CA1091582A

CA1091582A - Medicament immunostimulant et son procede de preparation

Info

Publication number: CA1091582A
Application number: CA279,825A
Authority: CA
Inventors: Gerard Ayme
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1976-06-04
Filing date: 1977-06-03
Publication date: 1980-12-16
Also published as: GB1583889A; DE2725204A1; FR2374042B1; US4182751A; BE855357A; NL7706174A; DE2725204C2; FR2374042A1; US4337243A

Abstract

L'invention a pour objet un médicament susceptible d'être utilisé dans le domaine très large des luttes contre les agents infectieux, à chaque fois qu'il s'agit d'augmenter le niveau de résistance des défenses immunitaires, par exemple contre les affections tumorales, et susceptible d'être associé à d'autres moyens de lutte contre les agressions, par exemple pour augmenter l'activité des vaccins, pour renforcer l'activité des antibiotiques en diminuant leurs doses ou pour agir en synergie avec certains agents antitumoraux. Ce médicament caractérisé en ce qu'il comporte un extrait ou une fraction d'extrait phénosoluble d'un ou plusieurs des micro-organismes monocellulaires suivants: bactéries choisies par exemple dans le groupe formé par : Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis, et Klebsiella pneumoniae, ou levures, ou protozoaires, ledit extrait ou fraction étant rendu hydrosoluble, exempt d'endotoxine et étant sensiblement exempt de phénol et dosé à une quantité stimulant l'organisme receveur, peut être obtenu en effectuant sur un microorganisme tel qu'une bactérie, levure ou protozoaire, une extraction à l'aide de phénol liquide à la température d'extraction inférieure à 70.degree.C, puis après avoir recueilli la phase phénolique, en éliminant le phénol, et enfin en rendant l'extrait hydrosoluble.

Description

109~58Z

La présente invention a trait à un médicament nouveau remarquable par ses propriétés de stimulation de l'immunité non spécifique.
L'invention a également trait à un procédé pour la préparation de ce médicament.
La présente invention se propose de fournir à titre de produit nouveau, un médicament stimulant de l'immunité non spéci-fique, représenté par un extrait purifié d'origine bactérienne, de nature protéique et physico-chimiquement définie.
0 On sait déjà, notamment d'après le brevet US 3.483.290, qu'il est possible d'obtenir des préparations stimulantes de l'immunité par extraction au phénol de matériaux bactériens et notamment protoplasmiques, notamment d'escherichia coli, cet extrait étant débarrassé du phénol par précipitation alcoolique. Cepen-dant le procédé décrit ne permet pas d'éliminer de fa~con suffisante l'endotoxine lipopolysaccharidique ce qui entraîne des effets pyrogènes et toxiques empêchant de parvenir à un véritable médicament. Certes le procédé du brevet US précité cherche à
limiter la contamination par l'endotoxine en partant principalement du protoplasme après broyage des cellules. Ceci ne suffit cepen-dant pas à assurer une élimination suffisante car la contamination subsiste même si le taux d'endotoxine est relativement faible.
En outre ce procédé aboutit à un extrait par définition insoluble dans l'eau, ce qui empêche en fait d'obtenir une puri-fication ultérieure suffisante et interdit la préparation de médicaments véritablement contrôlables.
La présente invention se propose donc d'aller bien au-del,~ de cet enseignement et de fournir un nouveau médicament pratique, sûr et contrôlable.
Ce médicament offre aussi bien à la médecine humaine que vétérinaire une arme susceptible d'être utilisée dans le domaine très large des luttes contre les agents infectieux, et lV91582 chaque fois qu'il s'agit d'augmenter le niveau de résistance des défenses immunitaires, par exemple contre les affections tumorales.
Il peut également être associé à d'autres moyens de lutte contre les agressions, par exemple pour augmenter l'activité des vaccins, pour renforcer l'activité des antibiotiques en diminuant leurs doses ou pour agir en synergie avec certains agents antitumoraux.
Ce médicament ne possède qu'une tox cité suffisamment faible pour être négligeable aux doses efficaces et permettre les traitements répétitifs.

En outre, le médicament selon l'invention présente une grande stabilité, facilitant ainsi la conservation et l'usage.
Il peut être stérilisé par exemple par filtration et/ou chauffage.
Enfin, l'invention se propose de fournir un procédé
pour la fabrication de ce médicament, ledit procédé présentant l'avantage d'être simple, peu coûteux, facile à mettre en oeuvre et susceptible de faire très facilement l'objet de nombreuses variantes, procurant ainsi une grande adaptabilité du procédé.
L'invention a pour objet un nouveau médicament stimulant de l'immunité non spécifique contenant un extrait phénolosoluble de microorganisme caractérisé par le fait qu'il comporte l'extrait phénolosoluble, ou une fraction de cet extrait, d'un ou plusieurs des microorganismes monocellulaires suivants : bactéries, levures et protozoaires, ledit extrait ou fraction étant rendu hydroso-luble et exempt d'endotoxine et étant sensiblement exempt de phénol et dosé à une quantité stimulant l'organisme receveur.
Dans une première forme de réalisation, le médicament comporte un extrait, ou une fraction d'extrait, phénolosoluble de - bactéries ou de mycobactéries.
Parmi les bactéries, on préfère :

Neisseria meningitidis, Proteus nirabilis, Bordetella Pertussis, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter anitratus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Brucella abortus, 1()9~S8Z

corynebacterium pseudodiphteria, Corynebacterium parvum, Staphylococcus aureus.
De fa~on particulièrement préférée, le médicament peut comporter un extrait de Neisseria meningitidis serogroupe A, Neisseria meningitidis serogroupe C, Proteus mirabilis ou Kleb-siella pneumoniae.
Dans une autre forme de réalisation, le médicament peut comporter un extrait, ou fraction, de mycobactéries, et de préfé-rence Mycobacterium phlei, Mucobacterium I~ansasii, M.scrofulaceum, M.intracellulare, M.fortuitum.
Dans le cas où le médicament comporte un extrait phéno-losoluble de levure, on préfère des extraits de Saccharomycès Cerevesiae.
Le médicament selon l'invention peut être assoclé à
d'autres produits ou compositions pharmaceutiques, tels que cory-nebactérium parvum, antibiotiques, antimitotiques, corticoides, vitamines et également à des vaccins divers, par exemple contre la grippe, contre la coqueluche, la poliomyélite, la rougeole, la rubéole, les anatoxines tétaniques et diphtériques, les polysac-charides méningococcyques, soit seuls soit associés.
Le médicament selon l'invention peut se présenter de différentes manières, par exemple sous forme injectable, par exemple sous forme d'une solution ou suspension dans une eau physi-ologique ou dans un excipient huileux ou encore d'une émulsion huile-dans-l'eau ou eau-dans-l'huile, soit sous forme lyophilisée soit sous forme d'aérosols, soit sous forme buvable, soit sous forme administrable par voie rectale. I1 peut avantageusement comporter un adjuvant sur lequel il est de préférence adsorbé, par exemple sur hydroxyde d'aluminium.
3b Le médicament peut également se présenter sous forme de pommade à l'aide d'un excipient habituel convenable.
Les doses à administrer dépendent de l'affection à

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traiter, de la nature du traitement et de l'organisme qui subit le traitement. Cette dose peut être laissée sans difficulté ~
l'appréciation du médecin ou du vétérinaire comme cela se fait, de fac,on bien connue, dans les traitements de stimulation de l'immunité.
A titre d'exemple, la dose peut comporter de 10 à 1000 microgrammes en poids sec d'extrait et pour le traitement humain une dose convenable peut être de l'ordre de 400 microgrammes.
L'administration du médicament peut notamment se faire par voie externe, par exemple sous forme de pommade ou de pulvé-risation, par voie sous-cutanée, intradermique, parentérale, intrapéritonéale, ou intramusculaire ou encore par inhalation sous forme d'aérosol, ou par voie orale ou rectale.
Le médicament selon l'invention est adapté notamment au traitement par stimulation de l'immunité non spécifique des brûlés, des traumatisés, ou des organismes sans défense immuno-logique. Il peut également être utilisé à titre préventif ou curatif dans un environnement infectieux, par exemple pour les infections banales ou pour éviter des complications subséquentes à des affections virales ou tumorales.
Le médicament selon l'invention ne présente qu'une toxicité faible variant assez peu en fonction du microorganisme utilisé, comme le montrent le test du gain de poids chez la souris, l'étude du pouvoir sensibilisant chez le lapin et le cobaye et les essais de toxicité chronique sur les porcelets, les veaux et les bovins adultes.
Le médicament selon l'invention agit notamment par la stimulation du système immunitaire non spécifique. Il présente une activité antibactérienne notable ainsi qu'une activité anti-virale. Il présente une excellente protection contre les surin-fections bactériennes au cours d'une affection virale. Il possède un pouvoir inducteur d'interféron. Il provoque une montée impor-tante du taux d~anticorps circulants hétéxologues~
Il présente également une lm~ortante actiVité cellu-laire, La phagocytose est f~ortement stimulée et on note une ex-haltation de la réaction du greffon contre l'hôte et un effet mitog8ne notamment sur le lymphocyte humain.
L'in~ention a agalement pour objet un procédé de pré-paration du médicament selon llinvention, caractérisé par le fait que l'on effectue sur au moins un microorganisme choisi dans le~ groupe constitué par les bactéries, levures et protozoaires, en présence dleau, une extraction a l'aide de phénol liquide o a la température d~extraction, inférieure a 70C, et qu'apres avoir recueilli Ia phase phénolique, on élimine ce phénol, puis on rend l'extrait hydrosoluble à l~aide d'un agent tensioactif ou basique.
Parmi les phénols, on préf8re le phénol lui-même ou éventuellement les crésols et notamment le métacrésol ou le méthyl-3 chloro-4 crésol.
La température est de préference inférieure à 70C et de préférence supérieure a 0C. On peut avantageusement opérer ~ une température comprise entre 60 et 67C.
La durée de l'extraction peut être comprise entre quel-ques minutes et quelques heures. De préférence, elle est comprise entre 30 minutes et 3 heures.
La quantité de phénol par rapport a la quantité d'eau de la suspension initiale peut être quelconque, elle peut être par exemple comprise entre lS et 85%. Cependant on-préfère utiliser la proportion de phénol donnant l'émulsion la plus satisfaisante. Dans le cas du phénol C6H5 OH lui-même, cette proportion préférée est de 45% de phénol.
Dans le cas des bactéries gram - on peut effectuer l'extraction directement sur une suspension bactérienne. Dans le cas des bactéries gram ~ou des mycobactéries, on effectue ~ 5 -B

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d'abord un broyage ou une lyse bactérienne avant de ~rocéder llextraction.
De-préf~rence~ l~extraction se fait en presence d'un ~091582 détergent anionique tel que du dodécylsulfate de sodium par exemple. La présence d'un détergent a pour effet de faciliter les opérations et également de faire disparaître certaines activités sensibilisantes et notamment les endotoxines.
Le pH est pratiquement indifférent, mais on peut faire agir le phénol sur une suspension à pH sensiblement neutre pour des raisons de simplicité.
La séparation entre la phase phénolique et la phase aqueuse peut s'effectuer de facon classique, par exemple soit par centrifugation, soit par séparation directe après décantation, par exemple à l'aide d'une pipette.
La séparation entre phase aqueuse et phase phénolique peut être avantageusement rendue plus aisée et plus complète par addition de sels tels que par exemple MgC12 ou NaCl à concentra-tion élevée. Le sel peut être ajouté soit sous forme cristallisée soit sous forme de solution concentrée et cette addition peut intervenir aussi bien au premier temps de l'extraction qu'après rupture de l'émulsion phénol/eau sur la phase phénolique déjà
décantée afin de la débarrasser de l'eau de saturation. La phase phénolique obtenue, limpide et colorée,peut ~galement être lavée plusieurs fois à l'eau.
Ces opérations permettent d'éliminer pratiquement la totalité des endotoxines, même dans le cas de bactéries gram-comme E. coli, qui sont fortement contaminées.
Ce qui est remarquable c'est que le procédé peut être mis efficacement en oeuvre par une extraction dans des limites extrêmement larges de température, de concentration entre la phase phénolique et la phase aqueuse, de pH, de force ionique.
En outre, les résultats positifs observés pour les extraits des très nombreux microorganismes testés dans le cadre de la présente invention permettent de penser que ces extraits autorisent la préparation de médicaments quelle que soit la lO91S82 souche de bactéries, mycobactéries, ou levures, utilisée.
Après l'extraction on procède à l'élimination du phénol afin de récupérer le matériel actif de nature protéique, dissous dans la phase phénolique. En raison de la grande stabilité physi-cochimique de cet extrait, cette élimination peut être effectuée par de nombreux moyens différents.
Ainsi, dans un premier mode de mise en oeuvre, on peut effectuer une précipitation alcoolique et recueillir le précipité.
Dans un deuxième mode de mise en oeuvre la phase phéno-lique est traitée par un agent précipitant tel que par exemplele polyéthylèneglycol en solution phénolique. Un premier stade de purification peut être obtenu en fonction de la concentration en polyéthylèneglycol qui permet de fractionner la population moléculaire en groupes différents.
Dans un troisième mode de mise en oeuvre l'élimination du phénol peut être effectuée par distillation sous vide.
Au terme des différents procédés précités le produit obtenu est pratiquement exempt de phénol et insoluble dans l'eau.
Après d'éventuels lavages et/ou dialyses pour éliminer les dernières traces de phénol il peut être remis en suspension et homogénéisé dans l'eau ou dans un tampon ou un sérum physiologi-que.
Il supporte un traitement à haute température en auto-clave, par exemple à + 115C durant 30 minutes, aussi bien sous forme de suspension aqueuse que de lyophilisat desséché.
Il peut alors être soumis à un traitement destiné à le rendre hydrosoluble et à le purifier davantage.
Un tel traitement peut comporter diverses étapes, notamment des mises en solution, par exemple à l'aide d'agents tensio-actifs, l'élimination de certains composants toxiques, par absorption sur divers supports tels que charbon activé, silice, argile ou de préférence sulfate de barium, d'élimination 1(~9158Z

des tensio-actifs en excès, par exemple par traitement au chlorure de potassium suivi de centrifugation, de fractionnement par toutes méthodes utilisées en biochimie, telles notamment que les divers types de chromatographie ou d'électrophorèse.
Le produit soluble et purifié obtenu peut être avanta-geusement mélangé à un support finement particulaire par exemple de l'hydroxyde d'aluminium, du phosphate d'aluminium ou du phosphate de calcium, ou être complexé à une macromolécule par exemple à un polycation tel qu'une albumine méthylée ou un DEAE Dextran.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, la phase phénoli-que recueillie est dialysée, de préférence contre un tampon alcalin pour des questions de rapidité. Si un culot subsiste on l'élimine, après quoi le produit recueilli hydrcsoluble peut subir une ou plusieurs des opérations de purification et de concentration et recevoir éventuellement un adjuvant ou un gel ou être complexé à une macromolécule comme précité.
D'autre avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à
titre d'exemple non limitatif.
I. EXTRACTION
EXEMPLE 01 : Extraction au phénol.
On mélange 10 g de cellules sèches de bactéries ou de levures, avec 350 ml d'eau distillée, et l'on amène ce mélange à une température de 65C. On ajoute ensuite 315 ml de phénol pur préalablement chauffé à 65C et 35 ml de SDS (dodécylsulfate de Na) à 6,66 % chauffé à 65C. La concentration finale en phénol est de 45 % et en SDS de 3,125/oo .
Ce mélange est agité pendant une heure en restant maintenu à la température de 65C, puis il est refroidi entre 0 et ~ 4C et laissé au repos une nuit à 4C.

On obtient une phase phénolique inférieure et une phase l~9~S~32 aqueuse supérieure avec une interphase comprenant de gros débris.
On élimine l'interphase et la phase aqueuse puis on centrifuge de préférence la phase phénolique décantée à 35.000 g pendant une heure à + 10C. L~interphase et la phase aqueuse obtenues sont éliminées et l'on conserve une phase phénolique limpide colorée.
Le même procédé d'extraction peut être utilisé pour tous les microorganismes entrant dans le cadre de l'invention.
EXEMPLE 02 : Extraction au métacrésol.
Une suspension contenant 10 g de germe sec dans 500 ml d'eau distillée est chauffée à 37C puis mélangée à 500 ml de métacrésol chauffé à 37. Après 3 minutes d'agitation,à 37C, le mélange est centrifugé et la phase aqueuse et l'interphase sont éliminées.
EXEMPLE 03 : Extraction au phénol.
On mélange 10 g de bactéries sèches avec 400 ml d'eau distillée et l'on amène la température du mélange à 40C. On ajoute ensuite 350 ml de phénol à 90 % à 4C. On agite le mélange pendant 6 heures à 4C et on laisse décanter une nuit à 4C. On élimine ensuite la phase aqueuse et l'interphase par centrifuga-tion.EXEMPLE 04 On mélange 10 g de germe sec avec 350 ml d'une solution à 30 % de NaCl et on amène à 65C. On ajoute 315 ml de phénol pur préalablement chauffé à 65C et 35 ml d'une solution à 0,2 M
de SDS chauffée à 65C et on agite 1 heure à cette température.
On refroidit à 25C.
On effectuc ensuite une ccntrifugation et on obtient une phase phénolique supérieure qu'on décante. On la mélange avec un volume égal d'eau distillée apyrogène à 25C, on agite pour former l'émulsion pendant 30 minutes à 25C puis on centrifuge pour briser l'émulsion et recueillir la phase phénolique ainsi lavée après décantation de la phase aqueuse surnageante.

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EXEMPLE 05 : Extraction au phénol.
Le mélange est préparé comme dans l'exemple 01 et le mélange est agité, comme dans cet exemple pendant 1 heure en restant maintenu à la température de 65C. Le mélange est ensuite refroidi à + 5C et on ajoute alors du NaCl cristallisé en quantité
suffisante pour porter la concentration de la phase aqueuse à 30 %, soit 115,5 g. On agite pendant 30 minutes à + 20C puis on centri-fuge et on recueille la phase phénolique surnageante.
II. ELIMINATION DU PHENOL
EXEMPLE'l :
La phase phénolique obtenue à l'exemple 01 précédent est mélangée avec 5 volumes de méthanol prérefroidi à 20C. On peut avantageusement ajouter 0,01 volume d'une solution méthanolique saturée d'acétate de sodium.
Le mélange est ensuite placé au repos plusieurs heures, par exemple une nuit, à basse température, par exemple 4C.
On procède ensuite à la décantation de la phase métha-nolique surnageante, puis à la centrifugation du sédiment à
15.000 g pendant environ 30 minutes.

2~ Le culot peut être conservé tel quel, pour subir un traltement de solubillsation et de précipitation ultérieur ou immédiat.
Il peut être lyophilisé, ce qui permet également de parfaire l'élimination du phénol et de le conserver à l'état sec durant de longues périodes. La suspension ou le lyophilisat peuvent être chauffés à l'autoclave.
Il peut également être lavé ou dialysé pour éliminer le phénol résiduel et être par exemple repris en eau physiologique.
I1 est par exemple repris en eau distillée ~ raison de deux fois le volume de la phase phénolique traitée et on effectue ensuite une dialyse sous agitation contre 50 volumes d'eau dis-tillée à ~ 4C, pendant plusieurs heures, par exemple une nuit.

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Cette dialyse est ensuite reprise une seconde fois contre de l'eau physiologique tamponnée à pH 7.
On obtient enfin une fraction S insoluble dans l'eau.
Cette fraction S peut être stériliése par chauffage en autoclave par exemple à 115C durant 30 minutes.

A la fraction S précédente ou au culot simplement remis en suspension dans l'eau, dispersée dans un volume d'eau à une concentration de 4 à 5 milligrammes de protéine par ml on ajoute 0,1 volume de SDS 0,2 M, goutte à goutte sous agitation à tempé-rature ambiante pour dissoudre la fraction.
L'agitation est poursuivie jusqu'à dissolution complète à la suite de quoi on ajoute 0,5 volume d'une suspension de BaS04 à 1~3,75 % dans l'eau. Après 2 heures d'agitation à température ambiante on centrifuge à 15.000 g durant 30 minutes. Le culot est éliminé et on ajoute au surnageant 0,05 volume de KCl saturé afin d'éliminer le dodécylsulfate qui précipite. On effectue ensuite une centrifugation à 15.000 g pendant environ 30 minutes. Le culot est éliminé et l'on recueille le surnageant limpide. Celui-ci est ensuite dialysé contre de l'eau physiologique tamponnée à
pH 7, à raison de 3 fois 50 volumes jusqu'à élimination du phénol résiduel ou du KCl résiduel.
On effectue enfin une filtration sur filtre Millipore 0,45u, puis 0,22u, obtenant la fraction SS qui, contrairement à
la fraction S, est soluble.
De préférence, on ajoute à cette fraction un adjuvant tel que de l'alumine ou un autre gel ou de DEAE Dextran ou une albumine méthylée.
EXEMPLE 3 :
La phase phénolique obtenue par extraction selon l'exemple 01 est mise en dialyse contre de l'eau distillée avec agitation du boyau de dialyse, jusqu'à élimination du phénol, ~091S8Z

ce qui nécessite trois dialyses à 50 volumes.
On effectue ensuite une dialyse contre tampon phosphate Na à pH 8, à température ambiante avec agitation du boyau jusqu'à
dissolution. Cette dialyse est effectuée deux fois à 50 volumes.
La durée totale des dialyses est de plusieurs heures par exemple d'environ 48 heures.
S'il existe un culot on effectue une centrifugation à
15.000 g pendant 30 minutes, et on élimine le culot. Cependant, pour un grand nombre de bactéries, on n'observe pas de culot.
Le surnageant limpide subit une dialyse contre de l'eau physiologique tamponnée à pH 7, à raison de deux dialyses à
50 volumes. On obtient alors une fraction SSp plus active encore que la fraction SS précédente.
On peut continuer la purification en abaissant le pH
à 4 par HCl sous agitation, ce qui conduit à une précipitation.
On effectue ensuite une centrifugation à 15.000 g pendant 30 minutes, permettant d'éliminer le surnageant.
Le précipité est repris en eau distillée à raison de 1 volume pour 1 volume de précipité par abaissement du pH et l'on effectue enfin une dialyse contre de l'eau physiologique tamponnée à pH 7, jusqu'à dissolution complète à raison de trois opérations à 50 volumes.
On obtient alors une fraction désignée SSpH, sous forme de solution.
EXEMPLE 4 :
L~extrait phénolique obtenu selon l'exemple 1 subit une précipitation par adjonction de polyéthylèneglycol de poids moléculaire compris entre 1.500 et 20.000 et de préférence de l'ordre de 6.000.
Le précipité est ensuite centrifugé et recueilli. Il est ensuite remis en suspension dans de l'eau, de préférence physio-logique.

lO91S82 Les fractions obtenues ont toutes la même activité et ne sont pas solubles. On peut cependant lesirendre solubles par des procédés analogues à ceux des exemples 2 et 3.
Afin de mettre en évidence l'activité de stimulation non spécifique de l'immunité on a soumis un nombre très important de souris à des épreuves sévères d'infections bactériennes en utilisant comrne bactéries d'épreuve Salmonella, Pseudomonas, Escherichia coli, Staphylocoques, Neisseria meningitidis sero-groupe A, B, C Klebsiella pneumoniae et Brucella Abortus.

En se référant au tableau I ci-après on peut voir les doses protectrices 50 % des divers extraits de 12 origines différentes avant chauffage et après chauffage à 115C durant 30 minutes. L'agent d'épreuve était Salmonella.
Le tableau II ci-après montre les résultats cumulés obtenus avec différents extraits de Neisseria et de Proteus, exprimés en pourcentages de survie, pour différentes doses adressées à des souris en microgrammes de poids sec.
Le tableau III ci-après montre les résultats, en fonction des doses adrninistrées à des souris, de la protection d'extraits selon l'invention contre l'épreuve meningitidis serogroupe A, B
et C.
A titre d'exemple on a représenté sur la figure 4 un graphique sur lequel sont porté en abscisse l'intervalle de temps séparant la stimulation de l'épreuve et en ordonnée le pourcen-tage de survie. Les doses sont administrées aux souris par voie interpéritonéale.
La courbe 1 représente la cinetique chez des souris stimulées par 50 microgrammes d'extraits S de Méningo M 21 à la suite d'une épreuve Salmonella. La courbe 2 représente la cinéti-que liée à une stimulation de 10 microgrammes d'extraits SS, adjuvésAl de Méningo M 29 contre une épreuve .Staphylo.
La courbe 3 représente la cinétique liée à une stilula-109~58Z

tion de 10 microgrammes d'extraits SS + Al de Pertussis Bp pour une épreuve Staphylo. On voit que la stimulation s'établit en un jour, atteint son plus haut niveau en deux à trois jours et reste significative pendant deux à trois semaines.
Le tableau IV montre les résultats obtenus pour des extraits de Neisseria et de Proteus en fonction de la durée séparant l'administration à la souris des extraits selon l'invention et l'épreuve ultérieure par N.meningitidis serogroupe A, B et C.
Le tableau V représente les résultats obtenus par une stimulat~ion par un extrait SS ~ hydroxyde d'aluminium de Neisseria tout d'abord à la suite d'une stimulation unique suivie d'une épreuve Salmonella 3 jours après et une épreuve Pseudomonas 17 hours après ainsi qu'après stimulation multiple à 0,7, 15, 21 et 28 jours et épreuve Salmonella aux 3è, 10è et 18è jour puis Pseudomonas le 24è jour et coli le 31è.
Le tableau VI représente la protection contre des épreuves mixtes par l'extrait Neisseria. L'agent d'épreuve était constitué
d'un mélange de quatre espèces bactériennes Salmonella, Pseudo-monas, Staphylocoques et coli.

L'effet de stimulation répété figure sur le tableau VII.
Le tableau VIII représente les résultats obtenus lors de la protection par extrait de Neisseria contre des épreuves virales EMC. (Virus de l'encéphalomyocardite de la souris) et SF
(Virus Semliki-Forest).
De même on a pu établir pour les médicaments selon l'invention une notable activité protectrice contre une surinfection bact~rienne au cours d'une infection virale. L'essai a ~t~ fait sur des souris soumises à une épreuve virale recevant une dose Dl 50, et soumises trois jours plus tard à une épreuve bactérienne à une dose supérieure à IDMM.
Le tableau IX représente l'activité d'un extrait Neisseria contre la surinfection bactérienne au cours d'une infec-lO91S82 tion virale EMC, la grande flèche représentant la date d'adminis-tration du médicament et la petite flèche représentant la date d'administration de l'agent d'épreuve, dans le premier cas unique-ment EMC, dans le deuxième uniquement coli, dans le troisième cas une épreuve double EMC puis coli.
On constate qu'une seule injection d'extrait SS de Neisseria avant ou après l'infection virale assure une excellente protection.
Les tests effectués sur plus de 20.000 souris, ont montré que les souris stimulées grâce au médicament selon l'inven-tion résistaient bien malgré la sévérité des épreuves. Les médica-ments les plus efficaces se sont avérés être ceux contenant des extraits de Neisseria et Proteus et dans une moindre mesure Klebsiella.
L'excellente activité des extraits de Neisseria meningitidis a été également confirmée sur divers modèles expéri-mentaux mettant en jeu de gros animaux, porcs et bovins. Ces extraits ont pu par exemple protéger le porc contre une épreuve de Rouget sufficante pour amener chez les témoins non stimulés la généralisation des lésions.
D'une façon générale les meilleurs résultats ont eté
obtenus pour les fractions SS et parfois pour les fractions SSp.
L'activité immunostimulante se trouve notablement augmentée en utilisant un adjuvant tel que A1203, Al Po4, du latex, de l'aérosil, du DEAE Dextran, une albumine méthylée.
Les essais ont également montré qu'une certaine stimula-tion anti-virale était obtenue. Ainsi par exemple l'extrait de Neisseria à la dose de 5 microgrammes par souris par voie intrana-sale protège 8 souris sur 10 contre le virus grippal également par voie d'aérosol.
La figure 1 représente un graphique avec en abscisse le nombre de jours séparant la stimulation de l'épreuve virale EMC

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et en ordonnée le pourcentage de survie. La courbe A correspond aux souris ayant re,cu par voie intrapéritonéale une dose de 225 microgrammes d'extraits de Neisseria et 150 microgrammes d'hydro-xyde d'aluminium. La courbe B représente des témoins qui n'ont re,cu, à la place de la stimulation qu'une administration intra-péritonéale de 150 microgrammes dlhydroxyde d'aluminium et la courbe C représente les témoins ayant subi une simple adminis-tration d'eau physiologique.
La figure 2 représente un graphique similaire à celui de la figure 1 pour une administration par voie sous-cutanée.
Il a été également établi dans les modèles d'affections tumorales chez la souris une action synergique de l'association entre les médicaments préparés selon l'invention et certains agents anti-tumoraux, par exemple le corynebactérium parvum, synergie particulièrement remarquable lorsque le traitement l'aide d'une telle association est instituée à titre curatif.
On a également pu établir que les médicaments selon l'in-vention assuraient une stimulation non spécifique des anticorps circulants hétérologues ainsi qu'une stimulation du nombre de cellules lymphoides sécrètrices. Du point de vue des activités cellulaires, on obtient une stimulation de la phagocytose, une stimulation des organes du système réticulo-endotélial, une exhaltation des réactions d'hypersensibilité retardée chez le cobaye, l'exhaltation de la réaction du greffon contre l'hôte et une stimulation de la synthèse d'ADN dans le lymphocyte humain activité in vitro.
La figure 3 illustre graphiquement l'effet adjuvant obtenu chez la souris vis-à-vis des anticorps antigrippaux après immunisation par un vaccin grippal bivalent A et B. En abscisse figure le logarithme de la dose en microgrammes d'extrait de Neisseria avec l'hydroxyde d'aluminium et en ordonnée le Log du Titre IHA. La courbe A représente l'effet du vaccin grippal lO91S82 valence A non adjuvé alors que la courbe Al représente le cas de ce vaccin adjuvé par l'extrait selon l'invention.
La courbe B correspond au vaccin valence B non adjuvé
et la courbe Bl au vaccin valence B adjuvé.
D'une fa~on générale les différentes fractions S, SS, SSP, SSH, SSpH montrent toutes un haut niveau d'activité.
Dans la plupart des cas on préférera donc utiliser l'extrait SS dont l'innocuité et la stérilisation sont plus faciles à contrôler que l'extrait S lequel en plus n'est pas solubler et dont la fabrication est plus facile que celle des extraits SSp et SSH.
Le médicament selon l'invention est de préférence adsorbé
sur un adjuvant, et de préférence l'alumine et il est de préfé-rence lyophilisé.
Sous forme dessèchée il peut avantageusement être chauffé
en autoclave par exemple à 115 permettant encore une nette atténuation des réactions toxiques qui pourraient subsister.

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PROTECTION CONTRE UNE SURINFECTIOY BACTERIENNE
AU DECOURS D'UNE AFFECTION VIRALE
(Cumul dc 2 cxpericnccs)

Claims

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé de fabrication d'un médicament stimulant de l'immunité non spécifique, exempt d'endotoxine, caractérisé par le fait que:
on effectue sur au moins un micro-organisme choisi dans le groupe constitué par les bactéries, les levures et les proto-zoaires, en présence d'eau, une extraction à l'aide d'un phénol liquide à la température d'extraction inférieure à 70°C;
on recueille la phase phénolique;
on élimine le phénol; et on rend l'extrait hydrosoluble à l'aide d'un agent tensio-actif ou basique.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise un crésol à la place du phénol.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la durée de l'extraction est comprise entre quelques minutes et quelques heures.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la durée de l'extraction est comprise entre 30 minutes et 3 heures.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la quantité de phénol par rapport à la quantité d'eau est comprise entre 15 et 85%.

6. Procédé selon la revendication 1, 3 ou 5, caractérisé
par le fait qu'avant de procéder à l'extraction, pour des bactéries gram + ou des mycobactéries, on effectue d'abord un broyage ou une lyse bactérienne.

7. Procédé selon la revendication 1, 3 ou 5, caractérisé
par le fait qu'on effectue l'extraction en présence d'un détergent anionique.

8. Procédé selon la revendication 1, 3 ou 5, caractérisé
par le fait que l'on facilite la séparation des phases phénolique et aqueuse par adjonction de sel.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que pour éliminer le phénol, on ajoute de l'alcool et recueille le précipité obtenu.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'après la précipitation alcoolique on récupère le préci-pité par centrifugation, le reprend par l'eau distillée, puis effectue une dialyse contre l'eau.

11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que pour éliminer le phénol on ajoute à la phase phénolique du polyéthylèneglycol et recueille le précipité obtenu.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que le poids moléculaire du polyéthylèneglycol est compris entre 1.500 et 20.000.

13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on effectue une évaporation sous vide de la phase phénolique pour éliminer le phénol.

14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on élimine le phénol par dialyse.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'on dialyse contre l'eau ou contre un tampon alcalin.

16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on solubilise l'extrait phénolique dans l'eau en milieu alcalin.

17. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'extrait est solubilisé dans l'eau à l'aide d'un agent tensio-actif.

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que l'agent tensio-actif est un agent tensio-actif anionique.

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé par le fait que l'on élimine l'agent tensio-actif en excès par addition d'un sel de potassium.

20, Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que l'on solubilise dans l'eau par dialyse contre une solution alcaline.

21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait que l'on dialyse contre un tampon alcalin.

22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé par le fait que l'on élimine le phénol et solubilise l'extrait dans l'eau par dialyse.

23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé par le fait que l'on effectue d'abord une dialyse de la phase phénolique contre de l'eau distillée puis une dialyse contre un tampon phos-phate de sodium.

24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé par le fait que l'on effectue une nouvelle dialyse contre de l'eau physiologique tamponnée à pH 7.

25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé par le fait que l'on soumet la solution aqueuse obtenue à des traite-ments de purification.

26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé par le fait que l'on purifie ladite solution en la soumettant à l'action d'un agent adsorbant.

27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé par le fait que l'agent adsorbant est le sulfate de baryum.

28. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on soumet l'extrait à un fractionnement.

29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé par le fait que l'on réalise le fractionnement sur l'extrait hydroso-luble, par abaissement du pH, et élimination du surnageant.

30. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que l'on soumet l'extrait à un fractionnement en fonction de la concentration en polyéthylèneglycol.

31. Procédé selon la revendication 1, 3 ou 5, caractérisé
par le fait que l'extraction est effectuée sur au moins une bac-térie choisie dansle groupe formé par: Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis, et Klebsiella pneumoniae.

32. Procédé selon la revendication 1, 3 ou 5, caractérisé
par le fait que l'extraction est effectuée sur au moins une bactérie choisie dans le groupe constitué par: Bordetella Pertussis, Acinetobacter anitratus, Pseudonomas aeroginosa, Escherichia Coli, Brucella abortus, Corynebacterium pseudodiphteriae, Corynebactorium parvum, Staphylococcus aureus.

33. Procédé selon la revendication 1, caractérise par le fait que l'extraction est effectuée sur au moins une mycobactérie.

34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé par le fait que la mycobactérie est choisie dans le groupe constitué
par: Mycobacterium phlei, Mycobacterium Kansasii, Mycobacterium Scrofulaceum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium fortui-tum.

35. Procédé selon la revendication 1, 3 ou 5, caractérisé
par le fait qu'il comporte un extrait ou fraction d'extrait de Saccharomyces Cerevisiae ou Candida Albicans.

36. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on ajoute au médicament un vaccin.

37. Procédé selon la revendication 36, caractérisé par le fait que le vaccin est choisi dans le groupe des vaccins contre la grippe, la coqueluche, la poliomyélite, la rougeole, la rubéole, l'anatoxine tétanique, l'anatoxine diphtérique et les polysacchar-ides méningococciques.

38. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on adsorbe ledit médicament sur un adjuvant.

39. Procédé selon la revendication 38, caractérisé par le fait que le médicament est adsorbé sur de l'hydroxyde d'aluminium.

40. Procédé selon la revendication 39, caractérisé par le fait que l'on associe ledit médicament à un adjuvant choisi dans le groupe constitué par: phosphate d'aluminium, latex, aé-rosil, DEAE Dextran, albumine méthylée.

41. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on ajoute en outre audit médicament un agent anti-tumoral.

42. Procédé selon la revendication 41, caractérisé par le fait que l'agent anti-tumoral est Corynebacterium Parvum.

43. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on conditionne le médicament sous forme de doses contenant de 10 à 1.000 microgrammes en poids d'extrait sec.

44. Médicament, caractérisé par le fait qu'il est préparé selon le procédé de la revendication 1, 3 ou 5.