JPH03501123A - グラム陰性非腸内病原性桿菌に対する獣医学用の無細胞ワクチンの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゲーム　、に・　る８の 無細胞ワクチンの９１ｉＪｊｌ　法 鼓王丘丘 本発明は、獣医学分野および生化学分野に関する。さらに詳細には１本発明は、 獣医学用の無細胞ワクチン組成物として有用である形態で、グラム陰性非腸内病 原性桿菌から所定の生物ポリマーを単離する方法に関する。

発里■■量 多くの小型グラム陰性桿菌は、動物に感染して１重大な疾患を引き起こす。これ らの病原体に対するワクチンは２通常。

細菌ワクチンの細胞全体を殺すか、もしくはその毒性を滅じている。これらのバ クテリアの抗原性成分の研究に関する文献には多くの報告があるが、これらの病 原体に対する無細胞（細胞を含有しない）ワクチン、もしくはサブユニットワク チンを製造するための商業的に生産可能な方法に関しては。

はとんど報告されていない。

ベトロス（Ｖｅｄｒｏｓ）、　Ｎ、Ａ、およびギアード（Ｇｉａｒｄ）、Ｒ，は 、海洋に住む哺乳類に感染するパスツレラ　ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ ａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）に対する粗製の無細胞ワクチンを調製する方法を記載し ている（１３ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｗｏｒｋｓ ｈｏｐおよび７ｔｈ　Ｅａｓｔｅｒｎ　Ｆｉｓｈ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｗｏｒｋｓｈ ｏｐに提出した要約、　１９８２年５月）。微生物の培養物はガラスピーズと共 に振盪され１次いで遠心分離にかけられた。得られた培養物の上滑を硫酸アンモ ニウムで処理し、得られた沈澱物をアルカリで消化してゲル濾過を行い、低分子 量の物質を除去した。得られたワクチンは、主に表面もしくは莢膜多糖類と、少 量のタンパクおよび核酸とからなっていた。この方法により効果的なワクチンが 提供されたが、これは複雑でかつコストもかかるので。

大規模に獣医学用のワクチンを製造するための商業的に生産可能な方法を提供す ることができない。

Ｍｏｎｏｇｒ、　Ａｌｌｅｒｇｙ（１９７５，９：２４５−２５８）は、ヒト髄 膜炎菌性疾患を予防するための多糖類ワクチンの製造方法を記載している。髄膜 炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎ　１ｔｉｄｉｓ）の培養物を、１χＣｅ ｔａｖｌｏｎで処理して髄膜炎菌を殺し、そして溶液から多糖類を沈澱させた。

遠心分離にかけて、沈澱物とバクテリア破砕物とを集め１次いで塩化カルシウム 溶液で処理して、多糖類−Ｃｅｔａｖｌｏｎ複合体を解離させた。次いで、核酸 をエタノールで沈澱させ、除去した。多糖類をさらにエタノールで沈澱させ、そ してエタノールとアセトンとで洗浄し、残留塩とＣｅｔａｖｌｏｎとを除去して 、５０％純粋な生成物を得た。上記多糖類のさらなる精製は、クロロホルム−ブ タノールで抽出し、続いて限外濾過を行うか、あるいはフェノールで抽出を行な い、続いて透析して沈降を行うことにより達成される。ヒトワクチンを調製する ためのこの方法はまた。コストがかかり、かつ複雑なので、商業的な量で獣医学 用のワクチンを製造するのには適当ではない。

発明の要約 本発明は、グラム陰性非腸内病原性桿菌に対する獣医学用の無細胞ワクチンとし て、単独でまたは組み合わせて有用な。

精製された表面多糖類の処方、および精製された体細胞多糖類の処方の調製方法 を提供する。

その精製された表面多糖類の調製方法は、バクテリアの水性懸濁液（例えば、培 養物）からはじまり１次の工程を包含する二 （ａ）バクテリアの外膜から、線膜を損傷することなく１表面多糖類および体細 胞多糖類を機械的に剪断力を加えて剥がし取ること： （１：））　該懸濁液からバクテリアを分離し１表面多糖類および体細胞多糖類 を含む上清を得ること； （Ｃ）該表面多糖類および体細胞多糖類を分解させない有機カチオン性沈澱剤を 該上清に加えて、該沈澱剤と表面多糖類とのイオン性コンプレックスを含む沈澱 物を形成させること；（ｄ）該上清から（Ｃ）の沈澱物を分離すること；（ｅ） ｆｌイオン性コンプレックスが解離するような条件下で。

（イ）の分離された沈澱物を水性媒体の中に可溶化させること；（ｆ）該（ｅ） の溶液に充分な量の低級アルカノールを加えて、実質的に該表面多糖類を共沈澱 させることなく、そこから核酸を沈澱させること； （（至）該溶液から（ｆ）の沈澱物を分離すること；（ハ）そののち４表面多［ ８がそこから沈澱するレベルにまで溶液中の低級アルカノールの濃度を上げるこ と；および（ｉ）該（５）の表面多糖類の沈澱物を回収すること。

上記精製された体細胞多糖類の調製方法も病原性バクテリアの水性懸濁液ではじ まる。それは次の工程を包含する＝（ａ）バクテリアの細胞膜から、該細胞膜を 損傷することなく。

表面多糖類および体細胞多糖類を機械的に剪断力を加えて剥がし取ること； ら）該懸濁液からバクテリアを分離し１表面多Ｆｉ類および体細胞多糖類を含む 上清を得ること； （Ｃ）該表面多糖類および体細胞多糖類を分解させない有機カチオン性沈澱剤を 該上滑に加えて、該沈澱剤と表面多糖類とのイオン性コンプレックスを含む沈澱 物を形成させること；（ｄ）該上清から（Ｃ）の沈澱物を分離すること；（ｅ） そののち９体細胞多糖類がそこから沈澱する濃度にまで。

該上清に低級アルカノールを添加すること；および（ｆ）　該（ｅ）の体細胞多 糖類の沈澱物を回収すること。

適当な注射可能なビヒクル中に、精製された表面多糖類。

精製された体細胞多糖類、または該生成された表面多糖類と体細胞多糖類との混 合物を含む獣医学用のサブユニットワクチンは１本発明の別の局面である。

るための　工 「表面多糖類（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）　」という用 語は。

バクテリアによって放出された酸性の細胞外炎Ｉ！ｉｌを意味する。これらの多 糖類は、多くの場合、「エキソポリサッカライド（ｅｘｏｐｏｌｙ−ｓａｃｃｈ ａｒｉｄｅｓ）　Ｊと呼ばれている。バクテリアが被包形態である場合には、そ の用語は「莢膜多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）　Ｊ という用語と同義語である。

１体細胞多糖類（ｓｏｍａｔｉｃ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）という用語 は。

バクテリアの細胞膜と全体として結合している中性多ＩＩを　−意味する０体細 胞多糖類！類は１通常、「リボ多糖類」もしくは「エンドトキシンＪと呼ばれて いる。

本発明の方法は、動物に感染するグラム陰性非腸内桿菌に対する獣医学用のワク チンを製造するために用いられ得る。　′この桿菌の抗原性は、少なくとも部分 的に２表面（莢膜）多１１あるいは体細胞（細胞膜）多糖類に原因がある。上記 バクテリアの例としては、ヘモフィラス・フロイロップニューモニア（ｈお薊旦 ヨユ旦ユユユヨユロ）およびヘモフィラス・ソムヌス（Ｈｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　 ｓｏｍｎｕｓ）などのへモフィラス　バクテリア、およびバスツレア・ハエモリ ティ力（ｈｕ印ｎ月１上目晩■■組）およびバスツレア・ムルトシダ（Ｐａｓｔ ｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）などのバスツレア属がある０本発明のワ クチンは、そのようなバクテリアの精製された形態の表面多糖類および／または 精製された形態の体細胞多１２Ｍを含有している。好ましくは、このワクチンは 、精製された形態の体細胞表面長１１Ｍを含有しているか、もしくは精製された 形態の表面多糖類および体細胞多糖類の両方を含有している。

（以下余白） バクテリアは、適当な水性増殖培地において生理的に適した温度で好気的に増殖 する。グラム陰性桿菌の培養、培養条件および増殖特性は、当該技術分野で公知 である。例えば。

Ｒｅｖｉｅｖ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８０ ）　１４版（ＬａｎｇｅＭｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を参照さ れたい。上記の培養物を上記方法にそのまま用いるか、あるいはバクテリアを培 養物から単離し、水性培地に再懸濁してもよい。

上記方法の第１工程は、バクテリアの外膜を損傷することなく、酸性の表面多糖 類および外膜由来の中性の体細胞多糖類を１機械的に剪断力を加えて剥し取るこ とである。この工程は、微粒子状の研磨手段を用いておだやかに膜をこする（ａ ｂｒａｄｉｎｇ）ことにより実施される。例えばガラスピーズや他の固形粒子が 用いられる。ビーズは通常的５〜７＋ｕ＋の直径で。

好ましくは、懸濁液ＩＬ当り５０〜７０ｇで懸濁液に添加される。

ビーズを含有する培養物は、典型的には１００〜１１０ｒｐｍで約４８〜７８時 開拓とうされて、膜から所望の表面多糖類と体細胞多糖類とが、剪断力を加えて 剥し取られる。

次いで懸濁液の表面多糖類および体細胞多糖類を含有する水相を、遠心分離など の方法を用いてバクテリアから分離する。次いで９表面多糖類を有機カチオン性 沈澱剤と結合させることによって９表面多糖類を水相から分離する。この沈澱剤 は、ポリアニオン性の多糖類を分解することなく、ポリアニオン性の多糖類と選 択的に結合する。そのような試薬の例は、セタブロン（臭化ヘキサデシルトリメ チルアンモニウム）などの脂肪酸の四級アンモニウム塩である。表面多糖類を含 有する沈澱したイオン性コンプレックスは、遠心分離によって体細胞多糖類を含 有する水相から分離される。

表面多糖類を含有するイオン性コンプレックスを、コンプレックスを解離させる に充分なイオン強度を有する水性媒体中に溶解させ、得られた溶液に表面多糖類 を共沈源させることなく溶液中の核酸を沈澱させる濃度にまで低級アルカノール （例えば０１〜Ｃ４のアルカノール、好ましくはエタノール）を添加することに よって１表面多糖類がさらに精製される。

この工程を実施するためのアルカノールを濃度は２通常２０％〜２５％（ｖ／ｖ ）の範囲内である。核酸の沈澱物は、遠心分離によって除去される。

次いで、得られる表面多糖類を含有する上清の低級アルカノールの濃度を、該表 面多糖類を沈澱させるに充分なレベル（典型的には、少な（とも約８０％（Ｖ／ Ｖ））にまで上げる。表面多糖類沈澱物を遠心分離によって液体から分離する。

沈澱物をリン酸塩で緩衝された生理食塩水、リンガ−液、デキストロース注射剤 などの従来の水性非経口ビヒクルに溶解させて。

獣医学用無細胞ワクチン組成物が形成される。ワクチン処方物中の表面多糖類の 濃度は２通常、０．５〜１ｍｇ／ｍｌ（マｉｖ＞の範囲内である。これとは別に ９表面多糖類をポリラクチド、ポリ無水物、ポリオルトエステルなどの担体とと もに処方し。

持続的放出性のワクチン処方物を形成することができる。

以下のようにして２表面多糖類を含有するイオン性コンブレックス沈澱物を除去 した後に残った上清から９体細胞多糖類を精製する。必要に応じて、セタブロン を上清に添加して。

残留する表面多糖類を沈澱させる。形成された沈澱物をすべて除去した後、低級 アルカノール（好ましくは、エタノール）を少なくとも約８０％の濃度まで添加 することによって上清から体細胞多糖類を沈澱させる。得られる体細胞多糖類を 含をする沈澱物を遠心分離によりて分離し９通常の非経口ビヒクルに再溶解させ るか、上述したような持続的放出性担体とともに処方する。この処方物中の体細 胞多糖類の濃度は１通常１〜５１ｇ／ｍｌの範囲内である。

表面多糖類および体細胞多糖類の両方の精製物を含有する好ましいワクチン処方 物は、典型的には、３：１〜１：３（表面多糖類二律細胞多糖類）の重量比を有 する。

本発明の無細胞ワクチンは、ワクチンの調製に用いた病原性バクテリアに感染し やすい動物に通常の方法で投与される。

通常、皮下注射、皮肉注射、あるいは筋肉注射が行われる。

最初の接種は、典型的には体重１ｋｇ当り、約０６５〜５　ｗａｇの活性成分で 行われる。長期間にわたる、感染に対する充分な防護効果を与えるためには、定 期的な追加免疫が必要である。

以下の実施例によって本発明をさらに例示する。これらの実施例は２本発明の範 囲を限定しようとするものでは決してない。

（以下余白） 実施例１ ヘモフィラス　プロイロツブニューモニ−ｒ　（ＨＰＰ、　ＡＴＣＣ２７０８９ 株、血清型２）をプレイン−ハート（ｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ）浸出寒天（ＢＨ Ｉ）上で一夜（３７℃、　ｐ）１７．２）培養した。１０−のＢ）ＩＩブロスを 、各培養プレートに添加した。各培養プレートにこすりつけることによってバク テリアを懸濁させ、５２０ｍ＋ｎでの０．Ｄ、が１．５となるように調節した。

１％グリセロールを補足したＢＨＩブロス５００　ｍｌに、この懸濁液５ｄを添 加して３７℃で２４時間１１００ｒｐで振とうしながらインキコベートした。２ ４時間後、直径５ｍｍｃｍのガラスピーズ７０ｇを培養物に添加し、この培養物 をこのビーズとともに、室温で４８時間、　１１００ｒｐで振とうした。

次いで、この培養物を４℃にて７０００Ｘ　ｇで３０分間遠心分離を行い、上清 を回収した。得られたバクテリアのペレットを２００ｄの脱イオン水に再懸濁し て、４℃で１０分間高速で混合した。

この混合液を、　７０００Ｘｇで３０分間遠心分離し、その上清を回収して先に 回収した上清とあわせた。

あわせられた上清にセタブロン（１０％溶液）を添加して最終の濃度を１％とし た。この混合物を室温で３０分間攪拌した。

この混合物（ｍｅｘｔｕｒｅ）から、７０００Ｘｇで３０分間遠心分離すること により回収した。体細胞多糖類を含有する上滑を得た。

上記沈澱を２００−の蒸留水に溶解させ、これに同容量の０．９ＭＮａＣ１を添 加し、つづいて室温で１時間攪拌した。次いで、エタノールを最終濃度が２５％ となるように添加し、得られた混合物を室温で２時間放置した。表面多糖類沈澱 物を、４℃で３０分間７０００Ｘｇで遠心分離することにより取り除いた。

次いで、得られた上清にさらにエタノールを添加して、最終濃度が８０％となる ようにした。得られた混合物を室温で１時間攪拌した。次いでこの混合物を４℃ で４５分間、　１２０００Ｘｇで遠心分離した。得られたベレットを３０−の０ ．１５Ｍ　ＩＪン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、得られた溶液を０． ２２　ミクロンのフィルターを用いて滅菌した。

この体細胞多糖類を含有した上清から体細胞多糖類を次のようにして回収した。

つまり、この上清のエタノールの濃度を８０％にし、生じた体細胞多糖類の沈澱 物を４℃にて４５分間１２（１０（ｌ　ｘ　ｇで遠心分離することにより１回収 した。この最終的に得られた物質を３０ｍ１２の０．１５Ｍ　ＰＢＳに溶解して 、これをフィルター滅菌した。あるいは１体細胞多糖類は、この上清に１％セタ ブロンを添加し、エタノール濃度を８０％にする以前に生じる沈澱を取り除くこ とによって回収される。

目的とするワクチン組成物は、３艷の表面多糖類溶液と０．５ｄの体細胞多糖類 溶液とをあわせることによって調製された。

／　このワクチン組成物を、市販のオイルアジュバント口Ｍと体積比が１＝１と なるように混合して、マウスにおいて以下のように試験した。

マウスの腹腔内にこの混合物を１表面多糖類のレベルが５０（ｏｃｇ、　１０ω ｃｇ、　２゜５　ｍｃｇとなるようにワクチンを接種した。このマウスに１週間 後、同じレベルの投与量を追加接種した。

そして追加免疫後の１週間後にこのマウスに、バクテリアを作用させた。ワクチ ンは、防護効果を与え、その防護効果は。

（対照に対する）相対的効力が１．４８であり、１：１０８に希釈して投与した ときに５０％の防護効果を示した。

ＨＰＰ血清型１に対するワクチンを、　ＨＰＰ　ＡＴＣＣ２７０８８株から。

実施例１の方法に従って調製した。

実施例３ パスツレラ　ハエモリティ力およびパスツレラ　ムルトシダに対するワクチンを 、実施例１の方法にしたがって調製する。バクテリアはＢ旧培地、または酵母− シスチンープロテオースーペブトン培地で培養される。

実施例４ 実施例１および２のワクチンを若いブタで試験した。この若いブタに、　）ＩＰ Ｐ血清型１の場合には、ワクチン０．２７５■とともにＩＭを、そして、　ＨＰ Ｐ血清型２の場合には、ワクチン１■とともにＩＭを注射した。この動物に最初 の注射から２週間後に同じレベルの投与量を追加投与した。追加免疫から１０日 〆後、この動物にバクテリアを作用させた。死亡率および肺損傷値はバクテリア 作用後７〜１０日で決定された。ワクチンが接種されていない対照動物で観察さ れた死亡率および肺損傷値よりも低い死亡率と低い肺損傷率とによって証明され るように９両方のワクチンは防護効果を与えた。

本発明は、グラム陰性の非腸内桿菌に関して述べられているが１本発明は、病原 性のグラム陽性桿菌から表面多糖類組成物を調製するのにも用いられ得る。

本発明を実施するだめの、上記態様における。生化学、ワクチン学または獣医学 分野の当業者に明らかな変更は、以下の請求の範囲内にある。

国際調１１８＠告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．病原性桿菌の水性懸濁液から，該桿菌に対する獣医学用の無細胞ワクチンを 調製するための方法であって，該方法は次の工程を包含する： （ａ）バクテリアの外膜から，該膜を損傷することなく，表面多糖類を機械的に 剪断力を加えて剥がし取る工程；（ｂ）該懸濁液からバクテリアを分離し，表面 多糖類を含む上清を得る工程； （ｃ）該表面多糖類を分解させない有機カチオン性沈澱剤を該上清に加えて，該 沈澱剤と表面多糖類とのイオン性コンプレックスを含む沈澱物を形成させる工程 ；（ｄ）該上清から（ｃ）の沈澱物を分離する工程；（ｅ）該イオン性コンプレ ックスが解離するような条件下で，（ｄ）の分離された沈澱物を水性媒体に可溶 化する工程；（ｆ）該（ｅ）の溶液に充分な量の低級アルカノールを加えて，実 質的に該表面多糖類を沈澱させることなく，そこから核酸を沈澱させる工程； （ｇ）該溶液から（ｆ）の沈澱物を分離する工程；（ｈ）そののち，表面多糖類 がそこから沈澱するレベルにまで該溶液中の低級アルカノールの濃度を上げる工 程；および（ｊ）該（ｈ）の表面多糖類の沈澱物を回収する工程。
2. ２．請求項１に記載の方法であって，前記桿菌はグラム陰性非腸内桿菌である。
3. ３．グラム陰性非腸内病原性桿菌の懸濁液から，該桿菌に対する無細胞ワクチン を調製するための方法であって，該方法は次の工程を包含する： （ａ）バクテリアの細胞膜から，該細胞膜を損傷することなく，表面多糖類およ び体細胞多糖類を機械的に剪断力を加えて剥がし取る工程； （ｂ）該懸濁液からバクテリアを分離し，表面多糖類および体細胞多糖類を含む 上清を得る工程； （ｃ）該表面多糖類および体細胞多糖類を分解させない有機カチオン性沈澱剤を 該上清に加えて，該沈澱剤と表面多糖類とのイオン性コンプレックスを含む沈澱 物を形成させる工程；（ｄ）該上清から（ｃ）の沈澱物を分離する工程；（ｅ） そののち，該体細胞多糖類がそこから沈澱する濃度にまで，該上清に低級アルカ ノールを添加する工程；および（ｆ）該（ｅ）の体細胞多糖類の沈澱物を回収す る工程。
4. ４．請求項２または３に記載の方法であって，前記機械的剪断は，該懸濁液を撹 拌して微粒子状の研磨手段と接触させることにより達成される。
5. ５．請求項４に記載の方法であって，前記微粒子状の研磨手段はガラスビーズで ある。
6. ６．請求項１から５のいずれかに記載の方法であって，前記（ｂ），（ｄ）およ び（ｇ）の分離工程は遠心分離を行うことにより達成される。
7. ７．請求項１から６のいずれかに記載の方法であって，前記有機カチオン性沈澱 剤は４級アンモニウム塩である。
8. ８．請求項７に記載の方法であって，前記４級アンモニウムイオンはＣｅｔａｖ ｌｏｎである。
9. ９．請求項１から８のいずれかに記載の方法であって，前記低級アルカノールは エタノールである。
10. １０．請求項１から９のいずれかに記載の方法であって，前記病原性桿菌は，Ｈ ｅｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属である。
11. １１．グラム陰性非腸内病原性桿菌に対する獣医学用無細胞ワクチンであって， 該ワクチンは次の混合物を包含する；（ｉ）注射可能なベヒクル；および （ｉｉ）請求項１から１０のいずれかに記載の表面多糖類沈澱物，請求項１から １０のいずれかに記載の体細胞多糖類沈澱物，またはそれらの混合物。