DD281296A7 - Verfahren zur herstellung eines impfstoffes gegen bordetella-bronchiseptca-infektionen - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur Gewinnung von Biomasse und die Herstellung eines Impfstoffes gegen Bordetella-bronchiseptica-Infektionen basiert auf einem normalen Fermentationsverfahren, unter Verwendung eines speziellen Komplexmediums, bei dem alle Substanzen mit protektiven Eigenschaften (Fimbrien, Exotoxin, Haemolysin, Kapsel) gebildet werden. Diese Substanzen, vom Ballast befreit, sind gleichfalls nach Versetzen mit einem Adjuvans als Impfstoff einsetzbar.

Description

erfolgt. Die B. br.-Stämrne (der Phase I) werden im normalen Fermentationsverfahren ohne Rühren als Mischkultur gezüchtet, nach bekannten Methoden inaktiviert, denn das gebildete und zum Teil sich im Nährmedium befindliche B. br.-Exotoxin wird bei der Inaktivierung in ein immunologisch wirksames Toxoid überführt und an einem Adjuvans angelagert. Die Bordetellenkultur, die Substanzen mit protektiven Eigenschaften (Fimbrien, hitzelabiles Exotoxin, Hämolysin, Kapsel) enthält, kann nach bekannten Verfahren vom Ballast befreit und dio Substanzen wie dargelegt an einem Adjuvans angelagert werden. Die zur Gewinnung der erforderlichen protektiven Biomasse ausgewählten Stämme befinden sich in Phase I und besitzen folgende Eigenschaften:

- nach der Kultivierung 60-60% bekapselt und gute Fimbrienbildung

- zeigen im Parmoquant eine elektrophoretische Beweglichkeit von 1,2-1,7 χ 10^a In²V^-1S"¹

- hämolytisch auf 10%igem Hammelblutagar

- hohe Toxizität und Letalität im Lienotoxtest an der Maus -- weisen serologisch die K-Antigene 7-14 auf

- besitzen gute Hämagglutinationstiter gegen Hammelerythrozyten

- weisen als abgetötete Bakteriensuspension eine statistisch gesicherte Schutzwirkung im Lienotox-Schutztest an der Maus und im Meerschweinchen-Schutzversuch im Vergleich zu den Kontrolltieren auf.

Die Gewinnung der protektiven Biomasse erfolgt im Fermentationsverfahren mit einem Medium, das sowohl eine hohe Biomasse durch die Konzentration an Gesamt-Glutarninsäure und Gesamt-Prolin als auch eine gesicherte Biosynthese der Kapsel durch die niedermolekularen Peptide und B-Vitamine des Mediums, der Fimbrien durch die niedermolekularen Inhaltsstoffe des Fleisches, insbesondere Taurin, die hohe Glutaminsäurekonzentration bei geringer Belüftungsrate und des Exotoxins durch die Verwendung eines Fleisch- oder Fibrintrypton in Verbindung mit einem geeigneten Hefeextrakt bei hoher Sauerstoffsättigung garantiert. Als N-Quolle wird tierisches Trypton, z. B. Fleisch vom Pferd oder Rind, pankreatisch gespalten (mit Pankreasdrüsen), als Quelle von Wirkstoffen wird Hefeextrakt neben einigen bekannten anorganischen Salzen verwendet. Zur Erzeugung der Biomasse mit ausgebildeten protektischen Antigenen kann in jedem normal ausgerüsteten Fermenter kultiviert werden, wenn folgende Bedingungen eingehalten werden:

- Arbeitsvolumen des Fermenters: ²h seines Bruttovolumens

- keine Rührung der Kultur

- Belüftung: 751 Luft/l Arbeitsvolumen

Als Adjuvantien können Verwendung finden: AI(OH)₃, AIPO₄, ein Gemisch von beiden und Öle nulsionen. Die Verabfolgung des Impfstoffes kann mit anderen bakteriellen Impfstoffen erfolgen. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur Bildung von Biomasse, die zur Herstellung eines sehr gut wirksamen Ii ipfstoffes gegen Bordetella-bronchiseptica-lnfektionen und als Teilkomponente eines Impfstoffes (mischbar als Kombinationsimpfstoff oder als assoziierter Impfstoff) gegen respiratorische Erkrankungen der Tiere geeignet ist. Der Impfstoff ist nach diesem Verfahren apparativ und finanziell ohne großen Aufwand herzustellen.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Stammcharakteristika

Zur Herstellung des Bordetella-bronchiseptica-lmpfstoffes haben die verwendeten Stämme folgende stammspezifischen Merkmale:

- Urease, Nitrat und Katalase positiv

- hämolytisch auf 10%igem Hammelblutagar

- gramnegative Stäbchen

- Nach Pas.sagierung auf Bordet-Gengou-Schrägagar und anschließender Inkubation in 8/83-Medium müssen die Standkulturen nach 20 Stunden eine Bekapselung von 60-80% aufweisen und fimbriniert sein.

- Wachstum in Phase I (72-96 h-Kultur auf McConkey-Agar: konkave Kolonien mit deutlichem Kolonienzentrum und scharfem Kolonienrand)

- Hämagglutinationstiter von 1:64 bis 256 als Ausdruck einer guten Fimbrienbildung: Lebendantigan von 10'° Keimen (1%igo Hammelerythrozytensuspension)

- Exotoxinbildung: Bei 2-5 χ 10⁸ Keimen Mäuseletalität vjn 1:16 und mehr und Milzmassereduktion im Vergleich zu Kontrolltieren.

- besitzen gute Schulzeigenschaften im Lienotox-Schützte U und Meerschweinchen-Schutzversuch.

Lienoto? ' utztest:

4 Mäusegruppen von mindestens 10 Tieren (Km > 18,0{|) werr.en mit einer abgetöteten Bakteriensuspension von etwa 10'° Keimen sowie in den Verdünnungen 1:10,1:100uno' 1:1030zweimal im Abstand von 14 Tagen in einer Dosis von 0,5ml s.c. immunisiert. 8-10 Tage danach werden sie einer intravenösen Belastung mit 2-5 χ 10⁸ Keimen eines virulenten B.br.-Stammes unterzogen. Eine Kontrollgruppe von ebenfalls mindestens 10 Tierer ι wird in gleicher Weise infiziert.

Eine gute immunogene Wirkung liegt vor, wenn die Tiere bszüglich der Letaütät in den Gruppen mit unverdünnter, 1:10 und 1:100 verdünnter Bakteriensuspension einen statistisch gesicherten Unterschied zu den Kontrollen aufweisen, die im allgemeinen eine 100%ige, jedoch mindestens 80%ige Letalität aufweisen müssen.

Meerschweinchen-Schutztest:

7 Meerschweinchen werden mit 5 bis 10 χ 10⁹ inaktivierten Keimen zweimal im Abstand von 14 Tagen immunisiert. 10 Tage p. vacc. werden diese und 7 Kontrollen mit 10⁷·⁶ Keimen intratracheal belastet. Die Auswertung erfolgt am 8. Tage nach der Infektion unter Berücksichtigung der Verendungen und Schwere der Lungenveränderungen. Zwischen beiden Gruppen muß ein statistisch zu erkennender Unterschied z. B. im Rangzahltest nachweisbar sein.

- Die elektrophoretisch^ Beweglichkeit ist wie folgt: ZIMET-Nr. 11002-1,40-1,60 x 10⁸ITiW¹ (s = 15%) ZIMET-Nr.11003-1,30-1,50 x KrOnW¹ (s = 10%) ZIMET-Nr.11004-1,45-1,65 x 10'mW¹ (8 = 8%)

Beispiel 2

Zur Gewinnung der Biomasse als Grundlage des Impfstoffes wird ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung verwendet

Nährboden 8/83

Fleischtrypton vom Pferd oder Rind 35,0

Hefeextrakt 5,0

Na₂HPO₄ x 12H₂O 5,0

MgSO₄ x 7H₂O 0,2

MnSO₄ 0,05

pH 7,4-7,6

Beispiel 3

Zur Gewinnung der Biomasse als Grundlage des Impfstoffes wird ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung verwendet

M!ncatose-40-B-Med!um

Fibrintrypton 8,0

Hefeextrakt 22,0

Caseinhydrolysat 10,0

Na₂HPO₄ χ 12H₂O 5,0

MgSO₄ χ 7H₂O 0,2

MnSO₄ 0,05

pH 7,4-7,6

Beispiel 4

Zur Gewinnung von Bordetella-bronchiseptica-Biomasse kann jeder normale Fermenter genutzt werden. Der Fermenter wird nur zu Vj gefüllt, um möglichst wenig Entschäumer einzusetzen (0,6ml χ Γ Nährmedium als Maximum). Zur Anzüchtung der Vorkultur wird ein Kölbchon (100ml Nährboden 6/83) vom Bordet-Gengou-Schragagai. jhrchen (1,5% Agar) beimpft und Stunden bebrütet. Von dem Kölbchen wird in eine 10-I-Flasche mit 618/83 Nährboden überimpft. Diese wird 48 Stunden bebrütet. Nach Prüfung der Kultur auf Reinheit wird damit der Fermenter beimpft. Kultiviert wird ohne Rührung und 30-751 Luft/h/l Nährmedium über eine Zeit von 18-22 Stunden. Die Kultur erreicht dann eine Dichte von 5-12 x 10⁹ Koimen/ml und 1-1,5g TM/l.

Beispiel 5

Die nach Beispiel 3 hergestellte Bakterienmasse wird zur Abtötung mit Formaünlösung versetzt, Endkonzentration 0,2%. Es kann auch Glutaraldehyd Verwendung finden. Nach positivem Ausfall der Sterilitätsprobe gibt man 10% Aluminiumhydroxid als Adjuvans hinzu, und der Impfstoff ist einsatzbereit. Die Konservierung des Impfstoffes kann mit Phenol oder Thiomersal erfolgen.

Beispiel 6

- Immunisierung gegen Rhinitis atrophicans und Pneumonien des Schweines:

• Muttertierimmunisierung: Verbesserung der kolostralen Immunität der Ferkel.

4 bis 6 Wochen iowie 2-3 Wochen a.p. mit einer Menge von 1OmK= 50-100 χ 10^ä Keime) subkutan.

• Jungtierimmunisierung

10. bis 14. und 32. bis 35.Lebenstag mit 3ml subkutan!= 15-30 χ 10⁹ Keims).

- Immunisierung von Meerschweinchen

Meerschweinchen 'ib einem Gewicht von 150-250g werden zweimal mit 1,0ml (= 5-10 χ 10⁹ Keimen) im Abstand von 14 Tagen immunisiert.

- Immunisierung von Kaninchen

• Muttertierimmunisierung

2. und4.Wcchea.p. mit 2,0ml(a 10-20 χ 10⁹ Keimen) subkutan.

• Jungtierimmunisierung

Zum Zeitpunkt des Absetzens mit 0,5 ml und 14 Tage danach mit 1,0ml subkutan.

Beispiel 7

Die nach Beispiel 3 hergestellte Bakterienmasse von B. br. wird zur Abtrennung der Ballaststorfe und Isolierung der Stoffe mit protective!! Eigenschaften (Fimbrien, Kapsel, Exotoxin) nach den bekannten Verfahren für Enterobacteriaceen behandelt. Die Wirkstofflösung aus Bordetella bronchiseptica wird entsprechend der erforderlichen Keimzahl durch Ultrafiltration konzentriert. Stoffe mit einem MG < 30000 werden dabei entfernt.

Claims (1)

1. Verfahren ζ· > .... ' rg eines Impfstoffes gegen Bordetella-bronchiseptica-lnfektionen durch Vermehrur.t, von Bcrdetnlla-bronchiseptica-Stämmen in einer Mischkultivierung ohne Rühren, nachfolgender Abtötung und Adsorbierung der kompletten Zellen oder nur deren Stoffe mit protektiven Eigenschaften an einem Adjuvans, gekennzeichnet dadurch, daß Bordetellabronchiseptica-Stämme der ZIMET-Nr. 11002,11003 und 11004 der Phase I eingesetzt werden, wobei die Biomassegewinnung mit einem Nährmedium, bestehend aus Fleischtrypton bz*". Fibrinpepton mit Caseintotalhydrolysat und Hefeextrakt, Mg- und Mn-Salzen sowie Na₂HPO₄ x 12H₂O erfolgt.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung immunogener Bordetella-bronchiseptica-Biomasse als Grundlage für einen wirksamen Impfstoff für die Veterinärmedizin.

   Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

   Bordetella-bronchiseptica (B. br.) verursacht bei zahlreichen Tieren respiratorische Erkrankungen. Von besonderer volkswirtschaftlicher Bedeutung sind die infektiöse Rhinitis atrophicans und enzootische Pneumonie des Schweines wegen ihrer weiten Verbreitung in unseren Schweinebeständen. An beiden Erkrankungsformen sind bestimmte B. br.-Stämme mit speziellen biologischen Eigenschaften wesentlich beteiligt. Die erkrankten Tiere, insbesondere Schweine, weisen 12-15% geringere Körpermasseiunahmsn auf. Daraus ergibt sich die große ökonomische Bedeutung der Bekämpfung dieses Krankheitsgeschehens durch einen entsprechenden Impfstoff. Solche Impfstoffe müssen in ihrem Wirksamkeitsprinzip die Pathogenese der genennten Erkrankungen berücksichtigen. An der Entstehung der Rhinitis atrophicans ist im wesentlichen ein von B. br. gebildetes Exotoxin entscheidend, das u. a. auch protektive Eigenschaften besitzt. Bislang sind sowohl Totimpfstoffe, DE AS 2212277 und US 4.016.253, als auch Lebendimpfstoffe, US 4.225.583, beschrieben worden. Den beschriebenen Verfahren, haften drei wesentliche Nachteile an. Erstens werden zu den Paramete.n, die die Schutzwirkung ausmachen (Kapsel-, Exotoxin- und Fimbrienbildung), keine Angaben gemacht, so daß die Wirkung der mit diesen En igern hergestellten Vakzine zweifelhaft erscheint. Zweitens ist bei Enterobacteriaceen bekannt, daß ballastfreie Impfstoffe, die Stoffe mit protektiven Eigenschäften enthalten, eine hohe Schutzwirkung und Verträglichkeit besitzen (OCKLITZ et al. Patentschrift DD 62894 vom 20.7.1968 und OCKLITZ et al. DD 111585 vom 20.5.75). Deshalb ist davon auszugehen, daß Stoffe mit immunogenen Eigenschaften (Fimbrien, Kapsel, Hämolysin und Exotoxin) auch bei Ei.br. von großer Bedeutung sind und vorhanden sein müssen. Drittens bestehen die Nährböden aus kommerziellen Bestandteilen, ohne an die spezifischen Nährstoffbedürfnisse von B. br. angepaßt zu sein. Van HEMERT, Dissertation 1971 UTRECHT, NL, beschreibt für Bordetelien einen Nährboden, bestehend aus Caseintotalhvdrolysat, Hefeextrakt, Stärke und verschiedenen Salzen. Dieser wird in geringfügig abgeänderter Form auch von MEBEL et al., Patent DD WP 217144, verwendet, ohne zu berücksichtigen, daß Caseintotalhydrolysat als N-Quelle, ohne die in Peptiden gebundenen Aminosäuren, die Kapsel- und Fimbrienbildung nicht unterstützt. Auch der Zusatz von Stä-'xe ist für die Kapselbildung fraglich und wird bei einem Sterilfiltrationsverfahren hinderlich. Die zur Züchtung angegebenen Nährmedien enthalten vielfach hohe Glutaminsäure- und Prolin-Konzentrationen. Um die erforderliche Biomasse zu erhalten, muß vielfach die Biomasse gefällt und abzentrifugiert werden. Dies sind zusätzliche Arbeitsprozesse, die die Impfstoffherstellung komplizieren. Die geforderte hohe Biomassekonzentration (150-180 χ 10⁹Keime/ml) von MEBEL et al., DD-WP 217144, erfordert eine intensive Rührung, die aber zum Abschlagen der Kapsel von der Bakterienzel'e führt, und es ist unsicher, ob diese im Fällungsprozeß mit der Zelle ausgefällt wird. Der nach HCI-Fällung und Zentrifugation erhaltene Überstand der Fermentationskultur besitzt nachweislich immunogene Eigenschaften. Diese gehen bei diesem Herstellungsverfahren der Produktion von noch wirksamen Impfstoffen verloren und müssen durch Applikation von höherer Biomasse bei der Immunisierung ausgeglichen werden. Für keinen Impfstoff erfolgt die Kultivierung dor Bakterienbiomasse mit Nährböden, die gezielt eine hohe Biomasse mit wichtigen immunbiologischen Parametern garantieren. Aufgrund der nicht beeinflußten Regulierung wichtiger immunbiologischer Parameter (Kapsel, Exotoxin, Hämolysin, Fimbrien) und der Biomassebildung sind die bisher beschriebenen Verfahren in der Wirkung als unzulässig anzusehen.

   Ziel der Erfindung

   Ziel der Erfindung ist es, einen wirksamen Impfstoff gegen Bordetella-bronchiseptica Infektionen bei Tieren herzustellen, der nachweisbar die immunbiologischen Parameter für eine hohe Wirksamkeit besitzt.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Aufgabe der Erfindung ist es, zur Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes die geeigneten Stämme, für diese Stämme die geeigneten Kultivierungsbedingungen und Form der Gewinnung von Substanzen mit protektiven Eigenschaften zu suchen. Erfindungsgemäß wird die Aufgebe dadurch gelöst, daß Bordetella-bronchiseptica-Stämme der ZIMET-Nr. 11002,11003 und 11004 (hinterlegt im Zentralinstitut für Mikiobiologie und experimentelle Therapie Jena) der Phase I eingesetzt werden, wobei die Biomassegewinnung mit den erforderlichen pro\ektiven Eigenschaften mit einem Nährmedium, bestehend aus Fleischtrypton bzw. Fibrintrypton mit Cassintotalhydrolysat und Hefeextrakt als Quelle für Nährstoffe und Wachstumsfaktoren,