина), которая требуется для связывания с Jun для образования транскрипционно активного фактора транскрипции AP-1 (Fos/Jun гетеродимер), может блокировать образование функциональной AP-1 и ингибировать AP-1-опосредованную генную транскрипцию. Также для примера липидизированные анти-ras антитело может связываться с эпитопом ras, что требуется для его функции сигнальной трансдукции (например, с участком связывания ГТФ/ГДФ, частью ras, которая связывает добавочный белок, такой как GAP или подобный ему), таким образом, модифицируя активность внутриклеточного ras в живых клетках.
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не для ограничения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ
Пример 1
Приготовление липидизированного бычьего IgG
Был получен глицилдиоктадециламид путем присоединения остатка глицина к диоктадециламину, согласно способу, описанному Behr и др., (1989) Proc. Natl, Acad. Sci. (U.S.A.) 86:6982, который включен в настоящий документ в качестве ссылки. 1 эквивалент бензилоксикарбонил-глицил-р-нитрофенола и 1,1 эквивалента триэтиламина в CH2-Cl2 реагировали в течение 5 часов, затем добавляли H2, 10% Pd/C в CH2 Cl2/этиловом спирте, и реакция продолжалась еще 1 час.
Пример 1
Приготовление липидизированного бычьего IgG
Был получен глицилдиоктадециламид путем присоединения остатка глицина к диоктадециламину, согласно способу, описанному Behr и др., (1989) Proc. Natl, Acad. Sci. (U.S.A.) 86:6982, который включен в настоящий документ в качестве ссылки. 1 эквивалент бензилоксикарбонил-глицил-р-нитрофенола и 1,1 эквивалента триэтиламина в CH2-Cl2 реагировали в течение 5 часов, затем добавляли H2, 10% Pd/C в CH2 Cl2/этиловом спирте, и реакция продолжалась еще 1 час.
Два мг бычьего IgG (Sigma) растворяли в 400 мкл 300 мМ NaHCO3 в 1,5 мл флаконе Эппендорфа. Пятьдесят мкл свежеприготовленного NaIO4 (42 мг/мл в воде) добавляли в флакон, заворачивали его в алюминиевую фольгу и осторожно оттрясывали 90 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь затем загружали в колонку PD-10 (Pharmacia), предварительно уравновешенную 10 мМ Na2CO3 (фракция 1) и из колонки вымывали 500 мкл фракции. Фракция 7 (между 3 мл и 3,5 мл) содержала приблизительно 1,6 мг бычьего IgG, что измерялось с помощью анализа Брэдфорда.
Раствор глицилдиоктадециламида в диметилсульфоксиде приготавливался следующим образом: 5 мг липида помещались в 1 мл диметилсульфоксида и перемешивался вихревым движением жидкости путем вращения флакона, интенсивно в течение нескольких минут. При этих условиях липид полностью не растворялся. Пятьдесят мкл этого раствора осторожно отбирали так, чтобы не попал нерастворенный липид, и прибавляли к 350 мкл фракции 7, полученной, как описано выше, в флакон Эппендорфа. Флакон заворачивали в алюминиевую фольгу и смесь осторожно встряхивали в течение 20 часов при комнатной температуре.
Сто мкл раствора NaBH4 (10 мг/мл в воде) прибавляли на следующем этапе. Спустя один час, 40 мкл раствора этаноламина (15 мкл в 1 мл Р2O) прибавляли к смеси. Спустя еще один час, реакционную смесь загружали в колонку PD-10, предварительно уравновешенную 100 мМ буфера HEPES, pH 8,5. Фракцию, содержащую липидизированный IgG (между 3 и 3,5 мл), собирали и хранили во льду.
Мечение 14C-уксусным ангидридом
Использовали 14C-уксусный ангидрид (500 мкCi, Amersham) в бензоле (10 • 106 имп. в мин/л). Две 5 мкл аликвоты добавляли к 500 мкл фракции, содержащей липидизированный IgG, с 10 мин интервалами во флакон Эппендорфа. Реакционную смесь оставляли во льду. 500 мкл раствора нативного IgG (800 мкг в 100 мМ HEPES, pH 8,6) обрабатывали подобным же образом.
Использовали 14C-уксусный ангидрид (500 мкCi, Amersham) в бензоле (10 • 106 имп. в мин/л). Две 5 мкл аликвоты добавляли к 500 мкл фракции, содержащей липидизированный IgG, с 10 мин интервалами во флакон Эппендорфа. Реакционную смесь оставляли во льду. 500 мкл раствора нативного IgG (800 мкг в 100 мМ HEPES, pH 8,6) обрабатывали подобным же образом.
Спустя 30 мин, флаконы подогревали до 20-25oC, 14C-меченые IgG отделяли от свободного 14C-эцетата на колонке PD-10, уравновешенной физиологическим раствором с фосфатным буфером. Инкорпорированная радиоактивность составляла приблизительно 10 • 106 имп./мин для 500 мкг.
Изучение органного поглощения
Мыши-самцы, швейцарские альбиносы, (20 г) использовались в настоящем исследовании. Внутривенно (через хвостовую вену) вводили 100 мкл 14C-меченых IgG в качестве контроля или 100 мкл 14C-меченых липидизированных IgG в физиологическом растворе с фосфатным буфером (приблизительно 400000 распадов/мин). Спустя 30 мин или 3 часа, мышей убивали, кровь собирали в пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК), мозг (исключая ствол и мозжечок), селезенку, одну почку и одну долю печени измельчали. Органы гомогенизировали в 1 мл 10 мМ ТРС буфера, pH 7,4 и 500 мкл аликвоты считали в сцинтилляционном счетчике Beckman. Концентрацию белка в этих гомогенатах определяли анализом Брэдфорда (кумасси синий). Кровь центрифугировали и считали 20 мкл фракции плазмы. Таблица 1 показывает поглощение 14C мозгом, печенью, селезенкой и почкой, выраженное частным от деления радиоактивности 1 мкг белка органа на радиоактивность 1 мкл плазмы (данные выражены в мкл/мкг белка).
Мыши-самцы, швейцарские альбиносы, (20 г) использовались в настоящем исследовании. Внутривенно (через хвостовую вену) вводили 100 мкл 14C-меченых IgG в качестве контроля или 100 мкл 14C-меченых липидизированных IgG в физиологическом растворе с фосфатным буфером (приблизительно 400000 распадов/мин). Спустя 30 мин или 3 часа, мышей убивали, кровь собирали в пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК), мозг (исключая ствол и мозжечок), селезенку, одну почку и одну долю печени измельчали. Органы гомогенизировали в 1 мл 10 мМ ТРС буфера, pH 7,4 и 500 мкл аликвоты считали в сцинтилляционном счетчике Beckman. Концентрацию белка в этих гомогенатах определяли анализом Брэдфорда (кумасси синий). Кровь центрифугировали и считали 20 мкл фракции плазмы. Таблица 1 показывает поглощение 14C мозгом, печенью, селезенкой и почкой, выраженное частным от деления радиоактивности 1 мкг белка органа на радиоактивность 1 мкл плазмы (данные выражены в мкл/мкг белка).
Контрольные группы состояли из 4 и 6 мышей на 30 мин и 3 часа соответственно. Группы мышей, получавших липидизированные IgG, везде составляли 6 особей. Данные являются средним ± средняя квадратичная погрешность среднего.
Пример 2
Ингибирование цитотоксичности ВИЧ-1 липидизированным анти-Tat антителами
Моноклональное антитело, которое специфично связывается с Tat белком ВИЧ-1, липидизировали согласно методике, описанной в примере 1, supra, включая окисление периодатом углеводной части антитела, в последующем ковалентным присоединением глицилдиоктадециламида для получения липидизированного антитела (через углеводную часть); антитела вымывались из конечной колонки PD-10 физиологическим раствором с фосфатным буфером.
Ингибирование цитотоксичности ВИЧ-1 липидизированным анти-Tat антителами
Моноклональное антитело, которое специфично связывается с Tat белком ВИЧ-1, липидизировали согласно методике, описанной в примере 1, supra, включая окисление периодатом углеводной части антитела, в последующем ковалентным присоединением глицилдиоктадециламида для получения липидизированного антитела (через углеводную часть); антитела вымывались из конечной колонки PD-10 физиологическим раствором с фосфатным буфером.
Sup T1 клетки содержали в 24-луночных планшетах (100000 клеток на мл, в 2 мл модифицированной RPM1 среде 1640). Клетки культивировали: (1) без дополнительной обработки (два контроля), (2) в присутствии нативных анти-Tat антител (15 мкг/мл) или (3) в присутствии липидизированных анти-Tat антител (11,7 мкг/мл), в течение первых пяти дней эксперимента. В конце первого дня в одну лунку контрольных клеток добавили ВИЧ-1 IIIВ и в лунки с культурами, содержащими клетки, обработанные нативным анти-Tat антителом и липидизированным анти-Tat антителом. Жизнеспособные клетки считали ежедневно. Необработанные ВИЧ-инфицированные клетки росли до плотности приблизительно 500000 клеток на мл, и их число начало уменьшаться, спустя приблизительно восемь дней, вследствие цитотоксического эффекта вируса.
Неинфицированные клетки росли до плотности приблизительно 1000000 клеток на мл. Воздействие на инфицированные клетки нативными анти-Tat антителами не защитило клетки от цитотоксического эффекта вируса. Напротив, липидизированные анти-Tat антитела обеспечили почти полную защиту клеток от цитопатического эффекта вируса. Эта защита длилась, по крайней мере, почти 5 дней после того, как воздействие антителами прекратили. Результаты представлены на фиг. 3.
В другом эксперименте клетки содержали, как описано выше в предыдущем примере, без какого-либо воздействия и без заражения, зараженными ВИЧ-1 и без лечения, с воздействием нативными анти-Tat антителами (1 мкг/мл) и зараженными, или с воздействием липидизированными анти-Tat антителами (1 мкг/мл) и зараженными. В последних трех вариантах вирус добавляли в конце первого дня культивирования. В последних двух вариантах нативные или липидизированные антитела присутствовали с первого до седьмого дня.
Данные, представленные в таблице 2, показывают, что в то время, как нативные анти-Tat антитела оказывали незначительное воздействие, если оказывали его вообще, на количество жизнеспособных клеток и активность обратной транскриптазы, липидизированные антитела создавали значительную защиту клеток в культуре от цитопатического эффекта вируса и значительное снижение активности обратной транскриптазы. Последний факт наводит на мысль о том, что липидизированные антитела угнетали внутриклеточную репликацию ВИЧ-1.
ВИЧ-1-инфицированные SupT1 клетки ежедневно обрабатывали анти-Tat антителами в нативной и липидизированной формах или rsCD4 (все белки использовали при концентрации 1 мкг/мл), начиная с первого дня перед добавлением ВИЧ-1 содержащих надосадочных жидкостей, до истечения 10 дней после инфекции. Количество клеток и активность обратной транскриптазы (ОТ) в культуральной среде определяли каждый день, начиная со второго дня после заражения. Вплоть до десятого дня, нативные анти-Tat антитела не оказывали существенного влияния как на количество клеток, так и на активность ОТ, в то время как липидизированные анти-Tat антитела повышали выживаемость клеток по сравнению с необработанными этими антителами, зараженными клетками приблизительно на 70%, и понижали активность ОТ примерно на такую же величину. Культивирование продолжали еще три дня без дальнейшего добавления антител. Эффект липидизированных анти-Tat антител продолжался эти три дня, что указывает на аккумуляцию липидизированных антител в клетках, в количествах, достаточных для обеспечения поддержания защитного эффекта против вирусной инфекции/репликации. Величины воздействий липидизированных анти-Tat антител на выживаемость клеток и активность ОТ были весьма сходны с теми, которые наблюдаются с теми же дозами rsCD4. Повышение концентрации липидизированных антител до 10 мкг/мл не вызывало дальнейшего снижения активности ОТ.
Пример 3
Способность липидизированных анти-Tat антител ингибировать транскрипционную активность Tat на ВИЧ-1 LTR-последовательности
Клеточная линия HeLa была подвергнута устойчивой трансфекции полинуклеотидом, экспрессирующим CD4, мембранный рецептор, опосредующий ВИЧ-1 инфекцию, и также содержащим ВИЧ-1 длинный концевой повтор (LTR-последовательность) и побуждающим транскрипцию связанного с ней гена (хлорамфеникол ацетилтрансфераза, ХАТ). Эти клетки (HLCD4-ХАТ) чувствительны к ВИЧ-1 инфекции, которая производит функциональный Tat белок; связывание вновь синтезированным Tat ВИЧ-1 LTR-последовательности приводит к транскрипции связанного ХАТ гена. Таким образом, величина экспрессии ХАТ приблизительно пропорциональна тяжести ВИЧ-1 инфекции и активности Tat белка в клетках.
Способность липидизированных анти-Tat антител ингибировать транскрипционную активность Tat на ВИЧ-1 LTR-последовательности
Клеточная линия HeLa была подвергнута устойчивой трансфекции полинуклеотидом, экспрессирующим CD4, мембранный рецептор, опосредующий ВИЧ-1 инфекцию, и также содержащим ВИЧ-1 длинный концевой повтор (LTR-последовательность) и побуждающим транскрипцию связанного с ней гена (хлорамфеникол ацетилтрансфераза, ХАТ). Эти клетки (HLCD4-ХАТ) чувствительны к ВИЧ-1 инфекции, которая производит функциональный Tat белок; связывание вновь синтезированным Tat ВИЧ-1 LTR-последовательности приводит к транскрипции связанного ХАТ гена. Таким образом, величина экспрессии ХАТ приблизительно пропорциональна тяжести ВИЧ-1 инфекции и активности Tat белка в клетках.
Культуру клеток HeLa (3 • 105 клеток/мл в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла) подвергали воздействию одинаковых концентраций (1 или 10 мкг/мл) различных антител (в нативной или липидизированной форме) или рекомбинатного растворимого CD4 (rsCD4) в течение одного часа и продолжительно отмывали перед добавлением ВИЧ-содержащих культуральных надосадочных жидкостей (100 мкл). Спустя 24 часа, клетки собирали и экспрессию ХАТ измеряли по способу Ho и др. (1984). Каждый эксперимент выполняли в четырех повторностях и в течение четырех различных периодов времени. Фиг. 4 показывает, что липидизированные анти-Tat антитела значительно ингибировали активность ХАТ (приблизительно на 75%), в то время, как нативные (нелипидизированные) анти-Tat антитела, липидизированные анти-gp120 антитела или rsCD4 были значительно менее эффективными в угнетении активности ХАТ. Эти данные показывают, что липидизированные анти-Tat антитела были способны специфично связываться с их внутриклеточной мишенью, Tat, и ингибировать активности мишени, как активатора транскрипции LTR- последовательности.
Более того, данные, демонстрирующие пассаж липидизированных анти-Tat антител внутрь клеток HeLa, показывают, что механизм транспорта, вероятно, не требует образования эндосом, поскольку сообщалось о том, что клетки HeLa не обладают или обладают малой фагоцитирующей способностью.
Пример 4
Приготовление липидизированных иммуноглобулинов, реагирующих с внутриклеточным белком
Глицилдиоктадециламид получали присоединением остатка глицина к диоктадециламину, согласно способу, описанному Behr и др. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. ) 86:6982, включенный в настоящий документ в качестве ссылки. 1 эквивалент бензилоксикарбонил-глицил-p-нитрофенола и 1,1 эквивалента триэтиламина в CH2Cl2 реагировали в течение 5 часов, затем к ним добавляли H2, 10% Pd/C в CH2Cl2/этаноле, и реакция продолжалась еще 1 час.
Приготовление липидизированных иммуноглобулинов, реагирующих с внутриклеточным белком
Глицилдиоктадециламид получали присоединением остатка глицина к диоктадециламину, согласно способу, описанному Behr и др. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. ) 86:6982, включенный в настоящий документ в качестве ссылки. 1 эквивалент бензилоксикарбонил-глицил-p-нитрофенола и 1,1 эквивалента триэтиламина в CH2Cl2 реагировали в течение 5 часов, затем к ним добавляли H2, 10% Pd/C в CH2Cl2/этаноле, и реакция продолжалась еще 1 час.
Ig против c-myc человека
Гликозилированные иммуноглобулины мыши, которые специфично связывают белок с-mус человека, приготавливали путем раздельного культивирования гибридомных клеточных линий MУC CT9-B7.3 (ATCC CRL1725), MУC CT 14-G4.3 (ATCC CRL 1727) и MУC 1-9E10.2 (ATCC CRL 1729) в среде RPM1 1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки в специфических условиях (Evan и др. (1985) Mol. Cell. Biol 5: 3610, включенный в настоящий документ в качестве ссылки); секретируемые моноклональные антитела собирали и очищали стандартными способами, хорошо известными в данной области.
Гликозилированные иммуноглобулины мыши, которые специфично связывают белок с-mус человека, приготавливали путем раздельного культивирования гибридомных клеточных линий MУC CT9-B7.3 (ATCC CRL1725), MУC CT 14-G4.3 (ATCC CRL 1727) и MУC 1-9E10.2 (ATCC CRL 1729) в среде RPM1 1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки в специфических условиях (Evan и др. (1985) Mol. Cell. Biol 5: 3610, включенный в настоящий документ в качестве ссылки); секретируемые моноклональные антитела собирали и очищали стандартными способами, хорошо известными в данной области.
Около 2 мг каждого очищенного моноклонального антитела растворяли в 400 мкл 300 мМ NaHCO3 в 1,5 мл флаконах Эппендорфа. Добавляли по 50 мкл свежеприготовленного раствора NaIO4 (42 мг/мл в воде), флаконы заворачивали в алюминиевую фольгу и осторожно трясли в течение 90 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь затем загружали в колонку PD-10 (Pharmacia), предварительно уравновешенную 10 мМ Na2CO3 (фракция 1), и из колонки элюировали 500 мкл фракции. Собирали фракции, содержащие по крайней мере приблизительно 500 мкг IgG, что измерялось посредством белкового анализа Брэдфорда.
Приготавливали раствор глицилдиоктадециламида в диметилсульфоксиде (5 мг липида в 1 мл ДМСО, интенсивно перемешивали воронкообразным движением жидкости при вращении флакона в течение нескольких минут). При этих условиях липид полностью не растворился. Пятьдесят мкл этого раствора осторожно отбирали и добавляли к 350 мкл очищенных фракций IgG, полученных, как описано выше, во флаконах Эппендорфа. Флаконы заворачивали в алюминиевую фольгу и смесь осторожно встряхивали в течение 20 часов при комнатной температуре.
Сто мкл раствора NaBH4 (10 мг/мл в воде) добавляли к реакционной смеси. Спустя один час, добавляли 40 мкл раствора этаноламина (15 мкл в 1 мл воды). Спустя еще один час, реакционную смесь загружали в колонку PD-10, предварительно уравновешенную физиологическим раствором с фосфатным буфером. Фракцию, содержащую липидизированный мышиный IgG против myc человека, собирали и хранили во льду.
Ig против HMG CoA редуктазы
Гликозилированные иммуноглобулины мыши, которые специфично связываются с внутриклеточным ферментом HMG CoA редуктазой, приготавливали путем раздельного культивирования гибридомной клеточной линии A9 (ATCC CRL 1811) в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с 4,5 г/л глюкозы, 5% лошадиной сыворотки и 2,5% фетальной бычьей сыворотки, как описано (Goldstein и др. , (1983) J. BioL Chem. 258:8450, включенный в настоящий документ в качестве ссылки), и секретируемые моноклональные антитела собирали и очищали стандартными способами, хорошо известными в данной области.
Гликозилированные иммуноглобулины мыши, которые специфично связываются с внутриклеточным ферментом HMG CoA редуктазой, приготавливали путем раздельного культивирования гибридомной клеточной линии A9 (ATCC CRL 1811) в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с 4,5 г/л глюкозы, 5% лошадиной сыворотки и 2,5% фетальной бычьей сыворотки, как описано (Goldstein и др. , (1983) J. BioL Chem. 258:8450, включенный в настоящий документ в качестве ссылки), и секретируемые моноклональные антитела собирали и очищали стандартными способами, хорошо известными в данной области.
Около 2 мг каждого очищенного моноклонального антитела растворяли в 400 мкл 300 мМ NaHCO3 в 1,5 мл флаконе Эппендорфа. Пятьдесят мкл свежеприготовленного раствора NaIO4 (42 мг/мл в воде) прибавляли к раствору, флакон заворачивали в алюминиевую фольгу и осторожно трясли 90 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь затем загружали в колонку PD-10 (Pharmacia), предварительно уравновешенную 10 мМ Nа2CO3 (фракция 1), и из нее элюировали 500 мкл фракции. Собирали фракции, содержащие по меньшей мере приблизительно 500 мкг IgG, измеренного посредством анализа Брэдфорда.
Приготавливали раствор глицилдиоктадециламида в ДМСО (5 мг липида в 1 мл ДМСО, интенсивно перемешивали несколько минут вращением флакона). При этих условиях липид полностью не растворялся. Осторожно отбирали 50 мкл этого раствора и прибавляли к 350 мкл фракций IgG, полученных, как описано выше, во флакон Эппендорфа. Флакон заворачивали в алюминиевую фольгу, и смесь осторожно трясли при комнатной температуре в течение 20 часов.
Затем прибавляли сто мкл раствора NaBH4 (10 мг/мл в воде). Спустя час прибавляли 40 мкл раствора этаноламина (15 мкл в 1 мл воды). Спустя еще один час, реакционную смесь загружали в колонку PD-10, предварительно уравновешенную физиологическим раствором с фосфатным буфером. Фракцию, содержащую липидизированный IgG против HMG CoA редуктазы (между 3 и 3,5 мл), собирали и хранили во льду.
Пример 5
Приготовление липидизированных иммуноглобулинов, реагирующих с трансмембранным белком
Глицилдиоктадециламид получали посредством присоединения остатка глицина к диоктадециламину, согласно методике, описанной Behr и др. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:6982, включенный в настоящий документ в качестве ссылки. Один эквивалент бензилоксикарбонил-глицил-з-нитрофенола и 1,1 эквивалента CH2Cl2 реагировали в течение 5 часов, затем прибавляли Н2, 10% Pd/C в CH2Cl2/этаноле, и реакция продолжалась еще один час.
Приготовление липидизированных иммуноглобулинов, реагирующих с трансмембранным белком
Глицилдиоктадециламид получали посредством присоединения остатка глицина к диоктадециламину, согласно методике, описанной Behr и др. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:6982, включенный в настоящий документ в качестве ссылки. Один эквивалент бензилоксикарбонил-глицил-з-нитрофенола и 1,1 эквивалента CH2Cl2 реагировали в течение 5 часов, затем прибавляли Н2, 10% Pd/C в CH2Cl2/этаноле, и реакция продолжалась еще один час.
Анти-Ras иммуноглобулин
Гликозилированные мышиные иммуноглобулины, которые специфично связываются с ras онкогенным белком, приготавливали путем раздельного культивирования гибридомной клеточной линии 142-24E5 (ATCC HB 8679; U.S. Pats. 5015571 и 5030565, включенные в настоящий документ в качестве ссылки) в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с 4,5 г/л глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, неосновными аминокислотами, 1 х ВМЕ витаминами, 0,1 мМ гипоксантина, 0,032 мМ тимидина, 0,05 мг/мл гентамицина и 10% фетальной бычьей сыворотки; и гибридомной клеточной линии MX (ATCC HB 9158) в Iscove's модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с 1% L- глутамина и HT и 10% фетальной бычьей сыворотки при специальных условиях (U. S. Patent 4820631, включенный в настоящий документ в качестве ссылки); моноклональные антитела, секретируемые гибридомными клетками, собирали и очищали с помощью стандартных методик, хорошо известных в данной области.
Гликозилированные мышиные иммуноглобулины, которые специфично связываются с ras онкогенным белком, приготавливали путем раздельного культивирования гибридомной клеточной линии 142-24E5 (ATCC HB 8679; U.S. Pats. 5015571 и 5030565, включенные в настоящий документ в качестве ссылки) в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с 4,5 г/л глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, неосновными аминокислотами, 1 х ВМЕ витаминами, 0,1 мМ гипоксантина, 0,032 мМ тимидина, 0,05 мг/мл гентамицина и 10% фетальной бычьей сыворотки; и гибридомной клеточной линии MX (ATCC HB 9158) в Iscove's модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с 1% L- глутамина и HT и 10% фетальной бычьей сыворотки при специальных условиях (U. S. Patent 4820631, включенный в настоящий документ в качестве ссылки); моноклональные антитела, секретируемые гибридомными клетками, собирали и очищали с помощью стандартных методик, хорошо известных в данной области.
Около 2 мг каждого очищенного моноклонального антитела растворяли в 400 мкл 300 мМ NaHCO3 в 1,5 мл флаконе Эппендорфа. Добавляли пятьдесят мкл свежеприготовленного раствора NaIO4 (42 мг/мл в воде), флакон заворачивали в алюминиевую фольгу и осторожно трясли 90 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь затем загружали в колонку PD-10 (Pharmacia), предварительно уравновешенную 10 мМ Na2CO3 (фракция 1), и собирали фракции по 500 мкл. Фракцию или фракции, содержащие по меньшей мере приблизительно 500 мкл IgG, измеренные с помощью анализа Брэдфорда, собирали из колонки.
Приготавливали раствор глицилдиоктадециламида в ДМСО (5 мг липида в 1 мл ДМСО, интенсивно перемешивали путем вращения флакона в течение нескольких минут). При этих условиях липид растворялся неполностью. Осторожно отбирали 50 мкл этого раствора и прибавляли к 350 мкл очищенных фракций IgG, полученных, как описано выше, во флакон Эппендорфа. Флакон заворачивали в алюминиевую фольгу и смесь осторожно трясли 20 часов при комнатной температуре.
Затем прибавляли 100 мкл раствора NaBH4 (10 мг/мл в воде). Спустя час, прибавляли 40 мкл раствора этаноламина (15 мл в 1 мл в воде). Спустя еще один час, реакционную смесь загружали в колонку PD-10, предварительно уравновешенную физиологическим раствором с фосфатным буфером. Фракцию, содержащую липидизированный мышиный IgG-анти-ras, собирали и хранили во льду.
Гибридомные клеточные линии, о которых упоминалось в приведенных выше примерах, можно получить в Американской Коллекции Тканевых культур, Rockville, MD (ATCC Cell Lines and Hybridomas (1992), 7-е издание, включенное в настоящий документ в качестве ссылки).
Пример 6
Липидизирование трансмембранного фермента
Фермент гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТ: EC-2.3, 2.2) является широко распространенным ферментом, который катализирует расщепление глутатиона и других γ-глутамил соединений посредством гидролиза γ-глутамил части или его переносом на подходящий акцептор. ГГТ является гетеродимерным гликопротеином, который синтезируется в виде белка-предшественника, который в свою очередь гликозилируется и распадается на две субъединицы зрелого фермента. ГГТ прикреплена к клеточной мембране посредством N-терминальной части тяжелой цепи. Активный участок фермента находится на внеклеточной части молекулы, которая обильно гликозилирована.
Липидизирование трансмембранного фермента
Фермент гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТ: EC-2.3, 2.2) является широко распространенным ферментом, который катализирует расщепление глутатиона и других γ-глутамил соединений посредством гидролиза γ-глутамил части или его переносом на подходящий акцептор. ГГТ является гетеродимерным гликопротеином, который синтезируется в виде белка-предшественника, который в свою очередь гликозилируется и распадается на две субъединицы зрелого фермента. ГГТ прикреплена к клеточной мембране посредством N-терминальной части тяжелой цепи. Активный участок фермента находится на внеклеточной части молекулы, которая обильно гликозилирована.
ГГТ выделяли отдельно из почек крыс и культуры клеток гепатомы человека, согласно процедуре, описанной ранее (Barouki и др., (1984) J. Biol. Chem. 259:7970; Curthoys and Hughey (1979) Enzyme 24:383; Matsuda и др., (1983) J. Biochem. 93: 1427; Taniguchi и др., (1985) J. Natl. Cancer Inst. 75:841; Tate and Meister (1985) Methods Enzymol 113:400; and Toya и др., (1983) Ann. N. Y.Acad. Sci 417:86, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки).
Около 1 мг каждого препарата очищенной ГГТ крысы и человека растворяли в 400 мкл 300 мМ NaHCO3 в 1,5 мл флаконе Эппендорфа. Добавляли 50 мкл свежеприготовленного раствора NaIO4 (42 мг/мл в воде), флакон заворачивали в алюминиевую фольгу и осторожно трясли 60 мин при комнатной температуре. Затем реакционную смесь загружали в колонку PD-10 (Pharmacia), предварительно уравновешенную 10 мМ Na2CO3 (фракция 1), и из нее элюировали 500 мкг фракции. Собирали фракции, содержащие по меньшей мере приблизительно 100 мкг ГГТ, измеренные посредством анализа Брэдфорда.
Приготавливали раствор глицилдиоктадециламида в ДМСО (5 мг липида в 1 мл ДМСО, тщательно перемешивали несколько минут вращением флакона). При этих условиях липид полностью не растворялся. Осторожно отбирали 50 мкл этого раствора и прибавляли к 350 мкл очищенных фракций ГГТ, полученных, как описано выше, во флаконы Эппендорфа. Флакон заворачивали в алюминиевую фольгу, смесь осторожно трясли 20 часов при комнатной температуре.
Затем добавляли 100 мкл раствора NaBH4 (10 мг/мл в воде). Спустя час добавляли 40 мкл раствора этаноламина (15 мкл в 1 мл воде). Спустя еще один час, реакционную смесь загружали в колонку PD-10, предварительно уравновешенную физиологическим раствором с фосфатным буфером. Фракцию, содержащую липидизированные ГГТ человека и крысы, собирали и хранили во льду.
Фракции липидизированных ГГТ человека и крысы исследовали на активность γ-глутамилтранспептидазы посредством стандартных методик (Tate and Meister (1983), цит., включенный в настоящий документ в качестве ссылки) и определяли специфичную активность липидизированной ГГТ человека и липидизированной ГГТ крысы.
Липидизированные ГГТ человека и крысы метили иодированием 125I с применением хлорамина T, и приблизительно 50 мкг радиоактивной липидизированной ГГТ вводили интраперитонеально крысам. Спустя 24 часа, крыс убивали и отбирали образцы тканей для ауторадиографии, чтобы определить характер распределения липидизированной ГГТ в различных органах.
Пример 7
Липидизирование антиактиновых антител и внутриклеточное окрашивание с использованием иммунной метки
Для того, чтобы продемонстрировать, что липидизированные антитела могут проникать внутрь живых клеток и связываться с внутриклеточными мишенями, антиактиновое антитело липидизировали и определили его способность проникать в фибробласты культуры Swiss ЗТЗ и связываться актином, белком цитоскелета. В качестве контроля использовали нативные (нелипидизированные) антиактиновые антитела.
Липидизирование антиактиновых антител и внутриклеточное окрашивание с использованием иммунной метки
Для того, чтобы продемонстрировать, что липидизированные антитела могут проникать внутрь живых клеток и связываться с внутриклеточными мишенями, антиактиновое антитело липидизировали и определили его способность проникать в фибробласты культуры Swiss ЗТЗ и связываться актином, белком цитоскелета. В качестве контроля использовали нативные (нелипидизированные) антиактиновые антитела.
Протеин-A-очищенные антиактиновые поликлональные антитела кролика липидизировали в соответствии со следующей процедурой: Липоамин, глицилдиоктадециламид, был ковалентно присоединен к углеводной части антиактинового антитела посредством окисления периодатом/восстановления боргидридом. Антитела растворяли в 0,8 мл 300 мМ NaHCO3 до концентрации приблизительно 0,2 - 1,0 мг/мл. Добавляли 50 мкл свежеприготовленного водного раствора NaIO4 (42 мг/мл), флаконы заворачивали в алюминиевую фольгу и осторожно трясли 90 минут при комнатной температуре. Реакционную смесь затем очищали на колонке PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ), уравновешенной и элюированной 10 мМ NaCO3. Пятьдесят мкл 10 мг/мл раствора глицилдиоктадециламида в бензоле добавляли к фракции, содержавшей антитела (например, как было определено посредством A280 мониторинга, анализа Брэдфорда), затем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре 20 часов при легком встряхивании. Затем добавляли 100 мкл свежеприготовленного водного раствора NaBH4 (10 мг/мл) и оставляли при комнатной температуре на один час, затем добавляли 50 мкл раствора этаноламина (15 мкл этаноламина в 1 мл воды). Спустя еще один час, при комнатной температуре полученные липидизированные антитела очищали посредством хроматографии на колонке PD-10, уравновешенной физиологическим раствором с фосфатным буфером.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)
Липидизированные антиактиновые и липидизированные анти-Tat антитела (supra) оценивали на их способность связываться со специфичными антигенами, по сравнению с нативными (нелипидизированными) антиактиновыми и анти-Tat антителами с помощью исследования ELISA. Липидизирование как антиактиновых, так и анти-Tat антител не вызывало измеримой потери сродства антител к их специфичным антигенам, по сравнению с нативными (нелипидизированными) антителами.
Липидизированные антиактиновые и липидизированные анти-Tat антитела (supra) оценивали на их способность связываться со специфичными антигенами, по сравнению с нативными (нелипидизированными) антиактиновыми и анти-Tat антителами с помощью исследования ELISA. Липидизирование как антиактиновых, так и анти-Tat антител не вызывало измеримой потери сродства антител к их специфичным антигенам, по сравнению с нативными (нелипидизированными) антителами.
Внутриклеточное окрашивание с использованием иммунной метки
Чтобы продемонстрировать, что липидизированные антиактиновые антитела способны связываться с внутриклеточным актином в живых клетках, липидизированные антиактиновые антитела или нативные антиактиновые антитела контактировали с культурой клеток Swiss ЗТЗ в течение часа, затем клетки продолжительно отмывали для удаления несвязанных антиактиновых антител. Затем клетки фиксировали, повышали их проницаемость и антиактиновые антитела определяли с помощью вторичных антител с флюоресцентной меткой. В то время как в клетках, предварительно инкубированных с нативными (нелипидизированными) антителами, не определяли специфического окрашивания, в клетках, предварительно инкубированных с липидизированными антиактиновыми антителами, совершенно очевидным было специфическое окрашивание актина. Характер окрашивания, наблюдаемый в случае липидизированных антиактиновых антител, примененных до фиксации, был аналогичен тому, что наблюдается при использовании нативных (нелипидизированных) антител, инкубированных с клетками после их фиксации и повышения проницаемости. Эти данные свидетельствуют о том, что липидизированные антиактиновые антитела были способны достигать внутриклеточного актина и связываться с ним и что они, тем не менее, могли узнаваться и связываться мечеными вторичными антителами, что указывает на их структурную и функциональную интактность.
Чтобы продемонстрировать, что липидизированные антиактиновые антитела способны связываться с внутриклеточным актином в живых клетках, липидизированные антиактиновые антитела или нативные антиактиновые антитела контактировали с культурой клеток Swiss ЗТЗ в течение часа, затем клетки продолжительно отмывали для удаления несвязанных антиактиновых антител. Затем клетки фиксировали, повышали их проницаемость и антиактиновые антитела определяли с помощью вторичных антител с флюоресцентной меткой. В то время как в клетках, предварительно инкубированных с нативными (нелипидизированными) антителами, не определяли специфического окрашивания, в клетках, предварительно инкубированных с липидизированными антиактиновыми антителами, совершенно очевидным было специфическое окрашивание актина. Характер окрашивания, наблюдаемый в случае липидизированных антиактиновых антител, примененных до фиксации, был аналогичен тому, что наблюдается при использовании нативных (нелипидизированных) антител, инкубированных с клетками после их фиксации и повышения проницаемости. Эти данные свидетельствуют о том, что липидизированные антиактиновые антитела были способны достигать внутриклеточного актина и связываться с ним и что они, тем не менее, могли узнаваться и связываться мечеными вторичными антителами, что указывает на их структурную и функциональную интактность.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было детально описано для большей его ясности и понимания, является очевидным, что в рамках настоящей формулы изобретения могут практиковаться определенные изменения и модификации.
Claims (20)
1. Способ получения липидизированного антитела, отличающийся тем, что осуществляют окисление углерода в антителе для получения окисленного антитела, затем осуществляют присоединение липидного заместителя липоамина к окисленному антителу в соответствующих условиях посредством ковалентного связывания для получения липидизированного антитела и выделение липидизированного антитела.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве липоамина используют липоамин с прямой цепью следующей формулы:
NH2 - R - (CH2)n - CH3
где R - выбирают из группы, состоящей из двузамещенного алкила (алкилена); 1,4-двузамещенного циклогексила; двузамещенного арила (арилена); аминогруппы формулы - (CHR1) - CO - NH-, где R1 является водородом или аминогруппой; алкилкарбонила и фосфат диэфира; n = 1 - 50.
NH2 - R - (CH2)n - CH3
где R - выбирают из группы, состоящей из двузамещенного алкила (алкилена); 1,4-двузамещенного циклогексила; двузамещенного арила (арилена); аминогруппы формулы - (CHR1) - CO - NH-, где R1 является водородом или аминогруппой; алкилкарбонила и фосфат диэфира; n = 1 - 50.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве липоамина используют липоамины с разветвленной цепью следующей формулы:
где R' - трехзамещенный алкил; трехзамещенный арил; амидогруппа формулы -(CHR1-CO-N<, где R1 является водородом или аминогруппой; иминогруппа формулы -CHR2-NH-CH<, где R2 является водородом или аминогруппой или иминогруппой формулы -CH2-N<; или фосфат диэфир; m = 1 - 50; n = 1 - 50; m и n выбирают независимо.
где R' - трехзамещенный алкил; трехзамещенный арил; амидогруппа формулы -(CHR1-CO-N<, где R1 является водородом или аминогруппой; иминогруппа формулы -CHR2-NH-CH<, где R2 является водородом или аминогруппой или иминогруппой формулы -CH2-N<; или фосфат диэфир; m = 1 - 50; n = 1 - 50; m и n выбирают независимо.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве разветвленного липоамина используют глицилдиоктадециламид.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антитела, используют антитело, кодируемое геном из суперсемейства иммуноглобулинов.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что в качестве гена из суперсемейства иммуноглобулинов, используют ген, кодирующий μ и λ тяжелую цепь.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антитела, используют моноклональное антитело.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают липидизированное антитело, включающее, по меньшей мере, один остаток липоамина, присоединенный к углеводной боковой цепи антитела.
9. Способ обеспечения связывания внутриклеточного белка с антителом, отличающийся тем, что он включает контактирование клетки с липидизированным антителом, включающим, по меньшей мере, один остаток липоамина, ковалентно присоединенный к углеводной боковой цепи антитела, при этом указанное антитело специфично связывается с внутриклеточным белком.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что липидизированное антитело включает, по меньшей мере, один остаток липоамина, присоединенный к углеводной боковой цепи иммуноглобулина.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве липоамина используют глицилдиоктадециламид.
12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что липидизированное антитело вводят животному in vivo.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что используемое липидизированное антитело поглощается органом в большей степени, чем соответствующее естественно встречающееся антитело, имеющее ту же аминокислотную последовательность и тот же характер гликозилирования.
14. Фармацевтическая композиция, ингибирующая цитотоксичность ВИЧ-1 инфицированных клеток, отличающаяся тем, что содержит терапевтически эффективную дозу липидизированного анти-Tat-антитела, включающего, по меньшей мере, один остаток липомина, ковалентно присоединенный к углеводной боковой цепи антитела для получения липидизированного антитела.
15. Композиция по п.14, отличающаяся тем, что содержит антитело, липидизированное через углеводную часть.
16. Композиция по п.14, отличающаяся тем, что липидизированного анти-Tat-антитело представляет собой иммуноглобулин, липидизированный через углеводную часть.
17. Композиция для диагностики заболеваний, связанных с экспрессией мишень-антигенов, отличающаяся тем, что содержит липидизированное антитело, которое связывается с антигеном-мишенью, причем липилизированное антитело содержит, по меньшей мере, один остаток липоамина, ковалентно присоединенный к углеводной боковой цепи антитела, и липидизированное антитело дополнительно содержит диагностический агент.
18. Фармацевтически приемлемая композиция, отличающаяся тем, что включает иммуноглобулин, липидизированный через углеводную часть и наполнитель.
19. Способ диагностики патологического состояния при заболевании, связанном с экспрессией антигена-мишени, отличающийся тем, что включает в качестве одного из этапов назначение больному липидизированного антитела, которое связывается с антигеном-мишенью, содержащим диагностический агент, причем липидизированное антитело включает, кроме того, по меньшей мере, один остаток липоамина, ковалентно связанный с углеводной боковой цепью антитела и выявляющий локализацию диагностического агента.
20. Липидизированное антитело, отличающееся тем, что оно включает в себя, по меньшей мере, один остаток липоамина, ковалентно присоединенный к углеводной боковой цепи антитела.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US91245392A | 1992-07-13 | 1992-07-13 | |
US07/912,453 | 1992-07-13 | ||
US07/912.453 | 1992-07-13 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU94024566A RU94024566A (ru) | 1996-09-27 |
RU2157239C2 true RU2157239C2 (ru) | 2000-10-10 |
Family
ID=25431949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU94024566/14A RU2157239C2 (ru) | 1992-07-13 | 1993-07-13 | Способ модификации, способ обеспечения связывания белка с антителом, фармацевтические композиции, способ диагностики |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0607408A4 (ru) |
JP (1) | JPH07502753A (ru) |
KR (2) | KR100372119B1 (ru) |
AU (1) | AU4772793A (ru) |
CA (1) | CA2118586A1 (ru) |
FI (1) | FI941169A (ru) |
NZ (1) | NZ255043A (ru) |
OA (1) | OA09893A (ru) |
RU (1) | RU2157239C2 (ru) |
WO (1) | WO1994001131A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2464315C2 (ru) * | 2006-03-16 | 2012-10-20 | Зе Скрипс Ресеч Инститьют | Генетически запрограммированная экспрессия белков, содержащих не встречающуюся в природе аминокислоту фенилселеноцистеин |
RU2558298C2 (ru) * | 2010-10-22 | 2015-07-27 | ИЭсБиЭйТЕК - Э НОВАРТИС КОМПАНИ ЭлЭлСи | Стабильные и растворимые антитела |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5543390A (en) * | 1990-11-01 | 1996-08-06 | State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University | Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting |
US5827819A (en) * | 1990-11-01 | 1998-10-27 | Oregon Health Sciences University | Covalent polar lipid conjugates with neurologically active compounds for targeting |
US6020526A (en) * | 1995-07-21 | 2000-02-01 | Genta, Incorporated | Amide-based cationic lipids |
US7045543B2 (en) | 2001-11-05 | 2006-05-16 | Enzrel Inc. | Covalent conjugates of biologically-active compounds with amino acids and amino acid derivatives for targeting to physiologically-protected sites |
AU2003205615B2 (en) | 2002-01-10 | 2008-09-25 | Universiteit Gent | A novel splice variant of MyD88 and uses thereof |
EP1488804A4 (en) * | 2002-03-22 | 2006-10-25 | Bipha Corp | HYDROPHILIC PEPTIDE COMPLEXES - IMMUNOGLOBULIN |
US8044100B2 (en) | 2004-12-22 | 2011-10-25 | Bellus Health Inc. | Methods and compositions for treating amyloid-related diseases |
WO2007082899A1 (en) | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Vib Vzw | Inhibitors of prolyl-hydroxylase 1 for the treatment of skeletal muscle degeneration |
CN103787927B (zh) | 2006-10-12 | 2017-03-01 | Bhi有限合资公司 | 递送3‑氨基‑1‑丙磺酸的方法、化合物、组合物和载体 |
WO2008055924A1 (en) | 2006-11-07 | 2008-05-15 | Vib Vzw | Diagnosis and treatment of t-cell acute lymphoblastic leukemia |
EP2096121A1 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-02 | Institut Pasteur Of Shanghai | Antiviral peptides comprising lipid attachment signals and methods of use |
CA2736729A1 (en) | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Amyloid beta-peptides and methods of use thereof |
US20130149297A1 (en) | 2010-07-02 | 2013-06-13 | Vib Vzw | Role of fragile x mental retardation gene and protein in cancer metastasis |
GB201012845D0 (en) | 2010-07-30 | 2010-09-15 | Vib Vzw | Inhibition of dicer function for treatment of cancer |
CA2884580A1 (en) | 2011-09-14 | 2013-03-21 | Abeterno Limited | Intracellular cell selection |
WO2013121042A1 (en) | 2012-02-16 | 2013-08-22 | Vib Vzw | PP2A SUBUNITS IN DNA REPAIR, THE PP2A B55α SUBUNIT AS NOVEL PHD2 INTERACTING PROTEIN, AND IMPLICATIONS FOR CANCER |
GB201306589D0 (en) | 2013-04-11 | 2013-05-29 | Abeterno Ltd | Live cell imaging |
JP6736464B2 (ja) | 2013-08-29 | 2020-08-05 | シティ・オブ・ホープCity of Hope | 細胞透過性コンジュゲート及びその使用の方法 |
KR101470793B1 (ko) * | 2014-06-30 | 2014-12-08 | 순천향대학교 산학협력단 | 흡수촉진제로서의 펩타이드와 이를 포함하는 조성물 |
EP3634978A1 (en) | 2017-06-07 | 2020-04-15 | Adrx, Inc. | Tau aggregation inhibitors |
EP3668886A2 (en) | 2017-08-18 | 2020-06-24 | Adrx, Inc. | Tau aggregation peptide inhibitors |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4429008B1 (en) * | 1981-12-10 | 1995-05-16 | Univ California | Thiol reactive liposomes |
EP0306912A3 (en) * | 1987-09-08 | 1989-07-05 | Albany Medical College | Immunogenic composites capable of selectively inducing antibody production and pharmaceutical compositions employing the same. |
ES2055907T3 (es) * | 1989-03-07 | 1994-09-01 | Genentech Inc | Conjugados covalentes de lipidos y oligonucleotidos. |
DK0478715T3 (da) * | 1989-06-23 | 1996-08-05 | Liposome Co Inc | Målrettede liposomer og fremgangsmåder til liposom-protein-kobling |
US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
AU647814B2 (en) * | 1990-07-24 | 1994-03-31 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Phospholipid- or lipid-combining glycosaminoglycan, production thereof, and cancer metastasis inhibitor |
-
1993
- 1993-07-13 EP EP93918190A patent/EP0607408A4/en not_active Withdrawn
- 1993-07-13 NZ NZ255043A patent/NZ255043A/en unknown
- 1993-07-13 CA CA002118586A patent/CA2118586A1/en not_active Abandoned
- 1993-07-13 KR KR1019940700829A patent/KR100372119B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-07-13 AU AU47727/93A patent/AU4772793A/en not_active Abandoned
- 1993-07-13 KR KR1020027011377A patent/KR20030097604A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-07-13 JP JP6503580A patent/JPH07502753A/ja active Pending
- 1993-07-13 WO PCT/US1993/006599 patent/WO1994001131A1/en not_active Application Discontinuation
- 1993-07-13 RU RU94024566/14A patent/RU2157239C2/ru not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-03-11 OA OA60481A patent/OA09893A/en unknown
- 1994-03-11 FI FI941169A patent/FI941169A/fi unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BANGHAM A.D. Liposomes in biological Systems. ed G.Gregoriagis. A.Allisson, 1980, NewYork - Brisbane-Toronto, pp.13 - 30. GREGORIADIS G. Liposomes for drugs and vaccins. J. "Trend. Biotechnol." 1986, v.3, pp.233 - 241. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2464315C2 (ru) * | 2006-03-16 | 2012-10-20 | Зе Скрипс Ресеч Инститьют | Генетически запрограммированная экспрессия белков, содержащих не встречающуюся в природе аминокислоту фенилселеноцистеин |
RU2558298C2 (ru) * | 2010-10-22 | 2015-07-27 | ИЭсБиЭйТЕК - Э НОВАРТИС КОМПАНИ ЭлЭлСи | Стабильные и растворимые антитела |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI941169A (fi) | 1994-05-04 |
KR20030097604A (ko) | 2003-12-31 |
EP0607408A4 (en) | 1997-12-10 |
KR100372119B1 (ko) | 2003-06-28 |
EP0607408A1 (en) | 1994-07-27 |
OA09893A (en) | 1994-09-15 |
RU94024566A (ru) | 1996-09-27 |
JPH07502753A (ja) | 1995-03-23 |
NZ255043A (en) | 1997-03-24 |
WO1994001131A1 (en) | 1994-01-20 |
CA2118586A1 (en) | 1994-01-20 |
AU4772793A (en) | 1994-01-31 |
FI941169A0 (fi) | 1994-03-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2157239C2 (ru) | Способ модификации, способ обеспечения связывания белка с антителом, фармацевтические композиции, способ диагностики | |
US5154924A (en) | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates | |
US5270199A (en) | Human mannose-binding protein | |
Seon et al. | Long-lasting complete inhibition of human solid tumors in SCID mice by targeting endothelial cells of tumor vasculature with antihuman endoglin immunotoxin. | |
US5182107A (en) | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates | |
RU2198895C2 (ru) | Конъюгат, обладающий способностью активировать иммунную систему, и фармацевтическая композиция, включающая указанный конъюгат | |
JP2756329B2 (ja) | 癌の診断、治療のための免疫結合体 | |
CA2436281A1 (en) | Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (ptpc) | |
HU208161B (en) | Process for producing cytotoxic active ingredient - antibody conjugates and pharmaceutical compositions | |
US20050181987A1 (en) | Compositions and methods for treatment of cancer | |
KR20040058229A (ko) | 항체 표적화 화합물 | |
JP4125383B2 (ja) | 悪性腫瘍中のn−グリコリル化−ガラクトース−グルコース シアル酸オリゴ糖を認識するモノクローナル抗体及びこの抗体を含有する組成物 | |
US20020054880A1 (en) | Anti-inflammatory, tolerogenic and immunoinhibiting properties of carbohydrate binding-peptides | |
RU2153885C2 (ru) | Способ осуществления селективного метионинового голодания клеток в организме млекопитающего, полинуклеотид, каталитически активный полипептид рекомбинантной метазы | |
JPS61122224A (ja) | 部位選択性プラスミノ−ゲン活性化因子及びその製造方法 | |
EP1877030A2 (en) | Duffy antigen receptor for chemokines and use thereof | |
WO1996040248A1 (en) | Transvacular and intracellular delivery of lipidized proteins | |
JP4761963B2 (ja) | 癌療法で用いる修飾されたサイトカイン | |
AU714868B2 (en) | Transvascular and intracellular delivery of lipidized proteins | |
US6440733B1 (en) | Monoclonal antibodies recognizing antigens on the surface of endothelial cells of tumor vessel | |
PT100568A (pt) | Anticorpos monoclonais e antigeneos para o melanoma humano | |
EP0365087B1 (en) | Immunotoxins for the treatment or prophylaxis of auto-immune diseases | |
JPH02504267A (ja) | 肝遮断薬 | |
JP2002529516A (ja) | CD66aを用いて新脈管形成に影響を及ぼす方法 | |
JP2000510097A (ja) | 宿主細胞シクロフィリンレセプター活性を妨げることによるhiv感染の治療 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20030714 |