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Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure Gegenstand der Erfindung
ist ein Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure durch aerobe Züchtung von
Mikroorganismen, indem man in einem hierfür üblichen Nährmedium, das zusätzlich
mindestens 20 y/1 Vitamin B1 (Thiamin) oder dessen Derivate enthält, unter Einhaltung
an sich bekannter pH-Werte und Temperaturen Brevibakterium lactofermentus nov. spez.
(Nr. 2256) ATCC 13869 oder (Nr. 2362) ATCC 13655 züchtet.
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Hierbei erhält man in der Züchtungsflüssigkeit die 1-Glutaminsäure
rasch und leicht in hoher Konzentration, auch im industriellen Maßstab.
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Die Einzelheiten des Verfahrens können aus der nachfolgenden Beschreibung
entnommen werden. Die Bakterien Brevibacterium lactofermentus wurden ATCC 13869
und ATCC 13655 zum ersten Mal aus der Natur isoliert, und es konnte festgestellt
werden, daß sie sich deutlich von allen bekannten Bakterien unterscheiden. Die Tatsache,
daß die Stämme Brevibacterium lactofermentus nov. spez. ATCC 13869 und ATCC 13655
von allen bisher bekannten 1-Glutaminsäure liefernden Bakterien, wie Pseudomonas
fluorescens, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Bazillus subtilis, Micrococcus
glutamicus und der Pilze der Gattung Cephalsporium, verschieden sind, geht klar
aus Tabelle 1 hervor, in welcher die charakteristischen Eigenschaften von Brevicbaterium
lactofermentus nov. spez. ATCC 13869 und ATCC 13655 zusammengestellt sind. Tabelle
2 gibt einen Vergleich der Stämme ATCC 13869 und ATCC 13655 mit den bekannten 1-Glutaminsäure
produzierenden Bakterien wieder. Da Pilze von Bakterien weitgehend verschieden sind,
wurde von einer Aufnahme der Gattung Cephalosporium in der Tabelle 2 abgesehen.
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Tabelle 1 Charakteristische Merkmale von Brevibacterium lactofermentus
nov. spez.ATCC13869 und ATCC 13655 A. Morphologische Kennzeichen: 1. Vegetative
Zellen: Stäbe, gewöhnlich 0,5 bis 0,9 - 1,0 bis 1,4, einzeln und in Paaren, keine
runden Formen beobachtet, z. Beweglichkeit: keine, 3. Sporenbildung: keine, 4. Gramfärbung:
positiv.
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B. Züchtungseigenschaften: 1. Nährbrühe: kein Oberflächenwachstum,
leicht getrübt, geringes Sediment, 2. Agarstrich: mäßig, trocken, nicht entwickelt,
fettig, dumpfe Farbe und opakes Wachstum, fadenförmig und manchmal perlartig. Die
Chromogenesis des Ausstrichs ist anfangs gewöhnlich gelb bis blaßgelb, später tiefer
gelb, 3. Agarkolonie: gewöhnlich kleine Kreise, kaum breiter auf Agarbrühe, glatt
und manchmal erhöht in der Mitte der Kolonie, 4. Gelatine-Einstichkultur: Wachstum
an der Oberfläche längs des Einstichs, keine Verflüssigung, 5. Litmus-Milchkultur:
Säurebildung, Entfärbung und meistens Koagulation.
C. Physiologisches
Verhalten: 1. Verhalten gegenüber reinem Sauerstoff: praktisch anaerob, 2. Gang
der Karbohydratumwandlung nach der Methode von L e i f s o n (Journal of Bacteriology,
Bd. 66, S. 24 bis 26, 1953): fermentativer Metabolismus von Glucose und Lactose,
3. pH für Wachstum: Optimum etwa bei 7,0, Wachstum im Bereich von 5,3 bis 8,4, 4.
Temperatur für Wachstum: Optimum 30 bis 37°C, kein Wachstum bei 42°C, 5. Nitritproduktion
aus Nitrat: positiv, 6. Stärkehydrolyse: negativ, 7. MR- und VP-Reaktion: beide
positiv, B. Wachstum in Huckers-Medium: gewöhnlich gering, schwankend mit dem Impfausmaß,
9. Indolproduktion: negativ, 10. H,S-Produktion: negativ, 11. Urease: positiv, 12.
Fermentation verschiedener Zucker: Säureproduktion aus verschiedenen Zuckern, aber
keine Gasbildung; Säure aus Xylose, Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Lactose,
Sucrose, Maltose, Trehalose, Melezitose, Cellobiose, Raffinose, Dextrin, Mannitol,
Salicinund Esculin. Bemerkung 1: Die vorstehend angeführten charakteristischen Merkmale
der Stämme Brevibacterium lactofermentus nov. spez. ATCC 13869 und ATCC 13655 sind
nach den Vorschriften im Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria (1946),
herausgegeben von der Society of American Bacteriologists, ermittelt worden.
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Bemerkung 2: Die neu aufgefundenen Bakterienstämme gehören zur Gattung
Brevibacterium Breed nach der Einteilung in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology
(1957, 7. Auflage).
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Die neuen Bacterienstämme unterscheiden sich klar von anderen Arten,
die zur Gattung Brevibacterium gehören, und zwar sowohl in den besonderen, charakteristischen
Eigenschaften als auch in bezug auf die Lactosefermentation. Es ist daher festgestellt
worden, daß es sich um Stämme handelt, die zu einer neuen Art der Gattung Brevibacterium
gehören, und mit Rücksicht auf die Lactosefermentation ist den Batkerienstämmen
ATCC 13869 und ATCC 13655 die Bezeichnung Brevibacterium lactofermentus nov. spez.
gegeben worden. Tabelle 2 Vergleich der Stämme Brevibacterium lactofermentus nov.
spez. (2256) ATCC 13869 und (2362) ATCC 13655 mit anderen Mikroorganismen
| Brev. lactofermentus |
| PS. fluo- g. coli A. aero- B. sub- M. glu- nov. spez. |
| rescens genes tilis tamicus ATCC 13869 |
| und ATCC 13655 |
| Sporenbildung .................. ..... - - - + - - |
| Gramfärbung........................... - - - + + + |
| Beweglichkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . + + + + - - |
| Freier Sauerstoff zum Wachstum . . . . . . . . . . + + + + |
| Chromogenesis ......................... gelbe keine keine keine
gelb gelb |
| Fluo- |
| reszenz |
| Gelatineverflüssigung ................... + - - + - - |
| Litmus-Milch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . P AC AC P - AC |
| Indolproduktion .................:..... - + + - - - |
| H,S-Produktion ........................ + + - - |
| Nitritproduktion aus Nitrat . . . . . . . . . . . . . . + +
+ + + + |
| Methylrottest........................... t + - + - + |
| Voges Proskauertest ..................... - - + + - + |
| Stärkehydrolyse......................... - - - + - - |
| NH3-Bedarf zum Wachstum . . . . . . . . . . . . . . + + + +
+ + |
| Catalase ............................... + + + + + + |
| Glucosefermentation ................... A AG AG A A A |
| Lactosefermentation . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . .
- AG AG - - A |
| Xylosefermentation ..................... - AG AG A - A |
| Dextrinfermentation . . . . . . ... . . . . . . . . . . . .
- A A A - A |
| A = Säure, G = Gas, C = Coagulation und P = Peptonisation. |
Es ist Gefunden worden, daß die Stämme Brevibacterium lactofermentus nov. spez.
ATCC 13869 und ATCC 13655 1-Glutaminsäure in höherer Ausbeute und bei kürzerer Züchtungszeit
liefert, verglichenmitjedem anderen bisher bekannten 1-Glutaminsäure produzierenden
Organismus, wenn es in ein synthetisches Medium eingetragen wird, das beispielsweise
anorganische Salze, irgendwelche Zucker, Harnstoff, Aminosäuren und Biotin enthält,
und darin einer aeroben Züchtung unterzogen wird, wie unter einem Luftstrom oder
unter Schütteln oder Rühren.
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Man hat ferner feststellen können, daß die Konzentration an 1-Glutaminsäure
auf mehr als 5,0 g/dl ansteigt, wenn Brevibacterium lactofermentus nov, spez.
ATCC
13869 oder ATCC 13655 unter aeroben Bedingungen in einem Medium gezüchtet wird,
das neben den anderen Bestandteilen noch Vitamin B, (Thiamin) oder dessen Derivate,
wie Thiaminpropyldisulfit oder Dibenzoylthiamin, enthält.
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Die Tabelle 3 zeigt, welche bedeutenden Wirkungsunterschiede durch
den Zusatz von Vitamin B, zum Züchtungsmedium hervorgerufen werden. Das benutzte
synthetische Medium enthielt 100/, Glucose, und die Kultur wurde 40 Stunden
lang in einer Schüttelflasche behandelt. Die Bedingungen waren die gleichen wie
im nachstehend angeführten Beispiel 1, jedoch mit der Ausnahme, daß an Stelle von
20/, Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle 2,4°/o Harnstoff angewendet wurden.
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Die Angaben »Zuckerverbrauch« und »Anhäufung von 1-Glutaminsäure«
in Tabelle 3 beziehen sich auf Prozente von der verwendeten Glucosemenge.
| Tabelle 3 |
| Vitamin B, 200y/1 |
| An- |
| häufung |
| Brevibacterium Wachstum Zucker- von |
| lactofermentus nov. spez. (Trübung) verbrauch 1-Glut- |
| amin- |
| säure |
| °/o (°/o) |
| (Nr. 2362) ATCC 13655 0,69 99,2 54,4 |
| (Nr. 2256) ATCC 13869 |
| 0,76 98,1 53,2 |
| Vitamin B, 0 y/1 |
| (Nr. 2362) ATCC 13655 0,25 14,2 4,2 |
| (Nr. 2256) ATCC 13869 1 0,60 1 65,1 24,3 |
Wie sich aus dem Vergleich ergibt, erleichtert die Zugabe von Vitamin B, das Bakterienwachstum,
beschleunigt den Zuckerverbrauch und erhöht die Produktion von 1-Glutaminsäure ganz
erheblich. Wiewohl in bezug auf die Produktionskraft von 1-Glutaminsäure zwischen
den Stämmen (2362) ATCC 13655 und (2256) ATCC 13869 ein gewisser Unterschied besteht,
wenn kein Vitamin B, zugefügt wird, ist es doch klar, daß man Ausbeuten an 1-Glutaminsäure
von mehr als
5001, und eine Konzentration von mehr als 5 g/dl nur in Gegenwart
von Vitamin B, erreichen kann.
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Diese unterschiedlichen Wirkungen, die man gemäß vorliegender Erfindung
durch Verwendung von Brevibacterium lactofermentus nov. spez. ATCC 13869 und ATCC
13655 und Vitamin B, erzielen kann, lassen sich auch feststellen, wenn andere Zucker,
wie Fructose Sucrose, Lactose od. dgl. an Stelle von Glucose als Zuckerquelle benutzt
werden, was aus Tabelle 4 hervorgeht. Die dort angeführten Versuche wurden gleichfalls
in Schüttelkolben während 40 Stunden unter Verwendung eines Züchtungsmediums vorgenommen,
das 10 °/o des betreffenden Zuckers enthielt, in Anwendung der gleichen Bedingungen
wie im nachstehenden Beispiel
1, nur mit dem Unterschied, daß an Stelle von
2 °/o Ammoniumsulfat 2,4 °/o Harnstoff benutzt wurden.
| Tabelle 4 |
| Vitamin B, 200 y/1 |
| An- |
| häufung |
| Bakterien- Zucker- von |
| Zuckerart wachstum verbrauch 1-Glut- |
| (Trübung) amin- |
| säure |
| (°/o) (°/a) |
| Glucose ............. 0,69 99,2 54,4 |
| Fructose............. 0,59 87,2 36,3 |
| Maltose ............. 0,51 33,0 15,4 |
| Saccharose........... 0,61 85,5 29,9 |
| Lactose ............. 0,43 79,3 32,9 |
| Stärkehydrolysat ..... 0,68 92,3 51,8 |
| Vitamin B, 0 y/1 |
| Glucose ............. 0,25 14,2 4,2 |
| Fructose............. 0,22 11,3 3,2 |
| Maltose ............. 0,17 9,1 2,8 |
| Saccharose........... 0,21 11,9 4,1 |
| Lactose ............. 0,18 12,0 4,3 |
| Stärkehydrolysat ..... 0,33 21,3 6,4 |
Die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Vitamin B, auf die Produktion von
1-Glutaminsäure wurde gleichfallsgeprüft, und eswurde, wie ausTabelle5 hervorgeht,
festgestellt, daß mindestens 20 y pro Liter für die insdutrielle Fermentation zweckmäßig
sind.
| Tabelle 5 |
| Vitamin B1 (y/1) 0 10 1 20 100 1 1000110000 |
| Ausbeute an 1-Glut- |
| aminsäure (°/o) ... 1,2 3,2 34,9 49,3 53,8 52,1 |
| Zuckerverbrauch ... 20,4 32;9 80,3 97,3 98,2 99,3 |
Die Versuchsbedingungen waren dieselben wie im Beispiel 1, nur mit dem Unterschied,
daß als Stickstoffquelle an Stelle von 20/, Ammoniumsulfat 2,40/, Harnstoff verwendet
wurden.
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Ähnliche Wirkungen ließen sich bei Versuchen feststellen, die unter
Benutzung von Derivaten des Vitamins B,, wie Thiaminpropyldisulfit, an Stelle von
Vitamin B, als solchem vorgenommen wurden, was aus Tabelle 6 hervorgeht. Die Versuchsbedingungen
waren dieselben wie bei den vorstehend beschriebenen Untersuchungen, bei denen das
Vitamin B, selbst verwendet worden war.
| Tabelle 6 |
| Thiaminpropyldisulfit (y11) 1 0 200 1 1000 10000 |
| Ausbeute an 1-Glutamin- |
| säure (°/o) ............ 3,6 45,9 49,8 47,5 |
| Zuckerverbrauch (°/o) .... 11,7 87,9 94,3
91,9 |
Ein anderes neben der Kohlenstoffquelle erforderliches Rohmaterial bei der fermentativen
Herstellung von 1-Glutaminsäure ist die Stickstoffquelle. Die bekannte kontinuierliche
Zufuhr von Ammoniakgas zu dem Züchtungsmedium während der aeroben Behandlung kann
gleichzeitig vier verschiedenen Zwecken dienen, nämlich der Beistellung des für
das Zellwachstum erforderlichen Stickstoffs, der Abgabe
von NHz-Stickstoff
für den Aufbau des 1-Glutaminsäuremoleküls, der Neutralisation der fermentativ entstandenen
1-Glutaminsäure und der als Nebenprodukte auftretenden organischen Säuren, und schließlich
der Aufrechterhaltung des optimalen pH im Züchtungsmedium.
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Die anderen bekannten Mittel zur Sicherstellung dieser vier Wirkungen,
wie die Anwendung von Ammoniumsalzen und Kalk, von Ammoniumsalzen und Ammoniakwasser,
von Harnstoff und Ammoniakwasser od. dgl., haben mindestens einen unvermeidbaren
Nachteil, wie geringe Ausbeute an Glutaminsäure, Verlangsamung des Zuckerverbrauchs,
Verlängerung der Fermentationszeit od. dgl., und die Produktion der 1-Glutaminsäure
wird dadurch unvorteilhaft beeinflußt. Die Tabelle 7 zeigt, wie sehr die Verwendung
der bekannten Ammoniakgasmethode allen anderen bekannten Methoden überlegen ist.
| Tabelle 7 |
| Fermentationszeit Änderung des Konzentration Ausbeute an |
| Stickstoffquelle Neutralisator pH während der [ an 1-Glutaminsäure
1-Glutaminsäure |
| (Stunden) Fermentation I Wdl) (°/o) |
| Ammoniumsulfat CaCOg 5'11, 50 5,0 bis 6,8 1,63 7,4 |
| 2% |
| Harnstoff 2,50/0 keiner 50 6,5 bis 8,7 2,32 19,3 |
| Harnstoff 0,8 0/0 Ammoniakwasser 50 6,8 bis 8,3 4,13 36,1 |
| 6 ml/dl |
| Ammoniakgas Ammoniakgas 40 7,6 bis 7,8 5,98 1 49,6 |
Die vorstehend angeführten Versuche wurden unter denselben Bedingungen durchgeführt,
wie sie weiter unten im Beispiel 4 beschrieben sind, nur mit dem Unterschied, daß
als Kohlenstoffquelle an Stelle von 12,83 0/0 der durch die Hydrolyse von süßer
Kartoffelstärke erhaltenen Zucker 120/0 Glucose benutzt wurden. Die Konzentration
des verwendeten Ammoniakwassers betrug 28 0/0. Die Ursache der Überlegenheit der
Ammoniakgasmethode muß wahrscheinlich in dem Umstand gesucht werden, daß sie in
einfacher Weise gestattet, dauernd das optimale pH in der Brühe aufrechtzuerhalten.
Außerdem steigt dieser Effekt mit der Erhöhung der benutzten Zuckerkonzentration,
und diese Tatsache ist besonders wichtig für die Herstellung der 1-Glutaminsäure
im technischen Maßstab. Die Einführung des Ammoniakgases in das Züchtungsmedium
kann einfach dadurch erfolgen, daß man das Gas der Luft beimischt, die man einleitet,
um die Brühe unter aeroben Bedingungen zu erhalten. Das Ammoniakgas wird auf diese
Weise durch die Luft verdünnt, die für die aerobe Kultur notwendig ist, und infolgedessen
wird der vorbestimmte pH-Bereich genau eingehalten.
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Viele andere Versuche, welche zur Prüfung des vorliegenden Verfahrens
ausgeführt wurden, führten zu dem Ergebnis, daß der bevorzugte pH-Bereich für das
Züchtungsmedium zwischen 7,4 und 8,3 liegt und daß der optimale Bereich 7,6 bis
7,8 beträgt, wie aus der Tabelle 8 hervorgeht. Die Versuchsbedingungen waren die
gleichen wie im nachstehend angegebenen Beispiel
3, nur mit dem Unterschied,
daß an Stelle von 10,3 0/0 an Zucker, welche durch die Hydrolyse von süßer Kartoffelstärke
erhalten waren, 10 0/0 Glucose zugesetzt wurden.
| Tabelle 8 |
| Aufrecht- Fermentationszeit Ausbeute an |
| erhaltenes 1-Glutaminsäure |
| pH (Stunden) (°/o) |
| 7,2 42 40,1 |
| 7,4 38 45,3 |
| 7,6 32 50,4 |
| 7,8 34 50,6 |
| 8,0 39 48,2 |
| 8,3 49 39,7 |
In einem typischen Beispiel, welches gemäß vorliegender Erfindung ausgeführt wurde
und bei welchem der pH-Wert innerhalb von 7,6 bis 7,8 gehalten wurde, waren die
Beziehungen zwischen dem Wachstum der Zellen von Brevibacterium lactofermentus nov.
spez. ATCC 13869 und ATCC 13655, der Anhäufung von 1-Glutaminsäure und dem Verbrauch
von Glucose wie folgt: Das Zellwachstum (Durchdringung) begann mit dem Einsetzen
der Fermentation. Es stieg dann bis auf 0,75 bei Erreichung der Brutzeit von 20
Stunden an, und nach dieser Zeit blieb es auf derselben Höhe. Der Verbrauch an Glucose
zeigte nach etwa 5 Stunden einen plötzlichen Anstieg, der bis zu 25 Stunden anhielt
und dann allmählich abfiel. Die Konzentration der Glucose, welche in dem Medium
verblieb, betrug ungefähr 1,95 g/dl nach 25 Stunden und etwa 0,3 g/dl nach 30 Stunden.
Die Anhäufung an 1-Glutaminsäure nahm nach ungefähr 13 Stunden plötzlich zu und
stieg dann dauernd an. Die Konzentration von 1-Glutaminsäure betrug nach 13 Stunden
ungefähr 0,95 g/dl und nach 32 Stunden etwa 5,3 g/dl.
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Die nachstehend angegebenen Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
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Beispiel 1 Ein Kulturmedium, das 100/0 chemisch reiner Glucose, 20/0
Ammoniumsulfat, 200y/1 Vitamin B" 4,08 y/1 Biotin, 0,20/0 einer Lösung von Aminosäuren
(Hydrolysat von Sojabohnen, enthaltend 2,40/0 Gesamtstickstoff), 0,10/0 KHzP04,
0,04 0/0 MgS04 - 7 H20, 0,0010/0 FeS04 und 0,0010/0 MnS04 enthielt, wurde in einen
Schüttelkolben eingefüllt, das pH auf 7,0 eingestellt und während 10 Minuten bei
115°C sterilisiert. Dieses Medium wurde mit der Bakterienkultur auf Bouillonabstrich
24 Stunden lang mit Brevibacterium lactofermentus (Nr. 2362) ATCC 13655 unter Zusatz
von CaCO3, das vorher durch trockene Erhitzung sterilisiert worden war, bebrütet,
indem man es bei 31'C schüttelte. Die Kultur wurde nach 40 Stunden unterbrochen,
als die Fermentationsbrühe 3,13 g/dl an 1-Glutaminsäure und 1,32 g/dl an verbleibender
Glucose enthielt. Das Verhältnis der angehäuften Menge an 1-Glutaminsäure zu dem
Zuckerverbrauch betrug 36,10/0. Nach Abtrennung der Bakterienzellen aus der Fermentationsbrühe
wurde
diese auf ungefähr 20 °/o an Glutaminsäure eingeengt und mit Salzsäure versetzt,
um das pH auf 3,2 einzustellen. Man erhielt 26,0 g rohe 1-Glutaminsäure aus 1 1
Fermentationsflüssigkeit.
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Beispiel 2 Ein Kulturmedium, welches 100/, chemisch reiner
Glucose, 200 y1/ Vitamin B1, 4 y/1 Biotin, 0,2 °/o einer Lösung von Aminosäuren
(Hydrolysat von Sojabohnen, enthaltend 2,4°/o Gesamtstickstoff), 0,1°/o KH,P04,
0,040/, MgS04 - 7H20, 0,0010/, FeS04 enthielt und in einer Schüttelflasche eingefüllt
war, wurde auf pH 6 eingestellt und 10 Minuten lang bei 115°C sterilisiert, worauf
man 0,5°/o sterilisierten Harnstoff zusetzte. Es wurde 24 Stunden lang mit einer
Bakterienkultur auf Bouillonabstrich von Brevibacterium lactofermentus (Nr. 2256)
ATCC 13869 bebrütet und bei 31'C geschüttelt. Nach 18 Stunden wurden 1,8
°/o Harnstoff zur Brühe zugesetzt, und die Bebrütung wurde weitergeführt. Die Fermentation
war nach 45 Stunden unterbrochen. Die Konzentration der 1-Glutaminsäure betrug 4,83
g/dl, und die Ausbeute war 49,7 °/o berechnet auf die Menge der verbrauchten Glucose.
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Beispiel 3 Ein Kulturmedium, welches 10,3 °/o an Zuckern aus der Hydrolyse
von süßer Kartoffelstärke, 100 y/1 an Vitamin B1, 3,5y/1 Biotin, 0,20/, der vorgenannten
Säurelösung, 0,10/,) KH,P04, 0,04 °/o M9S04 - 7 H20, 0,0010/, FeS04 und
0,0010/, MnS04 enthielt, wurde in einen Fermentationskolben aus rostfreiem
Stahl mit 201 Inhalt eingefüllt, mit Ammoniak neutralisiert und durch Dampfeinleitung
sterilisiert. Es wurde mit 5 °/o einer flüssigen Kultur von Brevibacterium lactofermentus
(Nr. 2362) ATCC 13655 bebrütet, die aus einem Kulturmedium erhalten worden war,
das 5 °/o Glucose, 0,8 °/o Harnstoff, 100 y/1 Vitamin B1, 3 y/1 Biotin, 0,20/0 der
vorgenannten Aminosäurelösung und die vorgenannten anorganischen Salze enthielt,
einer aeroben Kultur unter den Bedingungen einer Rührung von 600 Umdrehungen pro
Minute, einem Luftzufluß von '/,Volumen der Kulturflüssigkeit pro Minute bei einer
Temperatur von 31'C ausgesetzt war. In die Kulturflüssigkeit wurden pH-Elektroden
eingesetzt, um automatisch das pH innerhalb des Bereiches von 7,6 bis 7,8 aufrechtzuerhalten.
Wenn das pH unter 7,6 sank, fand die Einführung von NH3-Gas in die Kulturflüssigkeit
automatisch statt, während, wenn das pH über 7,8 anstieg, die Zufuhr von NH3-Gas
automatisch abgestellt wurde. Die Schaumbildung an der Oberfläche der Kulturflüssigkeit
wurde durch Zusatz von Siliconharz unterdrückt. Die Fermentation war nach 32 Stunden
beendet, die Konzentration an 1-Glutaminsäure erreichte 5,03 g/dl, und die Ausbeute
betrug 50,9 °/o.
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Beispiel 4 Ein Kulturmedium, welches 12,83 °/o Zucker aus der Hydrolyse
von süßer Kartoffelstärke, 200 y/1 Vitamin Bi, 3,5 y/1 Biotin, 0,2 °/o der vorgenannten
Aminosäurelösung, 0,10/, KH1P04, 0,04 M9S04 - 7H20, 0,0010/, FeS04 und 0,001
% MnS04 enthielt, wurde vorbereitet. 251 dieses Kulturmediums wurden in einen
Fermentationskolben aus rostfreiem Stahl mit 401 Inhalt eingefüllt, mit Ammoniak
neutralisiert und durch Dampf sterilisiert. Es wurde mit 501, einer flüssigen
Kultur von Brevibacterium lactofermentus (Nr. 2256) ATCC 13869 bebrütet, welche
dieselbe Zusammensetzung wie im Beispiel 3 hatte und dann der aeroben Bebrütung
unter Rühren bei 335 Umdrehungen pro Minute, einer Luftzufuhr von '/,Volumen der
Kulturflüssigkeit pro Minute und einer Temperatur von 31'C ausgesetzt. Die
Regelung des pH und die Einführung des NH3-Gases wurden automatisch in derselben
Weise durchgeführt wie es im Beispiel 3 angegeben ist, und das pH der Kulturflüssigkeit
wurde im Bereich von 7,6 bis 7,8 aufrechterhalten. Die aerobe Fermentation war nach
38 Stunden beendet. Die Konzentration an 1-Glutaminsäure zu dieser Zeit betrug 6,43
g/dl, und die Ausbeute war 49,60/,.