NO783153L - Nytt partikkelmateriale samt fremstilling og anvendelse derav, spesielt som medikament - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder et nytt, partikkelformig materiale, fremstilling av det og dets anvendelse som medikament.

Det er kjent at for effektivt å oppnå en hindring av kolera,

er det nødvendig å skaffe god immunitet overfor koleratoksinet.

Foreliggende-oppfinnelse gjelder et nytt, partikkelformig materiale som spesielt kan lede til immunitet og en syntese av antilegemet kolera-antitoksin, hvor det administreres til en levende organisme som har et immunitets-forsvarssystem.

Oppfinnelsen gjelder mere bestemt et nytt materiale som består av partikkelformige bærere som er belagt med et første sjikt av et gangliosid eller et gangliosid-derivat med affinitet for koleratoksin, og et andre sjikt bestående av koleratoksin.

De partikler som anvendes som bærere, kan være hematin fra hvilke som helst dyrearter, hvilke som helst bakterielle spirer, spesielt koleravibrioner av typen Inaba eller Ogawa, polymere organiske partikler som f.eks. syntetiske eller naturlige latekser, granulære eller kolloidale karbonpartikler, partikler av polysakkarider eller modifiserte polysakkarider, porøse mineralpartikler belagt med polysakkarider eller modifiserte polysakkarider, og rent generelt enhver annen type partikler som minst en av fremgangsmåtene for fiksering av gangliosider eller deres derivater kan anvendes på, og som beskrives senere.

<j>De porøse, mineralske partiklene som er nevnt ovenfor, er

spesielt metalloksyder, som f.eks. silisiumoksyd, alumimium-oksyd, magnesiumoksyd, titanoksyd eller deres syntetiske eller naturlige derivater, som f.eks. glass, silikater, borsilikater eller kaolin.

I foreliggende oppfinnelse betegnes med uttrykket "koleratoksin" ikke bare den toksiske formen eller koleragenet, men også den ikke-toksiske formen som kalles koleragenoid. Det er kjent at koleragenet naturlig og progressivt, eller også under varmepåvirkning, omdannes til koleragenoid. Koleragenet og koleragenoidet er begge til stede i filtratet av kolera-vibriokultur.

Det er kjent at blant de forskjellige gangliosider har gangliosidet G^ og visse av dets derivater en affinitet av biokjemisk type som er sterk og spesifikk overfor koleragenet og koleragenoidet. Denne affiniteten observeres likeledes med visse derivater av gangliosid G^. Det er spesielt tilfelle med lysogangliosid GMl»Lysogangsliosid Gflloppnås ved alkalisk hydrolyse av gangliosid GM1 ifølge den metode som beskrives av Holmgren, Månsson og Svennerholm, Medical Biology,

(1974), 52, 229-233. Denne alkaliske hydrolyse har som formål å omdanne de to N-acetyl-funksjoner og N-acyl-funksjoner i gangliosid G^ til en amin-funks jon NI^ •

Andre gangliosid-derivater har likeledes en affinitet overfor koleratoksin.

I foreliggende oppfinnelse kalles konvensjonelt ethvert^ gangliosid-derivat som har affinitet overfor koleratoksinet, for "derivat av gangliosid GMl", og spesielt de produkter som oppstår ved delvis eller total hydrolyse av N-acyl- eller N-acetyl-gruppene i gangliosid til NH 2 - grupper, men det oppstår også mono- eller a-sialo-gangliosider eller deres derivater (særlig deres derivater som oppstår ved total- eller delvis hydrolyse av N-acyl- eller N-acetyl-grupper).

Dimensjonene på partiklene ifølge oppfinnelsen kan variere fra o,l til lOOO^u. Oppfinnelsen gjelder også fremgangsmåte for fremstilling av det partikkelformige materiale som er beskrevet ovenfor. Denne fremgangsmåte omfatter i første trinn å fiksere gangliosid G„-, og/eller dets derivater til bærer-partiklene. Denne fiksering kan gjennomføres enten ved å etablere en kjemisk binding, eller ved å utnytte affinitetsfenomener, f.eks. absorps j ons fenomener.

Det andre trinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består

i å fiksere koleratoksinet til de partikler som er belagt med gangliosid G^, eller et av dets derivater.

Generelt er det da meget enkelt og meget raskt å fremstille

det partikkelformige materiale belagt med koleratoksin, når partikler belagt med gangliosid GMleller lyosgangliosid GMler fremstilt som beskrevet ovenfor. En enkel inkubering med filtratkulturen, fulgt av en sentrifugering, strekker faktisk til for å oppnå en rensing og en konsentrering av toksinet på partiklene. Den overstående væske kan således fullstendig tømmes fpr toksinet i ett eneste trinn, selv om alle andre makromolekyler generelt blir tilbake unyttbare. Toksinet konsentreres på partiklene takket være den meget sterke affiniteten for gangliosidet eller lysogangliosid G^ for koleragenet og koleragenoidet.

For fiksering av koleratoksinsjiktet (andre trinn i fremgangsmåten) får de partikler som er belagt med gangliosid G^ og/ eller et av dets derivater, være i kontakt med toksinet i så lang tid til at det, om ønsket, oppnås en metning eller bare en delvis belegning av de reaktive stillingene (gangliosid GM^eller dets derivater) med toksinet. Tiden varierer generelt fra 1 til 60 minutter ved en temperatur mellom 0 og 60^ C.

Det partikkelformige materiale ifølge oppfinnelsen består spesielt av hematin på hvilket er fiksert et første sjikt bestående av gangliosid G^^eller et av dets derivater, og et andre sjikt bestående av koleragen, koleragenoid eller blandinger av dem.

Hematinene behandles på forhånd med et karbonylert derivat før<j>det belegges med de to sjiktene.

Karbonylderivatet er fortrinnsvis formol eller glutaraldehyd.

Oppfinnelsen gjelder likeledes fremgangsmåte for fremstilling av det partikkelformige materiale bestående av således belagt hematin.

Denne fremgangsmåte består.i første trinn i å omsette en suspensjon av røde blodlegemer i fysiologisk vann med et karbonylderivat, eksempelvis med en løsning av nevnte karbonylderivat i fysiologisk salt vann, og deretter bringe det oppnådde produkt i kontakt med en løsning som inneholder koleragenet, koleragenoidet eller blandinger av dem.

Med "fysiologisk salt vann" menes en vandig løsning med nesten nøytralt pH som inneholder ca. 9 g/l natriumklorid.

Fortrinnsvis holdes hematinet i kontakt med karbonylderivatet

i 15 minutter til 15 timer ved en temperatur som kan variere fra 0 til 60° C.

Hematinet som er behandlet slik, vaskes deretter med destillert vann og bringes så i løsning med fysiologisk saltvann.

Generelt kan mengden karbonylderivat variere fra 0,01 til 20g pr. 100 ml hematinsuspensjon.

For fiksering av gangliosid G^ tilsettes en løsning av gangliosid ved pH over eller lik 8 til en suspensjon av hematin som er behandlet slik.

Ved fiksering av gangliosid G^ arbeides fortrinnsvis ved pH nær 13.

Inkuberingstemperaturen kan være mellom 0 og 60° C. Fortrinnsvis er den omtrent 45° C. Inkuberingstiden er vanligvis minst lik 1 time og er fortrinnsvis omtrent 15 timer.

Suspensjonen sentrifugeres så og bunnfallet fra sentrifugeringén vaskes og suspenderes i fysiologisk saltvann.

For å fiksere lysogangliosid til hematinet, arbeides fortrinnsvis på følgende måte: til suspensjon av røde blodlegemer som er underkastet behandling med karbonylderivater, tilsettes en løsning av lysogangliosid G^ ved pH over 5 og fortrinnsvis i nærheten av 7. Fortrinnsvis varierer inkubasjonstempera-turen fra 0 til 60° C i løpet av en tid som kan variere fra 30 minutter til 3 timer.

Deretter underkastes suspensjonen en sentrifugering og sentrifugeringsbunnfallet oppsamles, vaskes og suspenderes i fysiologisk saltvann.

Det er observert at det er mulig å fiksere lysogangliosid G^ direkte til friskt hematin. Mange ganger kan det konstateres stadige hemolysefenomener, særlig ved store doseringer av lyso-gangliosider. Av denne grunn er det foretrukket å forbedre reaktiviteten, som beskrevet ovenfor, ved å forbehandle de røde blodlegemer med karbonylderivater slik at de blir uføl-somme overfor enhver hemolytisk innvirkning.

Det er verifisert at aldehydfunksjonene som finnes på de røde blodlegemene som er behandlet med glutaraldehyd, ikke inn-virker på fikseringsreaksjonen av gangliosidet. Det er over-raskende funnet at dersom det gjennomføres en kjemisk nøy-tralisering før disse aldehydfunksjoner tilsettes, ved tilsetning av en løsning av 20 g/l glykokoll ved pH mellom 7 og 11, generer ikke denne behandlig i det hele tatt den senere fiksering av gangliosid ved alkalisk pH.

Det partikkelformige materiale ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av hematin fra hvilken som helst kilde, eksempelvis hematin fra mennesker, sau, ape, kanin, hund, geit, ku, hest, høne, due, gås osv.

Etter således å ha oppnådd hematin belagt med et først sjikt av gangliosid G^ eller lysogangliosid bringes det nevnte belagte hematin i kontakt med en løsning inneholdende koleratoksin. På grunn av den spesifikke affinitet for gangliosid G^ overfor koleratoksin kan koleratoksinløsningen være forurenset, eksempelvis et råkulturfiltrat av koleravibrioner. Det oppnås således en fiksering til det første sjiktet (gangliosid) av et andre sjikt (koleratoksin).

For fiksering av det andre sjiktet, som utgjør det andre trin-net i fremgangsmåten, får hematinet belagt med det første sjiktet være i kontakt med en løsning av toksinet i en tid som varierer fra 0 til 60° C, fortrinnsvis fra 20 til 45° C.

Så skilles partiklene ved hjelp av vanlige metoder, eksempelvis ved sentrifugering, de vaskes for å eliminere de eventuelle nærværende forurensninger og de suspenderes i fysiologisk saltvann eller de underkastes en lyofilisering.

Det partikkelformige materiale ifølge oppfinnelsen kan likeledes bestå av bakterier som partikkelformig bærer.

Teknikken med fiksering av lysogangliosid GMleller dets derivater på bakteriekim er analog med den som er beskrevet ovenfor for fiksering på hematin.

Før fiksering av gangliosid GMleller dets derivater inaktiveres vibrionene ved behandling med et karbonylderivat (formol, glutaraldehyd osv.) under samme betingelser som beskrevet ovenfor for hematin.

I den eksperimentelle delen skal det beskrives hvordan gangliosid GM1og lysogangliosid G^ fikseres på slike bakterielle partikler, idet koleravibrioner tas som eksempel.

Det partikkelformige materiale ifølge oppfinnelsen kan likeledes oppnås ved å anvende organiske polymerpartikler som f.eks. syntetiske eller naturlige latekser, som bærere.

Generelt kan det anvendes organiske polymerpartikler som kan holdes i stabil, homogen suspensjon i vann, eventuelt takket være nærvær av et overflate-aktivt middel, fortrinnsvis et anionisk overflateaktivt middel. Det kan eksempelvis anvendes polymerer på basis av vinylmonomerer som f.eks. styren, butadien, divinylbenzen osv., som blant annet kan inneholde andre kjemiske funksjoner som f.eks. alkohol-, amin-, epoksyd-, karboksylsyre-, sulfonsyre- og tilsvarende ester-funksjoner.

Det er fastslått at fiksering av gangliosid GMltil lateks-partiklene følger de samme lover som fikseringen av hematinet. Det er spesielt observert at det er nødvendig å arbeide ved alkalisk pH for å tilkople gangliosidet GMl, men at det ikke er'nødvendig med alkalisk pH for å tilkople lysogangliosid GMl-Fiksering av toksinet gjennomføres på analog måte som beskrevet tidligere.

For latekser er forbehandlingen med et karbonylderivat vanligvis unødvendig. Likevel tillater en slik forbehandling en kjemisk aktivering av bæreren, for latekser som har Nt^-funksjoner.

Generelt er fikseringen av gangliosid eller dets derivater

til partiklene sannsynligvis forårsaket av et fenomen for in-korporering av den hydrofobe delen av gangliosidet eller dets derivater i de hydrofobe stillingene i bærer-partiklene.

Dette fenomen, tilstrekkelig i og for seg, kan eventuelt kom-pletteres ved en kjemisk koplings-reaksjon med reaktive funksjoner som eventuelt forekommer på partiklenes overflater.

Det partikkelformige materialet ifølge oppfinnelsen kan også oppbygges av partikler av aktivt karbon.

For partikler av kolloidalt karbon, analogt med de som inne-holdes i tusj, kan det anvendes samme teknikker som for lateks.

For større partikler av aktivt karbon, av størrelsesorden mellom 1 og 10yU, er teknikken for fiksering enda enklere,tatt i be-traktning den betydelige absorberingsevne for disse partikler. Også gangliosid G^ absorberes like godt ved nøytralt Ph som ved alkalisk pH. Fiksering av toksinet gjennomføres på analog måte som det som er beskrevet tidligere.

Det partikkelformige materialet ifølge oppfinnelsen kan frem-! stilles ved hjelp av polysakkaridpartikler. Med polysakkarid-j partikler menes synlige partikler, eller også løselige makromolekyler som er usynlige. Uttrykket "polysakkarid" omfatter her modifiserte polysakkarider. Disse polysakkarider

er spesielt dekstran, cellulose, stivelse, agarose, osv.,

eller også modifiserte polysakkarider, spesielt dialkylamino-alkyl- eller di(hydroksyalkyl)aminoalkyl-polysakkarider, som f .eks..' ;dietylaminoetyl-.dekstran, dietylaminoetyl-cellulose osv.

Polysakkaridene kan likeledes anvendes, ikke bare i partikkel-form, men i form av belegning på mineralpartiklene, særlig mineraloksyder som f.eks. de som er nevnt tidligere.

De porøse mineralpartiklene belagt med polysakkarider eller modifiserte polysakkarider kan spesielt være de som er beskrevet i fransk søknad nr. 76.23176, eller de som er beskrevet i den franske søknad som søkeren har innlevert samme dag som foreliggende søknad, med tittelen': "Nytt materiale som på reversibel måte kan fiksere biologiske makromolekyler,

dets fremstilling og dets anvendelse".

De mineralpartikler som er belagt med polysakkarider overens-stemmende med fransk søknad nr. 76.23176, består av et porøst bærermateriale, som f.eks. et porøst mineraloksyd som er direkte belagt med et aminert, polymert polysakkarid på over-flaten.

Den porøse, mineralske bæreren kan være silisiumoksyd, alumimium-oksyd, magnesiumoksyd, titanoksyd eller deres syntetiske eller naturlige derivater, som f.eks. glass, borsilikater, silikater, kaolin osv.

Den aminerte polysakkaridpolymer er fiksert til den porøse, mineralske bæreren ved liming.

Den indre overflate til den porøse, mineralske bæreren er fortrinnsvis mindre enn eller lik 100 m 2/g og skal om mulig ligge mellom 5 og 80 m 2/g. Poremiddeldiameteren er fortrinnsvis over eller lik 25 nm og ligger om mulig mellom 50 og 1000 nm. For større overflater eller for mindre porediametere blir inner^-.overflaten til bæreren utilgjengelig for polysakkaridpolymerene. Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er den porøse, mineralske bæreren silisiumoksyd eller aluminium-oksyd og fortrinnsvis en bærer av porøst silisiumoksyd med anionisk karakter oppnådd eksempelvis ifølge de fremgangsmåter som er beskrevet i franske patentskrifter 1.473.239, 1.473.240 og 1.482.867. i Det anvendes eksempelvis de porøse silisiumoksyder som markedsføres av Rhone-Poulenc Chimie Fine under betegnelsene "Spherosil XOB 030, XOB 015 og XOB 005", hvilke silisiumoksyder har overflater som er 50, 25 og 10 m 2/g, respektive.

Den aminerte polysakkaridpolymeren som tjener til å impregnere og belegge den interne overflate i den porøse, mineralske bæreren, kan ha en uttalt kationisk karakter og gode hydro-file egenskaper. Den bør ha en molekylvekt minst lik 10<4>dalton og den bør om mulig være mellom 10 5 og 10 6. Dens formel kan være hvilken som helst, og kan spesielt være et amin-derivat av dekstran, stivelse, cellulose, agarose eller en naturlig eller syntetisk polymer fra alle kjente kilder.

Aminfunksjonene i polysakkaridpolymeren kan være primære, sekundære eller tertiære eller eventuelt kvartære.

Polysakkaridpolymeren kan særlig overensstemme med den følgende formel I:

hvor R betyr en polysakkaridrest som f .eks.' en dekstran-, stivelse-, cellulose- eller agarose-rest, n er et helt tall fra 1 til 10 og fortrinnsvis fra 2 til 5, R-^ og R2er identiske eller forskjellige og betyr en lavere alkyl- eller hydroksyalkyl-radikal, eksempelvis følgende radikaler: -CH3, -CH2- CH3, -CH2OH, -CH2- CH20H eller -CH2- CHOH - CH^/og disse polymerer kan kvartæriseres ved hjelp av et klassisk kvartæriseringsmiddel, som f.eks. alkyl-eller hydroksyalkyl-halogenider, dimetylsulfat osv.

Blant polymerene av denne type kan spesielt nevnes de for- bindelser som er kjent under betegnelsene "DEAE Dextran"

(dietylaminoetyldekstran) med molekylvekter på 500000 og "QAE Dextran" (kvartærisert dietylaminoetyl-dekstran) markedsført av firma Pharmacia og den forbindelsen som er kjent under betegnelsen "DEAE stivelse" (dietylaminoetylstivelse) såvel som de kationiske stivelser som f.eks. de som selges under varemerket "Cato" fra Societe Roquette National.

Den aminerte polysakkaridpolymeren kan også fornettes ved hjelp av et fornetningsmiddel som f.eks. 1,4-butandiol-diglycidyleter eller eipklorhydrin, epibromhydrin og et diepoksyd med formel II:

hvor R<1>^er alkyl med fra 1 til 20 karbonatomer, fortrinnsvis lavere alkyl med fra 1 til 4 karbonatomer,

R'2og R'3betyr en hydrokarbonkjede med fra 1 til 10 karbonatomer og fortrinnsvis en lavere alkylenradikal, f.eks. di-epoksydet med formel:

Fremgangsmåten for fremstilling av disse partiklene som er belagt med aminerte polysakkarider, kan utføres ifølge to forskjellige metoder, nemlig impregnering på kolonne og impregnering i ovn. Disse to metoder skal omtales kort nedenfor.

Ifølge den første metoden innføres det porøse mineraloksydet

i en kromatograferingskolonne ved direkte å helle på det tørre og homogene pulveret. Deretter innføres den aminerte polysakkaridpolymeren i løsning. Overskudd av aminert poly-. sakkaridpolymer elimineres så ved eluering med en buffer.

Ifølge den andre metoden som gjelder impregnering i ovn, impregneres det porøse mineraloksydet etter å ha blitt veid, varmt eller kaldt ved hjelp av en vandig løsning av den aminerte polysakkaridpolymeren. Deretter tørkes i tørkeskap mellom 50 og 120° C til konstant vekt.

Det er mulig etter impregnering ifølge en av de metoder som er beskrevet ovenfor, og etter å ha tørket i tørkeskap ved 50 til 80° C for å oppnå et homogent pulver, å behandle det oppnådde produkt ved hjelp av en løsning av et fornetningsmiddel i et flyktig løsningsmiddel som eksempelvis etyleter.

Som fornetningsmiddel kan det anvendes hvilket som helst av de som er nevnt tidligere.

Etter fordampning av løsningsmidlet holdes en temperatur mellom 40 og 120° C, fortrinnsvis i ca. 15 timer.

De porøse mineralpartiklene som er belagt med polysakkarider, som er modifisert eller ikke, ifølge den franske søknaden som er innlevert på samme dag som foreliggende søknad og nevnt ovenfor, består av en porøs, mineralsk bærer belagt med en polysakkarid eller en modifisert polysakkarid, eksempelvis en aminert polysakkarid med formel I, idet nevnte polysakkarid-belegg om nødvendig er stabilisert ve d fornetning, og på nevnte belegg av polysakkarid eller modifiserte polysakkarid, er påpodet lysogangliosid GM1eller andre derivater som er delvis eller total-hydrolisert gangliosid GMl, som f.eks. definert ovenfor, med den generelle formel IV-N^, hvor R" er resten av molekylet av gangliosid G^ eller lysogangliosid G^-derivatet, idet podeforbindingen for nevnte molekyl til-svarer følgende generelle formel IV:

hvor R" er som definert foran og R^ - CH2 - betyr resten av nevnte polysakkaridpolymer eller modifiserte polysakkaridpolymer, når denne er underkastet en oksyderende behandling etterfulgt av en reduksjon.

Den porøse, mineralske bæreren består spesielt av et metall-oksyd som f.eks. silisium-, aluminium-, magnesium- eller titanoksyd, eller av deres syntetiske eller naturlige derivatet, som f.eks. glass, silikater, borsilikater, kaolin osv.; poly-~ sakkaridpolymeren er spesielt cellulose; den modifiserte polysakkaridpolymeren er spesielt dietylaminoetyldekstran, dietylaminoetylstivelse eller dietylaminoetylcellulose;

belegget på den modifiserte eller ikke modifiserte polysakkarid-polymeren er om nødvendig stabilisert ved fornetning, idet fornetningsmidlet for eksempel er en karbonylforbindelse, et halogenhydrin eller et diepoksyd, spesielt 1,4-butandiol-diglycidyleter, epiklorhydrin, epibromhydrin, eller et epoksyd med formel II, som definert foran.

Fremgangsmåten for fremstilling av materialene ifølge oppfinnelsen i den franske søknad som ble innlevert samme dag som foreliggende søknad, erkarakterisert vedat det utføres en belegning av den porøse, mineralske bæreren med polysakkarid-polymeren eller den modifiserte polysakkarid-polymeren, at belegget av polysakkarid om ønsket omdannes til et belegg av modifisert polysakkarid, at det om nødvendig gjennomføres en fornetning for å stabilisere belegget, at nevnte belegg av polysakkarid eller modifisert polysakkarid underkastes en okdysa-sjonsreaks jon ifølge kjente metoder, at nevnte således oppnådde oksydasjonsprodukt omsettes med lysogangliosid G M, eller ethvert annet derivat av gangliosid G^, som f.eks. definert ovenfor, med den generelle formel R"-NH2, hvoretter det oppnådde iminderivatet underkastes innvirkning av et reduksjonsmiddel som kan redusere iminbindingene til aminbindinger.

Den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor, består følgelig spesielt i å fiksere lysogangliosid G^ eller ethvert annet derivat av G^ som definert tidligere, til belegget av polysakkarid eller modifisert polysakkarid etter følgende reaksjons-sekvens: a) oksyderende behandling av alfa-glykol-grupper for å oppnå karbonylderivater som generelt kan angis med formelen R'^-CHO, hvor R'4er polysakkaridmolekyl-resten etter oksydasjonsbehandlingen; b) reaksjon mellom gangliosid G^-derivatet med formel R"NH2 I og karbonylgruppene ifølge reaksjonen: c) iminbindingen reduseres til stabil aminbinding, eksempelvis hydrogen in statu nascendi ifølge reaksjonen:

R 3 er definert som tidligere.

De forskjellige kjemiske omdannelser kan gjennomføres ved omgivelsestemperatur i en kromatografikolonne.

For oksydasjonsbehandlingen kan det eksempelvis anvendes per-jodsyre eller et av dennes derivater, som f.eks. et alkali-perjodat eller også blytetraacetat.

For reduksjohsreaksjonen kan eksempelvis et hydrid som f.eks. natriumborhydrid anvendes.

For å gjennomføre -belegningen av den porøse, mineralske bæreren med polysakkaridpolymeren eller den modifiserte polysakkarid-polymeren kan det eksempelvis gjøres som beskrevet i fransk søknad nr. 76.23176, dvs. at den porøse, mineralske bæreren i form av et pulver innføres i. en kromatografikolonne, en buffer med pH fra 3 til 12 føres gjennom kolonnen inntil likevekt, en løsning av nevnte polymer innføres i samme buffer, hvoretter det elueres inntil fravær av polymer i eluatet, eller den porøse, mineralske bæreren impregneres ved hjelp av en vandig løsning av nevnte polymer ved pH mellom 3 og 12 og tørkes deretter i tørkeskap mellom 50 og 120° C inntil konstant vekt.

For å oppnå et celluloseovertrekk er det fordelaktig å arbeide på følgende måte: den porøse, mineralske bæreren impregneres med en celluloseesterløsning, det tørkes og den belagte bærer underkastes innvirkning av en vandig alkaliløsning for å hydro-lysere estergruppene. Det oppnås på denne måte en porøs, mineralsk bærer overtrukket med således regenerert cellulose. Cellulosebelegget oppnådd på denne måte er meget stabilt og !dekker fullstendig porene i den porøse,mineralske bæreren. j

Det er unødvendig å stabilisere dette belegget ved fornetning.

Polysakkaridpolymeren eller den modifiserte polysakkaridpolymer som tjener til å impregnere og belegge den interne overflate .i den porøse, mineralske bæreren, har en molekylvekt på minst lo'* dalton og ligger fortrinnsvis mellom IO<5>og 10^ dalton.

For å fiksere koleratoksinet til de partikler som består av eller er dekket med lysogangliosid GM1eller dets derivater, arbeides det som beskrevet ovenfor for belagt hematin.

Foreliggende oppfinnelse gjelder likeledes .anvendelse av det partikkelformige materiale som på slik måte er belagt med koleratoksin. Denne anvendelse består i å administrere det partikkelformige materiale til levende vesener som har et immunitets-system for å- lede til dannelse av antilegemer.

Det er fastlagt at alle partikkelformige materialer ifølge oppfinnelsen kan .lede til syntese av aktive antilegemer i form av antikoleratoksin i meget store mengder etter injisering i dyret. Disse antilegemer kan isoleres fra blodet ifølge kjente metoder. Oppnåelsen av slike antilegemer er interessant fordi de kan utnyttes spesielt som reaktive stoffer i serologi.

For de dyr som kan påvirkes av kolera, og for mennesker, ut-gjør anvendelsen en vaksinering.

Oppfinnelsen gjelder således også det foran beskrevne, partikkelformige materiale som medikament.

Dette medikament kan administreres oralt, forsåvidt som det gjelder vaksine. Blant annet når materialet ifølge oppfinnelsen består av bærer-partikler av bakterie-kim og spesielt av in-aktivie vibrioner, eller av løselige polysakkarider eller modifiserte polysakkarider, kan det administreres parenteiralt, spesielt sub-kutant.

Fremgangsmåten for vaksinering ifølge oppfinnelsen består i å administrere en dose av det partikkelformige materialet på en gang eller i flere porsjoner, som kan føre til en immuni-tetsrespons ved dannelse av antilegemer.

Enn videre oppnås ved hjelp av de partikkelformige materialer ifølge oppfinnelsen, når de administreres oralt til mennesker som er bærere av vibrioner og risikerer å få synlig kolera eller diare, en stimulering av immuniteten, og spesielt en stimulering av slimhinnene i fordøyelseskanalene og i tarmene.

Når individene allerede på forhånd er vaksinert parenteralt eller oralt mot kolera ved hjelp av et renset og inaktivert toksinpreparat og/eller ved hjelp av en vaksine ifølge oppfinnelsen, oppnås blant annet ved hjelp av det partikkelformige materiale ifølge oppfinnelsen ved oral administrering en nydannelse av immuniteten i fordøyelses-slimhinnéne.

Det skal bemerkes at når spesielt partikler på basis av

karbon eller lateks anvendes, kan foruten koleratoksin også andre makromolekyler som forefinnes i kulturfiltratene fra koleravibrioner,-fikseres. Den immunitet som er indusert av disse partikler kan, selv om de er mindre spesifikke enn for de andre partiklene, medføre visse fordeler i tilfelle av at immuniteten bare mot toksinet ikke er tilstrekkelig.

Det skal likeledes bemerkes at det er mulig å fremstille partikler som er belagt med gangliosid eller lysogangliosid G,,n , men som ikke er mettet med koleratoksin. Administrasjon

Ml

via fordøyelsen av disse partikler som ikke er mettet med koleratoksin, til mennesker som er truet av kolera, muliggjør en dobbelt beskyttelse, siden de for det første induserer ønsket immunitet og for det andre beskytter individet tempo-rært mot enhver utskillelse av koleratoksin fra vibrioner som eventuelt forefinnes i tarmene, fordi dette koleratoksin fortrinnsvis fikseres til de stillinger som er belagt med gangliosid eller lysogangliosid G^ og som ennå ikke er mettet med koleratoksin.

I nærvær av gangliosid G , eller et derivat derav forbindes

M-L

koleratoksinet til partikkelen og toksinet blir samtidig og I automatisk inaktivert. Det kan faktisk verifiseres at det

således oppnådde partikkelformige materialet er. blottet for den toksiske karakter som er egen for koleratoksin.

På grunn av forbindelsen mellom koleratoksinet Og en partikkel blir toksinet lett gjenkjent av immunitets-cellene i organis-men. Partikkelen spiller således samtidig rollen som vaksi-neringsmiddel og tilsétningsmiddel.

Oppfinnelsen gjelder likeledes det partikkelformige materiale som er beskrevet ovenfor i egenskap av medikament og spesielt vaksine.

Medikamentet ifølge oppfinnelsen kan foreligge i form av et pulver (eksempelvis lyofilisert) for oppløsning eller suspen-dering i vann eller fysiologisk saltvann (løsning av ca. 9 g/l natriumklorid i vann), eller i form av en løsning eller suspensjon for direkte administrering.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen uten å begrense den.

Eksempel 1

Fiksering av koleratoksin til porøst silisiumoksyd belagt med "DEAE" dekstran fornettet med 1,4-butandioldiglydidyleter og deretter belagt med gangliosid.

Utgående fra 1 kg hjernemasse fra kalv fremstilles et vandig ekstrakt på ca. 7 liter (ifølge en fremgangsmåte beskrevet av L. Svennerholm: Gangliosides, isolation Methods in Carbo-hydrate Chemistry, vol. 6, utgitt av R. L. Whister og J. N. Bemiller, Acad. Press, New York 1972).

Denne vandige ekstrakt føres direkte på en kolonne med 50 g av en bærer fremstilt ifølge eksempel 3 i den franske patent-søknad nr. 76.23176, som på forhånd er brakt i likevekt med en buffer TRIS-HCI 0,05 m, pH 6,8. Påføringsmengden er 200 ml/cm 2/time. Gangliosidene, av hvilke 40% er gangliosid G^, henger fast ved kolonnen under disse betingelser. En forut-jgående vasking med følgende løsninger i angitt rekkefølge: TRIS-HCI,0,05m, pH 6,8

NaOH, 0,ln

H20

Kloroform-metanol-vann i følgende respektive volumetriske forhold (30-60-25) muliggjør fjerning av mange forurensninger. Etter at gangliosidet således er fiksert på den partikkelformige bæreren, fikseres så koleratoksinet på følgende måte: Det partikkelformige produktet oppnådd i foregående trinn inkuberes med en koleratoksin-løsning i noen minutter ved omgivelsestemperatur. Etter sentrifugering konstateres at den ovenstående væske ikke har toksisk karakter. Deretter vaskes bunnfallet fra sentrifugeringen med en natriumkloridløsning med 9 g/l for å eliminere proteiner som ikke er fiksert til lysogangsliosid G^. Det oppnås til slutt en suspensjon med 10% partikler. Denne suspensjon kan lyofiliseres.

Eksempel 2

Poding av lysogangliosid GMlpå porøst, mineralsk bærermateriale impregnert med dietylaminoetyldekstran som er se-kundært fornettet, og deretter fiksering av koleratoksin.

2.1. Bæreren på basis av "DEAE" dekstran fremstilles ifølge en av de teknikker som er angitt i fransk søknad nr. 76.23176.

10 g "Spherosil XOB 030" tilsettes 30ml 7,5%-ig "DEAE" dekstran

med pH 11,5. Blandingen tørkes en natt ved 80° C, tilsettes deretter 30 ml av en 1,5%-ig løsning av butandiol-diglycidyl-eter i etyleter. Eteren fordampes under luftstrøm, hvoretter blandingen holdes i 15 timer ved 80° C for å oppnå en fornetning av "DEAE"-dekstranet.

2.2. Løsningen av gangliosidet fremstilles ved ioneveksler-kromatografi på porøst silisiumoksyd impregnert med "DEAE"-dekstran ifølge den metode som er beskrevet i foregående eksempel.

Den rå gangliosidløsningen som oppnås på denne måten, inneholder omtrent 40% gangliosid G , som er anvendbart i foreliggende oppfinnelse.

De to N-acetyl-funksjoner og N-acetyl-funksjonen i gangliosid GMlnYdrolyseres så til amin-funksjoner, NH2, ved alkalisk hydrolyse ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet tidligere (Holmgren, Månsson, Svennerholm, Medical Biology (1974),

52, 229-233). Det produkt'som så oppnås, kalles lysogangliosid, og dette har tre NH2~funksjoner i molekylet. Etter lyofilisering oppløses det oppnådde pulver i en 0,0lm karbonat-buffer med pH 9 inneholdende 20 g/l NaCl, til en konsentrasjon på 1 mg/ml. 1 ml av denne løsning inneholdt omtrent 370^ug sialinsyre pr. ml.

2.3. Perjod-oksydasjon av bæreren. De 10 g "Spherosil XOB 0 30" impregnert med DEAE" dekstran som er fornettet to ganger, tilsettes 100 ml av en vandig, 0,02m natriumperjodat-løsning (pH nær 4,5). Oksydasjonstiden er 2 timer, og omgivelsestemperatur passer bra for denne operasjon.

Bæreren vaskes så i en 0,01m natriumkarbonatløsning med pH 9, tilsatt 20 g/l natriumklorid. Den høye ionestyrken for denne buffer skal mette de kationiske gruppene i fornettet og oksydert "DEAE" dekstran med Cl -ioner og hindre lysogangliosid fra å fikseres til slutt ved elektrostatiske krefter, hvorved det er risiko for å generere reaksjonen til amingruppene med aldehydfunksjonene på bæreren.

På dette stadium er det lett å påvise aldehydfunksjonene på den oksyderte bæreren. I nærvær av Schiffs reagens utvikles en intens rosa-violett farging.

2.4. Poding av lysogangliosid. Den foran nevnte bærer vaskes og deretter tilsettes 50 ml løsning av lysogangliosid G^. Etter en kontakttid på to timer avdekanteres den over-

stående løsningen. Ved en dosering av sialinsyre er det lett å vise at nesten alt lysogangliosid er koblet (95 - 100%).

i [.Bæreren vaskes med karbonatbuf f er med pH 9 . På dette stadium. JI

er det likeledes lett å vise at fargingen av bæreren med Schiffs reagens er meget svakere enn i foregående trinn,

hvilket indikerer at det foreligger en god fiksering av lysogangliosid til aldehydfunksjonene på den oksyderte bæreren.

2.5. Reduksjon ved hjelp av natriumborhydrid. 50 ml av en 0,2m NaBH^-løsning i vann tilsettes til den foran nevnte bærer. Etter en kontakttid på 2 timer ved omgivelsestemperatur skylles bæreren med vann og føres så på kolonnen.

Etter at likevekt i den valgte buffer er oppnådd (fosfatbuffer, 0,0lm, pH 7,2, inneholdende 20 g/l NaCl) er kolonnen med biospesifikk affinitet ferdig til bruk.

På dette stadium kan intet spor av aldehydfunksjoner lenger påvises ved farging med Schiffs reagens. De aldehydfunksjoner som ikke har- reagert med lysogangliosidet, er omdannet til primære alkohol-funksjoner.

2.6. Fiksering av koleratoksin. For fiksering av toksinet arbeides det på samme måte som beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 3.

Poding av lysogangliosid G M-, på den porøse, mineralske bæreren som er impregnert med cellulose, hvoretter koleratoksin fikseres.

3.1. Impregnering med cellulose. 10 g "Spherosil XOC 005"

(eller enhver annen porøs, mineralsk bærer) tilsettes 30 ml av en 3%-ig acetonløsning av celluloseacetat (propionatet av cellulose eller andre estere som er løselige i organiske løsningsmidler og er hydrolyserbare kan også anvendes forut-satt at de kan gi tilbake den opprinnelige cellulose ved alkalisk hydrolyse).

Blandingen tørkes under en varm luftstrøm. Pulveret kan så

om nødvendig siktes og påføres på en kolonne.

Vasking med 10 liter 0,ln vandig, NaOH-løsning gjennomføres så I kontinuerlig i en mengde av 500 ml/time i-en hel natt. Etter | denne alkaliske hydrolyse kan kolonnen vaskes med aceton eller

vann, avhengig av pH, den således regenererte cellulose er ikke lenger løselig og forblir fullstendig inne i porene i den porøse bæreren, som den dekker så godt at den opprinnelige polymeren lett har kunnet komme til i hele inneroverflaten. Anvendelse av estere med så lave molekylvekter som mulig an-befales av denne grunn.

3.2. Fremstilling av løsning av lysogangliosid G Ml med amin-funksjoner.

Samme betingelser som i avsnitt 2.2. i foregående eksempel.

3.3. Perjod-oksydasjon av bæreren. Samme betingelser som i avsnitt 2.3.

3.4. Poding av lysogangliosid. Samme betingelser som i avsnitt 2.4.'

3.5. Reduksjon med natriumborhydrid, NaBH^. Samme betingelser som i avsnitt 2.5.

3.6. Fiksering av koleratoksin. Samme betingelser som i eksempel 1.

Eksempel 4.

Fiksering av lysogangliosid G^ til hematin som på forhånd

er behandlet med et karbonylderivat, og deretter fiksering av koleratoksin.

4.1. Sauehematin vaskes fire ganger med fysiologisk saltvann

(pH 7,2, 9 g/l NaCl) slik at det til slutt oppnås en klar, overstående væske.

Hematinet bringes til en konsentrasjon på 8% i fysiologisk saltvann og tilsettes et like stort volum av en 3%-ig løsning av formaldehyd i fysiologisk saltvann.

o i Etter inkuberihg i 18 timer ved 37 C vaskes det formolerte hema-

tinet 4 ganger med destillert vann og bringes til en konsentrasjon på 10% med fysiologisk saltvann.

4.2. Behandling av hematin med glutaraldehyd. Sauehematin vaskes 4 ganger med fysiologisk saltvann og bringes på en konsentrasjon på 10% og tilsettes endelig et volum som er 20 ganger så lite av 5%-ig glutaraldehyd i fysiologisk saltvann med pH 7,2.

Etter en inkuberingstid på 2 timer ved omgivelsestemperatur vaskes det glutaraldehyd-behandlede hematin med destillert vann og bringes på 10% i fysiologisk saltvann.

4.3. Fiksering av gangliosid G,,-, til hematin som på forhånd er behandlet med et karbonylderivat.

Røde blodlegemer som er formolert eller giutaraldehyd-behandlet oppnådd ovenfor, vaskes med en 0,ln NaOH-løsning eller med en annen basisk løsning med pH over eller lik 8 og fortrinnsvis lik 13.

En 10%-ig suspensjon av disse blodlegemer inkuberes med en løsning av gangliosid i 0,ln soda inneholdende lOO^ug sialinsyre pr. ml, dvs. omtrent 0,5 mg gangliosid G^</m>l.

Inkuberingstemperaturen kan ligge mellom 0 og 60° C, men justeres fortrinnsvis til 45° C.

Kontakt-tiden er over 1 time, fortrinnsvis 15 timer.

Suspensjonen vaskes så, og doseringen av sialinsyre i den overstående løsning muliggjør fastsettelse av prosent fiksert gangliosid til de røde blodlegemene til ca. 50%.

Etter tre vaskinger med fysiologisk saltvann er sluttkonsentra-sjonen på 10%.

4.4. Fiksering av lysogangliosid G^ til hematin som på forhånd er behandlet med et karbonylderivat.

i

En suspensjon av formolerte eller glutaraldehyd-behandlede røde blodlegemer, fremstilt som foran, tilsettes 2 mg lyofilisert pulver av gangliosid G ,. En mengde på 0,1 til 10 mg gir likeledes tilfredsstillende resultater. Inkuberings-pH er 7,2, men kan selvsagt også være alkalisk som i den foregående fremgangsmåte.

Inkuberingstiden er fra 30 minutter til 3 timer.

Inkuberingstemperaturen kan variere fra 0 til 60° C, men

velges lik 37° C.

Etter sentrifugering inneholder ikke den overstående væske

etter koplingen mer enn 1 til 5% av opprinnelig lysoganglio-

sid, hvilket viser denne fikseringsmetodens effektivitet.

Endelig etter tre vaskinger med fysiologisk saltvann fåes

en sluttkonsentrasjon i suspensjonen på 10%.

Lysogangliosid G ^, som anvendes som utgangsprodukt, fremstilles ved alkalisk hydrolyse ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet av Holmgren, Månsson og Svennerholm, Medical Biology. (1974) , 52, 229-233).

4.5. Fiksering av koleratoksin. For fiksering av toksinet arbeides det analogt med den måten som er beskrevet i ek-

sempel 1.

Eksempel 5

Kopling av gangliosid G^ eller lysogangliosid G^ til lateks-partikler og siden fiksering av koleratoksin.

5.1. Tre volumer av en 10%-ig lateks-suspensjon tilsettes et volum av en gangliosidløsning inneholdende 1 til 3 mg GMlpr. ml.

Den lateks som brukes, er den som markedsføres av Rhone-Poulenc under varemerket "Estapor".

I i Suspensj■ onens pH justeres til 13 ved tilsetning av en tilstrekk<I>e- lig mengde normal soda.

Temperaturen ved inkuberingen er 45° C, men kan variere fra

5 til 60° C.

Kontakttiden er omtrent 15 timer.

Suspensjonen ultrasentrifugeres ved 30000 omdreininger pr.

minutt i en time

Bestemmelse av sialinsyre og bestemmelse av gangliosid i den overstående væske viser at alle G,„, er fiksert til lateks-

Ml

partiklene.

Etter tre gangers vasking med fysiologisk saltvann tilsatt "Tween 80" til 0,1% er det mulig å verifisere at all biologisk aktivitet hos G M, er forsvunnet fra den overstående væske, er ikke kommet til syne i den overstående del av vaskevannene og finnes beskyttet integrert i bunnfallet i en sluttkonsentrasjon på 1%.

5.2. Kopling av lysogangliosid G^. Samme teknikk som for gangliosid G^ anvendes, bortsett fra at pH ikke nødvendigvis er alkalisk. Nøytralt pH kan også- anvendes.

5.3. Fiksering av koleratoksin. Det arbeides som i eksempel 1. For separering av det endelig oppnådde partikkelformige materiale må sentrifugeringstrinnet erstattes med et ultrasentrifugerings-trinn i foreliggende tilfelle.

Eksempel 6

Kopling av gangliosid G^ til partikler av aktivt karbon, og deretter fiksering av koleratoksin.

6.1. Et volum av en 30%-ig suspensjon av karbonpartikler blandes med et volum av en løsning av gangliosid G^ med en konsentrasjon som varierer mellom 1 og 3 mg/ml. Etter sentrifugering, vasking og opptakning i en fysiologisk buffer med en konsentra-ts jon på 1% er suspensjonen klar for bruk for fiksering av .J

koleratoksin.

Ved å arbeide på samme måte kan lysogangliosid fikseres i stedet for gangliosid G^.

6.2. Fiksering av koleratoksin. Det arbeides på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Om nødvendig erstattes sentrifugering med ultrasentrifugering med 30000 omdreininger pr. minutt i omtrent en time (tillfeller der partiklene er kolloidale). Sentrifugeringsbunnfallet vaskes så med fysiologisk saltvann og det oppnås en konsentrert suspensjon som muliggjør fremstilling av doser av antikoleravaksine ved fortynning.

Eksempel 7.

Immunisering av kaniner..

Den 10%-ige suspensjon av partikler oppnådd i eksempel nr.

4 ovenfor injiseres subkutant i kaninene i en mengde av 1 ml

hver uke i fire uker. Hver av kaninene uten unntagelse immu-niseres og syntetiserer antilegemer som røde antiblodlegemer som lett elimineres ved blanding av antiserum med et volum av en 50%-ig suspensjon av nye, røde blodlegemer.

Etter behandlingen bemerkes:

a) at de således immuniserte kaninsera gir en enkel utfelningsrekke med et filtrat av en kultur som er så rik på toksin ved dobbelt immunodiffusjon; b) at denne utfelningsrekke danner en reaksjon som er fullstendig identisk med den rekke som oppnås mellom en kontroll-blanding av renset koleratoksin og de samme kaninantisera; og c) at denne utfelningsrekke ikke forekommer mellom kaninsera og det samme kulturfiltrat uten toksisk aktivitet.

Eksempel 8.

I Poding av gangliosid G^ eller lysogangliosid G^ til kolera- | vibrioner.

En suspensjon av koleravibrioner (av typen INABA eller OGAWA eller blandinger av disse) justeres til en konsentrasjon av 10 9 kim/ml. Denne suspensjon behandles med formol eller glutaraldehyd under betingelser som er strengt identiske med de som er beskrevet ovenfor for hematinsuspensjonen.

Koplingsteknikken for gangliosidet og lysogangliosidet G M-,

er den samme som beskrevet for hematinsuspensjonen. På samme måten er koblingsteknikken for det andre sjuktet (toksinet) den samme som beskrevet ovenfor for hematin.

Det oppnådde produkt kan om ønsket lyofiliseres.

Det utgjør en vaksine som kan administreres subkutant.

Eksempel 9.

Fiksering av koleratoksin til karbonpartikler belagt med gangliosid Gjyj-^uten metning av gangliosidet med toksin.

Det arbeides som beskrevet i eksempel 6 ved hele tiden å anvende en mindre koleratoksinmengde, eksempelvis på 50%, enn den som er nødvendig for å mette de reaktive stillingene i gangliosid G^.

Det oppnås en suspensjon som oralt administrert muliggjør å beskytte de personer som er utsatt for kolerasmitte, for syk-dommen .

Claims (21)

1. Partikkelformig materiale,karakterisertved at det består av bærer-partikler belagt med et første sjikt bestående av et gangliosid eller et derivat av et gangliosid med affinitet for koleratoksin og et andre sjikt bestående av koleratoksin.

2.. Materiale ifølge krav 1,karakterisertved at bærer-partiklene velges blant hematin, bakterie-kim, spesielt inaktiverte koleravibrioner, organiske polymerer som kan holdes i stabil suspensjon i vann, som f.eks. syntetiske eller naturlige latekser, karbonpartikler, partikler av polysakkarider eller modifiserte polysakkarider og porøse mineralpartikler belagt med polysakkarider eller modifiserte polysakkarider, som eventuelt er fornettede.

3. Materiale ifølge et av de foregående krav,karakterisert vedat gangliosidet eller gangliosid-derivatet velges blant gangliosid lysogangliosid , de partielle hydrolyseprodukter av gangliosid GM^og mono- og a-sialo-gangliosidene som oppnås ved syrebehandling av gangliosider eller deres derivater.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av materiale ifølge et av ce foregående krav,karakterisert vedat i et første trinn fikseres gangliosidet og/eller gangliosid-derivatet til bærer-partiklene, hvoretter i et andre trinn koleratoksin fikseres til de partikler som er belagt med gangliosid eller gangliosid-derivater.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at for å fiksere koleratoksin-sjiktet får partiklene som er belagt med gangliosid og/eller gangliosid-derivater, være i kontakt med det i en tid som er tilstrekkelig til å oppnå metning eller om ønsket, en delvis belegning av gangliosid med toksin.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 4 og 5,karakterisert vedat bærer-partiklene består av hematin som på forhånd er behandlet med et karbonylert derivat.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at for å fiksere gangliosid GM^til hematin som på forhånd er behandlet med et karbonylderivat, tilsettes en løsning av gangliosid ved pH over eller lik 8, fortrinnsvis nær 13, til en suspensjon av således behandlet hematin.

8.. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at for å fiksere lysogangliosid til en suspensjon av på forhånd med et karbonylderivat behandlet hematin, tilsettes til suspensjonen av røde blodlegemer således behandlet til en løsning av lysogangliosid G^ ved pH over 5.

9. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 4 og 5,karakterisert vedat det som bærer anvendes bakterie-partikler.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisertved at bakteriepartiklene er koleravibrioner.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisertved at koleravibrionene på forhånd er inaktivert med et karbonylderivat.

12. /Fremgangsmåte ifølge et av kravene 4 og 5,karakterisert vedat bærer-partiklene er organiske polymerer som kan holdes stabilt i suspensjon i vann.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisertved at nevnte organiske polymerer er basert på vinylmonomerer som f.eks. styren, butadien. eller divinylbenzen.

14. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 4 og 5,karakterisert vedat bærer-partiklene er karbonpartikler.

15. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 4 og 5,karakterisert vedat bærer-partiklene er polysakkaridpartikler eller modifiserte polysakkaridpartikler.

16. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 4 og 5,karakterisert vedat bærer-partiklene er porøse mineralpartikler belagt med polysakkarider eller modifiserte polysakkarider.

17. Anvendelse av materiale som definert i et av kravene 1 til .3 for fremstilling av antilegemet anti-koleratoksin, k a r a!k- terisert ved at nevnte materiale injiseres i et dyr, hvoretter de frembrakte antilegemer isoleres ved hjelp av kjente metoder.

18. Anvendelse av materialet som definert i et av kravene 1 til 3,karakterisert vedat det anvendes som medikament.

19. Anvendelse ifølge krav 18,karakterisertved at det partikkelformige materiale som er definert i et av kravene 1 til 3, administreres oralt til mennesker som er bærere av vibrioner og risikerer å få eller har kolera.

20. Anvendelse ifølge krav 18,karakterisertved at det administreres til mennesker parenteralt, spesielt sub-kutant, et partikkelformig materiale som definert i et av kravene 1 til 3, idet nevnte materiale fremstilles ved hjelp av bærerpartikler bestående av bakteriekum som f.eks. inaktiverte koleravibrioner eller av løselige polysakkarider eller løselige, modifiserte polysakkarider.

21. Medikament, spesielt vaksine,karakterisertved at den som aktiv ingrediens inneholder et partikkelformig materiale som definert i et av kravene 1 til 3.