DE1942833B2 - Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel - Google Patents
Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches MittelInfo
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Description
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, danach hergestellte
L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel.
Das Enzym L-Asparaginase (3,5,1,1-L-Asparaginamidohydrolase
in der Nomenklatur der Internationalen Enzym-Kommission 1961) hat, falls es von bestimmten
Ausgangssubstanzen abgetrennt wird, eine Antitumorwirkung und bietet sich als neue, erfolgversprechende
Therapie für einige Formen von Leukämie und ausgebreitetem Krebs (Metastasen) an (vgl. zum
Beispiel Hill et al. in »J. A. M. A.« 1967, 202, Nr. 9, S. 116). Die Antitumorwirkung wurde zuerst in Meerschweincher.serum
entdeckt, später auch in Kulturen der Bakterien Escherichia coli und Serratia marcescens.
L-Asparaginase wird normalerweise kommerziell durch Abtrennung aus Kulturen Escherichia coil
gewonnen. Die kommerzielle Herstellung wird jedoch durch den relativ geringen Wirkungspegel von
L-Asparaginase in diesen Kulturen beeinträchtigt, so daß L-Asparaginase nur in sehr geringen Mengen
verfügbar ist, was die therapeutische Verwendung dieses Enzyms sehr erschwert.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahrer: zur Erzeugung von L-Asparaginase zu
entwickeln, bei dem die eingesetzten Bakterien eine größere Ausbeute an medizinisch brauchbarer
L-Asparaginase als die bekannten Bakterien Escherichia coli und Serratia marcescens liefern, und die so
erzeugte L-Asparaginase als therapeutisches Mittel zur Verfügung zu stellen.
Gegenstand der Erfindung, womit diese Aufgabe gelöst wird, ist zunächst ein Verfahren zur Erzeugung
von L-Asparaginase, gemäß dem man Bakterien in einem Nährmedium aerob züchtet, mindestens einen
Teil der entstandenen Bakterienzellen zwecks Freisetzens der L-Asparaginase aufbricht und die freigesetzte
L-Asparaginase isoliert, mit dem Kennzeichen, daß man Bakterien der Gattung Erwinia einsetzt.
Vorzugsweise setzt man Bakterien einer der Arten Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia
aroideae und Erwinia atroseptica ein.
Die Bakterien der Gattung Erwinia sind an sich als pathogen für Pflanzen bekannt. Die L-Asparaginase
wird aus Bakterien dieser Gattung isoliert, indem man die Bakterien auf einem geeigneten Nährboden züchtet,
bis sie in einer gewünschten Menge vorliegen, und anschließend die L-Asparaginase entweder nach üblichen
Zeilzerreißverfahren oder nach einem Verfahren abtrennt, wie es in der am gleichen Tag eingereichten
deutschen Patentanmeldung P 19 42 900.6-41 beschrieben ist.
Vorzugsweise züchtet man die Bakterien in einem flüssigen Nährmedium.
Die Temperatur wird beim Züchten vorteilhaft im Bereich von 10bis40°Cgehalten.
Der pH-Wert des Nährmediums wird vorzugsweise im Bereich von 6 bis 8 gehalten.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem L-Asparaginase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt ist.
Schließlich ist Gegenstand der Erfindung auch ein Mittel gegen Leukämie oder ausgebreiteten Krebs bei
Lebewesen, mit dem Kennzeichen, daß es aus einer Lösung von L-Asparaginase gemäß Anspruch 9 in
physiologischer Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein/ml Lösung besteht.
Die Enzymwirkung der Erwinia-Arten, insbesondere von Stämmen der Art Erwinia carotovora, ist oft sehr
hoch und kann bedeutend höher als die Enzymwirkung von L-Asparaginase sein, die aus den bisher verwendeten
Ausgangssubstanzen gewonnen wird.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die L-Asparaginase aus Bakterien der Gattung Erwinia
gewonnen werden, die unter irgendeiner der Bedingungen gezüchtet worden sind, die gewöhnlich zur
Züchtung benutzt werden. Die Züchtung von Erwinia ist von Bergey in seinem »Manual of Determinative
Bacteriology«, 7. Auflage 1957, auf S. 355 abgehandelt worden. Die Bakterien können in verschiedenen festen
oder flüssigen Nährböden oder Kulturmedien gezüchtet werden, wobei letztere zur Erzeugung größerer
Mengen bevorzugt werden. Es können chemisch einfache Nährböden, die Stickstoff in anorganischer
Form enthalten, und Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Glycerol oder dergleichen, verwendet werden. Wahlweise
können die Bakterien in komplizierter aufgebauten Nährböden gezüchtet werden, die Peptone,
Proteinhydrolysate, Hefeautolysate oder dergleichen enthalten. Wahlweise oder zusätzlich können Stickstoffoder
Kohlenstoffauellen verwendet werden. Wenn die
Bakterien in einem flüssigen Nährboden gezüchtet werden, kann entweder von einer chargenweisen oder
kontinuierlichen Kultivierung Gebrauch gemacht werden. Die Kulturen werden auf einer Temperatur von
10-400C, vorzugsweise 25-35°C, und auf einem
pH-Wert von etwa 6 — 8 gehalten. Die Bakterien werden normalerweise unter aeroben Bedingungen
gezüchtet, können aber auch bei geeigneten Umständen anaerob gezüchtet werden.
Im folgenden Ausführungsbeispiel werden Arten von Escherichia coli, Serratia marcescens und Erwinia unter
identischen Bedingungen gezüchtet, und die spezifische Wirkung der erzeugten L-Asparaginase wird in Tabelle
1 verglichen.
Ausführungsbeispiel 1
Die unten in der Tabelle I angegebenen Bakterien wurden sämtlich cuf einem Agar-Agar-Nährboden bei
300C während 48 h gezüchtet. Teile der Bakterien wurden mit einem Platinbügel in einen 0,05 M
Boratpuffer (0,05 M in bezug auf Na+) bei einem pH-Wert von 8,5 bis zu einer Konzentration von
0,5 —2mg Protein/ml (bestimmt nach Lowry) eingebracht.
Davon wurde ein Teil weiter auf etwa 10 —50 μg
Protein/ml in 0,05 M Boratpuffer verdünnt, und das Protein wurde bestimmt. Ein zweiter Teil wurde auf
10-50 μg Protein/ml mit 0,05 M Boratpuffer verdünnt, der 50 μg/ml Rinderserum-Albumin-Fraktion V für die
Bestimmung der L-Asparaginase enthielt. Diese Untersuchung wurde durch Brüten einer Suspension der
verdünnten gepufferten Bakterienkultur mit 1OmM L-Asparagin während 20 min bei 37°C durchgeführt.
Das erzeugte Ammoniak wurde nach N e s s 1 e r bestimmt. Die spezifische Wirkung der Kultur wurde
dann als das Verhältnis der (μΜοΙ erzeugtes Ammoniak/min)
zu Protein (mg) berechnet.
Bacterium
Hinterlegungs-Nr.
Spezifische Wirkung
Tabelle I | Hinterlegungs- | Spezifische |
Bacterium | . Nr. | Wirkung |
A.T.C.C. 11303 | 0,48 | |
Escherichia .x>li | M.R.E. 163 | 0,27 |
Escherichia coli | M.R.E. 164 | 0,65 |
Escherichia coli | N.C.T.C. 8164 | 0,46 |
Escherichia coli | N.C.T.C. 8196 | 0,36 |
Escherichia coli | N.C.T.C. 9001 | 0,47 |
Escherichia coli | N.C.I.B. 1377 | <0,05 |
Serratia marcescens | N.C.I.B. 4612 | <0,05 |
Serratia marcescens | N.C.I.B. 8266 | 0,2 |
Serratia marcescens | N.C.I.B. 8889 | 0,15 |
Serratia marcescens | N.C.I.B. 9155 | 0,15 |
Serratia marcescens | M.R.E. UK/8 | 0,26 |
Serratia marcescens | N.CP.P.B. 1274 | 0,54 |
Erwinia aroideae | N.CP.P.B. 1380 | 1,15 |
Erwinia aroideae | N.CP.P.B. 549 | 0,54 |
Erwinia atroseptica | N.CP.P.B. 31 | 0,53 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 312 | 1,5 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 392 | 0,6 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 438 | 1,0 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 468 | 0,51 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 491 | 0,95 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 569 | 0,79 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 708 | 4,9 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 898 | 1,2 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 1065 | 4,1 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 1066 | 6,3 |
Erwinia carotovora | N.CP.P.B. 1120 | 3.0 |
Erwinia carotovora | ||
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora
Erwinia chrysanthemi
Erwinia carotovora
Erwinia chrysanthemi
N.CP.P.B. | 1280 | 1.5 |
N.CP.P.B. | 1281 | 1.0 |
N.CP.P.B. | 516 | 0,68 |
A.T.C.C.
M.R.E.
M.R.E.
American Type Culture Collection, U.S.A.
Microbiological Research Establishment, Salisbury,
England
N.C.l.B. National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen,
N.C.l.B. National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen,
Scotland
N.CP.P.B. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,
N.CP.P.B. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,
England
N.C.T.C. National Collection of Type Cultures, U.S.A.
N.C.T.C. National Collection of Type Cultures, U.S.A.
Es sollen jetzt Ausführungsbeispiele der Erzeugung von L-Asparaginase in Tiefkultur sowohl chargenweise
als auch kontinuierlich angegeben werden.
Ausführungsbeispiel 2
150 ml Robertsons Kochfleischbrühe wurden mit einer gefriergetrockneten Kultur von Erwinia carotovora
(N. C P. P. B. 1066) geimpft und über Nacht (17 h lang) bei 37°C gezüchtet und bei 4°C gelagert.
Roux-Flaschen-Agar-Agar-Fladen (flats) (Kulturoberfläche
10 cm χ 20 cm, enthaltend eine Brühe von 30% Oxoid-CM-129-Granulat, verfestigt mit 2,40Zo Oxoid-Agar
Nr. 3) wurden mit 5 ml Brühenkultur geimpft und bei 37° C während 12 h gezüchtet und anschließend
wieder bei 4°C bis zu 4 Wochen gelagert. Unmittelbar vor Gebrauch wurden vier Roux-Flaschen mit 50 ml
destilliertem Wasser in eine Impfflasche ausgewaschen und mit destilliertem Wasser auf 550 ml aufgefüllt. Der
Inhalt der Impfflasche wurde verwendet, um 15 1 sterilen Nährboden (525 g Brauerhefeautolysat, 3,5%) zu impfen,
der auf einen pH-Wert von 6,8 — 7,0 vor der Sterilisierung eingestellt und auf 37°C vor seiner
Verwendung vorgewärmt worden war. Eine Brutdauer von 12 h bei 37°C in einem Wasserbad bei einer
Belüftung von 12 l/min durch ein Rohr mit einer Bohrung von 0,625 cm (0,25 Zoll) ergab den Impfstoff in
einer für das Verfahren gemäß der Erfindung geeigneten Form.
Die Kultur wurde in einem sterilisierbaren Kulturgefäß aus rostfreiem Stahl aufbewahrt, das mit einem Heizmantel und einer Einrichtung zur Regelung der Temperatur des Inhalts versehen war.
Die Kultur wurde in einem sterilisierbaren Kulturgefäß aus rostfreiem Stahl aufbewahrt, das mit einem Heizmantel und einer Einrichtung zur Regelung der Temperatur des Inhalts versehen war.
Ein geeignetes Kulturgefäß hat oben und unten sterile Lufteinlaßschlitze. Der Deckel, durch den das Gefäß
luftdicht abgeschlossen werden kann, hat Einlaßschlitze, durch die ein Schaumverhütungsmittel, ein Puffer, der
Impfstoff und zusätzliche Stoffe eingeführt werden können. Ein rostfreier Stahlrührer dient zum Umrühren
des Inhalts des Gefäßes, ferner ist ein pH-Wert-Regler vorhanden. Der pH-Wert-Regler kann auf den gewünschten
pH-Wert eingestellt werden und wenn während der Kultivierung der pH-Wert steigt, gibt eine
peristaltische Pumpe bei Bedarf einen autoklaveingeschlossenen 3,2-M-Phosphorsäurepuffer ab.
Der Nährboden wurde durch folgendes Verfahren hergestellt: 16,3 kg Brauerhefeautolysat wurden in 50 1
heißem Leitungswasser aufgelöst, umgerührt und in Leitungswasser gebracht, das in einem sterilen Kulturgefäß
enthalten war, um das Volumen auf 3691 aufzufüllen. Kaustische Soda (0,51 10 n) wurde zugesetzt,
um den pH-Wert auf 6,8 — 7 einzustellen. Der Nährboden wurde sofort durch Umrühren während
30 min bei 121°C sterilisiert, wobei die Temperatur
durch einen Dampfmantel, Dampfzufuhr oder -ablassen geregelt wurde. Der Nährboden wurde dann gekühlt,
und der Gefäßdruck wurde über dem Atmosphärendruck durch Einleitung steriler Luft gehalten. Die
Temperatur und der pH-Wert wurden auf 37°C bzw. 6,8 — 7,0 eingestellt und ein Schauinverhütungsmittel
wurde zugeführt. Das Schaumverhütungsmittel war eine 25 Vol.-% wäßrige Silikon-Emulsion, die autoklaveingeschlossen
aseptisch in den Kulturgefäßdeckel geleitet wurde. Der Druck im Kulturgifäß wurde abgelassen,
und 10 l/n-iin sterile Luft wurden in den Nährboden des
Kulturgefäßes eingeleitet. Der Nährboden wurde durch den Rührer mit 385 U/min umgerührt.
15 I Impfstoff wurden dann in das Kulturgefäß über einen Schlitz im Deckel eingeleitet. Der pH-Wert-Regler
war auf einen pH-Wert von 6,8 — 7 und der Temperaturregler auf 37°C eingestellt. Der Ablauf des
Verfahrens wurde durch Messen der Kohlendioxyd-Entwicklung und durch Enzymuntersuchungen
verfolgt.
Diese Untersuchungen zeigten, daß die Enzymwirkung, gemessen in internationalen Einheiten (I. U.)/ml
Kultur, nach etwa 8 h in diesem nicht ergänzten
Nährboden unverändert blieb. Nach Erreichen dieses konstanten Werts wurden der ρH-Wert- und Temperaturregler
abgeschaltet und die Luftzufuhr zum oberen Ende des Kulturgefäßes umgeleitet, um eine sterile
Dichtung zu erreichen. Das Urn rühren wurde fortgesetzt, und die Kultur wurde auf 20°C in etwa 1 h durch
Umwälzen von Kühlwasser durch den Mantel abgekühlt. Die Kultur wurde dann zentrifugiert und der
Zellbrei in einen Mischer gefüllt. Ein Puffer, der lOmMTris-HCI, 3OmM Natriumchlorid und ImM
Äthylendiamintetraessigsäure enthielt, wurde bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 20°C mit
dem Zellbrei in einem Verhältnis von 1 I Puffer/kg Zellbrei schaumig gemischt. Die L-Asparaginase wurde
dann aus der erhaltenen gepufferten Mischung nach dem in der bereits erwähnten Anmeldung der gleichen
Anmelderin P 19 42 900.6-41 beschriebenen Verfahren abgetrennt. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen
im Auflösen der Zellen durch ein stark alkalisches Reagenz, im Zentrifugieren und Salzausfällen der
Supernatanz oder schwimmenden Deckschicht, um das Enzym zu isolieren. Die Ergebnisse für 7 Kulturen sind
in Tabelle II angegeben.
Tabelle | II | Zell | Wirkung | auf Trockengewicht | Schaum | Trocken- Trocken | t gewicht | I.UVml | H3PO4 | Schaum- | CO2*) | N (g/l) | In |
Aus | Zell | schaum | auf Protein unter | 3,50 | gewich | insgesamt | verhü- | max. | Nähr | Super | |||
beute | brei | : von | 3,05 | (kg) | tungs- mit tp\ |
boden | natanz | ||||||
(I) | L-Asparaginase | 3,92 | (g/i) | 1,05 | (D | IlllllCI (1) |
(0/0) | ||||||
(I) | (kg) | 6,81 | (Megaeinheiten) | 3,46 | 2,80 | 0,97 | 2,4 | 0,2 | 1,6 | 2,30 | 1,90 | ||
375 | 3,91 | 6,18 | Kultur | 1,79 | 2,72 | 1,09 | 1,65 | 0,93 | 1,5 | 2,01 | 1,74 | ||
355 | 3,52 | 7,76 | 3,42 | 3,32 | 2,90 | 1,15 | 2,4 | 0,50 | 1,6 | 2,21 | 1,96 | ||
375 | 4,45 | 7,56 | 2,80 | 3,85 | 2,95 | 0,80 | 2,4 | 0,55 | 1,6 | 2,09 | 1,89 | ||
390 | 4,34 | 5,55 | 4,08 | 3,98 | 2,10 | 1,17 | 1,08 | 1,25 | 1,5 | 2,21 | 1,93 | ||
380 | 3,09 | 7,21 | 2,70 | 3,52 | 3,0 | 1,10 | 2,34 | 0,15 | 2,0 | 2,13 | 1,85 | ||
390 | 4,14 | 7,21 | 1,54 | 4,29 | 2,9 | 1,14 | 2,50 | 0,15 | 2,25 | 2,21 | 1,93 | ||
380 | 4,08 | 7,43 | 3,10 | 34,68 | 3,14 | 1,07 | 2,40 | 0,36 | 2,3 | 2,55 | 2,04 | ||
355 | 4,22 | 7,13 | 3,05 | 2,96 | 0,89 | 2,40 | 0,80 | 1,7 | 2,46 | 2,02 | |||
360 | 4,11 | 7,40 | 3,00 | 2,37 | 10,43 | 2,45 | 0,20 | 2,3 | 2,42 | 2,07 | |||
375 | 4,20 | 70,24 | 3,19 | ||||||||||
3735 | 40,06 | Enzymwirkung | 3,75 | der Annahme, daß | |||||||||
Mittlere | Γ | 30,63 | -8,2 | ||||||||||
In Kultui | -2,9 | I.UVmg Trockenzellen | |||||||||||
Bezogen | -4,1 | I.U.5mg Protein | |||||||||||
Bezogen | |||||||||||||
Protein 70% des Trockengewichts ausmacht *) Maximale Anzeige des CO2-Analysators im Abluftstrom.
Ausführungsbeispiel 3
Eine Kultur Erwinia carotovora (N. C. P. P. B. 1066) wurde in einer kontinuierlichen Kultur in einem »Porton
Type«-Kulturgefäß für kontinuierliche Kulturen gezüchtet, wie es von Herbert, Phipps und
Tempest (Laboratory Practice 1965, 14, 1150-1161)
beschrieben worden ist. Das mit einem Rührwerk versehene Gärgefäß wurde mit einer automatischen
Einrichtung zur Regelung der Temperatur und des pH-Wertes ausgerüstet, die bzw. der auf 370C bzw. 7,0
gehalten wurde. Der Nährboden war 5°/oiges Brauerhefeautolysat und die Herstellung des Nährbodens und
der Impfkulturen wurde wie im Ausführungsbeispiel 2 vorgenommen.
Nach dem Impfen des Gärgefäßes, das einen 5°/oigen Nährboden enthielt, und dem chargenweisen Züchten
der Kultur wurde frischer steriler Nährboden eingeleitet. Die Verdünnungsrate D = f/v, wobei f die
Durchflußmenge (l/h) und ν das Kulturvolumen (I)
bedeuten, wurde konstant auf D = 0,3 h -' für einige d
gehalten, bis ein stationärer Zustand eingestellt war, der sich durch Konstanz des Bakterientrockengewichts und
der L-Asparaginase-Pegel in den wiederholt entnommenen Proben zeigte. Die Durchschnittswerte des
Bakterientrockengewichts und der L-Asparaginaseproben im stationären Zustand waren wie folgt:
Bakterientrockengewicht
L-Asparaginase
I. UVmg
= 2,6 mg/ml
= 24I.U./ml
= 9,2
= 24I.U./ml
= 9,2
Der L-Asparaginase, wie sie durch die Erfindung hergestellt und durch das in der Patentanmeldung vom
gleichen Tag der gleichen Anmelderin P 19 42 900.6-41 bt:chriebene Verfahren abgetrennt und gereinigt ist,
entspricht einem Produkt, das mit 3,5,1,1-L-Asparaginamidohydrolase
in der Terminologie der Internationalen Enzym-Kommission bezeichnet ist, weicht jedoch in
seinen Eigenschaften von den bisher bekannten Asparaginase!! ab, die z. B. aus Escherichia coli
gewonnen sind. Die Aminosäureanalyse von Proben von L-Asparaginase, gewonnen aus E. coli, verglichen
mit denen aus Erwinia carotovora, hatte folgendes Ergebnis:
Aminosäure | Esch. coli | Er. carotovora |
Asp | 180 | 131 |
Thr | 120 | 89 |
Ser | 60 | 64 |
GIu | 84 | 80 |
Pro | 48 | 49 |
GIy | 108 | 123 |
AIa | 120 | 105 |
VaI | 120 | 98 |
CyS | 6 | <2 |
Met | 24 | 33 |
He | 48 | 61 |
Leu | 84 | 104 |
Tyr | 54 | 48 |
Phe | 36 | 27 |
Lys | 84 | 67 |
His | 12 | 25 |
Arg | 36 | 68 |
Trp | 12 | 0 |
Ähnlich ergaben Vergleichsmessungen des isoelektrischen Punkts (durch isoelektrische Fokussierung)
einen pH-Wert von etwa 5,2 (für E. coli) und etwa 8,5 (für Er. carotovora) sowie Glutaminasewirkungen von
2 — 3% der Asparaginasewirkung (für E. coli) verglichen mit 5-7% (für Er. carotovora). Außerdem sind die
beiden Asparaginasearten serologisch ziemlich verschieden. Beide erzeugte Antisera führen zu keiner
Gegenreaktion in bezug auf die andere Asparaginase. Das hat den klinischen Vorteil, daß in Fällen, in denen
die Behandlung mit einer Asparaginase eine Empfindlichkeit entstehen läßt (eine allergische Reaktion), mit
der zweiten Asparaginase die Behandlung fortgesetzt werden kann. Das Molekulargewicht von Asparaginase,
die aus der Gattung Erwinia hergestellt ist, liegt normalerweise bei etwa 130 000 - 150 000.
Die Behandlung von Leukämie und ausgebreitetem Krebs wird normalerweise durch Injektion von
L-Asparaginase in einer physiologischen Lösung, wie einer Kochsalzlösung, vorgenommen, obwohl unter
gewissen Bedingungen auch eine orale Verabreichung möglich ist. Eine typische Lösi'ng für eine intravenöse
Injektion ist eine 15-mg/ml-Lösung von L-Asparaginase
in physiologischer Kochsalzlösung. Typische Dosen sind 0,05-5,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten.
Claims (10)
1. Verfahren zur Erzeugung von L-Asparaginase, gemäß dem man Bakterien in einem Nährmedium
aerob züchtet, mindestens einen Teil der entstandenen Bakterienzellen zwecks Freisetzens der
L-Asparaginase aufbricht und die freigesetzte L-Asparaginase isoliert, dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien der Gattung Erwinia einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien der Art Erwinia carotovora einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Art Erwinia
chrysanthemi einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Art Erwinia
aroideae einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Art Erwinia
atroseptica einsetzt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien in
einem flüssigen Nährmedium züchtet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß beim Züchten die
Temperatur im Bereich von 10 bis 400C gehalten wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des
Nährmediums im Bereich von 6 bis 8 gehalten wird.
9. L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach einem Verfahren gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 8 hergestellt worden ist.
10. Mittel gegen Leukämie oder ausgebreiteten Krebs beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß
es aus einer Lösung von L-Asparaginase gemäß Anspruch 9 in physiologischer Kochsalzlösung bei
einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein/ml Lösung besteht.
10
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