JP2660341B2 - リポソーム製剤およびその製造法 - Google Patents
リポソーム製剤およびその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、インターロイキン−２（以下、「IL−２」
と略称することもある。）を安定に含むリポソーム製剤
およびその製造法に関する。 従来の技術 IL−２は生体内で免疫調節に中心的役割をはたしてお
り直接あるいは間接的に癌の排除や免疫失調からの回復
やその改善に働くとかんがえられているＴ細胞やナチュ
ラルキラー細胞の増殖因子としての機能を有するタンパ
ク質である（ネイチャー，第302巻,305−310頁（1983
年））。かかる生理作用を有するためヒトIL−２は新し
い免疫失調治療剤あるいは制癌剤としての応用が強く期
待されている。 リポソーム製剤としては、マルチラメラーベシクル
（MLV），スモールユニラメラーベシクル（SUV），ラー
ジユニラメラーベシクル（LUV），リバースフェーズエ
バポレーション−ベシクル（REV）が知られており、そ
の製造法については、たとえば細胞工学vol.2,No.9,第1
136−1150頁（1983年）に紹介されている。最近、ステ
イブル−プルリラメラーベシクルと呼ばれるリポソーム
も知られている（特表昭59−500952号公報。）また、IL
−２含有リポソームとして、特開昭60−243022号公報に
記載のものが知られている。 発明が解決しようとする問題点 上述の特開昭60−243022号公報においては、IL−２を
リポソームへ封入するときの緩衝液のpHは４ないし７の
ものが好ましいとされている。 しかしながら、緩衝液のpHを４以上に調整してIL−２
封入リポソームを製造した後IL−２の残存活性を調べて
みると、活性が低下することが分かった。 問題点を解決するための手段 上述した結果に鑑み、本発明者らは、IL−２を安定に
含有するリポソーム製剤を得る目的で鋭意研究したとこ
ろ、緩衝液はpHを２〜3.5に調整されたものを用いる
と、該目的が達成されることを見い出し、これに基づい
てさらに研究した結果、本発明を完成した。 本発明は、（１）、リポソーム内に封入されるインタ
ーロイキン−２含有緩衝液溶液のpHが２〜3.5であるイ
ンターロイキン−２リポソーム製剤， （２）、インターロイキン−２含有緩衝液溶液を用いて
膜状リン脂質をハイドレーションに付しリポソームを製
造する方法において、該緩衝液はpHを２〜3.5に調整さ
れたものを用いることを特徴とするインターロイキン−
２リポソーム製剤の製造法，および （３）、リン脂質溶液とインターロイキン−２含有緩衝
液溶液とを混合し（W/O）エマルションとし、これをゲ
ルとし、次いで該ゲルに緩衝液を添加しリポソームを製
造する方法において、該緩衝液のうち少なくともゲルに
添加する緩衝液はpHを２〜3.5に調整されたものを用い
ることを特徴とするインターロイキン−２リポソーム製
剤の製造法である。 上記IL−２としては、IL−２活性、すなわちＴ細胞を
継代維持しうる作用を有する物質であればいずれでもよ
い。例えば動物体内や動物細胞で産生される天然のIL−
２や遺伝子組み換え技術で生産されるIL−２やこれらの
関連物質が挙げられる。上記IL−２やこれらの関連物質
は、糖鎖を有していてもよくまた有さなくてもよい。 上記IL−２としては、具体的には、たとえば遺伝子工
学技術により製造される第１図で示されるアミン酸配列
を有するポリペプチド（Ｉ）［特開昭61−78799号公
報］，その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部
分のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられる。
上記フラグメントとしては、例えばポリペプチド（Ｉ）
のアミノ末端から１個のアミノ酸（EPC公開第91539号公
報）または４個のアミノ酸を欠くフラグメント（特開昭
60−126088号公報）やカルボキシル末端部の数個のアミ
ノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられる。さらに上記
ポリペプチド（Ｉ）の構成アミノ酸の一部が欠損してい
るか他のアミノ酸に置換されたもの、例えば125位のシ
ステイン残基がセリン残基に置換されたもの（特開昭59
−93093号公報）でもよい。 また、上記のIL−２としては、ポリエチレングリコー
ル誘導体で化学修飾されたものでもよい（特開昭60−22
6821号公報）。 また、ポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端にさらにMet
を有していてもよく［特開昭61−78799号公報］、また
ポリペプチド（Ｉ）とそのアミノ末端にさらにMetを有
するポリペプチド（Ｉ）との混合物でもよい［特開昭60
−115528号公報］。 本発明のIL−２リポソーム製剤の製造自体は、公知の
技術が採用される。 該製造法としては、（Ａ）リン脂質溶液の溶媒を蒸発
除去してリン脂質の薄膜とし、膜状リン脂質をIL−２含
有緩衝液溶液を用いてハイドレーションに付し、マルチ
ラメラ−ベシクル（MLV）を得ることができる。（Ｂ）
さらにこれを超音波振盪機で振盪することにより、スモ
ールユニラメラ−ベシクル（SUV）を得ることができ
る。本発明は、上記製造法（Ａ）または（Ｂ）の工程に
おいて用いられるIL−２含有緩衝液溶液のpHを２〜3.5
に調整したものを用いるところにある。 また、本発明のIL−２リポソーム製剤の製造法として
は、（Ｃ）リン脂質溶液とIL−２含有緩衝液溶液とを混
合し（W/O）エマルションとし、このエマルションの溶
媒を蒸発除去しゲルとし、このゲルに緩衝液を添加する
ことにより、リバースフェーズエバポレーション−ベシ
クル（REV）またはラージユニラメラベシクル（LUV）を
得ることができる。（Ｄ）リン脂質溶液とIL−２含有緩
衝液溶液とを混合し、溶媒の蒸発除去操作と超音波処理
とを同時に行なってゲルを得、このゲルに緩衝液を添加
することによりステイブル−プルリラメラ−ベシクル
（SPLV）を得ることができる。本発明は、上記製造法
（Ｃ）あるいは（Ｄ）の工程において、該緩衝液のうち
少なくともゲルに添加する緩衝液はpHを２〜3.5に調整
されたものを用いるところにある。 本発明のリポソーム製剤の製造の際に用いられるリン
脂質としては、自体公知のものが使用可能であり、その
例としては、たとえば卵黄レシチン，大豆レシチン，そ
れらの部分水添加物があげられ、さらに、半合成リン脂
質（例、ラウリル，ミリストイル，パルミトイル，ステ
アロイル，オレイルなどの組み合せからなる半合成によ
り得られるホスファチジルコリン，ホスファチジルエタ
ノールアミンなど），ホスファチジルセリン，ホスファ
チジルグリセロール，スフインゴミエリンなどが挙げら
れる。 また、リン脂質としては、ホスファチジン酸も挙げる
ことができる。 上記リン脂質は、単一で用いても良く、また二種また
はそれ以上のものを混合して用いてもよい。また、リン
脂質以外の脂質成分、例えばアシル化、モノ、ジ、トリ
グリセライド、またコレステロールをリン脂質に混合し
てもよい。 さらに、リポソームの安定化等を目的として、たとえ
ばコレステロール，ジセチルフォスフェート，ステアリ
ルアミン，抗酸化剤,BHT（ブチルヒドロキシトルエ
ン），α−トコフェロール等を加えてもよい。 IL−２と脂質との割合は、脂質が約50から200mgにた
いしてIL−２が約50から10000μｇであることが好まし
い。またIL−２が約300ないし5000μｇであることがよ
り好ましい。 本発明で用いられる緩衝液としては、リポソーム製剤
の製造に用いることのできるものであればいずれでもよ
く、その例としては、たとえばリン酸緩衝液，クエン酸
緩衝液，乳酸緩衝液，酢酸緩衝液，酢酸アンモニウム液
をたとえば塩酸でpHを調整したものなどが挙げられる。 緩衝液溶液中の緩衝液の濃度としては、5mMから50mM
程度が好ましい。 本発明で用いられるIL−２含有緩衝液溶液中のIL−２
の濃度は、IL−２の蛋白量として、約0.5〜10mg/mlであ
ることが好ましく、約0.5〜5mg/mlがより実際的であ
る。 本発明のリポソーム製剤の製造にあたっては、上述し
た如く、緩衝液のpHを２〜3.5に調整される。 本発明における緩衝液は、とりわけpH3付近が特に好
ましい。 該pHの調整は、たとえば5mM酢酸アンモニウム溶液に
溶解しているIL−２溶液にたとえば塩酸を加えることに
よりpHを調整する。 製造法（Ｄ）または（Ｅ）において、リン脂質溶液と
混合するIL−２含有緩衝液溶液は、そのpHを２〜3.5に
必ずしも調整する必要はないが、通常は、pHを約２〜３
に調整するのが良い。 このIL−２緩衝液溶液には各種添加物、例えば安定
剤、吸着防止剤としての人血清アルブミンや抗酸化剤を
加えてもよい。 上記製造法（Ａ），（Ｂ）におけるリン脂質溶液の溶
媒としては、たとえばエーテル，クロロホルム，イソプ
ロピルエーテルなどが挙げられる。使用に際してはそれ
らの混合物でもよい。 蒸発留去の操作としては、ロータリーエバポレーショ
ン法など一般的操作が挙げられる。残留有機溶媒をとり
のぞくためN2気流をふきつけてもよい。 上記製造工程（Ａ），（Ｂ）におけるハイドレーショ
ンとしては、たとえば室温で約１〜24時間、緩衝液を加
え静置するなどの一般的方法でよい。 上記製造工程（Ｃ）におけるエマルションの製造法と
しては、プルーブ型超音波によりW/O型エマルションを
調整する。 該超音波処理は、例えば連続的に約10〜60秒間照射
し、いったん照射をやめまた連続的に約10〜60秒間照射
するサイクルを３〜10回繰り返す。 上記製造工程（Ｃ）のエマルションの溶媒の蒸発除去
の方法としては、ロータリーエバポレーション法など一
般的操作でよい。残留有機溶媒をとりのぞくためN2気流
をふきつけてもよい。ゲルに緩衝液を添加する方法とし
ては、ゲルへ直接緩衝液を添加する。これによりリポソ
ームを得ることができる。 上記製造工程（Ｄ）における溶媒の蒸発除去操作と超
音波処理とを同時に行なう方法としては、超音波をう
け、脂質溶存有機溶媒とIL−２溶存緩衝液のW/O型エマ
ルジョンを生成させながらのエマルジョンにゆるくN2ガ
ス気流をふきつけ有機溶媒を除去する。これによりゲル
を得ることができる。得られたゲルに緩衝液を添加する
ことにより、リポソームを得る方法としては、撹拌振盪
することによりリポソームを得る。 このようにして得られたリポソームを採取する方法と
しては、約8000〜10000g×約５〜20minの遠心分離方法
が一般的に採用される。 本発明のIL−２リポソーム製剤を保存する方法として
は、N2ガス置換後密封し冷暗所で保存する。 本発明のIL−２リポソーム製剤は、IL−２を長期間安
定に保持するので、IL−２の持続的治療効果が発揮され
る。したがって、本発明のIL−２リポソーム製剤は、徐
放性製剤として有利に使用することができる。 本発明のIL−２リポソーム製剤は、非経口投与製剤と
して有利に用いることができる。 該非経口投与製剤としては、たとえば注射用製剤が挙
げられる。 本発明のIL−２リポソーム製剤を注射用製剤として用
いる場合には、得られたリポソーム分散液をそのまゝ用
いるか濃厚なリポソームとして用時、分散液［例、生理
食塩水，等張化水溶液（マンニット等が含有されたも
の）］で分散して用いるかあるいは可能ならば凍結乾燥
して用時再分散して用いる。 このようにして得られた注射用製剤は、たとえば、皮
下，筋肉内に投与することが挙げられる。 本発明のIL−２リポソーム製剤は、低毒性であるの
で、公知のIL−２と同様の目的・対象に同様の用量・用
法により使用することができる。 本発明で用いるIL−２は、低毒性である。たとえば、
遺伝子工学手法で製造され、特開昭60−115528号公報に
記載の方法で精製され、次いで特開昭61−78799号公報
に記載の方法で分離され、そのアミノ酸配列が第１図で
示され、その比活性が約3.5×104単位/mgであるIL−２
は、カニクイザルの静脈内に投与した場合、6mg/kgの単
回投与では死亡例は見られない。このように、IL−２は
低毒性であるので、安全に投与することができる。 IL−２の投与量は、本発明のリポソーム製剤にした場
合には、主薬であるIL−２は徐々に放出されるので、IL
−２の持続的効果が期待されるため、数日〜数週間分の
量となるIL−２を含むリポソーム製剤を、たとえば１〜
２週間分を投与するのが好ましく、１週間分を非経口的
に投与する際には、一般に約10〜100U/kgのIL−２とな
る量のリポソーム製剤を、２週間分のそれの場合には、
約20〜200U/kgのIL−２となる量のリポソーム製剤が投
与される。 1U（単位）とは、任意に定めた標準品1ml中のIL−２
活性であり、約28.6ngの純粋な組み換え型IL−２に相当
する。なお、IL−２活性の測定ならびに１単位の定義に
関しては、特開昭60−115528号公報に記載の方法によ
る。 本発明のIL−２リポソーム製剤は、哺乳動物（例、マ
ウス，ネコ，イヌ，牛，馬，羊，山羊，家兎，ヒト）の
免疫疾患や腫瘍の予防，治療に用いられる。 実施例 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるべきものではない。 なお、以下の実施例で用いられたIL−２は、いずれ
も、形質転換体エシエリヒア・コリ（Escherichia col
i）N4830/pTB285（IFO 14437,FERM BP−852）を用い
て、特開昭61−78799号公報の参考例２に記載の方法で
得られる、アミノ末端がアラニンで始まるIL−２（ポリ
ペプチド（Ｉ））およびポリペプチド（Ｉ）のＮ末端に
メチオニンが付加したIL−２との混合物であり、その比
活性は約3.5×104単位/mgである。 上記形質転換体エシエリヒア・コリN4830/pTB285は、
財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 14437とし
て昭和60年４月25日から寄託されている。また本形質転
換体は、通産産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI）に受託番号FERM Ｐ−8199として昭和60年４月3
0日から寄託され、該寄託はブタペスト条約による寄託
に切換えられて受託番号FERM BP−852として同研究所
（FRI）に保管されている。 実施例１ 100mg/ml濃度の卵黄レシチン（EPC）クロロホルム溶
液1mlを50から100mlの丸底フラスコに添加した。これを
ロータリーエバポレーターにかけクロロホルムを蒸発さ
せEPCのフィルムをつくった。ジエチルエーテル5mlでこ
のEPCフィルムを溶解した。このEPCのジエチルエーテル
溶液へ、塩酸でpHを3.0に調整したIL−２を1.0mg/mlの
濃度で含む酢酸アンモニウム緩衝液溶液0.3mlを添加し
た。この丸底フラスコを浴槽型超音波器［60W,445KHz］
にかけ緩い窒素気流でジエチルエーテルを蒸発させIL−
２およびEPCを含むゲルを生成させた。丸底フラスコの
内壁にできたゲルを、塩酸でpHを３に調整された酢酸ア
ンモニウム緩衝液10mlでサスペンドすることによりIL−
２封入リポソームを得た。このリポソームサスペンショ
ンから遠心分離［10000g×10min］により、リポソーム
に封入されていないIL−２を除去しIL−２リポソーム製
剤を分離した。 実施例２ 実施例１の方法において、ゲルに加える緩衝液溶液の
pHを２または3.5に調整したものを用いて、実施例１と
同様の操作でIL−２リポソーム製剤をそれぞれ製造し
た。 実施例３ 100mg/ml濃度の卵黄レシチン（EPC）クロロホルム溶
液1mlを100mlの丸底フラスコに添加した。これをロータ
リーエバポレーターにかけクロロホルムを蒸発させEPC
のフィルムをつくった。ジエチルエーテル5mlを加えこ
のEPCフィルムを溶解した。このEPCのジエチルエーテル
溶液へ、塩酸でpHを５に調整したIL−２を1.0mg/mlの濃
度で含む酢酸アンモニウム緩衝液溶液0.3mlを添加し
た。この丸底フラスコを浴槽型超音波器［60W,45KHz］
にかけ緩い窒素気流でジエチルエーテルを蒸発させIL−
２およびEPCを含むゲルを生成させた。丸底フラスコの
内壁にできたゲルを、塩酸でpHを３に調整された酢酸ア
ンモニウム緩衝液10mlでサスペンドすることによりIL−
２封入リポソームを得た。このリポソームサスペンショ
ンから遠心分離［10000g×10min］によりリポソームに
封入されていないIL−２を除去し、IL−２封入リポソー
ム製剤を分離した。 実施例４ 100mg/ml濃度の卵黄レシチン（EPC）クロロホロム溶
液1mlを100mlの丸底フラスコに添加した。これをロータ
リーエバポレータにかけクロロホルムを蒸発させEPCの
フィルムをつくった。塩酸でpHを３に調整したIL−２を
1.0mg/mlの濃度で含む酢酸アンモニウムへ緩衝液溶液2m
lをこのフラスコへ添加した。充分ハイドレーションし
た後、EPCフィルムが完全にサスペンドするまで振盪し
た。得られたサスペンションを、塩酸でpHを３に調整し
た酢酸アンモニウム緩衝液10mlで３回洗浄した後、遠心
分離してリポソームに封入されていないIL−２を除去
し、IL−２リポソーム製剤を分離した。 実施例５ 100mg/ml濃度の卵黄レシチン（EPC）クロロホルム溶
液3mlを500mlの丸底フラスコに添加した。これをロータ
リーエバポレーターにかけクロロホルムを蒸発させEPC
のフィルムをつくった。ジエチルエーテル70mlでこのフ
ィルムを溶解した。これに、塩酸でpHを３に調整したIL
−２を1.0mg/mlの濃度で含む酢酸アンモニウム緩衝液溶
液10mlを加え、プルーブ型超音波振盪機で乳化し［75W,
20KHz,30秒×10回］、W/O型エマルジョンを作成した。
このようにして得たエマルジョンをロータリーエバポレ
ータにかけ減圧下でジエチルエーテルを留去しゲルを得
た。このゲルを、塩酸でpHを３に調整された酢酸アンモ
ニウム緩衝液10mlでサスペンドした。このサスペンショ
ンから遠心分離により封入されていないIL−２を除去し
IL−２リポソーム製剤を分離した。 参考例１ 実施例１の方法において、ゲルに加える緩衝液溶液の
pHを1,4または５に調整したものを用いて、実施例１と
同様の操作でIL−２リポソーム製剤を製造した。 実験例１ 実施例1,2および参考例１で製造したIL−２リポソー
ムを生理食塩水にサスペンドしリポソーム内IL−２の安
定性を調べた。なお対照としてバルク溶液及びサスペン
ド緩衝液のpHが1.5のものを用いた。 実験条件は37℃で、10mlのリポソームサスペンション
を静置し、経時的にリポソームサスペンション中のIL−
２をHPLC法により測定した。HPLC法の測定はグラジュエ
ント法によりIL−２を分離し蛍光検出により定量した。
流速は2mlとし、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ遊離
液と）0.1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（Ｂ
遊離液）をグラジュエント遊離液として、15分をかけて
Ａ遊離液から40％から65％リニアに勾配をかけた。蛍光
検出はエクサイティション280nmエミッション340nmで測
定した。IL−２は約11分で遊離した。使用したカラムは
ウルトロン300C4（4.6φX150mm）である。結果を表１に
示す。 表１に示される様に、添加IL−２バルク緩衝液溶液及
びゲルサスペンド緩衝液のpHを2,3または3.5に調整する
と、リポソーム内IL−２の安定性が著しく向上した。 実験例２ 実施例３で製造したIL−２リポソームを生理食塩水に
サスペンドしリポソーム内IL−２の安定性を調べた。な
お対照として、IL−２バルク緩衝液溶液及びサスペンド
緩衝液のpHが５のものを実施例３と同様の方法で作成
し、これを用いた。実験条件は37℃で、10mlのリポソー
ムサスペンションを静置し、経時的にリポソームサスペ
ンション中のIL−２を実験例２に示したHPLC法により測
定した。結果を表２に示す。 表２で示される様に、ゲルをサスペンドする緩衝液の
pHを３にするとリポソーム内IL−２の安定性が著しく向
上した。 発明の効果 本発明のIL−２リポソーム製剤は、長期間安定である
ので、徐放性製剤として用いることができる。
と略称することもある。）を安定に含むリポソーム製剤
およびその製造法に関する。 従来の技術 IL−２は生体内で免疫調節に中心的役割をはたしてお
り直接あるいは間接的に癌の排除や免疫失調からの回復
やその改善に働くとかんがえられているＴ細胞やナチュ
ラルキラー細胞の増殖因子としての機能を有するタンパ
ク質である（ネイチャー，第302巻,305−310頁（1983
年））。かかる生理作用を有するためヒトIL−２は新し
い免疫失調治療剤あるいは制癌剤としての応用が強く期
待されている。 リポソーム製剤としては、マルチラメラーベシクル
（MLV），スモールユニラメラーベシクル（SUV），ラー
ジユニラメラーベシクル（LUV），リバースフェーズエ
バポレーション−ベシクル（REV）が知られており、そ
の製造法については、たとえば細胞工学vol.2,No.9,第1
136−1150頁（1983年）に紹介されている。最近、ステ
イブル−プルリラメラーベシクルと呼ばれるリポソーム
も知られている（特表昭59−500952号公報。）また、IL
−２含有リポソームとして、特開昭60−243022号公報に
記載のものが知られている。 発明が解決しようとする問題点 上述の特開昭60−243022号公報においては、IL−２を
リポソームへ封入するときの緩衝液のpHは４ないし７の
ものが好ましいとされている。 しかしながら、緩衝液のpHを４以上に調整してIL−２
封入リポソームを製造した後IL−２の残存活性を調べて
みると、活性が低下することが分かった。 問題点を解決するための手段 上述した結果に鑑み、本発明者らは、IL−２を安定に
含有するリポソーム製剤を得る目的で鋭意研究したとこ
ろ、緩衝液はpHを２〜3.5に調整されたものを用いる
と、該目的が達成されることを見い出し、これに基づい
てさらに研究した結果、本発明を完成した。 本発明は、（１）、リポソーム内に封入されるインタ
ーロイキン−２含有緩衝液溶液のpHが２〜3.5であるイ
ンターロイキン−２リポソーム製剤， （２）、インターロイキン−２含有緩衝液溶液を用いて
膜状リン脂質をハイドレーションに付しリポソームを製
造する方法において、該緩衝液はpHを２〜3.5に調整さ
れたものを用いることを特徴とするインターロイキン−
２リポソーム製剤の製造法，および （３）、リン脂質溶液とインターロイキン−２含有緩衝
液溶液とを混合し（W/O）エマルションとし、これをゲ
ルとし、次いで該ゲルに緩衝液を添加しリポソームを製
造する方法において、該緩衝液のうち少なくともゲルに
添加する緩衝液はpHを２〜3.5に調整されたものを用い
ることを特徴とするインターロイキン−２リポソーム製
剤の製造法である。 上記IL−２としては、IL−２活性、すなわちＴ細胞を
継代維持しうる作用を有する物質であればいずれでもよ
い。例えば動物体内や動物細胞で産生される天然のIL−
２や遺伝子組み換え技術で生産されるIL−２やこれらの
関連物質が挙げられる。上記IL−２やこれらの関連物質
は、糖鎖を有していてもよくまた有さなくてもよい。 上記IL−２としては、具体的には、たとえば遺伝子工
学技術により製造される第１図で示されるアミン酸配列
を有するポリペプチド（Ｉ）［特開昭61−78799号公
報］，その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部
分のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられる。
上記フラグメントとしては、例えばポリペプチド（Ｉ）
のアミノ末端から１個のアミノ酸（EPC公開第91539号公
報）または４個のアミノ酸を欠くフラグメント（特開昭
60−126088号公報）やカルボキシル末端部の数個のアミ
ノ酸を欠くフラグメントなどが挙げられる。さらに上記
ポリペプチド（Ｉ）の構成アミノ酸の一部が欠損してい
るか他のアミノ酸に置換されたもの、例えば125位のシ
ステイン残基がセリン残基に置換されたもの（特開昭59
−93093号公報）でもよい。 また、上記のIL−２としては、ポリエチレングリコー
ル誘導体で化学修飾されたものでもよい（特開昭60−22
6821号公報）。 また、ポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端にさらにMet
を有していてもよく［特開昭61−78799号公報］、また
ポリペプチド（Ｉ）とそのアミノ末端にさらにMetを有
するポリペプチド（Ｉ）との混合物でもよい［特開昭60
−115528号公報］。 本発明のIL−２リポソーム製剤の製造自体は、公知の
技術が採用される。 該製造法としては、（Ａ）リン脂質溶液の溶媒を蒸発
除去してリン脂質の薄膜とし、膜状リン脂質をIL−２含
有緩衝液溶液を用いてハイドレーションに付し、マルチ
ラメラ−ベシクル（MLV）を得ることができる。（Ｂ）
さらにこれを超音波振盪機で振盪することにより、スモ
ールユニラメラ−ベシクル（SUV）を得ることができ
る。本発明は、上記製造法（Ａ）または（Ｂ）の工程に
おいて用いられるIL−２含有緩衝液溶液のpHを２〜3.5
に調整したものを用いるところにある。 また、本発明のIL−２リポソーム製剤の製造法として
は、（Ｃ）リン脂質溶液とIL−２含有緩衝液溶液とを混
合し（W/O）エマルションとし、このエマルションの溶
媒を蒸発除去しゲルとし、このゲルに緩衝液を添加する
ことにより、リバースフェーズエバポレーション−ベシ
クル（REV）またはラージユニラメラベシクル（LUV）を
得ることができる。（Ｄ）リン脂質溶液とIL−２含有緩
衝液溶液とを混合し、溶媒の蒸発除去操作と超音波処理
とを同時に行なってゲルを得、このゲルに緩衝液を添加
することによりステイブル−プルリラメラ−ベシクル
（SPLV）を得ることができる。本発明は、上記製造法
（Ｃ）あるいは（Ｄ）の工程において、該緩衝液のうち
少なくともゲルに添加する緩衝液はpHを２〜3.5に調整
されたものを用いるところにある。 本発明のリポソーム製剤の製造の際に用いられるリン
脂質としては、自体公知のものが使用可能であり、その
例としては、たとえば卵黄レシチン，大豆レシチン，そ
れらの部分水添加物があげられ、さらに、半合成リン脂
質（例、ラウリル，ミリストイル，パルミトイル，ステ
アロイル，オレイルなどの組み合せからなる半合成によ
り得られるホスファチジルコリン，ホスファチジルエタ
ノールアミンなど），ホスファチジルセリン，ホスファ
チジルグリセロール，スフインゴミエリンなどが挙げら
れる。 また、リン脂質としては、ホスファチジン酸も挙げる
ことができる。 上記リン脂質は、単一で用いても良く、また二種また
はそれ以上のものを混合して用いてもよい。また、リン
脂質以外の脂質成分、例えばアシル化、モノ、ジ、トリ
グリセライド、またコレステロールをリン脂質に混合し
てもよい。 さらに、リポソームの安定化等を目的として、たとえ
ばコレステロール，ジセチルフォスフェート，ステアリ
ルアミン，抗酸化剤,BHT（ブチルヒドロキシトルエ
ン），α−トコフェロール等を加えてもよい。 IL−２と脂質との割合は、脂質が約50から200mgにた
いしてIL−２が約50から10000μｇであることが好まし
い。またIL−２が約300ないし5000μｇであることがよ
り好ましい。 本発明で用いられる緩衝液としては、リポソーム製剤
の製造に用いることのできるものであればいずれでもよ
く、その例としては、たとえばリン酸緩衝液，クエン酸
緩衝液，乳酸緩衝液，酢酸緩衝液，酢酸アンモニウム液
をたとえば塩酸でpHを調整したものなどが挙げられる。 緩衝液溶液中の緩衝液の濃度としては、5mMから50mM
程度が好ましい。 本発明で用いられるIL−２含有緩衝液溶液中のIL−２
の濃度は、IL−２の蛋白量として、約0.5〜10mg/mlであ
ることが好ましく、約0.5〜5mg/mlがより実際的であ
る。 本発明のリポソーム製剤の製造にあたっては、上述し
た如く、緩衝液のpHを２〜3.5に調整される。 本発明における緩衝液は、とりわけpH3付近が特に好
ましい。 該pHの調整は、たとえば5mM酢酸アンモニウム溶液に
溶解しているIL−２溶液にたとえば塩酸を加えることに
よりpHを調整する。 製造法（Ｄ）または（Ｅ）において、リン脂質溶液と
混合するIL−２含有緩衝液溶液は、そのpHを２〜3.5に
必ずしも調整する必要はないが、通常は、pHを約２〜３
に調整するのが良い。 このIL−２緩衝液溶液には各種添加物、例えば安定
剤、吸着防止剤としての人血清アルブミンや抗酸化剤を
加えてもよい。 上記製造法（Ａ），（Ｂ）におけるリン脂質溶液の溶
媒としては、たとえばエーテル，クロロホルム，イソプ
ロピルエーテルなどが挙げられる。使用に際してはそれ
らの混合物でもよい。 蒸発留去の操作としては、ロータリーエバポレーショ
ン法など一般的操作が挙げられる。残留有機溶媒をとり
のぞくためN2気流をふきつけてもよい。 上記製造工程（Ａ），（Ｂ）におけるハイドレーショ
ンとしては、たとえば室温で約１〜24時間、緩衝液を加
え静置するなどの一般的方法でよい。 上記製造工程（Ｃ）におけるエマルションの製造法と
しては、プルーブ型超音波によりW/O型エマルションを
調整する。 該超音波処理は、例えば連続的に約10〜60秒間照射
し、いったん照射をやめまた連続的に約10〜60秒間照射
するサイクルを３〜10回繰り返す。 上記製造工程（Ｃ）のエマルションの溶媒の蒸発除去
の方法としては、ロータリーエバポレーション法など一
般的操作でよい。残留有機溶媒をとりのぞくためN2気流
をふきつけてもよい。ゲルに緩衝液を添加する方法とし
ては、ゲルへ直接緩衝液を添加する。これによりリポソ
ームを得ることができる。 上記製造工程（Ｄ）における溶媒の蒸発除去操作と超
音波処理とを同時に行なう方法としては、超音波をう
け、脂質溶存有機溶媒とIL−２溶存緩衝液のW/O型エマ
ルジョンを生成させながらのエマルジョンにゆるくN2ガ
ス気流をふきつけ有機溶媒を除去する。これによりゲル
を得ることができる。得られたゲルに緩衝液を添加する
ことにより、リポソームを得る方法としては、撹拌振盪
することによりリポソームを得る。 このようにして得られたリポソームを採取する方法と
しては、約8000〜10000g×約５〜20minの遠心分離方法
が一般的に採用される。 本発明のIL−２リポソーム製剤を保存する方法として
は、N2ガス置換後密封し冷暗所で保存する。 本発明のIL−２リポソーム製剤は、IL−２を長期間安
定に保持するので、IL−２の持続的治療効果が発揮され
る。したがって、本発明のIL−２リポソーム製剤は、徐
放性製剤として有利に使用することができる。 本発明のIL−２リポソーム製剤は、非経口投与製剤と
して有利に用いることができる。 該非経口投与製剤としては、たとえば注射用製剤が挙
げられる。 本発明のIL−２リポソーム製剤を注射用製剤として用
いる場合には、得られたリポソーム分散液をそのまゝ用
いるか濃厚なリポソームとして用時、分散液［例、生理
食塩水，等張化水溶液（マンニット等が含有されたも
の）］で分散して用いるかあるいは可能ならば凍結乾燥
して用時再分散して用いる。 このようにして得られた注射用製剤は、たとえば、皮
下，筋肉内に投与することが挙げられる。 本発明のIL−２リポソーム製剤は、低毒性であるの
で、公知のIL−２と同様の目的・対象に同様の用量・用
法により使用することができる。 本発明で用いるIL−２は、低毒性である。たとえば、
遺伝子工学手法で製造され、特開昭60−115528号公報に
記載の方法で精製され、次いで特開昭61−78799号公報
に記載の方法で分離され、そのアミノ酸配列が第１図で
示され、その比活性が約3.5×104単位/mgであるIL−２
は、カニクイザルの静脈内に投与した場合、6mg/kgの単
回投与では死亡例は見られない。このように、IL−２は
低毒性であるので、安全に投与することができる。 IL−２の投与量は、本発明のリポソーム製剤にした場
合には、主薬であるIL−２は徐々に放出されるので、IL
−２の持続的効果が期待されるため、数日〜数週間分の
量となるIL−２を含むリポソーム製剤を、たとえば１〜
２週間分を投与するのが好ましく、１週間分を非経口的
に投与する際には、一般に約10〜100U/kgのIL−２とな
る量のリポソーム製剤を、２週間分のそれの場合には、
約20〜200U/kgのIL−２となる量のリポソーム製剤が投
与される。 1U（単位）とは、任意に定めた標準品1ml中のIL−２
活性であり、約28.6ngの純粋な組み換え型IL−２に相当
する。なお、IL−２活性の測定ならびに１単位の定義に
関しては、特開昭60−115528号公報に記載の方法によ
る。 本発明のIL−２リポソーム製剤は、哺乳動物（例、マ
ウス，ネコ，イヌ，牛，馬，羊，山羊，家兎，ヒト）の
免疫疾患や腫瘍の予防，治療に用いられる。 実施例 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるべきものではない。 なお、以下の実施例で用いられたIL−２は、いずれ
も、形質転換体エシエリヒア・コリ（Escherichia col
i）N4830/pTB285（IFO 14437,FERM BP−852）を用い
て、特開昭61−78799号公報の参考例２に記載の方法で
得られる、アミノ末端がアラニンで始まるIL−２（ポリ
ペプチド（Ｉ））およびポリペプチド（Ｉ）のＮ末端に
メチオニンが付加したIL−２との混合物であり、その比
活性は約3.5×104単位/mgである。 上記形質転換体エシエリヒア・コリN4830/pTB285は、
財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 14437とし
て昭和60年４月25日から寄託されている。また本形質転
換体は、通産産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI）に受託番号FERM Ｐ−8199として昭和60年４月3
0日から寄託され、該寄託はブタペスト条約による寄託
に切換えられて受託番号FERM BP−852として同研究所
（FRI）に保管されている。 実施例１ 100mg/ml濃度の卵黄レシチン（EPC）クロロホルム溶
液1mlを50から100mlの丸底フラスコに添加した。これを
ロータリーエバポレーターにかけクロロホルムを蒸発さ
せEPCのフィルムをつくった。ジエチルエーテル5mlでこ
のEPCフィルムを溶解した。このEPCのジエチルエーテル
溶液へ、塩酸でpHを3.0に調整したIL−２を1.0mg/mlの
濃度で含む酢酸アンモニウム緩衝液溶液0.3mlを添加し
た。この丸底フラスコを浴槽型超音波器［60W,445KHz］
にかけ緩い窒素気流でジエチルエーテルを蒸発させIL−
２およびEPCを含むゲルを生成させた。丸底フラスコの
内壁にできたゲルを、塩酸でpHを３に調整された酢酸ア
ンモニウム緩衝液10mlでサスペンドすることによりIL−
２封入リポソームを得た。このリポソームサスペンショ
ンから遠心分離［10000g×10min］により、リポソーム
に封入されていないIL−２を除去しIL−２リポソーム製
剤を分離した。 実施例２ 実施例１の方法において、ゲルに加える緩衝液溶液の
pHを２または3.5に調整したものを用いて、実施例１と
同様の操作でIL−２リポソーム製剤をそれぞれ製造し
た。 実施例３ 100mg/ml濃度の卵黄レシチン（EPC）クロロホルム溶
液1mlを100mlの丸底フラスコに添加した。これをロータ
リーエバポレーターにかけクロロホルムを蒸発させEPC
のフィルムをつくった。ジエチルエーテル5mlを加えこ
のEPCフィルムを溶解した。このEPCのジエチルエーテル
溶液へ、塩酸でpHを５に調整したIL−２を1.0mg/mlの濃
度で含む酢酸アンモニウム緩衝液溶液0.3mlを添加し
た。この丸底フラスコを浴槽型超音波器［60W,45KHz］
にかけ緩い窒素気流でジエチルエーテルを蒸発させIL−
２およびEPCを含むゲルを生成させた。丸底フラスコの
内壁にできたゲルを、塩酸でpHを３に調整された酢酸ア
ンモニウム緩衝液10mlでサスペンドすることによりIL−
２封入リポソームを得た。このリポソームサスペンショ
ンから遠心分離［10000g×10min］によりリポソームに
封入されていないIL−２を除去し、IL−２封入リポソー
ム製剤を分離した。 実施例４ 100mg/ml濃度の卵黄レシチン（EPC）クロロホロム溶
液1mlを100mlの丸底フラスコに添加した。これをロータ
リーエバポレータにかけクロロホルムを蒸発させEPCの
フィルムをつくった。塩酸でpHを３に調整したIL−２を
1.0mg/mlの濃度で含む酢酸アンモニウムへ緩衝液溶液2m
lをこのフラスコへ添加した。充分ハイドレーションし
た後、EPCフィルムが完全にサスペンドするまで振盪し
た。得られたサスペンションを、塩酸でpHを３に調整し
た酢酸アンモニウム緩衝液10mlで３回洗浄した後、遠心
分離してリポソームに封入されていないIL−２を除去
し、IL−２リポソーム製剤を分離した。 実施例５ 100mg/ml濃度の卵黄レシチン（EPC）クロロホルム溶
液3mlを500mlの丸底フラスコに添加した。これをロータ
リーエバポレーターにかけクロロホルムを蒸発させEPC
のフィルムをつくった。ジエチルエーテル70mlでこのフ
ィルムを溶解した。これに、塩酸でpHを３に調整したIL
−２を1.0mg/mlの濃度で含む酢酸アンモニウム緩衝液溶
液10mlを加え、プルーブ型超音波振盪機で乳化し［75W,
20KHz,30秒×10回］、W/O型エマルジョンを作成した。
このようにして得たエマルジョンをロータリーエバポレ
ータにかけ減圧下でジエチルエーテルを留去しゲルを得
た。このゲルを、塩酸でpHを３に調整された酢酸アンモ
ニウム緩衝液10mlでサスペンドした。このサスペンショ
ンから遠心分離により封入されていないIL−２を除去し
IL−２リポソーム製剤を分離した。 参考例１ 実施例１の方法において、ゲルに加える緩衝液溶液の
pHを1,4または５に調整したものを用いて、実施例１と
同様の操作でIL−２リポソーム製剤を製造した。 実験例１ 実施例1,2および参考例１で製造したIL−２リポソー
ムを生理食塩水にサスペンドしリポソーム内IL−２の安
定性を調べた。なお対照としてバルク溶液及びサスペン
ド緩衝液のpHが1.5のものを用いた。 実験条件は37℃で、10mlのリポソームサスペンション
を静置し、経時的にリポソームサスペンション中のIL−
２をHPLC法により測定した。HPLC法の測定はグラジュエ
ント法によりIL−２を分離し蛍光検出により定量した。
流速は2mlとし、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ遊離
液と）0.1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（Ｂ
遊離液）をグラジュエント遊離液として、15分をかけて
Ａ遊離液から40％から65％リニアに勾配をかけた。蛍光
検出はエクサイティション280nmエミッション340nmで測
定した。IL−２は約11分で遊離した。使用したカラムは
ウルトロン300C4（4.6φX150mm）である。結果を表１に
示す。 表１に示される様に、添加IL−２バルク緩衝液溶液及
びゲルサスペンド緩衝液のpHを2,3または3.5に調整する
と、リポソーム内IL−２の安定性が著しく向上した。 実験例２ 実施例３で製造したIL−２リポソームを生理食塩水に
サスペンドしリポソーム内IL−２の安定性を調べた。な
お対照として、IL−２バルク緩衝液溶液及びサスペンド
緩衝液のpHが５のものを実施例３と同様の方法で作成
し、これを用いた。実験条件は37℃で、10mlのリポソー
ムサスペンションを静置し、経時的にリポソームサスペ
ンション中のIL−２を実験例２に示したHPLC法により測
定した。結果を表２に示す。 表２で示される様に、ゲルをサスペンドする緩衝液の
pHを３にするとリポソーム内IL−２の安定性が著しく向
上した。 発明の効果 本発明のIL−２リポソーム製剤は、長期間安定である
ので、徐放性製剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、アミノ末端がＨ−Ala−であるヒトIL−２の
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．リポソーム内に封入されるインターロイキン−２含
有緩衝液溶液のpHが２〜３であるインターロイキン−２
リポソーム製剤。 ２．pHが２〜３であるインターロイキン−２含有緩衝液
溶液を用いて膜状リン脂質をハイドレーションに付して
得られた特許請求の範囲第１項記載のリポソーム製剤。 ３．リン脂質溶液とインターロイキン−２含有緩衝液溶
液とを混合し（W/O）エマルションとし、これをゲルと
し、次いで該ゲルに緩衝液を添加する方法であって、該
緩衝液のうち少なくともゲルに添加する緩衝液はpHを２
〜３に調整されたものを用いる方法により得られた特許
請求の範囲第１項記載のリポソーム製剤。 ４．インターロイキン−２含有緩衝液溶液を用いて膜状
リン脂質をハイドレーションに付しリポソームを製造す
る方法において、該緩衝液はpHを２〜３に調整されたも
のを用いることを特徴とするインターロイキン−２リポ
ソーム製剤の製造法。 ５．リン脂質溶液とインターロイキン−２含有緩衝液溶
液とを混合し（W/O）エマルションとし、これをゲルと
し、次いで該ゲルに緩衝液を添加しリポソームを製造す
る方法において、該緩衝液のうち少なくともゲルに添加
する緩衝液はpHを２〜３に調整されたものを用いること
を特徴とするインターロイキン−２リポソーム製剤の製
造法。 ６．免疫疾患予防治療剤である特許請求の範囲第１項記
載のリポソーム製剤。 ７．腫瘍予防治療剤である特許請求の範囲第１項記載の
リポソーム製剤。
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|---|---|---|---|
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