JPH04501562A - Ｉｌ―２含有リポソーム免疫アジュバント - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ＩＬ−２含有リポソ一ム免疫アジニバント発明の分野 本発明は有効な免疫アジュバント及び／又は抗腫瘍量のリンホカイン、例えばイ ンターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有するリポソームに関する。

発明の背景 免疫原生物質の投与における免疫アジュバントの有用性はずっと前から認められ て来ており、抗原又は他の免疫原生物質に加えた場合、抗原活性を高め、それに より抗体刺激能力を大にする物質を発見するというかなりの業績がなされた。今 日まで、多くのこのようなアジュバントは、例えば、ある特定の抗原を混合する と、そのあるものは混合物中の他のものの活性を高めるという抗原のミョウバン 沈降物の使用、インフルエンザ抗体生成を特に高めるリン酸カルシウムの使用、 及びある抗原に反応する抗体を改良するようにみえるスフタイロコツカス毒素の 類似の使用が見出された。幾つかの他のアジ二バント物質、例えばタピオカ、カ ルシウム又はマグネシウム塩、なども、ある特定抗原に加えた場合、抗原のみを 投与した場合に得られる以上に抗体力価を増加できると考えられて来た。

免疫アジュバントは、生成される抗体の量を増加し、注射に必要な抗原の分量、 即ち注射の度数を減じる。アルミニウムアジュバントは広く用いられ、ヒトに安 全であると考えられているが、滅菌膿瘍及び持続性小節がそれらの使用の後に続 きつる。完全フロインドアジュバント、結核菌含有水中油型乳剤はアルミニウム アジュバントよりも有効である。しかしながら、ひどい肉芽腫形成、アレルギー 反応及び組織内の油保持を含む有害な副作用がヒトへの使用を妨げる。

インターロイキン−２（ｉＬ−２）は、細胞性免疫反応の増強での中心的役割を 占める。ケイ、エイ、スミス、サイエンス、２４０．１１６９（１９ｓ　８）参 照。ワクチンアジュバントとして用いた場合、ＩＬ−２は、マラリアスポロゾイ トに対する一般的非反応性をなくし、単純ヘルペス及び狂犬病ウィルスに対する 保護を促進する。

例えばエム、エフ、グツド等、ジャーナル・オブ・イムノロシイ。

１４１．９７２（１９８８）、エイ、ワインバーブ等、ジャーナル・オブ・イム ノロシイ、１４０．２９４（１９８８）、ジェイ、エッチ、ナンバーグ等、ジャ ーナル・オブ・セル・バイオケム、サフル。

１２８．１２（１９８８）参照。ＩＬ−２も活性化マクロファージによる非特異 性腫瘍傷害、及びリンパ球内のリンホカイン活性化キラー（Ｌ　Ａ　Ｋ）現象の 誘発を促進する。例えばエム、マルコヴスキイ等、１５８．１３５６（１９８８ ）ニジエイ、ジェイ、ムール等、サイエンス、２２５．１４８７（１９８４）、 及びジエイ、エム、ザーリング等、ネイチャー、２７４．２６９（１９７８）参 照。それは、非常に多（のネズミ腫瘍モデルにおいて、単独で、又は養子移入細 胞、例えばＩＬ−２で活性化された、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）活性 を示す細胞との組合せで用いると、抗腫瘍活性を示す。

しかしながら、このリンホカインを単独で又は組織培養培地中、ＩＬ−２で活性 化された末梢血単核細胞との組合せで用いた場合、ヒト癌免疫治療プロトコール において成功が限られる。アール、アール、サラツブ等、キャンサー、イムツル ・イムノセル　２２．３１（１９８６）、エフ、ベリンシュタイン等ジャーナル ・オブ・イムノロシイ、１４０．２８３９（１９８８）、エフ。エイ、ローゼン バーグ等、エフ・エンクル、ジェイ・メト　３１３．１４８５（１９８５）。同 上、３１６．８８９（１９８７）、アン・オブ・スルフ　２０８．１２１（１９ ８８）、アンナルス・オブ・インターナル・メディシン１０８．８５３（１９８ ８）及びマール・アイ、フィッシャー等、アンナルス・オブ・インターナル・メ ディシン１０８．５１８（１９８８）参照。ＩＬ−２及び／又はＩＬ−２で活性 化した養子移入細胞を受けている患者の臨床応答は、腎細胞癌に対しては約２０ ％ないし３０％の範囲、メラノーマに対して１０％ないし２０％、そして結腸癌 に対しては１５％又はそれ以下である。

重症全身性毒性は、ヒトに長期間投与されたＩＬ−２の高用量と゛関連して、又 、ＩＬ−２との組合せでＬＡＫ活性を有する養子移入細胞を用いるプロトコール と関連する。副作用は、発熱、倦怠、肝臓及び腎機能障害、中枢神経系逆効果、 例えば昏蒙、失見当及び昏睡並びに生命脅迫肺毛細管露出症候群と関連する全身 水腫を含む。

ニス、エイ、ローゼンバーグ、インポータント・アドヴアンス・イン・オンコロ シイ−・ケイ・ティー・デヴイタ等、編集、ジェイ・ピー・クツピンコツト。カ ンパニー、フィラデルフィア、ペンシルヴアニア、２１７−２５７頁参照。さら に、イン・ビポでのＩＬ−２半減期はわずか約４分はどに過ぎない。

同遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるジメチルヒドラジンの皮下注射により 誘発された、ＭＣ−３８ネズミ結腸アデノカルシノーマによって、結腸癌の肝臓 移転に対する免疫療法処置の治療効力が評価されて来た。このモデルにおける有 意な腫瘍減少は、ＩＬ−２及びシクロホスファミドとの組合せで、腫瘍浸透リン パ球（ＴＩＬ）で活性化された、ＩＬ−２、生成癌に浸透するリンパ球のサブポ ピユレーションにより既に達成された。ニス、エイ、ローゼンバーダ等、サイエ ンス、２３３．１３１８（１９８６）参照。しかしながらＩＬ−２単独の高用量 は、この腫瘍に関し有意な治療効果を示さない。さらに、ＬＡＫ細胞は、腫瘍減 少に必要とするＴＩＬ細胞の数と比べると、ずっと多数を必要とする。両タイプ の細胞培養の拡大が困難であるので、効果的な免疫療法に充分な数の細胞を得る ため、始発培地中の細胞を大量にするか、長時間の培養を要する。

リポソーム、−又はそれ以上の二層を有するリン脂質小胞は、リンパ管吸収及び マクロファージ取込みにより、固定された（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）薬物の吸収及 び分配を十分に修飾し、変化させる。この取込みは、主として肝臓中で起こり、 肺、骨髄及び膵臓を含むマクロファージに富む他の組織で少し起こる。ケイ、ジ エイ、フワング、リポソーニス・フロム・バイオフィジックス・ツー・テラビュ ーティクス、エム、ジエイ、オストロ編集、マーセル・ディツカ−、ニューヨー ク（１９８７）１０９−１５６頁参照。例えば抗真菌効力が増加し、アンホテリ シンＢの全身性毒素をリポソーム製剤で有意に減少する。ジー・ロペズーベレシ ュタイン、アン・インク・メト　１０５．１３０（１９８０）参照。しかしなが ら、サイトカイン及び他の生理活性化合物の局在及び活性に関するリポソーム取 込み及び分配（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）の効果は全く予測できない。さらに、リポソ ーム安定性は、生理活性化合物又はその担体と　リン脂質小胞壁との相互作用、 活性成分の漏出、又は最終組成分の低安定性により逆に影響を及ぼしうる。ある 場合は、マクロファージによる内存化よりもむしろリポソームからのサイトカイ ン漏出が生物的活性と関連しているという証拠がある。

それゆえ、増強された効力と減少した毒性の免疫アジュバント及びＩＬ−２のバ イオ活性とバイオ有用性の改良が、その毒性を緩和する一方、より必要である。

さらに、癌の免疫療法用の養子細胞の改良変更、及び使用と関連する減少した毒 性が共にずっと必要である。加えて、サイトカイン、例えばＩＬ−２の薬物分配 における改良が、実用的な外部患者処置規制を開発するために必要である。

発明の概説 本発明は、有効な免疫アジュバント及び／又は抗腫瘍量のインク−ロイキン−２ （ＩＬ−２）を含むリポソームを提供する。本発明は、又、リポソーム取込みに よりインターロイキン−２の免疫アジュバント及び／又は抗腫瘍効力を増強し、 それにより有効なワクチンアジュバント又は抗腫瘍剤を生成する方法を提供する 。例えばＩＬ−２の、リポソームへの取込みにより、インビボでフリーのＩＬ− ２が示す（約４分）以上延長されたＩＬ−２半減期（６８分）を示し、ネズミ肺 転移モデルでの増強された抗腫瘍効力を示す組成物となる。ＩＬ−２リポソーム の有意の免疫アジュバント性質は、又、フリーの又はアラム吸着の破傷風トキソ イドをモデル抗原として用いることを試みた。これらの研究は、ＩＬ−２の有用 性及び他のサイトカインの、抗腫瘍剤としての、及び免疫学的組成物、例えばワ クチンにおける免疫アジュバントとしての可能性を示す。

従って、有効アジュバント量の本発明のサイトカインーリポソーム及び免疫学的 に有効量のワクチン抗原を含むワクチンも、又、本発明の範囲内にある。本明細 書でＩＬ−２に関して用いられる用語「有効免疫アジュバント量」とは、製薬単 位量の本発明のＩＬ−２す゛　ポソームが製薬単位量のワクチン抗原及び最終ワ クチンを生成するため生理的に許容しうる液体坦体と組合せた場合、用いたＩＬ −２によって有意のアジュバント効果を示すことを意味する。即ち、本発明の与 えられたリポソーム中のＩＬ−２の取込みレベルは、最終液体ワクチン処方が許 容量の液体坦体中直ちに注射できるほど充分に高いものである。所望により、他 のアジュバント、例えば以下に・開示するものも、抗原及びＩＬ−２リポソーム と組合せできる。

本発明は、又、養子移入細胞と有効抗腫瘍量のインビボＩＬ−２を含むリポソー ムとの組合せを用いる腹膜及び／又は肝臓に限られた種々の癌の有効な処置を提 供する。これらの養子移入細胞は、既に、リンパ球表面受容体、例えばモノクロ ーナル抗体抗−ＣＤ３、プラスＩＬ−２（抗−ＣＤ３＋ＩＬ−２）インビボに対 する抗体により刺激された。これらのインビボ培地でのＴ細胞は、非特異的［例 えばリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）］現象により抗癌活性を発達させ、そ こでは細胞は非ＭＨＣ限定方法で溶解する。エイ、シイ−、オコア等、キャンサ ー・リサーチ、４９．９６３（１９８９）参照。

Ｔ細胞はモノクローナル抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２の存在で非常に増加するので 、腫瘍に対する増強免疫特異性は、腫瘍浸透リンパ球又は抗ＣＤ３−ＩＬ−２刺 激培養の出発物質としての腫瘍関連抗原による予備免疫後得られる細胞を用いる ことにより得ることができる。それは、又、最近、ガンマデルタ型の特異的Ｔ細 胞受容体を伴うＣＤ３　ＣＤ４　ＣＤ８　Ｔ細胞が主組織適用性複合体（ＭＨＣ ）制限を必要とせずに特異的抗原認識用の能力を有することを示し７た。イー、 エム、ジャニス等、サイエンス、２４４．７１３（１９８９）参照。これらの細 胞は、又、抗ＣＤ３＋ＩＬ−２の存在で速やかに拡大する。

上で述べたように、ＩＬ−２とリポソームの取込みは、養子移入免疫細胞と共に 又はそれなくして、ネズミ肺転移に対する抗腫瘍剤とし７てのＩＬ−２の有効性 を増加する。他のネズミモデル系では、ＭＣ−３８結腸アデノカルシノーマ、養 子移入抗ＣＤ３＋ＩＬ−２刺激細胞及びＩＬ−２リポソームの組合せが、肝臓転 移に対する有意の抗腫瘍効果を有することを証明した。一方、養子移入抗ＣＤ３ ＋１Ｌ−２刺激細胞を用い又は用いることな（フリーのＩＬ−２を同一のＩＬ− ２用量及び予定で用いて刺激したとき、何らの有意な治療恩恵も見られなかった 。

従って、上述の抗腫瘍処置は、１）有効量の本発明のサイトカインリポソーム及 び２）有効抗腫瘍量の養子移入ＣＤ３＋ＴＬ−２刺激細菌を含む。本明細書でＩ Ｌ−２に関して用いられる用語「有効抗腫瘍量」は、用いたＩＬ−２による腫瘍 における有意な減少を示す本発明のＩＬ−２リポソーム処方の製薬上の単位用量 を意味する。又、「有効量の養子移入細胞及びＩＬ−２リポソーム」は、製薬上 の単位用量のＩＬ−２リポソームとの組合せで、混合治療による腫瘍における有 意な減少を示す細胞の数を意味する。一般に、ヒトの処置での好ましい数の細胞 は、約ｌＸｌ０”ないしＩ　Ｘ　１０”細胞の範囲である。ヒト患者の処置用の ＩＬ−２の最大使用量は、１日当り■２体表面当り約３Ｘ１０’単位である。し かしながら、治療用量が直接腫瘍源に投与される場合は、投与されるＩＬ−２の 量は、１日当りｍ２体表面当りｌＸｌ０’−１０ＸＩＯ’単位の範囲内である。

本発明の与えられたリポソームにおけるＩＬ−２の取込みレベルは、処方が、イ ンビボで許容量の液体坦体で直ちに注射しつるに充分なほど高い。注入経路は全 身性、即ち、静脈内又は皮下、腫瘍に関連する局所でありうる。局所注射は、例 えば腫瘍への直接、リンパ管内に、腫瘍を含む体腔に、或いは動脈床又は腫瘍の 血液供給への注射を含む。例えば肝腫瘍のヒトには、投与は静脈内又は腹腔内注 射で、或いはカテーテルで肝静脈に直接にしうる。

図面の要約 第１図は、破傷風トキソイド（ＴＴ）との組合せで用いたときのＩＬ−２リポソ ームのアジュバント効果を描くグラフである。

第２図（パネルＡ−Ｄ）は、フリーＩＬ−２．ＩＬ−２リポソーム（ＩＬ−２リ ボ）、及びハンクス均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）との組合せで、ＴＴを用いて得ら れる抗破傷風抗体力価を描（グラフである。

第３図はＩＬ−２リポソームを用い又は用いることな（、破傷風゛トキソイド（ ＴＴ）及び、アラム吸看ＴＴで得られる抗破傷１ｉＬＩｇＧ抗体力価を描くグラ フである。

発明の詳細な説明 　Ｌ−２ インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、商業上入手しうるＴ細胞増殖因子（ヒト インターロイキン−２、組換え体、Ｔ３２６７）でシグマ・ケミカル・カンパニ ー（セント・ルイス・ミズリイ）からの培養されたラット牌細胞（ＴＯ８９２） に由来する。組換え体ＩＬ−２は又、ゲンザイム（ボストン、マサチューセッツ ）又はアールアントディシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ）から得られつる 。当分野で入手可能な他のリンホカインも本発明に用いることができると確信す る。これらは、ｌ−４、ＩＬ−６、アルファインターフェロン、及びガンマ−イ ンターフェロンを含む。これらのインホカインは単独でも、順次に、又は組合せ て、例えばリポソームにおける混合固定（Ｃｏ−ｅｎｔｒｏｐｍｅｎｔＸ例えば 、ＩＬ−２及びＩＬ−６）で用いることができる。

１）リポソーム 適当な条件下で、リン脂質分散は、水の存在で自然に閉鎖膜系に再生できること が知られている。電子顕微鏡は、これらの構造が、多数の濃縮二層（ｂｉｌａｙ ｅｒ）のリン脂質分子から造られ、リポソームと呼ばれることを明らかにする。

リポソームの膜モデル系としての有用性は、乾燥リン脂質が限られた配列の分子 再配列を受けているという事実から起きており、親水性頭群の間の親水性溶質の 非特定の侵入の機会がある。同様に、親水性溶質の隔壁が、親油性二層内に起こ る。結果は、溶質とリン脂質の間の相互作用の型による、サイトカイン又は他の 生理活性化合物の量を変えることを含むことができる送り出し配送系である。

多くの方法がリポソームの製造に提案されて来た。これらの方法のほとんどは、 粉末形であるか乾燥フィルムのいずれかでありうる、脂質の水性水和の形を含む 。最も広く用いられる技術の一つは、フィルム法として知られている。簡単にい うと、有機溶剤を伴う溶液中の所望の組成物の脂質を丸底フラスコの壁土に、薄 いフィルムの形に乾燥させる。生理活性化合物は、この状態でフィルムに含むこ とができる。乾燥フィルムは、適当な水性相を加え、ゆるやかにフラスコを振蓋 することにより水和する。親水性生理活性化合物により、水性溶液は水和に用い られる。この手順により形成されるリポソームは、一般に多数の濃縮二層を有し 、多重ベシクル（ＭＬＶｓ）と呼ばれる。

リポソームは、生理学的に活性な物質を細胞に導入するための潜在性薬物分配系 として評価されて来た。ポズナンスキー及びジュリアノ、ファルマコル　Ｃａ１ ．　Ｒｅｖ　３６．２７７−３３６（１９８４）、ビー、イー、ライマン等、エ ッセイズ・イン・バイオケミストライ１６．４９（１９８０）参照。

幾つかの経路の投与がリポソームの投与に用いられて来た。例えば静脈内、皮下 、腹腔内及び経口分配。グレゴリアゾイス及びアリリン編集、リポソーム送・イ ン・バイオケミカル・システムズ、ジョーン・ウィリイ・アンド・ソング、ニュ ー・ヨーク（１９８０）１５３−１７８頁参照。リポソーム送り出しの重量な進 展は、組織分布における変化と、生理活性成分のフリー型と比べて同様の性質を 結合し、それにより治療係数を高め毒性を低下させる。例えば、腎毒性の低下は 、アンフォテリシンＢ又はサイクロスポリンＡを含むリポソームの使用と関連し た。ジー・ロープズーベレーシュタイン、アン・インド・メト　１０５．１３０ （１９８５）及びシー著、トランスフランティジョン・プロシーディンゲス、Ｘ ■巻、１３９７−１４００（１，９８５）参照。又、心臓毒性及び腎毒性の減少 は、フリー型の薬物に比べて、それぞれドキソルビシン及びシスプラチン含有リ ポソームと関連する。ラーマン著、キャンサー・リサーチ、４２．１８１７（１ ９８２）及びフォースン著、キャンサー・リサーチ、４３．５４６（１９８３） 参照。

生理活性剤の送り出しに用いられるリポソームは、典型的には直径２５０人から 数マイクロメーターにわたるけれども、約２５０人ないし１３００人の範囲の小 単層ベシクル（ＳＵＶｓ）は、その大きさの故に、薬物担体として特に望ましい 。５ＵＶｓは、静脈内に与えると、骨髄への分配を増大し、又、循環系での長命 を増加を増加゛　を示すように思える。より小さいベシクルも又、リンパ節に皮 下注射で薬物を与えるとより効果的であると報告されている。

しかしながら、５ＵＶｓを含むリポソームは、長期間の蓄臓及び哺乳動物への注 入でしばしば不安定である。物理的安定性に欠ける理由は、よ（わかっていない 。しかしながら、哺乳動物系での安定性に関しては、リン脂質がインビボで見ら れる酵素、例えばホスホリラーゼＡ２、レンチンーコレステロール、アシルトラ ンスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）などの基質であることが知られている。

最近、１９８７年２月２４日出願の米国特許出願第１７，３６９号において、ダ ブリュー・ジェイ・バウマンは、リポソーム膜のホスホリラーゼＡ２−型切断を 阻害する方法を記載した。この発明の−態様において、１−バルミトイル−２− オレオイル−８ｎ−グリセロ−３−ホスホ−コリン（ＰＯＰＣ）と約２０〜３０ モル％１−バルミトイル−３ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ｌｙｓｏ　Ｐ　 Ｃ）の混合物を含む膜を有する小単層ベシクル（ＳＵＶ）のホスホリラーゼＡ２ （ＰＬＡ２）加水分解が完全に阻害された。

歴史的に、リポソームは分散体として研究されて来、わずかに最近になって、投 与時に再び分散できるよう粉末形に凍結乾燥した。

ゴートン著、ドラッグ・Ｄｅｖ、Ｉｎｄ、ＰａｒＩｌｌ、８，４６５（１９８２ ）、クロメリン著、ファルム・レス、１．１５９（１９８４）及び工ヴアンズ著 、米国特許第４．３１１，７１２号及び第４，３７０．３４９号参照。リポソー ムの凍結乾燥の系統的最適化かく種々の三糖類および凍結保護物質の存在下、マ ーカーとしてカルボキシフルオレラセンを用いて行なわれた。フランセン著、Ｉ ｎｔ、Ｊ、Ｐａｒｍ　３３．２７（１９８６）参照。　リポソームの不安定性は 長期間の保存に太き（関係するので、すぐに再分散可能な乾燥粉末形でリポソー ムを提供することが大いに望ましい。一方、凍結乾燥は、乾燥粉末リポソーム及 び薬物混合物を造るのに適用されて来、研究者は、再構成に関する薬物漏出の問 題を報告した。ある場合には、リポソームはショ糖及びトレハローズを用いて安 定化され、凍結乾燥の間、リポソーム膜の結合性を保った。ストラウス及びハウ ザー・プロシーディンゲス・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、ニー ニス−エイ、８３．２４２２（１９８６，４月）：及びストラウス著、バイオキ ム・パイオフィス・アクタ、８５８．１６９（１９８６）参照。

ワクチン抗原 本発明は、広範囲のワクチン及び抗原組成物への取込み用の、人及び動物に用い るための、高力価の寛容性のよいアジュバントを提供する。抗原自体は、バクテ リア、寄生虫、ウィルス又はケラチャに由来する精製又は部分的に精製した抗原 、或いは腫瘍抗原の形でありうる。或いは抗原はアレルゲン、例えば花粉、はこ り、ふけ、又はそれらの抽出物でありうる。又は抗原は毒物又は毒性昆虫又はは 生類動物に由来する毒液の形でありうる。抗原は、又、多糖又は固相合成により 又は組換えＤＮＡの技術により得られる合成ポリペプチドでありうる。どの場合 でも、抗原は、有効なアジュバントと共に又はそれなくして適当なホストに導入 した場合、抗体及び／又は特異抗原に対する細胞免疫応答の生成を刺激すること により活性免疫を誘導するか、或いは、アレルゲンの場合、特異アレルゲンによ るアレルギーの症状を軽減することを助ける形になる。抗原は、単独で又は、組 合せて使用できる。特に重要な抗原は、バクテリア、例えばエッチ・ヘルツシス 、レプトスピラ・ポメラ及びイクテロヘモルハシア、ニス・テホサ、ニス・バラ チヒＡ及びＢ１シー・ジフテリア、シー・テタニ、シー・ボツリナム、シー・ベ ルフリンケンス、シー・フエセリ、及び他のガス壌痘バクテリア、ピー・アンス ラシス、ピー・ベスティス、ピー・ムルトシダ、ヴイー・コレラ、ミコバクテリ アなどに由来し、ウィルス、例えばポリオウィルス（多重型）、アデノウィルス （多重型）、パラインフルエンザウィルス（多重型）、麻疹、ムンプス　ＲＳウ ィルス、インフルエンザ（多重型）、運送熱（ＳＦ４）、Ｂ型肝炎、レトロウィ ルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶＩ、西部及び東部ウマ脳を髄炎ウィルス、二ホ ンＢ１脳を髄炎、ロシア春夏脳を髄炎、ブタコレラウィルス、口締病、鶏痘、ニ ューカッスル病ウィルス、狂犬病、ネコ及びイヌのジステンパーなどに由来し、 リケッチャ、例えば発疹チフス及び発疹熱又は他の多くの斑点熱群から由来し、 種々のクモ及び蛇毒液或いは全て゛　の既知のアレルゲン、例えばサワギク、家 のほこり、花粉抽出物、草の花粉などに由来する。加えて、重要な抗原は、石灰 病（Ｌｙｍｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）、マラリア（プラスモジウム・ファルシパルム 及びプラスモジウム・ヴイヴマックス）、シストミアシス、レシュメリアシス、 システィセアコシス（サナダムシ類）及びヒラメ類と関連した寄生虫などに由来 し、さらに肺癌、結腸癌メラノーマ及び神経芽腫に由来する腫瘍抗原に由来する 。

ワクチン製剤 本発明のＩＩ、−２リポソームは、商業的に入手可能な処方を補足するアジュバ ントとして用いることができるし、又は、それらを、有効量、製薬上許容しうる 非毒性担体、例えば、液体担体、例えば無菌の生理食塩水中で、有効量の抗原製 剤と組合せることによりワクチンに製剤化できる。ワクチンの送達は、筋肉、腹 腔、皮下又は皮肉注射により、滴下又は鼻腔内エロゾールで、或いはこれらのモ ードを組合せて、一度に、或いは多くの単位使用量で行ないうる。

ワクチンの与えられた単位用量に含まれる、ワクチン抗原及び／又はＩＬ−２リ ポソームの絶対量は、広く変えることができ、例えば、年齢、体重、ワクチン投 与が考慮される患者の生理的条件などの因子による。かかる因子は、臨床医又は 動物モデルを用いている獣医、又は、この分野でよく知られている他の試験系に よって直ちに決定できる。

刺激される細胞 培養しつる。リンパ球表面受容体に対するあるモノクローナル抗体、例えばＴ− リンパ球のＣＤ３コンプレツクスを結合するモノクローナル抗体は、分裂可能性 を有する。さらに、ＣＤ３Ｔ−細胞受容体コンプレックスの信号送付は、インタ ーロイキン−２依存経路を通るＴ細胞増殖となる。ニス・シー・ミューアー著、 プロシデインクスニナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、ニーニスエイ 、８１．１５０９（１９８４）参照。この情報は、ＩＬ−２の存在下、細胞表面 受容体に対する抗体で刺激したリンパ球の組合せを用いるリンホカイン活性化キ ラー活性による、末梢血モノクローナル細胞又は牌細胞の迅速拡大培養を行なう のに用いられた。例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体及びＩＬ−２エクスビボは 、組織培養培体中で、細胞の大量増殖を誘導する。エイ・シー・オチオア著、ジ ャーナル・オブ・イムノロシイ、１３８．２７２８（１９８７）、ピー・エム・ マンダーソン著、シャンサー・イムツル・アンド・イムノセル、２７．８２（１ ９８８）、エイ・シー・オチオア著、キャンサー・リサーチ、４９．９６３（１ ９８９）及びピー・エム・アンダーソン著、ジャーナル・オブ・イムノロジー、 １４２．１４２．１３８３（１９８９）参照。

抗ＣＤ３＋ＩＬ−２の組合せで活性化した培地は、一般に、ＩＬ＝２のみで刺激 した培地より約１０ないし１００倍速く拡大する。

さらに、ＭＣＡ１０６肉腫を用いる肺転移モデルで、インビボで、抗腫瘍活性を 示す。しかしながら、これらの抗ＣＤ３＋ＴＬ−２活性化細胞を、ＭＣ−３８肝 臓転移を有するマウスに養子移入し、且つ、その動物を細胞移入後、１日に１回 フリーＩＬ−２で処置したが、何らの有意な治療結果も見られなかった。驚くべ きことに、ＩＬ−２リポソームの存在下、リンパ球表面受容体プラスＩＬ−２に 対する抗体で、予め刺激した養子移入細胞は、肝臓転移の高い有意の減少を示し た。

本発明を、以下の詳細な実施例によりさらに詳しく記載する。

実施例１゜ ジミストイルホスファチジルダリセロールとの組合せによるシミリストイルホス ファチジルコリン（ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ）を含むＩＬ−２−含有リポソームの製 造。　３．６Ｘ１０’単位／ｍｇ蛋白の特異活性を有する組換えＩＬ−２をシー タス・コーポレーション、エメリイヴイル、カリホルニアから得た。水性Ｉ　Ｌ −２（１ｍｇＩ　Ｌ−２／ｍ／Ｈ２０，３００ｍｇ脂質当り１ｎｌＩＬ　２溶液 ）を、１３７Ｃｓ源からの１５，０００ラドガンマで予め刺激した脂質粉末に加 えた。

使用した脂質は、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びシミリ ストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）が３＝７の割合のものであっ た。これら安定な合成リン脂質は、アヴアンチ、バーミンガム、アラバマより入 手し、−２０℃でデシケーター゛　で保存した。

水和により形成した多重ベシクル（ＭＬＶｓ）として、脂質／水性ＩＬ−２混合 物を、渦き装置を用いて１分間子分に混合した。デタージェント透析を、塩化ナ トリウム、脂質とＩＬ−２の５０＝１比を用いて行なった。次いでデタージェン トを、リポソ−ム中商標）装置（ディアノルム・ゲラーテ、ミュンヘン、西独） 中、リン酸緩衝食塩水で３６時間透析した。この手段はオウ・ズンビュール著に よりバイオケム・バイオフィル・アクタ、６４０．２５２（１９８１）に記載さ れており、本記載を引用して明細書記載の一部とする。ＩＬ−２含有、水和ＭＬ Ｖｓの凍結／溶解は、ドライアイス／プロパツール及び３７℃水浴中、５分サイ クルで３回行なった。

１−２の抱括固定は、リポソームペレットと１０００ｇを１０分間遠心分離した ＩＬ−２ＭＬＶ製剤の上澄の蛍光アミン蛋白アッセーにより測定し、ゲル濾過ク ロマトグラフィーにより大量のリポソーム（０，２−４ミクロン径）からフリー 薬物（ＭＷ１５．０００）を分離して確認した。

表１ ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧリポソームにおけるＩＬ−２の抱括固定方　法　ベシクルの 型　Ｉ　Ｌ−２固定（１）水和　多重（ＭＬＶ）　１０ （２）デタージェント透析　単層　４２（３）水和プラス凍結／溶解　多重（Ｍ ＬＶ）　８０デタージエント透析技術により単層ベシクルは４２％ＩＬ−２を固 定することが判った。しかしながらＩＬ−２含有Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓの凍結／溶解に より、ＩＬ−２バイオアツセー及び蛍光アミン蛋白アッセーのいずれも７０％− ８０％ＩＬ−２蛋白固定であることが測定された。脂質組成物がシミリストイル ホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンのみである場合 、少なくとも９５％固定、例えば９５％−９８％が得られた（実施例２参照）。

ＩＬ−２バイオアツセー及び蛍光蛋白アッセーについては、それぞれ、ニス・ギ リス著、ジャーナル・オブ・イムノロシイ−１１２０，２０２７（１９７８）及 びピー・エム・アンダーソン著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト ライ、２５４．６９２４（１９７９）参照。この両者を引用して明細書記載の一 部とする。

これらの結果は、凍結／溶解手順が、多重ベシクル中、利用できる水性スペース が５倍ないし１０倍増加するという報告と一致する。リポソームＩＬ−２製剤は ４℃で保存すると少なくとも３ケ月安定であった。１２５ｍＭシジ糖又はトレハ ロースの存在下に製造すると、希釈ＩＬ−２リポソーム製剤は、溶解したときベ シクル含量のロスなく凍結できる。ＩＬ−２リポソームは、水和及び凍結／溶解 技術により３０分で造ることができ、４℃で保存できる。

リポソームは、その後、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、シグマ・ケミカル・カ ンパニー、セント・ルイス、ミズウライ）又は０．９％水性ＮａＣ１で希釈しう る。例えば、１ｍｇバイアルの水性ＩＬ−２をリポソーム中に造り、次いで３． ５ｍｌに希釈すると［ＩＬ−２＝Ｉ×１０６シ一タス単位／ｌｌｌコ、この用量 は、インビボ研究用に注射器で容易に投与できる。

実施例２ シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を含むＩＬ−２含有リポソー ムの合成 脂質と蛋白の濃度、凍結／溶解及び脂質におけるＩＬ−２の取込みに関する浴音 波処理の効果を、フリーのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳＸ実施例１で用いた シータスＩＬ−２と非類似）であるＩＬ−２の供給を利用して評価した。この組 換えＩＬ−２は、ホフマンーラロツシュ（ナツトレイ、二ニージャーシイ）から 提供され、１゜５Ｘ１０’単位／ｍｇの特異的活性を有した。研究は、ＩＬ−２ 含有ヒト血清アルブミ：／（ＩＳＡ）キャリヤー（２５ｍｇ／　Ｉ　Ｘ　１０６ ｔｔ　Ｉ　Ｌ−２）及びキャリヤーフリーＩＬ−２の両方について行なった。ハ ンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中のＩＬ−２の水性溶液を、シミリストイルホス ファチジルコリン（ＤＭＰＣ，アヴアンティ・ホーラー・リピッズ、ペルハン、 アラバマ、３００＋＋＋ｇ脂質／ｍｌのＩＬ−２）とを渦ミキサーを用いて１分 間混合し、３０分間浴音波処理し、ドライアイス／エタノール浴（５分）で凍結 し、３７℃水浴（５分）で溶解した。ＤＭＰＣを予め１３７Ｃｓ源からの１５． ０００ラドガンマ放射で刺激した。凍結／溶解／音波処理の３循環後、リポソー ムフラクション中のパーセントＩＬ−２を、ＣＴＬＬ−２０バイオアツセ・−及 びリポソームペレットと１０分間１０００ｇで遠心分離した製剤の上澄の蛍光ア ミン蛋白アッセーにより測定した。用いたアッセーは、既に実施例１に記載した 。ニス・ギリス著、ジャーナル・オブ・イムノロシイ、と記、ビー・エム・アン ダーソン著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストライ、上記、参照。

Ｈ８Ａキャリヤー蛋白により、脂質対蛋白比は２：１で、脂質対ＩＬ−２比は５ ０ｍｇＤＭＰＣ／ｍｌ中７５０：１であった。３００ｍｇＤＭ　Ｐ　Ｃ／ｍｌ中 、脂質対蛋白比は１２：１で、脂質対ＩＬ−２比は４５００：１であった。

結果は以下の表２に要約され、これらの実験でリポソームが脂質ヘジクル中高濃 度のＩＬ−２を保証する方法により造られたことを示す。

表２ リポソーム中のＩＬ−２の取込み 実験Ａ：キャリャー蛋白（ＨＳＡ）を伴う水和　３１　７０ （渦ミキサー） 水和プラス凍結／ 溶解Ｘ３　４３　９１ 水和プラス凍結／ 溶解および浴音波処理　５４　９７ （３０秒）Ｘ３ 水和プラス凍結／　３０：１　１７．２溶解及び浴音波処理　１００：１　３７ ．５（３０秒）Ｘ３　１５０：１　８６．２２００：１　９４．６ 実施例３ リポソームにおけるＩＬ−２のバイオ有用性ＭＬＶ、実施例１の凍結／溶解リポ ソームにおけるＩＬ−２のバイオ有用性は、ＩＬ−２依存ＣＴＬＬ−２細胞系の ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込みにより測定されるＩＬ−２バイオアツセーにお けるフリーリンホカインと少なくとも同様に良好であった。Ｃ５７ＢＬ／６マウ スでの皮下ＩＬ−２の半減期は、フリー薬物に関しての４分と比べて６８分であ った。２５０，０００単位のＩＬ−２リポソームの単一皮下（ＳＣ）注射後７２ 時間で、ＩＬ−２はマウス血清で検出可能であった。一方、薬物フリーは注射後 ２４時間で検出できなかった。

実施例４ リポソーム中のＩＬ−２の抗腫瘍活性 ＩＬ−２リポソームのＭＣＡ１０６肉腫肺転移に対する抗腫瘍活性を、Ｃ５７Ｂ Ｌ／６マウス中腹腔内（ｉｐ）経路を用いて評価したところ、何の治療効果も見 られなかった。しかしながら、皮下腫瘍へのＴＬ−２リポソームの局所注射によ り治療が達せられた。従って、肺転移に対するフリー又はリポソーム処方として 与えられた局所口肺内／肺部内（ｉｔｘ）］　ＩＬ−２の有効性が評価された。

８ないし１０のＣ５７ＢＬ／６マウス群を、ユニバーシティ・オブ・ミネソタ・ リサーチ・アミマル・リソーシイズ・ガイドラインに従って、任意に、即ち拘束 することなく、収容し、餌を与えた。

肺転移は、０．４ｃｃハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中、５Ｘ１０’ＭＣＡ１ ０６肉腫細胞の尻尾静脈への注射により誘導した。腫瘍接種後５．６及び７日目 に、マウスはエーテル麻酔と以下のルートによるＩＬ−２の治療注射を受けた。

皮下（ＳＣ）、噴霧、静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）又は肺内／肺部内（ｔｔ ｘ）ｏ実験Ａで、マウスに５．６及び７日目に、１日１回、５０，０００単位フ リーＩＬ−２をＳＣ又はｉｔｘルートで、又は、’１０，０００単位リポソーム のＩＬ−２をＳＣ，ｉｖ又はｉｔｘルートで与えた。肺転移の数は、１４４日目 ＣＯ２ガス室内で犠牲にし、墨汁を気管に注入し、フエチーツ溶液（３００ｃｃ ７０％エタノール、３０ｃｃホルムアルデヒド、１５ｃｃ水酢酸）中に集めた肺 を保存することにより、数え・　た。実験例Ｂ及びＣでは、マウスは、５．６及 び７日目に１日１回１００，０００単位を以下のいずれかにより受けた。ｉｐ又 はｉｔＸルートによるフリーＩＬ−２、噴霧によるフリーＩＬ−２、又はｉｔｘ ルートによるリポソームＩＬ−２、これらのマウスを生存により評価した。結果 は以下の表３に示す。

ＩＬ−２処置　Ｎ”　王傍　史大値　」ら−治療なし　１０　ｉ３７　１３７　 −−−ｓｃ−フリーＩＬ−２１０７７８６０，００１ｉｔｘ−フリーＩＬ−２１ ０２３１００，００１ｉｖ−ＩＬ−２リポソーム　１０　９９　９１　０．０９ ７ｓｃ−ＩＬ−２リポソーム　１０　７９　７０　０．０１３ｉｔｘ−ＩＬ−２ リポソーム　１０　１１　６　＜０．００１１　Ｉ−２処置　と　王均　史困■ 　−ピー治療なし　１０　１４．７　１４　−−−ｉｐ−フリーＩＬ−２１０２ ０１９０，６９１ｉｔｘ−フリーＩＬ−２１０１６，３１８０，０８４噴霧フリ ーＩＬ−２１０２０，３１９，５０，０１７ｉｔｘ−ＩＬ−２リポソーム　］、 ０　２３　１５　０．００３生存日数 １ｐ−７’）　−ＩＬ−２１０１７，３１６，５０，６９１ｉｔｘ−７！Ｊ　− ＩＬ−２８３４，６２６０，０８４ｉｔｘ−ＩＬ−２’）ボッーム９　３６．９ 　３９　０．００２５処置結果は、スチコーデント対合Ｔ検定（Ｐ）を用い対称 グルー表３に集約されたデータにより示されるようにｉｔｘルートは、ｉｐ、ｓ ｃ又はｉ　ｖルートよりも有意に良好であった。肺転移についての局所ルート処 置の有効性を示す幾つかの実験を実施し、表４にまとめた。肺転移は、８−１０ のＣ５７ＢＬ／６マウスのグループニ、０４ｃｃハンクス平衡塩溶液（ＨＢｓｓ ）中、５Ｘ１０’ＭＣＡ１０６肉腫細胞の尻尾静脈注射により誘導した。腫瘍接 種後５．６及び７日目に、マウスはエーテル麻酔し、フリー又はリポソームのＩ Ｌ−２処方を用い、局所ｉｔｘルートによりＩＬ−２の治療注射をした。

表４中に報告した５つの各実験で、ｉｔｘルートにより与えられたＩＬ−２リポ ソームは、ネズミ肺転移モデルでのフリーリンホカインに比べて、生存を延長し 、及び／又は肺転移を減少させた。

中空リポソーム　−−−−−−−−１８−−−治療なし　−−−−−−−−１４ −−−治療なし　−−−−−−−−１９−−−実験４ 治療なし　−−−−−−−−＞２５０　＞２５０　−−−７　’Ｊ　−ＩＬ−２ １０，０００単位　２２９　＞２５０　０．０９１ｄ　Ｘ　３ ｒＬ−２！Ｊポアー４．”　１０．０００単位　９５　４４　０．０４２ｄ　Ｘ 　３ 治療なし　−−−−−−−−２３，７２０，５−−−フリーＩＬ−２３０，００ ０単位　２７．４　２６　０．２９７ｄ　Ｘ　３ ＩＬ−２リポソーム°　３０．０００単位　３４Ｊ　３３．５　０．０７４ｄ　 Ｘ　３ 治療なし　−−−−−−−−＞２５０　＞２５０　−−−フリーＩＬ−２１５０ ，０００単位　１０７．７　６８．５　０．００８５日 ”全実験に用いた水和、凍結／溶解リポソーム５処置結果は、スチューデントを 検定を用い、対照（治療なし）と゛　比較した。

表５に要約されるデータにより示されるように、養子移入抗ＣＤ３＋ＩＬ−２刺 激細胞をｉｔｘルートで投与した場合、ＩＬ−２リポソームを用いると肺転移の 数がさらに大きく減少しているのが見られる。養子細胞は、抗ＣＤ３モノクロー ナル抗体及びＩＬ　２と共にインビボで８日間刺激し培養したネズミ牌細胞であ った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群は腫瘍接種後５．６及び７日目に、フリー又は リポソーム処方として１０，０００単位、局所肺部内（ｉｔｘ）に処置した。６ 日目に、２０．　ＯＯ０，０００細胞をＩＬ−２処方とｉｔｘ投与した。

治療なし　＞２５０　＞２５０　−−−ＩＬ−２（フリー薬物）　２２９　＞２ ５０　０．０９１１Ｌ−２（フリー薬物）子細胞　１１５　４０　０．０７２Ｉ Ｌ−２リポソーム’　９５　４４　０．０４２ＩＬ−２リポソーム”子細胞　７ ６　３５　０．０２５１水和、凍結／溶解ＩＬ−２リポソーム５処置結果は、ス チューデントを検定を用い対照（治療なし）グループと比較した。

実験を繰り返し、結果を生存に関して評価した。マウスのグループを、３Ｘ１０ ’単位１ｔｘＩＬ−２により、フリー又はリポソーム処方のいずれかで、養子移 入細胞と共に又はなしで、上に記載したと同じ日程で処置した。結果は表６に報 告する。

治療なし　２０．５　６．７　−−− ＩＬ−２（フリー薬物）　２６　７．４　０．２９７ｒＬ−２（フリー薬物）子 細胞　２８　１２．５　０．１５５ＩＬ−２リポソーム”　３３．５　２５．９ 　０．０７４ＩＬ−２リポソーム１＋細胞　３４．５　２２．１　０．０３０１ 水和、凍結／溶解ＩＬ−２リポソーム５処置結果は、スチューデンｈｔ検定を用 い対照（治療なし）最後に、実験を、ＩＬ−２の用量応答を決定するために行な った。１０のＣ５７ＢＬ／６腫瘍を持つマウスのグループを、１日１回、５日連 続して、ＩＬ−２の種々の用量で、ｉｔｘフリーＩＬ−２又はｉｔｘリポソーム ＩＬ−２処方を用いて、ｉｖＭＣＡ−１０６肉腫腫瘍接種後４−８日に処置した 。結果は表７に報告する。これらの結果は、用量応答効果と１０．０００単位、 ２５，０００単位及び５０．０００単位をｉｔｘで５日連続の用量で、フリーＩ Ｌ−２に比べ、ＩＬ−２の優れていることを示す。

１０、０００単位　３４．５　１７．９　７５．９　３０．９　０．００２２５ 、０００単位　１９．９　１３．１　５９．８　２０．７　０．００１５０、０ ００単位　９．６　４．５　６５．３　４０゜０　０．００２５フリーとリポソ ームＩＬ−２処方の処置結果の比較は、スチュ局所肺内（ｉｔｘ）ＩＬ−２リポ ソームがフリーＩＬ−２よりすぐれているのは、より長期のＩＬ−２半減期、マ クロファージによるＩＬ−２の有効なプロセシング、又はリンパ管取込み及びリ ンホカインの、ＬＡＫ減少又は免疫応答を仲介した細胞のいずれかに関係する免 疫細胞へのリンホカインの表現によると信じられる。

上記ネズミの研究において、撹乱したコート又は低下した活性レベルにより決定 されるように、リポソーム含有ＩＬ−２の日差ｉｔＸ又はｉｐ用量レジメで、毒 性の徴候は全（見られなかった。日差肺内ＩＬ−２リポソームによるイヌの研究 でも、前足骨肉腫のリセッション後の６０ｋｇアイルランドウルフハウンド及び グレートデンを、胸膜のスペースにカテーテルチップで皮下の穴を通して、週当 り３〜５の連続日間、１日当りｌ０ＸＩＯ’単位ＩＬ−２リポソームで処置した 場合、許容しうる毒性しか認められなかった。１℃の温度上昇が、ＩＬ−２リポ ソームの各投与後約３時間後に観察された。これらのイヌは、呼吸速度又は体重 増では有意な上昇を示さず、又、彼らの食欲及び活性レベルは全く影響しないよ うに見えた。

実施例５ ＩＬ−２リポソームのアジュバント効果Ａ、マウスの免疫 ＩＬ−２リポソームはマクロファージにより容易に取込まれることが知られてい ること、又、Ｉ’Ｌ−２がマクロファージに加えて、Ｔ及びＢリンパ球に作用す ることから、ワクチンアジュバントとして機能する実施例１［表１（３）コのＤ ＭＰＣ／ＤＭＰＧ　ＩＬ−２リポソームの能力を評価した。破傷風トキソイドを これらの研究のためのモデル抗原として選んだ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、アジ ュバントなしくハンクス平衡塩溶液、ＨＢＳＳ）　、３３，０００単位フリーＩ Ｌ−２、又は３３，０００単位ＩＬ−２リポソームと混合した０、２ｒｄ破傷風 トキソイド（０，８Ｌ　ｆ単位、コンノート・ラボ、（スウィフトウォーター、 ペンシルヴ工ニア）をＳＣ注射した。同一処方のＱ、１ｍｌの牛用量ブースター 免疫を２８日目にＳＣ投与した。抗体力価を、系列希釈及びオウ・オウ・ストラ ヴイトスキー、ジャーナル・オブ・イムノロシイ、７２．３６０　（１９５４） の方法［この開示を引用して明細書記載の一部とするコによる検出の受身血球凝 集法を用いて１４．２８．４２及び５６日に評価した第１図に示すように、フリ ー及びリポソームＩＬ−２は共に破傷風トキソイド単独よりも高い抗体力価を促 進し、即ち正にアジュバントであった。ＩＬ−２リポソーム処方のみが、受身血 球凝集により測定されるように抗体力価を高持続上昇に関連した。

次に、マウスを上記したようにして、アジュバントなしくＨＢＳＳ）、フリーＩ Ｌ−２又はＩＬ−２リポソームで免疫し、特異的抗破傷風抗体力価をエリサアッ セーを用いて測定した。エリザを実施するため、水性炭酸緩衝液（ＮａＨＣＯｓ 、Ｎａ２ＣＯｓ：　ｐＨ９，６）中、０．６μｇ／１００ｍＪのポリーｄ−リジ ン（シグマ・ケミカル・カンパニー）の溶液を９６−ウエルアツセープレートの ウェルに加え、２時間３７℃でインキュベートした。ウェルを５回ダルベツコリ ン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ、ＧＩＢＣＯ、グランドアイランド、ニューヨーク） で洗浄し、乾燥した。ＤＰＢＳ　（１００μｌ／ウエル）中０．５％に希釈した ５０％水性グルタルアルデヒドの溶液を３０分間３７℃でインキュベートシ、ウ ェルを５回ＤＰＢＳで洗浄した。ＤＰＢＳ　（ｐＨ９，６）中破傷風トキソイド （ＴＴ）の１＝４希釈液を、２２．５ｍＡ’のＴＴ保存溶液（コンノート・ラボ ）を６７．５ｍｌの緩衝液で希釈することにより調製した。希釈ＴＴをウェル（ １００μｌ／ウエル）に加えて２時間３７℃で、及び１８時間４℃でインキュベ ートした。ウェルを５回ＤＰＢＳで洗浄した。

水素化ホウ素ナトリウム、０．１９ｇ／　１００ｍｌ炭酸緩衝液の溶液をウェル （１５０μｌ／ウエル）に加え５分間２５℃でインキュベートした。ウェルを５ 回ＤＰＢＳで洗浄した。

陽性又は陰性対照マウス又はウサギからの、或は試験される動物からの血清をＮ ＦＤＭ／ＤＰＢＳ　（３ｇ脱脂乾燥牛乳／１００ｍＡ’リン酸緩衝食塩水プラス ５μｌの０．１％チメルゾール溶液／ＮＦＤＭ／ＤＰＢＳ溶液のｍＡ）中に希釈 し、１００μｌの希釈血清を各ウェルに加えた。インキュベーション時間は１時 間３７℃（ＩｇＧ）及び２時間３７℃（ＩｇＭ）であった。血清試料をウェルか ら取り、次いで１０＠ＤＰＢＳで洗った。

抗Ｉ　ｇＭ　（マウス又はウサギＩｇＭに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標 識ヒツジＩｇＧ）を１：２５０にＮＦＤＭ／ＤＰＢＳに希釈した。抗ＩｇＧ（ウ サギＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジＩｇＧ又はマウスＩ ｇＧに対すＺ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジＩｇＧ）をＮＦＤＭ／ＤＰ ＢＳ　（抗ウサギＩｇＧ）中１　：　４０００に、又は抗マウスＩｇＧに対し１ 　：　５００に希釈した。これらの二次抗体とのインキュベーションを１時間３ ７℃で実施した。次いでウェルを１０回ＤＰＢＳで洗浄した。

基質緩衝液（１００μｌ／ウェル：１１．５ｍｌリスクエン酸緩衝液、０．０３ ７５ｍ７！のＯ−フェニレンジアミン２ＨＣ１，０，０１１１１１！の３０％Ｈ ２ｏ２、及び１ｍ１Ｈ２０を組合せることにより調製）をウェルに加えて、５分 （ウサギＩｇＧ測定）、１０分（ウサギ１ｇＭ測定又はマウスＩｇＧ測定）又は ３０分（マウス１ｇＭ測定）、３７℃でインキュベートした。停止溶液（５０μ ｌ又は５３ｍｌ０．３ＭＨ３Ｐ　Ｏａプラス２１ｍ１０．５ＭＨＣｌを水で５０ ０ｍ１に希釈）を各ウェルに加えて、基質（Ａ）を４９０關フイルターを用いて 測定した第２図パネルＡ−Ｄに要約されるデータは、ＩＬ−２リポソーム処方が 、最初の注射から各１４．２８．４２及び５６日後に抗破傷風トキソイド抗体力 価を高める能力に関し、すぐれていることを示Ｂ５　ウサギの免疫 １．抗原吸着 ＡＡ’（ＯＨ）ｓとしてのアラム（０，０５ｗｇ）　（アベロ・ラボライライズ 、マドリド、スペイン）をｌＬｆ単位の破傷風トキソイド（保存溶液、８１．ｆ 単位／ＩＩｌ、コンノート・ラボ）と混合した。吸着は３０分間（２５℃で１０ 分ロッキングし２０分放置）実施した。

２、免疫プロトコール 免疫プロトコールは以下の表８に要約される。ウサギは、０日及び２８日に０． ７４ｍ／／ウサギの各４つの用量形をＳＣ注射した。

３．８　２Ｌｆアラム吸着ＴＴ＋　２００．０００単位のＩＬ−２リポソーム１ ．２　２Ｌｆアラム吸看ＴＴ　＋　ＦＩＢＳＳ４．５　２Ｌｆ非吸着買＋２００ ．０００単位のＩＬ−２リポソーム７．１０　２Ｌｆ非吸着ＴＴ　＋　ｏｓｓウ サギは、５６及び７０日に抗体応答のレベル及び持続性をアツセーするために採 血した。血清をＮＦＤＭ／ＤＰＢＳでに８０に希釈し、上に記載したエリサ手順 によりアッセーした。アツセーの結果は、最初の注射後５６日目及び７０日目の いずれも高い持続性の抗ＨＩＶ力価を示し、第３図に要約される。

実施例６ Ｂ型肝炎抗原との組合せでマウスに投与した場合のＩＬ−２リポソームのアジュ バント有効性 Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をメルク・インコーホレーテッドから入手した 、Ａ／ＪマウスをＩＬ−２リポソーム（免疫当り５ｏ、ｏｏｏ単位）と混合した ０、１ｍｃｇＨＢｓＡｇで、０．５及び１９日に免疫した。マウスは０．０５ｃ ｃを各後足内証に受けた。ラジオイムノアッセー（アボット）により測定した抗 体力価はＩ　Ｌ−２リポソームを用いると有意に高い抗体力価を示した。遅延型 高血圧（ＤＴＨ）により示されるように、細胞免疫応答も、ＩＬ−２リポソーム を使用した場合、有意に高かった。ＨＢｓＡｇに対するＤＴＨは、０，９％Ｎａ ＣＪ中１ｍｃｇ　ＨＢｓＡｇ　（０，０５ｃｃ＝容量）を右耳に、０．９％Ｎａ Ｃｌのみを左耳に注射することにより測定した。耳の厚さをミクロメーターを用 いて注射の２４時間後に測定した。結果は以下の表９に要約され、Ｂ型肝炎抗原 のみに比べＢ型肝炎／リポソームＩＬ−２ワクチン処方の接種による免疫応答で 有意の改善を示す。

なしくＨＢＳＳ）　４　２．０　０．９　−−−ＩＬ−２リポソーム　５　３９ ．３　１９゜５　０．００７なしくＨＢＳＳ）　５　０．０１８　０．０２８　 ０．２２１　−−−ＩＬ−２リポソーム　４　０．０９５　０．０３７　０．０ １４　０．００９５各グループのマウスの数 ５アボツトＲＩＡキツトで提供される基準標準を用いて測定した特異的抗ＨＢｓ Ａｇ抗体のミリ国際単位０スチユーデント非対合を検定 １対合を検定（グループ内） ２弁封合を検定（グループ間） 実施例７ ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）抗原との組合せでマウスに投与した場合のＩＬ −２リポソームのアジュバント有効性ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）抗原をバ イオデザイン・インコーホレイテッド（ゲンバンクポート・メーン）から精製ウ ィルス溶解物（１ｍｇ）として得た。ウィルス溶解物は少量のｇｐ４１とコア蛋 白を含むがｇｐ１２０は検出できなかった。ＨＩＶ抗原で免疫したバルブＣマウ スにおいて、液性及び細胞免疫応答へのＩＬ−２リポソームの有意なアジュバン ト効果を示した。１０マウスのグループを、ＨＢＳＳ又はＩＬ−２リポソーム（ 免疫当り７５．０００単位）と混合して０．１ｍｃｇ、０．５ｍｃｇ及び２．５ ｍｃｇＨＩＶ抗原を、０．７及び２１日に皮肉に（足肚）免疫した。各後足祉に ｓ　１．２ｍｇベンドパルビタールで麻酔後０．０５ｃｃ注射した。３３日目に 、５匹のマウスから血清を得、抗ＨＩＶ力価をジエネティック・システムズ・Ｅ ＩＡキットを用いて測定した。ＨＩＶ抗原に体する免疫応答を、０．９％ＮａＣ １（０，０５ｃｃ二容量゛　）中、１ｍｃｇＨＩＶ抗原で右耳を、０．９％Ｎａ Ｃ１のみで左耳を注射して測定した。耳の厚さはミクロメーターを用いて注射後 ２４時間目に測定した。結果は以下の表１０および１１に示され、ＨＩＶワクチ ン処方中のＩＬ−２リポソームの取込みで、液性及び細胞免疫応答において有意 な増加を示す。

抗原　抗ＨＩＶ力価。

用量（ｍｃｇ）　アジュバント　壬＄　ｓｄ（Ｉｇ）　」ら−Ｑ、ｌ　！ｌｌＢ ｓ５（なし）０．０９２　０．０２１０．１　ＩＬ−２リポソーム　０．７９５ 　０．２８１　＜０．００１０．５　ＨＢＳＳ（なし）　０．２３３　０．１２ ３０．５　ＩＬ−２リポソーム　０．５９４　０．１５８　＜０．００１２．５ 　ＨＢＳＳ　（なし）　０．１６３　０．０４０２．５　ＩＬ−２リポソーム　 １．０１０　０．３１４　＜０．００１″ンエネテイツク・システムズ平板読取 り器上４５０ｍｍでの吸光度。各マウスの血清試料を、シエネティック・システ ムズ酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を用いる特異的抗ＨＩＶ抗体の測定前に１．７５ に希釈した。

５同一用量の抗原で免疫したマウスのグループ間のスチューデン轟Ｕ ＩＬ−２リポソームにより増加した抗ＨＩＶ細胞免疫応答抗原 里！ぶ駈〔アジュバント　蓋、　Ｅ、　Ｔ、　Ｄ、　’　村Ω〔」亡−」亡−〇 、Ｉ　ＨＢＳＳ（すり、）　０．０１４　０．０３３　０．２９４　−−−０、 Ｉ　ＩＬ−２リｊソ−ム　０．１００　０．０２２　０．００７　０．００７０ ．５　ＨＢＳＳ（ナシ）　０．０３０　０．０２１　０．０９９　−−−０．５ 　比−２リポソーム　０．１２６　０．０４３　０．０１１　０．０１０５同一 用量の抗原で免疫したマウスのグループ間のスチューデント非対合を検定 ’ＨＩＶ試験耳試験対価性の食塩水対照写と比較したスチューブ杭ＣＤ３＋ＩＬ −２細胞の培養 ６−１２週のＣ５７ＢＬ／６マウスからの牌細胞を、無菌ガラスストッパーで膵 臓をゆっ（りとつぶし、５ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、５％ウシ胎 児血清、Ｎｌ当たり１００単位ペニシリン、ｍｌ当たり１００ミリグラムのスト レプトマイシン、１０ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム（ジ ブコ、グランド・アイランド、ニューヨーク）及び２５ミクロモル２−メルカプ トエタノール（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス・ミズウリ）を含 む、ＲＰＭ１１６４０補足（シブコ、グランド・アイランド、ニューヨーク）か らなる組織培養培地の懸濁液より得た。膵臓細胞懸濁液から得た巨大分子細胞を ナイテックススクリーンを通して濾過し、次いでフィコール−ハイパツク（ファ ルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャーシイ）で遠心分離し、巨大分子調製物 を得た。界面細胞を集めて組織培養培地で２回洗浄し、次いで、１４５−２Ｃ１ １ネズミ抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２（冨ｉ当り３００単位）を補助した組織培養 培地を入れたフラスコに移した。オウ、レオ著、プロシーディンゲス、ナショナ ル・アカデミイ・オブ・サイエンス・オブ・ニーニスエイ、８４．１３７４　（ １９８７）参照。最初の細胞の密度は、ｍｌ当り０．５　Ｘ　１０’細胞であっ た。これらを湿った５％ＣＤ、雰囲気中３７℃でインキュベートした。細胞を５ ．７及び９日目に集め、投与した。即ち、腹腔内ルートを用いて、各腫瘍を有す るマウスに０．２ｃｃの容量で養子移入した。これらのマウスは予め０．５ｘｌ Ｏ’ＭＣ−３８：結腸マデノカルシノーマ細胞を０日目に膵臓内に注射し、３． ５及び７日に養子関係細胞でｉｐに処置した。あるマウスは、又、ＩＬ−２リポ ソームで１日１回（１０，０００から５０，０００単位までの範囲の用量）で、 ３日から７日にかけて、０．２ｃｃｉｐで処置した。腫瘍接種後１１１日目、マ ウスを魚汁で超腸間膜静脈注射し、肝臓移転を直接数えることにより膵臓移転の 存在を評価した。空のリポソーム、細胞のみ、細胞プラスＩＬ−２、又はＩＬ− ２リポソームのみで処置した動物は、肝臓移転の数について有意な減少を示さな かった。ただ、抗ＣＤ３＋ＩＬ−２細胞及びＩＬ−２リポソームの組合わせを用 いた場合のみ、肝臓移転に有意な減少が見られた。用量応答パターンが治療のリ ポソーム及び細胞腕に存在した。即ち、移転のすぐれた減少がＩＬ−２リポソー ム及び細胞の用量を増加することで見られた。表１２−１４参照。

表１２ 抗ＣＤ３＋ＩＬ−２刺激細胞及び ＩＬ−２リポソームの相乗的抗腫瘍効果ＭＣ−３８肝臓移転の数 処置°　王抱　組σ〔」ら一 対照（空のリポソーム）　２４３　２１　Ｎ５５０、０００単位ＩＬ−２リポソ ーム　２３８　１９　Ｎ５５０、０００．０００細胞×３（細胞のみ）　２３７ 　２２　ＮＳ”ＭＣ−３８肝臓移転のマウスのグループは、１日１回、３日目か ら７日目まで空のリポソーム（対照）又はＩＬ−２リポソームのみと、３．５及 び７日に細胞のみと、３日目から７日目までフリーＩＬ−２プラスで、３．５及 び７日に細胞と、３日目から７日目までＩＬ−２リポソームプラスで、３．５及 び７日に細胞で処置した。

５処置結果をスチューデント１検定を用いて比較した。

ＮＳ＝有意でない 対照（空のリポソーム）２１０　４４　−−−１０、０００単位　１６５　６７ 　０．０１７２５、０００単位　１３８　６３　０．０２５０、０００単位　４ ６　３２　０．００１ループ）を５×１０７抗ＣＤ３＋ＩＬ−２ｍＦｉ１ｍ’、 ｍｓ接ａ後３．５及び７日目にｉｐ処置した。マウスは又、１日１回、３日目か ら７日目にかけて、上に示される用量でリポソーム中工Ｌ−２をｉｐで受けた ５処置結果は、スチューデントを検定を用いて対照群（空のリポソーム）と比較 した。

対照（なし）　２３２　２３　−−− １０．０００．０００　２０４　３９　０．０６２５．０００，０００　１２６ 　６２　＞ｏ、ｏｏｉ５０．０００．０００　６０　２９　＞０．００１日目ま で、５０．０００単位ＩＬ−２リポソームでｉｐ処置し、又、表に示すように種 々の数の養子移転した抗ＣＤ３＋ＩＬ−２刺激細胞で処置した。

即ち、ＩＬ−２リポソームの包投固定は、有意の抗腫瘍とアジュバント有効性を 有する組成物となる。Ｉ　Ｌ−２以外の数多くの組換えサイトカインも入手可能 であるから、同様の方法を用いるリポソームが、癌及びワクチン研究における免 疫応答修飾剤の治療有効性を増加するのに用いることが可能である。

本発明を種々の特異的及び好ましい態様並びに技術を引用して記載した。しかし ながら、多くの変更及び修飾をなし得、本発明の精神及び範囲内にあることが理 解されるべきである。引例の関連部分を引用して明細書記載の一部とする。

ＦＩＧ、　１ 日 ＦＩＧ、　３ 日 咽、収 Ｑ灸ψス ０　００　ロ　。　−− ＯＮ　ａ　ｃｎ　’ｃｎ　ｏ〜 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年４月２６日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．免疫原性的に有効量のワクチン抗原と有効な免疫アジュバントの、リボソー ム含有インターロイキン−２（ＩＬ−２）を含み、製薬上許容しうる液体担体と 組合せたワクチン。 ２．有効な免疫アジュバント量のＩＬ−２をリボソームに取込むことを含む、イ ンターロイキン−２（ＩＬ−２）の免疫アジュバント効力の増強方法。 ３．有効な抗腫瘍量のＩＬ−２をリボソームに取込むことを含む、インターロイ キン−２（ＩＬ−２）の抗腫瘍効力の増強方法。 ４．抗腫瘍効果が肺転移に対し増加される請求項３の方法。 ５．リボソーム中のＩＬ−２が肺管内に投与される請求項４の方法６．有効量の 活性化細胞とＩＬ−２リボソームをインビボで投与し、該細胞がＩＬ−２とリン パ球表面受容体に対する抗体で刺激されていることを含む転移に対する抗腫瘍処 置。 ７．細胞を刺激するために用いたリンパ球表面受容体に対する抗体がＣＤ３コン プレックスを結合するモノクローナル抗体である、請求項６の処置。 ８．転移が肺及び肝臓転移である請求項７の処置。 ９．転移が肺及び肝臓転移である請求項６の処置。