DE2717782A1

DE2717782A1 - Verfahren zur gewinnung von insulin mittels genetisch umgebildeter funguszellen

Info

Publication number: DE2717782A1
Application number: DE19772717782
Authority: DE
Inventors: John Adolph Anderson; Minn Minneapolis; Mandayam Jeersannid Narasimhan; Mandayam Jeersan Thirumalachar
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1976-04-23
Filing date: 1977-04-21
Publication date: 1977-11-03
Also published as: DK178777A; NL7704409A; JPS52151794A; GB1570453A; BE853874A; CA1077870A; CH629533A5; AU2450477A; FR2348971A1; US4082613A; IT1080447B; SE7704689L; FR2348971B1

Description

REGENTS OP THE UNIVERSITY OF MINNESOTA, Minneapolis, Minnesota, V.St.A.

Verfahren zur Gewinnung von Insulin mittels genetisch umgebildeter Funguszellen

beanspruchte

Priorität: 2?. April 1976 - V.St.A. - Nr. 679 565

Die Erfindung liegt im wesentlichen auf dem Gebiet der medizinischen Biologie und insbesondere auf den Gebieten der

a) Endokrinologie, Physiologie und klinischen Medizin,

b) der Mikrobiologie und der Zellumbildung und

c) der Fermentationssysteme von menschlichen Zellen und Mikroorganismenzellen.

Seit der Entdeckung des Hormons Insulin und seiner Anwendung bei der Behandlung beim Menschen mit Diabetes mellitus ist Insulin in großen Mengen aus den Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen erhalten und gewonnen worden. Menschliches Insulin aus Menschenpankreas hat man nur im Laboratoriumsmaßstab erhalten. Insuline aus einer großen Anzahl von Tierarten, die von Fischen bis zu Elefanten und Walen reichen, sind

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isoliert lind im Laboratoriumsmaßstab untersucht worden. Vor kurzem hat der Mangel an Rinder- und Schweinepankreas die Suche nach einer Insulingewinnung aus anderen Quellen oder nach anderen Verfahren erforderlich gemacht. Hinzu kommt noch, daß, obwohl Rinder- und Schweineinsuline seit mehreren Jahren verwendet worden sind, Nachteile infolge der Spezies und der immunologischen Unterschiede bestehen, die bekanntlich bei einem längeren Gebrauch beim Menschen eine Antiinsulin-Antikörperbildung stimulieren. Demzufolge werden von zahlreichen Forschern wissenschaftliche Untersuchungen für Verfahren zur Gewinnung von menschlichem Insulin betrieben, das biologisch hochwirksam ist und keine Antigenbildung hervorruft.

Es sind zwei Richtungen zur Gewinnung von menschlichem Insulin versucht worden: Erstens die chemische Synthese von menschlichem Insulin und zweitens die Gewinnung von menschlichem Insulin durch Züchten von menschlichem Insulin erzeugenden ß-Zellen mittels in vitro-Gewebekulturen. Die chemische Synthese von menschlichem Insulin in großem Maßstab ist infolge der Kompliziertheit der bei der Synthese angewendeten chemischen Stufen und auch Infolge der vielfachen Kosten derartiger synthetischer Verfahren im Vergleich zu den anfallenden Kosten bei der Gewinnung von Rinder- oder Schweineinsulin noch nicht erfolgreich gewesen. Bezüglich der Gewebekulturen beschäftigten sich alle Verfahren - soweit sie sich darauf beziehen - mit Primärkulturen kleiner angelegter Gewebekulturen oder mit primären Einschichten von Insulin erzeugenden pankreatitischen ß-Zellen, die sowohl von einer großen Anzahl von Tier-Spezies als auch von Menschen erhalten worden sind. Jedoch überleben derartige Primärkulturen nicht

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lange und können auch nicht serienmäßig vermehrt werden, um eine genügende Anzahl von ß-Zellen zu erhalten, um auf diese Weise Insulin in großem Naßstab zu erzeugen.

Es istnun ein neues Verfahren zum Züchten von sowohl tierischen als auch menschlichen ß-epithelähnlichen Zellen gefunden worden, die Insulin serienmäßig in Sekundärkulturen erzeugen, wodurch man angemessene Mengen an menschlichem oder tierischem Insulin erhalten kann. Dieses neue Verfahren ist, obwohl es den von anderen Forschern beschriebenen Verfahren mit anderen Gewebekultüren weit überlegen ist, gegenwärtig noch nicht befriedigend, um Insulin oder menschliches Insulin in großem Maßstab zu erhalten, da die Wachstumsgeschwindigkeit von menschlichen ß-Zellen in in-vifcro-Kultüren verhältnismäßig begrenzt ist. Demzufolge umfaßt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren, bei dem man ein rasch wachsendes Zellsystem mit einer genetischen Information, die von menschlichem Insulin erzeugenden Zellen zur Bildung von menschlichem Insulin in großem Maßstab erhalten worden ist, umbildet.

Auf dem Gebiet der Mikrobiologie sind im Verlauf der letzten Jahre verschiedene Untersuchungen durchgeführt worden, um Zellen umzubilden. Hierbei werden folgende Wege beschritten:

1) Beeinflussung der Wachstumsgeschwindigkeit, der Morphologie und der Struktur,

2) Umbildung der Funktion und

2) Kombination der beiden Maßnahmen (1) und (2).

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Morpho-Zu (1): Die F^einflussung der Wachstumsgeschwindigkeit,der / · logie und der Struktur ist erreicht worden unter Anwendung physikalischer Mittel, wie Röntgenstrahlen oder einer Einwirkung von &-, Q- oder ^-Strahlen, durch chemische Methoden unter Anwendung von sowohl organischen als auch anorganischen Mitogenen oder Metaboliten von Mikroorganismen, wie solchen, die zur Actinomycesgruppe gehören, sowie schließlich durch biologische Maßnahmen durch Anordnen der Zellen in einer fremden Umgebung oder einem Züchten der Zellen in Berührung mit anderen Zellarten, um eine zwischenzellulare Reizübertragung zu erreichen. Derartige Beispiele reichen von der Umbildung von spezialisierten, ectodermalen Zellen zu keratinisierten und sogar fibroblastischen Zellen, wenn sie in ungeschützter oder feindlicher Umgebung angeordnet sind, bis zur Umwandlung der Bakterien in resistente Stämme, wenn sie in einem langdauernden oder chronischen Kontakt mit geringen subletalen Dosen entsprechender Antibiotika vorliegen.

Zu (2): Die Umbildung der Punktion oder eines Teils der Punktionen oder der funktionellen Eigenschaften ist mit dem Bakterium Escherichia coil erreicht worden. Escherichia coli-Bakterien, die gegen ein Antibiotikum anfällig sind, werden in einen

durch
reslstenten Stamm/Übertragen der genetischen Substanz (DNA) aus einem anderen Escherichia coli-Stamm, der bereits gegen das genannte Antibiotikum resistent 1st, umgebildet. Dies wird durch Extrahieren des Plasmids DNA aus den resistenten Bakterien und überführen auf den nicht resistenten Stamm unter Verwendung eines Virus als Trägermaterial erreicht. Dieses Verfahren ist durch Serienmäßige Übertragungen erweitert worden, um

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einen Escherichia coli-Stamm zu erhalten, der gegen mehrere Antibiotika resistent ist, indem ein anfälliger, nicht resistenter Stamm mit genetischer Substanz (DNA) aus verschiedenen, gegen unterschiedliche Antibiotika resistenten Escherichia coli-Stäramen umgebildet wird.

Schließlich hat man Escherichia coil umgebildet , um eine einzige, in der Krötenblase enthaltene Proteinsequenz zu erzeugen, indem genetische Substanz (DNA) aus den Zellen der Krötenblase umgebildet wird. In allen der vorgenannten Beispiele wird gereinigte oder native DNA als die als Umbildungsprinzip tragende Gen-Information eingesetzt und ein Virus angewendet, um die genetische Information aus der Ursprungsumbildungszelle zu der aufnahmefähigen umgebildeten Zelle zu tragen. Somit ist es möglich, daß außer den funktioneilen Cha-

rakteristika des Donators Escherichia coil oder der Zellen der Krötenblase in der aufnahmefähigen umgebildeten Zelle auch die funktioneilen Eigenschaften in Form von Proteinsequenzen des Trägervirus auftreten können, der ebenfalls in die genetische Sequenz der umgebildeten Zelle eingebracht wird .

Eine biologische Umbildung in Antibiotika erzeugenden Kulturen ist erfolgreich von einem der Erfinder erreicht worden. Hierbei wurde Streptomyces aureofaciens, das Chlortetracyclin erzeugt, unter Verwendung des funktioneilen Genoms bzw. Erbguts aus Streptomyces pimprina biologisch umgebildet, weichletzteres das gegen Fungi wirkende Antibiotikum Thiolutin erzeugt. Das biologisch umgebildete Streptomyces aureofaciens erzeugt außer Tetracyclin ebenfalls Thiolutin.

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Erfinder haben auch funktionell nicht spezifische menschliche schuppenförmige Zellen aus der Mundhöhle mit den das funktioneile Genom aus menschlichem Insulin erzeugenden Zellen umgebildet, um die bukkalen Zellen zur Erzeugung von Insulin geeignet zu machen, wie dies durch einen speziellen Radioimmunitatsversuch gemessen worden ist.

Für eine Umbildung eines rasch wachsenden Zellsystems, wie Mikroorganismen mit genetischem Material aus menschliches Insulin erzeugenden Zellen, ist das Bakterium Escherichia coli von.mehreren Forschern eingehend untersucht worden. Jedoch haben diese Untersuchungen noch zu keinem Erfolg geführt. Escherichia coli, das eine megaloplastische Zelle ist (ohne definierten Kern), scheint offenbar ein ungeeignetes Modell für einen Umbildungsversuch mit genetischem Material aus den entwickelten eukaryotischen Zellen (mit einem definierten Kern) zu sein, da Escherichia coli kein geeignetes nukleares Netzwerk haben würde, genetische Segmente aus menschlichen Zellen einzubringen, die an der Insulinerzeugung beteiligt sind. Es ist auch von Escherichia coli nicht bekannt, irgendwelche langkettigen Aminosäuren zu erzeugen, die wesentlich für eine Synthese des Insulins sein würden. Jedoch sind Fungi, die rasch wachsen, eukaryotische Zellen, von denen bekannt ist, daß sie langkettige Aminosäuresequenzen,wie einige Antibiotika, erzeugen. Demzufolge ist für eine Umbildung ein primitiver Fungus mit dem funktionellen Gen-Bestand aus menschliches Insulin erzeugenden Zellen zur Gewinnung von Insulin verwendet worden.

Zusammenfassend ist als Stand der Technik bekannt, Bakterien-

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zellen (Escherichia coli) mit genetischem Material aus einem anderen Escherichia coli umzubilden und menschliche und tierische Zellen mit genetischer Substanz aus anderen durch Viren (tumorbildenden und anderen Viren) infizierten menschlichen und tierisch»Zellen umzuwandeln. Es ist jedoch keine Veröffentlichung über eine Umbildung von primitiven Mikroorganismen, wie einem Fungus, mit genetischem Material aus menschlichen Zellen mit der Fähigkeit bekannt, eine sehr spezialisierte oder spezifische Substanz zu erzeugen, um die Mikroorganismen in die Lage zu versetzen, die spezifische Substanz, nämlich Insulin, durch diese primitiven Mikroorganismen zu erzeugen.

Aufgabe vorliegender Erfindung war es nun, ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Insulin durch eine genetische Umbildung von Funguszellen zur Verfügung zu stellen. Die Erfindung löst diese Aufgabe.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Insulin durch genetisch umgebildete Funguszellen, bei denen insbesondere Pankreaszellen ,entweder vom Menschen oder von Tier-Spezies, in einem selektiv differenzierten, mit Aminosäuren angereicherten Medium dispergiert und unter Zeilwachstumsbedingungen an Luft gezüchtet werden, um ein Wachstum der Insulin erzeugenden ß-Zellen zu erreichen. Die erhaltene Nährlösung wird dann serienmäßig mehrmals in Sekundärkulturen weitergezüchtet, bis die erwünschte Höchstmenge an Zellen erreicht ist. Die funktioneilen genomischen Bestandteile, welche die Fähigkeit der Zellen zur Erzeugung von Insulin bestimmen, werden dann aus den Zellen extrahiert. Der Extrakt wird in einem weiteren, mit Ami-

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nosäuren angereicherten Nährmedium in einem Inkubationsgefäß dispergiert. Die Dispersion wird dann mit einer neuen Spezies des Fungus des Genus Trichosporon beimpft, der aus dem Boden isoliert und als TC-II76 bezeichnet worden ist. Die Hinterlegung des neuen Bodenbakteriums Pseudosaccharomyces TC-II76 ist gemäß Eingabe vom 29. April I97I (866 O.G. 638) bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erfolgt. Das Bakterium hat die Bezeichnung ATCC 20477 erhalten.

Die Kultur wird dann unter Zeilwachstumsbedingungen in Gegenwart eines antifungalen Membranpermeabilitätsmittels und Mitogen inkubiert, um das funktionellen Genom bzw. das Erbgut in die" Funguszellen einzubringen. Die erhaltenen biologisch umgebildeten Funguszellen werden dann in ein mit Kohlehydraten und

turns-Stickstoff angereichertes Medium überführt, das unter Zellwachs/ bedingungen gehalten wird, bis der erwünschte Höchstwert an Funguswachstum erreicht ist. Danach werden die Zellen aus den Medien abgetrennt, und das Insulin wird aus den Zellen und der überstehenden Flüssigkeit unter Anwendung üblicher Techniken extrahiert.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin mittels genetisch umgebildeter Funguszellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) Insulin erzeugende ß-epithelähnliche Zellen aus der Bauchspeicheldrüse selektiv wachsen läßt und sie unter Zellwachs-

tumsbedingungen an Luft in einem mit Aminosäure angereicherten Nährmedium serienmäßig in Sekundärkulturen weiterzüchtet,

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(b) einen rasch zUchtbaren Fungus mit genomischen Bestandteilen, die aus den Zellen der Sekundärkultur extrahiert worden sind, beimpft und zum Einbringen des funktioneilen Genoms - . in die Funguszellen inkubiert,

(c) die erhaltenen biologisch umgebildeten Funguszellen in einem mit Kohlehydraten und Stickstoff angereicherten Nährmedium unter Zellwachstumsbedingungen inkubiert und

(d) die Funguszellen aus den Nährmedien abtrennt und anschiiessend das Insulin aus den Zellen und der überstehenden Flüssigkeit extrahiert.

Nachstehend werden im einzelnen die Verfahrensstufen, die bei der Extraktion des funktioneilen Genoms, der Umbildung der Fun-

guszellen und der Züchtung angewendet werden, und andere Eigenschaften der umgebildeten Funguszellen beschrieben.

I. Züchtung eines freie Zellen enthaltenden selektiven Systems von ß-epithelähnllchen Zellen

Die Bauchspeicheldrüsen erhält man durch steriles Sezieren, vorzugsweise aus menschlichen Föten bei der Autopsie, und trennt sie von der umhüllenden Peritonealhaut und zerschneidet sie unter Verwendung einer gebogenen Iris-Schere und der stumpfen Kante einer BD 19-Skelpellklinge in feine Stückchen. Anschliessend werden die kleingeschnittenen Bruchstücke J50 Minuten in 0,125prozentigem Trypsin bei etwa 32 bis J59°C (Höchstwert bei 37°) tryptinisiert. Dann werden die Zellen zentrifugiert, und das restliche Trypsin wird neutralisiert, indem man die Zellen in dem Nährmedium suspendiert. Die Zellen werden als frei suspendierte Zellen 4 Tage lang bei etwa 32 bis 39°C (Höchstwert

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it

bei 37°C) in sterilen Kunststoffflaschen mit geöffneten Belflftungsdeckeln gezüchtet, wobei man minütlich 8 bis 16 Liter Luft durchströmen läßt, die in dem mit Wasserrinnen für die Feuchtigkeit versehenen Inkubationsgefäß zirkuliert. Das Medium ("Medium alpha HC") ist ein selektives charakteristisches Medium, das ein selektives Wachstum der Insulin erzeugenden ß-epithelähnlichen Zellen erlaubt.

Ein beispielsweise mit Aminosäuren angereichertes Nährmedium ist als "Medium 199" mit Earle¹scher Base bekannt (Proc.Soc.Exp. Biol.Med. 7J5 (1950), 1; Growth 15. (1951), Hj Proc.Soc.Exp.Biol. Med. 7_4 (1950), 22; Proc.Soc.Exp.Biol.Med. J^ (1951), 88Ο; J. Cell & Comp.Physiol. 36 (1950), 411; J. Am.Med .Assn. ljjl (1953), IO81). Je Liter Medium fügt man etwa 5 bis 20 ml,: vorzugsweise etwa 10 ml, Leberextrakt, etwa 5 bis 20 mg, vorzugsweise 12,5 mg, Hydrocortison-sulfat und geringe Mengen Antibiotika und Mittel gegen Fungi zu.

Eine bevorzugte Zusammensetzung des Nährmediums zur Züchtung von Pankreaszellen in dem "Medium alpha HC" enthält die folgenden Bestandteile:

Medium 199 mit Earle¹scher Base

("GIBCO" der Grand Island Biological Co.) 100 ml

injizierbarer Leberextrakt ("Lexavite-Lilly") 1,0 ml Hydrocortison-sulfat 1,25 ng

kristallines Penicillin 50 000 Einheiten

Streptomycin-sulfat 50 mg

Nystatin, ein Polyen-Antibiotikum gegen

Fungi 5000 Einheiten.

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Nach einer 4tägigen Züchtung in dem vorgenannten charakteristischen Nährmedium -werden die Züchtungen mit "Medium alpha" als Sekundärkultur weitergezüchtet, weichletzteres die gleichen Bestandteile wie das "Medium alpha HC" aufweist, jedoch kein Hydrocortison-sulfat enthält. Alle 4 bis 8 Tage werden die Flaschen durch Teilen des Volumens des Nährmediums und der Zellen in zwei gleiche Anteile und Rekonstituieren mit der Zugabe eines entsprechenden Volumens frischen Nährmediums als Sekundärkulturen weitergezüchtet. Die Insulin-Untersuchungen unter Anwendung der Radioimmunitatstechnik werden jeweils am 8ten

Tag vor der nächsten Weiterzüchtung als Sekundärkultur durchgeführt.

II. Extraktion des makromolekularen funktioneilen

Genoms

Das funktionelle Genom kann nach einer der nachstehenden verschiedenen Methoden extrahiert werden:

(A) Die nach der Stufe I erzeugten Kulturen (Zellen und Nährmedium) enthalten in einer Größenordnung von 80 bis 100 Mikroeinheiten je ml immun reagierendes Insulin (IRl). Nach J5 und 6 derartigen serienmäßigen Sekundärkulturen werden 10 ml des Nährmediums, das Zellen nach einer 8tägigen Sekundärkultur enthält, bei 1800 bis 2000 UpM 20 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird nochmals weitere 20 Minuten bei 2800 bis 5000 UpM zentrifugiert. Die beiden Zentrifugate werden zusammengegeben und mit isotonischer Normalkochsalzlösung gewaschen und schließlich 3 mal zentrifugiert, um Spuren von Insulin enthaltendem Nährmedium zu entfernen.

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Die vereinigten zentrifugierten Zellen werden zuerst einer osmotischen Lysis unterworfen, indem man sie in 5 ml sterilem destillierten Wasser bei neutralem pH-Wert suspendiert. Als nächstes werden die Zellen und ihre Membranen einer niedere Temperaturen erzeugenden Lysis und Zerreißung durch mehrmaliges alternierendes Einfrieren der Suspension bei -8o°C mittels Trockeneis und Aceton und Auftauen auf 37°C unterworfen. Nach dem letzten Auftauen wird das Zeil-Lysat weiterhin J>0 bis 60 Sekunden lang mittels eines "Branson"-Ultraschallgerätes (Vibrator) bei J5»5 Watt beschallt.

Nach der Beschallung wird die Gesamtlösung durch ein steriles ^MMillipore"-Pilter"(40 mMikron) filtriert. Das erhaltene Produkt wird danach unter dem Mikroskop untersucht, um zu gewährleisten, daß es frei von Teilchen und Hautbruchstücken ist. Die erhaltene makromolekulare Zubereitung wird dann als funktionelles Genom in den Umbildungsversuchen verwendet. Alle Verfahrensmaßnahmen werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. .

(B) Alternativ kann man unter Verwendung geringer Volumina der Zellmassen 5 ml des Gesamtnährmediums mit einem Gehalt an den fötalen ß-epithelähnlichen Zellen und dem Medium alpha" mit dem gleichen Volumen sterilen destillierten Wassers vermischen. Nach einem abwechselnden Gefrieren und Auftauen und Beschallen und Filtrieren durch'ein "Millipore"-Filter .(40 mMikron) wie unter II(A) beschrieben - wird die zellfreie Gesamtlösung als funktionelles Genom verwendet.

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(C) In einer zweiten Versuchsreihe wird nach einer Behandlung der Zellen wie unter II(A) beschrieben das zellfreie Lysat 3-mal mit dem gleichen Volumen aus einem Gemisch von Isopentanol (Isoamylalkohol) und Chloroform im Verhältnis 1 : 2k extrahiert. Die Lösungsmittelphasen werden vereinigt und entweder gefriergetrocknet oder bei 4°C an Luft getrocknet und mit sterilem Wasser oder steriler Kochsalzläs ung bei einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 10 (Optimum bei pH 8) rekonstituiert und dann als Umbildungsfaktor verwendet.

(D) . Bei einer dritten Versuchsreihe werden die Zell-Lysate unter Verwendung der Hirt'sehen oder einer anderen Technik zur Gewinnung von DNA extrahiert.

Bei diesen Versuchen ist ersichtlich, daß die besten Ergebnisse für die Umbildung und gegebenenfalls für die Insulingewinnung mit einem funktioneilen Genom erhalten werden, das nach den Methoden II(A) und II(B) erhalten worden ist, obwohl DNA-Extrakte nach den Methoden II(C) und II(D) ebenfalls verwendet werden können.

III. Verfahren und Techniken zur Umbildung der Funguszellen

mit Insulin erzeugenden ß-epithelähnlichen Zellen von menschlichen Föten

Die genomischen Zubereitungen aus den spezifischen Zellen, die nach den Methoden H(A), II(B), H(C) und H(D) hergestellt worden sind, werden jeweils in 5 ml des "Medium alpha" eingebracht, das die folgenden Zusammensetzung aufweist:

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Medium 199 mit Earle¹scher Base

CbIBCO" der Grand Island Biological Co.) 100 ml injizierbarer Leberextrakt ("Lilly Lexavite") 1,0 ml Penicillin 50 000 Einheiten

Streptomycin 50 mg

Nystatin+) 5000 Einheiten.

+) gegebenenfalls können Hamycin oder Griseofulvin oder Amphotericin-B oder andere Mittel gegen Fungi in diesem Medium sowie demjenigen der Methode I verwendet werden.

5 ml Jedes Mediums werden in 15 χ 2,5 cm großen sterilen Röhrchen mit einer Suspension des neuen Erdbakteriums Pseudosaccharomyces TC-II76 beimpft und auf einem "Kahn"-Schüttler mit 400

etwa _{n n} Schüttelungen Je Minute bewegt und bei/ 27⁰C (26 bis 28⁰C) in kubiert. Nach 120 Stunden werden die Funguszellen, die in Gegenwart der Mittel, die die Permeabilität der Membranen der Fungi (wie Nystatin, Hamycin, Griseofulvin oder Amphotericin-B oder andere Antifungimittel oder Merabranpermeabilitätsmittel) beeinfJus-v sen,, und in Gegenwart des funktioneilen Genoms gezüchtet worden sind, damit die Funguszellen mit geänderter Membranpermeabilität zur Einbringung des funktionellen Gen-Bestandes in ihre intrazellulare Struktur befähigt werden, auf eine Petriplattenkultur mit einem Glukose-Hefe-Agar ausgestrichen und

6 Tage bei etwa 27⁰C inkubiert.

Einige Sporenkolonien, die sich entwickelt haben, werden selektiv isoliert und auf Schrägagar des gleichen Mediums übertragen, als SekundärZüchtung weitergezüchtet und für eine weitere groß angelegte Züchtung konserviert.

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Um aus dem Fungus TC-II76 Insulin zu erzeugen, werden Flüssigkeitskulturen von beiden Oberflächen und submers belüftete Kulturen hergestellt. Zu diesem Zweck werden Schüttelflaschen und Fermentoren unterschiedlicher Fassungsvermögen verwendet. Aus Gründen der Ergiebigkeit werden hauptsächlich Submerskultüren mit einer Belüftung von 0,25 bis 1 Volumen steriler Luft je Volumen Flüssigkeit angewendet. Oberflächenkulturen, die nicht bewegt werden, können ebenfalls mit verlängerter Inkubationszeit hergestellt werden.

Das Verfahren zur Gewinnung von Insulin unter Verwendung des Fungus TC-II76 ist ähnlich den an sich bekannten Verfahren, die in der Fermentationsindustrie zur Erzeugung von Antibiotika und Enzymen angewendet werden. Das Nährmedium besteht aus Kohlehydratquellen, wie Zuckern, Alkoholen und ihren Estern, Stärke und ölen, und Stickstoffquellen, die sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein können. Beispiele von Stickstoffquellen organischer Natur sind zahlreiche Formen von Ölkuchen, Peptonen und Proteinen pflanzlichen und tierischen Ursprungs, und Beispiele von anorganischen Stickstoffquellen sind Nitrate, Nitrite, Ammoniumsalze, Harnstoff usw. Des weiteren können die Medien zahlreiche Spurenelemente, Vitamine und Wachstumsbeschleuniger enthalten. Der pH-Wert des Nährmediums kann im Bereich von 2 bis 10 liegen, je nach den Bestandteilen der Medien. Die Inkubationstemperatur liegt bei 16 bis 32°C. Das Nährmedium mit dem Funguswachstum wird nach einer geeigneten Zeitdauer des Wachstums geerntet, die durch Versuche vorbestimmt wird, und die geernteten Zellen werden zur Extraktion des aktiven, in den Funguszellen erzeugten Metaboliten, nämlich des Insulins,verwen-

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Das Verfahren zum Wachsen des Fungus wird weiterhin durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Ein Nährmedium mit einem Gehalt von 3 % entfettetem Sojabohnenmehl, 2 % Glukose, 2 % Glycerin, 0,5 % Hefeextrakt und 1 % Magermilchpulver wird mit destilliertem Wasser vermischt. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt. Das Nährmedium wird auf 500 mlrPlaschen verteilt, die jeweils 100 ml Nährmedium enthalten, und 30 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird 1 ml einer Suspension von Funguszellen aus einer 8 Tage

im
alten Züchtung des/Kühlschrank aufbewahrten umgebildeten TC-II76 überimpft, und die Flaschen werden in einem Drehschüttler mit 220 UpM in einem auf 28⁰C konstant gehaltenen Raum angeordnet. Die Flaschen werden von Zeit zu Zeit auf Sterilität,, auf Wachstum und den Verbrauch an Zuckern und anderen Bestandteilen untersucht. In Abständen von 4Ό bis 96 Stunden, wenn ein entsprechendes Wachstum der Zellen und der biologischen Synthese von Insulin bei einem Höchstwert angelangt ist, werden die Flaschen abgeerntet. Die Masse der Hefezellen mit Psaudomycelbruchstücken wird geerntet, und die Zellen werden mehrmals abwechselnd mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, bis sie frei von den Bestandteilen des Nährmediums sind. Die derart erhaltenen abfilfcrierten oder zentrifugierten Zellen werden zur Gewinnung des Insulins extrahiert.

Beispiel 2

Nährmediumzusammensetzungen mit einem Gehalt an "Medium 199" mit Earle'scher Base mit 1 % Leberextrakt, Penicillin und Streptomycin werden beimpft und in der gleichen Weise, wie in

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Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, Die erhaltenen Funguszellen werden zur Gewinnung des Insulins extrahiert.

Beispiel 3
Nährmediumzusammensetzungen mit einem Gehalt an den unter

(1) genannten Zuckern, und mit organischen und anorganischen Stickstoffquellen, Mineralsalzen und Vitaminen werden mit TC-1176-Zellen beimpft und bei der optimalen Temperatur mittels einer Oberflächenkultur inkubiert. Nach einer Inkubationsdauer von J3 bis 30 Tagen, je nach der Wachstumsgeschwindigkeit des

Inhalte der
Fungus-Stammes, werden die/Flaschen oder Gefäße, in denen der Fungus unter sterilen Bedingungen gewachsen ist, vereinigt. Die Fungusaellen werden für eine weitere Verarbeitung geerntet und zur Gewinnung des Insulins extrahiert.

Das! Filtrat, das häufig eine gewisse Menge an dem aktiven Metaboliten Insulin enthält, kann ebenfalls extrahiert werden.

Obwohl die Erfindung hinsichtlich spezieller diskontinuierlicher kleiner
/\ Ansätze beschrieben worden ist, umfaßt die vorliegende Erfindung auch andere gleichartige Verfahren, bei denen das Wachstum des Organismus TC-II76 bezüglich der Insulinerzeugung durch absatzweise Fermentierung oder kontinuierliche oder halbkontinuierliche Fermentierungen und anschließendes Ernten der biologisch umgebildeten Fungizellen für eine Extraktion des Insulins in einem großen Maßstab durchgeführt werden kann.

Selbstverständlich können viele Modifikationen und Veränderun- , gen bei der vorstehend beschriebenen Erfindung vorgenommen werden, ohne sich vom Geist und Umfang der Erfindung zu ent-

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fernen. Die spezifischen beschriebenen Ausführungsformen sind lediglich als Beispiele zu werten, und die Erfindung ist nicht nur auf den Wortlaut der nachstehenden Ansprüche beschränkt.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Insulin mittels genetisch umgebildeter Funguszellen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Insulin erzeugende ß-epithelähnliche Zellen aus der Bauchspeicheldrüse selektiv wachsen läßt und sie unter Zellenwachstumsbedingungen an Luft in einem mit Aminosäuren angereicherten Nährmedium serienmäßig in Sekundärkulturen weiterzüchtet,

(b) einen rasch züchtbaren Fungus mit genomischen Bestandteilen, die aus den Zellen der Sekundärkultur extrahiert worden sind, beimpft und zum Einbringen des funktioneilen Genoms in die Funguszellen inkubiert,

(c) die erhaltenen biologisch umgebildeten Funguszellen in einem mit Kohlehydraten und Stickstoff angereicherten Nährmedium unter Zellenwachstumsbedingungen inkubiert und

(d) die Funguszellen aus den Nährmedien abtrennt und anschliessend das Insulin aus den Zellen und der überstehenden Flüssigkeit extrahiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bauchspeicheldrüse menschliche Bauchspeicheldrüsen verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Funguszellen solche des Fungus Pseudosaccharomyces TC-II76 (ATCC 20477) verwendet.

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ORIGINAL INSPECTED

4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Gewinnung von Insulin mittels genetisch umgebildeter Funguszellen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) aus Bauchspeicheldrüsen selektiv Insulin erzeugende ß-epithelähnliche Zellen erhält,

(b) diese Zellen' in einem mit Aminosäure angereicherten Nährmedium in einem offenen, belüfteten, auf etwa J2. bis 39°C gehaltenen Inkubationsgefäß dispergiert,

(c) anfänglich diese Zellen mehrere Tage unter Zeilwachstumsbedingungen an Luft hält,

(d) . die erhaltene AnfangsZüchtung jeweils nach mehreren Tagen

serienmäßig als Sekundärkulturen weiterzuchtet und das ursprüngliche Volumen mit zusätzlichem Nährmedium rekonstituiert,

(e) die Sekundärkultüren weitere mehrere Tage unter Zellwachstumsbedingungen an Luft hält, bis das gewünschte Optimum an Zellenwachstum erreicht ist,

(f) die Zellen aus den Nährmedien abtrennt und die genomischen Bestandteile aus den Zellen extrahiert,

(g) diese genomischen Bestandteile (funktioneUes Genom)

in einem weiteren, mit Aminosäuren angereicherten Nährmedium in einem Inkubationsgefäß dispergiert,

(h) diese Dispersion mit Pseudosaccharomyces TC-II76 (ATCC 2C477) beimpft,

(i) die Kultur unter Zeilwachstumsbedingungen in Gegenwart eines antifungalen Membranpermeabilitätsmittels und Mitogen zum Einbringen des funktionellen Genoms in die Funguszellen inkubiert,

(j) die erhaltenen umgebildeten Funguszellen in ein mit Kohle-

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hydraten und Stickstoff angereichertes Nährmedium überführt, (k) die Kultur unter Zeilwachstumsbedingungen hält, bis das

gewünschte Optimum beim Funguswachstum erreicht ist und (1) die Zellen aus den Nährmedien abtrennt und das Insulin aus den Zellen und aus den Nährmedien extrahiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bauchspeicheldrüse menschliche Bauchspeicheldrüsen verwendet und als Insulin menschliches Insulin erhält.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Aminosäuren angereichertes Nährmedium das "Medium 199" mit Earle¹scher Base verwendet, das durch Zusatz von geringen Mengen Leberextrakt, Hydrocortison und gegen Bakterien und Fungi wirkende Antibiotika ergänzt ist.

7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährmedium eine Zusammensetzung verwendet, die etwa 5 bis 20 ml Leberextrakt und etwa 5 bis 20 mg Hydrocortisonsulfat Je Liter des "Medium 199" enthält.

8. Verfahren zur Gewinnung von Insulin mittels serienmäßiger Sekundärkulturen von Insulin erzeugenden Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) aus Bauchspeicheldrüsen Insulin erzeugende ß-epithelähnliche Zellen selektiv erhält,

(b) diese Zellen in einem mit Aminosäuren angereicherten Nährmedium in einem offenen belüfteten Inkubationsgefäß dispergiert,

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(c) anfänglich diese Zellen mehrere Tage unter Zellwachstumsbedingungen an Luft hält,

(d) die erhaltene Anfangskultur jeweils mehrere Tage serienmäßig als Sekundärkulturen weiter züchtet und das ursprüngliche Volumen mit zusätzlichem Nährmedium rekonstituiert,

(e) die Sekundärkulturen weiterhin mehrere Tage unter Zellwachs tumsbedingungen an Luft hält, bis das gewünschte Optimum des Zellwachstums erreicht ist, und

(f) die Zellen aus den Nährmedien abtrennt und das restliche Insulin extrahiert.

9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bauchspeicheldrüse menschliche Bauchspeicheldrüsen verwendet und daß man als Insulin menschliches Insulin erhält.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß nan als mit Aminosäuren angereichertes Nährmedium das "Medium 199" mit Earle'scher Base verwendet, das mit geringen Mengen Leberextrakt, Hydrocortison und gegen Bakterien und Fungi wirksame Antibiotika ergänzt ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährmedium eine Zusammensetzung verwendet, die etwa 5 bis 20 ml Leberextrakt und etwa 5 bis 20 mg Hydroeortisonsulfat je Liter des "Medium 199" enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Anfangskultur etwa 8 Tage inkubiert.

7098U/0947

13· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sekundärkulturen etwa 4 bis 8 Tage inkubiert.

709844/0947