FR2564319A1 - Nouvelles compositions de liposomes dotees d'une action specifique vis-a-vis de la proliferation de cellules donnees - Google Patents

Abstract

LES COMPOSITIONS DE LIPOSOMES COMPRENNENT AU MOINS UN COMPOSE ACTIF VIS-A-VIS DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE, ENCAPSULE DANS UN LIPOSOME AUQUEL EST LIE UN LIGAND CAPABLE DE CIBLER SPECIFIQUEMENT LES CELLULES A SAUVER.

Description

"Nouvelles compositions de liposomes dotées d'une
action spécifique vis-à-vis de la prolifération de
cellules données"
L'invention a pour objet de nouvelles compositions de liposomes dotées d'une action spécifique vis-à-vis de la prolifération de cellules données.

Elle concerne également l'utilisation de ces composés comme réactifs biologiques, notamment, pour permettre la croissance sélective, in vitro, d'une ou plusieurs populations cellulaires.

La sélection positive à partir d'une culture hétérogène, d'une population cellulaire donnée, en permettant sa survie et sa prolifération a suscité de nombreux travaux.

La plupart des techniques développées à ce jour sont basées sur la reconnaissance des cellules à sélectionner par un ligand spécifique, par exemple, une lectine, une hormone ou un anticorps, le ligand étant alors conjugué à un médicament , une toxine, un composé fluorescent ou divers composés protecteurs.

Ces techniques permettent d'élaborer des systèmes utilisables comme modèles mais ne conviennent pas pour des applications à plus grande échelle. Leurs inconvénients majeurs résident en particulier dans la capacité insuffisante de transport du ligand, les difficultés du couplage chimique dii ligand,la miseen oeuvre de lignées cellulaires ou d'équipements particuliers.

Dans les travaux antérieurs, les inventeurs ont montré qu'il est possible d'inhiber la prolifération in vitro d'une population cellulaire, en utilisant des liposomes. I1 s'agit de liposomes comportant à leur surface un anticorps capable de cibler spécifiquement une cellule donnée et renfermant, encapsulé, un composé inhibant la prolifération cellulaire à savoir, le,méthotrexate (en abréviation, ci-après,Mtx).

Les résultats obtenus ont montré que la prolifération des cellules qui sont reconnues par l'anticorps utilisé était inhibée avec une spécificité élevée.

L'état d'avancement des travaux des inventeurs dans ce domaine leur a permis d'étudier les possibilités d'application de composés favorisant au contraire la prolifération cellulaire, ce qui les a conduits à l'élaboration de nouvelles compositions de liposomes.

L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles compositions sous forme de liposomes capables d'assurer sélectivement la survie de cellules données.

Elle a également pour but de fournir des réactifs biologiques à base de ces compositions utilisables, en raison de leur spécificité d'action élevée et de leur efficacité, pour assurer- in vitro la survie d'une population cellulaire donnée ou d'une sous-population même présente à très faible concentration dans une culture.

Les compositions de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un composé actif vis-à-vis de la prolifération cellulaire, encapsulé dans un liposome auquel est lié un ligand capable de cADler spécifiquement les cellules dont on souhaite assurer la survie.

Ces compositions se lient spécifiquement in vitro aux cellules à sauver et d'une manière avantageuse pénètrent à l'intérieur de ces cellules en délivrant le composé actif capable d'assurer leur survie.

L'action exercée s'avère suffisamment puissante pour sauver une population de cellules données, même en présence dans le milieu de culture de concentrations léthales d'inhibiteurs.

Pour l'élaboration des compositions de l'invention, on met en oeuvre le composé actif selon une concentra- tion choisie de manière à pouvoir sauver des cellules données en présence de quantités toxiques d'inhibiteurs, tels que Mtx ou un dérivé, dans le milieu.

Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le composé actif comprend ou est formé de tétrahydrofolate , en particulier le NS-formyl-tétrahydrofolate, en abréviation ci-après TF ou d'un dérivé de ce dernier, ou encore d'un sel de ce dérivé.

L'utilisation de tétrahydrofolate ou de ses dérivés sous forme de sel, notamment de sel de sodium ou de sel de potassium est particulièrement avantageuse étant donné qu'elle permet d'éviter tout problème d'agrégation et de précipitation des liposomes.

Le ligand fixé à la surface du liposome, est choisi parmi les composés capables de reconnaître spécifiquement les cellules que l'on souhaite viser.

Des ligands appropriés comprennent des anticorps monoclonaux, des lectines, des hormones, des protéinQs- tr'potsetd'une manière générale tout composé ayese une affinité pour un phénotype donné sur la cellule à sauver.

D'une manière avantageuse, on utilise des anticorps monoclonaux correspondant à des déterminants - exprimés par les cellules dont on souhaite assurer la survie.

Seules les cellules exprimant ces déterminants
sont sauvées et prolifèrent de manière analogue à
celle observée avec du THF libre, lorsqu'on les expose
à des quantités de Mtx libre qui seraient suffisantes
pour les tuer en l'absence de THF. Au contraire, la
croissance des cellules n'exprimant pas les déterminants ciblés.

est inhibée par Mtx présent dans le milieu de culture.

Ges linosomes sont élaborés de manière hahituelle.

De Préférence, on utilise des liposomes tels que préparés selon
l'article de Machy, Barbetet Leserman dans Proc.Nat.Acad.

Sci. USA 79 (1982) p 4148-4152.

il s'aqiR de liposomes à base de phospholipides petite taille, ce qui favorise ladélivrance du composé actif. Leurs dimensions
sont de préférence inferieures à 4000 , plus spécialement inférieures à 1000 ,voire même à 600 . Ces liposomes sont avantageusement conjugués ou couplés par liaison covalente à un composé permettant d'assurer la liaison avec le ligand choisi.On utilise,de préférence, la protéine A spécialement lorsque le ligand est constitué par un anticorps capable de fixer cette protéine.

Pour identifier les cellules auxquelles se sont fixés les liposomes, ces dernières renferment en plus du composé actif, également encapsulé, un marqueur.

Des marqueurs appropriés comprennent les composés fluorescents, un composé préféré de ce type étant constitué par la carboxyfluorescéine. La concentration en marqueur est avantageusement de l'ordre de lmM~à 200 mM.

Ces liposomes permettent donc à la fois de protéger et de marquer les cellules sélectionnées.

La mise en oeuvre de liposomes de petite taille et de grande pureté favorise l'obtention d'une spécificité d'action élevée.

A cet égard, on a avantageusement recours à une purification des liposomes sur ue oeline de drt sur gel.

Les dispositions qui précèdent permettent d'obtenir des liposomes utilisables pour l'élaboration de réactifs biologiques de grande efficacité pour sélectionner une population cellulaire donnée en assurant sa survie.

Grace à ces réactifs, il est possible de délivrer aux cellules de cette population le composé actif sans qu'il soit nécessaire de le modifier chimiquement pour son admi- nistration ce qui assure une efficacité maximale.

Les travaux effectués ont montré que le composé actif encapsulé dans le liposome est aussi efficace que lorsqu'il est libre.

Selon un autre aspect particulièrement intéressant, les réactifs de l'invention permettent de mettre à profit les avantages des liposomes, à savoir, notamment, leur préparation relativement aisee, leur capacité de transport élevée, les moyens qu'ils offrent de pouvoir cibler des cellules d'un type donné et leur capacité à être endocytosé. Ils permettent egalement le couplage de nombreux ligands.

Les réactifs de l'invention sont donc particulièrement utiles, notamment, dans les stratégies de clonage de gènes.

Ils permettent, en effet, de sélectionner des cellules qui ont reçu un gène cloné ou non ou une séquence d'acide nucléique dès lors que le ligand fixé au liposome est capable de reconnaître spécifiquement une protéine de la surface cellulaire codée par le gène ou la séquence d'acide nucléique en question.

L'invention fournit ainsi les moyens de pondoir isoler des cellules eucaryotes ayant reçu une séquence d'ADN donnée.

Ces réactifs sont également. avantageusement utilise sables pour la sélection a partir d'une lignée cellulaire de cellules variantes.

A cet effet, on a recours à des liposomes cibles à l'aide des anticorps monoclonaux qui reconnaissant spécifiquement les cellules variantes grâce au degré de sélectivité élevé de ces liposomes.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont rapportés dans les exemples qui suivent et en se reportant aux planches sur lesquelles
- les figures la à ld représentent le nombre de cellules en fonction des jours de culture, dans différentes conditions,
- les figures 2a et 2b illustrent respectivement la croissance cellulaire et le pourcentage de cellules fluorescentes dans le cas d'une protection spécifique d'une sous-Dopulation cellulaire et
- la figure 3 représente les courbes obtenues en mesurant 1251 d'anticorps monoclonaux liés à des cellules variantes.

EXEMPLE I : Préparation de lîposomes renfermant THF
On prépare de petits liposomes unilamellaires par sonication sous azote pendant 30 mn à 50 C comme décrit par BARBET J. et al dans Supramol. Struct. Celez Biocies.

16,243-258.

Les liposomes sont formés de 64 moles % de dipalmi- toylphosphatidylcholine (produit commercialise par SIGNAL 35 moles% de cholestérol (commercialisé par FLuA) et et 1-mole% de dipalmitoyl phosphatidyléthanolamine
(comrne-icialisé par CALBIOCHEM) modifié avec du
N-hydroxy-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionate ou
SPDP (commercialisé par PHARMACIA).

La quantité de lipides est de 40?mole.

Les liposomes contiennent 100mM de formyltétrahydrofolate (THF) et 20 mM de carboxyfluorescéine
(commercialisé par EASTMAN), ou CF, dans lOOmM de NAHCO3.

Le THF obtenu sous forme de sel de calcium est passé tout d'abord à travers une colonne de Chelex 100 (Biorad) traitée avec HCl/lN et NAOH O,5N pour obtenir le sel de sodium. D'une manière conventionnelle, THF et
CF sont passés sur des colonnes LH-20 (PHARMACIA) pour éliminer les contaminants hydrophobes.

- Iodation de S aureus protéine A
On soumet à iodation 100 lug de protéine A (PHARMACIA) selon le procédé décrit par HUNTER et GREENWOOD dans Nature 125 1962, 194,pages 495 à 497 avec de l'iodure de sodium (New England Nuclear) 0,5moi et 7 jig de chloramine T puis on le dilue avec de la protéine A non marquée jusqu'à une activité spécifique finale de SmCi/umoles.-
- Réaction de couplage entre les liposomes et
la protéine A
Les liposomes sont mis à incuber avec de la protéine A modifiée par le SPDP(10 moles par mole de protéine A) à une concentration finale en protéine A de 180 à 200 ug/ml.

La concentration totale en lipides est de 7,5.mM.

Dans ces conditions, 40 à 50% de la protéine A deviennent liés au liposome, ce qui correspond à dés moyennes de 15 à 20 molécules de protéine A liées par des liposomes de 500-600 de diamètre.

Après la réaction de couplage, on ajoute du sérum de veau foetal inactivé par la chaleur à une concentration finale de 5% par rapport à la préparation de liposomes qui est dialysée durant environ 14 heures à 4"C contre un tampon
Hepes (145 mM NaCl ;-lOmM Hepes ; pH 7,45).

Dans ces conditions, les pertes en teneur de liposomes sont de 0,5 à 1% mesurées par fluorescence.

Après dialyse, on stérilise par filtration sur des filtres millipores de 0,45 pm. Le contenu des liposomes reste encapsulé de manière stable pour plusieurs mois à 4"C.

Ces petits liposomes peuvent être stockés indéfiniment par congélation à -180 C.

EXEMPLE 2 : Utilisation de liposomes selon l'exemple 1
sur lesquels sont fixés des. anticorps monoclo
naux pour la sélection positive de cellules.

Les résultats rapportés ci-après concernent des cultures de cellules Ltk (cellules murines L,H-2Kk positive, HLA négative, thymidine kinase négative), de cellules TRH 42(cellules L transfectées par HLA et
Herpès simplex thymidine kinase), de cellules de tumeurs murine RDM4 (H-2Kk positive, HLA négative) et de fibroblastes humains A431 (H-2 négative,HLA-B,C positive). Ces cultures sont réalisées à 37"C dans 7% de CO2, 93% d'air dans des flacons de culture tissulaire avec un milieu
RPMI 1640 (Gibco) supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (Eurobio).

Les anticorps utilisés pour cibler les cellules sont des anticorps monoclonaux de souris IgG2a,k, à savoir des anticorps H100-5/28, 15.5.5 etBl 23.2.H100-5/28 présenteune affinité pour la molécule H-2Kk codée par le complexe majeur d'histocompatibilité murin. (MHC) ;15.5.5 prG- -entelLle affinité psur les molécules H-2D codées par MHC murin.

B1.23.2 est dirigé contre les déterminants non- polymorphes exprimés sur les molécules HLA-B et-C codées par MHC humain.

Ces anticorps sont purifiés à partir de surnageants de culture- de cellules d'hybridomes sur des colonnes de Sépharose protéine A (PHARMACIA).

étude de l'action spécifique des liposomes renfermant THF
vis-à-vis de la prolifération d'une population
cellulaire donnee
On cultive des cellules murines Ltk-, TRH 42, des cellules tumorales murines RDM4 et des cellules de fibroblastes humain A431, à 37oC dans 7% de CO2 et 93% d'air sur des plaques de culture cellulaire avec un milieu RPMI 1640 (commercialisé par GIBCO) additionné de 5% de sérum de veau foetal inactivé( commercialisé par EURO3IO).

Les cellules sont mises en oeuvre à raison de 5x10.4 cellules dans 0,5ml e milieu.

Différentes conditions d'essai ont été utilisées pour étudier l'action des liposomes de l'invention. Sur les figures la à ld, on a rapporté les résultats obtenus respectivement avec les cultures de cellules TRH 42 (la), Ltk (lb), A431 (lc) et RDM4 (ld).

Sur les courbes données dans ces figures, on a indiqué en ordonnée le nombre de cellules (x10-5) et en abcisse le nombre de jours de culture, chaque courbe correspondant aux conditions de culture suivantes
- avec seulement le milieu (courbe 0),
- avec seulement du Mtx libre (courbe b #),
- avec du Mtx libre et des liposomes contenant
du THF, sans anticorps #,
- avec du Mtx libre et du THF libre zazou
- avec du Mtx libre et des liposomes contenant du RHF,auxquels sont fixés des anticorps anti-H-2Kk## razou
anti-HLA CI
Les concentrations en Mtx dans le milieu de culture, de THF libre et de THF encapsulé dans les liposomes sont comme suit selon le type de cellules
Cellules Concentration en
Mtx THF THF
en nM libre encapsulé
TRH 42 500 4 pM 4pM Ltk
A 431 250 4 MM 4-pM
RDM 62,5 2 pM 2
La concentration en THF utilisée est déterminée pour chaque type de cellules par essai biologique en utilisant de la déoxyuridine radio marquée.

Dans ces essais, on a choisi la concentration minimale de
THF nécessaire. pour éliminer l'effet du Mtx sur l'incorporation de déoxyuridine.

On utilise des liposomes qui contiennent une quantité de 100 mM de THF. La concentration en TUF dans la culture est obtenue par dilution des lipdsomes par mesure du CF encapsulé en se référant à CF standard de concentration connue.

Les concentrations finales en anticorps sont de 4 à 8 ug/ml.

Le milieu de culture est changé
(chaque jour) et les conditions de culture ci-dessus pour chaque type de cellules sont à nouveau mis-es en oeuvre deux
jours après.

Les cellules sont comptées chaque jour.

Les résultats obtenus montrent que lorsque
les cellules sont exposées à des quantités de Mtx libre
suffisantes pour les tuer en l'absence de THF.

seules les cellules exprimant les déterminants cibles pour les liposomes contenant WHF prolifèrent.

Cette prolifération est aussi bonne qu'avec du
THF libre.

Ainsi, les cellules murines (Ltk , TRH 42 et
RDM4) ne sont pas tuées S l'action de Mtx libre lorsqu'on utilise des liposomes contenant THF, et pour tant 1'anticorps anti-H-2K.

Au contraire, les cellules humaines A431 ne sont pas protégées et meurent.

Lorsque les cellules sont incubées avec l'anticorps anti-HLA, seules les cellules exprimant les molécules HLA, à savoir, les cellules TRH42 et A431, ne sont pas tuées par Mtx libre et prolifèrent aussi bien qu'avec du THF libre.

Protection spécifique d'une sous-population
de cellules à l'aide de liposomes conte
nant du THF et portant un anticorps.

On rapporte ci-après les résultats obtenus concernant la protection, vis-à-vis de Mtx libre dans le milieu de culture, des cellules TRH 42 (HLA positive et H-2Kk positive) en présence de l'anticorps monoclonal anti-HLA à l'aide de liposomes portant la protéine A contenant
THF.

A cet effet, on cultive des cellules TRH42 et Ltk selon différents rapports, à une concentration de 105 cellules dans 0,5ml de milieu de culture en présence de 500nM de Mtx et 4uM de THF libre ou encapsulé.

Les figures 2a et 2b illustrent respecttOement la croissance cellulaire et le pourcentage de cellules fluorescentes.

Les différentes courbes correspondent aux conditions respectives suivantes : courbe courbe courbe courbe

. utilisation de THF libre : utilisation de THF encapsulé
dans les liposomes avec comme anticorps
anti-HLA : comme la courbe ci-dessus mais l'anti
corps est constitué par anti-H-2K.

: sans anticorps
Avec l'anticorps anti-HLA, les rapports cellulaires de TRH42/Ltk sont respectivement de 1/100 -courbe - ), 1/1000(courbe - - -) ; 1/10000 (courbe-.-.-.) et 1/100 000 (. .

On utilise, à titre de témoin,un rapport cellulaire TRH42 à Ltk de 1/1000 avec l'anticorps anti-H-2K comme dans le cas de la protection avec THF libre.

Durant la protection avec les anticorps, on observe directement les cellules à l'aide d'un microscope par fluorescence sans autre marquage, les liposomes contenant CF co-encapsulée avec THF.

A titre de contrôle, des aliquots de cellules sauvées par THF libre dans le cas d'un rapport cellulaire de TRH42 à Ltk de 1/100 sont incubées avec des anticorps anti-HLA en présence de liposomes fluorescents et observés au microscope à fluorescence.

Au bout de 3,7 et lî jours de culture, on ajoute du tx libre (500nM).

Au bout de 4,8 et 12 jours, le milieu est changé et la sélection est répétée comme pour le sremler jour.

Au bout du quinzième jour, lorsqu'on observe une prolifération cellulaire active, le milieu est aspiré et Mtx est ajouté à une concentration finale de 1000nM.

On n'ajoute pas de liposomes.

Après un jour de plus, on aspire le milieu et on applique un cycle additionnel de sélection (liposomes avec ou sans anticorps, plus 500nM de Mtx).

On fait ensuite croître les cellules dans des flacons, au départ en présence de 4uM de THF libre pendant 3 à 4 jours puis dans un milieu normal.

Durant la sélection positive les cellules ciblées avec les liposomes contenant à la fois THF et CF sont observées directement au microscope à fluorescence et les cellules fluorescentes sont comptées.

Les résultats obtenus montrent que les cellules portant HLA sont sauvées même dans le cas de rapports cellulaires de 1/100 000 en cellules TRH42/Ltk-,
Les cellules ciblées restent viables alors que les cellules non ciblées sont tuées par Mtx libre dans le milieu.

On observe que lorsque la population cellulaire est ciblée à l'aide de 11 anticorps anti-H-2k (qui se lie à toutes les cellules), toutes les cellules sont protégées de l'action de Mtx par les liposomes contenant THF.

En revanche, lorsque les populations cellulaires sont incubées avec les liposomes sans anticorps, toutes les cellules sont tuées.

Après l'opération de sélection et de croissance cellulaire, toutes les cellules spécifiquement sauvées sont examinées au microscope à fluorescence après marquageavec les anticorps anti-HLA ou anti-H?k ou aucun anticorps et des liposomes contenant n
Toutes les cellules apparaissent avec les molécules HLA et H-2K, mais dans le cas de l'incubation avec les liposomes sans anticorps,aucune cellule n'est fluorescente. Ces résultats sont confirmés en utilisant un autre anticorps anti-HLA fluorescéin dirigé contre un épitope de la molécule HLA différent d celui retenu par l'anticorps de la molécule
HLA transfectée utilisée pour sélectionner les cellules.

Un radioimmunoessai sensible dans lequel on utilise des anticorps monoclonaux anti-HLA marqués avec de l'iodure de sodium 1251 confirme ces résultats.

EXEMPLE 3 : Application des liposomes de l'invention dans
les stratégies de clonage de gènes
On insère dans des cellules hôtes, en opérant de manière en soi connue, de 1'ADN d'une espèce notamment humaine dans des cellules d'espèce différente, par exemple, de souris. On sélectionne par la technique de l'invention des cellules transfectées qui renferment le gène ou la séquence recherchée et l'on insère leur ADN,au cours d'une deuxième étape de transfection, dans des cellules réceptrices.

Les cellules positives sont alors utilisées pour construire une banquedans des vecteurs (phage,plasmide ou autres).

Cette banquepeut être passée en revue avec de 1'ADN entier de l'espèce donneuse marqué sur la base de l'expression par ceux des quelques vecteurs qui ont reçu 1'ADN donneur qui peuvent s'hybrider. Les vecteurs positifs dans l'hybridation sont utilisés pour transfecter des cellules réceptrices.

Les cartographies de restriction des vecteurs positifs de transfection peuvent être utilisées pour déterminer les extrémités du gène recherché.

Dans une variante de stratégie de clonage, 1'ADN est utilisé pour transfecter des cellules et on isole par la technique de l'invention les cellules qui expriment le gène recherché. On peut prévoir une deuxième étape de transfection pour réduire la quantité d'ADN non relevant. L'ADN de ces cellules est hybridé à l'ARN-m des cellules n'exprimant pas le gene transfecté.

L'ADN non hybridé est sélectionné sur des colonnes d'hydroxyapatite. Cet ADN est radiomarqué et utilisé pour effectuer un screening d'une banque génomique.

Des colonies de vecteurs positifs peuvent servir de donneurs d'ADN pour transfecter d'autres cellules de mammifères et confirmer la présence du gène et établir une careographie de ses extrémités avec les enzymes restriction.

identification de vecteur ayant reçu une
séquence d'ADN donnée a l'aide des lipo
somes de l'invention
On utilise de 1'ADN cellulaire entier pour
construire une banque d'environ 200 000 vecteurs.

On fait croître cette banque dans E. Coli ou autre bactérie appropriée puis on la divise en 10 groupes de 20 000 vecteurs chacun. L'ADN extrait est utilisé pour transfecter 10 puits contenant des cellules réceptrices.

D'une manière générale, seulement un de ces dix groupes pousse grâce à la technique de l'invention car seulement un (ou deux pour un génome diplolde) des groupes de vecteur a reçu 1'ADN correspondant au gène sélectionné.

Les puits dans lesquels on observe une croissance
positive définissent le groupe devecteursqui a reçu le gène.

Ce groupe de vecteurs est divisé en 10 groupes de 2000 vecteurs et la sélection répétée.

Le puits positif est alors divisé en
10 groupes de 200 et après identification du' puits positif
en 10 groupes de 20 pour une transfection finale.

Les 20 clones de vecteurs dans le puits posi tif constituent une cartographie pour les enzymos~de restriction.

S'il reste une ambiguité quelconque pour
le clone positif, son identité peut être vérifiée par
transfection.

Cette stratégie est indépendante de l'espèce
du donneur d'ADN et peut être utilisée avec des cellules
de souris comme hôte d'ADN de souris ou d'ADN humain.

EXEMPLE 4 : Application des liposomes de l'invention
pour la sélection de cellules -variantes
On procède comme suit pour isoler des cellules exprimant selon des taux élevés les molécules H-2Dk.

On cultive des cellules RDM4, à raison de 5 x 104 cellules dans,0,5 ml de milieu de culture, dans des plaques de groupes de 24 puits, soit avec des anticorps
k monoclonaux capables d'être reconnus (anti-H-2Dk ; 15.5.5), soit avec des anticorps témoins (anti-HLA ; B 1.23.2) et de liposomes portant la protéine A et contenant THF.

Au départ, on opère en présence de 125nM. de Mtx libre.

La concentration en THF encapsulé dans le liposome est de 100 mM.

Lorsqu'on observe une prolifération cellulaire, on change le milieu et on double la concentration en
Mtx (à 250nM ) en l'absence de liposomes, jusqu'à observation de l'arrêt de la croissance cellulaire.

A ce moment là, le milieu est aspiré et on ajoute du milieu frais avec 2 yM d THF apporté par les liposomes et des anticorps ainsi que 125 nM de Mtx.

Après 3 à 5 cycles de cette sélection, on cultive les cellules avec 125 nM de Mtx pendant 2 jours puis on incube dans un milieu frais pour expansion.

Les cellules sélectionnées sont alors analysées dans un essai .radioimmunologique pour vérifier leur capacité de se lier à l'anticorps monoclonal qui permet d'opérer la sélection (15.5.5).

Pour réaliser l'essairadioimmunologique, on procede comme suit.

Les anticorps 15.5.5 et B.1.23.2 sont marqués avec de l'iodure de sodium 1251 jusqu'à une activité spécifique de 1OOmCi par moles comme décrit ci-dessus pour la protéine A.

Les anticorps non marqués sont ajoutés selon des dilutions en séries en commençant à 5 ijg par puits de plaques de microtitrage comportant 96 puits coniques avec 3 x 1O cpm du même anticorps marqué. On ajoute dans les puits dans le milieu de culture 5 x 105 cellules RDM4 de type sauvage et RDM4 sélectionnés en fonction de la forte expression H-2Dk.

Après 2 heures d'incubation à 40C, les cellules sont lavées 4 fois par centrifugation et comptées pour 125i dans un compteur gamma.

Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 3 sur laquelle la courbe en pointillés se rapporte aux résultats obtenus en mesurant 125I avec une souche RDM4 de type sauvage et la courbe en trait plein à ceux obtenus avec les cellules RDM4 à forte expression de H-2D k Les symboles @ correspondent aux mesures effectuées à différentes concentrations d'anticorps 15.5.5 et anti-H-2Dk. Les courbes avec les symboles # correspondent aux mesures effectuées avec l'anticorps B1.23.2 ou anti -HLA.

Claims (9)

- REVENDICATIONS

1.- Compositions de liposomes caractérisées en ce quelles comprennent au moins un composé actif vis-à-vis de la prolifération cellulaire, encapsulé dans un lipcsome auquel est lié un ligand capable de cibler spécifiquement les cellules dont on souhaite assurer la survie.

2.- Compositions selon la revendication l,carac-

térisées en ce que le composé actif comprend ou est formé de tétrahydrofolate ou d'un dérivé, en particulier le

N5-formyl-tétrahydrofolate ou encore d'un sel du tétrahydrofolate ou de ses dérivés.

3.- Compositions selon la revendication 2, caractérisées en ce que le tétrahydrofolate ou ses dérives sont sous forme de sel, notamment de sel de sodium ou de potassium.

4.- Compositions selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que le ligand est choisi parmi des anticorps monoclonaux, des lectines, des hormones, des protéines-transports et d'une manière générale tout composé ayant une affinité pour un pénot exrité per la oeiIule a sauver.

5.- Compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles comprennent des liposomes de préférence de moins de 4000 ,plus specialement de moins de lOOO0A

voire de dimensions inférieures à 600 A, environ à base de phospholipides, avantageusement conjugués ou couplés par liaison covalente à un compose permettant d'assurer la liaison avec le ligand choisi, les liposomes renferment, le cas échéant, également un marqueur rmettant l'identification des cellules c-iblées auxquelles se sont fixés les liposomes tel que la carboxyfluorescéine.

6.- Compositions selon la revendication 5, caractérisées en ce qu'elles renferment un anticorps monoclonal lié à la protéine A.

7.- Compositions selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que les lîposomes sont purifiés par exemple sur une colonne de chromatographie 8.- Application des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, en tant que réactifs biologiques.

9.- Réactifs biologiques comprenant au moins une composition selon l'une quelconque des revendications 1 utiles notamment pour cibler une population cellulaire donnée et assurer sa survie.

10.- Utilisation d'un réactif biologique selon la revendication 9 dans les stratégies de clonage de gênes pour la sélection de cellules variantes.